ES2293664T3 - Conjugados hapteno-portador para usar en terapia de drogadicion y metodos para la preparacion de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un conjugado hapteno-portador que comprende al menos un hapteno derivado de nicotina y al menos un portador que contiene un epítopo de las células T y en el que dicho hapteno y dicho portador están unidos por la rama CJ11, que se identifica en la solicitud como YCO(CH2)nCOQ, y en la que Y se selecciona entre S, O y NH, y Q es el portador y n es un número entero de 2 a 20.

Description

Conjugados hapteno-portador para usar en terapia de drogadicción y métodos para la preparación de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento de la drogadicción. Más específicamente, la presente invención se refiere a conjugados droga/hapteno-portador que provocan respuestas de anticuerpos y que se pueden utilizar en el tratamiento de la drogadicción.

Antecedentes de la invención

La preponderancia del uso y adicción a las drogas en todo el mundo, especialmente en los Estados Unidos, ha alcanzado niveles epidémicos. Hay una plétora de drogas, tanto legales como ilegales, cuya adicción ha llegado a ser un grave asunto de política pública que afecta a todos los estratos de la sociedad con sus lógicas consecuencias médicas y sociales. Algunos usuarios viven en una población de riesgo extremadamente alto asociada con la pobreza y actividades ilegales. Otros usuarios que podrían clasificarse a sí mismos como usuarios lúdicos están en riesgo debido a (a) las propiedades de las drogas que las hacen adictivas, (b) una predisposición del usuario a convertirse en un gran usuario o (c) una combinación de factores que incluyen circunstancias personales, penalidades, ambiente y accesibilidad. El tratamiento adecuado de la drogadicción, incluyendo la poli-drogadicción, requiere programas de intervención innovadores y creativos.

Tres drogas de adicción especialmente problemáticas son la cocaína, la heroína y la nicotina.

La nicotina (1-metil-2-(3-piridil)pirrolidina) es un alcaloide que se obtiene de las hojas de tabaco. El uso de la nicotina está extendido por todo el mundo y está legalmente disponible en muchas formas tales como cigarrillos, cigarros, tabaco de pipa, y tabaco sin humo (de mascar). Aunque la naturaleza adictiva de la nicotina y los peligros de fumar han sido conocidos desde hace muchos años (Slade et al. (1995) JAMA 274(3): 225-233), fumar cigarrillos continúa siendo popular. Un estimado de 51 millones de americanos fuman, y según el Center for Disease Control and Prevention, cada año mueren 420.000 personas por trastornos relacionados con fumar.

El sistema más popular de administración de nicotina es el cigarrillo. Los cigarrillos contienen 6 a 11 mg de nicotina, de los cuales el fumador absorbe típicamente 1 a 3 mg. El típico fumador de un paquete al día absorbe 20 a 40 mg de nicotina cada día, alcanzando concentraciones plasmáticas de 25 a 50 ng por mililitro. La semivida plasmática de la nicotina es aproximadamente dos horas; la semivida del principal metabolito, cotinina, es 19 horas. (Henningfield (1995) The New England Journal of Medicine 333(18): 1196-1203).

Puesto que la nicotina está legal y ampliamente disponible hay una presión relativamente baja en contra de su uso, a diferencia de la cocaína y la heroína. Aunque un gran porcentaje de fumadores adictos han expresado su deseo de dejar de fumar, y realmente muchos tratan de dejarlo, solamente 2 a 3 por ciento de los fumadores se convierten en no fumadores cada año. (Henningfield (1995) cita anterior). La alta proporción de tendencia a la recidiva en los fumadores que tratan de dejarlo es indicativa del fuerte efecto de dependencia de la nicotina. (O'Brien et al. (1996) Lancet 347: 237-240).

La adicción a la nicotina es un trastorno crónico, recidivante. La nicotina estimula el sistema mesolímbico de recompensa dando eventualmente como resultado la dependencia fisiológica. Las pruebas indican que la nicotina se une a la subunidad \alpha de los receptores nicotínicos de acetilcolina en los sistemas nerviosos central y periférico dando como resultado un aumento de la liberación de dopamina. Se cree que el incremento de las cifras de los receptores nicotínicos de acetilcolina en el cerebro aumenta la dependencia fisiológica de la nicotina (Balfour (1994) Addiction 89: 1419-1423). Estos efectos fisiológicos de la nicotina son potentes reforzadores de la adicción psicológica. El aumento de la cognición y la mejora del estado de ánimo de los usuarios de la nicotina, así como los efectos negativos asociados con la
abstinencia (esto es, síntomas de abstinencia), sirven como poderosos motivadores para el uso continuado del tabaco.

La falta de terapias eficaces para la dependencia de la nicotina y la baja proporción de éxito en los que tratan de dejar su uso indican que existe una gran necesidad de una nueva terapia. Actualmente, las dos terapias más populares son polacrilex de nicotina ("goma de nicotina") y sistemas de liberación transdérmicos ("parche de nicotina"). Estas "medicaciones de sustitución" actúan para liberar bajas cantidades de nicotina al usuario durante un periodo de tiempo para separar lentamente de la droga al usuario de la nicotina. Se cree que estos métodos reducen los síntomas de abstinencia y proporcionan algunos efectos que el usuario encontraba previamente en los cigarrillos (tales como estados de ánimo y atención deseables). (Henningfield (1995) cita anterior). Estos métodos, sin embargo, adolecen de los inconvenientes de baja penetración y tendencia a la recidiva de la persona no motivada que trata de dejar el vicio. Además, se han descrito efectos negativos por los usuarios de la goma de nicotina tales como irritación de la boca, músculos de la mandíbula doloridos, dispepsia, náuseas, hipo y parestesia. Los efectos adversos descritos del parche de nicotina incluyen reacciones de la piel (picores o eritema), trastornos del sueño, problemas gastrointestinales, somnolencia, nerviosismo, mareos y sudores (Haxby (1995) Am. J. Health-Syst. Pharm. 52: 265-281).

En las publicaciones científicas se han propuesto métodos de diagnóstico y terapias experimentales para tratar la adicción a la droga que todavía no se han practicado. Por ejemplo, la vacunación como un método terapéutico para la drogadicción ha sido descrita previamente en principio. Bonese et al. investigaron los cambios en la auto-administración de heroína por un mono rhesus después de inmunización frente a la morfina (Bonese et al. (1974) Nature 252: 708-710). Bagasra et al. investigaron usando la vacunación de cocaína-KLH como un medio para prevenir la adicción (Immunopharmacol. (1992) 23: 173-179), aunque no se ha llegado a resultados concluyentes y los métodos usados por Bagasra están en discusión. (Gallacher (1994) Immunopharrm. 27: 79-81). Obviamente, si un conjugado tiene que ser eficaz en un régimen terapéutico, debe ser capaz de provocar los anticuerpos que puedan reconocer la cocaína, heroína o nicotina libres circulantes in vivo. Cerny (WO 92/03163) describe una vacuna e inmunosuero contra las drogas. La vacuna comprende un hapteno unido a una proteína portadora para producir anticuerpos. También se describe la producción de anticuerpos contra las drogas, y el uso de estos anticuerpos en la desintoxicación de alguien que ha tomado la droga. Carrera et al., Nature 378: 727-730 (1995) describe la síntesis de una vacuna de cocaína-KLH para inducir anticuerpos anti-cocaína que bloquean los efectos locomotores de la droga en ratas. Blincko, U.S. Pat. No. 5.256.409, describe una vacuna que comprende una proteína portadora unida a un hapteno procedente de la clase de fármacos desipramina/imipramina y otro hapteno procedente de la clase de fármacos nortriptilina/amitriptilina. Liu et al., U.S. Pat. No. 5.283.066, describe el uso de un complejo hapteno-soporte polimérico sólido para inducir una respuesta inmunitaria.

La administración pasiva de anticuerpos monoclonales para tratar la drogadicción ha sido descrita previamente (véase, Killian et al. (1978) Pharmacol. Biochem. Behavior 9: 347-352; Pentel et al. (1991) Drug Met. Dispositions 19: 24-28). En este método, se administran pasivamente a animales anticuerpos pre-formados frente a drogas seleccionadas. Aunque estos datos proporcionan una demostración de la posibilidad de métodos inmunológicos para la terapia de la adicción, la inmunización pasiva como una estrategia terapéutica humana a largo plazo adolece de una serie de inconvenientes importantes. En primer lugar, si los anticuerpos a ser usados para la terapia pasiva proceden de fuentes no humanas o son anticuerpos monoclonales, estas preparaciones serán vistas como proteínas extrañas por el paciente, y puede haber una rápida respuesta inmunitaria a los anticuerpos extraños. Esta respuesta inmunitaria puede neutralizar el anticuerpo administrado pasivamente, bloqueando su eficacia y reduciendo drásticamente el tiempo de protección posterior. Además, la readministración del mismo anticuerpo puede llegar a ser problemática, debido a la inducción potencial de una respuesta de hipersensibilidad. Estos problemas se pueden resolver por la producción de inmunoglobulina inmunitaria en donantes humanos inmunizados con la vacuna. Esta método se discute con más detalle en los Ejemplos. En segundo lugar, los anticuerpos administrados pasivamente son aclarados de la circulación con relativa rapidez. La semivida de un anticuerpo dado in vivo está entre 2,5 y 23 días, dependiendo del isotipo. Por tanto, cuando los anticuerpos se administran pasivamente, en lugar de ser inducidos por inmunización, sólo se puede alcanzar una eficacia a corto plazo.

Otro método inmunológico para la adicción a las drogas ha sido utilizar un anticuerpo catalítico que es capaz de ayudar a la hidrólisis de la molécula de cocaína en el paciente (Landry et al. (1993) Science 259: 1899-1901). El anticuerpo catalítico es generado por inmunización de un animal experimental con un análogo del estado de transición de cocaína unido a una proteína portadora; se selecciona entonces un anticuerpo monoclonal que tiene la deseada actividad catalítica. Aunque este método es teóricamente atractivo, también adolece de algunos graves problemas. Los anticuerpos catalíticos deben ser administrados pasivamente y por tanto tienen todos los inconvenientes de la terapia de anticuerpos pasivos. La inmunización activa para generar un anticuerpo catalítico no es factible, porque la actividad enzimática es rara entre los anticuerpos producidos frente a análogos del estado de transición, y no parece que haya actividad detectable en las preparaciones policlonales. Además, la actividad general tipo esterasa de tales anticuerpos catalíticos y la naturaleza incontrolada de la respuesta inmunitaria activa en individuos genéticamente diferentes los convierte en moléculas potencialmente tóxicas, particularmente cuando se producen dentro de un paciente humano.

Yugawa et al. (EP 0 613 899 A2) sugieren el uso de un conjugado cocaína-proteína que contiene un derivado de cocaína para producir anticuerpos para la detección de cocaína o derivados de cocaína en una muestra de sangre. Las patentes Syva (U.S. Pat. No. 3.888..866, No. 4.123.431 y No. 4.197.237) describen conjugados para producir anticuerpos de cocaína para inmunoensayos. Se describen conjugados con BSA usando sales de diazonio derivadas de benzoil-ecgonina y cocaína. Los conjugados se preparan usando derivados para-imino-éster de cocaína y norcocaína para conjugar con un portador. Biosite (WO 93/12111) describe conjugados de cocaína que usan la posición para del anillo fenílico de diferentes derivados de cocaína que aumentan la estabilidad a la hidrólisis introduciendo un enlace amida. Las patentes Strahilevitz (U.S. Pat. No. 4.620.977; U.S. Pat. No. 4.813.924; U.S. Pat. No. 4.834.973; y U.S. Pat. No. 5.037.645) describen el uso de conjugados proteicos de sustancias endógenas y drogas para el tratamiento de enfermedades, para prevenir la dependencia de haptenos psicoactivos, así como para uso en inmunoensayos, inmunodiálisis e inmunoadsorpción.

Bjerke et al. (1987) Journal of Immunological Methods 96: 239-246 describe el uso de un conjugado cotinina-ácido 4'-carboxílico unido covalentemente a poli-L-lisina para generar anticuerpos frente al metabolito de la nicotina, cotinina, para uso en la determinación de la presencia de cotinina en fluidos fisiológicos. Adicionalmente, Abad et al. (1993) Anal. Chem. 65(22): 3227-3231 describen el uso de hemisuccinato de 3'-(hidroximetil)-nicotina conjugado con BSA para generar anticuerpos contra la nicotina para uso en un ensayo ELISA usado para medir la nicotina en condensados del humo de los cigarrillos. Ninguna referencia, sin embargo, enseña o sugiere el uso de un conjugado nicotina-portador para utilizar como una vacuna frente a la adicción a la nicotina.

No se ha desarrollado ninguna terapia eficaz para la drogadicción, especialmente, la adicción a la nicotina. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar un método de tratamiento a largo plazo para la adicción a la nicotina, que no dependa totalmente del individuo adicto en cuanto al cumplimiento y auto-administración.

Sumario de la invención

La presente invención resuelve los inconvenientes mencionados anteriormente y proporciona conjugados para tratar la drogadicción. Usando composiciones terapéuticas, en particular conjugados hapteno-portador, la presente invención provoca una respuesta inmunitaria en la forma de anticuerpos anti-droga dentro del adicto, que después de la exposición posterior a la droga en un individuo vacunado, neutralizan la droga de modo que los efectos farmacológicos esperados disminuyen, si no se eliminan.

La presente invención proporciona un conjugado hapteno-portador que comprende al menos un hapteno derivado de la nicotina, y al menos un portador que contiene un epítopo de las células T, y en el que dicho hapteno y dicho portador están unidos mediante la rama CJ11, que se identifica en la solicitud como YCO(CH_{2})nCOQ, y en la que Y se selecciona del grupo que consiste en S, O y NH, y Q es el portador y n es un número entero de 2 a 20.

La presente invención proporciona además el uso de un conjugado hapteno-portador que comprende al menos un hapteno derivado de la nicotina, y al menos un portador que contiene un epítopo de las células T, y en el que dicho hapteno y dicho portador están unidos mediante la rama CJ11, que se identifica en la solicitud como YCO(CH_{2})nCOQ, en la preparación de una composición terapéutica para el tratamiento de la drogadicción en los seres humanos.

La presente invención proporciona adicionalmente un procedimiento para preparar un conjugado de la invención, que comprende unir el hapteno y el portador que contiene un epítopo de las células T mediante reticulación con un compuesto seleccionado entre: un éster activo derivado de un ácido carboxílico, un anhídrido mixto, una azida de acilo, un haluro de acilo, un imino-éster.

Cuando la composición terapéutica que comprende el conjugado droga/hapteno-portador se administra a un individuo adicto, se producen anticuerpos anti-droga específicos para la droga. Un régimen de inmunización terapéutica provoca y mantiene títulos suficientemente altos de anticuerpos anti-droga, de tal modo que después de cada exposición posterior a la droga durante el periodo de protección proporcionado por los anticuerpos anti-droga terapéuticos, neutralizan una suficiente cantidad de la droga con el fin de disminuir, si no eliminar, el efecto farmacológico de la droga.

Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención serán más claros y se comprenderán mejor con respecto a los siguientes dibujos, descripción y reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1a es una representación de una serie de "ramas" posibles, etiquetadas arbitrariamente, de un conjugado hapteno-portador identificado para facilitar la comprensión de los compuestos y conjugados adecuados.

La Figura 1b es una representación de una serie de "ramas" posibles, etiquetadas arbitrariamente, de un conjugado hapteno-portador identificado para facilitar la comprensión de los compuestos y conjugados adecuados, en las que Q' es un portador modificado que contiene un epítopo de las células T, tal como un portador proteico modificado.

