ES2263250T3

ES2263250T3 - Un adenovirus quimerico.

Info

Publication number: ES2263250T3
Application number: ES99202233T
Authority: ES
Inventors: Menzo Jans Emco Havenga; Ronald Vogels; Abraham Bout
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 1998-07-08
Filing date: 1999-07-08
Publication date: 2006-12-01
Anticipated expiration: 2019-07-08
Also published as: CA2303477C; JP2002520026A; WO2000003029A3; AU4935699A; US20060014276A1; ATE325200T1; DE69931112T2; EP0978566B1; US20030073072A1; DE69931112D1; US7749493B2; EP0978566A3; WO2000003029A2; NZ503018A; AU765276B2; EP0978566A2; JP4472178B2; US20030017138A1; CA2303477A1

Abstract

La presente invención proporciona procedimientos y sistemas de vectores para la generación de adenovirus quiméricos recombinantes. Estos adenovirus híbridos contienen un genoma derivado de diferentes serotipos de adenovirus. En particular, se describen nuevos adenovirus híbridos con propiedades mejoradas para fines de terapia genética. Estas propiedades incluyen una sensibilidad disminuida hacia anticuerpos neutralizantes, un intervalo de huéspedes modificado, un cambio en el título al cual los adenovirus pueden crecer, la capacidad para escapar a la retención en el hígado en la distribución sistémica in vivo, y ausencia o descenso de la infección en las células que presentan antígenos (APC) del sistema inmune, como macrófagos o células dendríticas. Estos adenovirus quiméricos representan, por tanto, herramientas mejoradas para la terapia genética y vacunación, ya que superan las limitaciones observadas con los adenovirus del serotipo subgrupo C utilizados comúnmente.

Description

Un adenovirus quimérico.

La invención se refiere al campo de la genética molecular y la medicina. En particular la presente invención se refiere al campo de la terapia génica, más concretamente a la terapia génica en la que se utilizan virus, especialmente adenovirus.

En terapia génica, la información genética es trasladada a una célula huésped con el fin de corregir (suplementar) una deficiencia genética de dicha célula, o bien inhibir una función no deseada de dicha célula, o bien eliminar dicha célula huésped. Por supuesto también se puede pretender proporcionar la información genética a la célula huésped una función deseada, por ejemplo suministrar una proteína secretada para tratar otras células del huésped, etc.

De este modo existen básicamente tres enfoques diferentes en la terapia génica, uno dirigido a compensar una deficiencia presente en un huésped (mamífero); el segundo dirigido a la separación o eliminación de sustancias no deseadas (organismos o células) y el tercero a proveer a una célula de una función deseada.

Para el propósito de la terapia génica, se han propuesto adenovirus como vehículos adecuados para trasladar genes al huésped. Los vectores de transferencia génica derivados de adenovirus (también denominados vectores adenovirales) tienen numerosos rasgos que los hacen particularmente útiles para la transferencia génica. 1) la biología de los adenovirus está caracterizada con detalle, 2) el adenovirus no se asocia con una patología humana grave, 3) el virus es extremadamente eficaz al introducir su ADN en la célula huésped, 4) el virus puede infectar una amplia variedad de células y tiene una amplia gama de huéspedes, 5) el virus puede ser producido a títulos elevados en grandes cantidades, y 6) el virus se puede volver carente de replicación mediante la deleción de la región temprana 1 (E1) del genoma viral (Brody y col., 1994). No obstante, todavía existen desventajas asociadas con el uso de vectores adenovirales. Típicamente los adenovirus, especialmente los serotipos bien investigados logran normalmente una respuesta inmune por parte del huésped en el cual son introducidos. Asimismo, aunque el virus en términos generales tiene una amplia gama de infección, existe un problema en el redireccionamiento a ciertas células y tejidos. Asimismo, la replicación y otras funciones del adenovirus no siempre se ajustan bien a las células a las que se va a suministrar el material genético adicional.

