ES2223185T5

ES2223185T5 - Detector de analitos in vitro de pequeño volumen usando un mediador redox difusible o no lixiviable.

Info

Publication number: ES2223185T5
Application number: ES99951856T
Authority: ES
Inventors: Benjamin J. Feldman; Adam Heller; Ephraim Heller; Fei Mao; Joseph A. Vivolo; Jeffery V. Funderburk; Fredric C. Colman; Rajesh Krishnan
Original assignee: Abbott Diabetes Care Inc
Current assignee: Abbott Diabetes Care Inc
Priority date: 1998-10-08
Filing date: 1999-10-08
Publication date: 2012-02-09
Anticipated expiration: 2019-10-08
Also published as: US20100018873A1; US8192611B2; US8182670B2; US20050278945A1; US9891185B2; US20100012526A1; US8083928B2; US20100021659A1; CN100424180C; US8083924B2; KR20010085902A; US8425758B2; US8701282B2; US20140251827A1; US8211363B2; US20100032317A1; EP1119637B1; DE69915850D1; US20100018874A1; US20100012519A1

Abstract

Un detector para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido, comprendiendo el detector: un par de electrodos que comprende un electrodo de trabajo y un contraelectrodo, en el que al menos una parte del electrodo de trabajo está a una distancia eficaz de no más de 200 im de una parte del contraelectrodo y, opcionalmente, el contraelectrodo es un contraelectrodo/electrodo de referencia; un electrodo de referencia opcional; una cámara de muestra para contener la muestra de fluido en contacto electrolítico con el electrodo de trabajo, el contraelectrodo y el electrodo de referencia, si está presente, comprendiendo la cámara de muestra una zona de medida situada al lado del electrodo de trabajo, el contraelectrodo y el electrodo de referencia, si está presente, dimensionándose la zona de medida para contener un volumen de no más de aproximadamente 1 il de muestra de fluido y, opcionalmente, la cámara de muestra se dimensiona para no contener más de aproximadamente 1 il demuestra de fluido; y una enzima sensible al analito y un mediador redox difusible dispuestos en la zona de medida; habiéndose configurado y dispuesto el detector de manera que una señal de fondo generada por el mediador redox difusible no es más de cualquiera de: <br /><br />(a) cinco veces una señal generada por la oxidación o la reducción de una cantidad media fisiológicamente normal de analito; o <br /><br />(b) cinco veces la señal generada por la oxidación o la reducción de una cantidad de analito correspondiente a la desviación media de una cantidad media fisiológicamente normal de analito.

Description

La presente invención se refiere a detectores analíticos para detectar bioanalitos en una muestra de pequeño volumen.

Antecedentes de la invención

Los detectores analíticos son útiles en química y medicina para determinar la presencia y concentración de un analito biológico. Dichos detectores se necesitan, por ejemplo, para controlar la glucosa en pacientes diabéticos y el lactato durante los sucesos críticos de la asistencia sanitaria.

La tecnología disponible en la actualidad mide bioanalitos en volúmenes de muestra relativamente grandes que generalmente necesitan, por ejemplo, 3 microlitros o más de sangre u otro fluido biológico. Estas muestras fluidas se obtienen a partir de un paciente, por ejemplo, usando una aguja y una jeringuilla, o perforando con una lanceta una parte de la piel como por ejemplo la punta del dedo y “presionando” la zona para obtener un volumen de muestra útil. Estos procedimientos no son convenientes para el paciente, y a menudo son dolorosos, particularmente cuando se necesitan muestras frecuentes. Se conocen procedimientos menos dolorosos para obtener una muestra, como por ejemplo perforando con una lanceta el brazo o el muslo, que tiene una menor densidad de terminaciones nerviosas. Sin embargo, perforar el cuerpo con una lanceta en las zonas preferidas produce, típicamente, muestras de sangre de submicrolitros, porque estas zonas tienen un menor suministro con vasos capilares cercanos a la superficie.

Sería deseable, por lo tanto, y muy útil desarrollar un detector de analitos en sangre fácil de usar y relativamente indoloro, que pueda realizar un análisis preciso y sensible de la concentración de los analitos en un pequeño volumen de mezcla. En la técnica se conocen detectores que pueden medir electroquímicamente un analito en una muestra. Algunos detectores conocidos en la técnica usan al menos dos electrodos y pueden contener un mediador redox para ayudar en la reacción electroquímica. Sin embargo, el uso de un detector electroquímico para medir un analito en un pequeño volumen introduce un error en las mediciones. Un tipo de imprecisión surge del uso de un mediador redox difusible. Debido a que los electrodos están tan juntos entre sí en un detector de pequeño volumen, el mediador redox difusible puede oscilar entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo y aumentar la señal medida para el analito. Otra fuente de imprecisión en un detector de pequeño volumen es la dificultad para determinar el volumen de la pequeña muestra o para determinar si la cámara de muestra está llena o no. Por lo tanto, sería deseable desarrollar un detector electroquímico de pequeño volumen que pueda disminuir los errores que surgen por el tamaño del detector y de la muestra.

El documento WO 98/35225 divulga un detector que tiene un electrodo de trabajo, un contraelectrodo y una cámara de muestra para recibir una muestra que contiene el analito que se quiere medir. La cámara de muestra incluye una zona de medida que tiene un volumen menor de aproximadamente 1 µl. Un mediador redox no lixiviable, que actúa como agente de transferencia de electrones entre el analito y el electrodo de trabajo, está presente sobre una parte del electrodo de trabajo.

Sumario de la invención

Los detectores de la presente invención proporcionan un procedimiento para detectar y cuantificar un analito en muestras de submicrolitros. En general, la invención incluye un procedimiento y un detector para el análisis de un analito en un pequeño volumen de muestra, por ejemplo por culombimetría, amperometría y/o potenciometría. Un detector de la invención utiliza un mediador redox no lixiviable o difusible. El detector incluye también una cámara de muestra para mantener la muestra en contacto electrolítico con el electrodo de trabajo. En muchos casos, el detector contiene también un segundo agente de transferencia de electrones no lixiviable o difusible.

En una realización preferida, el electrodo de trabajo se enfrenta a un contraelectrodo, formando una zona de medida en la cámara de muestra, entre los dos electrodos, que se dimensiona para que no contenga más de aproximadamente 1 µl de muestra, preferiblemente no más de aproximadamente 0,5 µl, más preferiblemente no más de aproximadamente 0,25 µl y más preferiblemente no más de aproximadamente 0,1 µl de muestra. Opcionalmente, se pone un material absorbente en la cámara de muestra y en la zona de medida para reducir el volumen de muestra necesario para llenar la cámara de muestra y la zona de medida.

En una realización de la invención, se proporciona un biodetector que combina la detección electroquímica culombimétrica con un mediador redox no lixiviable o difusible para medir precisa y eficazmente un bioanalito en una muestra con un volumen de submicrolitros. El detector preferido incluye un electrodo, un mediador redox no lixiviable

o difusible sobre el electrodo, una cámara de muestra para mantener la muestra en contacto eléctrico con el electrodo y, preferiblemente, un material absorbente dispuesto en el interior de la cámara de muestra para reducir el volumen de la cámara. La cámara de muestra, junto con cualquier material absorbente, se dimensiona para permitir el análisis de un volumen de muestra que normalmente no contenga más de aproximadamente 1 µl de muestra, preferiblemente no más de aproximadamente 0,5 µl, más preferiblemente no más de aproximadamente 0,25 µly más preferiblemente no más de aproximadamente 0,1 µl. En algunos casos, el detector contiene también un segundo agente de transferencia de electrones no lixiviable o difusible.

Una realización de la invención incluye un procedimiento para determinar la concentración de un analito en una muestra, en primer lugar poniendo en contacto la muestra con un detector electroquímico y después determinando la concentración del analito. El detector electroquímico incluye un par de electrodos enfrentados con un electrodo de trabajo y un contraelectrodo y una cámara de muestra, incluyendo una zona de medida, situada entre los dos electrodos. La zona de medida se dimensiona para que no contenga más de aproximadamente 1 µl de muestra.

La invención incluye también un detector electroquímico con dos o más pares de electrodos enfrentados. Cada par de electrodos tiene un electrodo de trabajo, un contraelectrodo y una zona de medida entre los dos electrodos, dimensionándose la zona de medida para no contener más de aproximadamente 1 µl de muestra. Además, el detector incluye también un mediador redox no lixiviable sobre el electrodo de trabajo de al menos uno de los pares de electrodos o un mediador redox difusible sobre una superficie en la cámara de muestra o en la muestra.

Un aspecto de la invención es un procedimiento para determinar la concentración de un analito en una muestra poniendo en contacto la muestra con un detector electroquímico y determinar la concentración del analito por culombimetría. El detector electroquímico incluye un par de electrodos con un electrodo de trabajo y un contraelectrodo. El detector incluye también una cámara de muestra para mantener la muestra en contacto electrolítico con el electrodo de trabajo. En el interior de la cámara de muestra hay un material absorbente para reducir el volumen de muestra necesario para llenar la cámara de muestra de manera que la cámara de muestra se dimensiona para que no contenga más de aproximadamente 1 µl de muestra. La cámara de muestra contiene también un mediador redox no lixiviable o difusible y opcionalmente contiene un segundo agente de transferencia de electrones no lixiviable o difusible.

Los detectores pueden incluir también un indicador de llenado, como por ejemplo un electrodo indicador o un segundo par de electrodos, que se puede usar para determinar cuando se ha llenado la zona de medida o la cámara de muestra. También se puede usar un electrodo indicador o un segundo par de electrodos para aumentar la precisión de la medida de la concentración de analito. Los detectores pueden incluir también un elemento de calefacción para calentar la zona de medida o la cámara de muestra para aumentar la velocidad de oxidación o reducción del analito.

Los detectores se pueden configurar para llenado lateral o llenado por la punta. Además, en algunas realizaciones, el detector puede ser parte de un dispositivo integrado de toma de muestras y medida de analitos. El dispositivo integrado de toma de muestras y medida de analitos puede incluir el detector y un órgano que perfore la piel, de manera que el dispositivo se puede usar para perforar la piel de un usuario para provocar el flujo de una muestra de un fluido, como por ejemplo sangre, que puede recoger el detector. Al menos en algunas realizaciones, la muestra de fluido se puede recoger sin mover el dispositivo integrado de toma de muestras y medida de analitos.

Un procedimiento para formar un detector, como se ha descrito anteriormente, incluye formar al menos un electrodo de trabajo sobre un primer sustrato y formar al menos un contraelectrodo o contraelectrodo/electrodo de referencia sobre un segundo sustrato. Se dispone una capa espaciadora sobre el primer o segundo sustrato. La capa espaciadora define un canal en el que una muestra se puede extraer y mantener cuando el detector está completo. Se dispone un mediador redox y/o un segundo agente de transferencia de electrones sobre el primer o segundo sustrato en una región que se expondrá en el canal cuando el sensor esté completo. Después se juntan el primer y segundo sustrato y se separan mediante la capa espaciadora, con el canal que proporciona acceso a al menos un electrodo de trabajo y a al menos un contraelectrodo o contraelectrodo/electrodo de referencia. En algunas realizaciones, el primer y segundo sustrato son partes de una sola hoja o tejido continuo de material.

Estas y otras diversas características que caracterizan la invención se señalan particularmente en las reivindicaciones adjuntas. Para un mejor entendimiento de la invención, sus ventajas y objetivos obtenidos con su uso, se debe hacer referencia a los dibujos y a la descripción que los acompaña, en la que se ilustran y describen las realizaciones preferidas de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Haciendo referencia ahora a los dibujos, donde los números y letras de referencia indican a la estructura correspondiente de las diversas vistas:

La figura 1 es una vista esquemática de una primera realización de un detector electroquímico de acuerdo con los principios de la presente invención que tiene un electrodo de trabajo y un contraelectrodo enfrentados entre sí;

La figura 2 es una vista esquemática de una segunda realización de un detector electroquímico de acuerdo con los principios de la presente invención que tiene un electrodo de trabajo y un contraelectrodo en una configuración coplanar;

La figura 3 es una vista esquemática de una tercera realización de un detector electroquímico de acuerdo con los principios de la presente invención que tiene un electrodo de trabajo y un contraelectrodo enfrentados entre sí y que tiene una cámara de muestra extendida;

La figura 4 es dibujo de una sección lateral que no está a escala de una parte del detector de las figuras 1 o 3 que muestra las posiciones relativas del mediador redox, la cámara de muestra y los electrodos;

La figura 5 es una vista superior de una cuarta reliz de un detector electroquímico de acuerdo con los principios de la presente invención, incluyendo este detector múltiples electrodos de trabajo;

La figura 6 es una vista en perspectiva de una realización de un dispositivo de medida de analitos, de acuerdo con los principios de la presente invención, que tiene una medio de toma de muestra y el detector de la figura 4;

La figura 7 es un gráfico de la carga necesaria para electrooxidar una cantidad conocida de glucosa en una solución tamponada de electrolito (círculos llenos) o en una solución de suero (círculos vacíos) usando el detector de la figura 1 con glucosa oxidasa como segundo agente de transferencia de electrones;

La figura 8 es un gráfico de las concentraciones medias de glucosa para los datos de la figura 7 (sólo soluciones tamponadas) con curvas de calibrado calculadas para ajustar las medias; se calculó una curva de calibrado lineal para las concentraciones de 10-20 mM y se calculó una curva de calibrado polinómica de segundo grado para las concentraciones de 0-10 mM;

La figura 9 es un polarizador clínico de tipo Clarke que analiza la relevancia de las medidas de glucosa de la figura 7.

La figura 10 es un gráfico de la carga necesaria para electrooxidar una cantidad conocida de glucosa en una solución tamponada de electrolito usando el detector de la figura 1 con glucosa deshidrogenasa como segundo agente de transferencia de electrones;

Las figuras 11A, 11B y 11C son vistas superiores de tres configuraciones para electrodos de trabajo y contraelectrodos que solapan de acuerdo con la presente invención;

Las figuras 12A y 12B son vistas en sección transversal de una realización de un par de electrodos formado usando un hueco de un material de base, de acuerdo con la invención;

Las figuras 13A y 13B son vistas en sección transversal de otra realización de un par de electrodos de la presente invención formados en un hueco de un material de base;

Las figuras 14A y 14B son vistas en sección transversal de otra realización de un par de electrodos de la presente invención formados en un hueco de un material de base y material absorbente;

La figura 15 es un gráfico de la carga suministrada por un detector que tiene un mediador redox difusible con el tiempo para diversas concentraciones de glucosa;

La figura 16 es un gráfico de la carga suministrada por un detector que tiene un mediador redox difusible para diversas concentraciones de glucosa;

La figura 17 es un gráfico de la carga suministrada por detectores con diferentes cantidades de mediador redox difusible con el tiempo.

La figura 18A ilustra una vista superior de una primer película con un electrodo de trabajo para usar en una quinta realización de un detector de acuerdo con la invención;

La figura 18B ilustra una vista superior de una espaciador para situar sobre la primera película de la figura 18A;

La figura 18C ilustra una vista inferior de una segunda película (invertida con respecto a las figuras 18A y 18B) con los contraelectrodos situados sobre el espaciador de la figura 18B y la primera película de la figura 18A;

La figura 19A ilustra una vista superior de una primera película con un electrodo de trabajo para usar en una sexta realización de un detector de acuerdo con la invención;

La figura 19B ilustra una vista superior de una espaciador para situar sobre la primera película de la figura 19A;

La figura 19C ilustra una vista inferior de una segunda película (invertida con respecto a las figuras 19A y 19B) con los contraelectrodos situados sobre el espaciador de la figura 19B y la primera película de la figura 19A;

La figura 20A ilustra una vista superior de una primera película con un electrodo de trabajo para usar en una séptima realización de un detector de acuerdo con la invención;

La figura 20B ilustra una vista superior de una espaciador para situar sobre la primera película de la figura 20A;

La figura 20C ilustra una vista inferior de una segunda película (invertida con respecto a las figuras 20A y 20B) con los contraelectrodos situados sobre el espaciador de la figura 20B y la primera película de la figura 20A;

La figura 21A ilustra una vista superior de una primera película con un electrodo de trabajo para usar en una octava realización de un detector de acuerdo con la invención;

La figura 21B ilustra una vista superior de una espaciador para situar sobre la primera película de la figura 21A;

La figura 21C ilustra una vista inferior de una segunda película (invertida con respecto a las figuras 21A y 21B) con los contraelectrodos situados sobre el espaciador de la figura 21B y la primera película de la figura 21A;

La figura 22A ilustra una vista superior de una primera película con un electrodo de trabajo para usar en una novena realización de un detector de acuerdo con la invención;

La figura 22B ilustra una vista superior de una espaciador para situar sobre la primera película de la figura 22A;

La figura 22C ilustra una vista inferior de una segunda película (invertida con respecto a las figuras 22A y 22B) con los contraelectrodos situados sobre el espaciador de la figura 22B y la primera película de la figura 22A;

La figura 23A ilustra una vista superior de una primera película con un electrodo de trabajo para usar en una décima realización de un detector de acuerdo con la invención;

La figura 23B ilustra una vista superior de una espaciador para situar sobre la primera película de la figura 23A;

La figura 23C ilustra una vista inferior de una segunda película (invertida con respecto a las figuras 23A y 23B) con los contraelectrodos situados sobre el espaciador de la figura 23B y la primera película de la figura 23A;

La figura 24A ilustra una vista superior de una primera película con un electrodo de trabajo para usar en una undécima realización de un detector de acuerdo con la invención;

La figura 24B ilustra una vista superior de una espaciador para situar sobre la primera película de la figura 24A;

La figura 24C ilustra una vista inferior de una segunda película (invertida con respecto a las figuras 24A y 24B) con los contraelectrodos situados sobre el espaciador de la figura 24B y la primera película de la figura 24A;

La figura 25 ilustra una vista superior de una duodécima realización de un detector electroquímico de acuerdo con la invención;

La figura 26 ilustra una vista en perspectiva de una realización de un dispositivo integrado de toma y detección de analitos;

La figura 27 ilustra una vista en sección transversal de una decimotercera realización de un detector de acuerdo con la invención;

La figura 28 ilustra un gráfico que compara las medidas de la concentración de analito en muestras de sangre recogidas del brazo de un sujeto hechas mediante un detector de la invención con las determinadas por un ensayo de sangre patrón;

La figura 29 ilustra un gráfico que compara las medidas de la concentración de analito en muestras de sangre recogidas del dedo de un sujeto hechas mediante un detector de la invención con las determinadas por un ensayo de sangre patrón;

La figura 30 ilustra un gráfico que compara las medidas de la concentración de analito en muestras venosas hechas mediante un detector de la invención con las determinadas por un ensayo de sangre patrón;

La figura 31A ilustra una vista superior de una realización de una hoja de componentes de un detector de acuerdo con la presente invención;

La figura 31B ilustra una vista superior de otra realización de una hoja de componentes de un detector de acuerdo con la presente invención; y

La figura 32 ilustra una vista transversal mirando desde el interior del medidor de un detector de la invención dispuesto en un medidor.

Descripción detallada de la realización preferida

Cuando se usan en este documento, las siguientes definiciones definen los términos indicados:

Un “mediador que se puede oxidar al aire” es un mediador redox que se oxida al aire, preferiblemente de manera que al menos el 90% del mediador está en estado oxidado tras almacenarlo al aire, como sólido o como líquido, durante un periodo de tiempo, por ejemplo un mes o menos y, preferiblemente, una semana o menos y, más preferiblemente, un día o menos.

“Amperometría” incluye amperometría en estado estacionario, cronoamperometría y medidas de tipo Cottrell.

Un “fluido biológico” es un fluido corporal en el que se puede medir el analito, por ejemplo sangre, fluido intersticial, fluido dérmico, sudor y lágrimas.

El término “sangre” en el contexto de la invención incluye sangre completa y sus componentes libres de células, como por ejemplo plasma y suero.

“Culombimetría” es la determinación de la carga pasada o proyectada durante la electrolisis completa o casi completa del analito, directamente sobre el electrodo o mediante uno o más agentes de transferencia de electrones. La carga se determina midiendo la carga pasada durante la electrolisis parcial o casi completa del analito o, más a menudo, por medidas múltiples durante la electrolisis de una corriente en disminución y tiempo transcurrido. La corriente en disminución resulta de la disminución de la concentración de las especies electrolizadas por la electrolisis.

Un “contraelectrodo” se refiere a uno o más electrodos apareados con el electrodo de trabajo, a través del cual pasa una corriente electroquímica de una magnitud igual y de signo opuesto a la corriente que pasa a través del electrodo de trabajo. El término “contraelectrodo” pretende incluir contraelectrodos que funcionan también como electrodos de referencia (es decir, un contraelectrodo/electrodo de referencia) a menos que la descripción especifique que un “contraelectrodo” excluye un electrodo de referencia o un contraelectrodo/electrodo de referencia.

Un “coeficiente de difusión eficaz” es el coeficiente de difusión que caracteriza el transporte de una sustancia, por ejemplo un analito, una enzima o un mediador redox, en el volumen entre los electrodos de la célula electroquímica. Al menos en algunos casos, el volumen de la célula puede estar ocupado por más de un medio (por ejemplo, la muestra de fluido y una película polimérica). La difusión de una sustancia a través de cada medio puede tener lugar a una velocidad diferente. El coeficiente de difusión eficaz corresponde a una velocidad de difusión a través de estos múltiples medios y es típicamente diferente del coeficiente de difusión para la sustancia en una célula llena sólo con la muestra de fluido.

Un “detector electroquímico” es un dispositivo configurado para detectar la presencia de y/o para medir la concentración de un analito mediante reacciones electroquímicas de oxidación y reducción. Estas reacciones se transducen a una señal eléctrica que se puede correlacionar con una cantidad o concentración de analito.

“Electrolisis” es la electrooxidación o electrorreducción de un compuesto, directamente en un electrodo o mediante uno o más agentes de transferencia de electrones (por ejemplo, mediadores redox y/o enzimas).

El término “electrodos enfrentados” se refiere a una configuración de los electrodos de trabajo y contraelectrodo en la que la superficie de trabajo del electrodo de trabajo está dispuesta aproximadamente enfrente de una superficie del contraelectrodo. Al menos en algunos casos, la distancia entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo es menor que la anchura de la superficie de trabajo del electrodo de trabajo.

Un compuesto está “inmovilizado” sobre una superficie cuando queda atrapado en o unido químicamente a la superficie.

Un “electrodo indicador” incluye uno o más electrodos que detectan el llenado parcial o completo de una cámara de muestra y/o de una zona de medida.

Una “capa” incluye una o más capas.

La “zona de medida” se define en este documento como una zona de la cámara de muestra dimensionada de manera que sólo contenga una parte de la muestra que se tiene que analizarse durante el ensayo del analito.

Un compuesto “no difusible”, “no lixiviable” o “no liberable” es un compuesto que prácticamente no se difunde desde la superficie de trabajo del electrodo de trabajo durante la duración del ensayo del analito.

El “potencial del contraelectrodo/electrodo de referencia” es la mitad del potencial de celda del electrodo de referencia o del contraelectrodo/electrodo de referencia de la celda cuando la solución en la celda es una solución de NaCl 0,1 Ma pH 7.

“Potenciometría” y “cronopotenciometría” se refieren a tomar una medida potenciométrica en uno o más puntos con el tiempo.

Un “mediador redox” es un agente de transferencia de electrones para llevar electrones entre el analito y el electrodo de trabajo, directamente o mediante un segundo agente de transferencia de electrones.

Un “electrodo de referencia” incluye un electrodo de referencia que también funciona como contraelectrodo (es decir un contraelectrodo/electrodo de referencia) a menos que la descripción especifique que un “electrodo de referencia” excluye un contraelectrodo/electrodo de referencia.

Un “segundo agente de transferencia de electrones” es una molécula que lleva electrones entre un mediador redox y el analito.

Un “material absorbente” es un material que adsorbe, retiene y/o se humedece por una muestra de fluido y que típicamente no evita prácticamente la difusión del analito al electrodo.

Una “superficie de la cámara de muestra” incluye una superficie de un electrodo de trabajo, contraelectrodo, contraelectrodo/electrodo de referencia, electrodo de referencia, electrodo indicador, un espaciador o cualquiera de las superficies que limitan la cámara de muestra.

Un “electrodo de trabajo” es un electrodo en el que el analito se electrooxida o electrorreduce con o sin la ayuda de un mediador redox.

Una “superficie de trabajo” es la parte de un electrodo de trabajo que se recubre con un mediador redox no lixiviable y que se expone a la muestra o, si el mediador redox es difusible, una “superficie de trabajo” es la parte del electrodo de trabajo que está expuesta a la muestra.

Los detectores de analitos in vitro en pequeños volúmenes de la presente invención se diseñan para medir la concentración de un analito en una parte de una muestra que tiene un volumen de no más de aproximadamente 1 µl, preferiblemente de no más de aproximadamente 0,5 µl, más preferiblemente de no más de aproximadamente 0,25 µl y más preferiblemente de no más de aproximadamente 0,1 µl. El analito de interés se proporciona, típicamente, en una solución o fluido biológico, tal como sangre o suero. Haciendo referencia a los dibujos en general y a las figuras 1 -4 en particular, un detector 20 electroquímico in vitro en pequeños volúmenes de la invención incluye, generalmente, un electrodo de trabajo 22, un contraelectrodo (o un contraelectrodo/electrodo de referencia) 24 y una cámara de muestra 26 (véase la figura 4). La cámara de muestra 26 está configurada de manera que cuando se proporciona una muestra a la cámara, la muestra entra en contacto electrolítico con ambos electrodo de trabajo 22 y contraelectrodo 24. Esto permite que fluya una corriente eléctrica entre los electrodos para realizar la electrolisis (electrooxidación o electrorreducción) del analito.

Electrodo de trabajo

El electrodo de trabajo 22 puede estar formado por un material compuesto de fibra de carbono o puede consistir en un material de base inerte no conductor, como por ejemplo poliéster, sobre el que se deposita una cada conductora adecuada. La capa conductora típicamente tiene una resistencia eléctrica relativamente baja y típicamente es electroquímicamente inerte en el intervalo de potencial durante el funcionamiento del detector. Las capas conductoras adecuadas incluyen oro, carbono, platino, dióxido de rutenio, paladio y resinas epoxi conductoras, como por ejemplo Recubrimiento Epoxi Conductor Lleno con carbono ECCOCOAT CT5079-3 (disponible en W.R. Grace Company, Woburn, Massachussets), así como otros materiales no corrosivos conocidos por los expertos en la técnica. El electrodo (por ejemplo la capa conductora) se deposita sobre la superficie del material inerte por procedimientos conocidos como por ejemplo deposición por vapor o impresión.

Se puede proporcionar una lengüeta 23 sobre el extremo del electrodo de trabajo 22 para facilitar la conexión del electrodo a los elementos electrónicos externos (no mostrados) tales como una fuente de tensión o un equipo de medida de la corriente. Otros procedimientos o estructuras conocidos (como por ejemplo cojinetes de contacto) se pueden usar para conectar el electrodo de trabajo 22 con los elementos electrónicos externos.

Para evitar que ocurran reacciones electroquímicas en partes del electrodo de trabajo no recubiertas por el mediador, cuando se usa un mediador no lixiviable, se puede depositar un material dieléctrico 40 sobre el electrodo encima, debajo o alrededor de la zona con el mediador redox, como se muestra en la figura 4. Los materiales dieléctricos adecuados incluyen ceras y polímeros orgánicos no conductores como por ejemplo polietileno. El material dieléctrico 40 puede recubrir también una parte del mediador redox sobre el electrodo. La parte recubierta del mediador redox no entrará en contacto con la muestra y, por lo tanto, no será parte de la superficie del electrodo de trabajo.

Química de detección

Además del electrodo de trabajo 22, se proporcionan materiales químicos detectores en la cámara de muestra 26 para el análisis del analito. Esta química de detección incluye, preferiblemente, un mediador redox y un segundo mediador de transferencia de electrones, aunque en algunos casos, se pueden usar el uno o el otro en solitario. El mediador redox y el segundo agente de transferencia de electrones pueden ser independientemente difusibles o no lixiviables (es decir, no difusibles) de manera que cualquiera de ellos o ambos puedan ser difusibles o no lixiviables. La colocación de componentes químicos detectores puede depender de si son difusibles o no lixiviables. Por ejemplo, los componentes no lixiviables y/o difusibles forman típicamente una capa detectora sobre el electrodo de trabajo.

