JP6817941B2 - ヘモグロビン及び複合体を検出するための装置及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、一般に、生体試料中のバイオ検体を定量測定するためのバイオセンサ及び方法に関する。本発明は、特に、少量の血液サンプル中の電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を電気化学的に活性のバイオ検体及び複合体に変化させることで、ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン及びミオグロビンを正確に検出し定量測定する電気化学的に活性のバイオセンサに関する。

酸素は、人体内の様々な機能に関与する最も用途が広い分析試料である。酸素は、極性溶媒中よりも非極性溶媒中のほうがはるかに溶けやすい。単純な拡散では、十分迅速に二酸素を多細胞生物の内部細胞まで届けることができないため、ヘモグロビンやミオグロビンなどのキャリアが必要となる。ヘモグロビンは、人体における酸素運搬タンパク質である。

ヘモグロビンは、ヘム補欠分子族の形態の鉄（Ｆｅ^＋２）原子を４つ含む四次構造を有する水溶性球状タンパク質である。直接ヘモグロビンを電気化学検出することは難しい。中心のヘム鉄がグロビン鎖の内部に埋まっており、分子の電極表面到達が非常に難しい。ヘモグロビンは、赤血球中に存在する、分子量６４，５００ダルトンの酸素運搬金属タンパク質である。人体内には様々な形態のヘモグロビンが存在し、例えば、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン、メトヘモグロビン、カルボキシルヘモグロビン、スルフヘモグロビンなどがある。オキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンは酸素分子に結合してこれを運搬することができるが、他の形態のヘモグロビンは酸素に結合できない。

糖尿病は、多くの発展途上国や、先進国においても一部の人々の間で、世界的に重大な健康問題となっている。国際糖尿病連合によれば、世界中で３億８２００万人が糖尿病であり、２０３５年までに糖尿病患者数は５億９２００万人になると推定されている。３億８２００万人の糖尿病患者の大部分は４０歳から５９歳であり、その８０％が中・低所得国に住んでいる。すべてのタイプの糖尿病、特に２型糖尿病が増加しており、糖尿病患者数は２０３５年までに５５％増加するとみられている。この他に、妊娠中の高血糖が２１００万件あり、糖尿病の世界疾病負担の予備軍と考えられている。人命の面においても金銭面においても糖尿病の疾病負担は甚大であり、２０１３年には死者数が５１０万人にのぼり、保険医療費も約５４８０億ＵＳドルの（世界総支出の１１％）となっている。

２型糖尿病は、心臓血管疾患及び総死亡率の増加と関連している。疫学データには、典型的な心血管リスク因子、例えば、高コレステロール血症、高血圧症、喫煙などは、単独では、２型糖尿病における心血管罹患率及び死亡率を上げる過剰なリスクとはならないことが示されている。むしろ、過剰な罹患率や死亡率は、疾患そのものと関連している。１型糖尿病は、長期にわたる微小血管合併症及び大血管合併症の主な原因である。世界的にも、糖尿病性腎症は、最もよく見られる腎不全の原因の一つである。そのため、病因を理解し、これらの長期合併症を予防することは、糖尿病研究の主要な目標となっている。糖尿病研究の大きな焦点として、厳格な血糖コントロールによる糖尿病性合併症の予防がある。程度の差はあるが、高血糖が糖尿病性の微小血管合併症及び大血管合併症の主な原因となることは動かしがたい事実である。近年、血糖コントロールの様々なマーカの中で、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）が長期に渡る糖尿病管理では最も信頼できるバイオマーカであることが定着してきている。

Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｒｉａｌ（ＤＣＣＴ）及びＵｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｔｕｄｙ（ＵＫＰＤＳ）という大規模臨床研究では、糖尿病患者における微小血管疾患の発症を予防又は遅延させるには、厳格な血糖コントロールが重要であることを示している。Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｒｉａｌ（ＤＣＣＴ）では、ＨｂＡ１ｃ値と糖尿病性合併症の進行との関連性が示されている。糖尿病性合併症の進行のリスクは、ＨｂＡ１ｃ（糖化ヘモグロビン）と共に急激に増加する。

糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）は、グルコースや他のヘキソースのアルデヒド基とヘモグロビンの末端バリンのアミノ基との組み合わせの、非酵素的かつ基質濃度依存性の不可逆的プロセスによって形成される。ＧＨｂの概算による糖尿病患者の血糖コントロールの評価方法は信頼できる。血糖コントロールの様々なマーカの中で、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）は、長期に渡る糖尿病性合併症の進行の監視において最も信頼できるバイオマーカとして定着している。ＷＨＯによれば、ＨｂＡ１ｃは糖尿病の診断検査に使用できるとしている。糖尿病診断のカットポイントとしては、６．５％のＨｂＡ１ｃが推奨されている。ＨｂＡ１ｃ検査の検査値は、総ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンを、糖化ヘモグロビンのパーセンテージの形で出される。

糖化ヘモグロビン検出には様々な方法が利用でき、実験室で行っても、ポイントオブケア用装置で行ってもよい。これらの方法のほとんどは、総ヘモグロビンから糖化成分を分離すること、そして総ヘモグロビンと糖化ヘモグロビン成分を２種類の異なる技術を用いて検出することに基づいている。検出後の結果は、糖化ヘモグロビンを総ヘモグロビンで割ることにより、糖化ヘモグロビンのパーセンテージの形で算出される。本発明では、単一の試薬を使った技術で糖化ヘモグロビンの割合（％ＧＨｂ）を検出する電気化学的方法を開示する。

総ヘモグロビンは、貧血や他の血液疾患のバイオマーカである。ＷＨＯの報告によると、貧血は世界的な健康問題であり、世界中で１６億２０００万人の人々が患っている。貧血の罹患率は未就学児で最も高く、４７．４％である。４人に１人が貧血の患っており、そのうち妊婦と未就学児のリスクが最も高い。

メトヘモグロビンは、酸化形態のヘモグロビンであり、鉄の酸化数は＋３である。この形態のヘモグロビンは、酸素と結合することができない。健常者では、メトヘモグロビンの割合は１〜３％の間で変動する。この割合は、化学物質への暴露や酸化ストレスにより増加しうる。メトヘモグロビンは、メトヘモグロビン血症において公知のバイオマーカである。

メトヘモグロビン血症は、酸化ストレスや化学物質への暴露によって引き起こされる疾患であり、鉄中心のヘム補欠分子族が酸化され、酸素に結合できなくなるものである。メトヘモグロビン血症の一般的な治療法としては、メチレンブルーやアスコルビン酸の投与がある。メトヘモグロビン血症は、有機色素であるメチレンブルー（ＭＢ）色素を用いて治療することができる。

しかし、総ヘモグロビンにおけるメトヘモグロビンの割合は僅かなため、総ヘモグロビンと共にメトヘモグロビンも検出する電気化学的方法が必要である。

ミオグロビンは、主に筋肉組織にあるモノメリックのヘムタンパク質であり、細胞内の酸素貯蔵部位としての働きがある。血清中のミオグロビンは、筋肉組織の損傷や心筋梗塞においてもよく知られたマーカである。

ヘモグロビン検出に使用される既知の装置及び方法のほとんどは、免疫学的方法や、ラマン分光法やマイクロ流体工学のような複雑な機器の使用に基づくものであり、低コストのポイントオブケア用装置には最適とはいえない。

このため、血液サンプル中の総ヘモグロビン、グリコアルブミン、メトヘモグロビン、ミオグロビンなどのバイオ検体を電気化学的に検出し定量化することができる使い捨て可能装置に対する要望が非常に高い。

米国特許第７８５５０７９号は、酵素技術を用いた糖化ヘモグロビン用の光学的方法を開示している。

米国特許第８２０６５６３号は、血液サンプル中の糖化ヘモグロビンの割合を測定する方法を開示しており、分析段階の少なくとも１つが電気化学的に行われる。この方法は、カソードでの酸素電子還元反応におけるサンプル中の酸素量を電気化学的に測定することにより、サンプル中の総ヘモグロビン量を測定することを含む。

米国特許第８４６０５２５号は、血液サンプル中の糖化ヘモグロビンの割合を測定するための電気化学装置を開示している。この装置は、カソード、アノード及び１つ以上のセルを備える。この装置は、カソードでの酸素電子還元反応においけるサンプル中の酸素量を電気化学的に測定することによりサンプル中の総ヘモグロビン量を測定する際に、酸素を水に還元することができる酵素を含んでもよい。

米国特許第８５５７５９０号は、糖化ヘモグロビンを測定する方法を開示しており、血液サンプルを溶血させて溶血液にする工程と、ビーズが糖化ヘモグロビン結合物質と結合してなるビーズ結合体と溶血した血液サンプルとを反応させる工程と、反応させた血液サンプル中の総ヘモグロビン量を測定する工程と、ビーズ結合体と結合した糖化ヘモグロビンから正常ヘモグロビンを分離する工程と、が含まれる。

米国特許出願公開第２０１２／０２６１２５７号は、２つの異なる技術を用いた総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの電気化学的検出を開示している。グラフェン修飾電極を用いて糖化ヘモグロビンを検出する。

国際公開公報第２０１３／０９６８５６号は、ラマン分光法に基づく糖化ヘモグロビンの検出を開示している。

欧州特許第０２５６８５１号は、フェリシアン化物媒介に基づくヘモグロビン検出のための電気化学的方法を開示している。

欧州特許出願公開第２５６８２８１号は、ヘモグロビンの酸化に基づくヘモグロビンの電気化学的検出を開示している。

米国特許第４８７６２０５号は、ヘモグロビンによりフェリシアン化物がフェロシアン化物へ還元することで生じた電流の変化を監視することによるヘモグロビンの電気化学分析を開示している。

米国特許出願公開第２００４／０１８６３５９号は、監視されるマーカに特異的に結合する親和性リガンド又は結合メンバーに基づいてミオグロビンを検出する光バイオセンサを開示している。

Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、３０ （１９７０） ６７９−６８２には、Ｈｅｇｅｓｈらにより、シアン化物とメトヘモグロビンとの化反応に基づくメトヘモグロビン検出が開示されており、６３２ｎｍにおける光吸収の変化が測定されている。

本発明の主な目的は、電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を含む血液サンプルを採取及び保持し、引き続き、少量の血液サンプル中のヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及びミオグロビンを定量測定する電気化学的に活性の装置を提供することにある。

本発明の目的の１つは、少量の血液サンプル中のヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及びミオグロビンを連続して定量測定する電気化学的に活性の装置を収容するように構成された装置ホルダを提供することにある。

本発明の別の目的は、電気化学的に活性の装置を収容するように構成され、酸化還元電位の印加時に電気化学的に活性の装置を流れる酸化還元電流を測定することにより、少量の血液サンプル中のヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及びミオグロビンを検出及び定量測定するポイントオブケア用バイオセンサを提供することにある。

また、本発明の目的の１つは、電気化学的に活性の電極を流れる酸化還元電流を正確に測定することにより、少量の血液サンプル中のヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及びミオグロビンを検出及び定量測定する方法を提供することにある。

