ES3034914A1 - Biosensor electroquimico y metodo para la deteccion o cuantificacion de un analito - Google Patents

Abstract

Biosensor electroquímico para la detección y/o cuantificación de al menos un analito de una muestra líquida, que comprende una entrada (10) de muestra líquida, una zona (19) de contactos eléctricos, un sustrato (11) de soporte que comprende al menos un juego de electrodos (12) que comprende al menos un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia, en donde el electrodo de trabajo comprende al menos una enzima y opcionalmente un mediador, y una cubierta aislante (13), caracterizado porque entre el sustrato (11) y la cubierta aislante (13) hay un tramo (18) conectado en comunicación fluídica con la entrada (10), comprendiendo dicho tramo (18) una cámara de detección (16) en donde se dispone el juego de electrodos (12), comprendiendo el biosensor (100) una salida (17) de muestra líquida que está en comunicación fluídica con el tramo (18), de tal manera que permite la circulación de la muestra (10) líquida por capilaridad entre la entrada (10) y salida (17) a través del tramo (18) y la cámara de detección (16). Método para la detección o cuantificación de al menos un analito disuelto en una muestra líquida mediante el biosensor electroquímico.

Description

DESCRIPCIÓN

Biosensor electroquímico y método para la detección o cuantificación de un analito

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se relaciona con biosensores electroquímicos.

ESTADO ANTERIOR DE LA TÉCNICA

Los sensores electroquímicos son conocidos para la determinación y/o cuantificación de analitos presentes en muestras líquidas. Un «sensor electroquímico» es un dispositivo que registra cambios en la corriente eléctrica o potencial derivados de su interacción con el analito de interés. Estos cambios son transducidos a una señal eléctrica que se puede correlacionar con una cantidad, una concentración o un nivel del analito de interés en una muestra.

La portabilidad, el fácil manejo, la capacidad de realizar análisis rápidos con poco pretratamiento de la muestra y pequeños volúmenes de muestra, el procedimiento simple y el bajo costo son algunos de los requisitos previos para una aplicación exitosa en cualquier método analítico. Los biosensores electroquímicos enzimáticos basados en el empleo de electrodos serigrafiados suelen ser una buena solución en respuesta a estas necesidades. No obstante, dependiendo del analito a medir, por ejemplo, en el caso de los nitritos, el oxígeno presente en la muestra y/o zona de reacción puede interferir en la medida dando un resultado analítico erróneo.

Purgar argón o desgasificar la solución de trabajo antes del análisis suele ser la técnica más comúnmente empleada, pero aparte de esto, se han intentado varios mecanismos de eliminación de oxígeno, como el uso de eliminadores químicos y enzimáticos.

EXPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN

El objeto de la invención es el de proporcionar un biosensor electroquímico y un método para la detección y/o cuantificación de al menos un analito, según se define en las reivindicaciones.

Un primer aspecto de la invención se refiere a un biosensor electroquímico para la detección y/o cuantificación de al menos un analito presente en una muestra líquida, comprendiendo el biosensor una entrada de la muestra líquida, una zona de contactos eléctricos, un sustrato de soporte que comprende al menos un juego de electrodos, dicho juego comprendiendo al menos un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia, en donde el electrodo de trabajo comprende al menos una enzima y opcionalmente un mediador cuyos procesos redox (oxidación y/o reducción electroquímica) se dan a un potencial respecto al electrodo de referencia, y una cubierta aislante. El biosensor de la invención comprende entre el sustrato y la cubierta aislante un tramo conectado en comunicación fluídica con la entrada, comprendiendo dicho tramo una cámara de detección en donde se dispone el juego de electrodos, y una salida de muestra líquida que están en comunicación fluídica con el tramo, de tal manera que permite la circulación de la muestra líquida por capilaridad entre la entrada y salida a través del tramo y la cámara de detección.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método para la detección o cuantificación de al menos un analito disuelto en una muestra líquida mediante el biosensor electroquímico de la invención, comprendiendo el método las siguientes etapas:

a) Introducir una cantidad de muestra líquida a analizar a través de la entrada hasta llenar completamente el tramo;

b) Aplicar un potencial al juego de electrodos durante un determinado periodo de tiempo con respecto al electrodo de referencia;

c) Medir la intensidad de corriente producida por la reacción redox; y

d) Traducir el dato de intensidad de corriente obtenido en la etapa anterior mediante una curva de calibrado obtenida a partir de muestras patrón que comprenden diferentes concentraciones del analito a determinar.