El genoma del adenovirus es una molécula de ADN de doble hebra lineal de aproximadamente 36.000 pares de bases. El ADN del adenovirus contiene Repeticiones Terminales Invertidas (ITR) idénticas de aproximadamente 90-140 pares de bases con una longitud exacta dependiendo del serotipo. Los orígenes de replicación virales están en las ITR exactamente en los extremos del genoma. La mayor parte de los vectores adenovirales utilizados en la actualidad en la terapia génica tienen una deleción en la región E1, donde se puede introducir información genética novedosa. La deleción de E1 vuelve el virus recombinante carente de replicación (Levrero y col., 1991). Se ha demostrado ampliamente que el adenovirus recombinante, en particular el serotipo 5 es adecuado para la transferencia eficaz de genes in vivo al hígado, el epitelio de las vías respiratorias y los tumores sólidos en modelos animales y xenoinjertos humanos en ratones carentes de sistema inmune (Bout, 1996; Blaese y col., 1995). De este modo, los métodos preferidos para la transferencia génica in vivo a las células diana hace uso de vectores adenovirales como vehículos de reparto de genes.

En la actualidad, se han propuesto seis subgrupos diferentes de adenovirus humanos que en total abarcan 51 serotipos de adenovirus distintos (ver Tabla 1). Además de estos adenovirus humanos se han identificado un extenso número de adenovirus animales (ver Ishibashi y col. 1983).

Un serotipo se define basándose en su carácter distintivo inmunológico determinado mediante la neutralización cuantitativa con antisueros animales (caballo, conejo). Si la neutralización muestra un cierto grado de reacción cruzada entre dos virus, se supone el carácter distintivo del serotipo si A) las hemaglutininas no están relacionadas, como muestra la carencia de reacción cruzada sobre la hemaglutinación-inhibición, o B) existen diferencias biofísicas/bioquímicas sustanciales en el ADN (Francki y col. 1991). Los nueve serotipos identificados en último lugar (42-51) fueron aislados por primera vez a partir de pacientes infectados por HIV (Hierholzer y col. 1988; Schnurr y col. 1993; De Jong y col. 1988). Por razones no bien comprendidas, la mayor parte de tales pacientes inmunocomprometidos difunden adenovirus que habían sido aislados raramente o nunca a partir de individuos inmuno-competentes (Hierholzer y col. 1988, 1992; Khoo y col. 1995, De Jong y col. 1998).

Además de las diferencias en la sensibilidad contra los anticuerpos neutralizantes de diferentes serotipos de adenovirus, también se ha demostrado que los adenovirus del subgrupo C tales como Ad2, y Ad5 se unen a diferentes receptores en comparación con los adenovirus del subgrupo B tales como Ad3 (Defer y col. 1990). Del mismo modo, se demostró que la especificidad de receptor podía ser alterada intercambiando la proteína de la protuberancia de Ad3 por la de Ad5, y viceversa (Krasnykh y col. 1996; Stevenson y col. 1995, 1997). El serotipo 5 de adenovirus es el más ampliamente utilizado para los fines de la terapia génica. De un modo similar a los serotipos 2, 4 y 7, el serotipo 5 tiene una afiliación natural hacia el epitelio del pulmón y otros tejidos respiratorios. En contraste, se sabe que, por ejemplo, los serotipos 40 y 41 tienen una afiliación natural hacia el tracto gastrointestinal. Para una revisión detallada de la asociación de enfermedades de los diferentes serotipos de adenovirus ver la tabla 2. Los serotipos descritos antes, difieren al menos en las proteínas de la cápsida (base pentónica, hexona), las proteínas responsables de la unión celular (proteína de la fibra), y las proteínas implicadas en la replicación del adenovirus.

Uno de los principales problemas de la terapia génica de adenovirus es de este modo que ninguno de los serotipos descritos antes es idealmente adecuado para trasladar material genético adicional a las células huésped. Algunos tienen una gama de huésped algo limitada, pero tienen la ventaja de ser menos inmunogénicos, algunos son de otra manera. Algunos tienen el problema de ser de una virulencia limitada, pero tienen una amplia gama de huésped y/o una inmunogenicidad reducida. Para hacer las cosas aún más complicadas esta variación en los serotipos de adenovirus también depende mucho del huésped que se vaya a tratar. Algunos huéspedes pueden haberse encontrado ya con ciertos serotipos y por tanto habrán montado una fuerte respuesta inmune a dicho serotipo o a un serotipo relacionado. Las personas expertas en la técnica saben que existen muchas otras variaciones del mismo tema.