La Figura 2 es una representación de las estructuras de cinco reactivos.

La Figura 3 es una representación de las estructuras de cuatro drogas de adicción alternativas, adecuadas para conjugación y administración.

La Figura 4a es una representación de un gel que muestra los pesos moleculares relativos de la toxina B colérica (CTB), nativa (monómero y pentámero) y recombinante (monómero).

La Figura 4b es una representación de un gel que ilustra la estabilidad de los pentámeros CTB a lo largo de un intervalo de pH de 3-9.

La Figura 4c es un dibujo de un gel de transferencia Western que muestra 35 fracciones pico rCTB#32 y rCTB#53 que se obtuvieron por expresión periplásmica que produce CTB pentamérica.

La Figura 5a es un gráfico que representa un ensayo ELISA en el que el anticuerpo anti-CTB detecta la capacidad de rCTB para unirse al gangliósido GM1 en la placa ELISA.

La Figura 5b es un barrido que representa un ensayo de unión de citometría de flujo en el que la rCTB está unida a células eucarióticas que expresan el gangliósido GM1.

La Figura 6a es una representación esquemática de la fórmula estructural de la nicotina.

La Figura 6b es un diagrama que representa los sitios de variabilidad cuando se prepara un conjugado de nicotina de la presente invención. Los sitios de variabilidad están asignados arbitrariamente para designar el compuesto y los conjugados de la presente invención y no son necesariamente sitios de reacción. Estos sitios de variabilidad son como se denominan en la Figura 7.

La Figura 7 es una representación de "ramas" en los sitios de variabilidad de la molécula de nicotina para los conjugados y los intermedios de nicotina de la presente invención. Los conjugados de nicotina de la presente invención están representados cuando Q es un portador que contiene un epítopo de las células T.

La Figura 8 es una representación de metabolitos de nicotina útiles en la preparación de alguno de los conjugados de la presente invención.

Las figuras 9a-b muestran los resultados de analizar sueros de ratón en un ELISA en cuanto a la unión de anticuerpo a un conjugado de PS-55 y la proteína lisozima de huevo de gallina (HEL). En la Figura 9a, los ratones han sido inmunizados con un conjugado nicotina-BSA. En la Figura 9b, los ratones han sido inmunizados con un conjugado nicotina-CTB.

La Figura 10 muestra los resultados de analizar antisueros anti-nicotina en un ensayo ELISA de competición en cuanto a la especificidad de los antisueros para la nicotina libre cuando varían las concentraciones de nicotina libre y de los metabolitos de la nicotina, cotinina y nornicotina. Se prepararon los anti-sueros en ratones por inyección del conjugado de nicotina PS-55-BSA. Hubo poco o ningún reconocimiento de los metabolitos de nicotina, lo que demuestra que los anticuerpos anti-nicotina dentro de los antisueros eran específicos para la nicotina. Se utilizó el anestésico lidocaína como un control negativo y no fue capaz de competir por la unión del anticuerpo. El conjugado de nicotina PS-55-HEL se usó como un control positivo y su unión al anticuerpo fue inhibida por la nicotina libre.

Descripción detallada de la invención

Las patentes y las publicaciones científicas mencionadas en esta memoria establecen el conocimiento que está disponible para los expertos en la técnica.

La presente invención proporciona una terapéutica para la drogadicción, basada en la vacunación de un individuo adicto con un conjugado nicotina-proteína. Las composiciones terapéuticas de la invención comprenden al menos un hapteno y al menos un portador que contiene un epítopo de las células T que cuando se conjugan para formar un conjugado hapteno-portador son capaces de estimular la producción de anticuerpos anti-hapteno. Como se usa en esta memoria, el término "epítopo de las células T" se refiere al elemento básico o unidad más pequeña de reconocimiento por un receptor de células T, donde el epítopo comprende aminoácidos esenciales para el reconocimiento del receptor. Las secuencias de aminoácidos que imitan a los epítopos de las células T y que modifican la respuesta alérgica a los alergenos proteicos estén dentro del alcance de esta invención. Un "péptido mimético" se puede definir como estructuras químicas derivadas de péptidos bioactivos que imitan a las moléculas naturales. El hapteno puede ser una droga tal como heroína, nicotina o un derivado de la droga.

Cuando la composición terapéutica que contiene el hapteno/droga (o su derivado) se administra al individuo adicto, se producen anticuerpos anti-droga específicos para la droga. Un régimen de inmunización terapéutica provoca y mantiene títulos suficientemente altos de anticuerpos anti-droga, de tal modo que tras la exposición posterior a la droga, los anticuerpos neutralizantes se unen a una cantidad suficiente de la droga con el fin de disminuir, si no eliminar, los efectos farmacológicos de la droga. No se esperan efectos secundarios por la administración de la composición terapéutica de la presente invención. Por ejemplo, las presentes drogas-de-adicción son pequeñas y monovalentes y por tanto no son capaces de reticularse con el anticuerpo. Por tanto, no se espera que aparezcan la formación de complejos inmunitarios ni las patologías asociadas después de la exposición a la droga de adicción. Es ahora, y se espera que sea en el futuro, compatible con las actuales y futuras terapias farmacológicas. Además, la neutralización eficaz es de larga duración. Por ejemplo, las respuestas de los anticuerpos neutralizantes contra los patógenos se sabe que permanecen durante años. Por consiguiente, se espera que los altos títulos de anticuerpos anti-droga producidos usando la composición terapéutica de la presente invención se puedan mantener durante largos periodos de tiempo y posiblemente, al menos durante un año. Este efecto a largo plazo de la composición terapéutica con reducción de los problemas de cumplimiento reduce la tendencia a la recidiva que es un problema con las terapias actuales.

El método de vacunación terapéutica de la presente invención para la adicción a la nicotina es compatible con otras terapias para minimizar los síntomas de abstinencia de la nicotina. Por ejemplo, el conjugado nicotina-portador de la presente invención se puede utilizar conjuntamente con clonidina, buspirona, y/o antidepresivos o sedantes. La vacuna producida por este método será compatible con las terapias actuales de sustitución de la nicotina, esto es, gomas y parches. Puesto que los anticuerpos anti-nicotina necesitan varias semanas para ser generados, se debe proporcionar algún nivel de control de las ansias mediante el uso de las terapias actuales de sustitución de la nicotina.

Los siguientes son términos usados en esta memoria, cuyas definiciones se proporcionan como guía. Como se usa en esta memoria un "hapteno" es un compuesto orgánico de bajo peso molecular que reacciona específicamente con un anticuerpo y que es incapaz de provocar una respuesta inmunitaria por sí mismo pero que es inmunogénico cuando forma un complejo con un portador que contiene un epítopo de las células T formando un conjugado hapteno-portador. Además, el hapteno se caracteriza como la porción determinante de la especificidad del conjugado hapteno-portador, esto es, es capaz de reaccionar con un anticuerpo específico para el hapteno en su estado libre. En un sujeto adicto no inmunizado, hay ausencia de formación de anticuerpos para el hapteno. La composición terapéutica se usa para vacunar a individuos que buscan tratamiento para la adicción a las drogas. En la presente invención, el término hapteno incluirá el concepto de una droga/hapteno más específico, que es una droga, un análogo de una porción de la droga, o un derivado de la droga. La composición terapéutica, o vacuna terapéutica anti-droga, cuando se administra inicialmente producirá una subida hasta un "resultado mensurable deseado". Inicialmente, el resultado mensurable deseado es la producción de un alto título de anticuerpos anti-droga. El título se define como la dilución de suero requerida para la semidetección máxima de anticuerpo por el ensayo ELISA. Sin embargo, la manipulación del régimen de dosis adecuado para el individuo produce y mantiene un efecto terapéutico sostenido. El "efecto terapéutico deseado" es la neutralización de una fracción suficiente de la droga de adicción libre para reducir o eliminar los efectos farmacológicos de la droga dentro de un marco de tiempo terapéuticamente aceptable mediante anticuerpos anti-droga específicos para la droga después de una exposición posterior a la droga. La determinación de los marcos de tiempo terapéuticamente aceptables hasta que se consigue una respuesta suficiente de anticuerpos para una droga dada y durante los cuales se mantenga la respuesta de anticuerpos, se consigue por los expertos en la técnica evaluando las características del sujeto a ser inmunizado, la droga de adicción a ser neutralizada, así como el modo de administración. Usando éste y otros protocolos de vacunación como modelo, un experto en la técnica puede esperar que la inmunidad o el periodo de protección dure varios meses, hasta más de un año.

También se describe la "inmunización pasiva" que engloba la administración o la exposición a un anticuerpo anti-droga intacto o a un anticuerpo policlonal o a un fragmento de anticuerpo monoclonal (tal como Fab, Fv, (Fab')2 o Fab') preparado usando los nuevos conjugados de la presente invención. Como se ha indicado anteriormente, la inmunización pasiva de los seres humanos con un anticuerpo anti-nicotina de la presente invención como único tratamiento puede ser menos útil que la inmunización activa. La inmunización pasiva será particularmente útil como un co-tratamiento inicial y/o un tratamiento complementario suplementario (por ejemplo, durante el periodo de tiempo después de la administración inicial de la vacuna pero antes de la propia producción de anticuerpos en el cuerpo) o en situaciones agudas para evitar la muerte (por ejemplo, cuando una persona se presenta con una sobredosis de droga). En algunas situaciones, puede ser preferible la terapia pasiva sola, tal como cuando el paciente es inmunodeficiente o necesita un tratamiento rápido.

Los conjugados de droga de la presente invención, así como las composiciones de la presente invención, también se pueden usar como profilácticos. Esto es, los conjugados de droga o las composiciones se pueden administrar a un mamífero antes de cualquier exposición a la droga para generar anticuerpos anti-droga. Los anticuerpos anti-droga generados deben estar presentes en el mamífero para unirse a cualquier droga introducida posteriormente a la administración del conjugado o composición, y por tanto minimizar o prevenir la posibilidad de llegar a ser adicto a la droga.

La composición terapéutica de la presente invención, y más específicamente, la vacuna terapéutica anti-droga, es una composición que contiene al menos un conjugado droga/hapteno-portador capaz de provocar la producción de un título suficientemente alto de anticuerpos específicos para la droga/hapteno de tal modo que después del posterior enfrentamiento con la droga/hapteno dichos anticuerpos son capaces de reducir las propiedades adictivas de la droga. La respuesta inmunitaria esperada frente a un conjugado hapteno-portador es la formación de anticuerpos tanto anti-hapteno como anti-portador. El nivel terapéutico se alcanza cuando se produce una cantidad suficiente de los anticuerpos específicos anti-droga y se mantiene para montar un ataque neutralizante sobre la droga introducida después de la vacunación. Los regímenes terapéuticos de la presente invención cuentan con tiempo suficiente para la producción de anticuerpos después de la vacunación inicial y de cualquier dosis de refuerzo. Además, la vacuna anti-droga óptima contiene al menos un conjugado droga/hapteno-portador que comprende una combinación óptima de la droga como hapteno y un portador de tal modo que la producción de anticuerpos anti-droga es capaz de alcanzar un nivel terapéutico óptimo, esto es, que permanece in vivo con un título suficientemente alto para resistir un posterior enfrentamiento durante varios meses con la droga seleccionada. Más particularmente, los títulos de anticuerpo permanecen suficientemente altos para proporcionar una respuesta eficaz después de la exposición posterior a la droga durante aproximadamente dos meses a aproximadamente un año o más, dependiendo del individuo, más usualmente tres meses como mínimo. Esta composición óptima consiste en un conjugado hapteno-portador, excipientes y, opcionalmente adyuvantes.

Cuando se usa en el tratamiento de la nicotina, la presente invención define un conjugado hapteno-portador, en el que el hapteno es nicotina o un derivado de nicotina, que se puede usar para inmunizar a mamíferos, particularmente seres humanos, para provocar anticuerpos anti-nicotina capaces de unirse a la droga libre y de evitar el tránsito de la droga al sistema de recompensa en el cerebro con lo que se anula el comportamiento adictivo de tomar droga (por ejemplo, fumar cigarrillos). Se cree que la nicotina se une a la subunidad \alpha de los receptores nicotínicos de acetilcolina en el cerebro lo que da como resultado un aumento de la liberación de dopamina. Se cree que el incremento del número de los receptores nicotínicos de acetilcolina en el cerebro aumenta la dependencia fisiológica de la nicotina. Como se ha expuesto antes en relación con la heroína, los anticuerpos anti-nicotina deben limitar presumiblemente la distribución de nicotina a través de la barrera sanguínea del cerebro hasta el cerebro, reduciendo de este modo sus efectos farmacológicos.

Por ejemplo, hay cierto nivel de estandarización con la administración de nicotina; esto es, cada cigarrillo contiene una media de 9 mg de nicotina de los cuales 1-3 mg son efectivamente dispensados durante el acto de fumar. Adicionalmente, el pico de concentración plasmática de nicotina es de 25-50 ng/ml que es significativamente más bajo que el de la cocaína (0,3-1 \mug/ml). Esto debería proporcionar una oportunidad ideal para la intervención con anticuerpos de afinidad moderadamente alta.

La vacunación inicial con la composición terapéutica del conjugado hapteno-portador de la presente invención crea altos títulos de anticuerpos específicos del hapteno in vivo. Los análisis periódicos del plasma de los sujetos vacunados son útiles para determinar las dosis individuales eficaces. Los niveles del título se incrementan y se mantienen mediante dosis de refuerzo periódicas. Se anticipa que esta terapéutica será usada en combinación con programas actuales de rehabilitación de la droga, incluyendo la asistencia psicológica. Además, las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden estar dirigidas a una única droga o a varias drogas simultáneamente o en sucesión y se pueden usar en combinación con otras terapias. Por ejemplo, las composiciones terapéuticas de conjugado hapteno-portador y los métodos de la presente invención se usan sin interacciones adversas en combinación con métodos farmacológicos convencionales y la inmunización pasiva "a corto plazo" previamente discutida para mejorar el efecto global de la terapia.

La composición terapéutica del conjugado hapteno-portador de la presente invención se prepara acoplando una o más moléculas de hapteno a un portador que contiene un epítopo de las células T para obtener un conjugado hapteno-portador capaz de estimular las células T (inmunogénico) que lleva a la proliferación de las células T y a la liberación característica de mediadores que activan las células B relevantes y estimulan la producción de anticuerpos específicos. Los anticuerpos de interés son los específicos para la porción hapteno del conjugado hapteno-portador (también llamado el complejo hapteno-portador). Se describen las composiciones terapéuticas que contienen una combinación de conjugados, ya sea para la misma droga (inmunización cruzada) o para múltiples drogas (co-inmunización). Tales co-mezclas de conjugados de múltiple drogas son particularmente útiles en el tratamiento de la poli-drogadicción.

En la selección de una droga adecuada para la conjugación, un experto en la técnica debe seleccionar una droga con propiedades que probablemente provocan altos títulos de anticuerpo. Sin embargo, si la molécula elegida es similar a las moléculas que son endógenas para el individuo, los anticuerpos producidos frente a dicha molécula podrían reaccionar de modo cruzado con muchas moléculas diferentes del cuerpo produciendo un efecto indeseado. Por tanto, la droga a ser seleccionada como hapteno (droga/hapteno) debe ser suficientemente extraña y de un tamaño suficiente para evitar de este modo la producción de anticuerpos contra moléculas que se encuentran comúnmente dentro del cuerpo humano. Por estas razones, el alcohol, por ejemplo, no sería adecuado para la terapéutica de la presente invención. Los anticuerpos producidos frente a la composición terapéutica son altamente específicos y en una cantidad suficiente para neutralizar la droga en el torrente sanguíneo o en las mucosas o en ambos.