また、本発明の目的の１つは、少量の血液サンプル中の糖化ヘモグロビンを定量測定する方法を提供することにある。

図１は、少量の血液サンプル中の電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を受け取り、電気化学的に活性のバイオ検体及び複合体に変化させる電気化学的に活性の装置の二電極構造を示す概略分解図である。 図２は、本発明の一態様における電気化学的に活性の装置の三電極構造の概略分解図である。 図３ａは、本発明の更に別の態様における電気化学的に活性の装置の２対の三電極構造の概略分解図である。 図３ｂは、本発明の更に別の態様における電気化学的に活性の装置のトレイを備えた２対の三電極構造の概略分解図である。 図４ａは、ヘモグロビン測定用の三電極構造を有する電気化学的に活性の装置の概略上面図である。 図４ｂは、受容体が受容体膜の表面に配置され、溶血剤が溶解膜に配置された電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図４ｃは、受容体と溶血塩層が電極表面にある受容体膜に配置された電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図４ｄは、受容体が電極表面に配置され、溶血塩層を有する溶解膜が受容体の表面に配置された電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図４ｅは、受容体と溶血剤が電極に塗布された電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図４ｆは、受容体と溶血剤が電極の一部として一体化された電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図５ａは、糖化ヘモグロビンの割合を測定するための三電極構造を有する本発明の電気化学的に活性の装置の概略上面図である。 図５ｂは、受容体が受容体膜の表面に配置され、溶血塩層を有する溶解膜が受容体層の表面に配置された電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図５ｃは、受容体と溶血塩層が受容体膜に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図５ｄは、受容体が電極表面に配置され、溶血塩層を有する溶解膜が受容体の表面に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図５ｅは、受容体と溶血塩層が電極に配置された電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図５ｆは、受容体と溶血塩層が電極と一体的に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図５ｇは、受容体と受容体膜が電極に配置され、糖化ヘモグロビン濾過層とボロネート親和剤が受容体上に配置され、溶血塩を有する溶解膜が一番上に配置された電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図５ｈは、受容体が電極にある受容体膜に配置され、糖化ヘモグロビン濾過層が受容体上に配置され、溶血塩とボロネート親和剤が糖化ヘモグロビン濾過層上に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図５ｉは、受容体と溶血塩層とボロネート親和剤が共に電極にある糖化ヘモグロビン濾過層上に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図６ａは、メトヘモグロビン絶対量を定量測定するための２組の三電極構造を有する本発明の電気化学的に活性の装置の概略上面図である。 図６ｂは、受容体層を有する受容体膜と溶血塩層を有する溶解膜が電極に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図６ｃは、受容体層と溶血塩層が受容体膜に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図６ｄは、受容体層と溶解膜と溶血塩が電極に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図６ｅは、受容体層と溶血塩層が電極層上に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図６ｆは、受容体層と溶血塩層が電極の一部として一体化された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図７ａは、血液サンプル中のメトヘモグロビンの割合を測定するための２組の三電極構造を有する本発明の電気化学的に活性の装置の概略上面図である。 図７ｂは、電極に受容体膜とその上に受容体と溶解膜と溶血塩層が配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図７ｃは、受容体層と溶血塩層が受容体膜に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図７ｄは、受容体層と溶解膜と溶血塩層が電極に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図７ｅは、受容体層と溶血塩層が電極層上に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図７ｆは、受容体層と溶血塩層が電極と一体化された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図７ｇは、溶解膜と溶血塩層が受容体層１０５ｂ上に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図７ｈは、受容体層と溶血塩層が受容体膜に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図７ｉは、溶解膜が受容体層上に配置され、溶血塩層が溶解膜にある本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図７ｊは、受容体層と溶血塩層が電極に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図７ｋは、受容体層と溶血塩層が電極と一体化された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図８ａは、ミオグロビン測定用の三電極構造を有する本発明の電気化学的に活性の装置の概略上面図である。 図８ｂは、受容体膜が電極に配置され、受容体層が受容体膜に配置される本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図８ｃは、受容体層が電極に配置された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図８ｄは、受容体層が電極と一体化された本発明の電気化学的に活性の装置の概略断面図である。 図９は、ヘモグロビンバイオ検体と複合体を含む目的の血液サンプルを受け取るように構成された電気化学的に活性の装置を保持する本発明の装置ホルダの斜視図である。 図１０ａは、ヘモグロビンバイオ検体と複合体を定量測定し表示する本発明のポイントオブケア用バイオセンサの斜視図である。 図１０ｂは、本発明のポイントオブケア用バイオセンサの大まかな内部電子構造の概略図である。 図１１は、ヘモグロビンの酸化還元反応の模式図である。 図１２は、血液サンプル中の、アルカリヘマチンに変化した後のヘモグロビンのサイクリックボルタモグラムである。 図１３ａは、アルカリヘマチンに変化した後のヘモグロビンの様々な濃度におけるサイクリックボルタモグラムである。 図１３ｂは、様々なヘモグロビン濃度における還元電流に対するヘモグロビン値を示すプロットである。 図１４ａ及び図１４ｂは、イミダゾール及びピリジンＨＣｌの存在下におけるヘモグロビンを含む窒素複合体のサイクリックボルタモグラムを示す。 図１５は、全血液をヘミクロムに変化させる工程段階を示すフローチャートである。 図１６は、本発明の装置及びポイントオブケア用バイオセンサを用いてＨｂバイオ検体濃度を定量測定するための工程段階を示す高水準フローチャートである。 図１７は、本発明の装置及びポイントオブケア用バイオセンサを用いて糖化Ｈｂ濃度を定量測定するための工程段階を示す高水準フローチャートである。 図１８は、メチレンブルーのサイクリックボルタモグラムである。 図１９は、メトヘモグロビン血症におけるメチレンブルーの酸化還元挙動の模式図である。 図２０は、血液サンプル中のＭｅｔＨｂ濃度を定量測定するための工程段階を示す高水準フローチャートである。 図２１ａは、ピリジンヘミクロムに変化した後のヘモグロビンのイクリックボルタモグラムであり、図２１ｂは、酸化電流の変化に対するヘモグロビン濃度のプロットである。 図２２ａは、ヘモグロビンが病的範囲にある場合の酸化電流に対するヘモグロビン値を示すプロットであり、図２２ｂは、ヘモグロビンが病的範囲にある場合の酸化電流の変化に対するヘモグロビン値を示すプロットである。 図２３ａは、イミダゾール‐メトヘモグロビン複合体に変化した後のヘモグロビンのイクリックボルタモグラムであり、図２３ｂは、酸化電流に対するヘモグロビン値のプロットである。 図２４は、総ヘモグロビンと糖化Ｈｂ以外のヘモグロビンのサイクリックボルタモグラムである。 図２５は、糖化ヘモグロビンの割合％に対する酸化電流を示すプロットである。 図２６は、様々な濃度のミオグロビンのサイクリックボルタモグラムである。 図２７は、酸化還元電流に対するミオグロビン濃度のプロットである。

本発明は、導電路に接続された少なくとも１つの二電極部材を備えた、血液サンプルを採取及び保持するための電気化学的に活性の装置を提供する。二電極部材の上に配置された、受容体膜と一体化した受容体は、溶血剤を介して血液サンプルの赤血球（ＲＢＣ）から電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を受け取り、その電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を電気化学的に活性のバイオ検体及び複合体に変化させる。また、本発明は、本発明の装置を備えたポイントオブケア用バイオセンサと、少量の血液サンプル中のヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及びミオグロビンの濃度を検出し定量測定するための測定方法を提供する。本発明の装置、ポイントオブケア用バイオセンサ及び方法では、少量の血液サンプル中の酸化還元電流値を判定することにより、ヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及びミオグロビンの濃度の正確な測定を容易に行うことができる。

このように、本発明は、血液サンプルを採取及び保持するための電気化学的に活性の装置を提供する。また、本発明は、血液サンプルを載せた電気化学的に活性の装置を保持するホルダと、酸化還元電流値を測定することにより、バイオ検体を含む少量の血液サンプル中のヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及びミオグロビンを正確に検出し、定量測定するポイントオブケア用バイオセンサを提供する。

本発明の一態様では、血液サンプルを採取及び保持するための電気化学的に活性の装置は、基板に配置された少なくとも一対の導電路を備える。少なくとも一対の電極を有する電極部材が導電路に接続され、電極部材は、目的のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を電気化学的に活性のバイオ検体に変化させるために受容体で官能化されている。そして、溶血剤と化学的に接触する受容体は、少量の血液サンプルから電気化学的に不活性のバイオ検体を受け取り、これを電気化学的に活性のバイオ検体に変化させてその濃度を測定するように配置される。

本発明の別の態様では、本発明の電気化学的に活性の装置を保持するホルダは、装置検出・データ記憶・信号調整回路を有するハウジングを備える。ユニバーサル・シリアル・バス（ＵＳＢ）コネクタがハウジングの一端に設けられ、導電ポートがハウジングの他端に配置される。ホルダは、導電ポートを介して電気化学的に活性の装置を収容するように構成される。

本発明の更に別の態様では、少量の血液サンプル中のヘモグロビンバイオ検体及び複合体の濃度を測定するためのポイントオブケア用バイオセンサを提供する。ポイントオブケア用バイオセンサは、表示部材と本発明の電気化学的に活性の装置を挿入するためのインターフェースとを有するハウジングを備える。ポイントオブケア用バイオセンサには、マイクロＵＳＢ及びマイクロＳＤカードを挿入するためのスロットが設けられている。デジタル制御部は、ハウジング内に配置され、ヘモグロビンバイオ検体及び複合体を含む血液サンプルを載せた装置に酸化還元電位を印加するように構成される。また、デジタル制御部は、酸化還元電流を測定し、これをヘモグロビン及び複合体の濃度に直線的にマッチングさせることによりヘモグロビンバイオ検体及び複合体の濃度を表示するように構成される。

本発明の更なる態様では、受容体で官能化された少なくとも１つの二電極部材に酸化還元電位を印加し、電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を電気化学的に活性とすることで少量の血液サンプル中のバイオ検体濃度を測定する方法を提供する。ヘモグロビンバイオ検体及び複合体を含む少量の目的の血液サンプルを受容体上に載せ、対応する酸化還元電流と直線的にマッチングさせることにより、血液サンプル中のヘモグロビンバイオ検体濃度を測定する。

本発明の更に別の態様では、電気化学的に不活性のバイオ検体は、ヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及びミオグロビンである。

以下、添付の図面を参照して、本発明の好適な実施形態について説明する。図１は、血液サンプルを採取及び保持し、引き続き、血液サンプル中に存在するヘモグロビンバイオ検体を測定するように構成された電気化学的に活性の装置を示す。