La presente invención hace uso ahora del hecho de que algunos adenovirus tienen una inmunogenicidad más baja que otros, los cuales sobresalen típicamente en uno de los otros requerimientos para un régimen de terapia génica eficaz, por ejemplo tienen una elevada especificidad por un cierto grupo de células huésped, una buena maquinaria de replicación en tales células huésped, una elevada velocidad de infección en ciertas células huésped, etc. De este modo la invención proporciona adenovirus quiméricos que tienen las propiedades útiles de al menos dos adenovirus de serotipos diferentes. Típicamente, son necsarios más de dos requerimientos de la lista no exhaustiva anterior para obtener un adenovirus capaz de transferir eficazmente material adicional a una célula huésped y por lo tanto la invención proporciona vectores derivados de adenovirus que pueden ser utilizados como casetes para insertar genes adenovirales diferentes de serotipos adenovirales diferentes en los sitios requeridos para obtener un vector capaz de expresar adenovirus quiméricos, por medio de los cuales por supuesto también puede ser insertado un gen de interés por ejemplo en el sitio de E1 del adenovirus original del cual deriva el vector. De esta manera el adenovirus quimérico que va a ser producido puede ser adaptado a los requerimientos y necesidades de ciertos huéspedes que necesitan terapia génica para ciertos trastornos. Por supuesto para permitir esta producción se necesitará generalmente una célula de empaquetamiento con el fin de producir una cantidad suficiente de adenovirus quiméricos seguros.

Los vectores adenovirales son conocidos en la técnica. En WO98/22609 se describen vectores adenovirales quiméricos, en los que al menos un gen (que codifica la fibra, la hexona o la pentona) o una porción del mismo es remplazado por el correspondiente gen o porción del mismo de un segundo adenovirus perteneciente a un serotipo diferente. En WO96/26281 se describe un adenovirus recombinante que comprende una proteína de la fibra de un serotipo diferente. Ninguno de estos documentos describe o sugiere la elaboración de adenovirus quiméricos con una gama de huésped de infección alterada, donde la proteína de la fibra comprende un dominio de la protuberancia de adenovirus de serotipo 12, 16, 32, 40-S, 40-L, 49 o 51. Los documentos tampoco describen los vectores adenovirales recombinantes para la producción de tales virus.

De este modo en una realización la invención proporciona un adenovirus quimérico que comprende al menos una parte de una proteína de la fibra y/o una proteína implicada en la replicación de un serotipo de adenovirus que proporciona al virus quimérico una gama de huésped deseada y/o propiedades de replicación mejoradas y al menos una parte de una proteína de la pentona o la hexona de otro serotipo de adenovirus menos antigénico dando como resultado un adenovirus quimérico menos antigénico. Típicamente semejante virus será producido utilizando un vector (típicamente un plásmido, un cósmido o un sistema de baculovirus cuyo vector también es por supuesto parte de la presente invención. Un vector preferido es un vector que puede ser utilizado para elaborar un virus recombinante quimérico específicamente adaptado al huésped que va a ser tratado y al trastorno que va a ser tratado. Semejante vector es otra realización de la presente invención. De este modo la invención también proporciona un vector recombinante derivado de un adenovirus que comprende al menos una ITR y una señal de empaquetamiento, que tiene un sitio de inserción para una secuencia de ácido nucleico de interés, y adicionalmente que tiene un sitio de inserción para insertar funcionalmente un gen que codifica una proteína de la pentona y/o la hexona de un primer serotipo de adenovirus y que tiene un sitio de inserción para un gen que codifica una proteína de la fibra de un segundo adenovirus de un serotipo diferente, y/o un sitio de inserción para un gen derivado de un serotipo que tiene características mejoradas en la función llevada a cabo por ese gen o su producto. Típicamente la invención proporciona casetes que permiten la producción de cualquier adenovirus quimérico deseado, sea éste derivado solamente de dos serotipos o de tantos como sea necesario para obtener las características deseadas, por medio de lo cual no siempre es necesario que todas las características sean las mejores observadas como propiedades individuales. Puede incluso no ser necesario, por ejemplo, alterar siempre la pentona y/o la hexona junto con otra parte de los genes de adenovirus. A veces no se necesita alterar la inmunogenicidad junto con otras propiedades. No obstante, se prefiere utilizar genes de la pentona y/o la hexona de serotipos de adenovirus menos inmunogénicos. Un importante rasgo de la presente invención es el método para producir el virus quimérico. Típicamente, no se quiere administrar un lote de adenovirus a la célula huésped que contenga adenovirus de replicación competente, aunque esto no siempre es cierto. En general por lo tanto se desea omitir numerosos genes (al menos sólo uno) del genoma viral del vector que codifica el virus quimérico y proporcionar estos genes al genoma de la célula a la cual se lleva el vector para producir adenovirus quiméricos. Semejante célula se denomina normalmente célula de empaquetamiento. La invención también proporciona una célula de empaquetamiento para producir un adenovirus quimérico según la invención, que comprende todos los elementos en trans necesarios para la producción de adenovirus no presentes en el vector adenoviral según la invención. Típicamente el vector y la célula de empaquetamiento tienen que ser adaptados entre sí ya que tienen todos los elementos necesarios, excepto que no tienen elementos solapantes que conduzcan a un virus de replicación competente mediante recombinación.

