ES2201115T3

ES2201115T3 - Liposomas con capacidad de atrapar mejorada, metodo y uso.

Info

Publication number: ES2201115T3
Application number: ES95930698T
Authority: ES
Inventors: Herve Tournier; Michel Schneider; Christian Guillot
Original assignee: Bracco Research SA
Current assignee: Bracco Research SA
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1995-09-28
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2015-09-28
Also published as: EP0731690A1; KR100452306B1; US5702722A; CN1098067C; ZA958257B; NO962189L; NO962189D0; JPH09505773A; DE69531041D1; WO1996010393A1; CZ147096A3; US5980937A; JP2009046491A; NZ292260A; FI962255A0; NO317053B1; FI962255A7; AU699791B2; US5895661A; CA2175050C

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN DEPOSITO SECO COMO UN PRECURSOR DE VESICULAS DE LIPOSOMA, SIENDO EL PRECURSOR UNA ESTRUCTURA EXPANDIDA TRIDIMENSIONAL CON DENSIDAD ENTRE .01 Y .001 G/CM{SUP,3}. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A UN METODO PARA FABRICAR VESICULAS DE LIPOSOMA CON UNA CAPACIDAD REALZADA DE ATRAPAR DISOLVIENDO UNO O MAS LIPIDOS FORMADORES DE PELICULAS EN AL MENOS UN SOLVENTE ORGANICO PARA FORMAR UNA SOLUCION EN UN RECIPIENTE DE REACCION, EVAPORAR EL SOLVENTE PARA FORMA UNA ESTRUCTURA LIPIDICA POROSA TRIDIMENSIONAL EXPANDIDA, PONER EN CONTACTO EL DEPOSITO DE LIPIDOS CON UNA FASE PORTADORA ACUOSA Y PRODUCIR VESICULAS DE LIPOSOMA QUE ATRAPAN LA FASE PORTADORA ASI COMO UN APARATO QUE COMPRENDE UNA RED DE ENTUBACION O UN ENVASE INERTE QUE SIRVE DE SOPORTE DE MATERIAL O DE SUPERFICIE DE MATRIZ PARA LA DEPOSICION DE LIPIDOS PRODUCIDA DE ACUERDO CON EL METODO.

Description

Liposomas con capacidad de atrapar mejorada, método y uso.

Campo técnico

La invención se refiere a un precursor de vesículas de liposoma en forma de un depósito de lípidos seco y a un procedimiento para la preparación de vesículas de liposoma con una capacidad de captación aumentada al disolver uno o más lípidos formadores de película en por lo menos un disolvente orgánico en un recipiente de reacción, depositar los lípidos por evaporación del disolvente, poner en contacto el depósito de lípidos con una fase de vehículo de solución acuosa, y producir vesículas de liposoma que captan la solución.

Antecedentes de la técnica

Las vesículas de liposoma cuya envoltura protectora consiste en una bi- o multicapa de moléculas de lípido han sido reconocidas desde hace mucho tiempo como sistemas de administración de fármacos que pueden mejorar la eficacia terapéutica y de diagnóstico de muchos fármacos y agentes de contraste. Experimentos con cierto número de diferentes antibióticos y agentes de contraste de rayos X han mostrado que se puede conseguir una mejor actividad terapéutica o un mejor contraste con un nivel superior de seguridad al encapsular fármacos y agentes de contraste con liposomas. El gran interés sobre en liposomas como sistemas de encapsulación para fármacos ha revelado que un desarrollo y una comercialización satisfactorios de dichos productos requieren procedimientos reproducibles de producción a gran escala de vesículas de lípidos con características adecuadas. Por consiguiente, se ha iniciado una investigación sobre procedimientos que produzcan de una manera uniforme vesículas de liposoma del tamaño y de la concentración requeridos y una distribución de tamaños y una capacidad de captación requeridas cualquiera que sea la naturaleza de la mezcla de lípidos. Dichos procedimientos deberían proporcionar liposomas con una relación uniforme de sustancia activa a lípido, mientras que se respetan las prácticas de una buena preparación actualmente aceptadas. Como resultado de la investigación, y debido al hecho de que el comportamiento de los liposomas puede variar sustancialmente con diversos parámetros de producción, se han propuesto hasta la fecha muchos procedimientos diferentes de preparación.

Los procedimientos convencionales de preparación de liposomas incluyen cierto número de etapas en las que se disuelven componentes formadores de multi- o bicapas (fosfolípidos o mezclas de fosfolípidos con otros lípidos, p.ej. colesterol) en un disolvente o mezcla de disolventes orgánicos volátiles en un matraz de fondo redondo seguido de la evaporación del disolvente en condiciones (temperatura y presión) que eviten la separación de fases. Al efectuar la eliminación del disolvente, una mezcla de lípidos seca, usualmente en forma de un depósito de película sobre las paredes del reactor, se hidrata con un medio acuoso que puede contener disueltos agentes de tamponación, sales, agentes acondicionadores y una sustancia activa que se ha de captar. Los liposoma se formarán en a etapa de hidratación, con lo cual una proporción del medio acuoso queda encapsulado en los liposomas. La hidratación se puede realizar con o sin proporcionar energía a la solución por medio de agitación, tratamiento con ultrasonidos o microfluidización, con la subsiguiente extrusión a través de uno o más filtros de policarbonato. La sustancia activa no encapsulada libre se puede separar para su recuperación y el producto se filtra, se esteriliza, opcionalmente se liofiliza, y se envasa.