図１に示す装置１００は、基板１０１を備えており、その上に装置の他の構成要素が組み立てられるベースとなっている。本実施形態において、基板１０１は、細長い円形構造として例示されている。しかし、基板１０１は、装置１００を保持するバイオセンサの形状及び構成に応じて、長方形、円形など他の形状をとることができることが理解される。基板１０１は、パターン電極の組み込みに適した任意の適切な剛性材料又は可撓性材料で形成することができる。基板１０１の好適な材料としては、例えば、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、エポキシ繊維複合材料、ポリアミド複合材料及び紙などの材料を使用することができる。また、基板１０１の好適な剛性材料としては、セラミック、ガラス又は同様の他の材料とすることができる。いずれの場合でも、基板１０１に適した材料の選択は、基板１０１が所望の強度及び柔軟性を有するだけでなく、電気絶縁体としても機能することができるように行われる。生体試料が基板１０１と物理的に接触したときに浸出しないように、基板１０１に親水性を持たせると効果的である。基板１０１の表面の質は、一般的には滑らかである。しかし、基板１０１の表面は、粗面であってもよく、及び／又は、凹みや穴があってもよい。また、基板１０１の端部は、バイオセンサへ容易に挿抜できるように、テーパー形状又は湾曲形状など適切な形状とされる。

一対の導電路１０２ａ及び１０２ｂが、基板１０１上に配置される。導電路１０２ａ及び１０２ｂは、スクリーン印刷、リソグラフィ、熱蒸着、スパッタリング、レーザパターニングなどのパターン形成法を用いて形成されるが、スクリーン印刷が好ましい。図１の例示的態様は、一対の導電路１０２ａ及び１０２ｂを形成して実施される。しかし、必要な導電路数は適切に増加・変更することができる。導電路１０２ａ及び１０２ｂの経路は、図１では直線状の路線として例示されている。多角形などの他の適切な構成の導電路を使用することもできる。導電路１０２ａ及び１０２ｂの材料は、銅、アルミニウム、金、銀、プラチナ、炭素などの導電性材料、その他の適切な導電性材料、又は、これらの材料の合金とすることができる。また、導電路１０２ａ及び１０２ｂの材料は、金、プラチナ、水銀、炭素、ガラス状炭素及びグラファイトなどのように電気化学的に活性とすることもできる。導電路１０２ａ及び１０２ｂは、以下に説明する本発明のバイオセンサと電気的接続したために使用される。

図１に示すように、一対の電極１０３ａ及び１０３ｂが、導電路１０２ａ及び１０２ｂにそれぞれ電気的に接続される。図１に示すように、電極１０３ａ及び１０３ｂは、導電路１０２ａ及び１０２ｂに重ねられ、導電路１０２ａ及び１０２ｂ上に層を形成するように導電路１０２ａ及び１０２ｂの終端に配置される。電極１０３ａ及び１０３ｂの材料は、金、プラチナ、水銀、炭素、ガラス状炭素及びグラファイトなどの電気化学的に活性な金属、有機物又は合金から選択される。図１に示す電極配置では、電極１０３ａは作用電極、電極１０３ｂは対電極となる。

受容体膜１０４は、図１に示すように一対の電極１０３ａ、１０３ｂ上に配置され、以下に説明する受容体を一体化するベース部材となる。膜１０４の材料は、ポリマ、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、綿布、ろ紙、又はＰＡＬ ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＢＩＯＤＹＮＥメンブレンやＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のメンブレンなどの他の市販の膜とすることができる。

本発明の装置１００は、ヒト血液サンプル中のヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及びミオグロビンなどのバイオ検体を個別に又は共に検出及び定量測定するために使用される。

そこで、本発明では、電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を対応する電気化学的に活性のヘモグロビンバイオ検体に変化させる受容体１０５が、受容体膜１０４と共に電極１０３ａ及び１０３ｂ上に配置される。受容体膜１０４は、主に、受容体１０５を保持するように、又は、後述するように受容体１０４として作用する物質を保持するためのベースとなるように構成される。使用する受容体膜１０４は所望の多孔度を有しており、バイオ検体の浸透性が所望のレベルとなるようにヘモグロビンバイオ検体のサイズよりも大きい、好ましくは７ｎｍ〜１４ミクロンの範囲の孔となっている。また、受容体膜１０４は、受容体１０５の一部として一体化することもできる。受容体膜１０４の材料は、ポリマ、セルロース、布地、紙又はその他の適切な材料である。

この好適な実施形態では、受容体１０５は、有機材料、無機材料又はこれらを組み合わせた物質のなど電気化学的に活性の物質の層として示されている。

ここで、受容体１０５に用いる有機材料は、ピリジン、ピリジンＨＣｌ、ヒドロキシピリジン、シアノピリジン、イミダゾール、ピラゾール、インドール、ピラミジン及びプリンなどのＮ−ヘテロ原子を有する複素環式有機材料からからなる群から選択される。本発明では、受容体１０５に好適な有機材料として、ピリジン及びイミダゾールが選択される。

一方、受容体１０５に適した無機材料は、アルカリ、好ましくはＮａＯＨ及びＫＯＨである。

有機材料と無機材料の組み合わせを受容体１０５に使用する態様では、好適な有機材料はメチレンブルー（ＭＢ）であり、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ_３）、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ_２）又はドデシル硫酸ナトリウムなどの無機酸化剤と共に用いられる。

本発明の更に別の態様では、血液サンプル中の糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）の濃度レベルを測定するために使用される受容体膜１０４は、ボロネート親和剤で処理される。ボロネート剤には、フェニルボロン酸（ＰＢＡ）、アミノフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）及びその誘導体など適切なボロン酸及び誘導体、好ましくはアミノフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）が選ばれる。

本発明の別の態様では、受容体膜１０４を設けることなく受容体１０５を直接電極表面に配置してバイオ検体を検出することもできる。

溶血剤が、好ましくは溶解膜に、受容体１０５と化学的に接触して配置されており、血液サンプルを受け取ってその血液サンプルの赤血球（ＲＢＣ）から電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を放出させる。こうして、受容体１０５がバイオ検体を電気化学的に活性とすることができる。

溶血剤は、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、ドデシル・ベンゼン硫酸ナトリウム、ラウリルジメチルアミンオキシド、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、フェリシアン化カリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、亜硝酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシン、臭化ジドデシルジメチルアンモニウム、オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物及び塩酸から、好ましくはドデシル硫酸ナトリウム及び臭化ジドデシルジメチルアンモニウムからなる群から選択される。

本発明で使用され、その濃度が定量測定されるバイオ検体は、電気化学的に不活性な形態のヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及びミオグロビンを含む。

受容体１０５と電極１０３ａ、１０３ｂとの化学的接触は、以下のように開始することが好ましい。受容体１０５の溶液を調製した後、膜１０４を備えた電極１０３ａ、１０３ｂの上に吐出し乾燥することで、電極１０３ａ、１０３ｂ及び膜１０４の上に固体化学物質層を形成する。

あるいは、受容体溶液を、溶解した目的の血液サンプルと予め混合しておき、膜１０４を備えた電極１０３ａ及び１０３ｂ上に少量の予混合溶液を吐出する。

本発明の更に別の態様では、受容体溶液を別途調製し、膜１０４を有する電極１０３ａ及び１０３ｂ上に吐出する。その後、ヘモグロビンバイオ検体を含む目的の血液サンプルを電極に塗布する。

図１に示すように、パッシベーション層１０６が導電路を覆うように配置される。パッシベーション層１０６は、装置の導電素子を保護し、電極領域を正確に画定するために使用される。

本発明の更に別の態様では、図２に示すように、生体試料を採取及び保持するために、３つの電極１０３ａ、１０３ｂ及び１０３ｃを一組とした構成が図１に示す受容体と併せて使用され、電極１０３ａ、１０３ｂ及び１０３ｃはそれぞれ導電路１０２ａ、１０２ｂ及び１０２ｃに接続される。電極の数が多くなるほど、より高精度で血液サンプル中の単一のバイオ検体の検出を容易に行うことができる。この実施形態では、電極１０３ｃは基準電極として機能する。基準電極１０３ｃに好適な材料は、銀（Ａｇ）、塩化銀（ＡｇＣｌ）、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）又は飽和カロメルであり、電極の電位は経時変化しない。

図３ａに示す本発明の更に別の態様では、二組の三電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃ、１０３ｄ、１０３ｅ、１０３ｆが導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃ、１０２ｄ、１０２ｅ、１０２ｆ上に配置され、所定の血液サンプル中の複数のバイオ検体濃度を測定するために使用されるように構成されている。この態様では、電極にシールドされたウェルプレート又はトレイが配置され、図３ｂに示すように検知領域を異なる区分に分け、血液サンプルの個別検知が容易に行うことができるようにされる。したがって、電極の各組と併せて設けられた２つの別々の受容体がこれらのサンプルを受け取り、これらの２つの異なる血液サンプル中のヘモグロビン及び複合体の濃度測定が別々に行われる。また、必要と思われる場合には、物理的な仕切り壁を設けて電極を分離してもよい。

図４ａは、血液サンプル中のヘモグロビンを検出するための電気化学的に活性の装置の上面図を示す。

図４ｂは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体膜１０４が、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。受容体層１０５は、受容体膜１０４の表面に配置される。溶解膜１０７が、受容体層１０５の表面に配置される。溶血塩層１０８が、溶解膜１０７の表面に配置される。

図４ｃは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５と溶血塩層１０８の両方が、受容体膜１０４上に配置される。

図４ｄは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５が、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。溶解膜１０７が、受容体層１０５の表面に配置される。溶血塩層１０８が、溶解膜１０７の表面に配置される。

図４ｅは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５と溶血塩層１０８の両方が、電極層１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃ上に配置される。

図４ｆは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５と溶血塩層１０８の両方が、電極層１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの一部として一体化されている。

図４ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆに示すこれらの実施形態は、血液サンプル中のヘモグロビンバイオ検体を測定するために用いられる。

図５ａは、糖化ヘモグロビンを検出するための本発明の電気化学的に活性の装置の上面図を示す。

図５ｂは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面左半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の左半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体膜１０４が、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。受容体層１０５は、受容体膜１０４の表面に配置される。溶解膜１０７が、受容体層１０５の表面に配置される。溶血塩層１０８が、溶解膜１０７の表面に配置される。

図５ｃは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面左半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の左半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５と溶血塩層１０８の両方が、受容体膜１０４上に配置される。

図５ｄは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面左半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の左半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５が、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。溶解膜１０７が、受容体層１０５の表面に配置される。溶血塩層１０８が、溶解膜１０７の表面に配置される。

図５ｅは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面左半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の左半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５と溶血塩層１０８の両方が、電極層１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃ上に配置される。

図５ｆは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面左半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の左半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５と溶血塩層１０８の両方が、電極層１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの一部として一体化されている。

図５ｇは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面右半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の右半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体膜１０４が、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。受容体層１０５が、受容体膜１０４の表面に配置される。糖化ヘモグロビン濾過層１０９が、受容体層１０５上に配置される。ボロン酸系ボロネート親和性物質１１０が、糖化ヘモグロビン濾過層１０９上に配置される。溶解膜１０７が、ボロネート親和剤１１０の表面に配置される。溶血塩層１０８が、溶解膜１０７の表面に配置される。

図５ｈは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面右半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の右半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５は、受容体膜１０４上に配置される。糖化ヘモグロビン濾過層１０９が、受容体層１０５上に配置される。ボロン酸系ボロネート親和性物質１１０が溶血塩層１０８と共に、糖化ヘモグロビン濾過層１０９上に配置される。