Como alternativa, se pueden disponer uno o más componentes difusibles sobre cualquier superficie en la cámara de muestra antes de introducir la muestra. Como otro ejemplo, se pueden colocar uno o más componentes difusibles en la muestra antes de la introducción de la muestra en el detector.

Si el mediador redox no es lixiviable, entonces el mediador redox no lixiviable se dispone típicamente sobre el electrodo de trabajo 22 como una capa detectora 32. En una realización que tiene un mediador redox y un segundo agente de transferencia de electrones, si el mediador redox y el segundo agente de transferencia de electrones son ambos no lixiviables, entonces ambos componentes no lixiviables se disponen sobre el electrodo de trabajo 22 como una capa detectora 32.

Si por ejemplo el segundo agente de transferencia de electrones es difusible y el mediador redox es no lixiviable, entonces al menos el mediador redox se dispone sobre el electrodo de trabajo 22 como capa detectora 32. No es necesario que el segundo agente de transferencia de electrones difusible se disponga en una capa detectora sobre el electrodo de trabajo, pero se puede disponer sobre cualquier superficie de la cámara de muestra, incluyendo en la capa detectora del mediador redox, o se puede poner en la muestra. Si el mediador redox es difusible, entonces el mediador redox se puede disponer sobre cualquier superficie de la cámara de muestra o se puede poner en la muestra.

Si ambos mediador redox y el segundo agente de transferencia de electrones son difusibles, entonces los componentes difusibles se pueden disponer independientemente o conjuntamente sobre cualquier superficie de la cámara de muestra y/o poner en la muestra (es decir, no es necesario que cada componente difusible se disponga sobre la misma superficie de la cámara de muestra o se ponga en la muestra).

El mediador redox, cuando es difusible o no lixiviable, media una corriente entre el electrodo de trabajo 22 y el analito y permite el análisis electroquímico de moléculas que no son adecuadas para la reacción electroquímica directa sobre un electrodo. El mediador funciona como un agente de transferencia de electrones entre el electrodo y el analito.

En una realización, el mediador redox y el segundo agente de transferencia de electrones son difusibles y se disponen sobre la misma superficie de la cámara de muestra, como por ejemplo sobre el electrodo de trabajo. En este mismo caso, ambos se pueden disponer sobre, por ejemplo, el contraelectrodo, contraelectrodo/electrodo de referencia, electrodo de referencia o electrodo indicador. En otros casos, el mediador redox y el segundo agente de transferencia de electrones son ambos difusibles y se colocan independientemente sobre una superficie de la cámara de muestra y/o en la muestra. Por ejemplo, el mediador redox se puede colocar sobre el electrodo de trabajo mientras que el segundo agente de transferencia de electrones se coloca sobre cualquier superficie, excepto en el electrodo de trabajo, o se pone en la muestra. De manera similar, también es una realización adecuada la situación inversa, en la que el segundo agente de transferencia de electrones se dispone sobre el electrodo de trabajo y el mediador redox se dispone sobre cualquier superficie, excepto en el electrodo de trabajo, o se pone en la muestra. Como otro ejemplo, el mediador redox se puede disponer sobre el contraelectrodo y el segundo agente de transferencia de electrones se pone sobre una superficie excepto en el contraelectrodo o se pone en la muestra. La situación inversa también es adecuada..

El mediador redox y/o el segundo agente de transferencia de electrones difusible puede difundir rápidamente en la muestra o la difusión puede ocurrir durante un periodo de tiempo. De manera similar, el mediador redox y/o el segundo agente de transferencia de electrones difusible se puede disolver en primer lugar desde la superficie sobre la que se sitúa como un sólido y después el mediador redox y/o el segundo agente de transferencia de electrones difusible puede difundir a la muestra, rápidamente o durante un periodo de tiempo. Si el mediador redox y/o el segundo agente de transferencia de electrones se difunden durante un periodo de tiempo, un usuario puede tener que esperar un periodo de tiempo antes de medir la concentración de analito para permitir la difusión del mediador redox y/o del segundo agente de transferencia de electrones.

Señal de fondo

Al menos en algunos casos, un mediador redox difusible puede oscilar para adelante y para atrás desde el electrodo de trabajo hasta el contraelectrodo incluso en ausencia del analito. Esto crea típicamente una señal de fondo. Para las medida culombimétricas esta señal de fondo se refiere en este documento como “Qfondo”. La señal de fondo corresponde a la carga pasada en un ensayo electroquímico en ausencia del analito. La señal de fondo tiene, típicamente, un componente transitorio y un componente de estado estacionario. Al menos una parte del componente transitorio puede ser el resultado, por ejemplo, del establecimiento de un gradiente de concentración del mediador en un estado de oxidación particular. Al menos una parte del componente de estado estacionario puede ser el resultado, por ejemplo, del mediador redox oscilando entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo o el contraelectrodo/electrodo de referencia. La oscilación se refiere a que el mediador redox está siendo electrooxidado (o electrorreducido) en el electrodo de trabajo y después electrorreducido (o electrooxidado) en el contraelectrodo o en el contraelectrodo/electrodo de referencia, haciendo disponible de esta manera el mediador redox para que sea electrooxidado (o electrorreducido) de nuevo en el electrodo de trabajo de manera que el mediador redox entra en un ciclo de electrooxidación y electrorreducción.

La cantidad de oscilación del mediador redox y, por lo tanto, el componente de estado estacionario de la señal de fondo varía, por ejemplo con el coeficiente de difusión eficaz del mediador redox, la viscosidad de la muestra, la temperatura de la muestra, la dimensiones de la celda electroquímica, la distancia entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo o el contraelectrodo/electrodo de referencia, y el ángulo entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo o el contraelectrodo/electrodo de referencia.

En algunos casos, el componente de estado estacionario de la señal de fondo puede contener un ruido relacionado con (a) variabilidad en, por ejemplo, la temperatura de la muestra, la viscosidad de la muestra o cualquier otro parámetro del que dependa la señal de fondo durante la duración del ensayo o (b) imperfecciones en la celda electroquímica, como por ejemplo separación no uniforme entre electrodo de trabajo y el contraelectrodo o el contraelectrodo/electrodo de referencia, variaciones en la geometría del electrodo, o protusiones entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo o el contraelectrodo/electrodo de referencia.

Aunque el componente de estado estacionario de la señal de fondo puede ser reproducible, cualquier ruido inherente no es reproducible. Como resultado, el ruido afecta negativamente a la precisión. En algunos casos, la señal de fondo y el ruido están relacionados. Como resultado, el ruido y el error que introduce se pueden reducir reduciendo la señal de fondo. Por ejemplo, reduciendo la oscilación de la mediación entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo o el contraelectrodo/electrodo de referencia probablemente reduciría el ruido asociado con los cambios en la temperatura y viscosidad de la muestra que afectan a la difusión del mediador redox.

Por lo tanto, para aumentar la precisión de las medidas o para disminuir el error en las medidas en aquellos casos en los que al reducir la señal de fondo también se reduce el ruido, es deseable un nivel moderado próximo a cero de la señal de fondo. La invención proporciona una detector y un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones. En el caso de la amperometría, esta comparación se puede realizar determinando la proporción entre la corriente de oscilación del mediador redox y la corriente generada por la electrolisis del analito. En el caso de la potenciometría, esta comparación se puede hacer determinando la medida del potencial de oscilación del mediador redox y la medida potencial generada por la electrolisis del analito. En el caso de la culombimetría, esta comparación se puede hacer determinando la carga transferida al electrodo de trabajo por la oscilación del mediador redox y la carga transferida al electrodo de trabajo por la electrolisis del analito.

El tamaño de la señal de fondo se puede comparar con una cantidad predeterminada de analito. La cantidad de analito predeterminada en una muestra puede ser, por ejemplo, una cantidad molar media o esperada del analito. La cantidad molar media o esperada del analito se puede determinar, por ejemplo, como el valor medio para usuarios o individuos; un valor medio para una población; un máximo, mínimo o medio de un intervalo fisiológico normal; un valor fisiológico máximo o mínimo para una población; un valor fisiológico máximo o mínimo para usuarios o individuos; una desviación media, máxima o mínima fuera de un intervalo de valores fisiológicos normales para usuarios, individuos o una población; una desviación por encima o por debajo del valor medio para una población; un una desviación media, máxima o mínima por encima o por debajo de un valor fisiológico normal medio para usuarios

o individuos. Una población se puede definir, por ejemplo por la salud, sexo o edad, como por ejemplo una población normal de adultos, niños o recién nacidos. Si una población se define por la salud, la población puede incluir gente que carezca de una afección particular o, como alternativa, que tenga una afección particular como por ejemplo diabetes. Se pueden usar como guía los intervalos de referencia relacionados con los valores medios o esperados, como por ejemplo los proporcionados en Tietz Textbook of Clinical Chemistry, Appendix (pág. 2175-2217) (2ª Ed. Carl A. Burtis y Edwards R. Ashwood, editores, W.D. Saunders Co., Philadelphia, 1994), aunque también se puede usar un examen físico o una determinación química sanguínea por un médico especialista para determinar un valor medio o esperado para un individuo. Por ejemplo, un adulto puede tener una concentración de glucosa de 65 a 95 mg/dl en sangre completa o una concentración de L-lactato de 8,1 a 15,3 mg/dl en sangre venosa completa después de ayunar, de acuerdo con Tietz Textbook of Clinical Chemistry. Una concentración fisiológica normal media para un adulto puede corresponder por ejemplo a 80 mg/dl de glucosa o 12,7 mg/dl de lactato. Otros ejemplos incluyen a una persona que tiene principio de diabetes juvenil, aún un buen control glucémico y una concentración de glucosa entre aproximadamente 50 mg/dl y 400 mg/dl, teniendo por tanto una cantidad molar media de 225 mg/dl. En otro caso, un adulto no diabético puede tener una concentración de glucosa de aproximadamente 80 mg/dl (después de ayunar) y 140 mg/dl (después de consumir alimentos), teniendo por tanto una cantidad molar media de 110 mg/dl.

Se pueden determinar analitos adicionales incluyendo, por ejemplo, acetilcolina, amilasa, bilirrubina, colesterol, gonadotropina coriónica, creatina quinasa (por ejemplo CK-MB), creatina, ADN, fructosamina, glucosa, glutamina, hormonas del crecimiento, hormonas, cetonas, lactato, peróxido, antígeno específico de la próstata, protrombina, ARN, hormona estimuladora del tiroides y troponina. También se puede determinar la concentración de fármacos como por ejemplo antibióticos (por ejemplo gentamicina, vancomicina y similares), digitoxina, digoxina, fármacos de abuso, teofilina y warfarina.

Para construir un detector que tiene una proporción particular entre la señal de fondo y la señal de analito de la electrolisis, se pueden considerar y elegir diversos parámetros relacionados con la corriente y/o la carga de la señal de fondo por la oscilación del mediador redox y/o de la señal generada por la electrolisis del analito, para obtener una proporción deseada. Típicamente, la señal determinada presión reducida para un ensayo culombimétrico es la carga; mientras que la señal determinada para un ensayo amperométrico es la corriente en el momento cuando se toma la medida. Debido a que la corriente y la carga dependen de diversos parámetros, la proporción deseada entre la señal de fondo generada por la oscilación del mediador redox y la señal generada por la electrolisis del analito se puede conseguir mediante diversas configuraciones del detector y procedimientos de operación del detector.

Control de la señal de fondo

Un procedimiento para controlar la señal de fondo incluye usar un mediador redox que a) oxide el analito a un potencial de onda media, medido por voltametría cíclica en NaCl 0,1 M a pH 7, de no más de aproximadamente +100 mV con respecto al potencial de un electrodo de referencia o un contraelectrodo/electrodo de referencia, o b) reduzca el analito a un potencial de onda media, medido por voltametría cíclica en NaCl 0,1 M a pH 7, de no más de aproximadamente -100 mV con respecto al potencial de un electrodo de referencia o un contraelectrodo/electrodo de referencia. Se puede elegir un electrodo de referencia o un contraelectrodo/electrodo de referencia adecuado (por ejemplo un electrodo de plata/cloruro de plata). Preferiblemente, el mediador redox a) oxida el analito a un potencial de onda media, medido por voltametría cíclica en NaCl 0,1 M a pH 7, de no más de aproximadamente +50 mV, +25 mV, 0 mV, -25 mV, -50 mV, -100 mV o -150 mV, con respecto al potencial de un electrodo de referencia o un contraelectrodo/electrodo de referencia, o b) reduce el analito a un potencial de onda media, medido por voltametría cíclica en NaCl 0,1 M a pH 7, de no más de aproximadamente -50 mV, -25 mV, 0 mV, +25 mV, +50 mV, +100 mV, +150 mV o +200 mV con respecto al potencial de un electrodo de referencia o un contraelectrodo/electrodo de referencia. Como alternativa, en el caso de la reducción del mediador redox por el contraelectrodo, el detector funciona a un potencial aplicado de no más de aproximadamente +100 mV, +50 mV, +25 mV, 0 mV, -25 mV, -50 mV, -100 mV o -150 mV, entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo o contraelectrodo/electrodo de referencia. En el caso de la oxidación del mediador redox en el contraelectrodo, el detector funciona a un potencial aplicado de no más de aproximadamente -100 mV, -50 mV, -25 mV, 0 mV, +25 mV, +50 mV, +100 mV, +150 mV o +200 mV, entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo o contraelectrodo/electrodo de referencia.

Otro procedimiento incluye controlar el potencial aplicado de manera que para un ensayo electrooxidativo el mediador redox no se reduce fácilmente en el contraelectrodo o contraelectrodo/eletrodo de referencia o para un ensayo electrorreductor el mediador redox no se oxida fácilmente en el contraelectrodo o contraelectrodo/eletrodo de referencia. Esto se puede conseguir, por ejemplo, en un ensayo electrooxidativo usando un detector que tiene un mediador redox difusible con un potencial, relativo al contraelectrodo o contraelectrodo/eletrodo de referencia, que es negativo con respecto al potencial del contraelectrodo (relativo al electrodo de referencia) o al contraelectrodo/eletrodo de referencia. El potencial (relativo a un electrodo de referencia o contraelectrodo/eletrodo de referencia) del electrodo de trabajo se elige que sea positivo con respecto al mediador redox y puede ser negativo con respecto al contraelectrodo o contraelectrodo/eletrodo de referencia, de manera que el mediador redox se oxida en el electrodo de trabajo. Por ejemplo, cuando la electrooxidación de un analito está mediada por un mediador redox difusible con un potencial de -200 mV frente al electrodo de referencia o contraelectrodo/eletrodo de referencia, y el potencial al que se equilibra el electrodo de trabajo es de -150 mV relativo al electrodo de referencia

: o contraelectrodo/eletrodo de referencia, entonces el mediador redox prácticamente se oxida en el electrodo de trabajo y oxidará al analito. Además, si algo del mediador redox oxidado alcanza al contraelectrodo o contraelectrodo/eletrodo de referencia, el mediador redox no se reducirá fácilmente en el contraelectrodo o contraelectrodo/eletrodo de referencia porque el contraelectrodo o contraelectrodo/eletrodo de referencia se equilibra en un valor positivo (es decir, 150 mV) del potencial del mediador redox.

En un ensayo electrorreductor, se proporciona un detector que tiene un mediador redox difusible con un potencial formal, relativo a un electrodo de referencia o contraelectrodo/eletrodo de referencia, que es positivo con respecto al potencial del contraelectrodo o contraelectrodo/eletrodo de referencia. El potencial, relativo al electrodo de referencia

: o contraelectrodo/eletrodo de referencia, del electrodo de trabajo se elige para que sea negativo con respecto al mediador redox y se puede equilibrar en positivo con respecto al contraelectrodo o contraelectrodo/eletrodo de referencia, de manera que el mediador redox se reduce en el electrodo de trabajo.

Otro procedimiento más para limitar la corriente de fondo incluye hacer que un mediador redox quede inmovilizado cuando se hace reaccionar sobre el contraelectrodo o contraelectrodo/eletrodo de referencia, por ejemplo por precipitación o polimerización. Por ejemplo, el mediador puede ser catiónico en estado oxidado, pero neutro y mucho menos soluble en estado reducido. La reducción en el contraelectrodo/eletrodo de referencia lleva a la precipitación del mediador neutro reducido en el contraelectrodo/eletrodo de referencia.

Otra configuración del detector adecuada para controlar la señal de fondo incluye un detector que tiene una cantidad molar de mediador redox que es estequiométricamente igual a o menor que una cantidad molar esperada o media de analito. La cantidad molar esperada o media de analito se puede determinar como ya se ha explicado anteriormente. La cantidad molar esperada o media de analito se puede determinar, por ejemplo como el valor medio para usuarios o individuos; un valor medio para una población; un máximo, mínimo o media de un intervalo fisiológico normal; un valor fisiológico máximo o mínimo para una población; un valor fisiológico máximo o mínimo para usuarios o individuos; una desviación máxima o mínima fuera de un intervalo de valores fisiológicos normales para usuarios, individuos o una población; una desviación por encima o por debajo de un valor medio para una población; o una desviación media, máxima o mínima presión reducida encima o por debajo de un valor fisiológico normal medio para usuarios o individuos. Una población se puede definir por ejemplo por la salud, sexo o edad, como por ejemplo una población normal de adultos, niños o recién nacidos. Si una población se define por la salud, la población puede incluir gente que carezca de una afección particular o, como alternativa, que tenga una afección particular como por ejemplo diabetes. Se pueden usar como guía los intervalos de referencia relacionados con los valores medios o esperados, como por ejemplo los proporcionados en Tietz Textbook of Clinical Chemistry, supra, aunque también se puede usar un examen físico o una determinación química sanguínea para determinar un valor medio o esperado. Por ejemplo, la cantidad molar media fisiológica de analito puede depender de la salud o de la edad de la persona de la que se obtiene la muestra. Esta determinación está dentro del conocimiento de un médico especialista.

Reduciendo la concentración del mediador redox relativa a la concentración de analito, se aumenta la señal atribuible al analito relativa a la señal atribuible a la oscilación del mediador redox. En la realización práctica de este procedimiento, la cantidad molar de mediador redox puede ser no más del 50%, 20%, 10% o 5% en una base estequiométrica, de la cantidad molar media o esperada de analito.

La cantidad de medidor redox usada en dicha configuración del detector debería estar dentro de un intervalo. El límite superior del intervalo se puede determinar basándose, por ejemplo, en la señal máxima aceptable debida a la oscilación del mediador redox; el diseño de la celda electroquímica, incluyendo por ejemplo las dimensiones de la celda y la posición de los electrodos; el coeficiente de difusión eficaz del mediador redox; y el tiempo necesario para el ensayo. Además, la señal máxima aceptable debida a la oscilación del mediador redox puede variar de un ensayo a otro como resultado de uno o más parámetros de ensayo, como por ejemplo si se pretende que el ensayo sea cualitativo, semi-cuantitativo o cuantitativo; si las pequeñas diferencias de concentración del analito sirven como base para modificar la terapia; y la concentración esperada de analito.

Aunque es ventajoso minimizar la cantidad de mediador redox usado, el intervalo para la cantidad aceptable de mediador redox tiene, típicamente, un límite inferior. La cantidad mínima de mediador redox que se puede usar es la concentración de mediador redox que es necesaria para conseguir el ensayo en un periodo de tiempo de medida deseable, por ejemplo no más de aproximadamente 5 minutos o no más de aproximadamente 1 minuto. El tiempo necesario para conseguir el ensayo dependen de, por ejemplo, la distancia entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo o contraelectrodo/eletrodo de referencia, el coeficiente de difusión eficaz del mediador redox y la concentración de analito. En algunos casos, por ejemplo, cuando no hay limitaciones cinéticas presentes, es decir la oscilación del mediador redox sólo depende de la difusión, la concentración mínima de mediador redox se puede determinar por la siguiente fórmula:

Cm= (d2 CA) / Dmt

en la que Cm es la concentración mínima de mediador necesaria; d es la distancia entre un electrodo de trabajo y un contraelectrodo o contraelectrodo/eletrodo de referencia en una disposición enfrentada; CA es la concentración media de analito en la muestra; Dm es el coeficiente de difusión eficaz del mediador en la muestra; y t es el tiempo de medida deseado.

Por ejemplo, cuando la distancia entre el par de electrodos enfrentados es de 50 µm, el analito que se está analizando es glucosa 5 mM y el coeficiente de difusión eficaz del mediador es 10-6 cm 2/s y el tiempo de respuesta deseado no es más de aproximadamente 1 minuto, entonces la concentración mínima de mediador redox es de 2,08 mM. En estas condiciones la señal de fondo será menor que la señal de la electrooxidación del analito.

Aún otra configuración del detector para limitar la corriente de fondo generada por un mediador redox difusible incluye tener una barrera para el flujo del mediador difusible al contraelectrodo. La barrera puede ser, por ejemplo, una película a través de la que no puede difundir el mediador redox o a través de la que el medidor redox difunde lentamente. Los ejemplos de películas adecuadas incluyen policarbonato, alcohol polivinílico y membranas de celulosa regenerada o de éster de celulosa. Como alternativa, la barrera puede incluir partículas cargadas o polares, compuestos o grupos funcionales para prevenir o reducir el flujo de un mediador redox cargado relativo al flujo de un analito con carga neutra o menos cargado. Si el mediador redox está cargado positivamente, como lo están la mayoría de mediadores redox de osmio descritos a continuación, la barrera puede ser una película cargada positivamente o polar, como por ejemplo poli(1-vinil imidazol) metilado. Si el mediador redox está cargado negativamente, la barrera puede ser una película cargada negativamente o polar, como por ejemplo Nafion®. Los ejemplos de matrices polares adecuadas incluyen una membrana bipolar, una membrana que tiene un polímero catiónico reticulado con un polímero aniónico, y similares. En algunos casos, la barrera reduce la oxidación o reducción del mediador redox difusible en el contraelectrodo en al menos un 25%, 50% o 90%.

Aún otra configuración del detector para limitar la corriente de fondo incluye un detector que tiene un mediador redox que se oxida o se reduce más fácilmente sobre el electrodo de trabajo que se reduce o se oxida en el contraelectrodo. La velocidad de reacción del mediador redox en un electrodo puede ser función del material del electrodo. Por ejemplo, algunos mediadores redox pueden reaccionar más deprisa en un electrodo de carbono que en un electrodo de Ag/AgCl. La selección apropiada de los electrodos puede proporcionar una velocidad de reacción

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en un electrodo que es significativamente más lenta que la velocidad en otro electrodo. En algunos casos, la velocidad de oxidación o reducción del mediador redox difusible en el contraelectrodo se reduce al menos en un 25%, 50% o 90%, si se compara con la del electrodo de trabajo. En algunos casos, la velocidad de reacción para el mediador redox en el contraelectrodo o contraelectrodo/electrodo de referencia se controlar, por ejemplo, eligiendo un material para el contraelectrodo o contraelectrodo/electrodo de referencia que necesite un sobrepotencial o un potencial mayor que el potencial aplicado para aumentar la velocidad de reacción en el contraelectrodo o contraelectrodo/electrodo de referencia.

Otra configuración del detector para limitar la corriente de fondo incluye elementos adecuados para reducir la difusión del mediador redox. La difusión se puede reducir, por ejemplo, usando un mediador redox con un coeficiente de difusión relativamente bajo, o aumentando la viscosidad de la muestra en la zona de medida. En otra realización, la difusión del mediador redox se puede disminuir eligiendo un mediador redox con un elevado peso molecular, por ejemplo mayor de 5.000 dalton, preferiblemente mayor de 25.000 dalton y más preferiblemente mayor de 100.000 dalton.

Mediadores redox

Aunque se puede usar cualquier especie redox orgánica u organometálica como mediador redox, un tipo de mediador redox adecuado es un compuesto o complejo de metal de transición. Los ejemplos de compuesto o complejos de metal de transición adecuados incluyen compuestos o complejos de osmio, rutenio, hierro y cobalto. En estos complejos, el metal de transición está unido de manera coordinada a uno o más ligandos. Los ligandos son, típicamente, mono-, di-, tri-o tetradentados. Los ligandos más preferidos son compuestos heterocíclicos de nitrógeno, como por ejemplo derivados de piridina y/o imidazol. Los ligandos multidentados pueden incluir múltiples anillos de piridina y/o imidazol. Como alternativa, se pueden usar derivados de metaloceno, como por ejemplo ferroceno.

Los mediadores redox adecuados incluyen complejos de metal de transición de osmio o rutenio con uno o más ligandos, teniendo cada ligando uno o más heterociclos que contienen nitrógeno. Los ejemplos de dichos ligandos incluyen anillos de piridina e imidazol y ligandos que tienen dos o más anillos de piridina y/o imidazol, como por ejemplo 2,2’-bipiridina; 2,2’:6’2”-terpiridina; 1,10-fenantrolina; y ligandos que tienen las siguientes estructuras:

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y derivados de los mismos, en las que cada R1 y R2 es, independientemente, hidrógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, alquenilo, vinilo, alilo, amido, amino, vinilcetona, ceto o grupos que contienen azufre.

El término “alquilo” incluye una cadena hidrocarbonada alifática saturada lineal o ramificada que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, como por ejemplo metilo, etilisopropilo (1-metiletilo), butilo, terc-butilo (1,1-dimetiletilo) y similares. Preferiblemente, la cadena hidrocarbonada tiene de 1 a 3 átomos de carbono.

El término “alcoxi” incluye un alquilo como se ha definido anteriormente unido al resto de la estructura por un átomo de oxígeno, como por ejemplo metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi (1-metiletoxi), butoxi, terc-butoxi y similares.

El término “alquenilo” incluye una cadena hidrocarbonada alifática insaturada que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, como por ejemplo etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 1-butenilo, 2-metil-1-propenilo y similares. Preferiblemente la cadena hidrocarbonada tiene de 2 a 3 átomos de carbono.

El término “amido” incluye grupos que tienen un átomo de nitrógeno unido al átomo de carbono de un grupo carbonilo e incluye grupos que tienen las siguientes fórmulas:

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en las que cada R3 y R4 es, independientemente, hidrógeno, alquilo, alcoxi o alquenilo.

El término “amino” según se usa en este documento incluye alquilamino, como por ejemplo metilamino, dietilamino, N,N-metiletil-amino y similares; alcoxialquilamino, como por ejemplo N-(etoxietil)amino, N,N-di(metoxietil)amino, N,N(metoxietil)(etoxietil)amino, y similares; y anillos que contienen nitrógeno, como por ejemplo piperidina, piperazina, morfolina y similares.

El término “vinilcetona” incluye un grupo que tiene la fórmula:

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en la que cada R5, R6 y R7 es, independientemente, hidrógeno, alquilo, alcoxi o alquenilo. 10 El término “ceto” incluye un grupo que tiene la fórmula:

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en la que R8 es hidrógeno, alquilo, alcoxi o alquenilo.

El término “grupo que contiene azufre” incluye mercapto, alquilmercapto (como por ejemplo metilmercapto, etilmercapto y similares), alcoxialquilmercapto (como por ejemplo metoxietilmercapto y similares), alquilsulfóxido

15 (como por ejemplo metilsulfóxido y propilsulfóxido y similares), alcoxialquilsulfóxido (como por ejemplo etoxietilsulfóxido y similares), alquilsulfona (como por ejemplo metilsulfona y propilsulfona y similares) y alcoxialquilsulfona (como por ejemplo metoxietilsulfona y similares). Preferiblemente, el grupo que contiene azufre es un grupo mercapto.

Otros mediadores redox adecuados incluyen complejos de metales de transición de osmio o rutenio con uno o más

20 ligandos, teniendo cada ligando uno o más heterociclos que contienen nitrógeno y teniendo cada heterociclo que contiene nitrógeno un segundo heteroátomo seleccionada entre el grupo constituido por nitrógeno, oxígeno, azufre y selenio.

Los ejemplos de ligandos que tienen uno o más heterociclos que contienen nitrógeno y en cada heterociclo tienen un segundo heteroátomo incluyen ligandos que tienen las siguientes estructuras:

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en las que cada Y1, Y2, Y3 y Y4 es, independientemente, un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un átomo de selenio o un átomo de nitrógeno sustituido que tiene la fórmula NR9 en la que R9 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, alquenilo, amido, amino, vinilcetona, ceto o un grupo que contiene azufre. Los términos “alquilo”, “alcoxi”, “alquenilo”, “amino”, “vinilcetona”, “ceto” y “grupo que contiene azufre” son como se han definido anteriormente.