La Figura 3 muestra la estructura de cuatro drogas adecuadas para conjugación.

El portador de la presente invención es una molécula que contiene al menos un epítopo de las células T que es capaz de estimular las células T del sujeto, que a su vez ayudan a las células B a iniciar y mantener la producción sostenida de anticuerpos frente a porciones del conjugado completo, incluyendo la porción hapteno. De este modo, puesto que un portador se selecciona porque es inmunogénico, se espera una fuerte respuesta inmunitaria a la vacuna en una población diversa de pacientes. El portador, como el hapteno, debe ser suficientemente extraño para provocar una fuerte respuesta inmunitaria a la vacuna. Un método conservador, pero no esencial, es usar un portador al que la mayoría de los pacientes no han sido expuestos para evitar el fenómeno de inhibición del epítopo inducida por el portador. Sin embargo, incluso si tiene lugar la inhibición del epítopo inducida por el portador, ésta es ya manejable porque ha sido superada por cambios de dosis (DiJohn et al. (1989) Lancet 1415-1418) y otros cambios de protocolo (Etlinger et al. (1990) Science 249: 423-425), incluyendo el uso de CTB (Stok et al. (1994) Vaccine 12: 521-526). Las vacunas que utilizan proteínas portadoras a las que los pacientes son ya inmunes están disponibles comercialmente. Adicionalmente, los portadores que contienen un gran número de lisinas son particularmente adecuados para la conjugación según los métodos de la presente invención. Las moléculas adecuadas de portador son numerosas e incluyen, pero sin limitarse a ellas:

Toxinas o productos bacterianos, por ejemplo, toxina B colérica (CTB), toxina diftérica, toxoide tetánico, y toxina pertussis y hemaglutinina filamentosa, toxina shiga, exotoxina pseudomonas;

Lectinas, por ejemplo, subunidad B de ricina, abrina y lectina de guisante dulce;

Subvirales, por ejemplo, nucleoproteína de retrovirus (NP retro), ribonucleoproteína de la rabia (RNP rabia), virus de plantas (por ejemplo virus del mosaico del tomate-TMV, virus del mosaico de fréjol de vaca y de la coliflor), proteína nucleocápsida del virus de estomatitis vesicular (VSV-N), vectores de poxvirus y vectores de virus de la selva Semliki; Vehículos artificiales, por ejemplo, péptidos multiantigénicos (MAP), microesferas;

Partículas semejantes a virus (VLPs) de levaduras;

Antígeno proteico de la malaria;

y otros tales como proteínas y péptidos así como todas las modificaciones, derivados o análogos de los anteriores.

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Para determinar las características de los portadores adecuados, se realizaron experimentos iniciales utilizando albúmina de suero bovino como un portador proteico. La proteína ha sido ideal para experimentos animales, ya que es barata y contiene gran número de lisinas para conjugación. Sin embargo, es menos apropiada para la vacunación humana porque la generación de anticuerpos anti-BSA tiene el potencial de causar respuestas adversas. Por tanto, usando los resultados de estos experimentos, se aplicaron los criterios descritos antes a un gran número de portadores candidatos. El resultado es la lista de portadores descritos antes adecuados para la práctica de la presente invención.

El portador de una realización preferida es una proteína o un péptido ramificado (por ejemplo, los péptidos multi-antigénicos (MAP)) o un péptido de cadena sencilla. Un portador ideal es una proteína o un péptido que no se usa comúnmente para la vacunación en el país en que se aplica la terapia, con lo que se evita el potencial de "inhibición del epítopo inducida por el portador". Por ejemplo, en los Estados Unidos, donde la inmunización estándar de la población infantil incluye difteria y tétanos, proteínas tales como toxoide tetánico y toxoide diftérico, si no se modifican, pueden ser menos deseables como portadores apropiados. Además, la proteína portadora no debe ser una proteína para la que se es tolerante. En los seres humanos, esto debe excluir la seroalbúmina humana no modificada. Además, muchas proteínas alimenticias deben ser seleccionadas cuidadosamente antes de su uso como un portador. Una vez más, en los seres humanos, la seroalbúmina bovina debe ser menos deseable como portador debido a la dieta de carne de vacuno de la mayoría de los seres humanos. Todavía más, es muy ventajoso si el portador tiene de forma inherente inmunogenicidad y capacidad como adyuvante. Se debe establecer un equilibrio delicado entre el deseo de la inmunogenicidad del portador y el deseo de maximizar el anticuerpo anti-hapteno. Todavía más, el portador preferido debe ser capaz tanto de una respuesta sistémica como de una respuesta en el sitio de exposición. Esto es particularmente cierto para la nicotina que es administrada más frecuentemente a través de las membranas mucosales. Por consiguiente, en el caso de la nicotina, un portador preferido provoca no solamente una respuesta sistémica sino también una respuesta mucosal pre-existente de anticuerpos. En tal respuesta mucosal la reacción de los anticuerpos con cocaína, heroína y/o nicotina debe tener lugar de forma suficientemente rápida para neutralizar la droga antes de que empiece a circular en el torrente sanguíneo.

Uno de dichos portadores preferidos es la toxina B del cólera (CTB), una subunidad de proteína altamente inmunogénica capaz de estimular fuertes respuestas sistémicas y mucosales de anticuerpos (Lycke (1992) J. Immunol. 150: 4810-4821; Holmgren et al. (1994) Am. J. Trop. Med. Hyg. 50: 42-54; Silbart et al. (1988) J. Immun. Meth. 109: 103-112; Katz et al. (1993) Infection Immun. 61: 1964-1971). Esta respuesta combinada anti-hapteno IgA e IgG es altamente deseable para bloquear la heroína o cocaína que se administra nasalmente o por inhalación, y para bloquear la nicotina que es absorbida en la boca y en los pulmones. En adición, ya se ha demostrado que la CTB es segura para uso humano en los ensayos clínicos para las vacunas del cólera (Holmgren et al., cita anterior; Jertborn et al. (1994) Vaccine 12: 1078-1082; "The Jordan Report, Accelerated Development of Vaccines" 1993, NIAID, 1993).

Otros portadores útiles incluyen los que tienen la capacidad de mejorar una respuesta mucosal, más particularmente, la familia LTB de toxinas bacterianas, nucleoproteína de retrovirus (NP de retro), ribonucleoproteína de la rabia (RNP de rabia), proteína nucleocápsida del virus de estomatitis vesicular (VSV-N), y subunidades de poxvirus recombinantes.

En otra realización más, se usan como portadores diferentes derivados de proteínas, fragmentos de péptidos o análogos de alergenos. Estos portadores se eligen porque provocan una respuesta de las células T capaz de proporcionar ayuda para la iniciación por las células B de los anticuerpos anti-hapteno. Los ejemplos y métodos de preparar proteínas y péptidos de alergenos y sus secuencias están descritos en el documento WO 95/27786 publicado el 19 de octubre de 1995. Un alergeno particularmente adecuado como portador es Cryptomeria japonica, más particularmente, Cry j 1 recombinante, cuya secuencia ha sido publicada con ligera variación. En otros países aparte de Japón, la Cryptomeria japonica no es prevalente. Por tanto, el alergeno Cry j 1 generalmente cumple uno de los criterios de un portador adecuado, que es un portador al que un sujeto no ha estado previamente expuesto.

Aplicando los usos y composiciones de la presente invención, y más particularmente, los métodos indicados en los Ejemplos que siguen, un experto en la técnica une la droga seleccionada/hapteno con el portador seleccionado para preparar el conjugado hapteno-portador de la presente invención.

En una realización de la presente invención, los anticuerpos inducidos por la composición terapéutica actúan dentro del tiempo que tarda la droga para ir desde los pulmones a través del corazón al cerebro. La capacidad de provocar esta respuesta de anticuerpo requiere la selección cuidados de la molécula del portador.

Producción de la subunidad B recombinante de la toxina del cólera

La toxina del cólera es la enterotoxina producida por Vibrio cholerae y consiste en 5 subunidades B idénticas teniendo cada subunidad un peso molecular de 11,6 KDa (103 aminoácidos) y una subunidad A de 27,2 KDa (230 aminoácidos) (Finkelstein (1988) Immunochem. Mol. Gen. Anal. Bac. Path. 85-102). La subunidad de unión, CTB, se une al gangliósido GM1 en la superficie celular (Sixma et al. (1991) Nature 351: 371-375; Orlandi et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 17038-17044). CTA es la subunidad enzimática que entra en la célula y cataliza la ADP-ribosilación de una proteína G, activando constitutivamente la adenilato-ciclasa (Finkelstein (1988) Immunochem. Mol. Gen. Anal. Bac. Path. pp. 85-102). En ausencia de la subunidad A, la toxina del cólera no es tóxica.

Otros autores han descrito la producción de alto nivel de expresión recombinante de los pentámeros CTB (L'hoir et al. (1990) Gene 89: 47-52; Slos et al. (1994) Protein Exp. Purif. 5: 518-526). Aunque la CTB nativa está comercialmente disponible, es difícil evitar la contaminación con CTA. Por tanto, la CTB recombinante ha sido expresada en E. coli y se han desarrollado ensayos para su caracterización. La construcción coleragenoide se compró de la American Type Culture Collection (de conformidad con la patente de Estados Unidos No. 4.666.837). La CTB recombinante se clonó a partir del vector original (pRIT10810) en un plásmido de expresión (pET11d, Novagen) con una secuencia extra en N-terminal que contiene un His6 tag y se expresó en E. coli al nivel de 25 mg/litro de cultivo. Se purificó la proteína sobre una columna Ni^{2+} usando técnicas estándar y se analizó sobre SDS-PAGE (véanse las figuras 4a, b y c). La CTB recombinante es monomérica en este ensayo y es más grande que el monómero CTB nativo debido a la extensión en N-terminal.

La CTB pentamérica recombinante fue producida tanto con la secuencia His tag como sin ella usando el cDNA modificado por la PCR para incluir la secuencia líder Pel b. Se insertó un codón de terminación en el C-terminal para separar el His tag. Ambas construcciones se expresaron en E. coli desde el vector pET22b (Novagen). La proteína con His tag se purificó mediante cromatografía de afinidad Ni^{2+} como anteriormente (13 mg/l). La CTB recombinante no marcada (sin tag) se purificó mediante cromatografía de afinidad de columna de gangliósido GM1 como está descrito (Tayot et al. (1981) Eur. J. Biochem. 113: 249-258). Se demostró que la CTB pentamérica recombinante se une al gangliósido GM1 en un ensayo ELISA y se hizo reaccionar con anticuerpos específicos del pentámero en transferencias Western y ELISA. La CTB recombinante está disponible también de otras fuentes, tal como la vacuna AB de SBL.

La estructura pentamérica de CTB puede ser preferida para unirse al gangliósido GM1. El pentámero es estable a SDS siempre que las muestras no se hiervan, permitiendo que la pentamerización sea evaluada por SDS-PAGE. El gel de la Figura 4a demuestra que la CTB nativa es un pentámero y es fácilmente distinguible de la CTB monomérica desnaturalizada. La estructura pentamérica se mantiene a lo largo de un intervalo de pH de 4 a 9 (véase la Figura 4b), lo que facilita una variedad de reacciones químicas de conjugación. La CTB recombinante expresada inicialmente es monomérica. Una forma de obtener CTB pentamérica es haciendo ajustes para expresar la CTB pentamérica apropiadamente plegada. Se ha encontrado que la expresión citoplásmica proporciona un nivel mucho más alto de CTB monomérica. Un experto en la técnica conoce métodos para plegar la CTB monomérica a CTB pentamérica (véase, por ejemplo, L'hoir et al. (1990) Gene 89: 47-52). Una alternativa para re-plegar la CTB monomérica para obtener CTB pentamérica es la expresión periplásmica que da como resultado la CTB pentamérica recombinante capaz de unirse al gangliósido GM1 mediante el ensayo ELISA. La Figura 5a y la Figura 5b muestran los datos que apoyan este hallazgo. Un experto en la técnica puede encontrar varios métodos para obtener la CTB pentamérica recombinante que han sido descritos, incluyendo la expresión periplásmica con un líder (Slos et al., cita anterior; Sandez et al. (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 86: 481-485; Lebens et al. (1993) BioTechnol. 11: 1574-1578) o el replegado post-traducción (L'hoir et al., cita anterior; Jobling et al. (1991) Mol. Microbiol. 5: 1755-1767).

Otro portador útil es la toxina del cólera que proporciona una mejor respuesta mucosal sobre la CTB. Se ha descrito que el adyuvante de la subunidad A enzimáticamente activa aumenta la actividad (Liang et al. (1988) J. Immunol. 141: 1495-1501; Wilson et al. (1993) Vaccine 11: 113-118; Snider et al. (1994) J. Immunol. 153: 647).

Un aspecto para conseguir el conjugado de la presente invención implica modificar el hapteno, suficientemente para hacerlo capaz de ser conjugado o unido a un portador mientras se mantiene suficiente estructura de modo que se reconoce al mismo como hapteno en estado libre (nicotina libre). Es esencial que un individuo vacunado tenga anticuerpos que reconocen el hapteno libre (nicotina). Los experimentos de radioinmunoensayo y ensayo ELISA de competición, explicados con más detalle en los Ejemplos, pueden medir los títulos de anticuerpo frente al hapteno libre. Los anticuerpos de interés son anticuerpos específicos de la nicotina. Se debe reconocer que los principios y métodos usados para describir las realizaciones preferidas se pueden extender desde esta descripción a un amplio intervalo de conjugados hapteno-portador útiles en el tratamiento de una variedad de drogadicciones y respuestas tóxicas.

Conjugados

La preparación de los nuevos conjugados nicotina-portador de la presente invención se derivan de la nicotina y metabolitos de la nicotina. La Figura 8 muestra una representación de nicotina y alguno de sus metabolitos.

La longitud y naturaleza del enlace hapteno-portador es de tal modo que el hapteno está desplazado una distancia suficiente del dominio del portador para permitir su reconocimiento óptimo por los anticuerpos inicialmente producidos contra él. La longitud del enlace se optimiza variando el número de grupos -CH_{2}- que están estratégicamente situados dentro de una "rama" CJ 11 como se identifica a continuación:

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CJ 0

Q

CJ 1

(CH_{2})_{n} Q

CJ 1.1

CO_{2} Q

CJ 1.2

COQ

CJ 2

OCO(CH_{2})_{n} Q

CJ 2.1

OCOCH=Q

CJ 2.2

OCOCH(O)CH_{2}

CJ 2.3

OCO(CH_{2})_{n}CH(O)CH_{2}

CJ 3

CO(CH_{2})_{n}COQ

CJ 3.1

CO(CH_{2})_{n}CNQ

CJ 4

OCO(CH_{2})_{n}COQ

CJ 4.1

OCO(CH_{2})_{n}CNQ

CJ 5

CH_{2}OCO(CH_{2})_{n}COQ

CJ 5.1

CH_{2} OCO(CH_{2})_{n}CNQ

CJ 6

CONH(CH_{2})_{n}Q

CJ 7

Y(CH_{2})_{n}Q

CJ 7.1

CH_{2} Y(CH_{2})_{n}Q

CJ 8

OCOCH(OH)CH_{2}Q

CJ 8.1

OCO(CH_{2})_{n}CH(OH)CH_{2}Q

CJ 9

OCOC_{6}H_{5}

CJ 10

mostrado en la Figura 2b

CJ 11

YCO(CH_{2})_{n}COQ

y se muestra en las figuras 2a y 2b de esta memoria. Con respecto a las ramas anteriores, n es un número entero preferiblemente seleccionado de aproximadamente 2 a aproximadamente 20, más particularmente de aproximadamente 2 a aproximadamente 8, y lo más preferiblemente 3 a 5; Y se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en S, O, y NH; y Q se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en:

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(1)

-H

(2)

-OH

(3)

-CH_{2}

(4)

-CH_{3}

(4a)

-OCH_{3}

(5)

-COOH

(6)

halógeno

(7)

portador proteína o péptido

(8)

portador proteína modificada o péptido

(9)

ésteres activados, tales como éster de 2-nitro-4-sulfofenilo y éster de N-oxisuccinimidilo

(10)

grupos reactivos para los portadores o portadores modificados tales como anhídridos mixtos, haluros de acilo, azidas de acilo, haluros de alquilo, N-maleimidas, imino-ésteres, isocianato, isotiocianato; o

(11)

otra "rama" identificada por su número de referencia "CJ".