図５ｉは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面右半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の右半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５、溶血塩層１０８及びボロネート親和性物質１１０が共に、電極にある糖化ヘモグロビン濾過層１０９上に配置される。

図５ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ及びｉに示すこれらの実施形態は、血液サンプル中の糖化ヘモグロビンバイオ検体の割合（％ＧＨｂ）を測定するために用いられる。

図６ａは、血液サンプル中のメトヘモグロビンバイオ検体の絶対量を検出するための本発明の電気化学的に活性の装置の上面図を示す。

図６ｂは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体膜１０４が、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。受容体層１０５ｂが、受容体膜１０４の表面に配置される。溶解膜１０７が、受容体層１０５ｂの表面に配置される。溶血塩層１０８が、溶解膜１０７の表面に配置される。

図６ｃは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５と溶血塩層１０８の両方が、受容体膜１０４上に配置される。

図６ｄは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５が、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。溶解膜１０７が、受容体層１０５の表面に配置される。溶血塩層１０８が、溶解膜１０７の表面に配置される。

図６ｅは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５と溶血塩層１０８の両方が、電極層１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃ上に配置される。

図６ｆは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５と溶血塩層１０８の両方が、電極層１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの一部として一体化されている。

図６ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆに示すこれらの実施形態は、血液サンプル中のメトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）バイオ検体の絶対量を測定するために用いられる。

図７ａは、血液サンプル中のメトヘモグロビンの割合を測定するための本発明の電気化学的に活性の装置の上面図を示す。

図７ｂは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面左半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の左半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体膜１０４が、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。受容体層１０５ａが、受容体膜１０４の表面に配置される。溶解膜１０７が、受容体層１０５ａの表面に配置される。溶血塩層１０８が、溶解膜１０７の表面に配置される。

図７ｃは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面左半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の左半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５ａと溶血塩層１０８の両方が、受容体膜１０４上に配置される。

図７ｄは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面左半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の左半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５ａが、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。溶解膜１０７が、受容体層１０５ａの表面に配置される。溶血塩層１０８が、溶解膜１０７の表面に配置される。

図７ｅは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面左半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の左半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５ａと溶血塩層１０８の両方が、電極層１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃ上に配置される。

図７ｆは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面左半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の左半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５ａと溶血塩層１０８の両方が、電極層１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの一部として一体化されている。

図７ｇは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面右半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の右半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体膜１０４が、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。受容体層１０５ｂが、受容体膜１０４の表面に配置される。溶解膜１０７が、受容体層１０５ｂの表面に配置される。溶血塩層１０８が、溶解膜１０７の表面に配置される。

図７ｈは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面右半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の右半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５ｂと溶血塩層１０８の両方が、受容体膜１０４上に配置される。

図７ｉは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面右半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の右半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５ｂが、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。溶解膜１０７が、受容体層１０５ｂの表面に配置される。溶血塩層１０８が、溶解膜１０７の表面に配置される。

図７ｊは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面右半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の右半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５ｂと溶血塩層１０８の両方が、電極層１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃ上に配置される。

図７ｋは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面右半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の右半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５ｂと溶血塩層１０８の両方が、電極層１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの一部として一体化されている。

図７ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ及びｋに示すこれらの実施形態は、血液サンプル中のメトヘモグロビンバイオ検体の割合（％ＭｅｔＨｂ）を測定するために用いられる。

図８ａは、ミオグロビンを検出するための三電極構造を備えた電気化学的に活性の装置の上面図を示す。

図８ｂは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体膜１０４が、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。受容体層１０５は、受容体膜１０４の表面に配置される。

図８ｃは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５が、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。

図８ｄは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとを有する。受容体層１０５が、電極層１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの一部として一体化されている。

図８ａ、ｂ、ｃ及びｄに示すこれらの実施形態は、血液サンプル中のミオグロビンバイオ検体を測定するために用いられる。

このように、本発明は、基板に配置された少なくとも一対の導電路を備えた、血液サンプルを採取及び保持するための電気化学的に活性の装置を提供する。少なくとも１つの二電極部材が、少なくとも一対の導電路に接続される。装置は、受容体膜と一体化され、電極部材の上に配置された受容体を備える。溶血剤が受容体と化学的に接触して設けられ、血液サンプルを受け取って血液サンプルの赤血球（ＲＢＣ）から電気化学的に活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を放出させる。二電極部材の上に配置された受容体は、電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を受け取り、その電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を、電気化学的に活性のバイオ検体及び電気化学的に活性の複合体に変化させる。別の実施形態では、受容体は、受容体膜を介さず前記少なくとも１つの二電極部材の上に直接配置される。

本発明の装置はハウジング内に配置され、このハウジングはカートリッジ又はカセットである。

これまで電気化学的に活性の装置の例示的な実施形態を説明してきた。次に、電気化学的に活性の装置を保持する装置ホルダの例示的な実施形態を、図９を参照して説明する。血液サンプル中のバイオ検体の検出用の装置ホルダ２００は、ハウジング２０１を備え、装置検出内部回路をハウジング２０１内に有する。装置ホルダ２００は、表示部材を有する外部プロセッサに接続するように構成されることが好ましい。ハウジング２０１には、装置挿入口２０３が設けられている。装置挿入口２０３に挿入される本発明の装置１００は、少量の目的の血液サンプル受け取るように配置される。図９に示すように、ＵＳＢプラグ２０２がハウジング２０１に接続される。装置ホルダ２００は、検査用の生体試料の採取及び保持に使用される。また、装置ホルダ２００には、装置検出機能、データ記憶機能、信号調整機能、及び、装置１００に収容されたバイオ検体の種類を識別するためのデータ取得機能が設けられている。装置ホルダ２００のユーザは、ホルダ２００をバイオセンサに挿入し、測定用の生体試料を採取することができる。

このように、本発明は、目的の血液サンプルを載せた電気化学的に活性の装置１００を保持するための装置ホルダ２００を提供する。装置ホルダ２００は、ハウジング２０１内に配置された装置検出・信号調整回路を備える。ＵＳＢコネクタ２０２がハウジング２０１の一端に配置され、導電ポート２０３がハウジング２０１の他端に配置される。血液サンプルを採取及び保持するための電気化学的に活性の装置１００は、導電ポート２０３を介して装置ホルダ２００に接続される。装置１００は、基板１０１上にパターン形成された又は配置された少なくとも一対の導電路１０２ａおよび１０２ｂを備える。二電極部材１０３ａ／１０３ｂは、一対の導電路１０２ａ、１０２ｂに接続される。受容体１０４は、受容体膜１０５と一体化されており、二電極部材１０３ａ／１０３ｂ上に配置される。溶血剤は、受容体１０４と化学的に接触しており、血液サンプルを受け取ると血液サンプルの赤血球（ＲＢＣ）から電気化学的に活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を放出させる。この構成では、受容体１０４は、電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を受け取り、その電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を電気化学的に活性のバイオ検体及び電気化学的に活性の複合体に変化させるように設けられる。

本発明の装置ホルダ２００は、表示装置を有するプロセッサに挿入された後に電源が投入される。そして、装置を装置ホルダ２００内に装着する。装置検出回路手段又はハウジング２０１内にある回路は、指定の装置を検出するように構成されている。装置ホルダ２００が装置１００を検出すると、次に装置１００に生体試料が載せられ、基準電極に対して所望の酸化還元電位が、デジタル／アナログ変換器（ＤＡＣ）の内部回路から装置１００の作用電極に印加される。対電極及び作用電極を通過する酸化還元電流は、電流電圧変換器を使った内部回路により測定される。

図１０ａに、血液サンプル中のバイオ検体を検知するためのポイントオブケア用バイオセンサ３００を示す。バイオセンサはハウジング３０１を備える。ハウジング３０１には、マイクロＵＳＢ３０２用及びマイクロＳＤカード３０３用のポートが設けられている。マイクロＵＳＢ３０２はバイオセンサ３００の充電に用いられ、マイクロＳＤカードは記憶装置として用いられる。また、表示部材３０４がハウジング３０１に備えられており、タッチセンサー式の装置を含む、ＬＣＤ、ＬＥＤ、ＯＬＥＤ、ＯＭＬＥＤ、ＴＦＴ又はその他のディスプレイとすることができる。ハウジング３０１には、装置挿入口３０５が設けられている。装置挿入口３０５には、装置と電気的に係合する金属接点が設けられている。つまり、挿入口３０５は、装置１００の電極部材を介して装置１００が収容されるように設けられている。ポイントオブケア用バイオセンサ３００は、ユーザが容易に簡単な方法でポイントオブケア用バイオセンサ３００と装置１００を使用できるように設けられている。最初に装置１００がポイントオブケア用バイオセンサ３００に挿入され、その後、生体試料の採取に際し伴う侵襲的手段が最小限ですむ１〜３００μＬの範囲の少量の選択された生体試料が装置１００に載せられる。また、ユーザは、湿度、温度変化及び保存条件などの環境要因を気にすることなく、室温で自由にバイオセンサ３００を使用することができる。バイオセンサ３００を使用することにより、ユーザは、大幅に短時間で、目的のバイオ検体の濃度レベルを測定することができる。これは、バイオ検体が受容体に瞬間的に結合するためである。バイオセンサ３００では濃度レベルを測定するためにバイオ検体固有の結合特性を利用しているため、表示部材３０４上にバイオ検体濃度が瞬時且つ正確に表示され、ユーザに提供される。本発明のバイオセンサ３００を使用することにより、ユーザは、検査前の生体試料の活性調製を必要とすることなくバイオセンサを使用することができる。

次に、図１０ｂを参照すると、ポイントオブケア用バイオセンサ３００の電子機器の内部構造が示されている。ハウジング３０１内には、データベース部材３０６が設けられており、血液サンプル中に存在するヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及びミオグロビンのバイオ検体濃度と酸化還元電流の標準値が保存されている。また、データベース３０６は、過去及び現在のバイオ検体濃度に関するデータも含む。バイオセンサ３００の様々な機能を実行するために必要な実行ファイルが、ポイントオブケア用バイオセンサ３００の記憶媒体に保存されている。ハウジング３０１内にデータベース部材３０６に接続して設けられたデジタル制御部３０７は、ヘモグロビン及び複合体を含む血液サンプルを載せた電気化学的に活性の化受容体を有する少なくとも１つの二電極部材に酸化還元電位を印加し、対応する酸化還元電流を測定するように構成されている。デジタル制御部３０７は、濃度値に直線的にマッチングさせることによりヘモグロビンバイオ検体及び複合体の酸化還元電流を測定し、ヘモグロビンバイオ検体及び複合体の濃度の測定値を表示するように設けられる。

ポイントオブケア用バイオセンサ３００への電力供給は、バイオセンサ３００に接続された電源装置３０８により制御される。電源装置３０８は、充電回路を備えたオンライン及びオフラインの両方の方式の充電式電池を含む。信号調整・装置検出装置３０９は、マイクロコントローラ３０７に接続され、ポイントオブケア用バイオセンサ３００内に装置１００があることを検出し、電極に酸化還元電位を印加し、選択された生体試料からの酸化還元電流を測定する。湿度センサ３１０及び温度センサ３１１が、ハウジング３０１内に配置される。マイクロコントローラ３０７によるバイオ検体の濃度レベルの測定が完了すると、その濃度レベルが、目的のバイオ検体の濃度レベルの過去のデータと共にディスプレイ部材３０４に表示される。