Los derivados adecuados de estos ligandos incluyen, por ejemplo, la adición de grupos funcionales alquilo, alcoxi, alquenilo, viniléster y amido a cualquiera de los sitios disponibles en el anillo heterocíclico, incluyendo, por ejemplo, en la posición 4 (es decir, para respecto al nitrógeno) de los anillos de piridina o en uno de los átomos de nitrógeno del anillo de imidazol.

Los derivados adecuados de 2,2’-bipiridina para complejación con el catión osmio incluyen, por ejemplo, mono-, di-y polialquil-2,2’-bipiridinas, como por ejemplo 4-4’-dimetil-2,2’-bipiridina; mono-, di-y polialcoxi-2,2’-bipiridinas, como por ejemplo 4,4’-dimetoxi-2,2’-bipiridina y 2,6’-dimetoxi-2,2’-bipiridina; mono-, di-y poliacetamido-2,2’-bipiridinas, como por ejemplo 4,4’-di(acetamido)-2,2’-piridina; mono-, di-y polialquilaminoalcoxi-2,2’-bipiridina, como por ejemplo 4,4’-di(N,N-dimetilaminoetoxi)-2,2’-bipiridina; y mono-, di-y polipirazolil-2,2’-bipiridinas sustituidas, como por ejemplo 4,4’-dimetoxi-6-(N-pirazolil)-2,2’-bipiridina y 4,4’-dimetoxi-6-(N-pirazolilmetil)-2,2’-bipiridina.

Los derivados adecuados de 1,10-fenantrolina para complejación con el catión osmio incluyen, por ejemplo, mono-, di-y polialquil-1,10-fenantrolinas, como por ejemplo 4,7-dimetil-1,10-fenantrolina y mono-, di-y polialcoxi-1,10fenantrolinas, como por ejemplo 4,7-dimetoxi-1,10-fenantrolina y 5-metoxi-1,10-fenantrolina.

Los derivados adecuados para 2,2’:6’2”-terpiridina incluyen, por ejemplo, mono-, di-, tri-y polialquil-2,2’:6’2”terpiridinas, como por ejemplo 4,4’,4”-trimetil-2,2’:6’2”-terpiridina, 4,4’,4”-trietil-2,2’:6’2”-terpiridina y mono-, di-, tri-y polialcoxi-2,2’:6’2”-terpiridinas, como por ejemplo 4,4’,4”-trimetoxi-2,2’:6’2”-terpiridina y 4’-metoxi-2,2’:6’2”-terpiridina, y mono-, di-, tri-y poliamino-2,2’:6’2”-terpiridina, como por ejemplo 4’-amino-2,2’:6’2”-terpiridina, y mono-, di-, tri-y polialquilamino-2,2’:6’2”-terpiridina, como por ejemplo 4’-dimetilamino-2,2’:6’2”-terpiridina y mono-, di-, tri-y polialquiltio-2,2’:6’2”-terpiridina como por ejemplo 4’-metiltio-2,2’:6’2”-terpiridina y 4-metiltio-4’-etiltio-2,2’:6’2”terpiridina.

Los derivados adecuados para piridina incluyen, por ejemplo, piridinas mono-, di-, tri-y polisustituidas, como por ejemplo 2,6-bis(N-pirazolil)piridina, 2,6-bis(3-metil-N-pirazolil)piridina, 2,6-bis(2-imidazolil)piridina, 2,6-bis(1-metil-2imidazolil)piridina y 2,6-bis(1-vinil-2-imidazolil)piridina y mono-, di-, tri-y poliaminopiridinas, como por ejemplo 4aminopiridina, 4,4’-diaminobipiridina, 4,4’-di(dimetilamino)bipiridina y 4,4’4”-triamino terpiridina.

Otros derivados adecuados incluyen compuestos que comprenden tres anillos heterocíclicos. Por ejemplo, un derivado adecuado incluye un compuesto de fórmula:

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en la que cada R10, R11 y R12 es, independientemente, hidrógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, alquenilo, vinilo, alilo, amido, amino, vinilcetona, ceto o un grupo que contiene azufre.

Los términos “alquilo”, “alcoxi”, “alquenilo”, “amido”, “amino”, “vinilcetona”, “ceto” y “grupo que contiene azufre” son como se han definido anteriormente.

Otros derivados de mediador redox adecuados incluyen compuestos de fórmula:

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en la que R13 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, alquenilo, vinilo, alilo, vinilcetona, ceto, amido, amino o un grupo que contiene azufre; y cada Y5 e Y6 es, independientemente, un átomo de nitrógeno o de carbono.

Aún otros derivados más adecuados incluyen compuestos de fórmula:

imagen1

en la que R14 es como se ha definido anteriormente y cada Y7 e Y8 es, independientemente, un átomo de azufre o de oxígeno.

Los ejemplos de mediadores redox adecuados también incluyen, por ejemplo, cationes osmio complejados con (a) dos ligandos bidentados, como por ejemplo 2,2’-bipiridina, 1,10-fenantrolina o derivados de los mismos (los dos ligando no tienen por qué ser necesariamente iguales), (b) un ligando tridentado, como por ejemplo 2,2’,2”-terpiridina y 2,6-di(imidazol-2-il)-piridina o (c) un ligando bidentado y un ligando tridentado. Los complejos de metal de transición de osmio adecuados incluyen, por ejemplo, [(bpy)2OsLX]+/2+ , [(dimet)2OsLX]+/2+ , [(dmo)2OsLX]+/2+ , [terOsLX2]0/+, [(trimetOsLX2]0/+ y [(ter)(bpy)LOs]2+/3+, donde bpy es 2,2’-bipiridina, dimet es 4,4’-dimetil-2,2’-bipiridina, dmo es 4,4’-diemtoxi-2,2’-bipiridina, ter es 2,2’:6’2”-terpiridina, trimet es 4,4’,4”-trimetil-2,2’:6’,2”-terpiridina, L es un ligando heterocíclico que contienen nitrógeno y X es un halógeno, como por ejemplo flúor, cloro o bromo.

Los mediadores redox a menudo intercambian electrones rápidamente entre sí y con el electrodo de manera que el complejo se puede oxidar y/o reducir rápidamente. En general, los complejos de hierro son más oxidantes que los complejos de rutenio, que a su vez son más oxidantes que los complejos de osmio. Además, el potencial redox aumenta generalmente con el número de anillos heterocíclicos coordinados; los anillos heterocíclicos de seis miembros aumentan el potencial más que los anillos de cinco miembros, excepto cuando el nitrógeno que coordina el metal es formalmente un anión. Este es sólo el caso de que el nitrógeno del anillo está unido a ambos de sus átomos de carbono vecinos por enlaces simples. Si el nitrógeno es formalmente un anión, entonces el potencial redox generalmente aumenta más tras la coordinación del ión metálico.

Al menos algunos mediadores redox difusibles incluyen uno o más grupos funcionales piridina o imidazol. El grupo funcional imidazol puede incluir también otros sustituyentes y puede ser, por ejemplo vinil imidazol, por ejemplo 1vinil imidazol o metilimidazol, por ejemplo 1-metilimidazol. Los ejemplos de mediadores difusibles adecuados pueden incluir [Os(dmo)2(1-vinil imidazol)X]X, [Os(dmo)2(1-vinil imidazol)X]X2, [Os(dmo)2(imidazol)X]X, [Os(dmo)2( imidazol)X]X2, [Os(dmo)2(1-metilimidazol)X]X2 y [Os(dmo)2(metilimidazol)X]X2, en los que dmo es 4,4’-diemtoxi-2,2’bipiridina y X es halógeno como se ha descrito anteriormente.

Otros mediadores redox que contienen osmio incluyen [Os((metoxi)2fenantrolina)2(N-metilimidazol)X]+/2+; [Os((acetamido)2bipiridina)2(L)X]+/2+; en los que L es un compuesto monodentado que contiene nitrógeno (incluyendo, aunque no se limita a un derivado de imidazol) elegido para refinar el potencial; y Os(terpiridina)(L)2Cl, en el que L es una aminopiridina, como por ejemplo dialquilaminopiridina; un imidazol N-sustituido, como por ejemplo N-metil imidazol; un oxazol; un tiazol; o una alcoxipiridina, como por ejemplo metoxipiridina. X es halógeno como se ha descrito anteriormente.

Los mediadores redox difusibles exentos de osmio incluyen, por ejemplo, fenoxazinas, como por ejemplo 7dimetilamino-1,2-benzofenoxazina (Azul Meldola), 1,2-benzofenoxazina y Azul Nilo; 3-β-naftoílo (Azul Cresilo Brillante); tetrametilfenilendiamina (TMPD); diclorofenolindofenol (DCIP); sales de N-metil fenazonio, por ejemplo metosulfato de fenazina (PMS), metosulfato de N-metilfenazina y metosulfato de metoxifenazina; sales de tetrazonio, por ejemplo azul de tetrazolio o azul de nitrotetrazolio; y fenotriazina, por ejemplo azul de toluidina O.

Los ejemplos de otras especies redox incluyen quinonas estables y especies que en su estado oxidado tienen estructuras quinoides, como por ejemplo Azul Nilo e indofenol. Los ejemplo de quinonas adecuadas incluyen, por ejemplo, derivados de naftoquinona, fenoqujinona, benzoquinona, naftenoquinona y similares. Los ejemplos de derivados de naftoquinona incluyen juglona (es decir, 5-hidroxi-1,4-naftoquinona) y derivados de la misma, como por ejemplo 2,3-dicloro-5,8-dihidroxi-1,4-naftoquinona, 2,3-dimetil-5,8-dihidroxi-1,4-naftoqinona, 2-cloro-5,8-dihidroxi-1,4naftoquinona, 2,3-metoxi-5-hidroxi-1,4-naftoquinona y similares. Otros ejemplos incluyen aminonaftoquinonas, como por ejemplo morfolino-naftoquinonas, como por ejemplo 2-cloro-3-morfolino-1,4-naftoquinona; piperidinonaftoquinonas, como por ejemplo 2-metil-3-piperidino-1,4-naftoquinona; piperazino-naftoquinonas, como por ejemplo 2-etoxi-3-piperazino-1,4-naftoquinona; y similares.

Los derivados de fenoquinona adecuados incluyen, por ejemplo, coerulignona (es decir, 3,3’,5,5’tetrametoxidifenoquinona) y derivados de la misma, como por ejemplo 3,3’,5,5’-tetrametildifenoquinona, 3,3’,5,5’tetrahidroxifenoquinona y similares.

Los derivados de benzoquinona adecuados incluyen, por ejemplo, coenzima Q0 (es decir, 2,3-dimetoxi-5-metil-1,4benzoquinona) y derivados de la misma, como por ejemplo 2,3,5-trimetil-1,4-benzoquinona, 2,3-dimetil-5-metoxi-1,4benzoquinona, 2,3-dimetil-5-hidroxi-1,4-benzoquinona y similares.

Otros derivados de quinona adecuados incluyen, por ejemplo, acenaftenoquinona y ubiquinonas, como por ejemplo coenzima Q0, incluyendo Q1, Q2, Q6, Q7, Q9 y Q10.

Otros mediadores más redox difusibles exentos de osmio incluyen, por ejemplo azul de Taylor (es decir, azul de 1,9dimetilmetileno), yoduro de N,N’-dietiltiacianiina y tionina.

En otro procedimiento, una capa detectora 32 contiene un mediador redox no lixiviable (es decir, no liberable) y está dispuesta sobre una parte del electrodo de trabajo 22. El mediador redox no lixiviable puede ser, por ejemplo, un polímero redox (es decir, un polímero que tiene una o más especies redox). Preferiblemente, hay muy poca lixiviación o ninguna desde el mediador redox no lixiviable fuera del electrodo de trabajo 22 y hacia la muestra durante el periodo de medida, que típicamente es menor de 5 minutos. Los mediadores redox de esta realización se pueden unir o inmovilizar de otra manera al electrodo de trabajo 22 para evitar la lixiviación del mediador en la muestra. El mediador redox se puede unir o inmovilizar de otra manera al electrodo de trabajo por procedimientos conocidos, por ejemplo, por formación de múltiples puentes iónicos con un polielectrolito de carga contraria, por unión covalente del mediador redox al polímero sobre el electrodo de trabajo, por atrapamiento del mediador redox en una matriz que tiene gran afinidad por el mediador redox, o por biconjugación del mediador redox con un compuesto unido al electrodo de trabajo. En una realización, se puede usar una membrana de intercambio catiónico para atrapar al compuesto redox aniónico. De manera similar, en otra realización, se puede usar una membrana de intercambio aniónico para atrapar al compuesto redox catiónico. Aún en otra realización que implica biconjugación, se puede conjugar un mediador redox unido a biotina con avidina o estreptavidina en una matriz cerca de o inmovilizada en el electrodo de trabajo. Aún otra realización incluye hacer que un mediador redox de digoxina o digoxigenina reaccione con antidigoxina en una matriz cerca de o inmovilizada en el electrodo de trabajo.

Los mediadores redox no lixiviables preferidos son polímeros redox, como por ejemplo compuestos o complejos de metales de transición poliméricos. Típicamente, los polímeros usados para formar un polímero redox tienen heterociclos que contienen nitrógeno como por ejemplo piridina, imidazol o derivados de los mismos para unirse como ligandos a las especies redox. Los polímeros adecuados para complejarse con especies redox, como por ejemplo complejos de metal de transición descritos anteriormente incluyen, por ejemplo, polímeros y copolímeros de poli(1-vinl imidazol) (denominado “PVI”) y poli(4-vinil piridina) (denominado “PVP”), así como polímeros y copolímeros de poli(ácido acrílico) o poliacrilamida que se han modificado por adición de heterociclos que contienen nitrógeno colgante, como por ejemplo piridina e imidazol. La modificación de poli(ácido acrílico) se puede llevar a cabo por reacción de al menos una parte de las funcionalidades ácido carboxílico con una aminoalquilpiridina o un aminoalquilimidazol, como por ejemplo 4-etilaminopiridina, para formar amidas. Los sustituyentes copoliméricos adecuados de PVI, PVP y poli(ácido acrílico) incluyen acrilonitrilo, acrilamida, acrilhidrazida y 1-vinil imidazol sustituido o cuaternizado. Los copolímeros pueden ser copolímeros aleatorios o de bloque.

Los polímeros redox de complejos de metal de transición no lixiviables se unen, típicamente, covalente o coordinadamente con los heterociclos que contienen nitrógeno (por ejemplo, anillos de imidazol y/o piridina) del polímero. Los complejos de metal de transición pueden tener grupo funcionales vinilo a través de los cuales los complejos se pueden co-polimerizar. Los grupos funcionales de vinilo adecuados incluyen, por ejemplo, heterociclos vinílicos, amidas, nitrilos, ácidos carboxílicos, ácidos sulfónicos u otros compuestos vinílicos polares. Un ejemplo de un polímero redox de este tipo es poli(vinil ferroceno) o un derivado de poli(vinil ferroceno) funcionalizado para aumentar el hinchamiento del polímero redox en agua.

Otro tipo de polímero redox contiene una especie redox unida iónicamente, formando múltiples puentes iónicos. Típicamente, este tipo de mediador incluye un polímero cargado acoplado a una especie redox cargada con la carga opuesta. Los ejemplos de este tipo de polímero redox incluyen un polímero cargado negativamente como por ejemplo Nfion® (Du Pont) acoplado a una especie redox cargada positivamente tales como un catión polipiridil osmio

o rutenio. Otro ejemplo de un mediador unido iónicamente es un polímero cargado positivamente como por ejemplo poli(4-vinil piridina) o poli(1-vinil imidazol) cuaternizados acoplado a una especie redox cargada negativamente como por ejemplo ferricianuro o ferrocianuro. La especie redox unida iónicamente preferida es una especie redox con múltiples cargas, a menudo polianiónico, unido a un polímero cargado con la carga opuesta.

Otro polímero redox adecuado incluye una especie redox unida de manera coordinada a un polímero. Por ejemplo, el mediador puede estar formado por coordinación de un complejo de 2,2’-bipiridil osmio, rutenio o cobalto a poli(1vinil-imidazol) o poli(4-vinil-piridina), o por co-polimerización de, por ejemplo, un complejo 4-vinil-2,2’-bipiridil osmio, rutenio o cobalto con 1-vinil-imidazol o 4-vinil piridina.

Típicamente, la proporción de complejo de metal de transición de osmio o rutenio a grupos imidazol y/o piridina de los polímeros redox no lixiviables varía de 1:20 a 1:1, preferiblemente de 1:15 a 1:2 y, más preferiblemente, de 1:10 a 1:4. Generalmente, los potenciales redox dependen, al menos en parte del polímero siendo el orden de potenciales redox poli(ácido acrílico) < PVI < PVP.

Se puede usar una gran variedad de procedimientos para inmovilizar un polímero redox sobre la superficie de un electrodo. Un procedimiento es la inmovilización por adsorción. Este procedimiento es particularmente útil para polímeros redox con pesos moleculares relativamente altos. El peso molecular de un polímero se puede aumentar, por ejemplo, por reticulación. El polímero del polímero redox puede contener grupos funcionales, como por ejemplo hidrazida, amina, alcohol, nitrógeno heterocíclico, vinilo, alilo y grupos ácido carboxílico, que se pueden reticular usando un agente de reticulación. Estos grupos funcionales se pueden proporcionar al polímero o uno o más de los copolímeros. Como alternativa o adicionalmente, los grupos funcionales se pueden añadir mediante una reacción, como por ejemplo, por cuaternización. Un ejemplo es la cuaternización de PVP con grupos bromoetilamina.

Los agentes de reticulación adecuados incluyen, por ejemplo, moléculas que tienen dos o más grupos funcionales epóxido (por ejemplo, poli(etilenglicol)diglicidil éter (PEGDGE)), aldehído, aziridina, haluro de alquilo y azida o combinaciones de los mismos. Cuando un polímero tiene múltiples funciones acrilato se puede reticular con un di-o politiol; cuando tiene múltiples funciones tiol se puede reticular con un di-o poliacrilato. Otros ejemplos de agentes de reticulación incluyen compuestos que activan el ácido carboxílico u otros grupos ácidos funcionales para condensación con aminas u otros compuestos de nitrógeno. Estos agentes de reticulación incluyen carboiimidas o compuesto con grupos funcionales activos N-hidroxisuccimida o imidato. Aún otros ejemplos de agentes de reticulación son quinonas (por ejemplo, tetraclorobenzoquinona y tetracianoquinodimetano) y cloruro cianúrico. También se pueden usar otros agentes de reticulación. En algunas realizaciones, no se necesita un agente de reticulación adicional. Un análisis adicional y ejemplos de reticulación y agentes de reticulación se encuentran en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.262.035; 5.262.305; 5.320.725; 5.264.104; 5.264.105; 5.356.786 y 5.593.852.

En otra realización, el polímero redox se inmoviliza por la funcionalización de la superficie del electrodo y después por enlace químico, a menudo covalente, del polímero redox a los grupos funcionales en la superficie del electrodo. Un ejemplo de este tipo de inmovilización comienza con poli(4-vinil piridina). Los anillos de piridina del polímero se complejan, en parte, con una especie reducible/oxidable, como por ejemplo, [Os(bpy)2Cl]+/2+ en la que bpy es 2,2’bipiridina. Parte de los anillos de piridina se cuaternizan por reacción con 2-bromoetilamina. Después, el polímero se reticula, por ejemplo, usando un diepóxido, como por ejemplo, éter de poli(etilenglicol)diglicidilo.

Las superficies de carbono se pueden modificar por unión de un polímero redox, por ejemplo, por electrorreducción de una sal de diazonio. Como ilustración, la reducción de una sal de diazonio formada tras diazotación de ácido paminobenzoico modifica una superficie de carbono con grupos funcionales ácido fenilcarboxílico. Estos grupos funcionales pueden ser activados por una carbodiimida, como por ejemplo clorhidrato de 1-etil-3-(3dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC). Los grupos funcionales activos se unen con una pareja redox con funcionalidad amina, como por ejemplo el polímero redox que contiene osmio cuaternizado descrito anteriormente o 2-aminoetilferroceno, para formar la pareja redox.

De manera similar, se pueden funcionalizar oro y otras superficie metálicas, por ejemplo, mediante aminas, como por ejemplo cistamina, o mediante un ácido carboxílico, como por ejemplo ácido tióctico. Una pareja redox, como por ejemplo, [Os(bpy)2(piridina-4-carboxilato)Cl]0/+ , se activa mediante clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) para formar una O-acil-isourea reactiva que reacciona con la amina unida a oro para formar una amida. El grupo funcional ácido carboxílico de ácido tióctico se puede activar con EDC para unir una amina polimérica o proteica para formar una amida.

Cuando la enzima usada es PQQ glucosa deshidrogenasa o glucosa oxidasa los mediadores redox no lixiviables preferidos tienen un potencial redox entre aproximadamente -300 mV y aproximadamente +400 mV frente al electrodo patrón de calomelano (SCE). Los mediadores redox no lixiviables más preferidos tienen centro redox de osmio y un potencial redox más negativo de +100 mV frente a SCE, más preferiblemente el potencial redox es más negativo de 0 mV frente a SCE y, más preferiblemente, es casi -150 mV frente a SCE.

Al menos en algunos casos, los mediadores redox de los detectores se pueden oxidar al aire. Esto significa que el mediador redox se oxida al aire, preferiblemente, que al menos el 90% del mediador está en estado oxidado antes de la introducción de la muestra en el detector. Los mediadores redox que se oxidan al aire incluyen cationes de osmio complejados con dos ligandos mono-, di-o polialcoxi-2,2’-bipiridina o mono-, di-o polialcoxi-1,10-fenantrolina, no siendo necesario que los dos ligandos sean iguales, y complejados adicionalmente con polímeros u otros ligandos que tienen grupos funcionales piridina e imidazol. En particular, Os[4,4’-dimetoxi-2,2’-bipiridina]2Cl+/+2 complejado con poli(4-vinil piridina) o poli(1-vinil imidazol) consigue aproximadamente una oxidación del 90% o mayor al aire. La oxidación al aire del mediador redox puede tener lugar mientras el mediador redox es un sólido, como por ejemplo cuando está recubierto en el detector en estado seco y almacenado. Como alternativa, la oxidación al aire del mediador redox puede tener lugar mientras el mediador redox está en solución, como por ejemplo, aplicándose al detector antes de la disolución y secando. En el caso en el que el mediador redox se oxida al aire en solución, la solución que contiene el mediador redox se puede mantener en almacén durante un periodo de tiempo suficiente para que el aire oxide al mediador antes de usar la solución en el procedimiento de fabricación.

Segundo agente de transferencia de electrones

En una realización preferida de la invención, el detector incluye un mediador redox y un segundo agente de transferencia de electrones que puede transferir electrones hacia o desde el mediador redox y el analito. El segundo agente de transferencia de electrones puede ser difusible o puede ser no lixiviable (por ejemplo, atrapado en o unido de forma coordinada, covalente o iónica al polímero redox). Un ejemplo de un segundo agente de transferencia de electrones adecuado es una enzima que cataliza una reacción de un analito. Por ejemplo, cuando el analito es glucosa se usa una glucosa oxidasa o glucosa deshidrogenasa, como por ejemplo pirroloquinolina quinona glucosa deshidrogenasa (PQQ). Una lactato oxidasa ocupa este papel cuando el analito es lactato. Para otros analitos se pueden usar otras enzimas. Estas enzimas catalizan la hidrólisis de un analito transfiriendo electrones entre el analito y el electrodo por el mediador redox. En algunas realizaciones, el segundo agente de transferencia de electrones es no lixiviable y, más preferiblemente, está inmovilizado en el electrodo de trabajo para evitar la lixiviación no deseada del agente en la muestra. Esto se consigue, por ejemplo, por reticulación del segundo agente de transferencia de electrones no lixiviable con el mediador redox no lixiviable, proporcionando así una capa detectora con componentes no lixiviables en el electrodo de trabajo. En otras realizaciones, el segundo agente de transferencia de electrones es difusible (y puede disponerse sobre una superficie de la cámara de muestra o ponerse en la muestra).

Contraelectrodo

El contraelectrodo 24, como se ilustra en las figuras 1-4, se puede construir de una manera similar a la del electrodo de trabajo 22. El contraelectrodo 24 puede ser también un contraelectrodo/electrodo de referencia. Como alternativa, se puede proporcionar un electrodo de referencia diferente en contacto con la cámara de muestra. Los materiales adecuados para el contraelectrodo/electrodo de referencia o electrodo de referencia incluyen Ag/AgCl o Ag/AgBr impresos en un material de base no conductor o cloruro de plata en una base metálica de plata. Se pueden usar los mismos materiales y procedimientos para preparar el contraelectrodo que los disponibles para construir el electrodo de trabajo 22, aunque también se pueden materiales y procedimientos diferentes. Se puede proporcionar una lengüeta 25 en el electrodo para conectarlo de manera conveniente a los elementos electrónicos externos (no mostrados), como por ejemplo un culombímetro, un potenciostato u otro dispositivo de medida.

Configuración del electrodo

En una realización de la invención, el electrodo de trabajo 22 y el contraelectrodo 24 se disponen enfrentados entre sí para formar un par de electrones enfrentados como se describe en las figuras 1 y 3. En esta configuración preferida, la cámara de muestra 26 se dispone, típicamente, entre los dos electrodos. Para esta configuración de electrodos enfrentados, es preferible que los electrodos estén separados por una distancia de no más de aproximadamente 0,2 mm (es decir, al menos una parte del electrodo de trabajo está separada de una parte del contraelectrodo por no más de 200 µm), preferiblemente no más de 100 µm y, más preferiblemente, no más de 50 µm.

No es necesario que los electrodos estén enfrentados directamente entre sí; pueden están ligeramente desfasados. Además, no es necesario que los dos electrodos sean del mismo tamaño. Preferiblemente, el contraelectrodo 24 es al menos tan grande como la superficie de trabajo del electrodo de trabajo 22. El contraelectrodo 22 se puede formar con púas en forma de peine. Otras proporciones de configuración del contraelectrodo y del electrodo de trabajo están dentro del alcance de la invención. Sin embargo, para esta realización particular, la distancia de separación entre al menos una parte del electrodo de trabajo y alguna parte del contraelectrodo preferiblemente no excede los límites especificados en lo anterior.

Las figuras 11A, 11B y 11C ilustran diferentes realizaciones de parte de electrodos enfrentados 22, 24, como se ha descrito anteriormente. Una zona 21 de solapamiento entre los dos electrodos 22 y 24 corresponde, típicamente, a la zona de medida en la que se analizará la muestra. Cada uno de los electrodos 22, 24 es una superficie conductora y actúa como una placa de un capacitor. La zona de medida entre los electrodos 22, 24 actúa como una capa dieléctrica entre las placas. Por lo tanto, hay una capacitancia entre los dos electrodos 22, 24. Esta capacitancia es una función del tamaño de los electrodos solapantes 22, 24, la separación entre los electrodos 22, 24 y la constante dieléctrica del material entre los electrodos 22, 24. Por lo tanto, si se conoce el tamaño de la zona 21 de los electrodos solapantes 22, 24 y la constante dieléctrica del material entre los electrodos (por ejemplo, aire o un material adsorbente), entonces la separación entre los electrodos se puede calcular para determinar el volumen de la zona de medida.

La figura 11A ilustra una realización de la invención en la que los electrodos 22, 24 están situados en una disposición enfrentada. Para que la capacitancia sea uniforme entre detectores de analito construidos de manera similar que tienen esta configuración de detector particular, el registro (es decir, el posicionamiento de los dos electrodos entre sí) debería ser uniforme. Si la posición de cualquiera de los electrodos se modifica en el plano x-y desde la posición mostrada en la figura 11A, entonces cambia el tamaño del solape y, por lo tanto, la capacitancia. El mismo principio se mantiene para el volumen de la zona de medida.