\vskip1.000000\baselineskip

Un portador que contiene un epítopo de las células T (por ejemplo, un portador proteína o péptido) se puede modificar por métodos conocidos por los expertos en la técnica para facilitar la conjugación con el hapteno (por ejemplo, por tiolación). Por ejemplo con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) o por succinilación, etc. Para simplificar, (CH_{2})nQi, donde Q=H, se puede denominar (CH_{3}), metilo o Me, sin embargo, se entiende que se acomoda dentro del motivo identificado en las "ramas" como se muestra en las figuras 1a y 1b.

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Abreviaturas adicionales de compuestos comercialmente obtenibles usados en esta memoria incluyen:

BSA = Seroalbúmina bovina

DCC = Diciclohexilcarbodiimida

DMF = N,N-Dimetilformamida

EDC (o EDAC) = N-Etil-N'-(3-(dimetilamino)propil)carbodiimida, hidrocloruro

EDTA = Ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica

HATU = O-(7-Azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio, hexafluorofosfato

NMM = N-Metilmorfolina

HBTh = 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio, hexafluorofosfato

TNTU = 2-(5-Norbornen-2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetrametiluronio, tetrafluoroborato

PyBroP® = Bromo-tris-pirrolidino-fosfonio, hexafluorofosfato

HOBt = N-Hidroxibenzotriazol

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Además la nomenclatura de la IUPAC para varios compuestos importantes es:

Nicotina

1-Metil-2-(3-piridil)pirrolidina

Cotinina

N-Metil-2-(3-piridil)-5-pirrolidona

Reacciones

En una realización, el precursor de los conjugados PS-54 fue sintetizado acilando la nornicotina racémica con anhídrido succínico en cloruro de metileno en presencia de dos equivalentes de diisopropiletilamina. El producto de esta reacción se acopla entonces con el residuo de lisina de una proteína portadora usando HATU para obtener los conjugados PS-54 (véase el Ejemplo 1, método B).

En otra realización, los precursores de PS-55, PS-56, PS-57 y PS-58 se sintetizaron alquilando selectivamente el nitrógeno piridínico de la (S)-(-)-nicotina en metanol anhidro, con 3-bromobutirato de etilo, ácido 5-bromovalérico, ácido 6-bromohexanoico o ácido 8-bromooctanoico respectivamente (véase el Ejemplo 2, métodos A, B, C, y D). Los productos de estas reacciones se conjugaron con una proteína portadora usando HATU para obtener los conjugados PS-55, PS-56, PS-57 y PS-58 (véase el Ejemplo 3, Método A).

TABLA 1

1

Esta no es una lista limitativa de conjugados. Se han preparado otros conjugados con más de un hapteno acoplado al portador que contiene un epítopo de las células T. Preferiblemente, 1 a 100 haptenos se acoplan con el portador que contiene un epítopo de las células T. Muy preferiblemente, 1 a 70 haptenos se acoplan con el portador que contiene un epítopo de las células T

\global\parskip1.000000\baselineskip

Los métodos de síntesis de los compuestos PS-54, PS-55, PS-56, PS-57 y PS-58 se describen en los Ejemplos. Siguiendo los métodos descritos, por ejemplo, usando agentes activantes en condiciones acuosas, un experto en la técnica puede sintetizar cualquier compuesto deseado.

Hay un amplio conjunto de compuestos que han sido desarrollados para facilitar la unión cruzada de proteínas/péptidos o la conjugación de proteínas con moléculas derivadas, por ejemplo, haptenos. Estos incluyen, pero sin limitarse a ellos, ésteres activos derivados del ácido carboxílico (compuestos activados), anhídridos mixtos, haluros de acilo, azidas de acilo, haluros de alquilo, N-maleimidas, imino-ésteres, isocianatos e isotiocianatos, que son conocidos por los expertos en la técnica. Estos son capaces de formar un enlace covalente con un grupo reactivo de una molécula de proteína. Dependiendo del grupo activador, el grupo reactivo es el grupo amino de un residuo de lisina sobre una molécula de proteína o un grupo tiol de una proteína portadora o una molécula de proteína portadora modificada que, cuando reacciona, da como resultado la formación de un enlace amida, amina, tioéter, amidin-urea o tiourea. Un experto en la técnica puede identificar además grupos activantes adecuados, por ejemplo, en los textos generales de referencia tales como Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking (Wong (1991) CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.). Idealmente, la conjugación es a través de un grupo amino de la cadena lateral de lisina. La mayor parte de los reactivos reaccionan preferiblemente con lisina. Un portador especialmente adecuado es CTB ya que tiene 9 residuos de lisina por monómero en su forma nativa. Para determinar si la CTB pentamérica conjugada retiene su estructura y actividad, se puede evaluar la unión al gangliósido GM1.

Los solicitantes han expresado y purificado cantidades de CTB recombinante que, una vez optimizadas, se producen en grandes lotes de fermentación. Los procedimientos para expresar y purificar proteínas recombinantes son conocidos en la técnica, véase por ejemplo, el documento USSN 07/807.529. Por ejemplo, la CTB puede ser purificada por cromatografía de afinidad (Tayot et al. (1981) Eur. J. Biochem. 113: 249-258), conjugada con heroína o derivados de nicotina, y el conjugado se puede purificar entonces adicionalmente. La CTB purificada y el conjugado resultante se analizan en cuanto a pureza y mantenimiento de la estructura pentamérica de la CTB. Las técnicas incluyen SDS-PAGE, PAGE nativo, cromatografía de filtración en gel, transferencia Western, ELISA directo y de captura de GM1, y ELISA de competición con CTB biotinilada. El nivel de haptenación se mide por espectrometría de masas, HPLC de fase inversa y por análisis del incremento en la absorbancia UV que resulta de la presencia del hapteno. Tanto la solubilidad como la estabilidad del conjugado se mejoran en la preparación de la formulación a escala completa. Detalles de alguno de estos análisis se dan en los Ejemplos.

Aunque la estructura pentamérica de CTB es un portador preferido para la práctica de la presente invención, y la unión a GM1 es un ensayo eficaz para determinar que la forma pentamérica de CTB está presente, la presente invención no se limita al uso de la forma pentamérica de CTB. Otros portadores de un epítopo de las células T están englobados en la invención, así como otras formas de CTB (por ejemplo, monómero, dímero, etc.) que pueden ser manipuladas para uso en la invención. Si se utiliza un portador distinto de la forma pentamérica de CTB, entonces un experto en la técnica debe usar un ensayo apropiado para determinar la presencia y actividad del portador requerido (por ejemplo, el uso de la unión a GM1 para determinar la presencia de la forma pentamérica de CTB).

Con el fin de variar los niveles de haptenación, se siguen métodos alternativos. En una realización el portador es haptenado con una construcción multivalente de heroína o nicotina. Esta idea se basa en el concepto de péptidos antigénicos múltiples (MAP) (Lu et al. Mol. Immunol., 28: 623-630 (1991)). En este sistema, los residuos múltiples ramificados de lisina se usan para maximizar la densidad y valencia del hapteno. La premisa de este método es que la respuesta inmunitaria se aumenta si hay múltiple copias del hapteno unidas a la misma molécula de péptido o proteína. Por tanto, se prepara un hapteno multivalente que necesita ser unido solamente a uno o dos sitios del portador pentámero CTB como se indica en esta memoria. El núcleo de dicho hapteno antigénico múltiple es un núcleo ramificado de polilisina como es sugerido por Tam (Lu et al., cita anterior). Se conserva un soporte químicamente reactivo mediante la inclusión de un residuo Cys protegido. Después de la haptenación de todos los grupos amino disponibles de heroína o nicotina, se desenmascara el sulfhidrilo de Cys y se hace disponible para acoplar la proteína con cualquiera de los diferentes enlaces cruzados bifuncionales específicos sulfhidrilo/amino (Yoshitake et al. (1979) Eur. J. Biochem. 101: 395-399. Una serie de estructuras dendriméricas se usan como núcleo.

Adyuvante

Cualquier adyuvante que no enmascara el efecto del portador es considerado útil en las vacunas terapéuticas de heroína y nicotina de la presente invención (véase, Edelman (1980) Rev. Infect. Dis. 2: 370-373). Los experimentos iniciales de los solicitantes dirigidos a demostrar la viabilidad de una vacuna terapéutica contra la adicción a la cocaína usaron el poderoso adyuvante CFA . Sin embargo, el CFA no es preferido en los seres humanos. Un adyuvante útil actualmente autorizado para uso en los seres humanos es la alúmina, incluyendo hidróxido de aluminio (Spectrum Chem. Mtg. Corp., New Brunswick, N.J.) o fosfato de aluminio (Spectrum). Típicamente, la vacuna es adsorbida sobre la alúmina, que tiene una solubilidad muy limitada. Los datos preliminares en el modelo murino dan a entender que la alúmina es capaz de inducir una fuerte respuesta de anticuerpos anti-cocaína y MF59 (Chiron, Emeryville, Calif.) o también es adecuado el adyuvante RIBI.

La inmunización efectiva con CTB como la proteína portadora no requiere un adyuvante potente. Como se muestra en los Ejemplos, respuestas con altos títulos de anticuerpos anti-nicotina fueron inducidas por la inmunización con el conjugado CTB-nicotina ya sea usando alúmina como adyuvante o ya sea en ausencia de cualquier adyuvante añadido. Para otros portadores aparte de CTB un experto en la técnica será capaz de determinar un adyuvante apropiado, si fuera necesario.

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Excipientes y agentes auxiliares

Las composiciones terapéuticas pueden contener opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables incluyendo, pero sin limitarse a ellos, agua estéril, soluciones salinas tales como solución salina fisiológica, fosfato de sodio, cloruro de sodio, alcohol, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicol, gelatina, manitol, carbohidratos, estearato de magnesio, parafina viscosa, ésteres de ácidos grasos, hidroximetilcelullosa, y tampones. Otros excipientes adecuados pueden ser usados por los expertos en esta técnica. La composición terapéutica puede comprender opcionalmente al menos un agente auxiliar, por ejemplo, medios de dispersión, recubrimientos, tales como lípidos y liposomas, tensioactivos tales como agentes humectantes y emulsionantes, lubricantes, conservantes tales como agentes antibacterianos y agentes antifúngicos, estabilizantes y otros agentes bien conocidos por los expertos en la técnica. La composición de la presente invención puede contener también adyuvantes adicionales, agentes y/o excipientes inertes farmacológicamente aceptables que se pueden añadir para aumentar las propiedades terapéuticas de la droga o hacer posibles modos alternativos de administración.

Los conjugados hapteno-portador altamente purificados producidos como se ha expuesto antes se pueden formular en composiciones terapéuticas de la invención adecuadas para la terapia humana. Si una composición terapéutica de la invención es para ser administrada por inyección (esto es, inyección subcutánea), entonces es preferible que el conjugado hapteno-portador altamente purificado sea soluble en solución acuosa a un pH farmacéuticamente aceptable (esto es, un intervalo de aproximadamente 4-9) de tal modo que la composición sea fluida y la administración sea fácil. Es posible, sin embargo, administrar una composición en la que el conjugado hapteno-portador altamente purificado está en suspensión en una solución acuosa y dicha suspensión está dentro del alcance de la presente invención. La composición incluye también opcionalmente excipientes farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y agentes auxiliares o compuestos activos suplementarios. Dependiendo del modo de administración, los ingredientes opcionales asegurarán propiedades deseables de la composición terapéutica, por ejemplo, fluidez apropiada, prevención de la acción de microorganismos indeseables, mejor biodisponibilidad o absorción prolongada.

Una composición terapéutica de la invención debe ser estéril, estable en las condiciones de fabricación, almacenaje, distribución y uso, y protegida frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. Un medio preferido para fabricar una composición terapéutica de la invención con el fin de mantener la integridad de la composición es preparar la formulación de conjugado y excipiente farmacéuticamente aceptable de tal modo que la composición pueda estar en la forma de un polvo liofilizado que se reconstituye en excipientes o agentes auxiliares, por ejemplo agua estéril, inmediatamente antes de su uso. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado a vacío, liofilización o secado por centrifugación lo que da un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución del mismo previamente filtrada estéril.

Los compuestos activos de esta invención se pueden preparar de acuerdo con métodos convencionales de la farmacia galénica para producir composiciones terapéuticas para administración a pacientes, por ejemplo, mamíferos incluyendo los seres humanos. Los modos preferidos de administración son intranasal, intratraqueal, oral, dérmica, y/o inyección. Una combinación particularmente adecuada de modos de administración comprende una inyección inicial con dosis de refuerzo intranasales.

Para aplicación parenteral, son particularmente adecuadas las soluciones estériles inyectables, preferiblemente soluciones oleosas o acuosas, así como suspensiones, emulsiones, o implantes, incluyendo supositorios. Las ampollas son dosis unitarias convenientes. Para aplicación entérica, son particularmente adecuados los comprimidos, grageas, líquidos, suspensiones, gotas, supositorios, o cápsulas, que pueden incluir recubrimiento entérico. Se puede usar un jarabe, elixir, o similares en los que se emplea un vehículo edulcorado.

Se pueden formular composiciones de liberación directa o sostenida, por ejemplo, liposomas o aquellas en las que el compuesto activo (conjugado) está protegido con recubrimientos diferencialmente degradables, por ejemplo, por microencapsulación, recubrimientos múltiples, etc. También es posible liofilizar los nuevos compuestos y usar los liofilizados obtenidos, por ejemplo, para la preparación de productos para inyección.

Para aplicación tópica, se emplean como formas no pulverizables, formas viscosas a semi-sólidas o sólidas que comprenden un portador compatible con la aplicación tópica y que tienen una viscosidad dinámica preferiblemente mayor que el agua. Las formulaciones adecuadas incluyen pero sin limitarse a ellas, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas etc., que si se desea, se esterilizan o se mezclan con agentes auxiliares. Para aplicación tópica son adecuadas las preparaciones pulverizables en aerosol en las que el compuesto activo, preferiblemente en combinación con un excipiente adecuado o agente auxiliar, se envasa en un frasco presionable o en mezcla con un propelente presurizado volátil, normalmente un propelente gaseoso.