このように、血液サンプル中のバイオ検体濃度を測定するためのポイントオブケア用バイオセンサは、表示部材と導電ポートとを有するハウジング３０１を備える。血液サンプルを採取及び保持するための電気化学的に活性の装置１００は、導電ポート２０３を介して装置ホルダ２００に接続される。装置１００は、基板１０１上にパターン形成された又は配置された少なくとも一対の導電路１０２ａ及び１０２ｂを備える。二電極部材１０３ａ／１０３ｂは、一対の導電路１０２ａ、１０２ｂに接続される。受容体１０４は、受容体膜１０５と一体化されており、二電極部材１０３ａ／１０３ｂ上に配置される。溶血剤は、受容体１０４と化学的に接触しており、血液サンプルを受け取ると血液サンプルの赤血球（ＲＢＣ）から電気化学的に活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を放出させる。この構成では、受容体１０４は、電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を受け取り、その電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体を電気化学的に活性のバイオ検体及び電気化学的に活性の複合体に変化させるように設けられる。デジタル制御部は、ハウジング内に配置され、酸化還元電位を印加して装置からの酸化還元電流を測定するように構成される。また、デジタル制御部は、ヘモグロビン及び複合体の濃度に直線的にマッチングさせ、ヘモグロビン及び複合体の濃度レベルを読み取り表示するようにも構成される。ポイントオブケア用バイオセンサのデータベース部材は、デジタル制御部に接続して配置され、血液サンプル中のヘモグロビンバイオ検体及び複合体の濃度の基準値を相互関係する酸化還元電流と併せて記憶する。

また、本発明は、血液サンプル中のヘモグロビンバイオ検体と複合体を正確に検出及び定量測定するための方法を提供する。目的の血液サンプルを、以下に示す標準プロトコルに従った最小限の侵襲的手段により、非常に少量、即ち、マイクロリットル（μＬ）の範囲の量で、ヒト被験者から採取する。本発明の方法において、バイオ検体の測定に使用することができる生体試料の好適な量は、１〜３００マイクロリットル（μＬ）の範囲が好ましい。サンプルの必要量は、装置の受容体の表面積の大きさによって決まる。少量のサンプルの採取は、侵襲性が最小限の試料採取技術で行うことができることから、被験者の負担を大幅に減少させることができる。生体試料の量を少量とすることにより、ユーザは、瀉血による採取製品を調達する必要性を回避することができる。

本発明の方法では、バイオ検体の判定と正確な測定は、電気化学の原理を実施することにより行われる。よって、電位の印加時に電気化学的に活性の装置を流れる酸化還元電流の測定による場合、測定用に選択されると効果的なバイオ検体は、球状タンパク質‐ヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及びミオグロビン‐である。

本発明の方法では、受容体物質が、以下に記載される好適な化学物質の溶液として効果的に調製される。例えば、ピリジン及びＮａＯＨが好適な受容体として選択される場合、好ましくは蒸留水又は当該物質が可溶な他の溶媒にＮａＯＨを溶解させる。

ベースがイミダゾールである受容体物質の場合、蒸留水又は当該物質が可溶な他の溶媒に溶解させることが好ましい。

受容体としてメチレンブルー（ＭＢ）を用いる場合、当該化学物質を、蒸留水又は当該化学物質が可溶な他の溶媒に溶解させることが好ましい。

受容体としてメチレンブルー（ＭＢ）及び酸化剤、好ましくはＮａＮＯ_２を用いる場合、当該化学物質を、蒸留水又は当該化学物質が可溶な他の溶媒に溶解させることが好ましい。

受容体として無機材料、好ましくはＮａＯＨを用いる場合、当該化学物質を、蒸留水又は当該化学物質が可溶な他の溶媒に溶解させることが好ましい。

このようにして調製された受容体溶液は、生体試料の塗布前に、本発明の装置における電極部材又は膜に塗布される。

あるいは、このようにして調製された受容体溶液を、生体試料の塗布前に、本発明の装置における電極部材又は膜に塗布し、その表面で乾燥させて化学物質層を形成する。

また、受容体溶液を生体試料と予め混合し、混合溶液を装置における電極部材又は膜に塗布することもできる。

このように、受容体物質は、有機材料、無機材料、又はそれらを組み合わせた物質とすることができる。

本発明の更に別の態様では、有機材料は、Ｎ−ヘテロ原子を有する複素環式有機材料から、好ましくはピリジン、ピリジンＨＣｌ、ヒドロキシピリジン、シアノピリジン、イミダゾール、ピラゾール、インドール、ピラミジン、プリンから、より好ましくはピリジン及びイミダゾールからなる群から選択される。

次に、本発明の更に別の態様におけるヘモグロビンの検出及び測定方法を説明する。血液サンプル中のヘモグロビンの存在を検査するために、少量の生体試料（血液）を、本発明の装置の受容体と化学的に接触させる。

研究者は、ヘモグロビンの分子を電気化学的検出するためにその構造に注目している。ヘモグロビンは、その構造中に酸化数＋２の鉄を４つ含有するが、その本来の形態では、この鉄はグロビン鎖の内部深くに埋まっており、電気化学反応には利用できない。

図１１に示すように、ヘモグロビンは、溶液の状態によって鉄の酸化状態が異なる。アルカリ状態では、グロビン部分の分離によりヘモグロビンをアルカリヘマチンに変えることができる。ヘマチンは、ヘモグロビン構造において酸化形態のヘム補欠分子族である。ヘマチンは比較的小さな分子であり、ヘモグロビン分子よりも容易に電極表面に到達することができる。ヘマチンは、サイクリックボルタンメトリーにおいて図１２に示すような還元ピークを示す。しかし、ヘマチンが良好な還元ピークを示しても、総ヘモグロビンの電気化学的検出にはアルカリヘマチン法は好ましくない。アルカリヘマチンに基づくヘモグロビンの電気化学的検出での還元電流応答は直線的ではないが、これは、アルカリ性溶液中では、ヘマチンが二量体を形成して電極表面に吸着し、電極界面での電荷移動を妨げるためである。したがって、図１３ａ及び図１３ｂに示すように、線形応答を繰り返し得ることは困難である。水溶液中のヘマチンは、不可逆的な還元ピークを示す。吸着後は、線形の電流応答を得ることは非常に困難である。

本発明の一態様において、ヘモグロビン検出用の受容体は、ピリジン及びＮａＯＨである。

ヘマチンのポルフィリン環は、第二鉄の４つのＸ−Ｙ配位座に合致する。残り２つの配位座は、Ｚ軸上にあって第二鉄の上下に垂直に位置する。Ｚ軸上のこれらの位置を、ピリジン、イミダゾール、シアン化物又はその他のＮ−ヘテロ原子を有する複素環式化合物などのπ−結合配位子が占有して配位錯体を形成している場合、これらの錯体はヘミクロムとも呼ばれる。ヘミクロムは、複素環式試薬の窒素塩基の配位座で形成され、サイクリックボルタンメトリー実験において図１４ａ及びｂに示すような可逆的酸化還元ピークを示す。ピリジンによるヘミクロム形成のフローチャートを図１５に要約する。

電気化学的に不活性のヘモグロビンを電気化学的に活性のピリジンヘミクロムに変化させることを考慮し、ヘモグロビン濃度検出には、リガンド受容体としてピリジン及びＮａＯＨが選択される。ピリジンヘミクロムの酸化還元ピーク電流値を、血液サンプル中のヘモグロビン濃度の変化と照らし合わせる。

目的の血液サンプル中のヘモグロビン濃度の測定に先立ち、様々なヒト血液サンプル中の基準ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄＬ）に関するデータを収集し、データベース部材に保存する。これにより、データベース部材には基準ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄＬ）の値と対応するピリジンヘミクロム酸素還元電流値（μＡ）とが保存される。指定の濃度の好適な酸素還元電流値は、試験を繰り返し、選択されたヘモグロビン濃度に対する酸素還元電流値が同一となった結果として得られたものである。

測定された酸化還元電流が、記憶された酸化還元電流値との照合で一致すると、これに対応するヘモグロビン濃度がバイオセンサに取り込まれ表示される。あるいは、線形フィット方程式を使って、酸化還元電流値からバイオ検体濃度を計算することもできる。血液サンプル中のヘモグロビン濃度値を抽出した後、バイオセンサはその値を表示する。

次に、図１６を参照し、バイオ検体測定の工程段階を説明する。本発明のバイオセンサを選び、電源を投入する。そして、バイオセンサに装置を装着する。バイオセンサは、指定の装置を検出したことを示すように構成されている。バイオセンサが装置を検出すると、生体試料が装置に載せられ、デジタル／アナログ変換器（ＤＡＣ）により基準電極に対して所望の酸化還元電位が装置の作用電極に印加される。酸化還元電位は、化学物質の電子を受け取りやすさと、それによる還元の尺度である。化学物質は、それぞれ固有の酸化還元電位を有する。電位が正であるほど、電子に対する物質の親和性が大きくなり、還元される傾向にある。対電極と作用電極を通過する酸化還元電流は、電流電圧変換器を用いて測定される。

測定された酸化還元電流が、記憶された酸化還元電流値との照合で一致すると、これに対応するヘモグロビン濃度がバイオセンサに取り込まれ表示される。あるいは、線形フィット方程式を使って、酸化還元電流値からバイオ検体濃度を計算することもできる。血液サンプル中のヘモグロビン濃度値を抽出した後、バイオセンサはその値を表示する。

本発明の方法の別の態様においては、イミダゾールを受容体として、ＳＤＳを溶血・酸化剤として用いて、イミダゾール‐メトヘモグロビン複合体を形成する。ＳＤＳは赤血球を溶解し、ヘモグロビン分子を鉄の酸化数が＋３であるメトヘモグロビン分子に変える。イミダゾールのＮ−ヘテロ原子はこの鉄と配位し、可逆的サイクリックボルタモグラムを示すイミダゾール‐メトヘモグロビン複合体を形成する。還元及び酸化ピーク電流を示すメトヘモグロビンとのイミダゾールの配位を考慮し、ヘモグロビン濃度検出には、受容体としてイミダゾールが選択される。

電気化学的に不活性のヘモグロビンを電気化学的に活性のイミダゾール‐ヘモグロビン複合体に変化させることを考慮し、ヘモグロビン濃度検出には、リガンド受容体として、イミダゾール及び／又は酸化剤が選択される。イミダゾール‐ヘモグロビン複合体の酸化還元ピーク電流値を、ヘモグロビン値の変化と照らし合わせる。

目的の血液サンプル中のヘモグロビン濃度の測定に先立ち、様々なヒト血液サンプル中の基準ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄＬ）に関するデータを収集し、データベース部材に保存する。これにより、データベース部材には基準ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄＬ）の値と対応するイミダゾール‐ヘモグロビン複合体酸素還元電流値（μＡ）とが保存される。指定の濃度の好適な酸素還元電流値は、試験を繰り返し、選択されたヘモグロビン濃度に対する酸素還元電流値が同一となった結果として得られたものである。