De este modo la invención también proporciona un estuche de parte que comprende una célula de empaquetamiento según la invención y un vector recombinante según la invención por medio del cual no hay esencialmente una secuencia solapante que conduzca a la recombinación dando como resultado la producción de adenovirus de replicación competente entre dicha célula y dicho vector.

Con el fin de poder adaptar precisamente el vector viral y proporcionar al virus quimérico las propiedades deseadas a voluntad, se prefiere proporcionar un banco de genes adenovirales por medio del cual los genes estén localizados en los sitios de restricción. Típicamente se prefiere tener las mismas clases de genes de diferentes serotipos dentro de los mismos sitios de restricción y tener los mismos sitios de restricción en el vector adenoviral utilizado para producir el virus quimérico. Si todos los sitios para los diferentes genes son únicos se ha elaborado un sistema para entresacar y elegir. Se puede cortar un gen de la pentona del serotipo deseado del banco e insertarlo en el mismo sitio en el vector. Después se puede utilizar una enzima de restricción diferente para cortar un gen de replicación del banco de un serotipo diferente utilizando otra enzima de restricción e insertar ese gen en el correspondiente sitio de restricción en el vector quimérico. De este modo se prefiere tener un vector según la invención en el que los sitios de inserción sean diferentes y preferiblemente sitios de restricción únicos. Preferiblemente este vector se combina con un banco que tiene los correspondientes genes en los mismos sitios de restricción. Los métodos para usar este banco y el vector están dentro del conocimiento práctico de la técnica y son parte de la presente invención. Típicamente semejante método comprende numerosas etapas de restricción y ligadura y la expresión del resultado en una célula de empaquetamiento. Asimismo se puede utilizar un banco a partir del cual se obtienen los diferentes genes adenovirales deseados por medio de la recombinación homóloga o una recombinación de restricción y recombinación. De este modo la invención proporciona un método para producir un adenovirus quimérico que tenga una gama de huésped deseada y una antigenicidad reducida, que comprende proporcionar un vector según la invención que tenga los sitios de inserción deseados, insertar en dicho vector al menos una parte funcional de una proteína de la pentona o la hexona derivada de un serotipo de adenovirus que tenga una antigenicidad relativamente baja, insertar al menos una parte funcional de una proteína de la fibra de un serotipo de adenovirus que tenga la gama de huésped deseada y transfectar dicho vector en una célula de empaquetamiento según la invención y permitir la producción de partículas virales quiméricas. Por supuesto también se pueden insertar otras combinaciones de otros genes virales que se originan a partir de serotipos diferentes como se ha descrito antes. Una respuesta inmunogénica a adenovirus que se produce típicamente es la producción de anticuerpos neutralizadores por parte del huésped. Esta es típicamente una razón para seleccionar una pentona, hexona y/o fibra de un serotipo menos inmunogénico.

