ES2211197T3

ES2211197T3 - Uso de derivados de estaurosporina para tratar enfermedades neovasculares oculares.

Info

Publication number: ES2211197T3
Application number: ES99957321T
Authority: ES
Inventors: Romulus Kimbro Brazzell; Jeanette Marjorie Wood; Peter Anthony Campochiaro; Frances Elizabeth Kane
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1998-11-23
Filing date: 1999-11-22
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2019-11-22
Also published as: CN1328462A; AU1506600A; DK1131073T3; KR20010078398A; IL142757A; CA2348890A1; BR9915569A; JP2002530342A; ZA200103925B; DE69912304T2; PT1131073E; HK1040182A1; NZ511559A; AU761092B2; NO20012490D0; JP2011088938A; ATE252387T1; IL142757A0; NO20012490L; EP1131073A1

Abstract

Uso de un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo, **FORMULA** en la que R representa un radical hidrocarbilo Rº o un radical acilo Ac, en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades neovasculares oculares.

Description

Uso de derivados de estaurosporina para tratar enfermedades neovasculares oculares.

La presente invención se refiere, en particular, al uso de derivados de estaurosporina en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad neovascular ocular, por ejemplo, la neovascularización retiniana y la neovascularización coroidal.

La retina del ojo recibe su suministro sanguíneo de dos lechos vasculares, los vasos retinianos que suministran sangre a los dos tercios internos de la retina, y los vasos coroidales que suministran sangre al tercio externo. En varios procesos de enfermedad que incluyen retinopatía diabética, retinopatía asociada con partos prematuros, oclusión de la vena retiniana ramificada y oclusión de la vena retiniana central; denominados colectivamente retinopatías isquémicas, se producen lesiones en los vasos sanguíneos retinianos que ocasionan el cierre de los capilares retinianos. La isquemia retiniana da como resultado la liberación de uno o más factores angiogénicos que estimulan la neovascularización. Los nuevos vasos atraviesan la membrana limitante interna (ILM) que reviste la superficie interna de la retina y crecen a lo largo de la superficie externa del cuerpo vítreo. Reclutan otras muchas células y producen capas de vasos, células y matriz extracelular que ejercen tracción sobre la retina, produciendo a menudo desprendimientos de retina y una pérdida grave de la visión.

La neovascularización coroidal tiene lugar en varios procesos de enfermedad, siendo la más común la degeneración macular relacionada con la edad. En esta afección, la mácula, que está adaptada especialmente para una visión aguda y detallada, está dañada por la muerte gradual de células fotorreceptoras y RPE. Esto constituye la parte degenerativa de la enfermedad, que ocasiona una pérdida gradual de la visión central. Se desconoce la razón de la muerte celular y, en la actualidad, no existe tratamiento. Según tiene lugar la degeneración, los nuevos vasos sanguíneos tienden a crecer desde el coroides para invadir los espacios sub-RPE y subretinianos. Este proceso se denomina neovascularización coroidal (CNV) y a menudo lleva a una pérdida rápida y grave de visión debida a la hemorragia y cicatrización. Si la CNV está bien delineada y no está por debajo del centro de la fóvea, lo cual ocurre en una pequeña minoría de pacientes, a veces puede servir de ayuda el tratamiento con láser. Incluso cuando el láser es satisfactorio inicialmente, hay una alta tasa de CNV recurrente y pérdida de visión. Es necesario un tratamiento dirigido a los estímulos del crecimiento de los vasos sanguíneos que sería beneficioso para los pacientes con neovascularización retiniana o coroidal.

El uso según la presente invención para tratar o prevenir enfermedades neovasculares oculares, incluyendo neovascularización retiniana y neovascularización coroidal. El método tiene la etapa de administración de una cantidad eficaz de un derivado de estaurosporina o una sal del mismo.

El tratamiento con estaurosporina según la presente invención es muy eficaz para inhibir y prevenir la neovascularización ocular, a diferencia del tratamiento con láser de la técnica anterior, que tiene una eficacia limitada. Además, el tratamiento con estaurosporina es fácil de administrar, a diferencia de los métodos de tratamiento de la técnica anterior, por ejemplo, el tratamiento con láser, que son invasivos y requieren un equipo complejo.