Gracias a la invención, las posibles interferencias en el proceso de reacción enzima-mediadoranalito por el efecto de contaminantes o elementos ambientales sobre la muestra se ve disminuido o eliminado, según el caso. Tal y como se muestra en los ejemplos que se aportan, gracias a la invención se minimiza la interferencia debida al oxígeno u otros elementos ambientales presentes durante la medición. La invención además aporta otras ventajas como una mayor simplicidad estructural del biosensor y de método.

Estas y otras ventajas y características de la invención se harán evidentes a la vista de las figuras y de la descripción detallada de la invención.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las figuras 1A y 1B muestran una vista explosionada (Fig. 1A) y no explosionada (Fig. 1B) de un biosensor según una realización de la invención.

Las figuras 2A y 2B muestran una vista explosionada (Fig. 2A) y no explosionada (Fig. 2B) de un biosensor según otra realización de la invención.

Las figuras 3A y 3B muestran vista explosionada (Fig. 3A) y no explosionada (Fig. 3B) de un biosensor según otra realización de la invención.

La figura 4 muestra gráficos que representan el funcionamiento de un sensor según unas realizaciones de la invención.

La figura 5 muestra gráficos que representan el funcionamiento comparativo de un biosensor de nitrito según una realización de la invención frente a un biosensor de referencia.

La figura 6 muestra gráficos de la recta de calibrado obtenido con los biosensores de la figura 5.

La figura 7 muestra gráficos que representan el funcionamiento comparativo de un biosensor de nitrito según la realización de la figura 5 en presencia (7B) y en ausencia (7A) de un oxygen scavenger.

EXPOSICIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Tal y como se muestra en las figuras 1A a 3B, el biosensor electroquímico de la invención para la detección y/o cuantificación de al menos un analito presente en la muestra líquida, comprende una entrada 10 para la muestra líquida que comprende el analito, una zona 19 de contactos eléctricos, y un sustrato 11 de soporte, en forma de lámina, que comprende al menos un juego de electrodos 12 serigrafiados y una cubierta aislante 13 en forma de lámina. El juego de electrodos comprende al menos un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y opcionalmente un contraelectrodo, en donde el electrodo de trabajo comprende al menos una enzima y opcionalmente un mediador electroquímico depositados, preferiblemente inmovilizados, sobre el mismo, y cuyos procesos redox se dan a un potencial determinado con respecto al electrodo de referencia. Entre el sustrato 11 y la cubierta aislante 13 hay un tramo 18 conectado en comunicación fluídica con la entrada 10 para la muestra líquida, estando en el tramo 18 una cámara de detección 16 en donde se dispone el juego de electrodos 12. En la cámara de detección es donde ocurre la reacción electroquímica. El biosensor también comprende una salida 17 para la muestra líquida que está en comunicación fluídica con el tramo 18, de tal manera que permite la circulación de la muestra líquida por capilaridad entre la entrada 10 y salida 17 a través del tramo 18 y la cámara de detección 16. La entrada 10 y la salida 17 consisten en aberturas en el biosensor que comunican fluídicamente con el tramo 18.

Por “inmovilizado” se entiende que está atrapado sobre, o unido químicamente a, la superficie del electrodo. La enzima y el mediador están «inmovilizados» en un sensor, por ejemplo, cuando están unidos de manera covalente, iónica o coordinadamente a los constituyentes del sensor y/o están atrapados en una matriz o membrana polimérica o sol-gel que impide la movilidad de los mismos.

En una realización preferente, tal y como se muestra en las figuras 1A a 3B, en una dirección longitudinal X, el biosensor tiene un extremo proximal X1, un extremo distal X2 y una zona central X3. La zona 19 de contactos eléctricos está en el extremo distal X2 del biosensor, la entrada 10 de muestra líquida está en el extremo proximal X1 y la salida 17 de muestra líquida se dispone en la zona central X3, en una posición anterior a la zona 19 de contactos eléctricos.

En una realización, mostrada en la figura 1A y 1B, la salida 17 consiste en una abertura en la cubierta aislante 13, en una posición anterior a la zona 19 de contactos eléctricos y posterior al juego de electrodos.