Por supuesto puede no ser necesario elaborar adenovirus quiméricos que tengan proteínas completas de diferentes serotipos. Está dentro del conocimiento práctico de la técnica producir proteínas quiméricas, por ejemplo en el caso de las proteínas de la fibra es muy posible tener la base de un serotipo y el eje y la protuberancia de otro serotipo. De esta manera se hace posible tener las partes de la proteína responsable de ensamblaje de las partículas virales originadas a partir de un serotipo, intensificando de ese modo la producción de partículas virales intactas. De este modo la invención también proporciona un adenovirus quimérico según la invención, donde las proteínas de la hexona, la pentona y/o la fibra son proteínas quiméricas que se originan a partir de serotipos de adenovirus diferentes. Además de generar adenovirus quiméricos intercambiando los genes (proteínas) de la hexona, la pentona, la fibra etc. de tipo salvaje completos o partes de los mismos, también está dentro del alcance de la presente invención insertar genes (proteínas) de la hexona, pentona, fibra etc. llevando a cabo mutaciones tales como mutaciones puntuales, deleciones, inserciones etc. que pueden ser rastreadas fácilmente en cuanto a las características preferidas tales como estabilidad a la temperatura, ensamblaje, anclaje, infección redireccionada, respuesta inmune alterada etc. De nuevo se puede producir también otras combinaciones quiméricas y están dentro del alcance de la presente invención.

La disponibilidad de un banco de ácidos nucleicos derivado de diferentes serotipos permite, entre otros, la generación de un banco de adenovirus quiméricos. Por lo tanto la invención proporciona adicionalmente un banco de adenovirus quiméricos. En una realización la invención proporciona un banco de adenovirus quiméricos donde dichos adenovirus comprenden cápsidas quiméricas, es decir que comprenden proteínas de la cápsida derivadas al menos en parte de al menos dos serotipos de adenovirus diferentes. Preferiblemente, un ácido nucleico y/o una proteína o partes de los mismos, de al menos un adenovirus representativo de cada subgrupo de adenovirus está representado en dicho banco de adenovirus (quiméricos). Preferiblemente, el ácido nucleico y/o la proteína o las partes de los mismos derivan de más de uno representativo de cada subgrupo de adenovirus. Muy preferiblemente, dicho banco comprende un ácido nucleico y/o una proteína o una parte de los mismos, esencialmente de cada grupo representativo conocido de cada subgrupo de adenovirus. Se desea el ácido nucleico y/o la proteína o las partes de los mismos derivados de más de uno de dichos adenovirus representativos de cada subgrupo de adenovirus de dicho banco (quimérico) porque una propiedad deseable puede no ser una propiedad general del subgrupo. Asimismo, una propiedad deseable de un subgrupo de adenovirus puede ser expresada en diferentes cantidades en diversos miembros del subgrupo. Asegurarse de que más de un representante de un subgrupo está representado en el banco garantiza de este modo la selección de la mejor expresión de la propiedad deseada.