Un anticuerpo producido a través de las composiciones y métodos de la presente invención puede tener un peso molecular que varía de 150 KDa a 1.000 KDa. Cuando el sujeto se expone a la heroína o nicotina libres después de la vacunación con el conjugado optimizado en la composición terapéutica, la heroína o nicotina libres son el objetivo de un anticuerpo o anticuerpos específicos de la heroína o específicos de la nicotina. No son necesarios cambios ni en la forma ni en la estructura de la droga para que el anticuerpo reconozca la droga in vivo. Aunque no se pretende limitar la presente invención, se cree que después de la exposición del individuo vacunado a la heroína o a la nicotina, los anticuerpos anti-droga bloquearán los efectos de la heroína y de la nicotina. Se cree que al menos tres mecanismos contribuyen a la actividad de bloqueo. En primer lugar, los anticuerpos son incapaces de cruzar la barrera sanguínea del cerebro. Por tanto, se cree que la heroína o nicotina, cuando están unidas al anticuerpo anti-heroína o anti-nicotina, no cruzarán la barrera sanguínea del cerebro y no serán capaces de ejercer su efecto sobre los receptores de opioides y los trasportadores de dopamina, respectivamente. En segundo lugar, sin estar limitado por ninguna teoría particular, se cree que el anticuerpo evita que la droga se una a su receptor por un simple bloqueo estérico. Se espera que este mecanismo sea operativo en el bloqueo de alguno de los efectos fuera del CNS de las drogas (por ejemplo la toxicidad cardíaca) y en la actividad de los anticuerpos frente a otras drogas que no se dirigen al CNS. En tercer lugar, tanto la heroína como la nicotina tienen semividas relativamente cortas in vivo debido a la degradación tanto enzimática como no enzimática, que crea metabolitos inactivos. La heroína y la nicotina, en particular, son drogas suficientemente pequeñas de forma que es muy improbable que puedan reticularse con los anticuerpos, por tanto, es altamente improbable que tenga lugar la formación de un complejo inmunitario fisiológicamente significativo para cualquiera de las drogas.

Otras realizaciones adicionales de aplicaciones mucosales se usan en la práctica de la presente invención. Por ejemplo, se usan microesferas de copolímero para inducir o aumentar una respuesta inmunitaria mucosal. Estas microesferas pequeñas, biodegradables, encapsulan y protegen el conjugado y facilitan la absorción por el sistema inmunitario mucosal. Aunque se usan más ampliamente para la inmunización oral, también se ha descrito que son eficaces con la inmunización intranasal (Walker (1994) Vaccine 12: 387-399). A este respecto son particularmente útiles los polímeros inertes tales como poli(lactida-co-glicolida) (PLG) de 1-10 \mum de diámetro (Holmgren et al. (1994) Am. J. Trop. Med. Hyg. 50: 42-54; Serva (1994) Science 265: 1522-1524).

En adición a los conjugados preferidos, se lleva a cabo la inmunización cruzada con diferentes conjugados con el fin de minimizar la reactividad cruzada de los anticuerpos. Los ratones se sensibilizan en primer lugar con un conjugado, y después reciben dosis de refuerzo el día 14 con un conjugado diferente acoplado al mismo portador. Solamente el subconjunto de células B secretoras de anticuerpos que reconocen tanto los conjugados de heroína como de nicotina está estimulado y expandido al máximo. Se cree que debido a que los dos conjugados difieren en su punto de unión a la molécula de la droga, aumenta la especificidad del reconocimiento. La especificidad de los antisueros inducidos se confirma después por un ensayo ELISA de competición.

Todavía más, las composiciones terapéuticas que contienen más de un conjugado estimulan los anticuerpos policlonales con lo que aumentan la respuesta de anticuerpos después de un enfrentamiento posterior.

Dosis

Se sabe que las respuestas de anticuerpos neutralizantes frente a patógenos duran años, y debe ser posible alcanzar una respuesta de altos títulos de anticuerpos anti-heroína o anti-nicotina que se mantenga durante al menos un año. Basándose en los valores obtenidos con las vacunas convencionales, debe ser posible alcanzar las concentraciones de anticuerpos específicos requeridas para neutralizar las concentraciones plasmáticas de nicotina. Los datos farmacocinéticos en ratones, no se muestran los datos, demuestran claramente que se pueden alcanzar concentraciones de anticuerpos neutralizantes fisiológicamente relevantes. Finalmente, la capacidad de los anticuerpos maternales de cruzar la placenta en las mujeres adictas a la heroína y/o en las mujeres que fuman, y de este modo proteger al feto, representa un efecto adicionalmente deseable de la vacunación terapéutica de nicotina. La optimización de la terapia para que sea eficaz para una amplia población es siempre un reto incluso para los expertos en la técnica, mediante el uso de un cuidadoso entendimiento de diferentes factores para determinar la dosis terapéutica apropiada. Además, las respuestas de anticuerpos pueden ser monitorizadas usando ensayos ELISA específicos como se indica en los Ejemplos y otros ensayos basados en anticuerpos.

La variación genética en las proporciones de eliminación, interacciones con otras drogas, alteraciones inducidas por enfermedad en la eliminación y distribución, y otros factores, se combinan para dar un amplio intervalo de respuestas a los niveles de vacuna en pacientes que reciben la misma dosis. Los indicadores clínicos ayudan a la titulación de algunas drogas en el intervalo deseado, y ninguna determinación química es un sustituto de las observaciones cuidadosas de la respuesta al tratamiento. Debido a que el aclaramiento, acumulación de la semivida, y los niveles plasmáticos en estado de equilibrio son difíciles de predecir, la medida de la producción de anticuerpos anti-drogas de adicción es útil como una guía para la dosis óptima. Cada uno de los conjugados/portadores/adyuvantes de la presente invención se evalúa en cuanto a la capacidad de inducir una respuesta de anticuerpos que es la más capaz de unirse con la heroína libre o la nicotina libre en la circulación.

En los Ejemplos se dan detalles adicionales acerca de los efectos de portadores y adyuvantes sobre la inducción de una respuesta de anticuerpos. Por tanto, se apreciará que las cantidades reales preferidas de compuesto activo en un caso específico variará según el conjugado específico que se está utilizando, las composiciones particulares formuladas, el modo de aplicación, y los sitios particulares y el organismo a ser tratado. Por ejemplo, en una realización, la composición terapéutica que contiene un portador adecuado, se administra en primer lugar parenteralmente y las dosis de refuerzo se administran mucosalmente. Como se expone en más detalle en esta memoria, este tipo de inmunización con la combinación óptima de hapteno y portador es muy efectiva para generar principalmente IgG sistémicamente y principalmente IgA localmente.

Como se indica en los Ejemplos, se han usado modelos murinos para demostrar y medir diferentes características de la respuesta de anticuerpos, incluyendo el título de anticuerpos, la capacidad para reconocer la nicotina libre, la capacidad de unirse a la nicotina, la afinidad por la nicotina, la especificidad de la respuesta de anticuerpos, el isotipo de anticuerpo, la localización del anticuerpo en el tejido, y los efectos fisiológicos del anticuerpo después de la administración de nicotina.

Título de anticuerpos

El primer cribado para la vacunación es si el conjugado de interés induce o no un alto título de respuesta de anticuerpos. Los títulos de anticuerpos se determinan usando un ensayo ELISA como es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, se recubren placas con un conjugado nicotina-HEL, se lavan concienzudamente, y se incuban con diluciones variables del suero de ensayo. Se lavan de nuevo las placas y se desarrollan con un segundo anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con enzima. Se definen los títulos como el recíproco de la dilución de suero que da el 50% de la respuesta máxima.

El título de anticuerpos depende tanto de la concentración de anticuerpo como de la afinidad del anticuerpo. Para estimar el título de anticuerpo requerido, son consideradas por los expertos en la técnica tanto la concentración como la afinidad de los anticuerpos.

La afinidad del anticuerpo refleja la cantidad de complejo anticuerpo-droga en equilibrio con el anticuerpo no unido y la droga de adicción no unida, así:

Keq = [complejo Ab + droga]/[Ab] \times [droga]

donde [Ab] = concentración molar de los sitios de unión al anticuerpo no ocupados; [droga] = concentración molar de la droga no unida; y [Ab + droga] = concentración molar del complejo anticuerpo-droga.

Especificidad de la respuesta de anticuerpos

Con el fin de ser máximamente efectivos en el bloqueo de la actividad de una droga adictiva, los anticuerpos inducidos deben tener una afinidad mínima por los metabolitos farmacológicamente inactivos de dicha droga. La unión de los anticuerpos a los metabolitos farmacológicamente inactivos de una droga reducirá la potencia de la vacuna. La especificidad de los antisueros para los metabolitos se determina mediante un ensayo ELISA de competición y mediante un inmunoensayo radiomarcado. Además, la eficacia de la vacuna se aumenta si los anticuerpos inducidos se unen a los metabolitos y derivados de una droga farmacológicamente activos.

Adicionalmente, la interacción de los anticuerpos producidos con otras drogas usados en la terapia de adicción y en otros procedimientos médicos debe ser minimizada. En particular, se evita la reacción cruzada con drogas comúnmente prescritas a los adictos a la heroína y a poli-drogas. Las siguientes drogas son útiles como co-tratamientos, buprenorfina, desipramina, naloxona, haloperidol, clorproazina, mazindol y bromocriptina, así como otras que pueden llegar a ser relevantes.

La composición y métodos de esta invención se describirán ahora en detalle con referencia a realizaciones específicas.

Ejemplo 1 Preparación de conjugado de nicotina

Método A: A una solución de nornicotina (50 mmol) en cloruro de metileno se añadió trietilamina (75 mmol), seguida de anhídrido succínico (100 mmol). Se calentó la solución a reflujo durante 18 horas. Se lavó la mezcla de reacción secuencialmente con ácido clorhídrico acuoso al 10%, solución saturada de bicarbonato de sodio, salmuera y agua. Después de secado (MgSO_{4}) y separación de los disolventes a presión reducida, se purificó el residuo usando cromatografía rápida en gel de sílice para obtener el producto deseado.

Método B: La nornicotina succinilada se usó entonces para sintetizar el conjugado de nicotina PS-54 (Figura 7). A una solución de nornicotina succinilada (5 \mumol) en DMF (0,1 ml), se añadió diisopropiletilamina (10 \mumol) seguida de HATU (5,5 \mumol). Después de 10 minutos, la solución de color amarillo pálido se añadió gota a gota a una solución de HEL o de BSA (500 \mug) en tampón de borato de sodio 0,1 M a pH 8,8 (0,9 ml) y se agitó la mezcla durante 18 horas a temperatura ambiente. Se ajustó el pH de la solución del conjugado a pH 7,0 por cuidadosa adición de ácido clorhídrico acuoso 0,1 M, seguido de purificación por diálisis frente a PBS. Se filtró el dializado a través de un filtro de 0,2 \mum y se midió el nivel de haptenación por análisis espectral de masas o absorbancia UV.

Inducción de respuestas de anticuerpos específicos de nicotina

Para inducir una respuesta de anticuerpos específicos para una pequeña molécula, o hapteno, tal como la nicotina, fue necesario unir ésta a un portador que contiene un epítopo de las células T, por ejemplo, un portador proteico. El portador es reconocido por las células T que son necesarias para la iniciación y mantenimiento de la producción de anticuerpos por las células B específicas de la nicotina. En este ejemplo, el portador usado fue BSA. Se produjo un panel de conjugados nicotina-BSA estructuralmente distintos que se unieron a través de diferentes partes de la molécula de nicotina con varios tipos diferentes de conectores (Figura 6b). El conjunto de conjugados diferentes permitió el ensayo de diferentes alteraciones y presentaciones de la molécula de nicotina. Puesto que cualquier conjugado dado de nicotina puede inducir cantidades variables de anticuerpos que reconocen o el hapteno libre (nicotina), el portador, o el conjugado solamente (y no reconocen la propia nicotina), se realizó el cribado de los conjugados como en el siguiente ejemplo.

Cuatro ratones hembras Balb/c, de 2-3 meses de edad, fueron inmunizados intraperitonealmente con 50 \mug de conjugado nicotina-BSA, PS-55-BSA, en adyuvante completo de Freund. Estos animales tienen una respuesta reproducible bien diseñada para los antígenos en investigación. Se administró una segunda inyección de PS-55-BSA el día 21 y se sangraron los ratones el día 35. Se analizaron los sueros en un ensayo ELISA en cuanto a la unión del anticuerpo a un conjugado de PS-55 y proteína lisozima de huevo de gallina (HEL) y se muestran en la Figura 9a. Estos datos demuestran que este conjugado nicotina-BSA fue capaz de inducir fuertes respuestas de anticuerpos.

Un segundo grupo de diez ratones hembras Balb/cbyj, de 2-3 meses de edad, fueron inmunizados para la preparación de un fondo común de suero, de antisueros anti-nicotina. En este experimento, el portador usado fue CTB. Se inmunizaron los ratones por inyección intramuscular con 10 \mug de PS-55-CTB en alhidrogel y recibieron dosis de refuerzo tres veces con lo mismo. Se sangraron los ratones y se procesó el suero por separado. El suero de cada animal se analizó en primer lugar en un ELISA directo de nicotina, para medir los anticuerpos anti-nicotina y después se analizó en un ELISA de competición para determinar si los anticuerpos inducidos eran capaces o no de reconocer la nicotina libre.

El suero de cada animal se analizó en un ELISA directo anti-nicotina para medir los anticuerpos producidos como sigue. Las placas para ELISA de 96 pocillos Immulon 2 se recubrieron durante la noche a 4ºC con 50 \mul de 10 \mug/ml de un segundo conjugado de nicotina y HEL, PS-55-HEL, diluido en 1 X PBS. Se bloquearon las placas con gelatina al 0,5% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas 3 veces con 1 X PBS que contiene 0,05% de Tween-20 (PBS-T). Se añadieron las muestras de suero a las placas empezando a una dilución 1/300 para las placas recubiertas con PS-55-HEL. Se diluyeron los sueros por diluciones al triple y se incubaron sobre las placas bloqueadas durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron entonces las placas tres veces con PBS-T. Se diluyó IgG anti-ratón de cabra biotinilada (Lote # J194-N855B o C) 1/10.000 en PBS-T y se añadieron 100 \mul a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se diluyó estreptavidina-HRP 1/10.000 y se añadió a los pocillos durante 30 minutos siguiendo el lavado con PBS-T. Se lavaron las placas 3 veces con PBS-T y después se desarrollaron añadiendo sustrato TMB a cada uno de los pocillos. Se paró la reacción después de 5 minutos con ácido fosfórico 1 M. Se leyeron las placas usando un lector ELISA a O.D. 450 nm. El suero que generó anticuerpos anti-nicotina en el ensayo ELISA directo se analizó entonces en un ELISA de competición.

Reconocimiento de nicotina libre

Para determinar si los anticuerpos inducidos son capaces o no de reconocer la molécula de nicotina libre, se llevó a cabo un ensayo ELISA de competición. En este ensayo, la nicotina libre compite con el PS-55-HEL que recubre las placas ELISA por la unión de los anticuerpos en el suero. Si los anticuerpos que tienen una alta afinidad por la nicotina comprenden la mayor parte de los anticuerpos que se unen al PS-55-HEL, entonces bajas concentraciones de nicotina son capaces de inhibir de modo efectivo la unión del anticuerpo.