La hidratación, más que cualquier otra etapa, influye sobre el tipo de liposomas formados (tamaño, número de capas de lípido y volumen captado). La naturaleza del lípido seco, su superficie específica y su porosidad son de particular importancia. Así, se ha demostrado que el procedimiento de hidratación y captación son muy eficaces cuando la película de lípidos secos se mantiene delgada. Esto significa que cuanto mayor es la cantidad de lípido, tanto mayor ha de ser la superficie para la deposición de los lípidos, y significa asimismo que incluso si se utilizan perlas de vidrio y otras partículas insolubles inertes para aumentar la superficie exterior disponible para la deposición de película, el procedimiento de película delgada permanece en gran medida siendo un procedimiento de laboratorio.

Se han propuesto otros procedimientos de preparación de liposomas que implican la inyección de una solución orgánica de lípidos en un medio acuoso con eliminación continua de disolvente, utilización de un secado por aspersión, liofilización, microemulsificación y microfluidización etc., en cierto número de publicaciones o patentes tales como por ejemplo los documentos UA-A-4.529.561, US-A-4.572.425 y E-A-186.352.

En el documento US-A-4.935.171 (Vestar) se ha descrito un intento de resolver los problemas de llevar a mayor escala la producción de liposomas. En el mismo se da a conocer un procedimiento para la preparación de liposomas en cantidades comerciales al formar una película de lípido homogénea y uniforme en un evaporador de película delgada por medio de la evaporación del disolvente orgánico. Después del secado de la película de lípido delgada que se forma sobre la pared interna del evaporador, el depósito se hidrata in situ con una fase acuosa con agitación proporcionada por el rotor. Aunque la solución propuesta en dicho documento parece ser un paso en la dirección correcta, la relación de superficie de la película de lípido al volumen del reactor es sólo ligeramente, si no marginalmente, mejor que la de los matraces de fondo redondo utilizados a escala de laboratorio. El rendimiento horario del reactor o productividad es todavía demasiado bajo para que el procedimiento sea económicamente sano y competitivo.

Se han abordado diferentes aspectos de la preparación de liposomas y se han propuesto algunas mejoras y diferentes soluciones a los problemas de aumento de escala. Documentos tales como por ejemplo los documentos WO-A-86/00.238, WO-A-87/00.043, US-A-4.737.323, US-A-4.753.788 y US-A-4.781.871 han sugerido la utilización de una congelación rápida de vesículas multilamelares previamente preparadas con el posterior tratamiento de congelación y descongelación para mejorar su capacidad de captación, la utilización de una técnica de extrusión de liposomas multilamelares o la mejora de su distribución de tamaños, etc.

Hasta la fecha no ha habido ninguna sugerencia de un procedimiento a gran escala industrial cuyo control de los parámetros de producción permita un procedimiento reproducible en el que se traten grandes volúmenes de líquido en el interior de un espacio del reactor relativamente pequeño. Todos los procedimientos conocidos a escala piloto o comercial, estarían limitados típicamente a pequeños lotes en los que el tratamiento de grandes volúmenes de soluciones diluidas de liposomas requeriría una gran cantidad de suelo y espacio del reactor así como la manipulación de grandes volúmenes de soluciones y disolventes. En realidad, debido a los rendimientos horarios relativamente bajos o productividad de los reactores, dichos procedimientos son demasiado engorrosos y demasiado costosos para una producción comercial a gran escala.

Sumario de la invención

Resumiendo en pocas palabras, la invención se refiere a un precursor de vesículas de liposoma soportado o no soportado en forma de una estructura tridimensional de lípidos expandidos con una densidad aparente inferior a 0,1g/cm^{3}, con preferencia inferior a 0,08 g/cm^{3}, con mayor preferencia comprendida entre 0,05 y 0,001 g/cm^{3} e incluso con mayor preferencia comprendida entre 0,02 y 0,01. Por estructura soportada se entiende que el depósito poroso de lípidos se forma sobre un sistema o retículo de material de soporte inerte. Los lípidos que forman el depósito se seleccionan entre fosfolípidos saturados e insaturados, sintéticos o naturales que incluyen ácido fosfatídico, fosfatidil-colina, fosfatidiletanol-amina, fosfatidil-serina, fosfatidil-glicerol, fosfatidil-inositol y mezclas de los mismos. Los lípidos pueden contener adicionalmente sustancias seleccionadas entre fosfato de dicetilo, colesterol, ergosterol, fitosterol, sitosterol, lanosterol, \alpha-tocoferol, ácido esteárico, estearil-amina y mezclas de los mismos.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento para la preparación de vesículas de liposoma con una capacidad de captación aumentada tal como se indica en la reivindicación 11. La solución de lípidos se introduce en un recipiente de reacción adecuado y se somete a evaporación, con lo cual los líquidos que se secan forman una estructura porosa tridimensional expandida cuya densidad aparente es inferior a 0,1 g/cm^{3}, con preferencia inferior a 0,08 g/cm^{3}, con mayor preferencia comprendida entre 0,05 y 0,001 g/cm^{3} e incluso con mayor preferencia entre 0,02 y 0,01 g/cm^{3}. Posteriormente, la estructura porosa se pone en contacto con una fase de vehículo acuosa para producir vesículas de liposoma que captan una porción de la fase de vehículo.

Con preferencia, los tubos son tubos de acero inoxidable con un diámetro interno comprendido entre 0,5 mm y 5 mm y un espesor de pared comprendido entre 0,5 mm y 2 mm. Alternativamente, el relleno, que puede ser estacionario o móvil, p.ej. fluidizado, puede comprender anillos Raschig, esferas de vidrio huecas, carbono reticulado, carbono vítreo reticulado, metal reticulado, lana de vidrio o metal y fibra de vidrio o metal.