測定された酸化還元電流が、記憶された酸化還元電流値との照合で一致すると、これに対応するヘモグロビン濃度がバイオセンサに取り込まれ表示される。あるいは、線形フィット方程式を使って、酸化還元電流値からバイオ検体濃度を計算することもできる。血液サンプル中のヘモグロビン濃度値を抽出した後、バイオセンサはその値を表示する。

本発明の更なる態様では、本発明のバイオセンサを用いて糖化ヘモグロビン濃度を測定する。このように使用されるバイオセンサは、図５ａに示す電極構成を効果的に備えている。２組の電極のそれぞれをイミダゾールと溶血剤で処理し、そのうちの１組の電極にボロン酸又はその誘導体で処理した薄膜が設けられる。

ボロン酸及びボロン酸誘導体は、グルコースなどの炭水化物や、糖化ヘモグロビンなどの糖化タンパク質に対し親和性を持つ。本発明では、ボロン酸アフィニティー法の原理（又はボロネート親和性の原理）を利用して、全ヘモグロビン成分から糖化ヘモグロビン成分を分離する。

図１７の工程段階に示されるように、両組の電極に少量の血液を塗布する。両組の電極に酸化還元電位を印加し、対応する酸化還元電流をこれらの電極から測定する。両電極において測定された酸化還元電流の差を計算することにより、糖化ヘモグロビン濃度が得られる。

電気化学的に不活性のヘモグロビンを電気化学的に活性のイミダゾール‐メトヘモグロビン複合体に変化させることを考慮し、総ヘモグロビンと糖化ヘモグロビン成分を除くヘモグロビンの濃度の検出には、リガンド受容体として、イミダゾール及び／又は酸化剤が選択される。これらの２つの成分の差から、糖化ヘモグロビンの割合（％ＧＨｂ）を計算する。イミダゾール‐メトヘモグロビン複合体の酸化還元ピーク電流値を、血液サンプル中の糖化ヘモグロビン値の変化と照らし合わせる。

目的の血液サンプル中のヘモグロビン濃度の測定に先立ち、様々なヒト血液サンプル中の基準ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄＬ）に関するデータを収集し、データベース部材に保存する。これにより、データベース部材には基準ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄＬ）の値と対応するイミダゾール‐メトヘモグロビン複合体酸素還元電流値（μＡ）とが保存される。指定の濃度の好適な酸素還元電流値は、試験を繰り返し、選択されたヘモグロビン濃度に対する酸素還元電流値が同一となった結果として得られたものである。

測定された酸化還元電流が、記憶された酸化還元電流値との照合で一致すると、これに対応するヘモグロビン濃度がバイオセンサに取り込まれ表示される。あるいは、線形フィット方程式を使って、酸化還元電流値からバイオ検体濃度を計算することもできる。酸化還元電流値を得た後、バイオセンサは糖化ヘモグロビンの割合の値を計算し、その値を表示する。

メチレンブルー（ＭＢ）は、周知の電気化学的酸化還元色素である。図１８に示すように、ＭＢは、サイクリックボルタモグラムにおいて可逆的な酸化還元ピークを示す。一般に、ＭＢは、生物学におけるＤＮＡ染色や、メトヘモグロビン血症の解毒剤として使用される。メトヘモグロビン血症治療において、ＭＢは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）酵素の存在下で（電子を受け取とることにより）ロイコメチレンブルー（ＬＭＢ）に還元される。その後、ＬＭＢは、メトヘモグロビン分子中の第二鉄（Ｆｅ^＋３）に電子を供与し、これをヘモグロビン分子中の第一鉄（Ｆｅ^＋２）に変える。ＮＡＤＰＨ酵素の存在下でのＭＢからＬＭＢへの還元が、図１９に示すこのプロセスの鍵である。本発明では、サイクリックボルタンメトリー法を用いて、電気化学的経路によりＭＢをＬＭＢに還元する。Ｆｅ^＋３含有元素又は第二鉄の元素が還元形態のＭＢ（ＬＭＢ）に添加されると、ＭＢはその電子を第二鉄（Ｆｅ^＋３）に供与し、これを第一鉄（Ｆｅ^＋２）に還元する。この反応では、以下の化学反応式に示されるように、Ｆｅ^＋３の形の鉄がＦｅ^＋２の形の鉄に還元される一方で、ＬＭＢは更に酸化され、ＭＢの形態となる。
ＭＢ＋２ｅ^‐＋Ｈ^＋→ＬＭＢ
ＬＭＢ＋２Ｆｅ^＋＋＋→ＭＢ＋２Ｆｅ^＋＋

本発明の更に別の態様では、メトヘモグロビン検出用の受容体はメチレンブルー（ＭＢ）である。

ＭＢの還元ピーク電流は、ＬＭＢからＦｅ^＋３への電子供与による接触電流のため、メトヘモグロビンを添加した後に増加する。

上述したＭＢによるメトヘモグロビン活性の原理に基づき、本発明の方法では、ＭＢをベースとした受容体をメトヘモグロビン検出に採用している。このように使用されるバイオセンサは、図６に示す電極構成を効果的に備えている。測定された酸化還元電流が、記憶された酸化還元電流値との照合で一致すると、これに対応するメトヘモグロビン濃度がバイオセンサに取り込まれ表示される。あるいは、線形フィット方程式を使って、酸化還元電流値からバイオ検体濃度を計算することもできる。血液サンプル中のメトヘモグロビン濃度値を抽出した後、バイオセンサはその値を表示する。

本発明の一態様では、総ヘモグロビン（Ｈｂ）に対するメトヘモグロビンの割合（％ＭｅｔＨｂ）の検出に、メチレンブルー（ＭＢ）とイミダゾールの組み合わせが受容体として用いられる。

本発明の更なる態様では、本発明のバイオセンサを用いてメトヘモグロビンの割合（％ＭｅｔＨｂ）を測定する。このように使用されるバイオセンサは、図７ａに示す電極構成を効果的に備えている。２組のうち１組の電極を、イミダゾールと溶血剤で処理する。他方の組の電極にはＭＢが設けられる。

図２０の工程段階に示されるように、両組の電極に少量の血液又は血漿を塗布する。両組の電極に酸化還元電位を印加し、対応する酸化還元電流をこれらの電極から測定する。両電極において測定された濃度の差を計算することにより、ＭｅｔＨｂ濃度の割合が得られる。

目的の血液サンプル中の％ＭｅｔＨｂの測定に先立ち、様々なヒト血液サンプル中の基準ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄＬ）と基準メトヘモグロビン濃度に関するデータを収集し、データベース部材に保存する。これにより、データベース部材にはヘモグロビンとメトヘモグロビンの基準濃度（ｇ／ｄＬ）の値と対応する酸素還元電流値とが保存される。指定の濃度の好適な酸素還元電流値は、試験を繰り返し、選択されたヘモグロビン濃度及びメトヘモグロビン濃度に対する酸素還元電流値が同一となった結果として得られたものである。

測定された酸化還元電流が、記憶された酸化還元電流値との照合で一致すると、これに対応するヘモグロビン濃度及びメトヘモグロビン濃度がバイオセンサに取り込まれ、％ＭｅｔＨｂの計算に用いられる。あるいは、線形フィット方程式を使って、酸化還元電流値からバイオ検体濃度を計算することもできる。酸化還元電流値を得た後、バイオセンサはメトヘモグロビンの割合の値を計算し、その値を表示する。

本発明の別の態様では、ＭＢ−ＮａＮＯ_２の組み合わせの受容体がヘモグロビン検出に使用される。赤血球を溶血した後、酸化剤で全てのヘモグロビン成分をメトヘモグロビンに変化させ、受容体としてメチレンブルーを用いて検出する。総ヘモグロビン検出用の受容体がＮａＮＯ_２−ＭＢの組み合わせの場合、メトヘモグロビンをＭＢ溶液に添加すると、還元形態のメチレンブルー（ＬＭＢ）からメトヘモグロビン複合体に電子が供与され、電極表面でＭＢ濃度が増加するという事実により、還元ピーク電流が増加する。このように使用されるバイオセンサは、図４ａに示す電極構成を効果的に備えている。

測定された酸化還元電流が、記憶された酸化還元電流値との照合で一致すると、これに対応する総ヘモグロビン濃度がバイオセンサに取り込まれ表示される。あるいは、線形フィット方程式を使って、酸化還元電流値からバイオ検体濃度を計算することもできる。血液サンプル中の総ヘモグロビン濃度値を抽出した後、バイオセンサはその値を表示する。

本発明の別の態様では、血液サンプル中のミオグロビン含有量の測定に、ＮａＯＮが受容体として使用される。この生体試料に対し、上述したステップに沿って上述した受容体を使用してミオグロビン含有量を判断する。

アルカリ状態では、グロビン部分の分離によりミオグロビンをアルカリヘマチンに変えることができる。ヘマチンは、ヘモグロビン構造において酸化形態のヘム補欠分子族である。ヘマチンは比較的小さな分子であり、ヘモグロビン分子よりも容易に電極表面に到達することができる。ヘマチンは、サイクリックボルタンメトリーにおいて図１２に示すような還元ピークを示す。ヘマチンは良好な還元ピークを示すため、ヒト血漿中のミオグロビンの電気化学的検出に用いることができる。

ここで、ヒト血液中において、ミオグロビンの生理的濃度はヘモグロビンと比較して非常に低いため、ミオグロビン検出においては、二量体の形成ははっきりとしていないことに留意されたい。

アルカリヘマチンに基づくミオグロビンの電気化学的検出での還元電流応答は直線的であるが、これは、血液中では、ミオグロビン濃度がヘモグロビンと比較して非常に低く、ミオグロビン濃度に対する酸化還元電流が線形応答となるという事実によるものである。

測定された酸化還元電流が、記憶された酸化還元電流値との照合で一致すると、これに対応するミオグロビン濃度がバイオセンサに取り込まれ表示される。あるいは、線形フィット方程式を使って、酸化還元電流値からバイオ検体濃度を計算することもできる。血液サンプル中のミオグロビン濃度値を抽出した後、バイオセンサはその値を表示する。

このように、本発明の方法では、血液サンプル中のヘモグロビンバイオ検体及び複合体の濃度が、定量的かつ正確に測定される。この方法では、酸化還元電流を、一対の導電路に接続された電極部材を備えた電気化学的に活性の装置に印加する。ヘモグロビン検体及び複合体を含む目的の血液サンプルは、二電極部材の溶血剤と接触することができる。接触すると、血液サンプルの電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体は、赤血球（ＲＢＣ）から放出される。放出された電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体は、受容体膜と一体化した受容体により、対応する電気化学的に活性のヘモグロビンバイオ検体及び複合体となる。電気化学的に活性のヘモグロビン及び複合体の濃度は、対応する酸化還元電流を測定し、それをヘモグロビン及び複合体の濃度に直線的にマッチングさせることにより測定される。

本発明の方法において、少量の血液サンプルは、１〜３００マイクロリットル（μＬ）の範囲である。

次に、本発明の主題を以下の実施例を使って説明する。これらの実施例は説明目的のものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