Para 3 de los 4 ratones descritos antes que fueran inyectados con PS-55-BSA, la unión del anticuerpo a PS-55-HEL fue inhibida por la nicotina libre (no se muestran datos). Nótese que no se debe esperar que la presencia del anticuerpo específico para el conjugado solo, interfiera con la acción del anticuerpo anti-nicotina. Esto indica que en cada uno de estos sueros hay anticuerpos que reconocen la nicotina libre. También se ensayó en el ELISA de competición el principal metabolito de la nicotina, cotinina, y no puede competir con los anticuerpos en ninguno de los sueros excepto a muy altas concentraciones. Para verificar que los anticuerpos inducidos eran capaces de reconocer la molécula de nicotina libre, se utilizó un RIA para medir la unión específica a [^{3}H]-nicotina. El suero inmune del experimento anterior se incubó con [^{3}H]-nicotina y perlas de sefarosa conjugadas a proteína-G (Gammabind-G Sepharose, Pharmacia), que se unen a la IgG en las muestras de suero. Se aisló la [^{3}H]-nicotina unida al anticuerpo por centrifugación de las perlas y se detectó por contaje de centelleo de las perlas. Los sueros de 3 de los 4 ratones se unieron significativamente a la [^{3}H]-nicotina libre (no se muestran datos). La pre-incubación de estos sueros con un exceso de nicotina no marcada de 50 veces, inhibió completamente la unión de la [^{3}H]-nicotina a estos anticuerpos. Estos datos demuestran que han sido sintetizados conjugados nicotina-portador que inducen respuestas de anticuerpos específicos de la nicotina que serán capaces de evitar la distribución de nicotina al cerebro in vivo.

Para el segundo grupo de 10 ratones que fueron inmunizados usando PS-55-CTB, la unión del anticuerpo a PS-55-HEL, fue inhibida por la nicotina libre (Figura 10). Se utilizó una dilución de suero que representaba el 50% del título. Las placas para ELISA de 96 pocillos Immulon 2 se recubrieron durante la noche a 4ºC con 50 \mul de PS-N-3,2 HEL, diluido en 1 X PBS. Se bloquearon las placas con gelatina al 0,5% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas 3 veces con 1 X PBS que contiene 0,05% de Tween-20 (PBS-T). Se incubaron las placas con antisuero en presencia de concentraciones variables de nicotina libre así como los metabolitos, drogas, y compuestos relacionados durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron entonces las placas 3 veces con PBS-T. Se diluyó IgG anti-ratón de cabra biotinilada (Lote # J194-N855B o C) 1/10.000 en PBS-T y se añadieron 100 \mul a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se diluyó estreptavidina-HRP 1/10.000 y se añadió a los pocillos durante 30 minutos siguiendo por lavado con PBS-T. Se lavaron las placas 3 veces con PBS-T y después se desarrollaron añadiendo sustrato TMB a cada uno de los pocillos. Se paró la reacción después de 5 minutos con ácido fosfórico 1 M. Se leyeron las placas usando un lector ELISA a O.D. 450 nm. Las curvas de competición para cada fondo de sueros se muestran en la Figura 10. Se representan las concentraciones crecientes del competidor en el eje de las x y la absorbancia a 450 nm en el eje de las y.

Como se representa en la Figura 10, hubo escaso o nulo reconocimiento para los metabolitos de la nicotina, cotinina o norcotinina. Se usó como control negativo el anestésico lidocaína y no fue capaz de competir por la unión del anticuerpo. Se usó también como un competidor el propio conjugado y fue capaz de competir por la unión de este anticuerpo.

Con el fin de ser efectivos al máximo en el bloqueo de la actividad de la nicotina, los anticuerpos inducidos deben tener una afinidad mínima por los metabolitos de la nicotina. La unión de los anticuerpos a los metabolitos más estables reduciría la potencia de la vacuna. En el cribado del fondo común de antisueros solamente la nicotina fue capaz de inhibir la unión del anticuerpo al conjugado. En este experimento, se vio un escaso o nulo reconocimiento con los metabolitos (cotinina y norcotinina) y con el anestésico (lidocaína). Por tanto, el conjugado nicotina-CTB induce anticuerpos que reconocen la nicotina y no reconocen los metabolitos menos activos. El conjugado nicotina-CTB no reconoce tampoco los compuestos que tienen estructuras relacionadas ni las drogas que están siendo usadas actualmente para tratar la adicción a la nicotina (no se muestran datos).

Especificidad de los anticuerpos específicos para la nicotina

Para analizar la especificidad de los anticuerpos anti-nicotina inducidos por la vacuna de nicotina, se analizaron en un ensayo ELISA de competición los sueros de ratones inmunizados con conjugado nicotina-CTB. Se ensayó un panel de metabolitos de nicotina y moléculas relacionadas a concentraciones variables. Si los anticuerpos tienen alta afinidad por el metabolito, entonces bajas concentraciones son capaces de competir de forma efectiva en este ensayo. La reactividad relativa se expresa como IC_{50}, la concentración del inhibidor que disminuye la señal ELISA en un 50%. Los siguientes metabolitos se ensayan en cuanto a reactividad: glucurónido de nicotina, cotinina, glucurónido de cotinina, trans-3'-hidroxicotinina, glucurónido de trans-3'-hidroxicotinina, 1'-N-óxido de nicotina, N-óxido de cotinina, y nornicotina.

Eficacia de los anticuerpos específicos de la nicotina para inhibir la distribución de nicotina in vivo, inhibición de la distribución de nicotina al cerebro

Para evaluar los cambios en la distribución tisular de la nicotina causados por los anticuerpos específicos de la nicotina, se sigue la distribución de ^{3}H-nicotina en ratones inmunizados con nicotina-CTB comparados con ratones control nativos (no inmunizados). Los ratones inmunes y los ratones control inmunizados se inyectan con 0,08 mg/kg de ^{3}H-nicotina i.v. y después se decapitan 1,0 minutos después de la inyección. Se separan los cerebros y la sangre (plasma) para posterior análisis de la concentración de nicotina en tejido y plasma. Se recoge la sangre en tubos que contienen EDTA para evitar la coagulación. Se colocan las muestras de cerebro y plasma en viales de centelleo que contienen un estabilizante de tejidos; la digestión de las muestras tiene lugar durante 3 días a temperatura ambiente. Se colorean las muestras y se añade el coktail de centelleo a cada muestra. Se añade ácido acético glacial para clarificar las muestras. Después se cuentan las muestras en un contador de centelleo, y se convierten los datos a ng/g o ng/ml de tejido. La concentración de nicotina en el tejido cerebral de los ratones inmunizados con nicotina-CTB es significativamente más baja después de la inyección de ^{3}H-nicotina que en el tejido cerebral de los ratones control nativos (no se muestran datos).

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Ejemplo 2

Método A

Aducto de ácido N'-butírico de (S)-nicotina

A una solución de (S)-nicotina (0,031 mol) en metanol anhidro (50 ml) a temperatura de hielo-agua bajo argón, se añadió 4-bromobutirato de etilo (0,0341 mol) gota a gota a lo largo de 10 minutos. Se dejó que la solución resultante de color naranja se calentara a temperatura ambiente y se agitó durante 18 horas. Se separaron los disolventes a presión reducida dejando un residuo pardo que se precipitó con hexano para dar una muestra analíticamente pura del éster deseado.

Se disolvió el éster (36 mg) en metanol (3 ml) y solución 1 M de hidróxido de sodio (5 ml) y se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. Se separaron los disolventes a presión reducida y se disolvió el residuo en ácido clorhídrico al 10% y se extrajo con acetato de etilo. Después de secado (MgS_{4}) se separaron los disolventes a presión reducida para obtener el compuesto deseado.

Método B

Aducto de ácido N'-valérico de (S)-nicotina

A una solución de (S)-nicotina (0,031 mol) en metanol anhidro (50 ml) a temperatura de hielo-agua bajo argón, se añadió ácido 1-bromovalérico (0,0341 mol) gota a gota a lo largo de 10 minutos. Se dejó que la solución resultante de color naranja se calentara a temperatura ambiente y se agitó durante 18 horas. Se separaron los disolventes a presión reducida dejando un residuo pardo que se precipitó con hexano para dar una muestra analíticamente pura del compuesto deseado.

Método C

Aducto de ácido N'-hexanoico de (S)-nicotina

A una solución de (S)-nicotina (0,031 mol) en metanol anhidro (50 ml) a temperatura de hielo-agua bajo argón, se añadió ácido 1-bromohexanoico (0,0341 mol) gota a gota a lo largo de 10 minutos. Se dejó que la solución resultante de color naranja se calentara a temperatura ambiente y se agitó durante 18 horas. Se separaron los disolventes a presión reducida dejando un residuo pardo que se precipitó con hexano para dar una muestra analíticamente pura del compuesto deseado.

Método D

Aducto de ácido N'-octanoico de (S)-nicotina

A una solución de (S)-nicotina (0,031 mol) en metanol anhidro (50 ml) a temperatura de hielo-agua bajo argón, se añadió el apropiado ácido 1-bromooctanoico (0,0341 mol) gota a gota a lo largo de 10 minutos. Se dejó que la solución resultante de color naranja se calentara a temperatura ambiente y se agitó durante 18 horas. Se separaron los disolventes a presión reducida dejando un residuo pardo que se precipitó con hexano para dar una muestra analíticamente pura del compuesto deseado.

Ejemplo 3

Método A

Preparación general de PS-55, PS-56, PS-57 y PS-58

A una solución del apropiado análogo de ácido N'-alcanoico de nicotina (6,27 \times 10^{-5} mol) (del Ejemplo 1) en DMF (1,6 ml), se añadieron DIEA (1,25 \times 10^{-4} mol) y HATU (7,53 \times 10^{-5} mol). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añadió la solución de color amarillo pálido a HEL o a BSA (16,5 mg) en bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 8,3 (14,4 ml) y se agitó durante 18 horas. La solución del conjugado se purificó por diálisis frente a PBS a 4ºC durante la noche. Se analizaron los conjugados usando análisis espectral de masas con desorción láser para determinar el número de haptenos.

Método B

Preparación de PS-55

A una solución del aducto de nicotina y ácido N'-butírico (39 mg, 1,56 x 10^{-4} mol) (del Ejemplo 2, Método A) en DMF (0,4 ml), se añadieron DIEA (54 ml, 3,10 \times 10^{-4} mol) y HATU (71 mg, 1,87 \times 10^{-4} mol). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añadió la solución de color amarillo pálido gota a gota a rCTB (2 mg, 3,4 x 10^{-8} mol [15,6 x 10^{-6} moles de lisinas]) en 4 ml de tampón de borato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 0,15 M, pH 8,5 y después se agitó durante 1 hora. Se purificó el conjugado por diálisis frente a PBS a 4ºC durante la noche. Se analizó el conjugado usando análisis espectral de masas con desorción láser para determinar el número de haptenos.

Método C

Preparación de PS-56

A una solución del aducto de nicotina y ácido N'-valérico (2 mg) (del Ejemplo 2, Método B) en DMF (0,4 ml), se añadieron DIEA (2 ml) y HATU (2 mg). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añadió la solución de color amarillo pálido gota a gota a rCTB (2 mg, 3,4 x 10^{-8} mol [15,6 x 10^{-6} moles de lisinas]) en 4 ml de tampón de borato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 0,15 M, pH 8,5 y después se agitó durante 1 hora. Se purificó el conjugado por diálisis frente a PBS a 4ºC durante la noche. Se analizó el conjugado usando análisis espectral de masas con desorción láser para determinar el número de haptenos.

Método D

Preparación de PS-57

A una solución del aducto de nicotina y ácido N'-hexanoico (2 mg) (del Ejemplo 2, Método C) en DMF (0,4 ml), se añadieron DIEA (2 ml) y HATU (2 mg). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añadió la solución de color amarillo pálido gota a gota a rCTB (2 mg, 3,4 x 10^{-8} mol [15,6 x 10^{-6} moles de lisinas]) en 4 ml de tampón de borato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 0,15 M, pH 8,5 y después se agitó durante 1 hora. Se purificó el conjugado por diálisis frente a PBS a 4ºC durante la noche. Se analizó el conjugado usando análisis espectral de masas con desorción láser para determinar el número de haptenos.

Método E

Preparación de PS-58

A una solución del aducto de nicotina y ácido N'-octanoico (2 mg) (del Ejemplo 2, Método D) en DMF (0,4 ml), se añadieron DIEA (2 ml) y HATU (2 mg). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añadió la solución de color amarillo pálido gota a gota a rCTB (2 mg, 3,4 x 10^{-8} mol [15,6 x 10^{-6} moles de lisinas]) en 4 ml de tampón de borato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 0,15 M, pH 8,5 y después se agitó durante 1 hora. Se purificó el conjugado por diálisis frente a PBS a 4ºC durante la noche. Se analizó el conjugado usando análisis espectral de masas con desorción láser para determinar el número de haptenos.

Método F

Preparación de PS-60 i) Preparación del aducto de N-pirrolidina

A una solución de nornicotina (10 mmol) en metanol, se añade gota a gota 5-bromovalerato de etilo (10 mmol). Una vez consumido el material de partida, como se indica por TLC, se separan los disolventes a presión reducida y se purifica el residuo usando cromatografía rápida sobre gel de sílice para obtener el aducto de N-pirrolidina deseado.

ii) Preparación del conjugado

Se disuelve el éster (15 mmol) en metanol acuoso al 5% y se añade a esto hidróxido de sodio (15 mmol). Una vez consumido el material de partida, como se indica por TLC, se ajusta el pH a pH 2 por cuidadosa adición de ácido clorhídrico acuoso 1 M y después se extrae con acetato de etilo. Después de secado (MgSO_{4}) y separación de los disolventes a presión reducida, se purifica el producto usando cromatografía rápida en gel de sílice para obtener el ácido libre deseado.

A una solución del ácido libre (1,55 x 10^{-4} mol) en DMF (0,4 ml), se añaden DIEA (3,1 x 10^{-4} mol) y HATU (1,86 x 10^{-4} mol). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añade la solución de color amarillo pálido gota a gota a rCTB (2 mg, 3,4 x 10^{-8} mol [15,5 x 10^{-6} moles de lisinas]) en 4 ml de tampón de borato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 0,15 M a pH 8,5. Se mantiene la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora, se neutraliza y después se dializa frente a PBS a 4ºC para obtener el PS-60.