Las estructuras de lípido tridimensionales de la invención son muy adecuadas para una producción a gran escala de liposomas con una capacidad de captación elevada.

Cuando se incuban con una fase de vehículo acuosa que contiene un medio de contraste, las estructuras de lípido tridimensionales de la invención son particularmente adecuadas para la preparación de agentes de contraste para diagnósticos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama esquemático del reactor con un corte que muestra la estructura de lípido tridimensional expandida de la invención.

La Figura 2 es un diagrama esquemático del reactor con una sistema de tubos inertes.

La Figura 3 es una representación gráfica de la deposición de lípido en función de la concentración.

La Figura 4 es una representación gráfica de la deposición de lípido en función de la velocidad lineal.

La Figura 5 es un diagrama de operaciones de la producción de un medio de contraste utilizando las estructuras de lípido expandidas de la invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el inesperado descubrimiento de que se obtienen la formación óptima de liposomas y una capacidad del reactor mejorada si durante la producción de las vesículas, el depósito de lípidos obtenido por evaporación del disolvente a partir de una solución orgánica de uno o más lípidos formadores de película en por lo menos un disolvente orgánico, antes de ponerse en contacto con una fase de vehículo acuosa, se expande para formar una estructura tridimensional cuya densidad aparente es inferior a 0,1 g/cm^{3}, con preferencia inferior a 0,08g/cm^{3}, con mayor preferencia comprendida entre 0,05 y 0,001 g/cm^{3} e incluso con mayor preferencia entre 0,02 y 0,01 g/cm^{3}. Aunque no se han demostrado totalmente las razones exactas de dichos resultados inesperados, se supone que el procedimiento proporciona una relación de superficie a volumen excepcionalmente grande del depósito cuya hidratación posterior es por consiguiente más eficaz. Se producen de este modo altos rendimientos de liposomas del tamaño y de la distribución deseados mediante el procedimiento que es particularmente fácil de llevar a una escala superior y de controlar. Al disponer de una gran relación de superficie a volumen, las estructuras de lípido expandidas mejoran el rendimiento horario de los reactores, con lo cual la técnica se vuelve industrialmente muy atractiva. Además de la facilidad de llevar a una escala superior y de favorecer una alta productividad, el procedimiento proporciona ventajas adicionales que incluyen un ciclo de utilización más rápido del reactor, facilidad de control de la etapa de hidratación, tiempos de tratamiento reducidos, utilización de materiales poco costosos, y finalmente la utilización del mismo reactor para la deposición, evaporación del disolvente, hidratación de la estructura de lípido expandida y esterilización de las vesículas de liposoma formadas.

Se ha demostrado que las estructuras porosas de lípidos puros de la invención presentan una relación de superficie a volumen muy grande. Por desgracia, debido a la gran fragilidad de la estructura expandida, no se ha podido demostrar con gran precisión la superficie específica exacta de la unidad de volumen o de peso de la estructura de lípido expandida. Sin embargo, un cálculo conservador de la superficie específica total de 1 g de la estructura expandida de la invención sugiere que la superficie específica total puede variar entre 0,1 y 50 m^{2}, lo cual implica relaciones de superficie a volumen comprendidas entre 10 y 5 x 10^{5}.

La estructura de lípido tridimensional expandida se puede obtener por medio de la evaporación del disolvente orgánico a partir de un recipiente de reacción que contiene un retículo poroso inerte o un soporte que sirve como material de soporte o una superficie matriz para la deposición de lípidos. El retículo inerte puede ser cualquier material conveniente con una relación de superficie a volumen relativamente grande y puede incluir un sistema de tubos o un sistema de relleno inerte, tal como esferas de vidrio huecas, carbono reticulado, carbono vítreo reticulado, metal reticulado, lana de vidrio, cerámica o metal y fibra de vidrio, cerámica o metal. Cuando se utiliza un sistema de tubos, las dimensiones de los tubos deberán seleccionarse de tal manera, que se consiga la máxima relación de superficie a volumen. Los experimentos llevados a cabo en el transcurso del desarrollo y la caracterización del reactor de acuerdo con la invención han mostrado que en una configuración dada, los tubos con un diámetro interno comprendido entre 0,5 mm y 5 mm y un espesor de pared comprendido entre 0,5 y 2 mm han proporcionado resultados satisfactorios, sin embargo, otra configuración del reactor puede favorecer otras dimensiones de los tubos. Se ha demostrado que puesto que la solución de lípidos se extiende sobre la superficie interna y externa de los tubos por gravedad, se prefiere un sistema de tubos dispuestos verticalmente, aunque es asimismo posible una disposición helicoidal.

Con el fin de facilitar una deposición uniforme de las películas de lípido, el relleno inerte puede ser fluidizado suavemente o el reactor relleno con anillos Raschig o cualquier otro material inerte tal como se ha mencionado anteriormente se puede alimentar con la solución de lípido desde la parte superior y dejar que gotee suavemente hacia abajo del relleno. Se cree que los excelentes resultados obtenidos en la disposición de torre de goteo se debe al hecho de que se consigue un control eficaz del espesor del depósito mediante la manera de goteo de puesta en contacto de la solución de lípido y el soporte. El exceso de líquido se está eliminando constantemente, con lo cual se asegura un espesor de líquido uniforme sobre toda la superficie del soporte. Para favorecer adicionalmente la formación uniforme del revestimiento de la solución de lípido sobre el relleno, se puede introducir aire o un gas inerte tal como nitrógeno de una manera en contracorriente durante un periodo de tiempo. El gas que está usualmente frío, sin embargo en ciertas condiciones puede ser deseable que la temperatura del gas se seleccione de tal manera que se favorezca o se realice el secado y la expansión de la película de lípido utilizando un gas caliente.