Las figuras 11B y 11C ilustran otras realizaciones de la invención con los electrodos 22, 24 en una disposición enfrentada. En estas disposiciones particulares, se puede modificar la posición de cualquiera de los electrodos, al menos una distancia mínima, en el plano x-y respecto al otro electrodo sin un cambio de capacitancia o de volumen de la zona de medida. En estas disposiciones de electrodo, cada electrodo 22, 24 incluye un brazo 122, 124, respectivamente, que solapa con el brazo correspondiente del otro electrodo. Los dos brazos 122, 124 no son paralelos entre sí (como se ilustra en la figura 11A); en ocasiones, los brazos 122, 124 están dispuestos entre sí formando un ángulo 123, que es mayor de cero. Además, los dos brazos 122, 124 se extienden más allá de la zona 21 del solape (es decir, cada brazo tiene una longitud extra que corresponde a la diferencia entre la longitud del brazo 222, 224, respectivamente, y el ancho 121 del solape 21). Con estas disposiciones de electrodos, puede haber una cierta cantidad de imprecisión permitida en el registro de los electrodos 22, 24 que no cambia la capacitancia de la disposición de electrodos. Una cantidad deseada de imprecisión permitida en el registro se puede diseñar en la disposición de electrodos disponiendo un ángulo de variación 123 en el que los brazos 122, 124 solapan y el tamaño de la longitud extra de cada brazo 122, 124 respecto al ancho 121 de la zona 21 de solape. Típicamente, lo más cerca que están los brazos 122, 124 de ser perpendiculares (es decir, el ángulo 123 es de 90º) mayor es la imprecisión permitida. También, cuanto más grande sea la longitud de cada brazo 122, 124 (que pueden ser ambos de la misma longitud o tener longitudes diferentes) respecto al ancho 121 de la zona 21 de solape, mayor será la imprecisión permitida. A la inversa, cuanto más grande sea la cantidad de imprecisión permitida, mayor será el tamaño de los electrodos (para un ancho, espesor de electrodo dado y ángulo un 123 de intersección dado con el otro electrodo). Por lo tanto, la distancia mínima que se puede modificar un electrodo respecto al otro se equilibra contra la cantidad de material necesario para los electrodos. Típicamente, el ángulo 123 de los intervalos de intersección es de 5 a 90 grados, preferiblemente de 30 a 90 grados, y más preferiblemente de 60 a 90 grados. Típicamente, la proporción de longitud extra de un brazo 122, 124 (que corresponde a la diferencia entre la longitud del brazo 222, 224 y al ancho 121 de la zona 21 de solape) frente al ancho 121 de la zona 21 de solape varía entre 0,1:1 a 50:1, preferiblemente de 1:1 a 15:1, y más preferiblemente de 4:1 a 10:1.

En otra realización de la invención, los dos electrodos 22, 24 son coplanares como se muestra en la figura 2. En este caso, la cámara de muestra 26 está en contacto con ambos electrodos y se une por el lado opuesto a los electrodos mediante una base inerte no conductora 30. Los materiales adecuados para la base inerte incluyen materiales no conductores como por ejemplo poliéster.

También son posibles otras configuraciones de los detectores de la invención. Por ejemplo, los dos electrodos pueden estar formados sobre superficies que forman un ángulo entre sí. Una de dichas configuraciones tendría electrodos sobre superficies que forman un ángulo recto. Otra configuración posible tiene los electrodos en una superficie curva como el interior de un tubo. Los electrodos de trabajo y contraelectrodo se pueden disponer de manera que se enfrenten entre sí desde lados opuestos del tubo. Este es otro ejemplo de un par de electrodos enfrentados. Como alternativa, los electrodos se pueden colocar cerca uno del otro en la pared del tubo (por ejemplo, uno en la parte superior del tubo y el otro en un lateral del mismo).

En cualquiera de las configuraciones los dos electrodos se deben configurar de manera que no hagan contacto eléctrico directo cuando los electrodos enfrentados están separados, como media, no más de aproximadamente 100 µm.

Se puede usar un espaciador 28 para mantener separados los electrodos cuando los electrodos se enfrentan como se describe en las figuras 1 y 3. El espaciador se construye, típicamente a partir de un material inerte no conductor como por ejemplo un adhesivo sensible a presión, poliéster, MylarTM, KevlarTM o cualquier otra película polimérica fina y fuerte o, como alternativa, una película polimérica fina como por ejemplo una película de TeflonTM, elegida por su inertividad química. Además, para evitar el contacto entre los electrodos, el espaciador 28 a menudo funciona como una parte del límite para la cámara de muestra 26 como se muestra en las figuras 1-4. Otros espaciadores incluyen capas de adhesivo y cinta adhesiva por las dos caras (por ejemplo, una película que lleva adhesivo en ambos lados de la película).

Cámara de muestra

La cámara de muestra 26 se define, típicamente, por una combinación de los electrodos 22, 24, una base inerte 30 y un espaciador 28 como se muestra en las figuras 1-4. Dentro de esta cámara de muestra está contenida una zona de medida y el la zona de la cámara de muestra que sólo contiene la parte de la muestra que se analiza durante el ensayo del analito. En la realización de la invención ilustrada en las figuras 1 y 2, la cámara de muestra 26 es el espacio entre los dos electrodos 22, 24 y/o la base inerte 30. En esta realización, la cámara de muestra tiene un volumen que preferiblemente no es mayor de aproximadamente 1 µl, más preferiblemente no más de aproximadamente 0,5 µl y más preferiblemente no más de aproximadamente 0,25 µl. En la realización de la invención descrita en las figuras 1 y 2, la zona de medida tiene un volumen que es aproximadamente igual al volumen de la cámara de muestra. En una realización preferida, la zona de medida incluye el 80% de la cámara de muestra, el 90% en una realización más preferida y aproximadamente el 100% en una realización aún más preferida.

En otra realización de la invención, mostrada en la figura 3, la cámara de muestra 26 incluye mucho más espacio que la zona próxima a los electrodos 22, 24. Esta configuración hace posible proporcionar múltiples electrodos en contacto con una o más cámaras de muestra, como se muestra en la figura 5. En esta realización, la cámara de muestra 26 está dimensionada preferiblemente para contener un volumen de no más de aproximadamente 1 µl, más preferiblemente no más de aproximadamente 0,5 µl y aún más preferiblemente no más de aproximadamente 0,25 µl. La zona de medida (es decir, la zona que contiene el volumen de muestra a analizar) generalmente se dimensiona para contener un volumen de muestra de no más de aproximadamente 1 µl, preferiblemente no más de aproximadamente 0,5 µl, más preferiblemente no más de aproximadamente 0,25 µl, y más preferiblemente no más de aproximadamente 0,1 µl. Una configuración particularmente útil de esta realización sitúa el electrodo de trabajo 22 y el contraelectrodo 24 enfrentados entre sí, como se muestra en la figura 3. En esta realización, la zona de medida, correspondiente a la zona que contiene la parte de muestra que se analizará, es la parte de la cámara de muestra 26 unida por la superficie de trabajo del electrodo de trabajo y dispuesta entre los dos electrodos enfrentados.

En las dos realizaciones analizadas anteriormente, el espesor de la cámara de muestra y de la zona de medida corresponde, típicamente al espesor del espaciador 28 (por ejemplo, la distancia entre los electrodos de las figuras 1 y 3, o la distancia entre los electrodos y la base inerte en la figura 2). El espaciador puede ser, por ejemplo, un adhesivo o una cinta o película adhesiva por ambas caras. Preferiblemente, este espesor es pequeño para proveer la rápida electrolisis del analito, pues una mayor parte de la muestra estará en contacto con la superficie del electrodo para un volumen de muestra dado. Además, una cámara de muestra fina ayuda a reducir errores de la difusión del analito en la zona de medida de otras partes de la cámara de muestra durante el ensayo del analito, porque el tiempo de difusión en relativamente largo para el tiempo de medida. Típicamente, el espesor de la cámara de muestra no es más de aproximadamente 0,2 mm. Preferiblemente, el espesor de la cámara de muestra no es más de aproximadamente 0,1 mm y, más preferiblemente, el espesor de la cámara de muestra es de aproximadamente 0,05 mm o menos.

La cámara de muestra se puede formar por otros procedimientos. Los procedimientos ejemplares incluyen embutición, indentación o cualquier otra forma de formar un hueco en un sustrato en el que se forma el electrodo de trabajo 22 o el contraelectrodo 24. Las figuras 12A y 12B ilustran una realización de esta estructura. En primer lugar, se forma una capa conductora 100 sobre un material de base no conductor inerte 102. Como se ha descrito anteriormente, la capa conductora 100 puede incluir oro, carbono, platino, dióxido de rutenio, paladio u otro material no corrosivo. El material de base no conductor inerte 102 se puede preparar usando un poliéster, otros polímeros u otros materiales deformables no conductores. Después se forma un hueco 104 en una zona del material de base no conductor 102 de manera que al menos una parte de la capa conductora 100 se incluye en el hueco 104. El hueco 104 se puede formar usando diversas técnicas incluyendo indentación, deformación u otro tipo de presionar el material de base 102. Un procedimiento ejemplar adicional para formar el hueco incluye embutir el material de base

102. Por ejemplo, el material de base 102 se puede poner en contacto con un rodillo de embutición o estampación que tiene partes elevadas, tales como órganos o canales de perforación, para formar el hueco 104. En algunas realizaciones el material de base 102 se puede calentar para ablandar el material.

El hueco 104 puede ser circular, ovalado, rectangular o de cualquier otra forma regular o irregular. Como alternativa, el hueco 104 se puede formar como un canal que se extiende a lo largo de la parte del material de base 102. La capa conductora 100 se puede extender a lo largo de todo el canal o sólo en un parte del canal. La zona de medida se puede restringir a una zona particular en el interior del canal, por ejemplo, depositando la capa detectora 32 sólo en esa parte de la capa conductora 100 en la zona particular del canal. Como alternativa, la zona de medida se puede definir poniendo un segundo electrodo 107 sólo sobre la zona deseada del primer electrodo 105.

Al menos una parte, y en algunos casos, toda la capa conductora 100 se sitúa en el hueco 104. Esta parte de la capa conductora 100 puede actuar un primer electrodo 105 (un contraelectrodo o un electrodo de trabajo). Si la capa conductora 100 forma el electrodo de trabajo, entonces se puede formar una capa detectora 32 sobre una parte de la capa conductora 100 depositando un mediador redox no lixiviable y/o un segundo agente de transferencia de electrones en el hueco 104, como se muestra en la figura 12B. Si se usa un mediador redox o un segundo agente de transferencia de electrones difusible, entonces el material difusible se puede depositar en cualquier superficie en la cámara de muestra o en la muestra.

Después se forma un segundo electrodo 107 depositando una segunda capa conductora sobre un segundo material de base 106. Este segundo electrodo 107 se sitúa entonces sobre el primer electrodo 105 en una disposición enfrentada. Aunque no se ilustra, si el mediador redox no es lixiviable se entenderá que si el primer electrodo 105 tuviera que funcionar como contraelectrodo, entonces la capa detectora 32 se depositaría sobre el segundo electrodo 107 que entonces funcionaría como el electrodo de trabajo. Sin en embargo, si el mediador redox es difusible, el mediador redox se puede disponer sobre cualquier superficie de la cámara de muestra o se puede poner en la muestra.

En una realización, el segundo material de base 106 descansa sobre una parte del primer material de base 102 y/o la capa conductora 100 que no está deprimida, de manera que el segundo electrodo 107 se extiende hacia el hueco. En otra realización, hay un espaciador (no mostrado) entre el primer y el segundo material de base 102, 106. En esta realización, el segundo electrodo 107 se puede extender o no hacia el hueco. En cualquier caso, el primer y segundo electrodos 105, 107 no hace contacto, de otra manera, los electrodos se acortarían.

La profundidad del hueco 104 y el volumen de la capa conductora 100, la capa detectora 32 y la parte, si la hubiera, del segundo electrodo 107 en el hueco 104 determina el volumen de la zona de medida. Por lo tanto, la predecibilidad del volumen de la zona de medida depende de la extensión en que la formación del hueco 104 es uniforme.

Además de la capa conductora 100, se puede depositar una cada adsorbente 103, descrita con detalle a continuación, sobre el material de base 102 antes de formar el hueco 104, como se muestra en la figura 14A. El material adsorbente 103 se puede indentar, embutir o deformar de cualquier otra forma con la capa conductora 100 y el material de base 102, como se muestra en la figura 14B. Como alternativa, el material adsorbente se puede depositar después de que la capa conductora 100 y el material de base 102 se indentan, embuten o deforman de cualquier otra manera para preparar el hueco 104.

En otro procedimiento ejemplar para formar el detector de analitos, se forma un hueco 114 en un primer material de base 112, como se muestra en las figuras 13A y 13B. El hueco se puede formar por indentación, embutición, ataque químico (por ejemplo, usando procedimientos fotolitográficos o retirado con láser de una parte del material de base)

o deformando de cualquier otra manera o retirando el material del base 112. Después, se forma una primera capa conductora 110 en el hueco 114. Se puede usar cualquiera de los materiales analizados anteriormente. Un material preferido es una tinta conductora, como por ejemplo una tinta de carbono conductora disponible, por ejemplo, en Ercon, Inc. (Wareham, MA). La tinta conductora contiene, típicamente, metal o carbono disuelto o disperso en un disolvente o dispersante. Cuando el disolvente o dispersante se retira, el metal o carbono forma una capa conductora 110 que se puede usar como primer electrodo 115. Se puede formar un segundo electrodo 117 sobre un segundo material de base 116 y colocarse sobre el hueco 114, como se ha descrito anteriormente. En las realizaciones que tienen un mediador redox no lixiviable, se forma una capa detectora 32 sobre el primer electrodo 115 para formar un electrodo de trabajo, como se muestra en la figura 13B. En otras realizaciones que tienen un mediador redox no lixiviable, la capa detectora 32 se puede formar sobre el segundo electrodo 117 para formar un electrodo de trabajo. Como alternativa, si se una un mediador redox difusible, entonces el electrodo de trabajo no necesita incluir la capa detectora dispuesta sobre el mismo. De hecho, no se necesita ninguna capa detectora porque el mediador redox se puede poner en la muestra e igualmente para un segundo agente de transferencia de electrones difusible, si hubiera uno presente. Cualquier componente difusible se puede disponer independientemente sobre cualquier superficie de la cámara de muestra o poner en la muestra. Además, se puede formar un material adsorbente (no mostrado) en el hueco, por ejemplo, en el primer electro 115.

En la tinta conductora también se puede incluir un aglutinante, como por ejemplo, una resina de poliuretano, un derivado de celulosa, un elastómero (por ejemplo, siliconas, dienos poliméricos o resinas de acrilonitrilo-butadienoestireno (ABS)), un polímero altamente fluorado o similares. El curado del aglutinante puede aumentar la conductividad de la capa conductora 110, sin embargo, el curado no es necesario. El procedimiento de curado del aglutinante puede depender de la naturaleza del aglutinante particular que se use. Algunos aglutinantes se curan por calor y/o luz ultravioleta.

Estas estructuras permiten la formación de detectores electroquímicos en los que el volumen de la zona de medida depende, al menos en parte, de la precisión y reproducibilidad del hueco 104. Se puede usar embutición, ataque con láser, ataque fotolitográfico y otros procedimientos para preparar un hueco reproducible 104, incluso en la escala de 200 µm o menor.

Material absorbente

La cámara de muestra se puede vaciar antes de poner la muestra en la cámara. Como alternativa, la cámara de muestra puede incluir un material adsorbente 34 para adsorber y contener un fluido durante el procedimiento de medida. Los materiales adsorbentes adecuados incluyen poliéster, nylon, celulosa y derivados de celulosa como por ejemplo nitrocelulosa. El material adsorbente facilita la captación de muestras de pequeño volumen mediante una acción adsorbente que puede complementar o, preferiblemente, sustituir cualquier acción capilar de la cámara de muestra. Además o como alternativa, una parte o toda la pared de la cámara de muestra se puede recubrir con un tensioactivo, como por ejemplo Zonyl FSO.

En algunas realizaciones, el material adsorbente se deposita usando un líquido o suspensión en el que el material adsorbente se disuelve o dispersa. El disolvente o dispersante en el líquido o suspensión se puede conducir entonces mediante procedimientos de calentamiento o evaporación. Los materiales adsorbentes adecuados incluyen, por ejemplo, polvos de celulosa o nylon disueltos o dispersos en un disolvente o dispersante adecuado, tales como agua. El disolvente o dispersante particular debe ser compatible también con el material del electrodo de trabajo 22 (por ejemplo, el disolvente o dispersante no debería disolver al electrodo).

Una de las funciones más importantes del material adsorbente es reducir el volumen de fluido necesario para llenar la cámara de muestra y la zona de medida correspondiente del detector. El volumen real de muestra en la zona de medida se determina parcialmente por la cantidad de espacio vacío en el interior del material adsorbente. Típicamente, los adsorbentes adecuados comprenden aproximadamente de aproximadamente 5% a aproximadamente el 50% de espacio vacío. Preferiblemente, el material adsorbente comprende de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 25% de espacio vacío.

El desplazamiento de fluido por el material adsorbente es ventajoso. Añadiendo en adsorbente, se necesita menos muestra para llenar la cámara de muestra 26. Esto reduce el volumen de muestra que se necesita para obtener una medida y también reduce el tiempo necesario para electrolizar la muestra.

El material adsorbente 34 puede incluir una lengüeta 33 que se prepara con el mismo material que el adsorbente y que se extiende desde el detector, o desde una abertura del detector, de manera que la muestra se puede poner en contacto con la lengüeta 33, adsorber por la lengüeta y transportar a la cámara de muestra 26 por la acción adsorbente del material adsorbente 34. Esto procedimiento un procedimiento preferido para dirigir la muestra a la cámara de muestra 26. Por ejemplo, el detector se puede poner en contacto con una zona de una animal (incluyendo seres humanos) que se ha perforado con un bisturí para extraer sangre. La sangre se pone en contacto con la lengüeta 33 y se extrae a al cámara de muestra 26 por la acción adsorbente del adsorbente 34. La transferencia directa de la muestra al detector es especialmente importante cuando la muestra es muy pequeña, por ejemplo cuando se usa el bisturí para perforar una parte del animal que cuyo suministro es pequeño con vasos capilares cercanos a la superficies y proporciona un volumen de muestra de sangre de 1 µl o menos.

Se pueden usar procedimientos distintos de la acción adsorbente de un adsorbente para transportar la muestra a la cámara de muestra o a la zona de medida. Los ejemplos de dichos procedimientos de trasporte incluyen la aplicación de presión a una muestra para empujarla dentro de la cámara de muestra, la creación de un vacío mediante una bomba u otro procedimiento de producción de vacío en la cámara de muestra para tirar de la muestra hacia la cámara, por acción capilar debida a la tensión interfacial de la muestra con las paredes de una cámara de muestra fina, así como la acción adsorbente de un material adsorbente.

El detector se puede usar junto con una corriente de muestra de fluido. En esta configuración, la corriente de muestra se prepara para que fluya a través de la cámara de muestra. El flujo se detiene periódicamente y se determina la concentración del analito por un procedimiento electroquímico, como por ejemplo culombimetría. Después de la medida, se reanuda el flujo, retirando la muestra del detector. Como alternativa, la muestra puede fluir a través de la cámara a una velocidad muy lenta, tal que todo el analito se electroliza al pasar, dando una corriente dependiente sólo de la concentración de analito y del caudal.

Se pueden usar otras cargas para completar la zona de medida y reducir el volumen de la muestra. Por ejemplo, se pueden depositar perlas de vidrio en la zona de medida para ocupar espacio. Preferiblemente, estas cargas son hidrófilas, de manera que el fluido corporal puede fluir fácilmente a la zona de medida. En algunos casos, como por ejemplo con perlas de vidrio con una gran área superficial, estas cargas pueden adsorber también el fluido corporal a la zona de medida debido a su gran área superficial e hidrofilicidad.

El ensamblaje del detector en su conjunto se mantiene unidos firmemente para asegurar que la muestra permanece en contacto con los electrodos y que la cámara de muestra y la zona de medida mantienen el mismo volumen. Esta es una importante consideración en el análisis culombimétrico de una muestra, donde se necesita la medida de un volumen de muestra definido. En las figura 1 y 2 se describe un procedimiento para mantener unido al detector. Se proporcionan dos placas 38 en extremos opuestos del detector. Estas placas se construyen, típicamente, de materiales no conductores tales como plásticos. Las placas se diseñan de manera que puedan mantener unido al detector entre las dos placas. Los dispositivos de mantenimiento incluyen adhesivos, abrazaderas, tuercas y pernos, tornillos y similares.

Diseños alternativos del detector

Las figuras 18A a 18C ilustran un diseño alternativo del detector para formar detectores de película fina. El detector incluye un primer sustrato 500 sobre el que se forma un electrodo de trabajo 502. El electrodo de trabajo 502 incluye una zona de contacto 503 para conectar con los elementos electrónicos externos. Un espaciador 504 (figura 18B), como por ejemplo una capa de adhesivo o una cinta de doble cara adhesiva, define un canal 506 para producir una cámara de muestra para el detector. Se forman dos contraelectrodos (o contraelectrodos/electrodos de referencia) 520, 512 sobre un segundo sustrato 508, como se muestra en la figura 18C (invertida con respecto a las figuras 18A y 18B para mostrar el costado del electrodo). Esta disposición de contraelectrodos múltiples puede proporcionar una función indicadora de llenado, como se describe a continuación. Cada contraelectrodo 510, 512 tiene una zona de contacto 511, 513 para conectar con los elementos electrónicos externos. El segundo sustrato 508 se invierte y se pone sobre el primer sustrato 500, con el espaciador 504 entre medias, de manera que el electrodo de trabajo 502 y los dos contraelectrodos 510, 512 se enfrentan en la zona del canal 506.

En algunos casos, el contraelectrodo 510 cerca de la entrada 514 del canal 506 tiene un área superficial en la cámara de muestra que es al menos dos veces mayor que el otro contraelectrodo 512, y puede ser al menos cinco o diez veces mayor. El mediador redox y/o el segundo agente de transferencia de electrones no lixiviable o difusible se puede proporcionar sobre cualquiera de de los sustratos primero o segundo 500, 508 en una zona correspondiente al canal 506, como se ha descrito anteriormente.

El electrodo de trabajo y el contraelectrodo se pueden formar para cubrir toda la zona del canal (excepto un pequeño espacio entre los dos contraelectrodos). En esta realización, la cámara de muestra y la zona de medida son eficazmente la misma y tienen el mismo volumen. En otras realizaciones, la zona de medida tiene, por ejemplo, un 80% o 90% del volumen de la cámara de muestra. Se entenderá que se pueden preparar detectores similares usando un contraelectrodo o tres o más contraelectrodos. También se entenderá que se pueden proporcionar múltiples electrodos de trabajo al detector.

Un ejemplo de un procedimiento para preparar los detectores de película fina se describe con respecto a la disposición del detector descrita en las figuras 18A a 18C y se puede usar para preparar una variedad de disposiciones diferentes del detector, incluyendo la descrita anteriormente. Se proporciona un sustrato, como por ejemplo un sustrato plástico. El sustrato puede ser una hoja individual o un rollo continuo en una red. Este sustrato se puede usar para preparar un solo detector o parar preparar múltiples detectores. Los múltiples detectores se pueden formar sobre un sustrato 1000 como electrodos de trabajo 1010 y contraelectrodo(s) 1020. En algunas realizaciones, el sustrato se puede entallar y replegar para juntar los electrodos de trabajo 1010 y contraelectrodo(s) 1020 para formar el detector. En algunas realizaciones, como se ilustra en la figura 31A, los electrodos de trabajo 1010 individuales (y, en una sección separada los contraelectrodo(s) 1020) se pueden formar cera unos de otros sobre el sustrato 1000, para reducir el material residual, como se ilustra en la figura 31A. En otras realizaciones, los electrodos de trabajo 1010 individuales (y, en una sección separada los contraelectrodo(s) 1020) se pueden espaciar entre sí, como se ilustra en la figura 31B. El resto del procedimiento se describe para la fabricación de múltiples detectores, pero se puede modificar fácilmente para formar detectores individuales.

Se forma carbono u otro material de electrodo (por ejemplo, un metal como por ejemplo oro o platino) sobre el sustrato para proporciona un electrodo de trabajo para cada detector. El carbono u otro material de electrodo se puede depositar por diversos procedimientos incluyendo imprimir una tinta de carbono o de metal, deposición de vapor y otros procedimientos.

Opcionalmente, se puede formar un material no conductor como por ejemplo una tinta no conductora al lado del electrodo de trabajo para proporcionar una superficie planar a lo largo del recorrido de la muestra de fluido. El material no conductor es adecuado para crear una superficie lisa para facilitar el llenado por acción capilar y/o para reducir la probabilidad de que queden atrapadas burbujas de aire cerca del electrodo de trabajo. Este material no conductor puede ser coloreado o incoloro y se puede formar sobre el sustrato por impresión u otras técnicas. El material no conductor se deposita antes de o después de la formación del electrodo de trabajo.

El contraelectrodo o contraelectrodos se forman sobre el sustrato. El contraelectrodo o los contraelectrodos se forman depositando carbono u otro material de electrodo sobre el sustrato. En una realización, el material del (de los) contraelectrodo (s) es una tinta de Ag/AgCl. El material del (de los) contraelectrodo (s) se puede depositar por diversos procedimientos, incluyendo impresión o deposición de vapor. En algunas realizaciones, el (los) contraelectrodo (s) se forman usando diferentes materiales y/o un electrodo es un contraelectrodo o contraelectrodo/electrodo de referencia y el otro electrodo es un referencia o contraelectrodo/electrodo de referencia.

En una realización, los electrodos de trabajo se forman en una primera mitad de una hoja o red polimérica y los contraelectrodos se forman en una segunda mitad de la hoja o red polimérica de manera que la hoja o red se puede replegar para que se superpongan los electrodos de trabajo y los contraelectrodos en una disposición enfrentada.

Se puede depositar un segundo material no conductor adyacente y/o entre el (los) contraelectrodo (s) para proporcionar una superficie planar a lo largo del recorrido de la muestra de fluido. Esto puede ser particularmente deseable en la zona entre los contraelectrodos que serán parte de la cámara de muestra para aplanar la superficie de la cámara de muestra. El material no conductor es adecuado para crear una superficie lisa para facilitar el llenado por acción capilar y/o para reducir la probabilidad de que queden atrapadas burbujas de aire entre o cerca del (de los) contraelectrodo (s). Este material no conductor puede ser coloreado o incoloro y se puede formar sobre el sustrato por impresión u otras técnicas. El material no conductor se deposita antes de o después de la formación del (de los ) contraelectrodo (s).

Se forma un espaciador adhesivo sobre al menos uno del sustrato/electrodo de trabajo y sustrato/contraelectrodo (s). El espaciador adhesivo puede ser una sola capa de adhesivo o una cinta adhesiva por las dos caras (por ejemplo, una película polimérica con adhesivo dispuesto en las superficies opuestas). Para formar el canal, el espaciador, opcionalmente provisto con uno o más revestimientos de liberación, se puede cortar (por ejemplo cortado con troquel) para retirar la parte de adhesivo que corresponde al canal antes de disponer el espaciador sobre el sustrato. Como alternativa, el adhesivo se puede imprimir o disponer de cualquier otra manera sobre el sustrato de acuerdo con un patrón que define la zona del canal. El espesor del espaciador determina, típicamente, el espaciado entre el electrodo de trabajo y los contraelectrodos. Cuando es necesaria la uniformidad de este espaciado entre los detectores (por ejemplo para medida culombimétricas), es importante la uniformidad del espesor del espaciador. Preferiblemente, el espesor no varía más de un ± 5% sobre el detector individual y/o entre los detectores individuales en un lote.

El mediador redox y/o el segundo agente de transferencia de electrones no lixiviable o difusible se disponen sobre el sustrato en al menos la zona de la cámara de muestra. Si cualquiera o ambos elementos es no lixiviable, este componente o componentes se pueden disponer sobre el electrodo de trabajo. Si cualquiera o ambos de estos componentes es difusible, este componente o componentes se puede disponer sobre cualquiera de las superficies del sustrato en la zona del canal. El mediador redox o el segundo agente de transferencia de electrones se pueden disponer independientemente o juntos sobre el sustrato antes de o después de disponer el espaciador. El mediador redox y/o el segundo agente de transferencia de electrones se pueden disponer mediante diversos procedimientos incluyendo, por ejemplo, impresión en pantalla, impresión por inyección, pulverización, pintado, lavado a lo largo de una fila o columna de electrodos alineados y/o adyacentes, y similares. Se pueden depositar otros componentes por separado o con el mediador redox y/o el segundo agente de transferencia de electrones incluyendo, por ejemplo, tensioactivos, polímeros, películas poliméricas, conservantes, aglutinantes, tampones y reticulantes.