El medicamento según la presente invención se va a usar en un método para tratar enfermedades neovasculares oculares. El método usa un medicamento que contiene un derivado de estaurosporina. Ahora se ha descubierto, sorprendentemente, que los compuestos de fórmula (I) son muy útiles para tratar la neovascularización ocular, incluyendo la neovascularización retiniana y la neovascularización coroidal.

Según esto, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I),

1

en la que R representa un radical hidrocarbilo Rº o un radical acilo Ac,

en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades neovasculares oculares.

Los radicales hidrocarbilo adecuados incluyen radicales hidrocarbilo acíclico, carbocíclico y carbocíclico-acíclico que tienen un número máximo total de átomos de carbono de preferiblemente 30, especialmente 18. Adicionalmente, son radicales hidrocarbilo adecuados radicales heterocíclicos y radicales heterocíclicos-acíclicos. Los radicales hidrocarbilo (Rº) pueden estar saturados o insaturados y substituidos o no substituidos. Los radicales acilo adecuados incluyen ácido carboxílico opcionalmente modificado funcionalmente y ácido sulfónico orgánico, y ácido fosfórico opcionalmente esterificado, por ejemplo, ácido piro- u orto-fosfórico.

Los radicales hidrocarbilo acíclicos preferidos incluyen radicales alquilo de 1 a 20 átomos de carbono; radicales hidroxialquilo de 2 a 20 átomos de carbono cuyo grupo hidroxi está en cualquier posición distinta de la posición 1; radicales ciano-alquilo [de 1 a 20 átomos de carbono]; radicales carboxi-alquilo [de 1 a 20 átomos de carbono] cuyo grupo carboxi; y radicales alquenilo de 3 a 20 átomos de carbono en los que la valencia libre no está en el mismo átomo de carbono que el doble enlace. Son radicales hidrocarbilo acíclico ejemplares radicales de alquilo inferior, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo y heptilo; alquenilo inferior, por ejemplo, propenilo, 2- o 3-metalilo y 2- o 3-butenilo; alcadienilo inferior, por ejemplo, 1-penta-2,4-dinilo; y alquinilo inferior, por ejemplo, propargilo o 2-butinilo. Son radicales hidrocarbilo carbocíclicos preferidos radicales cicloalquilo mono-, bi- o policíclicos, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, biciclo[2,2,2]octilo, 2-biciclo[2,2,1]heptilo y adamantilo; cicloalquenilo; cicloalcandienilo; y el arilo correspondiente. Los radicales arilo incluyen radicales fenilo, naftilo (por ejemplo, 1- o 2-naftilo), bifenililo (por ejemplo, 4-bifenililo), antrilo, fluorenilo, azulenilo y análogos aromáticos de los mismos que tienen uno o más anillos saturados. Son radicales carbocíclico-acíclico preferidos radicales acíclicos que llevan uno o más radicales carbocíclicos. Los radicales heterocíclicos y los radicales heterocíclicos-acíclicos incluyen radicales monocíclicos, bicíclicos, policíclicos, aza-, tia-, oxa-, taza- oxaza-, diaza-, triaza- y tetraza-cíclicos con carácter aromático.

Los radicales acilo ejemplares provenientes de un ácido carboxílico opcionalmente modificado funcionalmente (Ac^{1}) tienen la fórmula Z-C(=W)- en la que W es oxígeno, azufre o imino y Z es hidrógeno, hidrocarbilo Rº, hidrocarbiloxi RºO o amino. Preferiblemente, W es oxígeno o azufre y Z es alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, especialmente alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, que está substituido opcionalmente con halógeno, carboxi o alcoxicarbonilo de 1 a 4 átomos de carbono. Adicionalmente, es preferible que Z sea fenilo, piridilo, furilo, tienilo, imidazolilo, quinolilo, isoquinolilo, benzofuranilo o bencimidazolilo, estando cada uno de ellos sin substituir o substituido con alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno, nitro, trifluorometilo, carboxi, alcoxicarbonilo de 1 a 4 átomos de carbono, metilenodioxi, ciano y/o una sal de los mismos. Los radicales acilo Ac^{1} preferidos son de fórmula R_{b}º-CO-, en la que R_{b}º es hidrógeno, benzoílo o un radical hidrocarbilo, por ejemplo, un radical alquilo de 1 a 19 átomos de carbono que está substituido opcionalmente con un grupo carboxi, un grupo ciano, un grupo éster, un grupo amino o halógeno. Otro grupo de radicales acrilo Ac^{1} preferidos son de fórmula Rº-O-CO-. Aún otro grupo de radicales acrilo Ac^{1} preferidos son de fórmula