Tal y como se muestra en las figuras 2A, 2B y 3A, 3B, para un mejor control de la salida de muestra líquida, el tramo 18 que define la cámara de detección 16 comprende al menos un canal fluídico 16a lateral que está en comunicación fluídica con la salida 17 de muestra líquida, estando la salida 17 en un lateral 17a del biosensor. En una realización preferente, en la dirección longitudinal X, el canal fluídico lateral 16a se dispone en una posición posterior al juego de electrodos 12, en un ángulo con respecto a la dirección longitudinal X de entre 90° y 175°, coincidiendo la salida del canal fluídico con la salida 17 de muestra líquida. La disposición de estas salidas de muestra favorece que la muestra líquida cubra la cámara de detección y que cualquier salida de muestra líquida durante el uso de biosensor esté alejada de la zona 19 de contactos eléctricos. La realización del canal fluídico lateral 16a, con ángulo menor a 90° impide aún más el efecto del oxígeno en la reacción.

En una realización preferente, la cámara de detección 16 comprende un canal fluídico que está en comunicación fluídica con la entrada 10 de muestra líquida. Este tipo de configuración permite la generación de un canal interno de entrada de muestra líquida hacia la cámara de detección 16.

En las figuras 2A, 2B y 3A, 3B se muestran biosensores con al menos una lámina separadora 14 divida en dos partes 14a y 14b, las cuales definen la geometría que dispondrá el tramo 18 con su cámara de detección y canales fluídicos, una vez la lámina se una al soporte y la cubierta.

En una realización preferente, el biosensor comprende al menos una lámina separadora 14 entre el sustrato 11 y la cubierta 13. La lámina separadora 14, junto con el sustrato 11 y la cubierta 13 definen el tramo 18 así como su geometría. La lámina separadora 14 tiene dos caras, estando unida o adherida por una de las caras al sustrato 11 y por la otra cara a la cubierta 13. En la realización que no comprende la lámina separadora 14, el sustrato 11 y la cubierta 13 están unidas o adheridas entre sí, de tal manera que dejan un espacio sin unir el cual define el tramo 18, así como su geometría.

Con respecto a los materiales, en una realización preferente:

- El sustrato 11 de soporte comprende un material aislante y no poroso. A modo de ejemplo no limitativo, el sustrato comprende o consiste en tereftalato de polietileno (PET), policarbonato (PC), poliimida, alúmina u otros materiales cerámicos, papel para electrónica impresa, cloruro de polivinilo (PVC), politetrafluoroetileno (PTFE), preferiblemente PET, PC o alúmina.

- La cubierta aislante 13 comprende un área hidrofílica que está en contacto con el tramo 18. A modo de ejemplo, pero no limitativo, la cubierta comprende o consiste en tereftalato de polietileno (PET), policarbonato (PC), policloruro de vinilo (PVC) o poliéster (PL). La cubierta aislante 13 puede ser translúcida o transparente de tal manera que permite visualizar el juego de electrodos 12 y la cámara de detección 16. - La lámina separadora (14) comprende un material aislante eléctrico seleccionado entre adhesivos sensibles a la presión (PSA) y/o adhesivos térmicos y/o polidimetilsiloxano (PDMS), y/o polietileno (PE), tereftalato de polietileno (PET), policarbonato (PC) y/o polimetilmetacrilato (PMMA) recubiertos de un adhesivo por ambas caras, de tal manera que se adhieran al sustrato y a la cubierta aislante.

En una realización preferente, el sustrato 11 comprende PET, la cubierta aislante comprende PL y la lámina separadora 14 comprende PE.

Con respecto a la cámara de detección 16, en una realización preferente, la cámara de detección alberga entre 5 y 50 μL, preferiblemente 40 μL, con la ventaja adicional de que no se requieren muestras de gran volumen de muestra líquida de análisis.

Con respecto al origen de la muestra líquida, esta puede ser de origen biológico, alimentario o medioambiental, preferiblemente de origen alimentario. La muestra de origen puede ser sometida un pretratamiento que permita la disolución del analito a cuantificar o detectar. A modo de ejemplo pero no limitativo, la muestra puede ser pretratada, por ejemplo, mediante filtración, dilución o pretratamiento con compuestos químicos.

Con respecto a las dimensiones del biosensor, preferiblemente comprende las siguientes dimensiones:

- el biosensor tiene un tamaño de entre 15 y 20 mm de ancho y 25 y 40 mm de largo y 150 μm y 2,4 mm de grosor, preferiblemente 300 μm.