Después del secado y de la expansión del depósito que consiste en lípidos puros o con un grado usual de pureza en la estructura tridimensional, el depósito se pone en contacto con una fase de vehículo acuosa. Dependiendo de la configuración del reactor, la fase de vehículo se puede introducir en el extremo inferior del reactor, p.ej. en el caso de una torre de goteo o una configuración de lecho fluidizado, o en la parte superior de la columna de reacción (en el caso de un sistema fijo de tubos). La fase de vehículo acuosa utilizada puede ser pura o puede contener sustancias biológicamente activas, agentes de contraste o ambas cosas. Virtualmente, cualquier sustancia biológicamente activa puede ser captada por los liposomas producidos de acuerdo con la invención. Dichas sustancias incluyen, pero sin limitarse a ellas, compuestos antibacterianos tales como gentamicina, compuestos antivíricos tales como rifamicinas, compuestos antifúngicos tales como anfotericina B, compuestos antiparasitarios tales como derivados de antimonio, compuestos antineoplásicos tales como mitomicina C, doxorrubicina y cisplatino, proteínas tales como albúmina y lipoproteínas, inmunoglobulinas, toxinas tales como la toxina de la difteria, enzimas tales como catalasa, hormonas, neurotransmisores y compuestos opacos a radiaciones tales como ^{99}Tc, compuestos fluorescentes tales como carboxi-fluoresceína, agentes antiinflamatorios tales como ácido salicílico e ibuprofeno, anestésicos tales como dibucaína o lidocaína, etc.

Se consiguen muy buenos resultados y altas cargas de captación con agentes de contraste de rayos X yodados, tales como yopamidol, yomeprol, yohexol, yopentol, yotralán, yodixanol, yoflucol, etc. La relación de yodo a lípido de las vesículas de liposoma de acuerdo con la invención es por lo menos de 2,75.

La evaporación del disolvente orgánico o de la mezcla de disolventes se lleva a cabo a temperaturas por encima de la ambiente o a presiones reducidas o ambas cosas. Experimentos han mostrado que el régimen de evaporación presenta una fuerte influencia sobre el grado de expansión de la estructura de lípido. Por lo tanto, para una expansión óptima, se controlará apropiadamente la cantidad de calor y la presión en el interior del reactor. El control es particularmente importante cerca del final de la evaporación del disolvente, es decir, cuando la solución se espesa y se vuelve viscosa. En ese momento, una ligera reducción de la presión dará como resultado una expansión (formación de espuma) relativamente rápida. Se ha demostrado que mediante un equilibrio apropiado de la temperatura y la presión para un disolvente o mezcla de disolvente dado, se pueden conseguir diferentes grados de expansión del depósito de lípidos. Los mejores resultados se obtienen cuando el disolvente orgánico se selecciona entre éter de petróleo, cloroformo, metanol, etanol, propanol, isopropanol, n-butanol, t-butanol, pentanol, hexanol, pentano, hexano, heptano, ciclohexano y mezclas de los mismos. Con preferencia, el disolvente es una mezcla azeotrópica de dos disolventes. Se han obtenido buenos resultados con mezclas azeotrópicas de etanol con ciclohexano, cloroformo con metanol, e isopropanol con hexano.

Los lípidos utilizados para la producción de vesículas de liposoma son convencionales y se seleccionan entre fosfolípidos saturados y/o insaturados, sintéticos o naturales, que incluyen fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol y ácido fosfatídico. Los siguientes fosfolípidos son particularmente útiles: dipalmitoilfosfatidil-colina, dipalmitoilfosfatidil-glicerol, ácido dipalmitoilfosfatídico, dipalmitoilfosfatidil-etanolamina y los correspondientes equivalentes distearoil- y dimiristil- y mezclas de los mismos. Dichos lípidos o sus mezclas pueden contener adicionalmente sustancias seleccionadas entre fosfato de dicetilo, colesterol, ergosterol, fitosterol, sitosterol, lanosterol \alpha-tocoferol, ácido esteárico, estearil-amina y mezclas de los mismos.

La invención incluye asimismo una estructura tridimensional soportada o no soportada de lípidos secos expandidos con una densidad inferior a 0,1 g/cm^{3}, con preferencia inferior a 0,08 g/cm^{3} y con mayor preferencia con una densidad comprendida entre 0,05 y 0,01 g/cm^{3}. Por estructura soportada se entiende que el depósito poroso de lípidos se forma sobre un sistema de material de soporte inerte.

Las estructuras de lípido tridimensionales expandidas son sumamente útiles para la preparación de liposomas con una alta capacidad de captación, particularmente cuando dichos liposomas se utilizan para llevar fármacos o agentes de contraste para diagnósticos. En cada caso, la estructura de lípido tridimensional porosa se pone en contacto con una solución acuosa que contiene el fármaco o el agente para diagnósticos como ingrediente activo, con lo cual los liposomas se formarán y encapsularán el ingrediente. Los liposomas que llevan la sustancia activa se tratan a continuación según sea apropiado de una manera convencional. Alternativamente, se pueden formar en primer lugar una suspensión de vesículas de liposoma "vacías", es decir vesículas de liposoma que contienen únicamente un vehículo líquido acuoso. En la etapa subsiguiente, dichos liposomas "vacíos" se ponen en contacto con una solución que contiene un ingrediente activo y las vesículas se cargan utilizando, por ejemplo, técnicas de carga de trans-membrana.