Típicamente, se utiliza un banco de adenovirus quiméricos o una parte del mismo en análisis de rastreo para determinar las propiedades de dichos adenovirus quiméricos. Cualquier adenovirus quimérico concreto que comprenda propiedades deseables concretas puede ser identificado de ese modo y posteriormente ser utilizado, por ejemplo, en el desarrollo de un vehículo de reparto de ácido nucleico mejorado. Entre las propiedades deseables que dicho banco de adenovirus quimérico puede rastrear se incluyen, pero no están limitadas a, especificidad de la célula diana, inmunogenicidad reducida, inmunogenicidad aumentada, neutralización re-dirigida, hemaglutinación re-dirigida, eficacia de infección mejorada, toxicidad reducida, replicación mejorada y/o farmacocinética mejorada tal como distribución tisular alterada tras la administración in vivo. La comparación de las propiedades de adenovirus quiméricos diferentes puede conducir a la delineación de elementos de adenovirus implicados en proporcionar un adenovirus con dicha propiedad. Semejante conocimiento puede ser utilizado después para optimizar adicionalmente vehículos de reparto de ácidos nucleicos. En un aspecto la invención proporciona una selección de adenovirus (quiméricos) con una capacidad mejorada para transducir células de tipo macrófago o fibroblasto en comparación con el adenovirus 5, preferiblemente dichos adenovirus (quiméricos) comprende al menos parte de un tropismo tisular que determina parte de una proteína de la fibra de un adenovirus del subgrupo B, o un derivado y/o análogo de dicha proteína de la fibra. La invención proporciona adicionalmente una selección de adenovirus (quiméricos) con una capacidad mejorada para transducir células de músculo liso en comparación con el adenovirus 5, preferiblemente dichos adenovirus (quiméricos) comprenden al menos parte de una porción determinante del tropismo tisular de una proteína de la fibra de un adenovirus del subgrupo B, o derivado o análogo de dicha proteína de la fibra. Un banco de adenovirus quiméricos de la invención puede ser utilizado adicionalmente para estudiar la biología de los adenovirus. Semejante banco es, por ejemplo, muy adecuado para estudiar diferencias en la biología de los diversos serotipos de adenovirus. En un aspecto la invención proporciona una selección de adenovirus (quiméricos), capaces de transducir una célula CAR negativa. Preferiblemente dicha célula CAR negativa es una célula del líquido amniótico o un derivado de la misma. Preferiblemente dicha célula del líquido amniótico es una célula de los villi coriónicos o un derivado de la misma. Preferiblemente dicha célula CAR negativa es una célula hematopoyética CAR negativa, tal como, pero no limitada a, una célula precursora eritroide y/o una célula precursora de monocitos y/o derivados de las mismas. Preferiblemente dichos adenovirus (quiméricos) capaces de transducir una célula CAR negativa comprenden al menos una porción de unión al receptor de adenovirus de una proteína de la fibra de un adenovirus del subgrupo D o F.

En un aspecto la invención proporciona un adenovirus quimérico que comprende un patrón de neutralización re-dirigido comparado con el adenovirus 5. La neutralización re-dirigida es útil en numerosas circunstancias. Por ejemplo, pero no limitado a, rodear los anticuerpos neutralizadores pre-existentes en un paciente al que se ha administrado dicho adenovirus quimérico. Los anticuerpos neutralizadores pre-existentes neutralizarían el adenovirus y de ese modo disminuirían la cantidad eficaz del virus administrado. Normalmente este es un efecto no deseado por ejemplo en entornos de terapia génica donde un ácido nucleico debe ser repartido a las células diana. No obstante, los anticuerpos neutralizadores pre-existentes pueden resultar ventajosos por ejemplo en otras aplicaciones de la terapia génica cuando el ácido nucleico de interés repartido por medio de dicho adenovirus quimérico no debe ser repartido a las células de todo el organismo. El reparto local utilizando por ejemplo una aguja en un tejido sólido combinado con la presencia de anticuerpos neutralizadores en la sangre que puedan regular el adenovirus quimérico que trasciende puede ayudar en ese caso a contener la transducción en cierta área.

En otro aspecto la invención proporciona un adenovirus quimérico que comprende un patrón de hemaglutinación re-dirigido en comparación con el adenovirus 5. La hemaglutinación re-dirigida es útil es numerosas circunstancias. El material sometido a hemaglutinación es extraído preferentemente por los macrófagos y derivados y/o precursores. De este modo la hemaglutinación de un adenovirus quimérico es preferida en el caso en el que se desea el reparto intensificado de ácido nucleico a dichos macrófagos. No obstante, en general, las células diana no serán dichos macrófagos en aquellos casos en los que se desea una hemaglutinación reducida. Un adenovirus quimérico re-dirigido en su hemaglutinación es útil para muchas aplicaciones que la persona experta en la técnica puede pensar ahora y de este modo forman una parte integral de la presente invención.