Después de disponer el espaciador, el mediador redox, y el segundo agente de transferencia de electrones el sustrato se puede replegar para formar el detector. Las caras del sustrato se unen mediante el adhesivo del espaciador. Después de enlazar las caras juntas, el detector se puede cortar usando diversos procedimientos, incluyendo por ejemplo corte con troquel, rasuración o cualquier otra forma de corte del exceso de material de sustrato y separar los detectores individuales. En algunas realizaciones, se puede usar una combinación de procedimientos. Por ejemplo, algunas características se pueden cortar con troquel, mientras que el resto del detector se corta por ranuración. Como otra alternativa, los componentes del detector (por ejemplo, los componentes ilustrados en las figuras 18A y 18C) se pueden cortar primero de los sustratos y después juntar para formar el detector, uniendo adhesivamente los dos componentes usando el adhesivo espaciador.

La realización de un detector ilustrado en las figuras 18A a 18C es un ejemplo de un detector de llenado por la punta. Una construcción del detector alternativa se ilustra en las figuras 19A a 19C. Este es un detector de llenado lateral. La figura 19A ilustra un primer sustrato 520 con un electrodo de trabajo 522. La figura 19B ilustra un espaciador 524 que define un canal 526. La figura 19C (invertida con respecto a la figura 19A y 19B para ilustrar los electrodos) ilustra un segundo sustrato 528 con tres contraelectrodos (o contraelectrodo/electrodo de referencia) 530, 532, 534.

Este detector se puede preparar como se ha descrito anteriormente. La disposición simétrica de los contraelectrodos permite al detector llenarse desde el lado derecho o desde el izquierdo, según convenga para diestros o zurdos. Se entenderá, sin embargo, que se pueden formar disposiciones del detector similares usando uno, dos o cuatro o más contraelectrodo (s) y/o dos o más electrodos de trabajo. Las zonas festoneadas 536, 538 se pueden formar, por ejemplo por corte con troquel y, al menos en algunos casos, se pueden controlar con precisión para proporcionar una longitud de canal reproducible. Como disposición alternativa, los lados del detector pueden ser rectos para permitir al detector ser cortado del resto del sustrato y/o de los otros detectores ranurando el sustrato en direcciones paralelas usando, por ejemplo, un sistema de eje de cuchillas. Como se ilustra en las figura 19A, 19B y 19C, los extremos del detector pueden definir los extremos de la cámara de muestra y/o de la zona de medida. Controlando con precisión la distancia entre los cortes, a menudo se reduce la variabilidad de volumen de la cámara de muestra. En algunos casos, estos cortes son preferiblemente paralelos entre sí, ya que los cortes paralelos son los más fáciles para permitir la reproducibilidad.

Las figura 20A, 20B y 20C ilustran otro ejemplo de disposición de un detector de llenado lateral. La figura 20A ilustra un primer sustrato 540 con un electrodo de trabajo 542. La figura 20B ilustra un espaciador 544 que define un canal

546. La figura 20C (invertida con respecto a las figuras 20A y 20B) ilustra un segundo sustrato 548 con tres contraelectrodos (o contraelectrodos/electrodos de referencia) 550, 552, 554.

La figura 21A, 21B y 21C ilustran otro ejemplo de una disposición de un detector de llenado por la punta. La figura 21A ilustra un primer sustrato 560 con un electrodo de trabajo 562. La figura 21B ilustra un espaciador 564 que define un canal 566. La figura 21C (invertida con respecto a las figuras 21A y 21B) ilustra un segundo sustrato 568 con dos contraelectrodos (o contraelectrodos/electrodos de referencia) 570, 572. Se proporciona un orificio de venteo 574 (indicado como una región sombreada en la figura 21C) en el segundo sustrato. En la realización ilustrada, este orificio de venteo 574 se realiza sólo a través del sustrato 568 que lleva el (los) contraelectrodo (s) y, opcionalmente, el espaciador 564. En esta realización, el orificio de venteo puede estar formado, por ejemplo cortando con troquel una parte del sustrato. Este corte con troquel puede retirar una parte de al menos un contraelectrodo, aunque permanecerá una cantidad suficiente del contraelectrodo para contactar con la muestra en el canal y para la conexión eléctrica con un contacto en el otro extremo del detector. En otra realización, el orificio de venteo 574 se puede preparar a través de todas las capas o a través del primer sustrato y no del segundo sustrato.

En las figuras 22A, 22B y 22C se ilustra otra realización, con una forma diferente. Este detector incluye un primer sustrato 579 con al menos un electrodo de trabajo 580, como se ilustra en la figura 22A. El detector incluye también un espaciador 581 con un canal 582 formado en el espaciador 581, como se muestra en la figura 22B. El detector también incluye un segundo sustrato 583 con dos contraelectrodos 584, 585 como se muestra en la figura 22C (invertida respecto a las figuras 22A y 22B). Se corta una abertura de venteo 586 típicamente a través de todas las capas y se extiende desde un lado del detector. En algunas realizaciones, la abertura de venteo y la parte frontal 587 del detector se cortan simultáneamente con una distancia reproducible entre la abertura de venteo y la parte frontal 587 del detector para proporcionar una longitud reproducible para el canal 582 y el electrodo de trabajo 580. Las figuras 22A, 22B y 22C ilustran también otra característica que se puede usar con cualquier disposición del detector. Se puede formar una indentación 588 en la abertura de llenado del canal 582 para facilitar la extracción de fluido al interior del detector. En esta configuración, el fluido no está provisto de una cara plana, sino de una cana indentada que puede ayudar en la adsorción o llenado capilar del canal (es decir, la cámara de muestra). Esta configuración puede reducir también la probabilidad de que el usuario del detector bloquee el canal durante la recogida de la muestra. Un detector con caras planas se puede bloquear presionando la punta del detector de canto contra la piel.

Las figuras 23A, 23B y 23C ilustra otro ejemplo de una disposición de un detector de llenado lateral. La figura 23A ilustra un primer sustrato 640 con un electrodo de trabajo 642. La figura 23B ilustra un espaciador 664 que define un canal 646. La figura 23C (invertida con respecto a las figuras 23A y 23B) ilustra un segundo sustrato 648 con tres contraelectrodos (o contraelectrodos/electrodos de referencia) 650, 652, 654. Este detector se puede formar haciendo cortes rectos de los sustratos. Los detectores pueden ser adyacentes entre sí, como se ilustra en la figura 31A, que puede producir menos material residual. La longitud del canal 646 se define, típicamente, por dos cortes paralelos a lo largo de los lados 656, 658 de los detectores. Otra ventaja adicional del procesado, particularmente si los detectores se forman adyacentes entre sí, es que el mediador redox y/o el segundo agente de transferencia de electrones se puede disponer en el canal lavando una corriente continua de estos componentes a lo largo de una fila

: o columna de detectores adyacentes. Esto puede dar como resultado una mejor eficacia y menos gasto del mediador redox y/o del segundo agente de transferencia de electrones, comparada con otras técnicas, como por ejemplo poniendo individualmente estos componentes en el interior de canales individuales.

Las figuras 24A, 24B y 24C ilustran otra configuración del detector. Este detector incluye un primer sustrato 600 con al menos un electrodo de trabajo 602, como se ilustra en la figura 24A. El detector incluye también un espaciador 604 con un canal 606 formado en el espaciador 604, como se muestra en la figura 24B. El detector incluye también un segundo sustrato 608 con dos contraelectrodos 610, 612 como se muestra en la figura 24C (invertida respecto a las figura 24A y 24B). El detector puede incluir también, por ejemplo, un indicador, como por ejemplo una ranura 614

: o una extensión 616 desde el cuerpo del detector que indica al usuario qué lado se debe poner junto a la muestra. Esto puede ser particularmente importante cuando la lectura del detector sólo es correcta cuando la muestra entra desde un lado particular.

La figura 24B ilustra también otra característica opcional que se puede usar en cualquiera de las configuraciones del detector. En esta ilustración, la cámara de muestra 606 no se forma usando líneas rectas, si no que hay una zona expandida 618 en el interior de la cámara de muestra. Esto permite cámaras de muestra más grandes sin formar aberturas más grandes. Esta zona expandida se puede formar con cualquier forma incluyendo circular, cuadrada, rectangular y otras formas regulares e irregulares.

La figura 25 es un ejemplo de un detector ensamblado que ilustra otra disposición alternativa del detector para un detector de llenado lateral 620. Este detector incluye extensiones 622 a partir del cuerpo del detector 624 para indicar al usuario donde se proporcionan las aberturas de la cámara de muestra 626.

En la figura 32 se ilustra una característica adicional que es una vista lateral del detector desde el interior del medidor. La figura 32 ilustra un primer sustrato 1120 y un segundo sustrato 1130 que se extiende en el medidor desde el resto del detector 1100 (es decir, se rebaja la parte 1140 con respecto a los sustratos 1120 y 1130 de la figura 32). Los ejemplos de esta configuración se ilustran en las figuras 18A-18C y 24A-24C. Típicamente, el detector 1100 se acopla al medidor 1110 que incluye almohadillas de contacto (no mostrados) que ponen en contacto las zonas de contacto (por ejemplo las zonas 503, 511 y 513 en las figuras 18A y 18C) de los electrodos del detector 1100. El extremo del detector 1100 que contiene las zonas de contacto se puede deslizar dentro del medidor 1110. Es típicamente importante que las almohadillas de contacto del medidor 1110 hagan contacto con las zonas de contacto correctas del detector de manera que el electrodo de trabajo y el (los) contraelectrodo (s) se acoplen correctamente al medidor. En algunos casos, el detector se configura de manera que la zona de contacto para el electrodo de trabajo sobre el primer sustrato 1120 tenga un ancho diferente w1 que el ancho w2 para la zona de contacto del segundo sustrato 1130 que lleva el (los) contraelectrodo (s). Los ejemplos de configuraciones de electrodos con esta estructura se proporcionan en las figura 18A-18C y 24A-24C. Para asegurar la inserción correcta del detector 1100 en el medidor 1110, el medidor 1110 puede incluir una zona elevada 1140 que evita o impide la inserción del detector en una dirección inapropiada. Por ejemplo, el ancho w2 de la zona de contacto del segundo sustrato 1130 puede ser más ancho que el ancho w1 de la zona de contacto del primer sustrato 1120, como se ilustra en la figura 32. En este caso, la zona elevada 1140 se coloca para permitir que el detector 1100 se deslice dentro del medidor de manera que el primer sustrato 1120 esté próximo a la superficie 1150 desde que la zona elevada 1140 sobresale, pero prevendría o impediría que el segundo sustrato 1130 esté cerca de la superficie 1150 desde la que la zona elevada 1140 sobresale. Se pueden usar objetos distintos de la zona elevada para guiar al usuario en la introducción correcta del detector dentro del medidor.

Dispositivo integrado de toma de muestras y medida de analitos

Se conocen diversos planteamientos en la técnica para tomar y/o transportar una pequeña muestra del cuerpo al detector. Estos incluyen, por ejemplo las Patentes de Estados Unidos Nº 5.746.217; 5.820.570; 5.857.983; y

5.879.311. Cualquiera de estos procedimientos de toma y/o transporte de la muestra se puede usar con el detector de la presente invención.

En una realización preferida de la invención, el dispositivo de medida de analitos 52 construido de acuerdo con los principios de la presente invención incluye un detector 20, como se ha descrito anteriormente en este documento, combinado con un apartado de toma de muestra 50 para proporcionar un dispositivo integrado de muestreo y medida. El aparato de toma de muestra 50 ilustrado en la figura 6 incluye, por ejemplo, un órganos de perforación de la piel 54, como por ejemplo un bisturí, unido a una banda elástica desviable 56 (u otro dispositivo similar, como por ejemplo un muelle) que se puede empujar para inyectar el bisturí en la piel del paciente para provocar el flujo de sangre.

La banda elástica 56 se libera después y el órgano de perforación de la piel 54 se retrae. La sangre que fluye de la zona de la piel perforada por el órgano 54 se puede transportar entonces, por ejemplo, por la acción adsorbente de un material adsorbente 34, dentro del detector 20 para analizar el analito. El dispositivo de medida del analito 52 se puede poner entonces en un lector, no mostrado, que conecta un culombímetro u otro equipo de análisis electroquímico a las lengüetas del electrodo 23, 25 para determinar la concentración de analito por medios electroquímicos. Preferiblemente, el dispositivo de medida del analito está cerrado dentro del lector cuando se conecta al culombímetro u otro equipo de análisis electroquímico.

En una realización preferida, el dispositivo integrado de toma de muestras y medida de analitos comprende un instrumento de perforación con lanceta que sostiene un bisturí y una banda de medida. El instrumento de perforación con lanceta necesita, preferiblemente, un seguro activo. Como es necesario que el usuario amartille el dispositivo antes de usarlo, así se minimiza el riesgo de pulsar el bisturí sin darse cuenta.

Preferiblemente, el instrumento de perforación con lanceta se pulsa automáticamente cuando el instrumento de perforación con lanceta se presiona firmemente contra la piel con una cantidad de presión adecuada. Se sabe ya en la técnica que una muestra mayor de fluido corporal como por ejemplo sangre o fluido intersticial se expresa cuando se aplica presión alrededor de un sitio donde se ha creado un orificio en la piel. Por ejemplo, véase las patentes de Estados Unidos mencionadas anteriormente de Integ y Amira, así como el diseño de la punta del instrumento de perforación con lanceta vendido por Becton Dickenson. Todos estos dispositivos de perforación con lanceta tienen un anillo que sobresale y rodea el sitio de perforación con lanceta para crear presión que fuerza a la muestra fuera de la herida. Sin embargo, todos estos dispositivos necesitan que el usuario aplique la presión necesaria al sitio de la herida para expresar la muestra, y todos los instrumentos de perforación con lanceta se pulsan mediante un botón que aprieta el usuario. El diseño de un pulsador de presión apropiado es bien conocido por los expertos en la técnica.

Preferiblemente, el instrumento de perforación con lanceta también permitirá al usuario ajustar la profundidad de penetración del bisturí en la piel. Dichos dispositivos ya están disponibles en el mercado en compañías como por ejemplo Boehringer Mannheim y Palco. Esta característica permite a los usuarios ajustar el instrumento de perforación con lanceta para las diferencias de espesor de la piel, durabilidad de la piel y sensibilidad al dolor entre diferentes sitios del cuerpo y entre diferentes usuarios.

En una realización más preferida, el instrumento de perforación con lanceta y el lector de ensayo están integrados en un solo dispositivo. Para hacer funcionar el dispositivo, el usuario sólo necesita insertar un cartucho desechable que contiene una banda de medida y el dispositivo de perforación con lanceta dentro del dispositivo integrado, amartillar el instrumento de perforación con lanceta, presionarlo contra la piel para activarlo y leer el resultado de la medida. Dicho instrumento de perforación con lanceta integrado y lector de ensayo simplifica el procedimiento de ensayo para el usuario y minimiza el manejo de fluidos corporales.

La figura 26 ilustra otro ejemplo de un dispositivo integrado de toma de muestras y medida de analitos y un dispositivo detector 700. El dispositivo integrado de toma de muestras y medida de analitos y el dispositivo detector 700 incluyen un alojamiento 702, un órgano de perforación de la piel (por ejemplo un bisturí) 704, una abertura de perforación/recogida 706 y, opcionalmente, un detector amovible 708, una guía de detector 710 y un mecanismo de retracción 714 para el órgano de perforación de la piel. Este dispositivo 700 se puede diseñar para reutilizarlo (por ejemplo, haciendo amovibles el órgano de perforación de la piel 704 y el detector 708) o para un solo uso.

El alojamiento 702 puede estar formado por diversos materiales incluyendo metal y plástico. El alojamiento 702 puede incluir una bisagra 716 u otra configuración (por ejemplo, partes adhesivas o interrelacionadas) para mantener unidas las partes del alojamiento.

La abertura de perforación/recogida 706 se proporciona en el alojamiento 702 permitiendo al órgano de perforación de la piel 704 que se extienda a través de la apertura 706 y perforar la piel de un usuario, haciendo que le salga sangre (u otro fluido corporal). El detector 708 se extiende también hasta el extremo o fuera de la abertura 706 para recoger la sangre (u otro fluido corporal) a través de una abertura (no mostrada) en la punta del detector. Esto puede permitir al usuario perforar la piel y recoger la muestra de fluido sin mover el dispositivo 700. Como alternativa, se pueden proporcionar aberturas diferentes para el órgano de perforación de la piel 704 y el detector 708. La guía del detector se pude formar en el alojamiento 702 o añadir al alojamiento para guiar al detector 708 al lugar si el detector se inserta en y a través del alojamiento y/o para soportar al detector en el alojamiento y durante la recogida de muestra.

El órgano de perforación de la piel 704 puede incluir un actuador (no mostado) que incluye un mecanismo que permite amartillar y liberar el órgano de perforación de la piel 704, o el órgano de perforación de la piel puede ser dirigido externamente. Por ejemplo, se puede acoplar un detector de lectura (no mostrado) u otro dispositivo al dispositivo integrado de toma de muestras y medida de analitos, incluyendo el detector de lectura o el otro dispositivo un mecanismo que amartilla y/o libera el órgano de perforación de la piel 704.

El mecanismo de retracción 714 del dispositivo 700 puede ser, por ejemplo, un muelle o tira metálica elástica que retrae el órgano de perforación de la piel 704 de nuevo hacia el alojamiento después de perforar la piel del usuario. Esto puede permitir una recogida sin obstrucciones de la muestra y/o evitar la perforación adicional de la piel del usuario o reducir o evitar la contaminación o infección provocada por la transferencia de fluidos corporales u otros agentes dañinos. Como alternativa, la retracción del órgano de perforación de la piel se puede conseguir usando un dispositivo o aparato externo.

Un ejemplo de funcionamiento incluye amartillar el órgano de perforación de la piel 704 y después liberar el órgano de perforación de la piel 704 de manera que se extienda fuera del alojamiento 702 a través de la abertura de perforación/recogida 706 y perfore la piel del usuario. El elemento de perforación de la piel 704 opcionalmente empuja el detector fuera del camino mientras se extiende fuera del alojamiento. El elemento de perforación de la piel 704 se retrae de nuevo hacia el alojamiento 702 usando el mecanismo de retracción 714. Tras la retracción del elemento de perforación de la piel, el detector recoge una muestra de fluido de la piel perforada a través de una abertura en el detector 708.

Si se usa un detector de lectura, el detector de lectura se puede configurar también para acoplarse con un extremo de contacto del detector. El detector de lectura puede incluir un potenciostato u otro componente para proporcionar un potencial y/o corriente para los electrodos del detector. El detector de lectura puede incluir también un procesador (por ejemplo un microprocesador o hardware) para determinar la concentración de analito a partir de las señales del detector. El detector de lectura puede incluir una pantalla o un puerto para acoplar una pantalla al detector. La pantalla puede mostrar las señales del detector y/o los resultados determinados de las señales del detector incluyendo, por ejemplo, la concentración de analito, la velocidad de cambio de concentración de analito y/o lo que se excede de un umbral de concentración de analito (indicando, por ejemplo, hipo o hiperglucemia). Este detector de lectura se puede usar junto con el dispositivo integrado de toma de muestras y medida de analitos o el detector de lectura se puede usar sólo con el detector, haciendo contacto los contactos del detector con los contactos del detector de lectura.

Funcionamiento del detector

Un detector electroquímico de la invención se puede hacer funcionar con o sin la aplicación de un potencial. En una realización, la reacción electroquímica tiene lugar espontáneamente y no se necesita aplicar un potencial entre el electrodo de trabajo y los contraelectrodos.

En otra realización, se aplica un potencial entre el electrodo de trabajo y los contraelectrodos. Aún así el potencial no es necesario que permanezca constante. La magnitud del potencial necesario depende del mediador redox. El potencial al que el electrodo se autoequilibra, o cuando se equilibra por la aplicación de un polarizador externo, y cuando el analito se electroliza es típicamente tal que la reacción electroquímica se conduce a la finalización o casi a la finalización, aunque preferiblemente no es lo suficientemente oxidante para dar como resultado una reacción electroquímica significativa de elementos interferentes, como por ejemplo urato, ascorbato y paracetamol, que pueden afectar la señal medida. Para mediadores redox no lixiviables el potencial es, típicamente, de -350 mV a aproximadamente +400 mV frente al electrodo patrón de calomelano (SCE). Preferiblemente, el potencial del mediador redox es más negativo de +100 mV, más preferiblemente el potencial es más negativo de 0 mV y más preferiblemente el potencial es de aproximadamente -150 mV frente a SCE.

Cuando se aplica un potencial externo, se puede aplicar antes o después de que la muestra se coloque en la cámara de muestra. Si la zona de medida comprende sólo una parte de la cámara de muestra entonces el potencial se aplica preferiblemente después de que la muestra se hay puesto en la cámara de muestra para evitar la electrolisis de la muestra que pasa por la zona de medida mientras se llena la cámara de muestra. Como alternativa, en el caso en el que la zona de medida comprenda la mayoría o toda la cámara de muestra, el potencial, opcionalmente, se puede aplicar antes o durante el llenado de la cámara de muestra sin afectar a la precisión del ensayo. Cuando el potencial se aplica y la muestra está en la zona de medida, fluirá una corriente eléctrica entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo. La corriente es un resultado, al menos en parte, de la electrolisis del analito en la muestra. La reacción electroquímica tiene lugar a través del mediador redox y el segundo agente de transferencia de electrones opcional. Para la mayoría de biomoléculas B, el procedimiento se describe por las siguientes ecuaciones de reacción:

enzima

nA (ox) + B

imagen1 nA (red) + C (1)

nA (red) → nA (ox) + ne -(2)

El compuesto bioquímico B se oxida a C por la especie A que es un mediador redox en presencia de una enzima apropiada. Después, el mediador redox A se oxida en el electrodo. Los electrones se recogen en el electrodo y se mide la corriente resultante. La corriente medida puede incluir también una corriente de fondo resultante de una carga de fondo medida, debido, al menos en parte, a la oscilación de un mediador redox difusible entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo. Esta corriente de fondo se pude minimizar o computar como se ha descrito anteriormente.

Como ejemplo, un detector de la presente in se basa en la reacción de una molécula de glucosa con dos cationes [Os(dmo-phen)2(NMI)Cl]2+, donde dmo-phen es 4,8-dimetoxifenantrolina y NMI es N-metil-imidazol, en presencia de glucosa oxidasa para producir dos cationes [Os(dmo-phen)2(NMI)Cl]+, dos protones y un producto de oxidación de glucosa, por ejemplo glconolactona u otra cetona. La cantidad de glucosa presente se ensaya electrooxidando los cationes [Os(dmo-phen)2(NMI)Cl]+ a cationes [Os(dmo-phen)2(NMI)Cl]2+ y midiendo la carga pasada total.

Los expertos en la técnica reconocerán que hay muchas reacciones diferentes que proporcionarán el mismo resultado; es decir, la electrolisis de un analito por la ruta de reacción incorporando un mediador redox. Las ecuaciones (1) y (2) son un ejemplo no limitante de dicha reacción.

Culombimetría

En una realización preferida de la invención, se usa culombimetría para determinar la concentración del analito. Esta técnica de medida utiliza medidas de corriente obtenidas a intervalos durante el transcurso del ensayo, para determinar la concentración de analito. Estas medidas de corriente se integran con el tiempo para obtener la cantidad de carga Q que pasa a o desde el electrodo. Después se usa Q para calcular la concentración del analito (CA) mediante la siguiente ecuación (cuando el mediador redox no es lixiviable):

CA=Q/nFV (3a)

en la que n es el número de electrones equivalentes necesario para electrolizar el analito, F es la constante de Faraday (aproximadamente 96.500 culombios por equivalente) y V es el volumen de muestra en la zona de medida. Cuando se usa un mediador difusible, la concentración de analito se puede obtener a partir de la siguiente ecuación:

CA = (Qtot -Qfondo) / nFV (3b)

en la que Qtot es la carga total transferida durante la medida y Qfondo es la cantidad de carga transferida que no se debe al analito, por ejemplo la carga transferida por la oscilación del mediador difusible entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo. Al menos en algunos casos, el detector se construye de manera que la carga de fondo es al menos 5 veces el tamaño de la carga generada por la electrolisis de una cantidad de analito. Preferiblemente, la señal de fondo es al menos del 200%, 100%, 50%, 25%, 10% o 5% de la carga generada por la electrolisis del analito.

Un ejemplo de un procedimiento para determinar la proporción de la señal de fondo generada por electrolisis del analito se describe de la siguiente manera para los pares de electrodos enfrentados. Si el potencial aplicado no inhabilita la oscilación del mediador redox, la carga que resulta de la oscilación del mediador redox se puede representar mediante la siguiente fórmula:

Qfondo = (A FDMCM/ d) (t nM)

en la que A es el área del electrodo de trabajo; F es la constante de Faraday (96.500 culombios / equivalente); DM es el coeficiente de difusión eficaz del mediador redox; CM es la concentración de mediador redox en la zona de medida; d es la distancia que separa a los electrodos enfrentados; t es la cantidad de tiempo para la medida; y nM es el número de electrones ganados o perdidos por el mediador redox.

Adicionalmente, la carga del analito, por ejemplo glucosa, cuando el analito se electrooxida a aproximadamente un 90% del total en el periodo de medida se puede representar mediante la siguiente fórmula:

QG = A d(0,90) CG nGF

en la que A es el área del electrodo de trabajo; d es la distancia que separa a los electrodos enfrentados; CG es la concentración de glucosa; n es el número de electrones necesario para electrolizar el analito (por ejemplo, 2 electrones por molécula de glucosa); y F es la constante de Faraday. Cuando CG es 5 mM (o 5 x 10-6 moles/cm3), t es 60 segundos, nG es 2 y nM es 1, la proporción de carga del mediador redox a la carga por la electrooxidación del analito se puede representar por la siguiente fórmula:

Qfondo / QG = (DMCM/ d2) (t nM/(0,9 nGCG)) = (DMCM/ d2) x(6,7 x106)

Por ejemplo, si la proporción Qfondo / QG es 5, entonces (DMCM) / d2 es 7,5 x 10-7 moles/(cm3·s). También por ejemplo si la proporción Qfondo / QG es 1, entonces (DMCM) / d2 es 1,5 x 10-7 moles/(cm3·s). Aún otro ejemplo, si la proporción 0,1, entonces (DMCM) / d2 es 1,5 x 10-6 moles/(cm3·s). Por lo tanto, dependiendo de la proporción deseada, se puede configurar un detector para que tenga la proporción deseada eligiendo DM, CM y d en consecuencia. Por ejemplo, la concentración del mediador redox se puede reducir (es decir, CM se puede reducir). Como alternativa o adicionalmente, la difusión del mediador redox se puede reducir, por ejemplo poniendo una barrera al flujo del mediador difusible al contraelectrodo (es decir, reducir el coeficiente de difusión eficaz del mediador redox DM). También son adecuadas otras configuraciones del detector para controlar la proporción de señal de fondo a la señal generada por el analito y se describirá a continuación.

La carga de fondo Qfondo se puede contabilizar de diferentes maneras. Qfondo se puede hacer menor, por ejemplo usando sólo cantidades limitadas del mediador redox difusible; proporcionando una membrana sobre el contraelectrodo que limita la difusión del mediador redox del contraelectrodo; o teniendo una diferencia de potencial relativamente pequeña entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo. Otros ejemplos de configuraciones del detector y procedimiento adecuados para reducir Qfondo incluyen los ya descritos como por ejemplo detectores que tienen una velocidad de reacción del mediador redox en el electrodo de trabajo que es significativamente más rápida que en el contraelectrodo; inmovilizar el mediador redox sobre el electrodo de trabajo; hacer que el mediador redox quede inmovilizado sobre el contraelectrodo/electrodo de referencia tras su reacción en el contraelectrodo o contraelectrodo/electrodo de referencia; o ralentizar la difusión del mediador redox.