- la entrada tiene un tamaño de entre 2 y 5 mm, preferiblemente 3 mm

- la salida tiene un tamaño de entre 2 y 5 mm, preferiblemente 1,5 mm.

- la cámara de detección tiene entre 14 y 17 mm y 6 y 9 mm.

- El ancho del canal fluídico es menor que el largo, siendo la anchura de entre 2 y 5 mm, preferiblemente de 1,5 mm.

- El grosor del sustrato, de la cubierta y de la lámina separadora es de entre 50 y 800 μm cada uno, preferiblemente de 100 μm de grosor cada uno.

El biosensor de la invención, por lo tanto, comprende unas dimensiones que le permiten un transporte fácil y manipulación por parte del usuario.

Con respecto a los mediadores, este puede ser seleccionado entre mediadores orgánicos, inorgánicos, organometálicos o polímeros redox.

En el caso de mediadores orgánicos, en una realización preferente, este es seleccionado entre viológenos, azul de metileno, verde de metileno, azul de bromofenol, fenotiazinas, fenoxazinas, sales de Wurster, citocromo C, quinoideos y sus derivados, fulvalenos y derivados y/o anilinas, entre otros.

En el caso de los mediadores inorgánicos, este es seleccionado entre complejos de rutenio, cobalto y hexacianoferrato (II y/o III), entre otros.

En el caso de los mediadores organometálicos, estos son seleccionados entre, ferrocenos y derivados, complejos de osmio, hierro y/o rutenio, pentacianoferrato con piridina, pirazol, imidazol o heterociclos, entre otros.

En el contexto de la invención, por mediador se entiende un compuesto con actividad redox que facilita la transferencia de electrones de la enzima con la superficie electródica una vez que se ha producido la reacción enzimática. El empleo de mediadores para facilitar una catálisis enzimática es necesario en el caso de que la enzima no tenga una transferencia electrónica directa con el electrodo o en el caso de que esta sea poco efectiva. En el primer caso, el mediador permite el transporte de electrones del centro activo de la enzima con la superficie electródica. En el segundo caso, el mediador redox mejora la transferencia electrónica entre enzima y superficie electródica aumentando la eficiencia catalítica y por lo tanto la sensibilidad del dispositivo.

Con respecto al enzima, en una realización preferente, la enzima es seleccionada entre reductasas, oxidasas, deshidrogenasas, y/o oxidorreductasas. En una realización, la enzima es una reductasa y es seleccionada entre nitrito reductasa, nitrato reductasa, citocromo C reductasa, aldehído reductasa, glutatión reductasa, cetona reductasa o acetoacetil-CoA reductasa, entre otras. En otra realización, la enzima es una oxidasa y es seleccionada entre glucosa oxidasa, NAD(P)H oxidasa, alcohol oxidasa o citocromo oxidasa, entre otras. En otra realización, la enzima es una deshidrogenasa y es seleccionada entre glucosa deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa, o glutamato deshidrogenasa, entre otras. En otra realización, la enzima es una oxidorreductasa y es seleccionada entre peroxidasas, hidroxilasas, oxidasas y reductasas, entre otras.

Con respecto al juego de electrodos, en una realización preferente el juego de electrodos 12 están serigrafiados sobre el sustrato, donde el electrodo de referencia es serigrafiado con tintas de Ag/AgCl o Ag, preferiblemente de Ag/AgCl, el electrodo de trabajo de tinta de grafito, grafeno, carbono, nanotubos de carbono, oro, platino, preferiblemente de grafito, y en las realizaciones que comprende el contraelectrodo, de grafito, grafeno, carbono, nanotubos de carbono, oro, platino, preferiblemente de grafito. El juego de electrodos 12 puede comprender más de un electrodo de trabajo.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método para la detección o cuantificación de al menos un analito disuelto en una muestra líquida mediante el biosensor electroquímico de la invención, que comprende las siguientes etapas:

a) introducir una cantidad de muestra líquida a analizar a través de la entrada 10 hasta llenar completamente el tramo 18,

b) aplicar un potencial, preferiblemente constante al juego de electrodos 12 durante un determinado periodo de tiempo, preferiblemente entre 20 y 60 segundos,

c) medir la intensidad de corriente producida por la reacción electroquímica y d) traducir el dato de intensidad de corriente obtenido en la etapa c) mediante una curva de calibrado obtenida a partir de muestras patrón que comprenden diferentes concentraciones del analito a determinar.