La invención comprende adicionalmente un aparato para la preparación de liposomas con alta capacidad de captación, que comprende un recipiente de reacción con una entrada y una salida, una conexión a un sistema de vacío, medios para enfriar o calentar, un medio de control, y un relleno, caracterizado porque el relleno es un sistema de tubos estrechamente compactados de un material inerte. Los tubos que presentan un diámetro interno comprendido entre 0,5 mm y 5 mm y un espesor de pared comprendido entre 0,5 y 2 mm están dispuestos con preferencia de una manera vertical, aunque también es posible una disposición semejante a un serpentín.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención.

Ejemplo 1 Caracterización del reactor

Una columna vertical de acero inoxidable 316 L con una altura de 1 metro, con regulación térmica, con un diámetro interno de 50 mm provista en su extremo inferior de una rejilla metálica se rellenó con 12 tubos de acero inoxidable. El diámetro interno de los tubos era de 4 mm y el espesor de pared de 1 mm. Antes de su introducción en el reactor, los tubos se soldaron por puntos para formar un sistema de tubos paralelos. Se ha preparado y ensayado asimismo la misma configuración de reactor, pero con tubos de 2 mm y 3 mm de diámetro.

Antes de los ensayos dirigidos a la expansión de los depósitos de lípido, se llevó a cabo la caracterización del reactor mediante la deposición de películas de lípido no expandidas utilizando la siguiente composición de lípidos: lecitina de soja hidrogenada/fosfato de dicetilo en una relación molar 9:1. Se realizaron experimentos para determinar las mejores condiciones para la deposición de los lípidos en los tubos y para demostrar la influencia de la concentración de lípidos, el diámetro interno y la naturaleza de los tubos y el caudal de drenaje de la solución de lípidos. En todos los casos, las soluciones de lípidos en cloroformo se introdujeron en los tubos a temperatura ambiente y después del llenado de los tubos desde la parte inferior, las soluciones de lípidos se drenaron a un caudal controlado. El depósito se secó a una temperatura de 80ºC bajo una atmósfera de nitrógeno por evaporación del disolvente y el depósito seco se enjuagó 3 veces con una pequeña cantidad de cloroformo.

TABLA 1

Concentración de lípidos	Lípidos depositados en mg de lípido/100 cm^{2}
g/l	tubo 3 mm	tubo 4 mm
180	33,1	23,3
220	43,7	29,7
260	62,5	40,0
300	81,5	56,5
320	94,5	80,4
340	111,3	84,2

Tal como se muestra en la Tabla 1 y en la Figura 3, las cantidades de lípidos depositados a diversas concentraciones de lípidos y con dos diámetros diferentes de tubos de acero inoxidable, el revestimiento con lípidos aumenta con un aumento de la concentración de lípidos. Además, se obtienen depósitos más gruesos por unidad de superficie en los tubos de 3 mm que en los de 4 mm. En ambos casos, se ha encontrado que las cantidades de lípidos depositados son proporcionales al cuadrado de la concentración de lípidos.

Como se puede observar a partir de la Tabla 2, la cantidad de lípidos depositados aumenta con el caudal de drenaje. Sin embargo, si estos resultados se expresan como una función de la velocidad de drenaje (en cm por min) en lugar del caudal de drenaje (en ml por min), se ha encontrado que las cantidades de lípidos depositados son casi proporcionales a la velocidad lineal. Eso independientemente del tamaño real de los tubos. Véase la Figura 4.

TABLA 2

Caudal de drenaje	Lípidos depositados en mg de lípido/100 cm^{2} en un tubo de
ml/min	2 mm	3 mm	4 mm
1	55,2	55,3	37,4
2	76,5	63,0	47,3
3,75	114,9	83,7	65,4
5	121,0	94,5	80,4

Se llevaron a cabo experimentos adicionales en un montaje idéntico, pero utilizando tubos de vidrio en lugar de tubos de acero inoxidable y han mostrado que no existen diferencias importantes en los dos soportes con respecto a la deposición de lípidos. La homogeneidad del revestimiento con lípidos se determinó cortando los tubos de acero revestidos a partir de la parte superior en intervalos de 10 cm y midiendo el espesor de la película. Los resultados obtenidos se indican en la Tabla 3.

TABLA 3

Fracción	Lípidos depositados en mg
	tubo de 3 mm	tubo de 4 mm
1	5,15	5,13
2	6,63	3,77
3	7,22	4,52
4	8,20	3,50
5	7,59	5,58
6	6,55	6,16
7	5,59	6,38
8	5.63	6,21
9	5,22	6,97
10	9,06	6,86
Media \pm D.E.	6,68 \pm 1,33	5,51 \pm 1,24

El cálculo de las densidades aparentes de los depósitos de lípidos obtenidos en las tres diferentes configuraciones de reactor han mostrado que para los tubos de 2 mm, las densidades aparentes estaban comprendidas entre 0,04 y 0,06 g/cm^{3}, para tubos de 3 mm entre 0,02 y 0,04 g/cm^{3} y para tubos de 4 mm las densidades aparentes estaban comprendidas entre 0,01 y 0,03 g/cm^{3}.