ピリジン及びＮａＯＨを受容体として用いた場合の血中ヘモグロビン濃度とその対応する還元電流の測定
１．５ｍｌの全血を、４ｍｌの冷たい脱イオン（ＤＩ）水で溶血する。２ｍｌの１％ＮａＯＨをこの溶血溶液に加え、含有されるヘモグロビンをヘマチンに変化させる。１．５ｍｌのピリジンをヘマチン溶液に加え、ピリジンヘミクロムに変化させる。このピリジンヘミクロム溶液の原液を適切に希釈することにより、様々な濃度のヘモグロビン溶液を調製する。試験には、最終容量の３００μＬが使用される。

所望量の血液サンプルを取り、バイオセンサ装置の電極に載せる。図２１ａに示されるように、これに対応するサイクリックボルタモグラムが、走査速度０．６Ｖ／秒、０．４Ｖから‐１．２Ｖまでの様々な電位窓でＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用した値から得られる。

冷たい脱イオン水は、血液サンプル中の赤血球を溶血し、Ｈｂ分子が放出される。ＮａＯＨはヘモグロビン分子を変性させ、ヘミンとグロビン部分を分離する。その後、ピリジンがヘミンをピリジンヘミクロムに変化させ、電気化学的に活性の分子とする。これにより、図２１ａ及び２１ｂに示されるように、ピリジンヘミクロムの酸化還元ピーク電流がヘモグロビン濃度に対し直線的に増加する。血液サンプル中のヘモグロビンの濃度が増加すると、ヘミンも更に形成され、これにより電極上のピリジンヘミクロム濃度が増加し、その結果、酸化還元ピーク電流が増加する。

ヘモグロビン濃度値（ｇ／ｄＬ）をその対応する酸化電流値（μＡ）と共に記録し、表１に示すような表にまとめる。

表１は、再現性データのプロットから得られた以下に示す線形フィット方程式から作成される。
ｙ＝−１０．３７ｘ−２３．６８

上記の式において、「ｙ」は酸化還元電流値を表し、「ｘ」は検体濃度を表す。

ピリジン−ＮａＯＨ受容体を使ったヘモグロビンの測定
試料容積３００μＬのピリジンヘミクロムを電極に載せ、電位窓を０．４Ｖ〜−１．２Ｖに指定してＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使ったサイクリックボルタモグラムから、還元ピーク電流値を得る。還元ピーク電流の値は２３８μＡである。この電流値を表１で検索すると、対応するヘモグロビン濃度２．４ｇ／ｄＬが得られる。

ピリジン及びＮａＯＨを受容体として用いた場合の生理的範囲における血中ヘモグロビン濃度及びその対応する還元電流の測定
１．５ｍｌの全血を、４ｍｌの冷たい脱イオン水で溶血する。２ｍｌの１％ＮａＯＨをこの溶血溶液に加え、含有されるヘモグロビンをヘマチンに変化させる。この溶液に固形のウシのヘミンを加え、生理的範囲におけるヘマチン含有量を更に増加させる。そして、１．５ｍｌのピリジンをヘマチン溶液に加え、ピリジンヘミクロムに変化させる。このピリジンヘミクロム溶液の原液を適切に希釈することにより、様々な濃度のヘモグロビン溶液を調製する。試験には、最終容量の３００μＬが使用される。

所望量の血液サンプルを取り、バイオセンサ装置の電極に載せる。図２２ａに示されるように、これに対応するサイクリックボルタモグラムが、走査速度０．６Ｖ／秒、０．４Ｖから‐１．２Ｖまでの様々な電位窓でＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用した値から得られる。

冷たい脱イオン（ＤＩ）水は、血液サンプル中の赤血球を溶血し、Ｈｂ分子が放出される。ＮａＯＨはヘモグロビン分子を変性させ、グロビン部分からヘミンを分離する。その後、ピリジンがヘミンをピリジンヘミクロムに変化させ、電気化学的に活性の分子とする。これにより、図２２ａ及び２２ｂに示されるように、ピリジンヘミクロムの酸化還元ピーク電流がヘモグロビン濃度に対し直線的に増加する。血液サンプル中のヘモグロビンの濃度が増加すると、ヘミンの形成も更に行われ、これにより電極上のピリジンヘミクロム濃度が増加し、その結果、酸化還元ピーク電流が増加する。

ヘモグロビン濃度値（ｇ／ｄＬ）をその対応する酸化電流値（μＡ）と共に記録し、表２に示すような表にまとめる。表２は、再現性データのプロットから得られた以下に示す線形フィット方程式から作成される。
ｙ＝−４５．４３ｘ−１５１．３９

上記の式において、「ｙ」は酸化還元電流値を表し、「ｘ」は検体濃度を表す。

ピリジン−ＮａＯＨ受容体を使った生理的範囲におけるヘモグロビンの測定
試料容積３００μＬのピリジンヘミクロムを電極に載せ、電位窓を０．４Ｖ〜−１．２Ｖに指定してＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使ったサイクリックボルタモグラムから、還元ピーク電流値を得る。酸化ピーク電流の値は１０１４μＡである。この電流値を表１で検索すると、対応するヘモグロビン濃度２５ｇ／ｄＬが得られる。

イミダゾールを受容体として用い、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を溶血剤として用いた場合の生理的範囲における血中ヘモグロビン濃度及びその対応する還元電流の測定
５ｇｍのイミダゾールと２００ｍｇのＳＤＳを１０ｍｌの脱イオン水に溶解し、この溶液１００μＬを一片の濾紙膜に散布し、室温で２４時間乾燥させる。この膜は、パターン電極に配置される。

３００μＬの量の血液サンプルを取り、バイオセンサ装置の電極に載せる。図２３ａに示されるように、これに対応するサイクリックボルタモグラムが、走査速度０．６Ｖ／秒、０Ｖから‐１．０Ｖまでの様々な電位窓でＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用した値から得られる。

ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、赤血球を溶血し、血液サンプル中のヘモグロビン分子を酸化形態のメトヘモグロビンに変化させる。イミダゾールは、電気化学的に活性なイミダゾール‐メトヘモグロビン複合体を形成する。イミダゾール‐メトヘモグロビン複合体の量は、ヘモグロビン濃度が高いほど多く、図２３ａ及び図２３ｂに示すように酸化還元ピーク電流がヘモグロビン濃度に対し直線的に増加する。血液サンプル中のヘモグロビンの濃度が増加すると、メトヘモグロビンも更に形成され、これにより電極上のイミダゾール‐メトヘモグロビン複合体濃度が増加し、その結果、酸化還元ピーク電流が増加する。

ヘモグロビン濃度値（ｇ／ｄＬ）をその対応する酸化電流値（μＡ）と共に記録し、表３に示すような表にまとめる。表３は、再現性データのプロットから得られた以下に示す線形フィット方程式から作成される。
ｙ＝７．０９０ｘ＋８３．０４４

上記の式において、「ｙ」は酸化還元電流値を表し、「ｘ」は検体濃度を表す。

イミダゾールを受容体、ＳＤＳを溶血剤として使った生理的範囲におけるヘモグロビンの測定
試料容積３００μＬの全血を電極に固定された薄膜に載せ、電位窓を０Ｖ〜−１．０Ｖに指定してＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使ったサイクリックボルタモグラムから、還元ピーク電流値を得る。酸化ピーク電流の値は１４４μＡである。この電流値を表１で検索すると、対応するヘモグロビン濃度９ｇ／ｄＬが得られる。

イミダゾールを受容体、ＳＤＳを溶血剤として用いた場合の生理的範囲における糖化ヘモグロビン濃度の割合（％ＧＨｂ）及びその対応する還元電流の測定
１．５ｇｍのイミダゾールと１００ｍｇのＳＤＳを１０ｍｌの脱イオン水に溶解し、この溶液１００μＬを一片の濾紙膜に散布し、室温で２４時間乾燥させる。この膜は、全血液サンプル中の総ヘモグロビンの検出に用いられる。

１．５ｇｍのイミダゾールと、１００ｍｇのＳＤＳと、３１０ｍｌのアミノフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）を１０ｍｌの脱イオン水に溶解し、この溶液１００μＬを一片の濾紙膜に散布し、室温で約２４時間乾燥させる。この膜は、全血液サンプル中の糖化ヘモグロビン以外のヘモグロビン含有量の検出に用いられる。

３００μＬの量の血液サンプルを取り、バイオセンサ装置の２組の三電極に固定された薄膜に載せる。図２４に示されるように、これに対応するサイクリックボルタモグラムが、走査速度０．６Ｖ／秒、０Ｖから‐１．０Ｖまでの様々な電位窓でＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用した値から得られる。

ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、赤血球を溶血し、血液サンプル中のヘモグロビン分子を酸化形態のメトヘモグロビンに変化させる。イミダゾールは、電気化学的に活性なイミダゾール‐メトヘモグロビン複合体を形成する。図２４に示すようにイミダゾール‐メトヘモグロビン複合体の酸化還元ピーク電流がヘモグロビン濃度に対し直線的に増加する。血液サンプル中のヘモグロビンの濃度が増加すると、メトヘモグロビンも更に形成され、これにより電極上のイミダゾール‐メトヘモグロビン複合体濃度が増加し、その結果、酸化還元ピーク電流が増加する。

第２の膜をアミノフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）で処理し、血液サンプル中に含まれる糖化ヘモグロビンを濾過することで、図２５に示すような糖化ヘモグロビンを含まないヘモグロビンの信号を得る。

糖化ヘモグロビンの割合は、糖化ヘモグロビン成分の有無にかかわらず酸化電流の変化率に比例し、以下の式を用いて計算される。

ここで、ΔＩ_ｏｘは電流の変化率であり、Ｉ−ｏｘは総ヘモグロビンの酸化電流であり、Ｉｏｘ＿ＡＰＢＡは糖化ヘモグロビン成分が存在しない場合のヘモグロビンの酸化電流である。

糖化ヘモグロビン濃度の割合とその対応する酸化電流の変化率と共に記録し、表４に示すような表にまとめる。

表４は、再現性データのプロットから得られた以下に示す線形フィット方程式から作成される。
ｙ＝７．２２３３ｘ＋２６．０６４

上記の式において、「ｙ」は酸化還元電流値を表し、「ｘ」は検体濃度を表す。

イミダゾールを受容体、ＳＤＳを溶血剤として使った生理的範囲における糖化ヘモグロビンの割合の測定
試料容積３００μＬの全血を取り、２組の三電極に固定された薄膜に載せる。電位窓を０Ｖ〜−１．０Ｖに指定してＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使ったサイクリックボルタモグラムから、酸化還元ピーク電流値を得る。血液サンプル中の総ヘモグロビンの酸化ピーク電流値は８０μＡであり、グリコヘモグロビン成分を含まない場合の酸化ピーク電流は３２μＡである。％ＧＨｂは、以下のように計算される。

この電流値を表４で検索すると、対応する％ＧＨｂ５．３が得られる。

ＮａＯＨを受容体として用いた場合の生理的範囲におけるミオグロビン濃度及びその対応する酸化還元電流の測定
リン酸緩衝食塩水にＳｉｇｍａ社のミオグロビンを入れて標準溶液を調製する。１％ＮａＯＨ溶液をミオグロビン溶液に加える。ＮａＯＨがミオグロビン構造を分解し、遊離アルカリヘマチンが放出される。