R_{1}---

\delm{N}{\delm{\para}{R _{2} }}

---C(=W)---

en la que R_{1} y R_{2} se seleccionan, independientemente, entre hidrógeno e hidrocarbilo acíclico de 1 a 7 átomos de carbono no substituido, preferiblemente alquilo de 1 a 4 átomos de carbono y alquenilo de 3 a 7 átomos de carbono. R_{1} y R_{2} pueden ser, independientemente, arilo monocíclico, aralquilo o aralquenilo que tienen como máximo 10 átomos de carbono, estando cada uno de ellos substituido opcionalmente con alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno y/o nitro. Los radicales particularmente deseables de este grupo tienen hidrógeno como R_{1} y alquilo de 1 a 4 átomos de carbono opcionalmente substituido, alquenilo de 3 a 7 átomos de carbono, fenilo, piridilo, pirimidilo, furilo, tienilo, imidazolilo, quinolilo, isoquinolilo, benzofuranilo o bencimidazolilo como R_{2}.

Los radicales acilo ejemplares provenientes de un ácido sulfónico orgánico (Ac^{2}) son de fórmula Rº-SO_{2}- en la que Rº es un radical hidrocarbilo. Preferiblemente, Rº de los radicales acilo de ácido sulfónico es alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, fenilo, piridilo, pirimidilo, furilo, tienilo, imidazolilo, quinolilo, isoquinolilo, benzofuranilo o bencimidazolilo, estando cada uno de ellos no substituido o substituido con alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno, nitro, trifluorometilo, carboxi, alcoxicarbonilo de 1 a 4 átomos de carbono, metilenodioxi, ciano y/o una sal de los mismos.

Los radicales acilo ejemplares provenientes de ácido fosfórico esterificado opcionalmente (Ac^{3}) son de fórmula

2

en la que R_{1} y R_{2} se seleccionan, independientemente, entre hidrógeno, hidrocarbilo acíclico de 1 a 7 átomos de carbono no substituido, preferiblemente alquilo de 1 a 4 átomos de carbono y alquenilo de 3 a 7 átomos de carbono. R_{1} y R_{2}, independientemente, pueden ser arilo monocíclico, aralquilo o aralquenilo que tienen un máximo de 10 átomos de carbono, estando cada uno de ellos substituido opcionalmente con alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno y/o nitro.

Otros derivados de estaurosporina adecuados incluyen estaurosporinas de fórmula (I) en la que R proviene de un \alpha-aminoácido seleccionado entre glicina, fenilglicina, alanina, fenilalanina, prolina, leucina, serina, valina, tirosina, arginina, histidina y asparagina, o una sal de los mismos. Se describen derivados de estaurosporina adecuados para la presente invención con mayor detalle en la patente de Estados Unidos nº 5.093.330 de Caravatti et al. La descripción de los derivados de estaurosporina de la patente se incorpora en el presente documento como referencia.

Los derivados de estaurosporina particularmente preferidos de fórmula (I) para la presente invención incluyen:

N-(3-carboxipropionil)-estaurosporina, N-benzoil-estaurosporina, N-trifluoroacetil-estaurosporina, N-metilaminotiocarbonil-estaurosporina, N-fenilcarbamoil-estaurosporina, N-(3-nitrobenzoil)-estaurosporina, N-(3-fluorobenzoil)-estaurosporina, N-terc-butoxicarbonil-estaurosporina, N-(4-carboxibenzoil)-estaurosporina, N-(3,5-dinitrobenzoil)-estaurosporina, N-alanil-estaurosporina, N-etil-estaurosporina, N-carboximetil-estaurosporina, N-[(terc-butoxicarbonilamino)-acetil]-estaurosporina, N-(2-aminoacetil)-estaurosporina y las sales farmacéuticamente aceptables de las mismas.

Las composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de fórmula I como ingrediente activo se pueden administrar por vía entérica, nasal, bucal, rectal, tópica, oral y parenteral, por ejemplo, mediante administración intravenosa, intramuscular, intravítrea, sub-conjuntival o subcutánea, para tratar una neovascularización ocular en mamíferos, especialmente en seres humanos. Las composiciones pueden contener el ingrediente activo solo o, preferiblemente, el ingrediente activo junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La dosificación eficaz del ingrediente activo depende del tipo de enfermedad diana, así como de la especie, edad, peso y estado físico del sujeto, de los datos farmacocinéticos y del modo de administración.