Producción de liposomas

Después de la caracterización, se construyó un nuevo reactor con 250 tubos de acero inoxidable y se conectó al circuito mostrado en la Figura 5. Se introdujeron 26 g de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (Nattermann) con 2 g de fosfato de dicetilo y 106 g de cloroformo en un reactor de vidrio con una capacidad de 1 l equipado con un agitador, una camisa de calentamiento y un condensador (1) y se calentaron a una temperatura de 60ºC con agitación hasta disolución completa. La solución de lípido se filtró a través de un filtro estéril (3) y se cargó en una columna de acero inoxidable 316 L con una camisa de calentamiento, rellena con 250 tubos paralelos de acero inoxidable 304 de 1 m de longitud (4) por medio de una bomba peristáltica (2). El exceso de solución se eliminó, el disolvente se evaporó y los lípidos se depositaron a una temperatura de 80ºC haciendo circular aire desde la parte inferior de la columna.

El reactor de vidrio con una capacidad de 2 litros con agitador, camisa de calentamiento y condensador (5) se llenó con 849 g de yopamidol, 1.196 g de agua, 0,54 g de EDTA y 1,60 g de Tris y se calentó a una temperatura de 90ºC con agitación hasta que se obtuvo la solubilización completa. La solución de yopamidol se filtró a continuación, se transfirió al reactor de vidrio (6) y desde allí a la columna (4). La solución se hizo circular a una temperatura de 75ºC entre el reactor (6) y la columna (4) por medio de una bomba de engranajes (7). La suspensión de liposoma formada se extruyó seguidamente a través del filtro (8), se recuperó en el reactor (9) y a continuación se concentró utilizando el sistema de microfiltración (10) por medio de una bomba (11). La solución concentrada se lavó con una solución salina (12) para eliminar el yopamidol libre (diafiltración). Las relaciones típicas de yodo a lípido (Y/L) para cierto número de experimentos llevados a cabo en diferentes condiciones experimentales se encontraban en el intervalo de 2,5 a 3,5 con concentraciones de lípidos comprendidas entre 25 y 35 mg/ml con un tamaño medio de liposomas de 570 nm.

La unidad de producción se puede esterilizar (p.ej. con vapor de agua) y se considera como una unidad de producción a gran escala aséptica de circuito cerrado.

Ejemplo 2

Se repitió el Ejemplo 1 en el montaje experimental mostrado en la Figura 5, pero con un tamaño ampliado a escala por un factor de cuatro. Se introdujeron 518,6 g de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (Nattermann) con 41,4 g de fosfato de dicetilo y cloroformo 2.130 g, en un reactor de vidrio con una capacidad de 3 litros equipado con un agitador, una camisa de calentamiento y un condensador (1) y se calentaron a una temperatura de 60ºC con agitación hasta disolución completa. La solución de lípidos se filtró en un filtro estéril de 0,22 \mum (3) utilizando la bomba peristáltica (2). La solución de lípidos se transfiere a continuación a la columna de acero inoxidable 316 L con una camisa de calentamiento, rellena con 1.000 tubos paralelos de acero inoxidable 304 de 1 m de longitud (4) y se elimina el exceso de la solución de lípidos. El cloroformo se evaporó y los lípidos se depositaron secos a una temperatura de 80ºC haciendo recircular aire desde la parte inferior de la columna.

El reactor de acero inoxidable (316 L) con una capacidad de 7 litros con agitador, camisa de calentamiento y condensador (5) se cargó con 2.920 g de yopamidol, 4.110 g de agua, 1,87 g de EDTA y 5,50 g de Tris (HCl qsp para pH7,2) y se calentó a una temperatura de 90ºC con agitación hasta que se obtuvo la solubilización completa. La solución de yopamidol se hizo pasar a continuación a través del filtro estéril (no indicado), se transfirió a la columna (4) utilizando una bomba de engranajes (7) y se hizo circular a una temperatura de 75ºC entre el reactor(6) y la columna (4) durante un periodo de tiempo. La suspensión de liposomas formada se recuperó en el reactor (6), se extruyó a través del filtro (8) a 75ºC y los liposomas se recuperaron en el reactor (9). La solución de liposoma se concentró seguidamente utilizando el sistema de microfiltración (10). Las relaciones típicas de yodo a lípido (Y/L) para cierto número de experimentos llevados a cabo en diferentes condiciones experimentales se encontraban en el intervalo de 2,5 a 3,5 con concentraciones de lípidos comprendidas entre 25 y 35 mg/ml con un tamaño medio de liposomas de 570 nm. La densidad aparente del depósito de lípidos varió en función de las condiciones experimentales y se calculó que estaba comprendida entre 0,08 y 0,05 g/cm^{3}. Sin embargo, los mejores liposomas se prepararon con densidades aparentes comprendidas entre 0,01 y 0,02 g/cm^{3}.

Ejemplo 3

Se repitió el Ejemplo 2 utilizando como disolvente la mezcla azeotrópica de cloroformo y metanol (87/13 = v/v). Después de la evaporación del disolvente a presión reducida, se añadió al reactor agua destilada calentada a 40ºC. La temperatura del agua añadida se encontraba por encima de la temperatura de transición (54ºC) de los lípidos utilizados. El depósito de lípidos tridimensional expandido obtenido se dejó que se hidratara y los liposomas formados se distribuyeron homogéneamente por todo el líquido. Se formaron liposomas del tipo MLV con alto rendimiento. Después de aproximadamente 1 hora, la suspensión de liposomas que contenía 5 mg/ml de lípidos se extruyó a una temperatura de 60ºC a través de una membrana de policarbonato de 2 \mum (Nuclepore) y, después de enfriarse a temperatura ambiente, se concentró a 30 mg/ml por microfiltración utilizando un sistema de mifrofiltro de 0,22 \mum Prostak (Millipore).