Método G

Preparación de PS-51 i) Preparación de 6-metilnicotinato de metilo

Se añade 6-metilnicotinato (0,375 mol) a una solución a reflujo de ácido sulfúrico concentrado (25 ml) en metanol y se agita a reflujo durante 3 horas. Se añade entonces metanol, (250 ml) y la mezcla resultante se calienta a reflujo durante 18 horas adicionales. Se enfría la mezcla de reacción y se concentra a presión reducida hasta una suspensión que se añade a una solución de bicarbonato de sodio (80 g) en agua (450 ml). Se concentra la mezcla a presión reducida para separar la mayor parte del metanol. La mezcla turbia resultante se extrae con cloruro de metileno, se seca (MgSO_{4}), se filtra y se concentra a presión reducida. El producto crudo resultante se purifica por destilación a presión reducida para obtener el éster deseado.

ii) Preparación de 6-metilmiosmina

A una solución de diisopropilamina (0,33 mol) en éter dietílico (500 ml) bajo argón a -70ºC se añade n-butil-litio (0,247 mol de una solución 1,6 M en hexano). A la diisopropilamina-litio (LDA) preparada, se añade N-(trimetilsilil)-pirrolidinona (0,265 mol) y se agita la solución durante 15 minutos a -70ºC. Se añade a esta solución 6-metilnicotinato de metilo (0,165 mol) en éter dietílico (25 ml) y se deja calentar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Después de esto, se enfría la mezcla en un baño de hielo, se añade agua (33 ml) y se separa por decantación la capa etérea. Se añade éter adicional y se repite el procedimiento de decantación dos veces. Se añade a la capa acuosa ácido clorhídrico concentrado y la solución resultante se mantiene a reflujo durante la noche. Se lava la solución ácida con éter dietílico, se concentra a presión reducida, se enfría en un baño de hielo y se alcaliniza con hidróxido de potasio acuoso al 50%. Se extrae la capa acuosa con éter dietílico (3 x 150 ml), se seca (Na_{2}SO_{4}), se concentra a presión reducida y se purifica por destilación a presión reducida para obtener la 6-metilmiosmina deseada.

iii) Preparación del aducto de 6-metilmiosmina y valerato de etilo

A una solución de 6-metilmiosmina (10 mmol) en tolueno seco se añade amiduro de sodio (15 mmol). Después de 10 minutos, se añade 5-bromovalerato de etilo (20 mmol) y se agita la mezcla hasta que se ha consumido el material de partida, como se indica por TLC. Se enfría la mezcla en un baño de hielo, se sofoca con etanol seco, se extrae con acetato de etilo, se seca (MgSO_{4}), y se concentra a presión reducida. Por purificación usando cromatografía rápida sobre gel de sílice se obtiene el producto deseado.

iv) Preparación del aducto de 6-metilnornicotina y ácido valérico

A una solución del aducto (10 mmol) del punto (iii) anterior en metanol, se añade cianoborohidruro de sodio (10 mmol), unas trazas de indicador verde de bromocresol y suficiente HCl 2 N/metanol de tal modo que el color de la solución cambie de azul a amarillo y permanezca amarillo. Se deja la solución en agitación durante varias horas, tras lo cual se añade ácido clorhídrico acuoso 6 N y se concentra la mezcla a presión reducida. Después de alcalinización con solución de bicarbonato de sodio, extracción con éter dietílico y secado (MgSO_{4}), se purifica el material usando destilación a presión reducida para obtener el compuesto deseado.

v) Preparación del aducto de 6-metilnicotina y ácido valérico

A una solución del aducto de nornicotina (10 mmol) del punto (iv) anterior en éter dietílico, se añade yodometano (20 mmol). Se mantiene a reflujo la solución bajo argón usando un condensador eficiente hasta que se ha consumido el material de partida, como se indica por TLC. Se separan los disolventes a presión reducida y se purifica el residuo usando cromatografía rápida para producir una mezcla racémica del compuesto deseado. Se separan los isómeros utilizando HPLC quiral para obtener el (S)-isómero deseado.

vi) Preparación del conjugado

A una solución del (S)-isómero del derivado de 6-metilnicotina (1,53 x 10^{-5} mol) del punto (v) anterior en DMF, se añade DIEA (3,06 x 10^{-5} mol) seguido por HATU (1,86 x 10^{-5} mol). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añade la solución de color amarillo pálido a rCTB (2 mg, 3,40 x 10^{-8} moles de proteína; 1,53 x 10^{-6} moles de lisinas) en 4 ml de tampón de borato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 0,15 M a pH 8,5. Después de 1 hora a temperatura ambiente, se dializa la solución exhaustivamente frente a PBS a 4ºC y se analiza el número de haptenos usando análisis espectral de masas.

Método H

Preparación de PS-52 i) Preparación de 5-metilnicotinato de metilo

Se añade 5-metilnicotinato (0,375 mol) a una solución a reflujo de ácido sulfúrico concentrado (25 ml) en metanol (250 ml) y se agita a reflujo durante 3 horas. Se añade entonces metanol (250 ml) y la mezcla resultante se calienta a reflujo durante 18 horas adicionales. Se enfría la mezcla de reacción y se concentra a presión reducida hasta una suspensión que se añade a una solución de bicarbonato de sodio (80 g) en agua (450 ml). Se concentra la mezcla a presión reducida para separar la mayor parte del metanol. La mezcla turbia resultante se extrae con cloruro de metileno, se seca (MgSO_{4}), se filtra y se concentra a presión reducida. El producto crudo resultante se purifica por destilación a presión reducida para obtener el éster deseado.

ii) Preparación de 5-metilmiosmina

A una solución de diisopropilamina (0,33 mol) en éter dietílico (500 ml) bajo argón a -70ºC se añade n-butil-litio (0,247 mol de una solución 1,6 M en hexano). A la diisopropilamina-litio (LDA) preparada, se añade N-(trimetilsilil)-pirrolidinona (0,265 mol) y se agita la solución durante 15 minutos a -70ºC. Se añade a esta solución 6-metilnicotinato de metilo (0,165 mol) en éter dietílico (25 ml) y se deja calentar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Después de esto, se enfría la mezcla en un baño de hielo, se añade agua (33 ml) y se separa por decantación la capa etérea. Se añade éter adicional y se repite el procedimiento de decantación dos veces. Se añade a la capa acuosa ácido clorhídrico concentrado y la solución resultante se mantiene a reflujo durante la noche. Se lava la solución ácida con éter dietílico, se concentra a presión reducida, se enfría en un baño de hielo y se alcaliniza con hidróxido de potasio acuoso al 50%. Se extrae la capa acuosa con éter dietílico (3 x 150 ml), se seca (Na_{2}SO_{4}), se concentra a presión reducida y se purifica por destilación a presión reducida para obtener la 5-metilmiosmina deseada.

iii) Preparación del aducto de 5-metilmiosmina y valerato de etilo

A una solución de 5-metilmiosmina (10 mmol) en tolueno seco se añade amiduro de sodio (15 mmol). Después de 10 minutos, se añade 5-bromovalerato de etilo (20 mmol) y se agita la mezcla hasta que se ha consumido el material de partida, como se indica por TLC. Se enfría la mezcla en un baño de hielo, se sofoca con etanol seco, se extrae con acetato de etilo, se seca (MgSO_{4}), y se concentra a presión reducida. Por purificación usando cromatografía rápida sobre gel de sílice se obtiene el producto deseado.

iv) Preparación del aducto de 5-metilnornicotina y ácido valérico

A una solución del aducto (10 mmol) del punto (iii) anterior en metanol, se añade cianoborohidruro de sodio (10 mmol), unas trazas de indicador verde de bromocresol y suficiente HCl 2 N/metanol de tal modo que el color de la solución cambie de azul a amarillo y permanezca amarillo. Se deja la solución en agitación durante varias horas, después se añade ácido clorhídrico acuoso 6 N y se concentra la mezcla a presión reducida. Después de alcalinización con solución de bicarbonato de sodio, extracción con éter dietílico y secado (MgSO_{4}), se purifica el material usando destilación a presión reducida para obtener el compuesto deseado.

v) Preparación del aducto de 5-metilnicotina y ácido valérico

A una solución del aducto de nornicotina (10 mmol) del punto (iv) anterior en éter dietílico, se añade yodometano (20 mmol). Se mantiene a reflujo la solución bajo argón usando un condensador eficiente hasta que se ha consumido el material de partida, como se indica por TLC. Se separan los disolventes a presión reducida y se purifica el residuo usando cromatografía rápida para producir una mezcla racémica del compuesto deseado. Se separan los isómeros utilizando HPLC quiral para obtener el (S)-isómero deseado.

vi) Preparación del conjugado

A una solución del (S)-isómero del derivado de 5-metilnicotina (1,53 x 10^{-5} mol) del punto (v) anterior en DMF, se añade DIEA (3,06 x 10^{-5} mol) seguido por HATU (1,86 x 10^{-5} mol). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añade la solución de color amarillo pálido a rCTB (2 mg, 3,40 x 10^{-8} moles de proteína; 1,53 x 10^{-6} moles de lisina) en 4 ml de tampón de borato de sodio 0,1 M, NaCl 0,15 M a pH 8,5. Después de 1 hora a temperatura ambiente, se dializa la solución exhaustivamente frente a PBS a 4ºC y se analiza el número de haptenos usando análisis espectral de masas.

Método I

Preparación de PS-53 i) Preparación de 4-metilnicotinato de metilo

Se añade 4-metilnicotinato (0,375 mol) a una solución a reflujo de ácido sulfúrico concentrado (25 ml) en metanol (250 ml) y se agita a reflujo durante 3 horas. Se añade entonces metanol (250 ml) y la mezcla resultante se calienta a reflujo durante 18 horas adicionales. Se enfría la mezcla de reacción y se concentra a presión reducida hasta una suspensión que se añade a una solución de bicarbonato de sodio (80 g) en agua (450 ml). Se concentra la mezcla a presión reducida para separar la mayor parte del metanol. La mezcla turbia resultante se extrae con cloruro de metileno, se seca (MgSO_{4}), se filtra y se concentra a presión reducida. El producto crudo resultante se purifica por destilación a presión reducida para obtener el éster deseado.

ii) Preparación de 4-metilmiosmina

A una solución de diisopropilamina (0,33 mol) en éter dietílico (500 ml) bajo argón a -70ºC se añade n-butil-litio (0,247 mol de una solución 1,6 M en hexano). A la diisopropilamina-litio (LDA) preparada, se añade N-(trimetilsilil)-pirrolidinona (0,265 mol) y se agita la solución durante 15 minutos a -70ºC. Se añade a esta solución 6-metilnicotinato de metilo (0,165 mol) en éter dietílico (25 ml) y se deja calentar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Después de esto, se enfría la mezcla en un baño de hielo, se añade agua (33 ml) y se separa por decantación la capa etérea. Se añade éter adicional y se repite el procedimiento de decantación dos veces. Se añade a la capa acuosa ácido clorhídrico concentrado y la solución resultante se mantiene a reflujo durante la noche. Se lava la solución ácida con éter dietílico, se concentra a presión reducida, se enfría en un baño de hielo y se alcaliniza con hidróxido de potasio acuoso al 50%. Se extrae la capa acuosa con éter dietílico (3 x 150 ml), se seca (Na_{2}SO_{4}), se concentra a presión reducida y se purifica por destilación a presión reducida para obtener la 4-metilmiosmina deseada.

Ejemplo 4 Preparación de conjugados de heroína Preparación de PS-61 i) Preparación de norheroína

A una solución de heroína (10 mmol) en agua a 0ºC se añade permanganato de potasio (12 mmol). Una vez consumido el material de partida, como se indica por TLC, se deja que la suspensión se caliente a temperatura ambiente. Se separa entonces el dióxido de manganeso por filtración y se separan los disolventes a presión reducida para obtener norheroína como el producto deseado.

ii) Preparación del precursor del conjugado

A una solución de la norheroína (10 mmol) en THF se añade gota a gota 5-bromovalerato de etilo (20 mmol). Una vez consumido el material de partida, como se indica por TLC, se separan los disolventes a presión reducida. Se purifica entonces el residuo sobre gel de sílice usando cromatografía rápida para obtener el aducto de éster de norheroína deseado.

iii) Preparación del conjugado

Se disuelve el éster (15 mmol) en metanol acuoso al 5% y se añade a esto hidróxido de sodio (15 mmol). Una vez consumido el material de partida, como se indica por TLC, se ajusta el pH a pH 2 por adición cuidadosa de ácido clorhídrico acuoso 1 M y después se extrae con acetato de etilo. Después de secado (MgSO_{4}) y separación de los disolventes a presión reducida, se purifica el producto usando cromatografía rápida en gel de sílice para obtener el ácido libre deseado.

A una solución del ácido libre (1,55 x 10^{-4} mol) en DMF (0,4 ml), se añade DIEA (3,1 x 10^{-4} mol) seguido por HATU (1,86 x 10^{-4} mol). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añade la solución de color amarillo pálido gota a gota a rCTB (2 mg, 3,4 x 10^{-8} mol [15,5 x 10^{-6} moles de lisinas]) en 4 ml de tampón de borato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 0,15 M a pH 8,5. Se mantiene la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora, se neutraliza y después se dializa exhaustivamente frente a PBS a 4ºC para obtener el PS-61. El conjugado se analiza usando análisis espectral de masas con desorción láser para determinar el número de haptenos.

Ejemplo 5 Preparación de PS-62 y PS-63 i) Preparación de precursores

A una solución de heroína (10 mmol) en THF seco a 0ºC, se añade gota a gota n-butil-litio (1,5 mmol de una solución 1,6 M en hexano). Se mantiene la mezcla resultante a 0ºC durante 2 horas y se añade después 4-bromobutirato de etilo (22 mmol) en THF gota a gota a lo largo de 10 minutos. Se calienta entonces la mezcla resultante hasta que se ha consumido el material de partida, como se indica por TLC. Después de esto, se enfría la mezcla de reacción a 0ºC y se añade cuidadosamente ácido clorhídrico acuoso al 10%. Se separan las dos capas y la capa acuosa se extrae con acetato de etilo. Los extractos orgánicos reunidos se lavan entonces secuencialmente con solución acuosa 1 M de hidróxido de sodio, agua y salmuera. Después de secado (Na_{2}SO_{4}), se separan los disolventes a presión reducida y se purifica el residuo usando cromatografía rápida sobre gel de sílice para obtener dos productos, uno orto y uno meta en relación con el grupo acetato aromático.

ii) Preparación de PS-62

Se disuelve el éster del orto-aducto (5 mmol) en metanol acuoso al 5% y se añade a esto hidróxido de sodio (5 mmol). Una vez consumido el material de partida, como se indica por TLC, se ajusta el pH a pH 2 por adición cuidadosa de ácido clorhídrico acuoso 1 M y se extrae después con acetato de etilo. Después de secado (MgSO_{4}) y separación de los disolventes a presión reducida, se purifica el producto usando cromatografía rápida en gel de sílice para obtener el ácido libre deseado.

A una solución del ácido libre (1,55 x 10^{-4} mol) en DMF (0,4 ml), se añade DIEA (3,1 x 10^{-4} mol) seguido por HATU (1,86 x 10^{-4} mol). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añade la solución de color amarillo pálido gota a gota a rCTB (2 mg, 3,4 x 10^{-8} mol [15,5 x 10^{-6} moles de lisinas]) en 4 ml de tampón de borato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 0,15 M a pH 8,5. Se mantiene la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora, se neutraliza y después se dializa exhaustivamente frente a PBS a 4ºC para obtener el PS-62. El conjugado se analiza usando análisis espectral de masas con desorción láser para determinar el número de haptenos.

iii) Preparación de PS-63

Se disuelve el éster del meta-aducto (5 mmol) en metanol acuoso al 5% y se añade a esto hidróxido de sodio (5 mmol). Una vez consumido el material de partida, como se indica por TLC, se ajusta el pH a pH 2 por cuidadosa adición de ácido clorhídrico acuoso 1 M y se extrae después con acetato de etilo. Después de secado (MgSO_{4}) y separación de los disolventes a presión reducida, se purifica el producto usando cromatografía rápida en gel de sílice para obtener el ácido libre deseado.

A una solución del ácido libre (1,55 x 10^{-4} mol) en DMF (0,4 ml), se añade DIEA (3,1 x 10^{-4} mol) seguido por HATU (1,86 x 10^{-4} mol). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añade gota a gota la solución de color amarillo pálido a rCTB (2 mg, 3,4 x 10^{-8} mol [15,5 x 10^{-6} moles de lisinas]) en 4 ml de tampón de borato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 0,15 M a pH 8,5. Se mantiene la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora, se neutraliza y después se dializa exhaustivamente frente a PBS a 4ºC para obtener el PS-63. El conjugado se analiza usando análisis espectral de masas con desorción láser para determinar el número de haptenos.