El potencial aplicado respecto al electrodo de referencia estará determinado por el enzima y mediador a utilizar. A modo de ejemplo, cuando la enzima es una reductasa, en una realización preferente, el potencial es un potencial negativo con respecto al electrodo de referencia, siendo este potencial preferiblemente entre -0.4V y -0.8V

Por traducir se entiende correlacionar el dato de intensidad de corriente con el valor de concentración.

En una realización preferente, en la etapa a) se introduce una cantidad de muestra líquida a analizar a través de la entrada 10 hasta llenar completamente la cámara de detección 16 forzando la salida de parte de la muestra líquida a analizar a través de la salida 17 de muestra líquida, asegurándose el usuario de que la cámara de detección se cubre o llena con la muestra líquida completamente y que se elimina cualquier presencia de burbuja en el interior de la cámara de detección.

Gracias al biosensor y al método de la invención se minimiza la presencia de oxígeno en la cámara de detección, por lo tanto, la interferencia del oxígeno en la reacción.

A continuación, se describen algunos ejemplos ilustrativos que ponen de manifiesto las características y ventajas de la invención, no obstante, no se deben interpretar como limitativos del objeto de la invención tal como está definido en las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1: Funcionamiento de distintos mediadores en un sensor de la invención sin enzima

Se fabricaron sensores de la invención, cada sensor comprendiendo un mediador depositado sobre el electrodo de trabajo:

- Sustrato: PET

- Cubierta aislante: PL

- Lamina separadora: PE

- Electrodos serigrafiados:

- Electrodo de trabajo: grafito

- Electrodo de referencia: Ag/AgCl

- Contraelectrodo grafito

- Mediador (uno por biosensor): metil viológeno (A), azul de metileno (B) , safranina (C), azul de bromofenol (D).

- Electrolito: Disolución de KCl 1M.

- Volumen de muestra: 40 μL

Se comparó el resultado con biosensores de referencia, que comprenden los mismos elementos excepto que no llevan una cubierta.

Equipo de medición: potenciostato comercial.

En la figura 4 se representan los voltamperogramas obtenidos con sensores con cubierta (línea continua) con respecto al de referencia ( línea discontínua) con cada mediador. En el eje x se muestran los datos de potencial aplicado y en el eje y la corriente registrada. Tal y como se puede observar en los gráficos de la figura 4, con los sensores con cubierta se obtienen curvas con picos de reducción mejor definidos y con potenciales menos negativos que con los sensores sin cubierta. Los procesos redox registrados con el sensor con cubierta muestran una mejor definición de los procesos electroquímicos de reducción, hecho que se debe principalmente al registro de una menor corriente de fondo, debido a la eliminación de la aportación a ésta de la reducción directa del oxígeno sobre la superficie electródica y/o de la interacción del oxígeno con el proceso redox del mediador/enzima.

Ejemplo 2: Biosensor de nitrito

Se fabricaron biosensores con cubierta y sin cubierta para la cuantificación de nitrito.

Materiales:

- Sustrato: PET

- Cubierta aislante: PL

- Lamina separadora; PE

- Electrodos serigrafiados:

- Electrodo de trabajo: grafito

- Electrodo de referencia: Ag/AgCl

- Contraelectrodo grafito

- Mediador y enzima: metil viológeno y nitrito reductasa

- Volumen de muestra: 40 μL

- Potencial aplicado: -0.725 V

- Tiempo de aplicación de potencial: 60 s

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Biosensor electroquímico para la detección y/o cuantificación de al menos un analito de una muestra líquida, que comprende una entrada (10) de muestra líquida, una zona (19) de contactos eléctricos, un sustrato (11) de soporte que comprende al menos un juego de electrodos (12) que comprende al menos un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia, en donde el electrodo de trabajo comprende al menos una enzima y opcionalmente un mediador, y una cubierta aislante (13),caracterizado porqueentre el sustrato (11) y la cubierta aislante (13) hay un tramo (18) conectado en comunicación fluídica con la entrada (10), comprendiendo dicho tramo (18) una cámara de detección (16) en donde se dispone el juego de electrodos (12), comprendiendo el biosensor (100) una salida (17) de muestra líquida que está en comunicación fluídica con el tramo (18), de tal manera que permite la circulación de la muestra (10) líquida por capilaridad entre la entrada (10) y salida (17) a través del tramo (18) y la cámara de detección (16).