A la suspensión concentrada de liposomas se le añadió 1 litro de una solución acuosa que contenía 1.040 g de (S)-N,N'-bis[2-hidroxi-1-(hidroximetil)-etil]-2,4,6-tri-yodo-5-lactomido- isoftalamida (yopamidol), es decir 250 g/l de yodo covalente a una temperatura de 60ºC. La mezcla resultante (2 1) con una concentración de yodo de 260 g/l se incubó durante aproximadamente 30 min a 60ºC, después de cuyo tiempo la concentración de yodo en el exterior y en el interior del núcleo de liposoma se había igualado. La preparación resultante se concentró a 30 g/lípidos/l. La relación de yodo captado a lípido (Y/L) fue de aproximadamente 4,0.

Ejemplo 4

Una columna de vidrio (500 mm de altura y 50 mm de diámetro) se rellenó con anillos Raschig y se hizo funcionar como un reactor de torre de goteo. Una solución de lípidos que contenía 50 g/l de una mezcla de distearoilfosfatidil-colina (DSPC), colesterol y fosfato de dicetilo en una relación molar de 5:4:1 en cloroformo se hizo gotear hacia debajo de la columna provista de 35 capas de anillos Raschig extendidas sobre una malla de níquel como soporte hasta que la última capa en la parte inferior estuvo totalmente empapada con la solución. El exceso de la solución se eliminó y se inyectó una corriente de nitrógeno caliente (80ºC) desde la parte inferior hacia arriba a través del reactor. El depósito de lípidos se secó durante 2 horas. Se detuvo el flujo de nitrógeno y el reactor se conectó a un sistema de vacío
(1-2 Torr) y se dejó que el depósito se secara hasta que se eliminó todo el cloroformo. Después de la evaporación del disolvente, se añadió al reactor una solución de yomeprol con una concentración de yodo de 260 g/l a una temperatura de 60ºC. Se dejó que el depósito de lípidos tridimensional expandido se hidratara durante 30 minutos. La suspensión de liposomas se extruyó a una temperatura de 60ºC a través de una membrana de policarbonato de 2 \mum (Nuclepore) y después de enfriarse a temperatura ambiente, se concentró a 30 g de lípidos/l. La relación de yodo captado a lípido (Y/L) fue superior a 4,0.

Se repitió a continuación el mismo experimento con carbono reticulado, níquel reticulado y carbono vítreo reticulado como relleno de la columna. Las densidades aparentes de la estructura de lípidos tridimensional obtenidas en estos experimentos estaban comprendidas entre 0,05 y 0,005 g/cm^{3}. Se obtuvieron liposomas con una relación de lípido a yodo de 3,5 a 4,5.

Ejemplo 5

Una columna de vidrio (500 mm de altura y 50 mm de diámetro) se rellenó con perlas de vidrio huecas como sistema de relleno inerte y se hizo funcionar como un reactor de lecho fluidizado. Una solución de lípidos que contenía 50 g/l de una mezcla de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), colesterol y ácido dipalmitoilfosfatídico (DPPA) con una relación molar de 5:4:1 en una mezcla azeotrópica de ciclohexano/etanol (69,5/30,5 v/v) se introdujo en la columna que contenía un lecho de 100 mm de altura de esferas de vidrio huecas soportadas por una frita de vidrio poroso. Se dejó que la solución humedeciera totalmente las perlas de vidrio y el exceso se eliminó. Se inyectó una corriente de aire caliente (80ºC) desde la parte inferior a través del reactor y las esferas se fluidizaron hasta que el depósito de lípidos estuvo casi seco. A continuación se detuvo el flujo de aire caliente, el reactor se conectó a un sistema de vacío (1-3 Torr) y se dejó que el depósito se secara hasta eliminación completa de los disolventes. Después de la evaporación del disolvente, se añadió al reactor una solución del 4% en peso de lidocaína-HCl en agua (pH 7,2) a una temperatura de 60ºC. La solución de liposomas formada se extruyó a una temperatura de 80ºC a través de una membrana de policarbonato de 2 \mum (Nuclepore) y después de enfriarse a temperatura ambiente se concentró a 35 mg de lípido/ml. La lidocaína captada en liposomas fue de 0,35 mmol de lidocaína/g de lípido.

Diversas expansiones (20-80%) del lecho durante la fluidización mostraron poca influencia sobre la calidad del depósito.

Ejemplo 6

Se repitió el Ejemplo 4 utilizando una columna de vidrio de 500 mm de altura sin ningún relleno inerte. La columna se llenó con 100 ml de una solución de lípidos (80 g/l) preparada a partir de mezclas azeotrópicas de etanol/ciclohexano, cloroformo/metanol e isopropanol/hexano. El disolvente orgánico se evaporó en primer lugar a una temperatura de 55ºC y una presión de 300 mm Hg y a continuación a 70ºC y 10 mm Hg hasta la formación de un depósito seco espumado. En todos los casos, la estructura de lípidos expandida tridimensional obtenida se hidrató a continuación a una temperatura de 70ºC con una solución acuosa de yomeprol para producir suspensiones de yomeprol encapsuladas en liposomas. Después de una extrusión a 70ºC a través de una membrana de policarbonato de
0,6 \mum (Nuclepore), la suspensión de liposomas se concentró. Las relaciones típicas de yodo a lípido (Y/L) para cierto número de experimentos llevados a cabo en diferentes condiciones experimentales se encontraban en el intervalo de 1,9 a 2,5 con concentraciones de lípidos comprendidas entre 25 y 35 mg/ml. Se calculó que las densidades aparentes de la estructura de lípidos expandida estaban comprendidas entre 0,05 y 0,001 g/cm^{3}.