Como alternativa, el detector se puede calibrar individualmente o por lotes para determinar una curva de calibración

o un valor para Qfondo. Otra opción es incluir un segundo par de electrodos al que le falta un objeto necesario para la electrolisis del analito, como por ejemplo el segundo agente de transferencia de electrones, de manera que toda la señal de este segundo par de electrodos corresponde a Qfondo.

Para medidas culombimétricas, se electroliza al menos el 20% del analito. Se electroliza al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 80% e incluso más preferiblemente al menos el 90% del analito. En una realización de la invención, el analito se electroliza completamente o casi completamente. La carga se puede calcular entonces a partir de las medidas de corriente hechas durante la reacción electroquímica, y la concentración del analito se determina usando la ecuación (3a) o (3b). La finalización de la reacción electroquímica típicamente se señala cuando la corriente alcanza un valor de estado estacionario. Esto indica que todo o casi todo el analito se ha electrolizado. Para este tipo de medida, se electroliza al menos el 90% del analito, preferiblemente se electroliza al menos el 95% del analito y, más preferiblemente, se electroliza al menos el 99% del analito.

Para culombimetría, es típicamente deseable que el analito se electrolice rápidamente. La velocidad de la reacción electroquímica depende de diversos factores, incluyendo el potencial que se aplica entre los electrodos y la cinética de las reacciones (1) y (2). (Otros factores significantes incluyen el tamaño de la zona de medida y la presencia de adsorbente en la zona de medida). En general, cuando mayor es el potencial mayor es la corriente a través de la celda (hasta un máximo de transporte limitado) y por lo tanto, más rápida será la reacción. Sin embargo, si el potencial es demasiado grande, otras reacciones electroquímicas pueden introducir un error significativo en la medida. Típicamente, el potencial entre los electrodos así como el mediador redox específico y el segundo agente de transferencia de electrones opcional se eligen de manera que el analito se electrolice casi completamente en menos de 5 minutos, basándose en la concentración esperada del analito en la muestra. Preferiblemente, el analito se electrolizará completamente en aproximadamente 2 minutos y, mas preferiblemente, en aproximadamente 1 minuto.

En otra realización de la invención, el analito sólo se electroliza parcialmente. La corriente se mide durante la reacción parcial y después se extrapola usando técnicas matemáticas conocidas por los expertos en la técnica para determinar la curva de corriente para la electrolisis completa o casi completa del analito. La integración de esta curva da la cantidad de carga que pasaría si el analito se electrolizara completamente o casi completamente, la concentración de analito se calcula usando la ecuación (3a) o(3b).

Aunque la culombimetría tiene la desventaja de que necesita el volumen de la muestra medida sea conocido, la culombimetría es una técnica preferida para el análisis de muestras pequeñas, porque tiene las ventajas, por ejemplo de no depender de la temperatura par la medida, no depender de la actividad enzimática para la medida, no depender de la actividad del mediador redox para la medida y sin error en la medida por el empobrecimiento de analito en la muestra. Como ya se ha descrito anteriormente, la culombimetría es un procedimiento para determinar la cantidad de carga que pasa o que se proyecta que pase durante la electrolisis completa o casi completa del analito. Una técnica culombimétrica implica electrolizar el analito en un electrodo de trabajo y medir la corriente resultante entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo do o más veces durante la electrolisis. La electrolisis finaliza cuando la corriente alcanza un estado estacionario. La carga usada para electrolizar la muestra se calcula entonces integrando las corrientes medidas con el tiempo y contabilizando si hubiera señal de fondo. Como la carga está relacionada directamente con la cantidad de analito en la muestra, la medida no depende de la temperatura. Además, la actividad de la enzima no afecta al valor de la medida, pero sólo el tiempo necesario para obtener la medida (es decir, una enzima menos activa necesita un mayor tiempo para conseguir la electrolisis completa de la muestra) por lo que una disminución de la enzima con el tiempo no hará que la determinación de la concentración de analito sea imprecisa. Y finalmente, el empobrecimiento del analito en la muestra por electrolisis no es una fuente de error, si no el objetivo de la técnica. (Sin embargo, no es necesario que el analito esté completamente electrolizado si la curva de electrolisis se extrapola de la curva de electrolisis parcial basada en principios electroquímicos bien conocidos).

Ensayos no culombimétricos

Aunque los ensayos culombimétricos son útiles, los expertos en la técnica reconocerán que un detector de la invención puede utilizar también técnicas potenciométricas, amperométricas, voltamétricas y otras técnicas electroquímicas para determinar la concentración de un analito en la muestra. Las medidas obtenidas por estos procedimientos no culombimétricos puede que no sean independientes de la temperatura como lo son las medidas culombimétricas.

Además, las medidas obtenidas por estas técnicas electroquímicas no culombimétricas pueden ser sensibles a la cantidad de enzima activa proporcionada en el detector. Si la enzima se desactiva o decae con el tiempo, las medidas resultantes pueden verse afectadas. Esto puede limitar la vida media de dichos detectores a menos que la enzima sea muy estable.

Finalmente, las medidas obtenidas por técnicas electroquímicas no culombimétricas, como por ejemplo amperometría en estado estacionario, pueden verse afectadas negativamente si una parte sustancial del analito y/o mediador redox se electroliza durante el periodo de medida. No se puede obtener una medida precisa en estado estacionario a menos que haya suficiente analito y/o mediador redox de manera que sólo se electroliza una parte relativamente pequeña del analito y/o el mediador durante el procedimiento de medida. Esto se puede conseguir en un tamaño de muestra de no más de 1 µl.

En algunos casos puede ser deseable utilizar ensayos no culombimétricos, como por ejemplo técnicas de medida amperométricas o potenciométricas. Por ejemplo, la culombimetría necesita que el volumen de la muestra medida sea conocido. Y, el volumen de la muestra en la zona de medida de un detector de pequeño volumen (es decir, de no más de un microlitro) puede ser difícil de reproducir con precisión si las tolerancias de fabricación de una o más dimensiones de la zona de medida tienen variaciones significativas.

Como se ha descrito para las medidas culombimétricas, la señal de fondo resultante de la oscilación del mediador

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15

25

35

45

55

redox entre los electrodos puede ser una fuente de error en loa medida en los ensayos amperométricos o potenciométricos de muestras de no más de 1 µl en celdas electroquímicas de capa fina. En general, es deseable que el mediador no oscile entre un par de electrodos más de diez veces en el periodo de medida, preferiblemente no más de una vez y, más preferiblemente, no más de 0,1 veces como media. Para disminuir el error que surge de la señal de fondo, se pueden usar procedimientos y configuraciones del detector similares a y, en algunos casos, idénticas a los usados para las medidas culombimétricas. Los ejemplos incluyen todos los procedimientos y estructuras descritos anteriormente, como por ejemplo llevar a cabo el ensayo electroquímico a un potencial aplicado relativamente bajo, electrooxidar el analito a potenciales aplicados negativos o electrorreducir el analito a potenciales aplicados positivos, usando un contraelectrodo en el que el mediador redox reacciona relativamente lentamente (particularmente comparando con la reacción del mediador redox en el electrodo de trabajo) y/o usando un mediador redox que experimenta una reacción irreversible en el contraelectrodo. A continuación se analizan otros ejemplos.

Como se ha descrito para las medidas culombimétricas, es preferible que el detector se diseñe y funcione de manera que la señal de fondo sea al menos cinco veces la señal generada por la electrolisis del analito. Preferiblemente, la señal de fondo es al menos 200%, 100%, 50%, 25%, 10% o 5% de la señal generada por la electrolisis de una cantidad de analito. La cantidad de analito contra la que se compara la señal de fondo se ha descrito anteriormente en la sección titulada “Señal de fondo”. En el caso de la amperometría, la señal generada por la electrolisis de una cantidad de analito es la corriente en el tiempo o tiempos en los que se toma la medida. En el caso de la potenciometría, la señal generada por electrolisis es una cantidad de analito es el potencial en el tiempo o tiempos en los que se toma la medida.

En un conjunto dado de condiciones de operación, por ejemplo temperatura, geometría de la celda y tamaño del electrodo, la magnitud de la corriente de fondo Ifondo se da mediante la siguiente expresión:

Ifondo =K CMDM/ d

donde: K es una constante de proporcionalidad; CM es la concentración del mediador en la zona de medida; DM es el coeficiente de difusión eficaz del mediador en la zona de medida en condiciones normales de operación; y d es la distancia entre los electrodos.

Es deseable reducir la corriente de fondo para los ensayos no culombimétricos. Las configuraciones del detector y los procedimientos descritos anteriormente son generalmente útiles e incluyen, por ejemplo, usar bajas concentraciones del mediador redox y/o del segundo agente de transferencia de electrones (por ejemplo una enzima) con respecto a la concentración del analito y/o usando un mediador redox grande que tiene un constante de difusión eficaz relativamente baja. Otros procedimientos útiles descritos anteriormente incluyen procedimientos para reducir la difusión del mediador redox, por ejemplo poniendo una barrera (por ejemplo una barrera cargada o polar) al flujo del mediador difusible o usando un mediador redox que tiene una constante de difusión eficaz relativamente baja.

En algunos casos, el coeficiente de difusión eficaz no es más de aproximadamente 1 x 10-6 cm 2/s, no más de aproximadamente 1 x 10-7 cm 2/s, o no más de aproximadamente 1 x 10-8 cm 2/s. Además, en algunos casos, el producto CMDM (la concentración de mediador redox por el coeficiente de difusión eficaz) no es mayor de

10-12 10-13

aproximadamente 1 x moles/cm·s, no más de aproximadamente 1 x moles/cm·s o no más de aproximadamente 1 x 10-14 moles/cm·s.

A continuación se proporciona un ejemplo específico para el caso de una medida amperométrica de glucosa realizada durante 60 segundos durante los cuales se electrolizó el 10% de la glucosa en una celda de un microlitro con electrodos enfrentados separados por una distancia de d = 0,01cm. Si la medida se realizara en las siguientes condiciones: una concentración de glucosa CG = 5 mM (o 5 x 10-6 moles/cm3) y un área de A = 0,1 cm2, un número de electrones del mediador redox de nM = 1 y un número de electrones de glucosa nG = 2, entonces la corriente de fondo generada por el mediador redox y por la glucosa se determina de la siguiente manera:

ifondo = A F nMDMCM/ d

= (0,1) (96.500) (1) DM CM / (0,01)

= 9,65 X 105 CM DM

iG = nGA d (0,1) F CG/ t

= (2) (0,01) (0,1) (96.500) (5 x 10-6) / 60 = 1,61 µamperios

Por lo tanto, si ifondo /iG = 5, el valor de CMDM es igual a 8,34 x 10-12 moles/cm2 s. Otro ejemplo es, si ifondo / iG = 0,5, el valor de CMDM es igual a 8,34 x 10-13 moles/cm2 s. Adicionalmente, si ifondo / iG = 0,05, el valor de CMDM es igual a 8,34 x 10-14 moles/cm2 s.

En algunas realizaciones amperométricas o potenciométricas, la circulación del mediador redox disminuye por separar el electrodo de trabajo del contraelectrodo o contraelectrodo/electrodo de referencia de manera que la distancia a través de la cual se difundiría el mediador redox durante el periodo de medida no es mayor de, por ejemplo, la distancia entre los electrodos. Un mediador redox puede difundir una distancia igual a (Dmt)1/2, donde Dm es el coeficiente de difusión eficaz para el medio entre los electrodos y t es el tiempo. Para un periodo de tiempo de medida de 30 segundos y un mediador redox con un coeficiente de difusión eficaz entre 10-5 y 10-6 cm 2/segundo, los electrodos deberían estar separados por al menos 100 µm, preferiblemente, al menos 200 µm e incluso más preferiblemente al menos 400 µm.

Un procedimiento para separar el electrodo de trabajo y el contraelectrodo es usar un espaciador grueso entre los electrodos. Un procedimiento alternativo se ilustra en la figura 27. En esta realización, el electrodo de trabajo 740 se deposita sobre un primer sustrato 742 y el contraelectrodo 744 se dispone sobre un segundo sustrato 746 (alternativamente, los electrodos se pueden disponer sobre el mismo sustrato). El electrodo de trabajo 742 y el contraelectrodo 744 están desfasados de manera que la distancia eficaz, d, entre los dos electrodos es mayor que el espesor, w, de la capa espaciadora 748. En una realización, la distancia entre los electrodos, d, se selecciona para que esté en el intervalo de 25 a 1000 µm,de 50 a500 µm ode 100 a 250 µm.

Como alternativa o adicionalmente, en el caos de amperometría y potenciometría en estado estacionario, la señal de fondo se puede controlar limitando la velocidad de electrolisis de manera que la velocidad sea los suficientemente lenta para evitar que la concentración de analito disminuya más de aproximadamente el 20%, 10%, 5% o menos durante un periodo de medida, por ejemplo 30 segundos, 1 minuto, 5 minutos o 10 minutos. En algunos casos, para controlar la velocidad de electrolisis, se puede reducir la concentración o actividad del segundo agente de transferencia de electrones y/o se puede reducir el área del electrodo de trabajo.

Por ejemplo, el segundo agente de transferencia de electrones puede ser una enzima y la actividad de la enzima puede ser un factor limitante para la velocidad de electrolisis. Si por ejemplo la concentración de analito es glucosa 5 mM (es decir, 5 x 10-9 moles de glucosa en 1 µl) y no se electrooxida más del 10% de la glucosa (5 x 10-10 moles) durante un periodo de medida de 30 segundos, la corriente no debería sobrepasar los 3,3 x 10-6 amperios por 1 µl. Una unidad de enzima es la cantidad de enzima que cataliza la electrolisis de 1 µmol de su sustrato en 60 segundos a un pH de 7,4 a 37ºC en tampón HEPES. En consecuencia, para la glucosa se puede generar una corriente de hasta 3,3 x 10-3 amperios en 1 cm3 (es decir, 1 ml). Por lo tanto, la cantidad máxima de enzima usada en un detector que limita la cantidad de electrolisis controlando la cantidad de enzima debería ser de 1 unidad/cm3 o menor.

La velocidad de electrolisis puede estar limitada también usando un área de electrodo de trabajo relativamente pequeña. Cuando el área del electrodo de trabajo es suficientemente pequeña (por ejemplo, no más de aproximadamente 0,01 cm2, no más de aproximadamente 0,0025 cm2 o no más de aproximadamente 0,001 cm2), entonces la difusión radial del analito al electrodo puede dar como resultado una corriente en estado estacionario, a un potencial aplicado constante, que es representativo de la concentración de analito. Para electrodos circulares, se puede conseguir el área superficial apropiada usando un electrodo con un radio de no más de 60 µm, no más de 30 µm o no más de 20 µm. La difusión radial del analito incluye el transporte del analito a todas las direcciones y no sólo a la dirección perpendicular a la superficie del electrodo, y por lo tanto puede reducir o evitar el empobrecimiento del analito cerca de la superficie del electrodo. Un electrodo pequeño sobre una superficie planar permite la difusión radial. En un detector que tiene electrodos con área superficial más grande, el transporte del analito al electrodo se puede modelar como difusión lineal semi-infinita en lugar de difusión radial. Por lo tanto, el transporte del analito al electrodo está dominado por la difusión por la dirección perpendicular a la superficie del electrodo. Como resultado, la velocidad de transporte reducida típicamente es incapaz de superar el empobrecimiento del analito cerca de la superficie del electrodo, y a un potencial aplicado constante, la corriente disminuye con el tiempo, t, de acuerdo con t-1/2 .

Para un ensayo potenciométrico del tipo propuesto por Yarnitzky y Heller, J. Phys. Chem., 102: 10057-61 (1998), en el que el potencial varía linealmente con la concentración de analito, la concentración de analito y/o de mediador redox en un estado de oxidación particular no debería variar más del 20% durante el ensayo. Si la concentración varía más del 20%, entonces la difusión del analito o del mediador redox se debería controlar, por ejemplo, controlando la temperatura y/o el volumen de la cámara de muestra y/o de la zona de medida.

Aunque esta memoria descriptiva ha descrito la electrolisis de un analito, un experto en la técnica reconocerá que los mismos dispositivos y técnicas también serían adecuados para medir el estado de oxidación medio del mediador, como por ejemplo en reacciones de tipo Cottrell.

Mediadores redox oxidables al aire

En un detector que tiene un mediador redox, una fuente potencial de error en la medida es la presencia de mediador redox en un estado de oxidación mixto desconocido (es decir, el mediador no se puede reproducir en un estado de oxidación conocido). La carga que pasa cuando el mediador redox se electrooxida o electrorreduce en el electrodo de trabajo está afectada por su estado de oxidación inicial. Haciendo referencia a las ecuaciones (1) y (2) analizadas anteriormente en la sección titulada “Funcionamiento del detector”, la corriente no atribuible a la oxidación del compuesto bioquímico B fluirá debido a la electrooxidación de dicha parte del mediador redox, A, que está en su forma reducida antes de añadir la muestra. Por lo tanto, puede ser importante conocer el estado de oxidación del analito antes de introducir la muestra en el detector. Además, es deseable que todo o casi todo el mediador redox tenga el mismo estado o extensión de oxidación antes de introducir la muestra en el detector.

Cada mediador redox tiene una forma o estado reducido y una forma o estado oxidado. Es preferible que la cantidad de mediador redox en la forma reducida antes de la introducción de la muestra sea significativamente menor que la cantidad esperada de analito en una muestra para evitar una contribución de fondo significativa a la corriente medida. En esta realización de la invención, la cantidad molar de mediador redox en forma reducida antes de la introducción del analito es, preferiblemente, no más de, en una base estequiométrica, aproximadamente el 10% y más preferiblemente no más de aproximadamente el 5%, y más preferiblemente no más del 1% de la cantidad molar de analito para concentraciones de analito esperadas. Las cantidades molares relativas de analito y mediador redox se comparan basándose en la estequiometría de la reacción redox aplicable. Si por ejemplo se necesitan dos moles de mediador redox para electrolizar un mol de analito, entonces la cantidad molar de mediador redox en forma reducida antes de introducir el analito es preferiblemente no más del 20% y más preferiblemente no más de aproximadamente el 10% y más preferiblemente no más de aproximadamente el 2% de la cantidad molar de analito para concentraciones de analito esperadas). Los procedimientos para controlar la cantidad de mediador reducido se analizan a continuación.

En otro aspecto de la invención, se prefiere que la proporción de cantidades de mediador redox oxidado a mediador

5

15

25

35

45

55

redox reducido, antes de introducir la muestra en el detector, sea relativamente constante entre detectores construidos de manera similar. Cualquier desviación de mantener la proporción relativamente constante puede aumentar la dispersión de los resultados obtenidos para la misma muestra con múltiples detectores hechos de la misma manera. Para este aspecto de la invención, el porcentaje de mediador redox en forma reducida antes de introducir la muestra en el detector varía no más del 20% y, preferiblemente, no más de aproximadamente el 10% entre detectores construidos de manera similar.

Un procedimiento para controlar la cantidad de mediador redox reducido antes de la introducción de la muestra en el detector es proporcionar un oxidante para oxidar la forma reducida del mediador. Uno de los oxidantes más convenientes es O2. El oxígeno normalmente está fácilmente disponible par realizar esta función de oxidación. El oxígeno se puede suministrar exponiendo el detector al aire. Además, la mayoría de polímeros y fluidos absorben O2 del aire a menos que se tomen precauciones especiales. Típicamente, al menos el 90% de un mediador oxidable al aire (es decir, oxidable por O2) en estado sólido está en estado oxidado tras almacenamiento o exposición al aire durante un periodo de tiempo útil, por ejemplo, un mes o menos y, preferiblemente, una semana o menos y, más preferiblemente, un día o menos. La oxidación al aire puede tener lugar en estado sólido o como solución almacenada durante un periodo de tiempo suficiente para que el mediador se oxide al aire antes de la deposición en el detector. En el caso de mediadores redox oxidables al aire en solución, es deseable que el tiempo necesario para conseguir al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90% de la oxidación del mediador redox sea al menos 10 veces la duración esperada del ensayo y también es menos que la vida en almacenamiento de la solución. Preferiblemente, al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90% del mediador redox se oxida al aire en menos de 1 semana, preferiblemente en menos de 1 día, más preferiblemente en menos de 8 horas e incluso más preferiblemente en menos de 1 hora.

Aunque es deseable dar a los mediadores de los detectores fabricados en un solo lote el mismo estado o extensión de oxidación, no es necesario que el mediador se oxide completamente al estado de mayor valencia. Adicionalmente, es deseable que la oxidación al aire del mediador redox disuelto no sea tan rápida que la oxidación al aire durante el ensayo pueda interferir con o introducir un error en las medidas.

Los mediadores adecuados que son ambos oxidables al aire (es decir, oxidables con O2) y tienen capacidad de transferencia de electrones se han descrito ya anteriormente. Una familia particular de mediadores útiles son los complejos de osmio que se unen a heterociclos que contienen nitrógeno ricos en electrones o a una combinación de heterociclos que contienen nitrógeno ricos en electrones y haluros. Los heterociclos que contienen nitrógeno ricos en electrones incluyen, aunque no se limitan a, derivados de imidazol y piridina o derivados de fenantrolina que contienen sustituyentes donadores de electrones como por ejemplo grupos alquilo, alcoxi, amino, alquilamino, amido y mercapto. Preferiblemente, los complejos de osmio no tienen más de un haluro coordinado con el metal, de manera que los mediadores tienen una carga general positiva y, por lo tanto, son hidrosolubles. Un ejemplo es osmio complejado con mono-, di-y polialcoxi-2,2’-bipiridina. Otros ejemplos incluyen mono-, di-y polialcoxi-1,10fenantrolina, donde los grupos alcoxi tienen una proporción de carbono a oxígeno suficiente para retener la solubilidad en agua, son oxidables al aire. Estos complejos de osmio típicamente tienen dos ligandos de bipiridina sustituida o fenantrolina sustituida, no siendo necesario que ambos ligandos sean idénticos. Estos complejos de osmio se complejan adicionalmente con un ligando monomérico o polimérico con uno o más heterociclos que contienen nitrógeno, como por ejemplo piridina e imidazol. Los ligando poliméricos preferidos incluyen poli(4-vinil piridina) y, más preferiblemente, poli(1-vinil imidazol) o copolímeros del mismo. Se ha demostrado que [Os[4,4’dimetoxi-2,2’-bipirina]2Cl]+/+2 complejado con un poli(1-vinil imidazol) o poli(4-vinil piridina) es particularmente útil pues el catión Os+2+ es oxidable por O2 a Os+3. Se esperan resultados similares para complejos de [Os(4,7-dimetoxi1,10-fenantrolina)2Cl]+/+2 y otros mono-, di-y polialcoxipiridinas y fenantrolinas con los mismos polímeros. Otros grupos halógeno como por ejemplo bromo se puede sustituir por cloro. También se esperan resultados similares para complejos que comprenden las siguientes estructuras, como se ha especificado anteriormente:

imagen1

Surge una complicación relacionada con los mediadores oxidables al aire si la oxidación del mediador redox es tan rápida que una parte sustancial del mediador redox reducida por analito se oxida por O2 durante el ensayo con el analito. Esto daría como resultado un ensayo poco preciso pues la cantidad de analito se subestimará porque el mediador se oxidará al aire en lugar de por su electrooxidación en el electrodo. Es preferible que la reacción del mediador redox con O2 ocurra más lentamente que la electrooxidación del mediador, porque si la oxidación al aire del mediador fuera rápida, entonces el aire disuelto y la difusión interior de aire podría afectar el resultado de la medida.

Como el ensayo típicamente tarda 10 minutos o menos, preferiblemente 5 minutos o menos y más preferiblemente aproximadamente 1 minutos o menos, es preferible que el mediador, oxidable al aire durante el almacenamiento, no se oxide por el oxígeno disuelto durante el tiempo de ensayo. Por lo tanto, los mediadores que no se oxidan al aire en 1 minuto, y preferiblemente ni siquiera en 10 minutos cuando se disuelven en plasma o en suero, son los preferidos. Típicamente, menos del 5% y preferiblemente menos del 1%, del mediador reducido se oxidaría al aire durante el ensayo.

La velocidad de reacción de la oxidación al aire del mediador se puede controlar eligiendo un polímero complejante adecuado. Por ejemplo, la reacción de oxidación es mucho más rápida para [Os[4,4’-dimetoxi-2,2’-bipirina]2Cl]+/+2 acoplado de manera coordinada con poli(1-vinil imidazol) que para el mismo complejo acoplado con poli(4-vinil piridina). La elección de un polímero adecuado dependerá de la concentración de analito esperada y del potencial aplicado entre los electrodos, determinando ambos la velocidad de la reacción electroquímica.

Por lo tanto, en una reliz de la invención el mediador redox preferido tiene las siguientes características: 1) el mediador no reacciona con cualquier molécula de la muestra o en el detector distinta del analito (opcionalmente, mediante un segundo agente de transferencia de electrones); 2) casi todo el mediador redox se oxida por un oxidante como por ejemplo O2 antes de la introducción de la muestra en el detector; y 3) la oxidación del mediador redox por el oxidante es lenta comparada con la electrooxidación del mediador por el electrodo.

Alternativamente, si el mediador redox se tiene que oxidar en presencia del analito y electrorreducir en el electrodo, se necesitaría más un reductor que un oxidante. Las mismas consideraciones para la elección apropiada del reductor y el mediador se aplican como se ha descrito anteriormente para el oxidante.

El uso de mediadores redox oxidables al aire estables en los detectores electroquímicos de la invención proporciona una ventaja adicional durante el almacenamiento y envasado. Los detectores de la invención que incluyen mediadores redox oxidables al aire se pueden envasar en una atmósfera que contiene oxígeno molecular y almacenar durante largos periodos de tiempo, por ejemplo mayor de un mes, manteniendo al menos el 80% y preferiblemente al menos el 90% de las especies redox en estado oxidado.

Uso de mediadores oxidables al aire en detectores ópticos

Las especies redox oxidables al aire de la presente invención se pueden usar en otros tipos de detectores. Los complejos de osmio descritos anteriormente en este documento son adecuados para usarlos en detectores ópticos, debido a la diferencia en los espectros de absorción, características de luminiscencia y/o fluorescencia de las especies Os+2 y Os+3 complejadas. Las medidas de absorción, transmisión, reflexión, luminiscencia y/o fluorescencia de la especie redox se correlacionarán con la cantidad de analito en la muestra (después de la reacción entre un analito y la especie redox, directamente o mediante un segundo agente de transferencia de electrones como por ejemplo una enzima). En esta configuración, la cantidad molar de mediador redox debería ser mayor, en una base estequiométrica que la cantidad molar de analito esperada razonablemente para llenar la zona de medida del detector.

Los detectores ópticos convencionales, incluyendo detectores de fibra óptica con guía luminosa, y las técnicas de medida se pueden adaptar para usar con los mediadores oxidables al aire. Por ejemplo, los detectores ópticos de la invención pueden incluir un soporte que transmite la luz o que refleja la luz sobre el que la especie redox oxidable al aire y, preferiblemente, una enzima sensible al analito, se recubren para formar una película. Las formas de película de soporte son un límite para la zona de medida en la que se pone la muestra. Los otros límites de la zona de medida se determinan por la configuración de la celda. Tras llenar la zona de medida con la muestra que contiene el analito, la reducción del mediador oxidable al aire por el analito, preferiblemente por reacción con la enzima sensible al analito, provoca una modificación en el estado de oxidación del mediador que se detecta por un cambio en la transmisión, absorción de la luz o en el espectro de reflexión de la luz o en la luminiscencia y/o fluorescencia del mediador a una o más longitudes de onda luminosas.