Descripción detallada

Se ha demostrado en ratones que tras el reparto sistémico in vivo de adenovirus recombinante de serotipo 5 para fines de terapia génica aproximadamente el 99% del virus es atrapado en el hígado (Herz y col. 1993). Por lo tanto, la alteración de la gama de células huésped del adenovirus de serotipo para que sea capaz de dirigirse a otros órganos in vivo es el principal interés de la invención, concretamente combinado con otras alteraciones, en particular la inmunogenicidad.

La etapa inicial para una infección exitosa es la unión del adenovirus a su célula diana, un procedimiento mediado por la proteína de la fibra. La proteína de la fibra tiene una estructura trimérica (Stouten y col. 1992) con diferentes longitudes dependiendo del serotipo del virus (Signas y col. 1985; Kidd y col. 1993). Los diferentes serotipos tiene polipéptidos con extremos N y C estructuralmente similares, pero diferentes regiones del tallo medio. N-terminalmente, los primeros 30 aminoácidos están implicados en el anclaje de la fibra a la base pentónica (Chroboczeck y col. 1995), especialmente la región FNPVYP conservada en la cola (Arnberg y col. 1997). El extremo C, o protuberancia, es responsable de la interacción inicial con el receptor del adenovirus celular. Después de esta unión inicial la unión secundaria entre la base pentónica de la cápsida y las integrinas de la superficie celular conduce a la internalización de partículas virales en fosas recubiertas y endocitosis (Morgan y col. 1969; Svensson y col. 1984; Varga y col. 1992; Greber y col. 1993; Wickham y col. 1994). Las integrinas son \alpha\beta-heterodímeros de los cuales se han identificado al menos 14 subunidades \alpha y 8 subunidades \beta (Hynes y col. 1992). La disposición de las integrinas expresadas en las células es compleja y variará entre los tipos celulares y el entorno celular. Aunque la protuberancia contiene ciertas regiones conservadas, entre los serotipos, las proteínas de la protuberancia muestran un alto grado de variabilidad, indicando que existen diferentes receptores de adenovirus. Por ejemplo, se ha demostrado que los adenovirus del subgrupo C (Ad2, Ad5) y los adenovirus del subgrupo B (Ad3) se unen a diferentes receptores (Defner y col. 1990). La proteína de la fibra también contiene el antígeno \gamma específico del tipo, que junto con el antígeno \varepsilon de la hexona determina la especificidad del serotipo. El antígeno \gamma se localiza sobre la fibra y se sabe que consta de 17 aminoácidos (Eiz y col. 1997). Los anticuerpos anti-fibra del huésped son dirigidos por lo tanto a la estructura trimérica de la protuberancia. Los anticuerpos anti-fibra junto con los anticuerpos dirigidos contra las proteínas de la base pentónica y la hexona son responsables de la neutralización de las partículas de adenovirus. Primero los anticuerpos anti-fibra descubren las partículas de adenovirus después de lo cual la base pentónica es accesible a los anticuerpos anti-base pentónica (Gahery-Segard y col. 1998). Aunque esto parece ser un modo muy eficaz de neutralizar las partículas de adenovirus otros han
descrito que los anticuerpos anti-hexona son los más eficaces en la neutralización de las partículas (Gall y col. 1996).

Para obtener una infección re-dirigida de adenovirus recombinante de serotipo 5, ha habido diferentes enfoques o todavía están siendo investigados. Wickham y col. han alterado la unidad RGD (Arg, Gly, Asp) en la base pentónica que se cree que es responsable de la unión de la integrina \alphaV\beta3 y \alphaV\beta5 a la base pentónica. Ellos han remplazado esta unidad RGD por otra unidad peptídica que es específica para el receptor \alpha4\beta1. De este modo podría ser logrado el redireccionamiento del adenovirus a una célula diana específica (Wickham y col. 1995, 1996). Krasnykh y col. han hecho uso del bucle HI asequible de la protuberancia. Este bucle, basado en cristalografía de rayos X, está localizado en el exterior de la estructura trimérica de la protuberancia y por lo tanto se piensa que no contribuye a las interacciones intramoleculares de la protuberancia (Krasnykh y col. 1998). No obstante, no se había observado infección independiente de CAR completa.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método y los medios por medio de los cuales se pueden construir adenovirus con una respuesta inmune alterada, o con la ausencia o disminución de infección en células presentadoras de antígenos tales como las células dendríticas o los macrófagos. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar los métodos para la generación de adenovirus quiméricos como se ha descrito antes que puedan ser redireccionados a tipos celulares específicos in vitro así como tengan un tropismo alterado in vivo para ciertos tipos de células. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método y los medios por medio de los cuales puedan ser utilizados tales adenovirus como vehículo de reparto de ácido nucleico o proteína a un tipo de célula o tejido específico.