還元ピーク電流は、ミオグロビン濃度に直線的に依存する。したがって、サンプル中のミオグロビンの量が増加すると、アルカリヘマチンの量が増加する。

３００μＬのミオグロビンサンプルを、バイオセンサ装置の電極に載せる。図２６に示されるように、これに対応するサイクリックボルタモグラムが、走査速度０．１Ｖ／秒、‐０．３０Ｖから‐０．９Ｖまでの様々な電位窓でＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用した値から得られる。

図２７に示すように、還元ピーク電流は、ミオグロビン濃度に直線的に依存する。

ミオグロビン濃度値（ｎｇ／ｍｌ）をその対応する還元電流値（μＡ）と共に記録し、表５に示すような表にまとめる。

表５は、再現性データのプロットから得られた以下に示す線形フィット方程式から作成される。
ｙ＝０．０４３２ｘ＋１０．０９６

上記の式において、「ｙ」は酸化還元電流値を表し、「ｘ」は検体濃度を表す。

ＮａＯＨを受容体として使った生理的範囲におけるミオグロビンの測定
試料容積３００μＬの全血を電極に載せ、電位窓を−０．３Ｖ〜−０．９Ｖに指定してＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使ったサイクリックボルタモグラムから、還元ピーク電流値を得る。酸化ピーク電流の値は４６μＡである。この電流値を表１で検索すると、対応するミオグロビン濃度８３３ｎｇ／ｍｌが得られる。

本発明では、血液サンプル中のバイオ検体、すなわち、ヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及びミオグロビンを定量測定するために、非酵素的な非抗体ベースの受容体が電極と併用される。

本発明は、ヒトヘモグロビン及び複合体を電気化学的活性物質に変化させ、ヒトヘモグロビンに関連するバイオ検体を電気化学的に検出する方法を採用している。

本発明のバイオ検体の定量測定は、少量の試料を用いて行う最小侵襲技術である。

また、以下の特許請求の範囲は、本明細書に記載された本発明の一般的及び特定の特徴の全てと、言語上その中間にあると考えられるであろう本発明の特許請求の範囲の記述の全てを対象とすることを意図していることも理解される。

１００ 装置
１０１ 基板
１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃ、１０２ｄ、１０２ｅ、１０２ｆ 導電路
１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃ、１０３ｄ、１０３ｅ、１０３ｆ 電極
１０４ 受容体膜
１０５、１０５ａ、１０５ｂ 受容体
１０６ パッシベーション層
１０７ 溶解膜
１０８ 溶血塩層
１０９ 糖化ヘモグロビン濾過層
１１０ ボロネート親和性物質
２００ 装置ホルダ
２０１ ハウジング
２０２ ＵＳＢプラグ（ＵＳＢコネクタ）
２０３ 装置挿入口（導電ポート）
３００ ポイントオブケア用バイオセンサ
３０１ ハウジング
３０２ マイクロＵＳＢ
３０３ マイクロＳＤカード
３０４ 表示部材
３０５ 装置挿入口
３０６ データベース部材
３０７ デジタル制御部（マイクロコントローラ）
３０８ 電源装置
３０９ 信号調整・装置検出装置
３１０ 湿度センサ
３１１ 温度センサ

Claims (22)

1. （ｉ）基板に配置された少なくとも一対の導電路と、
   （ｉｉ）前記少なくとも一対の導電路に接続された少なくとも１つの二電極部材と、
   （ｉｉｉ）前記少なくとも１つの二電極部材の上に配置され、受容体用膜と一体化された電気化学的に不活性のＮ−複素環式有機材料を含む受容体と、
   （ｉｖ）前記受容体と化学的に接触して設けられ、血液サンプルを受け取って前記血液サンプルの赤血球（ＲＢＣ）から電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及びその複合体を放出させる膜状の溶血剤とを備え、
   （ｖ）前記少なくとも１つの二電極部材の上かつ前記膜状の溶血剤の下に配置された前記受容体は、前記電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及びその複合体を受け取り、酸化還元電位を印加したときに可逆的酸化還元電流ピークを提供するために、前記電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及びその複合体を電気化学的に活性のヘミクロムに変化させることを特徴とする、血液サンプルの採取及び保持のための電気化学的活性化装置。
2. 前記基板がポリマ又は紙からなる、請求項１に記載の装置。
3. １つの三電極部材が前記基板に配置される、請求項１に記載の装置。
4. 複数の二電極部材が前記基板に配置される、請求項１に記載の装置。
5. 複数の三電極部材が前記基板に配置される、請求項１に記載の装置。
6. 前記電極部材はパターン電極である、請求項１に記載の装置。
7. 前記受容体用膜は、ポリマ、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、綿布又は紙からなる、請求項１に記載の装置。
8. 前記有機材料は、ピリジン、ピリジンＨＣｌ、ヒドロキシピリジン、シアノピリジン、イミダゾール、ピラゾール、インドール、ピラミジン、プリンからなる群から選択される、請求項７に記載の装置。
9. 前記受容体は、前記有機材料、又は、前記有機材料と無機材料の組み合わせからなり、前記無機材料はＮａＯＨ及びＫＯＨである、請求項８に記載の装置。
10. 前記受容体は、前記有機材料、又は、前記有機材料と無機材料の組み合わせからなり、前記無機材料は、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ _３ ）、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ _２ ）又はドデシル硫酸ナトリウムから選択される酸化剤である、請求項８に記載の装置。
11. 前記電気化学的に不活性のバイオ検体は、ヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及びミオグロビンである、請求項１に記載の装置。
12. 前記受容体用膜の下かつ前記少なくとも１つの二電極部材の上に配置された糖化ヘモグロビン膜を、ボロン酸、フェニルボロン酸（ＰＢＡ）、アミノフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）及びその誘導体からなる群から選択されるボロネート親和剤で処理する、請求項１に記載の装置。
13. 前記溶血剤は、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、ドデシル・ベンゼン硫酸ナトリウム、ラウリルジメチルアミンオキシド、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、フェリシアン化カリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、亜硝酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシン、臭化ジドデシルジメチルアンモニウム、オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物及び塩酸からなる群から選択される、請求項１に記載の装置。
14. 前記受容体は、前記受容体用膜を介さず前記少なくとも１つの二電極部材の上に直接配置される、請求項１に記載の装置。
15. 前記装置はハウジング内に配置され、前記ハウジングはカートリッジ又はカセットである、請求項１に記載の装置。
16. 血液サンプルを載せた電気化学的活性化装置を保持するホルダであって、
    （ｉ）ハウジングの内部に配置された装置を検出し信号を調整する手段と、
    （ｉｉ）前記ハウジングの一端に配置されたＵＳＢコネクタと、前記ハウジングの他端に配置された導電ポートと、
    （ｉｉｉ）前記導電ポートを介して前記ホルダに接続するように配置された、血液サンプルを採取及び保持するための電気化学的活性化装置を備え、
    前記装置は、基板に配置された少なくとも一対の導電路と、前記少なくとも一対の導電路に接続した少なくとも１つの二電極部材と、前記少なくとも１つの二電極部材の上に配置され、受容体用膜と一体化された電気化学的に不活性のＮ−複素環式有機材料を含む受容体と、前記受容体と化学的に接触して設けられ、血液サンプルを受け取ると前記血液サンプルの赤血球（ＲＢＣ）から電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及びその複合体を放出させる膜状の溶血剤とを備え、前記少なくとも１つの二電極部材の上かつ前記膜状の溶血剤の下に配置された前記受容体は、前記電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及びその複合体を受け取り、酸化還元電位を印加したときに可逆的酸化還元電流ピークを提供するために、前記電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及びその複合体を電気化学的に活性のヘミクロムに変化させることを特徴とするホルダ。
17. 血液サンプル中のバイオ検体濃度を測定するためのポイントオブケア用バイオセンサであって、
    （ｉ）表示部材と導電ポートとを有するハウジングと、
    （ｉｉ）前記導電ポートを介して前記ハウジングに接続するように配置された、血液サンプルを採取及び保持するための電気化学的活性化装置であって、前記装置は、基板に配置された少なくとも一対の導電路と、前記少なくとも一対の導電路に接続した少なくとも１つの二電極部材と、前記少なくとも１つの二電極部材の上に配置され、受容体用膜と一体化された電気化学的に不活性のＮ−複素環式有機材料を含む受容体と、前記受容体と化学的に接触して設けられ、血液サンプルに接すると前記血液サンプルの赤血球（ＲＢＣ）から電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及びその複合体を放出させる膜状の溶血剤と、を備え、前記少なくとも１つの二電極部材の上かつ前記膜状の溶血剤の下に配置された前記受容体は、前記電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及びその複合体を受け取り、前記電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及びその複合体を電気化学的に活性のヘミクロムに変化させ、
    （ｉｉｉ）前記ハウジング内に配置され、酸化還元電位を印加して前記装置からの酸化還元電流を測定し、ヘモグロビン及びその複合体の濃度に直線的にマッチングさせることによりヘモグロビン及びその複合体の濃度値を読み取り表示するように構成されたデジタル制御部を備えたことを特徴とするバイオセンサ。
18. データベース部材は、前記デジタル制御部に接続され、血液サンプル中のヘモグロビン及び複合体のその濃度の基準値を相互関係する酸化還元電流と併せて記憶する、請求項１７に記載のポイントオブケア用バイオセンサ。
19. （ｉ）少なくとも一対の導電路に接続された少なくとも１つの二電極部材を有する電気化学的活性化装置に酸化還元電流を印加し、ヘモグロビン検体及びその複合体を含む血液サンプルを電気化学的活性化装置の少なくとも一対の導電路に接続された少なくとも１つの二電極部材の上に配置された膜状の溶血剤に接触させる工程と、
    （ｉｉ）前記血液サンプルの赤血球（ＲＢＣ）から電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及びその複合体を放出させる工程と、
    （ｉｉｉ）前記少なくとも１つの二電極部材の上かつ前記膜状の溶血剤の下に配置され、受容体用膜と一体化された電気化学的に不活性のＮ−複素環式有機材料を含む受容体であって、前記有機材料、又は、前記有機材料と無機材料の組み合わせからなる前記受容体により、前記電気化学的に不活性のヘモグロビンバイオ検体及びその複合体を対応する電気化学的に活性のヘミクロムに変化させる工程と、
    （ｉｖ）酸化還元電流を測定し、これをヘモグロビン及びその複合体の濃度に直線的にマッチングさせることにより、血液サンプル中の電気化学的に活性のヘモグロビン及びその複合体の濃度を測定する工程を含むことを特徴とする、血液サンプル中のヘモグロビンバイオ検体及びその複合体の濃度を測定する方法。
20. 前記血液サンプルの量は、１〜３００マイクロリットル（μＬ）の範囲である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記受容体は、前記受容体用膜を介さず前記少なくとも１つの二電極部材の上に直接配置される、請求項１９に記載の方法。
22. 前記電気化学的に不活性のバイオ検体は、ヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）、メトヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）及びミオグロビンである、請求項１９に記載の方法。