Detectores de múltiples electrodos y calibración

Los detectores de múltiples electrodos se pueden usar por diversas razones. Por ejemplo, los detectores de múltiples electrodos se pueden usar para ensayar diversos analitos usando una sola muestra. Una realización de un detector de múltiples electrodos, mostrada en la figura 5, tiene una o más de una cámara de muestra que a su vez puede contener uno o más electrodos de trabajo 22, definiendo cada electrodo de trabajo 22 una zona de medida diferente. Si el mediador redox es no lixiviable, uno o más de los electrodos de trabajo tiene los reactivos químicos apropiados, por ejemplo, una enzima apropiada, para ensayar un primer analito y uno o más de los electrodos de trabajo restantes tienen reactivos químicos apropiados para ensayar un segundo analito. Los reactivos químicos (por ejemplo, mediador redox y/o segundo agente de transferencia de electrones) se pueden depositar como una capa detectora sobre el electrodo de trabajo o, si se usan reactivos difusibles, se pueden depositar sobre cualquier superficie de la cámara de muestra o ponerlos en la muestra. Por ejemplo, un electrodo múltiple puede incluir 1) uno

o más electrodos de trabajo que tiene glucosa oxidasa en la capa detectora para determinar la concentración de glucosa y 2) uno o más electrodos de trabajo que tienen lactosa oxidasa en la capa detectora para determinar la concentración de lactato.

Los detectores de múltiples electrodos se pueden usar también para mejorar la precisión de las lecturas resultantes. Con las medidas de cada uno de los electrodos de trabajo (todos los cuales están detectando el mismo analito) se puede hacer la media para obtener una lectura más precisa. En algunos casos, las medidas se pueden rechazar si la diferencia entre el valor y la media excede de un umbral límite. Este umbral límite se puede determinar, por ejemplo, basándose en un parámetro estadístico, como por ejemplo la desviación típica de las medidas promediada. Después se puede recalcular la media omitiendo los valores rechazados. Además, las lecturas posteriores de un electrodo que produjo un valor rechazado se pueden ignorar en ensayos posteriores si se asume que el electrodo particular es defectuoso. Como alternativa, un electrodo particular se puede rechazar sólo después de haber rechazado un número predeterminado de lecturas comparando con las lecturas de otros electrodos.

Además de usar detectores de múltiples electrodos para aumentar la precisión, se pueden realizar múltiples medidas y hacer la media para aumentar la precisión. Esta técnica se puede usar también con un detector de un solo electrodo para aumentar la precisión.

Los errores en los ensayos pueden ocurrir cuando se usan detectores que producen masa debido a las variaciones de volumen de la zona de medida de los detectores. Dos de las tres dimensiones de la zona de medida, la longitud y la anchura, normalmente son relativamente grandes, entre aproximadamente 1-5 mm. Los electrodos de dichas dimensiones se pueden producir fácilmente con una varianza del 2% o menor. La zona de medida con un volumen de submicrolitros necesita, sin embargo, que la tercera dimensión sea menor que la longitud o la anchura en uno o dos órdenes de magnitud. Como se ha mencionado anteriormente en este documento, el espesor de la cámara de muestra es típicamente de 50 a aproximadamente 200 µm. Las varianzas de fabricación en el espesor pueden ser del orden de 20 a 50 µm. Por lo tanto, sería deseable proporcionar un procedimiento para adaptarse a esta incertidumbre en el volumen de la muestra en el interior de la zona de medida.

En una realización de la invención, descrita en la figura 5, se proporcionan múltiples electrodos 42, 44, 46 sobre un material de base 48. Estos electrodos se cubre con otra base, no mostrada, que tiene contraelectrodos, no mostrados, dispuestos sobre ella para proporcionar múltiples pares de electrodos enfrentados. La varianza en la distancia de separación entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo entre los pares de electrodos en un detector dado se reduce significativamente porque cada uno de los electrodos de trabajo y los contraelectrodos está provisto en una sola base con el mismo espaciador 28 entre cada par de electrodos (véase la figura 3).

En este documento se presenta un ejemplo de un detector de múltiples electrodos que se puede usar para determinar con precisión el volumen de las zonas de medida de los pares de electrodos también es útil para reducir el ruido. En este ejemplo, uno de los electrodos de trabajo 42 se prepara con un mediador redox no lixiviable y un segundo agente de transferencia de electrones no lixiviable (por ejemplo una enzima). El material adsorbente se puede disponer entre el electrodo de trabajo 42 y su contraelectrodo correspondiente. Otro electrodo de trabajo 44 incluye un mediador redox no lixiviable, pero no un segundo agente de transferencia de electrones sobre el electrodo. De nuevo, este segundo par de electrodos puede tener un material adsorbente entre el electrodo de trabajo 44 y el contraelectrodo correspondiente. Un tercer electrodo de trabajo 46 opcional no tiene mediador redox ni segundo agente de transferencia de electrones unido al electrodo, ni hay material adsorbente entre el electrodo de trabajo 46 y su contraelectrodo correspondiente. Se puede construir una configuración similar usando un mediador redox difusible y/o un segundo agente de transferencia de electrones difusible aunque los componentes difusibles no se limitan a estar dispuestos sobre el electrodo de trabajo. En algunos casos, la distancia entre los pares de electrodos es suficiente para que el mediador redox y/o enzima no se difunda prácticamente entre los pares de electrodos durante el periodo de medida y/o en el periodo de tiempo desde la introducción de la misma muestra en la cámara de muestra hasta el final de la medida.

El error del detector provocado por el mediador redox en un estado de oxidación no uniforme antes de la introducción de la muestra se puede medir electrolizando simultáneamente la muestra en las zonas de medida que son aproximadamente los electrodos 42 y 44. En el electrodo 42, el analito se electroliza para proporcionar la señal de muestra. En el electrodo 44, el analito no se electroliza debido a la ausencia del segundo agente de transferencia de electrones (asumiendo que es necesario un segundo agente de transferencia de electrones). Sin embargo, pasará una carga (y fluirá una corriente) debido a la electrolisis del mediador redox que estaba en un estado de oxidación mixto (es decir, algunos centros redox en estado reducido y otros en estado oxidado) antes de introducir la muestra y/o la oscilación de un mediador redox difusible entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo. La pequeña carga que pasa entre los electrodos en este segundo par de electrodos se puede sustraer de la carga que pasa entre el primer par de electrodos para prácticamente eliminar el error debido al estado de oxidación del mediador redox y/o para eliminar la corriente de fondo provocada por un mediador redox difusible. Este procedimiento reduce también el error asociado con otras elementos interferentes electrolizados, como por ejemplo ascorbato, urato y paracetamol, así como los errores asociados con la carga capacitiva y las corrientes de Faraday.

El espesor de la cámara de muestra se puede determinar midiendo la capacitancia, preferiblemente en ausencia de cualquier fluido, entre el electrodo 46 (o cualquier otro electrodo 42, 44 en ausencia de material adsorbente) y su contraelectrodo correspondiente. La capacitancia de un par de electrodos depende del área superficial de los electrodos, el espaciado entre electrodos, y de la constante dieléctrica del material entre las placas. La constante dieléctrica del aire es la unidad que típicamente significa que la capacitancia de esta configuración de electrodo es un poco picofaradios para aproximadamente 100-1000 picofaradios si hay fluido entre el electrodo y el contraelectrodo dado que la constante dieléctrica para la mayoría de fluidos biológicos es de aproximadamente 75). Por lo tanto, como el área superficial de los electrodos es conocida, la medida de la capacitancia del par de electrodos permite determinar el espesor de la zona de medida en aproximadamente un 1-5%.

La cantidad de volumen hueco en el material adsorbente se puede determinar midiendo la capacitancia entre el electrodo 44 (que no tiene un segundo agente de transferencia de electrones) y su contraelectrodo asociado, tanto antes como después de añadir el fluido. Tras añadir el fluido, la capacitancia aumenta en gran medida, pues el fluido tiene una constante dieléctrica mucho mayor. La medida de la capacitancia con y sin fluido permite determinar el espaciado entre los electrodos y el volumen hueco en el adsorbente, y así el volumen de fluido en la zona de reacción.

Otras configuraciones de electrodo pueden usar también estas técnicas (es decir, medidas de capacitancia y medidas culombimétricas en ausencia de un componente crítico) para reducir el ruido de fondo y el error debido a los elementos interferentes y el conocimiento impreciso del volumen de la muestra analizada. Los protocolos que implican uno o más pares de electrodos y una o más de las medidas descritas anteriormente se pueden desarrollar dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, sólo se necesita un par de electrodos para las medidas de capacitancia, sin embargo, es conveniente usar pares de electrodos adicionales.

Indicador de llenado

Cuando se usa una cámara de muestra que se llena con 1 µl o menos de fluido, a menudo es deseable determinar cuando se llena la cámara de muestra. Las figuras 18A-18C ilustran un detector que tiene una estructura de indicador de llenado. La figura 18A ilustra un primer sustrato 500 sobre el que está impreso un electrodo de trabajo

502. Un espaciador 504 (figura 18B) como por ejemplo una capa de adhesivo o una cinta de doble cara, se forma sobre el primer sustrato 500 y el electrodo de trabajo 502 con un canal 506 formado en la capa para proporcionar una cámara de muestra. Un segundo sustrato 508 está impreso con dos contraelectrodos 510, 512, como se muestra en la figura 18C (invertida con respecto a las figuras 18A y 18B para mostrar el electrodo de lado). En algunos casos, el contraelectrodo 510 más cercano a la entrada 514 del canal 506 tiene un área superficial en la cámara de muestra que es al menos dos veces mayor que la del otro contraelectrodo 512 y, preferiblemente, al menos cinco o diez veces mayor.

Se puede indicar que el detector está lleno observando una señal entre el segundo contraelectrodo 512 y el electrodo de trabajo 502 mientras el detector se llena con el fluido. Cuando el fluido alcanza el segundo contraelectrodo 512, la señal de dicho contraelectrodo cambia. Las señales adecuadas para ser observadas incluyen, por ejemplo, tensión, corriente, resistencia, impedancia o capacitancia entre el segundo contraelectrodo 512 y el electrodo de trabajo 502. Como alternativa, el detector se puede observar después del llenado para determinar si se ha alcanzado un valor de la señal (por ejemplo, tensión, corriente, resistencia, impedancia o capacitancia), lo que indica que la cámara de muestra está llena.

En realizaciones alternativas, el contraelectrodo y/o el electrodo de trabajo se puede dividir en dos o más partes y las señales de las partes respectivas observadas para determinar si el detector se ha llenado. En un ejemplo, el electrodo de trabajo está en una posición enfrentada con el contraelectrodo y el electrodo indicador. En otro ejemplo, el contraelectrodo, el contraelectrodo y el electrodo indicador no están en una posición enfrentada, pero pueden estar, por ejemplo, uno al lado del otro. En otros casos, se puede usar un segundo par de electrones, controlando las señales del segundo par de electrodos para observar los cambios y/o para aproximar un valor particular para determinar que el detector se ha llenado. Típicamente, el electrodo indicador está bastante más abajo desde el puerto de entrada de la muestra que el electrodo de trabajo y el contraelectrodo.

Para detectores de llenado lateral, como los ilustrados en las figuras 19A-19C y 20A-20C, se pueden disponer dos electrodos indicadores en cada lado del contraelectrodo primario. Esto permite al usuario llenar la cámara de muestra desde el lado derecho o desde el izquierdo, disponiéndose un electrodo indicador más arriba. Esta configuración de tres electrodos no es necesaria. Los detectores de llenado lateral pueden tener también un solo electrodo indicador y, preferiblemente, alguna indicación sobre a qué lado se debe poner en contacto con la muestra de fluido.

En una realización, el uso de tres contraelectrodos/electrodos de referencia y/o electrodos indicadores detecta cuando se ha llenado la cámara de muestra para evitar el llenado parcial de la cámara de muestra. En esta realización, los dos electrodos indicadores se mantienen a un potencial diferente que el mayor contraelectrodo/electrodo de referencia. El comienzo y la finalización del llenado de la cámara de muestra se indica por el flujo de corriente entre el electrodo indicador y los contraelectrodos/electrodos de referencia.

En otros casos, el potencial de cada uno de los contraelectrodos/electrodos de referencia puede ser el mismo. Cuando el potencial en los tres contraelectrodos/electrodos de referencia es el mismo, por ejemplo 0 voltios, entonces cuando la zona de medida comienza a llenarse, el fluido permite el contacto electroquímico entre un electrodo de trabajo y el primer contraelectrodo/electrodo de referencia, provocando una corriente en el primer contraelectrodo/electrodo de referencia debida a la reacción del analito con la enzima y el mediador. Cuando el fluido alcanza el tercer contraelectrodo/electrodo de referencia, se puede medir otra corriente similar a la del primer contraelectrodo/electrodo de referencia indicando que la zona de medida está llena. Cuando la zona de medida está llena, los tres contraelectrodos/electrodos de referencia se pueden acortar conjuntamente o sus señales se pueden añadir o combinar de cualquier otra manera.

El electrodo indicador se puede usar también para mejorar la precisión de las medidas del analito de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente para detectores de múltiples electrodos. El electrodo indicador puede funcionar como un electrodo de trabajo o como un contraelectrodo o como un contraelectrodo/electrodo de referencia. En la realización de las figuras 18A-18B, el electrodo indicador 512 puede actuar como segundo contraelectrodo o como contraelectrodo/electrodo de referencia con respecto al electrodo de trabajo 502. Las medidas desde el par electrodo indicador/electrodo de trabajo se pueden combinar (por ejemplo añadir y/o promediar) con las del primer contraelectrodo o contraelectrodo/par electrodo de referencia/electrodo de trabajo para obtener medidas más precisas. En una realización, el electrodo indicador puede funcionar como un segundo electrodo de trabajo con el contraelectrodo o contraelectrodo/electrodo de referencia. En otra realización, el electrodo indicador puede funcionar como un segundo electrodo de trabajo con un segundo contraelectrodo o contraelectrodo/electrodo de referencia. Aún en otra realización, el electrodo indicador puede funcionar como un segundo contraelectrodo o contraelectrodo/electrodo de referencia con un segundo electrodo de trabajo.

El detector o un detector de lectura puede incluir una señal (por ejemplo, una señal visual o una señal auditiva) que se activa como respuesta al electrodo indicador para alertar al usuario de que la zona de medida se ha llenado. En algunos casos, el detector o un segundo lector se puede configurar para iniciar una lectura cuando el electrodo indicador indica que la zona de medida se ha llenado con o sin alertar al usuario. La lectura se puede iniciar, por ejemplo, aplicando un potencial entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo y empezando a controlar las señales generadas en el electrodo de trabajo.

Calentamiento de la muestra

La muestra se puede calentar para aumentar la velocidad de difusión, o para reducir el analito. Este calentamiento se puede conseguir por diversas técnicas incluyendo poner el detector en un ambiente calentado o aplicar una unidad calorífica al detector.

Otra técnica incluye proporcionar un elemento de calentamiento térmico, por ejemplo un cable o una tinta que pueda trasformar la energía eléctrica en energía calorífica, sobre el detector. Este cable o tinta se puede aplicar, por ejemplo, en lados opuestos de un material de base, como por ejemplo una película polimérica, en uno o más de los electrodos de trabajo, contraelectrodos, electrodos de referencia o contraelectrodos/electrodos de referencia, o se puede aplicar alrededor dela periferia de los electrodos de trabajo, contraelectrodos, electrodos de referencia o contraelectrodos/electrodos de referencia. En algunos casos, la muestra se puede calentar hasta de 5 a 20ºC por encima de la temperatura inicial. En otros casos, la temperatura de la muestra puede no ser conocida pero se puede aplicar una cantidad constante de potencial o corriente al cable o tinta.

Ejemplos

La invención se caracterizará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no pretender limitar el alcance de la invención que se ha expuesto completamente en la descripción precedente. Las variaciones dentro de los conceptos de la invención son evidentes para los expertos en la técnica. Los ejemplos 1 a 8 representan los antecedentes de la técnica de acuerdo con el documento WO 98/35225.

Ejemplo 1

Preparación de un detector in vitro de pequeños volúmenes para determinar la concentración de glucosa

Se construyó un detector correspondiente a la realización de la invención descrita en la figura 1. El electrodo de trabajo se construyó con una película MylarTM (DuPont), teniendo la película MylarTM un espesor de 0,175 mm y un diámetro de aproximadamente 2,5 cm. Se estampa con estarcido una almohadilla de carbono con un espesor de aproximadamente 12 micrómetros que tiene un diámetro de aproximadamente 1 cm sobre la película MylarTM. El electrodo de carbono se recubre con un aislante eléctrico insoluble en agua (Insulayer) que tiene un espesor de 12 µm y una abertura de 4 mm en el centro.

El centro del electrodo de carbono, que no estaba cubierto por el material dieléctrico, se recubrió con un mediador redox no lixiviable. El mediador redox se formó complejando poli(1-vinil imidazol) con Os(4,4’-dimetoxi-2,2’bipiridina)2Cl2 seguido de reticulación de glucosa oxidasa con el polímero de osmio usando diglicidil éter de polietilenglicol (PEGDGE) como se describe en Taylor et al., J. Electroanal. Chem., 396:511 (1995). La proporción de osmio a funcionalidades imidazol en el mediador redox era de aproximadamente 1:15. El mediador se depositó sobre el electrodo de trabajo en una capa que tenía un espesor de 0,6 µm y un diámetro de 4 mm. El recubrimiento del mediador sobre el electrodo fue de aproximadamente 60 µ/cm2 (peso seco). Se puso un material espaciador sobre el electrodo que rodeaba a la superficie del electrodo cubierta por el mediador. El espaciador se preparó de politetrafluoroetileno (PTFE) y tenía un espesor de aproximadamente 0,040 mm.

Se puso un material adsorbente en contacto con la superficie del electrodo de trabajo cubierta con el mediador. El adsorbente se preparó de nylon (nylon Tetko Nitex -10/2). El adsorbente tiene un diámetro de 5 mm, un espesor de 0,045 mm, y un volumen de huecos de aproximadamente el 20%. El volumen de la muestra en la zona de medida se calculó a partir de las dimensiones y características del adsorbente y del electrodo. La zona de medida tenía un diámetro de 4 mm (el diámetro de la superficie del electrodo cubierto por el mediador) y un espesor de 0,045 mm (espesor del adsorbente de nylon) para dar un volumen de 0,57 µl. De este espacio, aproximadamente el 80% se llenó con nylon y el otro 20% era espacio vacío en el interior del adsorbente de nylon. Este volumen resultante de la muestra en el interior de la zona de medida fue de aproximadamente 0,11 µl.

Se puso un contraelectrodo/electrodo de referencia en contacto con el espaciador y el lado del adsorbente contrario al electrodo de trabajo de manera que los dos electrodos se enfrentaron entre sí. El contraelectrodo/electrodo de referencia se construyó sobre una película MylarTM que tenía un espesor de 0,175 mm y un diámetro de aproximadamente 2,5 cm sobre el que se estampa con estarcido una capa de un espesor de 12 micrómetros de plata/cloruro de plata que tiene un diámetro de aproximadamente 1 cm.

Los electrodos, el adsorbente y el espaciador se presionaron conjuntamente usando las placas de los lados del ensamblaje del electrodo. Las placas se formaron de plástico de policarbonato y se afianzan de forma segura para mantener unido al detector. Los electrodos se almacenaron al aire durante 48 horas antes de su uso.

Las lengüetas se extendían desde el electrodo de trabajo y desde el contraelectrodo/electrodo de referencia y proporcionaban contacto eléctrico con el equipo de análisis. Se usó un potenciostato para aplicar una diferencia de potencial de +200 mV entre el electrodo de trabajo y los contraelectrodos/electrodos de referencia, siendo el ánodo el electrodo de trabajo. No hubo flujo de corriente entre los electrodos en ausencia de muestra, que se esperaba que estuviera presente, como ruta no conductora entre los electrodos.

La muestra se introdujo mediante una pequeña lengüeta de material adsorbente de nylon formado como una extensión del adsorbente de nylon de la cámara de muestra. El líquido se adsorbe en el interior del adsorbente cuando se hizo contacto entre la muestra y la lengüeta adsorbente. Mientras la cámara de muestra se llenaba y la muestra hacía contacto con los electrodos, la corriente fluyó entre los electrodos. Cuando las moléculas de glucosa entraron en contacto con la glucosa oxidasa en el electrodo de trabajo, las moléculas de glucosa se electrooxidaron a gluconolactona. Los centros redox de osmio en el mediador redox reoxidaron entonces la glucosa oxidasa. Los centros de osmio se reoxidaron a su vez por reacción con el electrodo de trabajo. Esto proporcionó una corriente que se midió y se integró simultáneamente en un culombímetro (EG&G Princeton Applied Research Model Nº 173).

La reacción electroquímica continuó hasta que la corriente alcanzó un valor de estado estacionario que indicó que más del 95% de la glucosa se había electrorreducido. La curva de corriente obtenida midiendo la corriente a intervalos específicos se integró para determinar la cantidad de carga que había pasado durante la reacción electroquímica. Después, estar cargas se representaron frente a la concentración conocida de glucosa para producir una curva de calibrado.

El detector se ensayó usando alícuotas de 0,5 µl de soluciones que contenían concentraciones conocidas de glucosa en un tampón o fluido cerebroespinal artificial o en un suero de control (Baxter-Date, Monitrol Level 1, Miami, FL) en el intervalo de 3 a 20 mM de glucosa. El fluido cerebroespinal artificial se preparó como una mezcla de las siguientes sales: NaCl 126 mM, NaHCO3 27,5 mM, KCl 2,4 mM, KH2PO4 0,5 mM, CaCl2·2H2O 1,1 mM y 0,5 Na2SO4 0,5 mM.

Los resultados de los análisis se muestra en la tabla 1 y en la figura 7. En la tabla 1, Qmed es la carga media usada para electrolizar la glucosa en 3-6 muestra de ensayo idénticas (la figura 7 es un gráfico de la carga para cada una de las muestras de ensayo) y el 90% del tiempo de desarrollo corresponde a la cantidad de tiempo necesaria para

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que se electrolice el 90% de la glucosa. Los datos muestran una precisión del detector del 10-20%, lo que indica una sensibilidad adecuada del detector para concentraciones bajas de glucosa, así como en el intervalo fisiológicamente relevante (30 µg/dl -600 µg/dl).

TABLA 1 Resultados del detector usando glucosa oxidasa

Número de muestras ensayadas: Qmed (TC) 90% del tiempo de desarrollo (s)

Sólo tampón: 4 9,9 ± 1,8 13 ± 6

Glucosa 3 mM/tampón: 5 17,8 ± 3,5 19 ± 5

Glucosa 6 mM/tampón: 4 49,4 ± 4,9 25 ± 3

Glucosa 10 mM/tampón: 6 96,1 ± 12,4 36 ± 17

Glucosa 15 mM/tampón: 5 205,2 ± 75,7 56 ± 23

Glucosa 20 mM/tampón: 4 255,7 ± 41,0 62 ± 17

Glucosa 4,2 mM/suero: 3 44,2 ± 4,3 44 ± 3

Glucosa 15,8 mM/suero: 3 218,2 ± 57,5 72 ± 21

Los valores medidos medios de concentración de glucosa se ajustaron mediante una o más ecuaciones para proporcionar una curva de calibrado. La figura 8 muestra las curvas de calibrado para los datos de glucosa/tampón de la tabla 1. Se omitió una de las medidas de glucosa 15,0 mM de estos cálculos porque estaba más de dos desviaciones típicas distanciada de la media de las medidas. Las concentraciones de glucosa más altas (10 -20 mM) se ajustaron mediante una ecuación lineal. Las concentraciones de glucosa más bajas se ajustaron mediante un polinomio de segundo orden.

La figura 9 muestra los datos de la tabla 1 representados en un polarizador de error desarrollado por Clarke et al., Diabetes Care, 5, 622-27, 1987, para determinar los errores resultantes basándose en la determinación imprecisa de la concentración de glucosa. El gráfico representa la concentración de glucosa “verdadera” frente a la concentración de glucosa medida, determinándose la concentración de glucosa medida calculando una concentración de glucosa usando las curvas de calibrado de la figura 8 para cada dato puntual dela figura 7. Los puntos en la zona A son precisos, los de la zona B son clínicamente aceptables y los de las zonas C, D y E llevan a tratamientos cada vez más inapropiados y finalmente peligrosos.

Había 34 datos puntuales. De estos datos puntuales, el 91% cayó dentro de la zona A, el 6 % en la zona B y el 3% en la zona C. Se determinó que sólo una lectura estaba en la zona C. esta lectura estaba fuera de la escala y no se muestra en la figura 9. por lo tanto, el 97% de las lecturas cayeron en las zonas clínicamente aceptables A y B.

El número total de átomos de Os se determinó reduciendo todos los Os y después electrooxidándolos con un tampón exento de glucosa en la cámara de muestra. Esto dio como resultado una carga de 59,6 ± 5,4 µC. La comparación de este resultado con el resultado del tampón exento de glucosa de la tabla 1 indicó que menos del 20% del Os estaba en forma reducida antes de introducir la muestra. La variabilidad en la cantidad de osmio en estado reducido es menor del 5% de la cantidad total de osmio presente.

Ejemplo 2

Respuesta del detector de glucosa a los elementos interferentes

Se construyó un detector de la misma manera descrita anteriormente par el ejemplo 1 y se usó para determinar la respuesta del detector a los elementos interferentes. Los elementos electroquímicos interferentes principales para las medidas de glucosa en sangre son ascorbato, paracetamol y urato. Los intervalos de concentración normal o terapéutica (en el caso de paracetamol) de estos elementos interferentes comunes son:

ascorbato: 0,034 -0,114 mM

paracetamol: 0,066 -0,200 mM

urato (macho adulto): 0,27 -0,47 mM

Tietz, in: Texbook of Clinical Chemistry, C.A. Burtis y E.R. Ashwood, eds., W.B. Saunders Co., Filadelfia 1994, pág. 2210-12.

Las soluciones de elementos interferentes exentas de glucosa tamponadas se ensayaron con concentraciones de los elementos interferentes en el extremos de los intervalos fisiológicos o terapéuticos indicados anteriormente. El volumen de muestra inyectado en cada caso fue de 0,5 µl. Se aplicó un potencial de +100 mV o +200 mV entre los electrodos. La carga media (Qmed) se calculó restando una corriente de fondo media obtenida a partir de una solución sólo de tampón (es decir, sin elementos interferentes) a partir de una señal media registrada estado presente el elemento interferente. La carga media resultante se comparó con las señales de la tabla 1 para concentraciones de glucosa de 4 mM y 10 mM para determinar el error porcentual que resultaría de la presencia del elemento interferente.

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TABLA 2 Respuesta de los elementos interferentes de los detectores de glucosa

Solución: E (mV) n Qmed (TC) Error @ glucosa 4 mM Error @ glucosa 10 mM

ascorbato 0,114 mM: 100 4 0,4 2% <1%

ascorbato 0,114 mM: 200 4 -0,5 2% <1%

paracetamol 0,2 mM: 100 4 0,1 <1% <1%

paracetamol 0,2 mM: 200 4 1,0 5% 1%

urato 0,47 mM: 100 4 6,0 30% 7%

urato 0,47 mM: 200 4 18,0 90% 21%

Estos resultados indicaron que el ascorbato y el paracetamol no fueron elementos interferentes significativos para la configuración del detector de glucosa, especialmente para medidas de bajo potencial. Sin embargo, el urato proporcionó una interferencia significativa. Esta interferencia se puede minimizar calibrando la respuesta del detector a la concentración de urato de 0,35 mM, por ejemplo, restando una cantidad apropiada de carga según se determinar por la extrapolación de estos resultados de todas las medidas de glucosa del detector. El error resultante debido a la variación de 0,10 mM en la concentración de urato (el intervalo de la concentración de urato fue de 0,27 0,47 en un macho adulto) sería de aproximadamente el 6% a 4 mM de glucosa y 100 mV.

Ejemplo 3

Detector con glucosa deshidrogenasa

Se preparó un detector similar al descrito para el ejemplo 1 y se usó para este ejemplo, excepto que la glucosa oxidasa se sustituyó por pirroloquinolina quinona glucosa deshidrogenasa y se aplicó un potencial de sólo +100 mV diferente del potencial de +200 mV aplicado en el ejemplo 1. Los resultados se

TABLA 3 Resultados del detector usando glucosa deshidrogenasa

n: Qmed (TC) 90% del tiempo de desarrollo (s)

Tampón: 4 21,7 ± 5,2 14 ± 3

glucosa 3 mM/tampón: 4 96,9 ± 15,0 24 ± 6

glucosa 6 mM/tampón: 4 190,6 ± 18,4 26 ± 6

glucosa 10 mM/tampón: 4 327,8 ± 69,3 42 ± 9

Los resultados indicaron que la carga obtenida a partir del detector de glucosa deshidrogenasa fue mucho mayor que la comparable del detector de glucosa oxidable, especialmente para concentraciones bajas de glucosa. Para una concentración de glucosa 4 mM, las medidas obtenidas por los dos detectores diferían en un factor de cinco. Además, el detector de glucosa deshidrogenasa funcionó a un potencial menor, reduciendo de esta manera los efectos de las reacciones de los interferentes.