Los compuestos de fórmula I se administran en una cantidad eficaz contra estados patológicos de un mamífero, por ejemplo, un ser humano. Para un individuo que tiene un peso corporal de aproximadamente 70 kg, la dosis sistémica diaria administrada es de aproximadamente 0,1 g a aproximadamente 20 g, preferiblemente de aproximadamente 0,5 g a aproximadamente 5 g, del ingrediente activo, y las composiciones farmacéuticas adecuadas pueden tener de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 95% del ingrediente activo. Las formas de dosificación unitaria adecuadas incluyen comprimidos con y sin recubrimiento, ampollas, viales, supositorios o cápsulas. Otras formas de dosificación adecuadas incluyen inyectables, dispositivos intraoculares, dispositivos intravítreos, pomadas, cremas, pastas, espumas, tinturas, barras de labios, gotas oculares, gotas orales, pulverizadores, dispersiones y similares. Las composiciones farmacéuticas adecuadas se preparan de una manera conocida en la técnica, por ejemplo, por medios convencionales de mezcla, granulación, recubrimiento, disolución o liofilización.

Se prefiere el uso de soluciones del ingrediente activo, y también suspensiones o dispersiones, especialmente soluciones, dispersiones o suspensiones acuosas isotónicas. Las composiciones farmacéuticas adecuadas que contienen el ingrediente activo pueden tener vehículos, por ejemplo, manitol y almidón, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulgentes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica, tampones y similares. Las composiciones se preparan de una manera conocida en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de disolución y liofilización. Una forma en solución o suspensión de la composición puede contener agentes que aumenten la viscosidad, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinilpirrolidona y gelatinas; y solubilizantes, por ejemplo, Tween 80 [monooleato de polioxietileno(20)sorbitán; marca comercial de ICI Americas, Inc., Estados Unidos].

Los vehículos adecuados incluyen cargas, por ejemplo, azúcares, por ejemplo, lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa; fosfatos cálcicos; por ejemplo, fosfato tricálcico e hidrogenofosfato cálcico; aglutinantes, por ejemplo, almidones, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y polivinilpirrolidona; y, si se desea, disgregantes, por ejemplo, almidones, polivinilpirrolidona reticulada, ácido algínico o sales del mismo. Son otros excipientes adecuados acondicionadores del flujo y lubricantes; por ejemplo, ácido silícico, talco, ácido esteárico y sales del mismo, tales como estearato magnésico o cálcico, polietilenglicol y derivados del mismo.

El ingrediente activo, es decir, un derivado de estaurosporina, de la presente invención inhibe completamente o casi completamente la neovascularización ocular, especialmente la neovascularización retiniana y la neovascularización coroidal. Además, se observa una eficacia preventiva cuando se administra a un individuo un compuesto de la presente invención. En cada caso, el efecto sobre los vasos sanguíneos patológicos es drástico y profundo con una inhibición completa o casi completa, pero no hay un efecto tóxico identificable sobre los vasos retinianos maduros.

La presente invención se ilustra además con los siguientes ejemplos. Sin embargo, no se debe interpretar que la invención se limita a los mismos.

Ejemplo 1

Se produce retinopatía isquémica en ratones C57/BL6J mediante un método descrito por Smith et al., Oxygen-induced Retinopathy in the Mouse, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35, 101-111 (1994). Se ponen ratones con una edad de siete días y sus madres en una incubadora hermética al aire y se exponen a una atmósfera de 75 \pm 3% de oxígeno durante 5 días. La temperatura de la incubadora se mantiene a 23 \pm 2ºC y se mide el oxígeno cada 8 horas con un analizador de oxígeno. Después de 5 días, los ratones se sacan de la incubadora, se ponen en el aire ambiente y se someten a tratamiento con el fármaco. Se disuelve N-benzoil-estaurosporina (NBS) en dimetil sulfóxido (DMSO) y se diluye a las concentraciones finales con agua; la concentración máxima de DMSO es del 1%. El vehículo (1% de DMSO) o el vehículo que contiene diversas concentraciones del fármaco (volumen = 10 \mul por gramo de peso corporal) se introduce en el estómago mediante una sonda. Los diferentes ratones reciben 60, 300 ó 600 mg de NBS por kg de peso corporal. Como control, un grupo de ratones recibe el vehículo sin NBS.