Claims

1. Un precursor de vesículas de liposoma en forma de un depósito de lípidos seco, que comprende fosfolípidos seleccionados entre ácido fosfatídico, fosfatidil-colina, fosfatidiletanol-amina, fosfatidil-serina, fosfatidil-glicerol, fosfatidil- inositol y mezclas de los mismos, caracterizado porque el depósito de lípidos es una estructura expandida tridimensional porosa con una densidad aparente inferior a 0,1 g/cm^{3}.

2. El precursor de vesículas según la reivindicación 1, en el que los lípidos contienen adicionalmente sustancias seleccionadas entre fosfato de dicetilo, colesterol, ergosterol, fitosterol, sitosterol, lanosterol, \alpha-tocoferol, ácido esteárico, estearil-amina y mezclas de los mismos.

3. El precursor de vesículas según la reivindicación 1, en el que el depósito de lípidos seco está constituido por fosfolípidos tales como los definidos en la reivindicación 1, opcionalmente mezclados con otras sustancias tal como se han definido en la reivindicación 2.

4. El precursor de vesículas según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que la densidad aparente del depósito de lípidos tridimensional expandido es inferior a 0,08 g/cm^{3}.

5. El precursor de vesículas según la reivindicación 4 , en el que la densidad aparente del depósito de lípidos tridimensional expandido está comprendida entre 0,05 y 0,001 g/cm^{3}.

6. El precursor de vesículas según la reivindicación 5, en el que la densidad aparente del depósito de lípidos tridimensional expandido está comprendido entre 0,02 y 0,01 g/cm^{3}.

7. El precursor de vesículas según la reivindicación 1, en el que la estructura tridimensional expandida está soportada por un retículo de material poroso inerte.

8. El precursor de vesículas según la reivindicación 7, en el que el material poroso inerte comprende un sistema de tubos o un sistema de relleno inerte.

9. El precursor de vesículas según la reivindicación 8, en el que los tubos presentan un diámetro interno comprendido entre 0,5 mm y 5 mm y un espesor de pared comprendido entre 0,5 y 2 mm.

10. El precursor de vesículas según la reivindicación 8, en el que el relleno inerte se selecciona entre esferas de vidrio huecas, carbono reticulado, carbono vítreo reticulado, metal reticulado, lana de vidrio o metal y fibra de vidrio o metal.

11. Un procedimiento para la preparación de vesículas de liposoma con una capacidad de captación aumentada que consiste en disolver uno o más lípidos formadores de película en por lo menos un disolvente orgánico, formar un depósito de lípidos mediante evaporación del disolvente a partir de dicha solución orgánica y, antes de poner en contacto el depósito de lípidos con una fase de vehículo de solución acuosa, expandir el depósito de lípidos para formar una estructura tridimensional cuya densidad aparente es inferior a 0,1 g/cm^{3}.

12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que la densidad es inferior a 0,08 g/cm^{3}.

13. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que la densidad aparente está comprendida entre 0,05 y 0,001 g/cm^{3}.

14. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que el recipiente de reacción contiene un retículo de material poroso inerte o relleno que sirve como soporte o matriz para la deposición de lípidos.

15. El procedimiento según la reivindicación 14, en el que el relleno se selecciona entre carbono reticulado, carbono vítreo reticulado, metal reticulado, lana de vidrio o metal o fibra de vidrio o metal.

16. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que el relleno poroso inerte consiste en esferas de vidrio huecas que se fluidifican.

17. El procedimiento según la reivindicación 14, en el que el relleno inerte comprende anillos Raschig compactados en una columna como recipiente de reacción y la solución de lípidos se introduce desde la parte superior en un modo de goteo.

18. El procedimiento según la reivindicación 17, en el que después de la evaporación del disolvente orgánico el depósito de lípidos se pone en contacto con la fase de vehículo acuosa y la cual se introduce en el extremo inferior de la columna.

19. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que la evaporación se lleva a cabo a una temperatura por encima de la temperatura ambiente o a presión reducida.

20. El procedimiento según la reivindicación 11 ó 14, en el que la evaporación se lleva a cabo por medio de inyección de aire o de un gas inerte, con preferencia nitrógeno, a través del recipiente de reacción.

21. El procedimiento según la reivindicación 11 ó 14, en el que el disolvente orgánico se selecciona entre cloroformo, éter de petróleo, metanol, etanol, propanol, iso-propanol, n-butanol, t-butanol, pentanol, hexanol, pentano, hexano, heptano, ciclohexano o mezclas de los mismos.

22. El procedimiento según la reivindicación 21, en el que el disolvente orgánico es una mezcla azeotrópica de dos disolventes.

23. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que el disolvente es una mezcla de etanol y ciclohexano, cloroformo y metanol, o isopropanol y hexano.

24. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que la fase de vehículo acuosa contiene una sustancia biológicamente activa.

25. El procedimiento según la reivindicación 24, en el que la sustancia activa es un agente de contraste.

26. El procedimiento según la reivindicación 25, en el que el agente de contraste es un agente de contraste de rayos X yodado.

27. El procedimiento según la reivindicación 25, en el que la relación de yodo a lípido de las vesículas de liposoma es por lo menos de 2,75.

28. Utilización de las estructuras de lípido tridimensionales según las reivindicaciones 1 a 10, para la preparación de liposomas con una alta capacidad de captación.

29. Utilización de las estructuras de lípido tridimensionales según las reivindicaciones 1 a 10, para la preparación de agentes de contraste para diagnósticos.