Además, los resultados de la tabla 3 se ajustaron todos mediante una curva de calibrado lineal, frente a los resultados del ejemplo 1, como se muestra en la figura 10. Es preferible una sola línea de calibrado lineal para simplificar la construcción y funcionamiento del detector.

También, asumiendo que los resultados de los elementos interferentes de la tabla 2 son aplicables para este detector, todos los elementos interferentes introducirían un error de menos del 7% para una solución de glucosa 3 mM a un potencial de 100 mV.

Ejemplo 4

Determinación de la concentración de lactato en una corriente de fluido

El detector de este ejemplo se construyó usando una celda de flujo (BioAnalytical Systems, Inc. # MF-1025) un electrodo de carbono vidrioso. Se recubrió un mediador redox sobre el electrodo de la celda de flujo para proporcionar un electrodo de trabajo. En este caso, el mediador redox era un polímero formado por poli(1-vinil imidazol) que se complejó con Os(4,4’-dimetil-2,2’-bipiridina)2Cl2 con una proporción de 1 osmio por cada 15 funcionalidades imidazol. La lactato oxidasa se retículo con el polímero mediante diglicidil éter de polietilenglicol. El mediador se recubrió sobre el electrodo con un cubrimiento de 500 µg/cm2 y un espesor de 5 Tm. El mediador se cubrió con una membrana de policarbonato con pistas atacadas (Osmonics-Poretics #10550) para mejorar la adherencia en la corriente de flujo. Después la membrana se recubre con una junta espaciadora con un espesor de 50 Tm (BioAnalytical Systems, Inc. # MF-1062) que contenía un hueco que definía la cámara de muestra y la zona de medida correspondiente. El ensamblaje del detector se completó uniendo un bloque de celda (BioAnalytical Systems, Inc. # MF-1005) que contenía los electrodos de referencia y auxiliares de la celda de flujo.

La cámara de muestra en este caso correspondía a un cilindro con un espesor de 50 Tm (el espesor de la junta espaciadora) en contacto con un electrodo recubierto con el mediador que tenía un área superficial de 0,031 cm2. El volumen calculado de muestra en la zona de medida de este detector era de aproximadamente 0,16 Tl.

El caudal de la corriente de fluido era de 5 Tl/minutos. Se unión un potenciostato estándar de tres electrodos a los plomos de la celda y se aplicó un potencial de +200 mV entre el electrodo de carbono vidrioso recubierto con el mediador redox y el electrodo de referencia. El potencial fue suficiente para dirigir la oxidación del lactato mediada por la enzima.

Mientras la corriente de fluido fluía a través del detector, se midió una corriente en estado estacionario proporcional a la concentración de lactato. Se detuvo el flujo de fluido a intervalos periódicos y se dejó que la corriente fluyera entre los electrodos antagonista que aproximadamente todo el lactato de la zona de medida se había electrooxidado, lo que se indica mediante la consecución de una corriente en estado estacionario estabilizada. La carga total Q necesaria para la electrooxidación del lactato se encontró integrando la corriente diferencial registrada a partir de la detención del flujo hasta que la corriente alcanzó un estado estacionario. Después se calculó la concentración mediante la siguiente ecuación:

[lactato] = Q / 2FV (4)

en la que V es el volumen de la muestra en el interior de la zona de medida y F es la constante de Faraday.

Este ensayo se realizó usando soluciones de lactato que tenían concentraciones nominales de lactato de 1,0, 5,0 y 10,0 mM. Las concentraciones medidas para el ensayo fueron de 1,0, 5,4 y 8,9 mM, respectivamente.

Ejemplo 5

Determinación del estado de oxidación de Os(4,4’-dimetoxi-2,2’-bipiridina)2Cl+/+2 complejado con poli(1-vinil imidazol)

Se obtuvo en el mercado un detector que tenía un diseño de tres detectores, de Ecossensors Ltd., Long Hanborough, Inglaterra, siendo el nombre del modelo “electrodo desechable de área grande”. El detector contenía electrodos de trabajo, de referencia y contraelectrodos paralelos y coplanares. El área superficial de trabajo (0,2 cm 2) y los contraelectrodos estaban hechos de carbono impreso y el electrodo de referencia estaba hecho de Ag/AgCl impreso. Se recubrió un mediador redox sobre el electrodo de trabajo de carbono. El mediador redox se formó por complejación de poli(1-vinil imidazol) con Os(4,4’-dimetoxi-2,2’-bipiridina)2Cl2 en una proporción de 15 grupos imidazol por catión de Os seguido de reticulación del polímero de osmio con glucosa oxidasa usando diglicidil éter de polietilenglicol.

El electrodo se curó a temperatura ambiente durante 24 horas. El conjunto de electrodos coplanares se sumergió entonces en una solución de electrolito tamponada, y se aplicó un potencial de +200 mV (suficiente para la trasformación de Os(II) en Os(III)) entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia.

Tras la aplicación del potencial, se pasó una carga indetectable de menos de 1 µC. La posterior reducción y reoxidación del mediador redox dio una carga para la transformación de todo el Os de Os(II) a Os(III) de 65 TC. Por lo tanto, más del 98% de los cationes Os en el mediador redox estaban en el estado de oxidación deseado, Os(III).

Ejemplo 6

Determinación del estado de oxidación de Os(4,4’-dimetoxi-2,2’-bipiridina)2Cl+/+2 complejado con poli(4-vinil piridina)

Se llevó a cabo un experimento similar al del ejemplo 5, con la misma configuración de electrodo de trabajo/contraelectrodo/electrodo de referencia, excepto que el mediador redox sobre el electrodo de trabajo se cambió por un complejo de Os(4,4’-dimetoxi-2,2’-bipiridina)2Cl2 con poli(4-vinil piridina), con 12 grupos piridina por catión de Os, reticulado con glucosa oxidasa mediante diglicidil éter de polietilenglicol.

Se construyeron dos detectores. Los electrodos de los dos detectores se curaron a temperatura ambiente durante 24 horas. Después, los electrodos se sumergieron en una solución de electrolito tamponada y se aplicó un potencial de +200 mV entre los electrodos de trabajo y de referencia.

Tras aplicar el potencial a los electrodos, se pasó una carga de 2,5 TC y 3,8 TC en los dos detectores, respectivamente. Por lo tanto, los detectores originalmente contenía un 91% y un 86% de cationes Os en el estado de oxidación deseado, Os(III).

Ejemplo 7

Detector óptico

Se construyó un detector óptico aplicando una película de polímero redox con enzima reticulada sobre un soporte transparente a la luz como por ejemplo un portaobjetos de vidrio. La cantidad de mediador redox es igual o mayor que (en un sentido estequiométrico) la cantidad de analito con que se espera llenar la zona de medida. El material espaciador, el adsorbente y el soporte enfrentado se afianzan de forma segura. La cámara de muestra se adapta para transmitir luz a través del detector montado a un detector de densidad óptica o a un detector luminiscente y/o fluorescente. Mientras la muestra llena la cámara de muestra y el mediador redox se oxida, los cambio de absorción, transmisión, reflexión o luminiscencia y/o fluorescencia del mediador redox en la cámara de muestra se correlacionan con la cantidad de glucosa en la muestra.

Ejemplo 8

Volúmenes de sangre de la parte superior del brazo con lanceta de tipo bastoncillo

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Se perforó en antebrazo de un solo individuo con un bisturí varias veces para determinar la reproducibilidad de los volúmenes de sangre obtenidos por este procedimiento. A pesar de que se produjeron más de 30 lanceta de tipo bastoncillo en la parte anterior de cada antebrazo y en la zona dorsal del antebrazo izquierdo, el individuo identificó cada bastoncillo como prácticamente indoloro.

El antebrazo se perforó con un bisturí Payless Color. La sangre de cada bastoncillo se recogió usando un tubo capilar de 1 µl, y el volumen se determinó midiendo la longitud de la columna de sangre. A continuación se muestra, en la tabla 4, el volumen obtenido para cada bastoncillo.

Tabla 4 Volumen de lanceta tipo bastoncillo

Antebrazo anterior izquierdo (nl): Antebrazo anterior derecho (nl) Antebrazo dorsal izquierdo (nl)

1: 180 190 180

2: 250 180 300

3: 170 120 310

4: 150 100 300

5: 100 210 60

6: 50 140 380

7: 90 120 220

8: 130 140 200

9: 120 100 380

10: 100 320

11: 260

12: 250

13: 280

14: 260

Media: 138 ± 58 nl 140 ± 40 nl 264 ± 83 nl

Ejemplo 9

Un detector con mediador redox difusible

Se formó un detector imprimiendo tinta de grafito (Graphite Nº G4491, Ercon, Wareham, WA) en un sustrato de poliéster. Se depositó una mezcla de 5,5 µg/cm2 de [Os(dimetoxibipiridina)2(vinilimidazol)Cl]Cl, 23,7 µg/cm2 de PQQ-glucosa deshidrogenasa y 18,2 µg/cm2 de tensioactivo Zonyl FSO® (E.I. du Pont de Nemours & Co., Inc. Wilmington, DE) en una parte del electrodo de trabajo. Después se aplicó al electrodo de trabajo una cinta adhesiva sensible a presión con un espesor de 150 µm, dejando sólo una parte del electrodo de trabajo expuesta para formar la cámara de muestra. Se proporcionó una segunda película de poliéster con un contraelectrodo dispuesto sobre la película, sobre la cinta adhesiva sensible a presión. El contraelectrodo se formó disponiendo tinta de Ag/AgCl (plata/cloruro de plata Nº R414, Ercon, Wareham, MA) sobre la segunda película de poliéster. El contraelectrodo de Ag/AgCl se recubrió con aproximadamente 100 µg/cm2 de poli(vinil imidazol) metilado reticulado usando PEGDGE.

Ejemplo 10

Medida de glucosa usando un detector con mediador redox difusible a un potencial de 0 V

Los detectores se formaron como se ha descrito en el ejemplo 9 para medir glucosa/soluciones tampón a una concentración de glucosa de 0 ,90, 180, 270 y 360 mg/dl. La figura 16 ilustra la carga medida frente a la concentración para tres detectores a cada concentración de glucosa. La carga medida varía linealmente con la concentración de glucosa de manera similar a la observada para los detectores que utilizan un mediador redox no lixiviable.

Ejemplo 11

Otros detectores formados usando un mediador redox difusible

Los detectores A y B se formaron imprimiendo tinta de grafito (Graphite Nº G4491, Ercon, Wareham, MA) en un sustrato de poliéster. Para el detector A, se depositó una mezcla de 8,0 µg/cm2 de tensioactivo Zonal FSO® (E.I. duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE) sobre una parte del electrodo de trabajo. Para el detector B, se depositó una mezcla de 24 µg/cm2 de [Os(diemtoxibipiridina)2(vinil imidazol)Cl]Cl, 105 µg/cm2 de PQQ-glucosa deshidrogenasa y 80 µg/cm2 de tensioactivo Zonal FSO® (E.I. duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE) sobre una parte del electrodo de trabajo. Después se formó una cinta adhesiva sensible a presión de 200 µm sobre el electrodo de trabajo de cada detector dejando sólo una parte del electrodo de trabajo expuesta para formar una cámara de muestra. Se proporcionó una segunda película de poliéster con un contraelectrodo dispuesto sobre ella, sobre la cinta adhesiva sensible a presión. El contraelectrodo de cada electrodo se formó disponiendo tanta de Ag/AgCl (plata/cloruro de plata Nº R414, Ercon, Wareham, MA) sobre la segunda película de poliéster. El contraelectrodo de Ag/AgCl se recubrió con aproximadamente 100 µg/cm2 de poli(vinil imidazol) metilado reticulado usando PEGDGE.

Ejemplo 12

Variación de la cantidad de mediador redox difusible en el detector

Se ensayó cada uno de los detectores A y B para determinar la cantidad de tiempo necesaria para la electrolisis del analito. La figura 17 ilustra los resultados. El aumento de la cantidad de mediador redox en la muestra disminuye el tiempo de respuesta del detector.

Ejemplo 13

Precisión clínica del detector de pequeño volumen

El detector de este ejemplo se construyó correspondiendo a la realización de la invención descrita en las figura 24A, 24B y 24C. El electrodo de trabajo de carbono se imprimió en una película de poliéster MelinexTM (DuPont, Wilmington, Delaware), como se ha descrito en el ejemplo 11. El electrodo de carbono se recubrió con 18 µg/cm2 de Os[(MeO)2bpy]2(1-vinil imidazol)Cl3, 162 µg/cm2 de GDH (Tokio, Japón), 1,35 µg/cm2 de PQQ (Fluka, Mila, Wisconsin) y 60 µg/cm2 de Zonal FSO (DuPont, Wilmington, Delaware). Los recubrimientos se aplicaron al electrodo de trabajo a 18ºC y a una humedad relativa del 50%. Se puso un adhesivo (espesor de 50 µm) sobre el electrodo de carbono que rodeaba a la superficie recubierta y formando un canal que tenía un ancho de aproximadamente 1,02 mm.

Los contraelectrodos/electrodos de referencia de Ag/AgCl se imprimieron sobre una segunda película polimérica MelinexTM, como se ha descrito en el ejemplo 11. Después, la película se puso en contacto con el adhesivo y la película del electrodo de trabajo de manera que el electrodo de trabajo y los dos contraelectrodos estaban enfrentados entre sí. Los contraelectrodos/electrodos de referencia se recubrieron con 142 µg/cm2 de polivinil imidazol metilado, 18 µg/cm2 de PEGDGE (Polysciences, Warington, Pensilvania) y 7 µg/cm2 de de zonal FSO (DuPont, Wilmington, Delaware). Uno de los contraelectrodos, aguas arriba del otro contraelectrodo, se usó como electrodo indicador para determinar cuando estaba llena la cámara de muestra. Los detectores se laminaron con tres pasadas de un rodillo de mano y se envejecieron durante tres días a temperatura ambiente sobre CaSO4.

Los detectores se construyeron de manera que cuando fluyó una corriente suficiente entre los electrodos indicador y contraelectrodo/electrodo de referencia, un circuito externo emitió una señal visual indicando que el canal que recubre el electrodo de trabajo estaba lleno de sangre.

Unos días antes de usar los detectores, se tomaron medidas de capacitancia en seco para determinar la uniformidad del volumen de la cámara de muestra. La variación de capacitancia reflejó que los electrodos no estaban bien alineados y/o una variación en el espesor del adhesivo. La capacitancia media medida fue de 7,49 pF con una desviación típica de 0,28 pF o del 3,8%. La capacitancia máxima medida fue de 8,15 pF y la capacitancia mínima medida fue de 6,66 pF.

Los detectores se usaron para determinar la concentración de glucosa en muestras de sangre obtenidas de 23 personas. En el estudio, la gente tenía una edad entre 26 y 76 años, catorce eran hombres y nueve eran mujeres. A seis de las personas se les diagnosticó diabetes de tipo 1, a dieciséis se les diagnosticó diabetes de tipo 2 y se desconocía el estado diabético de una persona. Las personas del estudio tenían un hematocrito medio del 40,7% con una desviación típica del 3,9%. El hematocrito máximo fue del 49% y el hematocrito mínimo fue del 33,2%.

Se tomó una muestra de sangre de cada persona pinchando el dedo del sujeto. Se llenó un detector de pequeño volumen con esta sangre residual.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un detector (20) para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido, comprendiendo el detector:

un par de electrodos que comprende un electrodo de trabajo (22, 502, 522, 542, 562, 580, 602, 642, 1010) y un contraelectrodo (24, 510, 530, 550, 570, 584, 610, 650, 1020), en el que al menos una parte del electrodo de trabajo está a una distancia eficaz de no más de 200 µm de una parte del contraelectrodo y, opcionalmente, el contraelectrodo es un contraelectrodo/electrodo de referencia;

un electrodo de referencia opcional (512, 532, 552, 572, 585, 612, 652);

una cámara de muestra (26, 526, 546, 566, 582, 606, 646) para contener la muestra de fluido en contacto electrolítico con el electrodo de trabajo, el contraelectrodo y el electrodo de referencia, si está presente, comprendiendo la cámara de muestra una zona de medida situada al lado del electrodo de trabajo, el contraelectrodo y el electrodo de referencia, si está presente, dimensionándose la zona de medida para contener un volumen de no más de aproximadamente 1 µl de muestra de fluido y la cámara de muestra se dimensiona para no contener más de aproximadamente 1 µl de muestra de fluido; y

una enzima sensible al analito y un mediador redox difusible dispuestos en la zona de medida;

habiéndose configurado y dispuesto el detector de manera que una señal de fondo generada por el mediador redox difusible no es más de la señal generada por la oxidación o la reducción de la cantidad media fisiológicamente normal de analito.
2. Un detector (20) para determinar la concentración de: el analito glucosa en una muestra de fluido, comprendiendo el detector:

un par de electrodos que comprende un electrodo de trabajo (22, 502, 522, 542, 562, 580, 602, 642, 1010) y un contraelectrodo (24, 510, 530, 550, 570, 584, 610, 650, 1020), en el que el electrodo de trabajo y el contraelectrodo están separados por una distancia eficaz en un intervalo de 25 a 1000 µm;

una cámara de muestra (26, 526, 546, 566, 582, 606, 646) para contener la muestra de fluido, comprendiendo la cámara de muestra una zona de medida situada al lado del electrodo de trabajo y del contraelectrodo, dimensionándose la zona de medida y la cámara de muestra para contener un volumen de no más de aproximadamente 1 µl de muestra; y

una enzima sensible al analito y un mediador redox difusible dispuestos en la zona de medida;

estando configurado y dispuesto el detector de manera que una señal de fondo generada por el mediador redox difusible no es más de cinco veces una señal generada por la oxidación o la reducción de glucosa 5 mM y la señal generada por la oxidación o la reducción de la cantidad media fisiológicamente normal de analito.
3.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el detector se configura y se dispone de manera que una señal de fondo generada por el mediador redox difusible no es mayor del 25% de la señal generada por la oxidación o reducción del analito y, preferiblemente, no mayor del 5% de la señal generada por la oxidación o reducción del analito.
4.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo el detector:

(a)

un primer sustrato (500, 520, 540, 560, 579, 600, 640) que tiene un extremo proximal y un extremo distal, definiendo el primer sustrato un primer extremo lateral (656) y un segundo extremo lateral (658) del detector electroquímico que se extiende desde el extremo proximal al extremo distal del primer sustrato, configurándose y disponiéndose el extremo distal para insertarlo dentro de un detector de lectura;

(b)

un segundo sustrato (508, 528, 548, 568, 583, 608, 648) dispuesto sobre el primer sustrato, disponiéndose el electrodo de trabajo sobre uno de los sustratos primero o segundo y disponiéndose el contraelectrodo sobre uno de los sustratos primero o segundo;

(c)

un espaciador (28, 504, 524, 544, 564, 581, 604, 644) dispuesto entre el sustrato primero y segundo y definiendo una primera abertura a lo largo del primer extremo lateral del detector y una segunda abertura lateral a lo largo del segundo extremo lateral del detector, extendiéndose la cámara de muestra desde la primera abertura hasta la segunda abertura; y

(d)

al menos un electrodo indicador dispuesto sobre al menos uno de los sustratos primero y segundo y situado relativo a cualquier zona de medida o a la cámara de muestra para determinar cuando la zona de medida o la cámara de muestra contiene muestra.
5.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el detector comprende:

(a)

un primer sustrato que tiene un extremo proximal y un extremo distal, configurándose y disponiéndose el extremo distal para insertarlo dentro de un detector de lectura, definiendo el primer sustrato un primer extremo lateral y un segundo extremo lateral del detector electroquímico que se extiende desde el extremo proximal hasta el extremo distal del primer sustrato;

(b)

un segundo sustrato dispuesto sobre el primer sustrato, disponiéndose el electrodo de trabajo sobre uno

de los sustratos primero o segundo y disponiéndose el contraelectrodo sobre uno de los sustratos primero o segundo;

(c)

un espaciador dispuesto entre el sustrato primero y segundo y definiendo una primera abertura a lo largo del primer extremo lateral del detector y una segunda abertura lateral a lo largo del segundo extremo lateral del detector, extendiéndose la cámara de muestra desde la primera abertura hasta la segunda abertura; y

(d)

al menos un electrodo indicador dispuesto al menos sobre uno de los sustratos primero y segundo y situado relativo a cualquier zona de medida o a la cámara de muestra para determinar cuando la zona de medida o la cámara de muestra contienen muestra.
6.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el detector comprende un electrodo indicador dispuesto en el detector para indicar cuándo la zona de medida contiene una muestra o cuándo la cámara de muestra contiene una muestra.
7.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el electrodo indicador también es un electrodo de trabajo o un contraelectrodo.
8.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, que además comprende una señal visual o auditiva, acoplada al electrodo indicador, que se activa cuando el electrodo indicador indica que la zona de medida o la cámara de muestra contienen muestra.
9.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que el electrodo indicador está dispuesto en relación enfrentada con uno de los electrodos de trabajo y el contraelectrodo.
10.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que el detector comprende al menos dos electrodos indicadores dispuestos en el detector, indicando el primer electrodo indicador cuándo la zona de medida o la cámara de muestra está empezando a llenarse con muestra, un segundo electrodo indicador que indica cuándo la zona de medida o la cámara de muestra están suficientemente llenas con muestra.
11.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que el detector comprende al menos dos electrodos indicadores dispuestos en el detector, comprendiendo los dos electrodos indicadores un primer contraelectrodo/electrodo indicador y un segundo contraelectrodo/electrodo indicador, disponiéndose el contraelectrodo entre el primer y el segundo contraelectrodos/electrodos indicadores.
12.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la zona de medida y la cámara de muestra tienen el mismo volumen.
13.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el analito es glucosa y la enzima sensible al analito es una enzima sensible a glucosa.
14.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el analito es un fármaco.
15.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la zona de medida está unida en al menos dos lados por el electrodo de trabajo y el contraelectrodo y, opcionalmente, el electrodo de trabajo y el contraelectrodo forman un par de electrodos enfrentados con la zona de medida situada entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo.
16.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el detector está dispuesto de manera que el mediador oxide al analito y el potencial de onda media del mediador redox, medido por voltametría cíclica en NaCl 0,1 M a pH 7, no es mayor de aproximadamente +100 milivoltios con respecto al potencial del contraelectrodo/electrodo de referencia.
17.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el detector está dispuesto de manera que el mediador oxide al analito y el potencial de onda media del mediador redox, medido por voltametría cíclica en NaCl 0,1 M a pH 7, es aproximadamente igual que el potencial del contraelectrodo/electrodo de referencia.
18.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, estando dispuesto el detector de manera que el mediador oxide al analito y el potencial de onda media del mediador redox, medido por voltametría cíclica en NaCl 0,1 M a pH 7, no es mayor de aproximadamente -150 milivoltios con respecto al potencial del contraelectrodo/electrodo de referencia..
19.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que, en interior del detector, el coeficiente de difusión eficaz del mediador redox a través de la muestra de fluido es menor que el coeficiente de difusión eficaz del analito a través de la muestra de fluido y, preferiblemente, al menos diez veces menor que el coeficiente de difusión eficaz del analito a través de la muestra de fluido.
20.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que el mediador difusible tiene un peso molecular de al menos 5.000 dalton.
21.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el detector está configurado y dispuesto de manera que el mediador redox se electroliza más fácilmente sobre el electrodo de trabajo que el contraelectrodo.
22.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que el detector comprende una cantidad molar del mediador redox que no es, en base estequiométrica, mayor de una cantidad media fisiológica normal del analito y, preferiblemente, el detector comprende una cantidad molar que no es, en base estequiométrica,

mayor del 20% de una cantidad media fisiológica normal.
23.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que el electrodo de trabajo tiene un área superficial de no más de aproximadamente 0,01 cm2 expuesta en la zona de medida.
24.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que la actividad de la enzima no es mayor de 1 unidad/cm3.
25.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que el detector está dispuesto de manera que el mediador redox difusible precipita cuando reacciona en el contraelectrodo.
26.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en el que el detector está dispuesto de manera que un producto matemático del coeficiente de difusión eficaz del mediador redox y la concentración del mediador redox no es mayor de 1 x 10-12 moles cm-1 s-1 cuando la muestra de fluido llena la zona de medida.
27.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, en el que el mediador redox difusible está dispuesto sobre el electrodo de trabajo.
28.

Un detector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que la enzima sensible al analito está dispuesto sobre el electrodo de trabajo.
29.

Un procedimiento para determinar una concentración de un analito en una muestra, comprendiendo las etapas de:

poner en contacto una muestra con cualquiera de los detectores electroquímicos de las reivindicaciones 1 a 28;

generar una señal del detector en el electrodo de trabajo, y

determinar la concentración del analito usando la señal del detector.
30.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, en el que la señal de fondo que genera el mediador redox difusible no es mayor que la señal generada por la oxidación o la reducción de las cantidad media fisiológicamente normal de analito.
31.

Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30, en el que determinar la concentración del analito comprende determinar la concentración del analito por culombimetría usando la señal del detector.
32.

Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30, en el que determinar la concentración del analito comprende determinar la concentración del analito por amperometría usando la señal del detector.
33.

Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30, en el que determinar la concentración del analito comprende determinar la concentración del analito por potenciometría usando la señal del detector.
34.

Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30, en el que determinar la concentración del analito comprende determinar la concentración del analito por cronoamperometría usando la señal del detector.
35.

Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30, en el que determinar la concentración del analito comprende determinar la concentración del analito por cronopotenciometría usando la señal del detector.
36.

Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30, en el que determinar la concentración del analito comprende determinar la concentración del analito por la técnica de medida de Cotrell usando la señal del detector.
37.

Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 36, que además comprende:

proporcionar datos de calibrado en un lote de detectores electroquímicos a un instrumento de medida, comprendiendo dichos datos de calibrado información relacionada con una magnitud de una carga de fondo para el lote de detectores electroquímicos;

comprendiendo la etapa de determinación de la concentración del analito determinar la concentración del analito usando una señal del detector y los datos de calibrado.
38. Un procedimiento para determinar una concentración de un analito en una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

poner en contacto una muestra con cualquiera de los detectores electroquímicos de las reivindicaciones 1 a 28;

observar una señal del electrodo indicador que significa que la zona de medida contiene muestra;

aplicar un potencial entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo para electrolizar el analito en la muestra; generar una señal sensible al analito desde el detector como respuesta a la electrolisis del analito en la muestra; y

determinar la concentración del analito usando la señal sensible al analito.
39. Un procedimiento para fabricar cualquiera de los detectores electroquímicos de las reivindicaciones 1 a 28, comprendiendo el procedimiento:

(a)

formar una pluralidad de electrodos de trabajo sobre un primer sustrato;

(b)

formar una pluralidad de contraelectrodos sobre un segundo sustrato;

(c)

disponer una capa espaciadora sobre uno de los sustratos primero y segundo;

(d)

retirar una parte de la capa espaciadora para definir zonas de la cámara de muestra;

(e)

laminar los sustratos primero y segundo conjuntamente; y

(f)

separar una pluralidad de detectores electroquímicos de los sustratos laminados, comprendiendo cada detector electroquímico al menos uno de los electrodos de trabajo, al menos uno de los contraelectrodos y al menos una de las zonas de la cámara de muestra.
40.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 39, en el que el primer sustrato es una primera zona de un sustrato y el segundo sustrato es una segunda zona del sustrato y que además comprende:

plegar el sustrato para recubrir las zonas primera y segunda del sustrato.
41.

Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 39 y 40, en el que separar la pluralidad de detectores electroquímicos comprende cortar el primer y segundo sustratos para separar los detectores electroquímicos y para definir al menos un extremo de la cámara de muestra de los detectores electroquímicos.
42.

Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 39 a 41, que además comprende formar una pluralidad de electrodos indicadores sobre uno de los sustratos primero y segundo.
43.

Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 39 a 42, en el que la parte de la capa espaciadora se retira para definir las zonas de la cámara de muestra después de disponer la capa espaciadora sobre uno de los sustratos primero y segundo.