Después de 5 días de tratamiento, se sacrifican los ratones, se extraen los ojos rápidamente y se congelan en un compuesto de impregnación a una temperatura óptima de corte (OCT; Miles Diagnostics, Elkhart, IN) o se fijan en formalina tamponada con fosfato al 10% y se incluyen en parafina. También se tratan ratones C57BL6J adultos por medio de una sonda con el fármaco o vehículo y, después de 5 días, se sacrifican y sus ojos se procesan para obtener secciones congeladas o en parafina.

Las secciones congeladas (10 \mum) de los ojos de ratones tratados con el fármaco y de control se tiñen histoquímicamente con lectina de griffonia simplicifolia B4 biotinilada (Vector Laboratories, Burlingame, CA) que se une selectivamente a células endoteliales. Los portaobjetos se incuban en metanol/H_{2}O_{2} durante 10 minutos a 4ºC, se lavan con solución salina tamponada con Tris 0,05 M, pH 7,6 (TBS) y se incuban durante 30 minutos en suero porcino normal al 10%. Los portaobjetos se incuban 2 horas a temperatura ambiente con lectina biotinilada y después de enjuagar con TBS 0,05 M, se incuban con avidina acoplada con peroxidasa (Vector Laboratories) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después de lavarse durante 10 minutos con TBS 0,05 M, los portaobjetos se incuban con diaminobencidina dando un producto de reacción marrón. Algunos portaobjetos se tiñen usando hematoxilina como tinte de contraste y se montan con Cytoseal.

Para llevar a cabo estimaciones cuantitativas, se cortan secciones en serie de 10 \mum por la mitad de cada ojo y se tiñen secciones separadas por aproximadamente 50-60 \mum con lectina, proporcionando 13 secciones por ojo para el análisis. Las secciones teñidas con lectina se examinan con un microscopio Axioskop (Zeiss, Thornwood, NY) y las imágenes se digitalizan usando una videocámara a color 3 CCD (IK-TU40A, Toshiba, Tokio, Japón) y un "frame grabber" (sistema de visión artificial). Se usa el programa Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) para delinear las células teñidas con lectina sobre la superficie de la retina y se mide su área. Como valor experimental único se usa la media de las 13 medidas de cada ojo.

Los ratones con retinopatía isquémica tratados con el vehículo sin NBS muestran un marcado aumento en el área de tinción de las células endoteliales por toda la retina con grandes grupos de células sobre la superficie de la retina en comparación con ratones no isquémicos, que muestran vasos normales en los lechos capilares superficiales y profundos con unos pocos vasos conectores. Los ratones isquémicos que reciben 600 mg/kg de NBS una vez al día durante 5 días tienen una disminución drástica en la tinción de las células endoteliales sobre la superficie y en el interior de la retina en comparación con los ratones tratados con el vehículo. De hecho, la tinción de las células endoteliales en el interior de la retina de los ratones isquémicos tratados con NBS es menor que la de los ratones no isquémicos. La ampliación elevada demuestra que no hay células endoteliales identificables sobre la superficie de la retina, lo cual indica que hay una inhibición completa de la neovascularización. También hay una ausencia sorprendente de tinción de células endoteliales en la capa nuclear interna y en la capa plexiforme externa en la que normalmente se localizan los lechos capilares profundos.

Los ratones con retinopatía isquémica que reciben 300 mg/kg o 60 mg/kg de NBS dos veces al día mediante alimentación por sonda muestran algunos grupos de neovascularización sobre la superficie de la retina que son menores que los grupos en la retina de los ratones de control tratados con el vehículo. Las retinas de los ratones tratados con NBS muestran también una disminución de la tinción endotelial en el interior de la retina. El resultado del análisis de la imagen demostró que la tinción de células endoteliales sobre y en las retinas de ratones tratados con 600 ó 60 mg/kg una vez al día, fue significativamente menor que la de los ratones tratados con el vehículo y mostró un efecto dependiente de la dosis cuando se comparó con los ratones que se trataron dos veces al día. Los resultados demuestran claramente que el derivado de estaurosporina inhibe la neovascularización retiniana.

Ejemplo 2

A ratones C57BL6J adultos se les suministra el vehículo o 600 mg/kg de NBS por medio de una sonda una vez al día y después de 5 días, se sacrifican y sus ojos se procesan como en el ejemplo 1.