Ejemplo 6 Preparación de PS-64 i) Preparación de codeína acetilada

A una solución de codeína (10 mmol) en cloruro de metileno se añade trietilamina (12 mmol), seguida por anhídrido acético (12 mmol). Una vez consumido el material de partida, como se indica por TLC, se separan los disolventes a presión reducida y se purifica el residuo usando cromatografía rápida en gel de sílice para obtener el producto acetilado deseado.

ii) Desmetilación de la codeína acetilada

A una solución del producto acetilado (10 mmol) en cloruro de metileno se añade tribromuro de boro (12 mmol de una solución 1,0 M en cloruro de metileno) gota a gota. Una vez consumido el material de partida, como se indica por TLC, se añade cuidadosamente metanol anhidro y se concentra la mezcla a presión reducida. Se disuelve el residuo en metanol, se vuelve a concentrar a presión reducida y se purifica después usando cromatografía rápida en gel de sílice para obtener el alcohol deseado.

iii) Succinilación de la codeína acetilada desmetilada

A una solución del alcohol (10 mmol) en cloruro de metileno se añade trietilamina (12 mmol), seguida por anhídrido succínico (20 mmol). Se calienta a reflujo la mezcla resultante hasta que se ha consumido el material de partida, como se indica por TLC. Después de esto se separan los disolventes a presión reducida y se purifica el residuo usando cromatografía rápida en gel de sílice para obtener el hemisuccinato deseado.

iv) Preparación de PS-64

A una solución del hemisuccinato (1,55 x 10^{-4} mol) en DMF (0,4 ml), se añade DIEA (3,1 x 10^{-4} mol) seguido por HATU (1,86 x 10^{-4} mol). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añade gota a gota la solución de color amarillo pálido a rCTB (2 mg, 3,4 x 10^{-8} mol [15,5 x 10^{-6} moles de lisinas]) en 4 ml de tampón de borato de sodio 0,1 M, cloruro de sodio 0,15 M a pH 8,5. Se mantiene la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora, se neutraliza y después se dializa exhaustivamente frente a PBS a 4ºC para obtener el PS-64. El conjugado se analiza usando análisis espectral de masas con desorción láser para determinar el número de haptenos.

Ejemplo 7 Ensayos para detectar la actividad funcional de CTB

Para analizar la actividad funcional de CTB solo, se desarrollaron dos ensayos. En primer lugar, se midió la unión de CTB a las células usando citometría de flujo. Se incubaron las células con CTB, seguido por un antisuero de cabra anti-CTB comercial y un anticuerpo secundario anti-cabra marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Figura 13). La CTB pentamérica nativa se unió a las células, causando una notable subida en la intensidad de la fluorescencia. La CTB monomérica fue incapaz de unirse a las células en este ensayo. En segundo lugar, se preparó un ELISA para medir la capacidad de CTB para unirse al gangliósido GM1. Las placas de ELISA se recubrieron con gangliósido GM1 y se incubaron con concentraciones variables de CTB. Se detectó la unión usando un anticuerpo anti-CTB (o solución salina fisiológica como control) seguido por un segundo anticuerpo marcado con enzima y desarrollo con sustrato. Este ensayo proporcionó una medida cuantitativa y extremadamente sensible de la capacidad de la CTB pentamérica para unirse a los gangliósidos GM1. Estos ensayos se usan para monitorizar la actividad funcional de los conjugados CTB recombinantes y haptenados antes de los experimentos in vivo.

Ejemplo 8 Inducción de la respuesta mucosal

Se ha demostrado en muchos sistemas que la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) retiene la actividad de la toxina del cólera intacta, incluyendo la inducción de una respuesta mucosal de anticuerpos. Por tanto, este portador debe inducir una fuerte respuesta de anticuerpo IgA anti-heroína o anti-nicotina. En adición, la primera dosis de sensibilización oral debe inducir una fuerte respuesta sistémica de anticuerpo IgG.

Un modo efectivo de producir una respuesta inmunitaria en el tracto respiratorio es liberar directamente el antígeno a estos sitios. El antígeno se administra en solución salina fisiológica, con la CTB actuando como su propio adyuvante. Para confirmar la capacidad de CTB de sensibilizar por administración a una superficie IgA mucosal, se realizan experimentos iniciales con portador solo. Los ratones se sensibilizan con 50 \mug de la CTB o conjugado heroína-CTB o nicotina-CTB por tres vías: oralmente, nasalmente o intratraquealmente. Para la administración oral de los ratones, se aplican 250 \mug de conjugado heroína-CTB o nicotina-CTB o CTB sola, intragástricamente, o directamente al estómago, mediante el uso de una aguja roma de 23G. Catorce días después de la sensibilización, los ratones reciben dosis de refuerzo usando el mismo protocolo. La administración nasal es una vía común y sencilla para sensibilizar. Se aplica el antígeno a cada orificio nasal de un ratón ligeramente anestesiado, con un volumen total de 50 \mul por ratón. Catorce días después de la sensibilización, los ratones reciben dosis de refuerzo usando el mismo protocolo. La administración nasal es fácilmente adaptable para aplicación humana como una pulverización nasal. La vacunación nasal ha sido usada satisfactoriamente con las vacunas de gripe vivas (Walker et al. (1994) Vaccine 12: 387-399).

La inmunización intratraqueal aplica directamente el antígeno al tracto respiratorio inferior, con lo que aumenta la inmunidad en los pulmones. Se anestesian los ratones con un cocktail de quetamina y xilazina. Se colocan los animales en un aparato que mantiene su boca abierta y expone la tráquea; se visualiza la tráquea con una sonda ligera de fibra óptica. Se usa una aguja roma de 23 gauge para administrar 50 \mul de solución a los pulmones. Catorce días después de la sensibilización, los ratones reciben dosis de refuerzo usando el mismo protocolo.

Se sacrifican los animales por asfixia con CO_{2} a puntos de tiempo variables después de las dosis de refuerzo (14, 21, o 28 días) y se recogen los fluidos de lavado nasal y broncoalveolar y se determina en ellos la IgA específica para el conjugado administrado. El fluido de lavado nasal se obtiene lavando la cavidad nasal cuatro veces con un total de 1 ml de PBS como está descrito (Tamura et al. (1989) Vaccine 7: 257-262). El fluido de lavado broncoalveolar se obtiene exponiendo quirúrgicamente la tráquea, inyectando 0,5 ml de PBS en los pulmones, y lavando tres veces como está descrito (Nedrud et al. (1987) J. Immunol. 139: 3484-3492). Después de la centrifugación para separar las células, se determina en las células la IgA específica del antígeno mediante ELISA usando un segundo anticuerpo específico de IgA. La IgG específica de la heroína o específica de la nicotina se mide en los lavados nasales y pulmonares, ya que ha sido descrito que la IgG es frecuentemente detectable en ambos y es importante en el pulmón (Cahill et al. (1993) FEMS Microbiol. Lett. 107: 211-216).

La vía de inmunización oral se evalúa en cuanto a su capacidad para generar IgA específica de la heroína o específica de la nicotina en los lavados intestinales y se compara con otras vías en cuanto a su capacidad para generar suero Ig específico para la heroína o la nicotina. La administración oral es particularmente preferida en los seres humanos debido a la facilidad de administración. Las vías de administración intranasal e intratraqueal se comparan directamente en cuanto a su capacidad para inducir una respuesta de IgA en ambos fluidos de lavado, pulmonar o nasal. Cualquiera de las vías que se encuentre que es la más potente, es preferida y usada para el resto de los experimentos. Si las dos vías son de una eficacia comparable, la inmunización nasal es la preferida debido a su simplicidad.

Para la máxima protección contra la heroína o la nicotina, las respuestas de IgG sistémica e IgA mucosal pueden ser maximizadas las dos. Por tanto, se prefieren tanto una inyección sistémica con el conjugado heroína-CTB o nicotina-CTB en alúmina (o algún otro adyuvante) como un enfrentamiento mucosal con el conjugado para sensibilizar de modo efectivo ambos compartimentos. Se comparan tres grupos. En primer lugar, se sensibilizan los ratones sistémicamente, seguido de un enfrentamiento mucosal después de 14 días. En segundo lugar, se sensibilizan los ratones mucosalmente, seguido de un enfrentamiento sistémico después de 14 días. En tercer lugar, se sensibilizan los ratones tanto sistémicamente como mucosalmente al mismo tiempo, seguido de un idéntico refuerzo después de 14 días. Los ratones control se sensibilizan solo mucosalmente o solo sistémicamente. En cada caso, la eficacia en el enfrentamiento se determina midiendo los títulos de ambos anticuerpos IgG y IgA.

Como una medida inicial de la eficacia in vivo de los anticuerpos mucosales anti-heroína o anti-nicotina, se mide el cambio respectivo en la farmacocinética de la droga para la heroína o la nicotina administradas mucosalmente.

Ejemplo 9 Transferencia pasiva de inmunoglobulina inmune en humanos

Un conjunto de donantes humanos se inmuniza con un conjugado de la invención usando regímenes óptimos de inmunización como se describe en los Ejemplos. A diferentes tiempos, se toma sangre de los donantes por venipunción y los títulos de anticuerpo anti-hapteno se ensayan por ELISA. El plasma hiperinmune de múltiples donantes se reúne en un fondo y se aísla la fracción IgG mediante fraccionamiento con alcohol frío. La preparación de anticuerpo se tampona, estabiliza, conserva y estandariza según sea necesario para las preparaciones de anticuerpo hiperinmune para uso humano. El nivel de anticuerpo anti-hapteno se estandariza mediante ELISA u otro ensayo basado en anticuerpos.

Se administra una dosis apropiada de anticuerpo purificado a 20 pacientes intramuscularmente o intravenosamente con o sin la vacuna de hapteno-CTB, pero no en el mismo sitio anatómico que la vacuna. La dosis apropiada se determina ensayando los niveles séricos de los receptores en un ensayo de población de pacientes mediante ELISA u otro ensayo basado en anticuerpos a las 24 horas o a otro punto de tiempo apropiado después de la inyección de la preparación de anticuerpo hiperinmune y/o ensayando la eficacia de diferentes dosis para inhibir los efectos de la heroína o nicotina.

La globulina inmune transferida pasivamente inhibe los efectos de la heroína o nicotina en los pacientes. El uso de donantes humanos, anticuerpos policlonales, y el gran número de donantes en el fondo de donantes limita la posibilidad de respuesta inmunitaria por los pacientes al anticuerpo transferido.

Ejemplo 10 Purificación a escala preparativa de rCTB

La rCTB procedente de V. cholerae suministrado por SBL Vaccin AB en tampón de fosfato 0,22 M de pH 7,3, NaCl al 0,9% se filtró por diálisis a fosfato de sodio 20 mM, pH 6,5. Se purificó entonces una muestra usando cromatografía de intercambio catiónico sobre resina Pharmacia SP Sepharose Fast Flow con Tampón A: fosfato de sodio 20 mM pH 6,5 y Tampón B: fosfato de sodio 20 mM pH 6,5, NaCl 1,0 M como los tampones de elución. Se analizaron las fracciones purificadas por SDS-PAGE, tiñendo con Daichi Silver Stain. Se filtró la muestra purificada a través de un filtro de 0,22 micras y se mantuvo estéril a 4ºC.

Ejemplo 11

Método A (Analítico): Se prepararon muestras para HPLC analítica de fase inversa (RP HPLC) por el siguiente método: 100 \mul de conjugado CTB-5,200 se precipitaron añadiendo 1,0 ml de etanol absoluto y congelando a -80ºC durante la noche. Se centrifugó el conjugado a 14000 rpm durante 20 minutos a 4ºC y después se separó el etanol por decantación y se secó el sedimento al aire. Se resuspendió el sedimento en 25 \mul de acetonitrilo al 20% con 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) y se midió la concentración de proteína por el ensayo de Pierce Micro BCA.

Se analizó el conjugado usando una columna C18 de fase inversa (Vydac No. 218TP5215 de agujero estrecho)
2,1 \times 150 mm; tamaño de partícula: 5 \mu; caudal: 200 \mul/min.; Tampón A: 100% de agua, 0,1% de TFA; Tampón B: 80% de acetonitrilo, 0,08% de TFA. El gradiente empezó a 16%, aumentó a 56% a lo largo de un periodo de 50 minutos, aumentó a 80% a los 60 minutos, y se mantuvo durante 10 minutos.

Método B (Semi-preparativo): Se prepararon muestras para RP HPLC a escala semi-preparativa como sigue: dos viales de CTB-5,200 liofilizados se resuspendieron en acetonitrilo al 20% 0,1% de TFA, se filtraron por filtración estéril, y se cuantificaron por el Pierce Micro BCA. Se hicieron dos inyecciones de 1,24 mg cada una sobre un sistema RP HPLC semi-preparativa usando una columna C18 (Vydac No. 218TP1520) 10 \times 50 mm, tamaño de partícula: 5 \mu; caudal: 1,8 ml/min; Tampón A: 0,1% de TFA en agua; Tampón B: 0,08% de TFA en acetonitrilo al 80%. Se usó un gradiente en etapas como sigue: 20% de B durante 10 minutos, 35% de B durante 40 minutos, 55% de B durante 5 minutos, terminando con un lavado de 5 minutos a 100% de B. Se recogieron los picos y se liofilizaron inmediatamente.

Claims (11)

1. Un conjugado hapteno-portador que comprende al menos un hapteno derivado de nicotina y al menos un portador que contiene un epítopo de las células T y en el que dicho hapteno y dicho portador están unidos por la rama CJ11, que se identifica en la solicitud como YCO(CH_{2})nCOQ, y en la que Y se selecciona entre S, O y NH, y Q es el portador y n es un número entero de 2 a 20.

2. Un conjugado hapteno-portador según la reivindicación 1, en el que n de la rama CJ11, que se identifica en la solicitud como YCO(CH_{2})nCOQ, es 2, y en la que Y es NH.

3. Un conjugado hapteno-portador según las reivindicaciones 1 o 2, en el que el portador se selecciona de: proteínas o péptidos, toxinas o productos bacterianos, subvirales, lectinas, alergenos y fragmentos de alergenos, antígeno proteico de la malaria, péptidos multi-antigénicos artificiales, y sus modificaciones.

4. El conjugado hapteno-portador de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que más de un hapteno está acoplado con el portador.

5. El uso de un conjugado hapteno-portador que comprende al menos un hapteno derivado de nicotina y al menos un portador que contiene un epítopo de las células T y en el que dicho hapteno y dicho portador están unidos por la rama CJ11, que se identifica en la solicitud como YCO(CH_{2})nCOQ y en la que Y se selecciona entre S, O y NH, y Q es el portador y n es un número entero de 2 a 20, en la preparación de una composición terapéutica para el tratamiento de la drogadicción en un ser humano.

6. El uso según la reivindicación 5, en el que dicha preparación farmacéutica comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. El uso según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que dicha preparación farmacéutica se puede administrar mucosalmente y comprende microesferas de copolímeros opcionalmente de co-polímero poli(lactida-co-glicolida).

8. El uso según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que dicha preparación farmacéutica se puede administrar tópicamente y cuya preparación tiene opcionalmente una viscosidad dinámica mayor que el agua.

9. El uso según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que dicha preparación farmacéutica se puede administrar como una solución estéril inyectable.

10. El uso según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que dicha preparación farmacéutica comprende adyuvantes.

11. Un procedimiento para preparar un conjugado según la reivindicación 1, que comprende unir el hapteno y el portador que contiene un epítopo de las células T por reticulación con un compuesto seleccionado entre: un éster activo derivado de ácido carboxílico, un anhídrido mixto, una azida de acilo, un haluro de acilo, un imino-éster.