2. Biosensor electroquímico según la reivindicación 1, en donde en una dirección longitudinal (X) el biosensor tiene un extremo proximal (X1), un extremo distal (X2) y una zona central (X3), en donde la zona (19) de contactos eléctricos se sitúa en el extremo distal (X2), la entrada (10) de muestra líquida se sitúa en el extremo proximal (X1) y la salida (17) de muestra líquida se sitúa en la zona central (X3) en una posición anterior a la zona (19) de contactos eléctricos.

3. Biosensor electroquímico según la reivindicación 2, en donde la cámara de detección (16) comprende al menos un canal fluídico (16a) lateral que está en comunicación fluídica con la salida (17) de muestra líquida, estando la salida (17) en un lateral del biosensor.

4. Biosensor electroquímico según la reivindicación 3, en donde en la dirección longitudinal (x), el canal fluídico lateral (16a) se dispone en una posición posterior al juego de electrodos (12) en un ángulo con respecto a la dirección longitudinal (x) de entre 90a y 175°.

5. Biosensor electroquímico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el biosensor comprende al menos una lámina separadora (14) entre el sustrato (11) y la cubierta (13) la cual junto con el sustrato (11) y la cubierta (13) define el tramo (18).

6. Biosensor electroquímico según la reivindicación 5, en donde la lámina separadora (14) comprende un material aislante eléctrico seleccionado entre adhesivos sensibles a la presión y/o adhesivos térmicos y/o polidimetilsiloxano, y/o polietileno, policarbonato y/o polimetilmetacrilato recubiertos de un adhesivo.

7. Biosensor electroquímico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sustrato (11) de soporte comprende un material aislante y no poroso.

8. Biosensor electroquímico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cubierta aislante (13) comprende un área hidrofílica que está en contacto con el tramo (18).

9. Biosensor electroquímico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cámara de detección (16) comprende al menos un canal fluídico que está en comunicación fluídica con la entrada (10) de muestra líquida.

10. Biosensor electroquímico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el mediador es seleccionado entre mediadores orgánicos, inorgánicos, organometálicos y/o polímeros redox.

11. Biosensor según la reivindicación 10, en donde el mediador es orgánico y es seleccionado entre viológenos, azul de metileno, verde de metileno, azul de bromofenol, fenotiazinas, fenoxazinas, sales de Wurster, citocromo C, quinoideos y sus derivados, fulvalenos y derivados y/o anilinas.

12. Biosensor según la reivindicación 10, en donde el mediador es inorgánico y es seleccionado entre complejos de rutenio, cobalto y/o hexacianoferrato (II y/o III)

13. Biosensor según la reivindicación 10, en donde el mediador es organometálico y es seleccionado entre, ferrocenos y derivados, complejos de osmio, hierro y/o rutenio y/opentacianoferrato con piridina, pirazol, imidazol o heterociclos.

14. Biosensor electroquímico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la enzima es seleccionada entre reductasas, oxidasas, deshidrogenasas, y/o oxidorreductasas.

15. Biosensor electroquímico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cámara de detección alberga entre 5 y 50 μL.

16. Biosensor electroquímico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el juego de electrodos (12) están serigrafiados sobre el sustrato, y comprenden el electrodo de referencia de Ag/AgCl o Ag, el electrodo de trabajo de grafito, grafeno, carbono, nanotubos de carbono, oro, y/o platino y opcionalmente un contraelectrodo de grafito, grafeno, carbono, nanotubos de carbono, oro y/o platino.

17. Método para la detección o cuantificación de al menos un analito disuelto en una muestra líquida mediante un biosensor electroquímico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende las siguientes etapas:

a) introducir una cantidad de muestra líquida a analizar a través de la entrada (10) hasta llenar completamente el tramo (18),

b) aplicar un potencial al juego de electrodos (12) durante un determinado periodo de tiempo,

c) medir la intensidad de corriente producida por la reacción redox, y

d) traducir el dato de intensidad de corriente obtenido en la etapa c) mediante una curva de calibrado obtenida a partir de muestras patrón que comprenden diferentes concentraciones del analito a determinar.

18. Método según la reivindicación 17, en donde en la etapa a) se introduce una cantidad de muestra líquida a analizar a través de la entrada (10) hasta llenar completamente la cámara de detección (16) forzando la salida de parte de la muestra líquida a analizar a través de la salida (17) de muestra líquida.