El análisis de las imágenes demuestra que no hay diferencia en el área total de tinción endotelial en la retina o en el aspecto de los vasos retinianos en los ratones tratados con NBS en comparación con los ratones tratados con el vehículo. El análisis no muestra tampoco una diferencia en la cantidad de tinción de células endoteliales retinianas entre los ratones tratados con NBS y los tratados con el vehículo. Esto demuestra que el derivado de estaurosporina no es tóxico para las células endoteliales de los vasos maduros.

Ejemplo 3

Se dividen camadas de ratones C57/BL6J recién nacidos (ratones neonatales) en grupos de tratamiento y de control que reciben inyecciones subcutáneas diarias de 100 mg/kg del fármaco o vehículo, respectivamente. A los 7 ó 10 días de edad, los ratones se anestesian con éter y se someten a una perfusión de 1 ml de solución salina tamponada con fosfato que contiene 50 mg/ml de dextrano marcado con fluoresceína (peso molecular medio de 2 x 10^{6}, Sigma, St. Louis, MO) según describen Tobe et al., Evolution of Neovascularization in Mice with Overexpression of VEGF in Photoreceptors, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998). Se extraen los ojos y se fijan durante 1 hora en formalina tamponada con fosfato al 10%. Se extraen la córnea y el cristalino y se disecciona cuidadosamente toda la retina del globo ocular. Se realizan cortes radiales desde el extremo de la retina hasta el ecuador en los 4 cuadrantes, y la retina se monta en plano en Aquamont con los fotorreceptores mirando hacia arriba. Los montajes planos se examinan mediante microscopía de fluorescencia y las imágenes se digitalizan usando una videocámara a color 3 CCD y un "frame grabber" (sistema de visión artificial). Se usa Image- Pro^{TM} Plus para medir la distancia desde el centro del nervio óptico al frente principal de vasos retinianos en desarrollo en cada cuadrante y se usa la media como valor experimental único.

A los 7 días de edad, los vasos retinianos en los ratones tratados con vehículo casi alcanzan el borde periférico de la retina, pero en los ratones tratados con NBS, los vasos retinianos se extienden sólo un poco más allá de la mitad de la periferia. A los 10 días de edad, el lecho capilar superficial está completo y se extiende por todo el borde periférico de la retina y el lecho capilar profundo está parcialmente desarrollado. Pero en los ratones tratados con NBS, el lecho capilar superficial aún no ha alcanzado el borde de la retina. La distancia del nervio óptico al frente vascular se calcula mediante análisis de imágenes y las diferencias entre los ratones tratados y los ratones de control en ratones de 7 y 10 días es estadísticamente significativa. Esto indica que el derivado de estaurosporina inhibe el desarrollo vascular retiniano.

Ejemplo 4

Se tratan ratones C57BL/6J de acuerdo con la Asociación para la Investigación de la Visión y resolución Oftalmológica para el tratamiento de animales. La neovascularización coroidal se genera modificando una técnica descrita anteriormente, Tobe et al., Targeted disruption of the FGF2 gene does not prevent choroidal neovascularization in a murine model, publicado en Amer. J. Path. En resumen, se anestesian ratones C57BL/6J macho de 4 ó 5 semanas de edad con clorhidrato de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y las pupilas se dilatan con tropicamida al 1%. Se provocan tres quemaduras por fotocoagulación con láser de criptón (tamaño de mancha de 100 \mum, duración 0,1 segundos, 150 mW) en cada retina usando el sistema de administración de lámpara de hendidura de un Fotocoagulador Coherent Modelo 920 y un portaobjetos portátil como lente de contacto. Las quemaduras se realizan en las posiciones 9, 12 y 3 del reloj del polo posterior de la retina. La producción de una burbuja a la vez que el láser, que indica la ruptura de la membrana de Bruch, es un factor importante para obtener CNV, por lo que sólo se incluyen los ratones en los que se produce una burbuja para las tres quemaduras. Se asignan aleatoriamente 10 ratones al tratamiento con vehículo solo y se asignan 10 ratones para recibir el vehículo que contiene 400 mg/kg/día de NBS suministrado por vía oral por medio de una sonda. Después de 14 días, los ratones se sacrifican con una sobredosis de pentobarbital sódico y sus ojos se extraen rápidamente y se congelan en un compuesto de impregnación a la temperatura óptima de corte (OCT). Se cortan secciones en serie congeladas (10 \mum) en toda la extensión de cada quemadura y se tiñen histoquímicamente con lectina de griffonia simplicifolia B4 biotinilada (Vector Laboratories, Burlingame, CA) que se une selectivamente a las células endoteliales. Se incuban portaobjetos en metanol/H_{2}O_{2} durante 30 minutos a 4ºC, se lavan con solución salina tamponada con Tris 0,05 M, pH 7,4 (TBS) y se incuban durante 30 minutos en suero porcino normal al 10%. Los portaobjetos se enjuagan con TBS 0,05 M y se incuban 2 horas a 37ºC con lectina biotinilada. Después de enjuagarse con TBS 0,05 M, los portaobjetos se incuban con estreptavidina-fosfatasa (Kirkegaard & Perry Laboratories, Cabin John, MD) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de una incubación de 10 minutos en tampón Tris 0,05 M, pH 7,6, los portaobjetos se revelan en Histomark Red (Kiekegaard & Perry) para dar un producto de reacción rojo y se montan con Cytoseal (Stephens Scientific, Riverdale, NJ). Algunos portaobjetos se tiñen con Contrast Blue (Kiekegaard y Perry) como tinte de contraste.

Para llevar a cabo estimaciones cuantitativas, se examinan secciones teñidas con lectina con un microscopio Axioskop (Zeiss, Thornwood, NY) y las imágenes se digitalizan usando una videocámara a color 3 CCD (IK-TU40A, Toshiba, Tokio, Japón) y un "frame grabber" (sistema de visión artificial). Se usa el programa Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) para delinear y medir el área de vasos sanguíneos teñidos con lectina en el espacio subretinal. Para cada lesión, se toman medidas de área para todas las secciones en las que alguna de las lesiones aparecen y se añaden juntas para dar una medida de área integrada. Se calcula la media de los valores dando un valor experimental por ratón. Se lleva a cabo un ensayo t con 2 muestras para varianzas desiguales para comparar la media logarítmica del área integrada entre los ratones en tratamiento y los de control.

Dos semanas después del láser, todas las lesiones en ambos grupos de ratones muestran una discontinuidad en la membrana de Bruch con un daño aproximadamente equivalente al de la retina suprayacente. Todos los ratones tratados con el vehículo solo muestran grandes áreas de neovascularización coroidal en el sitio de cada ruptura de la membrana de Bruch inducida por láser. Existe proliferación de las células epiteliales pigmentadas de la retina a lo largo del margen de los nuevos vasos. Los vasos sanguíneos retinianos teñidos con lectina se ven en la retina suprayacente. Por el contrario, todos los ratones que reciben 400 mg/kg/día de NBS tienen una neovascularización coroidal muy pequeña, si la hay, en el sitio de la ruptura de la membrana de Bruch inducida por láser. En la mayoría de los casos, no se puede identificar tejido neovascular teñido con lectina en toda la quemadura, aunque algunas quemaduras contenían zonas en las que hay discos finos de tejido teñido con lectina. Hay una ligera proliferación de las células RPE. A pesar de la notable disminución de la neovascularización coroidal en los ojos de los ratones tratados, los vasos retinianos superyacentes parecen normales. Esto se puede verse mejor en las secciones en las que no hay tinción con tinte de contraste.

La cuantificación del área integrada de tinción con lectina por lesión muestra una disminución drástica en los ratones tratados con NBS (0,0090182 \pm 0,0017540 mm^{2}) en comparación con las lesiones en ratones tratados sólo con el vehículo (0,0695621 \pm 0,0073960 mm^{2}). Esta diferencia es muy significativa estadísticamente (p = 0,004). Estos resultados demuestran claramente que el derivado de estaurosporina inhibe drásticamente la neovascularización coroidal.

Los ejemplos anteriores ilustran la eficacia del ingrediente activo. Los derivados de estaurosporina de la presente invención son muy eficaces para inhibir completamente o casi completamente la neovascularización retiniana y coroidal, y los ingredientes activos se pueden administrar a un paciente mediante un modo de tratamiento con un fármaco que sea convencional y/o práctico.

Claims

1. Uso de un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo,

3

en la que R representa un radical hidrocarbilo Rº o un radical acilo Ac, en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades neovasculares oculares.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho radical hidrocarbilo es un radical hidrocarbilo acíclico, carbocíclico, carbocíclico-acíclico, heterocíclico o heterocíclico-acíclico.

3. El uso de la reivindicación 2, en el que dicho radical hidrocarbilo acíclico es un radical como un radical alquilo de 1 a 20 átomos de carbono, un radical hidroxialquilo de 2 a 20 átomos de carbono cuyo grupo hidroxi está en cualquier posición distinta de la posición 1, un radical ciano-alquilo [de 1 a 20 átomos de carbono], un radical carboxi-alquilo [de 1 a 20 átomos de carbono] cuyo grupo carboxi, o un radical alquenilo de 3 a 20 átomos de carbono cuya valencia libre no está en el mismo átomo de carbono que el doble enlace.

4. El uso de la reivindicación 2, en el que dicho radical hidrocarbilo carbocíclico es un radical cicloalquilo mono-, bi- o policíclico; cicloalquenilo; cicloalcandienilo; y arilo.

5. El uso de la reivindicación 2, en el que dicho radical carbocíclico- acíclico es un radical acíclico que lleva uno o más radicales carbocíclicos y dichos radicales heterocíclico y heterocíclico-acíclico son radicales monocíclicos, bicíclicos, policíclicos, aza-, tia-, oxa-, taza-, oxaza-, diaza-, triaza- y tetraza-cíclicos de carácter aromático.

6. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho radical acilo es un ácido carboxílico opcionalmente modificado funcionalmente, ácido sulfónico orgánico o ácido fosfórico opcionalmente esterificado.

7. El uso de la reivindicación 6, en el que dicho radical acilo es de fórmula Z-C(=W)-, en la que W es oxígeno, azufre o imino y Z es hidrógeno, alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, amino, fenilo, piridilo, furilo, tienilo, imidazolilo, quinolilo, isoquinolilo, benzofuranilo o bencimidazolilo.

8. El uso de la reivindicación 6, en el que dicho radical acilo es de fórmula R_{b}º-CO-, en la que R_{b}º es hidrógeno, benzoílo o un radical alquilo de 1 a 19 átomos de carbono.

9. El uso de la reivindicación 6, en el que dicho radical acilo es de fórmula Rº-O-CO-, en la que Rº es un radical hidrocarbilo acíclico, carbocíclico, carbocíclico-acíclico, heterocíclico o heterocíclico-acíclico.

10. El uso de la reivindicación 6, en el que dicho radical acilo es de fórmula

R_{1}---

\delm{N}{\delm{\para}{R _{2} }}

---C(=W)---

en la que R_{1} y R_{2} se seleccionan, independientemente, entre hidrógeno e hidrocarbilo acíclico de 1 a 7 átomos de carbono no substituido.

11. El uso de la reivindicación 6, en el que dicho radical acilo es de fórmula Rº-SO_{2}- en la que Rº es un radical hidrocarbilo.

12. El uso de la reivindicación 6, en el que dicho radical acilo es de fórmula

4

13. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho ingrediente activo se selecciona entre N-(3-carboxi-propionil)-estaurosporina, N-benzoil-estaurosporina, N-trifluoroacetil-estaurosporina, N-metilaminotiocarbonil-estaurosporina, N-fenilcarbamoil-estaurosporina, N-(3-nitro-benzoil)-estaurosporina, N-(3-fluorobenzoil)-estaurosporina, N-terc-butoxicarbonil-estaurosporina, N-(4-carboxibenzoil)-estaurosporina, N-(3,5-dinitrobenzoil)-estaurosporina, N-alanil-estaurosporina, N-etil-estaurosporina, N-carboximetil-estaurosporina, N-[(terc-butoxicarbonilamino)-acetil]-estaurosporina, N-(2-aminoacetil)-estaurosporina y sales de las mismas.

14. El uso de la reivindicación 1 en el que dicho ingrediente activo es N-benzoil-estaurosporina o una sal de la misma.

15. El uso de la reivindicación 1 en el que dicho tratamiento y/o prevención es el tratamiento y/o prevención de enfermedades neovasculares oculares humanas.

16. El uso de la reivindicación 1 en el que dicho tratamiento y/o prevención es el tratamiento y/o prevención de enfermedades neovasculares retinianas humanas.

17. El uso de la reivindicación 1 en el que dicho tratamiento y/o prevención es el tratamiento y/o prevención de enfermedades neovasculares coroidales humanas.

18. El uso de la reivindicación 1 en el que dicho tratamiento y/o prevención es el tratamiento y/o prevención de enfermedades neovasculares oculares en mamíferos.