Se describe la generación de adenovirus quiméricos basados en adenovirus de serotipo 5 con genes tardíos modificados. Para este fin, se construyeron tres plásmidos, que contenían juntos el genoma del adenovirus de serotipo 5 completo. A partir de estos plásmidos los ADN que codificaban la proteína de la base pentónica, la proteína de la hexona, y la proteína de la fibra fueron separados y remplazados por secuencias de ADN ligador que facilitan una clonación fácil. Estos plásmidos servían con posterioridad como molde para la inserción de ADN que codificaba la proteína de la base pentónica, la proteína de la hexona, y la proteína de la fibra derivadas de diferentes serotipos de adenovirus (humanos o animales). Los ADN derivados de los diferentes serotipos fueron obtenidos utilizando la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa combinada con oligonucleótidos (degenerados). En la primera localización E1 del genoma del adenovirus de serotipo 5, puede ser clonado cualquier gen de interés. Un único procedimiento de transfección de los tres plásmidos juntos daba como resultado la formación de un adenovirus quimérico recombinante. Esta nueva tecnología de bancos consistente en adenovirus quiméricos permite de este modo un rápido rastreo de vectores adenovirales recombinantes mejorados para los fines de la terapia génica in vitro e in vivo.

Aunque se ha informado sobre la introducción exitosa de cambios en la fibra y la base pentónica del adenovirus de serotipo 5, la estructura compleja de la protuberancia y el conocimiento limitado de los aminoácidos precisos que interaccionan con CAR hacen laboriosos y difíciles semejantes enfoques de redireccionamiento. Para superar las limitaciones descritas antes los autores de la presente invención utilizaron fibras, proteínas de la base pentónica, y hexonas de adenovirus pre-existentes derivadas de otros serotipos de adenovirus. Generando bancos de adenovirus quiméricos de serotipo 5 conteniendo proteínas estructurales de serotipos de adenovirus alternativos, los autores de la presente invención desarrollaron una tecnología que permite el rápido rastreo de un vector adenoviral recombinante con características preferidas.

En un aspecto esta invención describe el uso de adenovirus quiméricos para superar la actividad neutralizadora del huésped, natural existente o inducida, hacia los adenovirus recombinantes administrados in vivo para aplicaciones terapéuticas. La respuesta inmune del huésped está dirigida predominantemente contra las proteínas de la base pentóni-
ca - y la hexona presentes en la cápsida adenoviral y en menor grado dirigida a la fibra.

Los serotipos de adenovirus se definen por la incapacidad para reaccionar de forma cruzada con los anticuerpos neutralizadores de los sueros animales. Por lo tanto los virus quiméricos basados por ejemplo en el adenovirus de serotipo 5 pero quiméricos para la proteína de la base pentónica, y/o la proteína de la hexona provocan una respuesta inmune menos grave, alterada. La necesidad de semejantes adenovirus quiméricos está subrayada por las observaciones de que 1) el reparto sistémico repetido de adenovirus recombinante de serotipo 5 es infructuoso debido a la formación de elevados títulos de anticuerpos neutralizadores contra el adenovirus recombinante de serotipo 5 (Schulik y col. 1997), y 2) la inmunidad pre-existente o natural.

Este aspecto de la invención burla por lo tanto la incapacidad de repetir la administración de un adenovirus para los fines de la terapia génica. Preferiblemente, las proteínas de la base pentónica, la hexona y la fibra derivan de adenovirus en el subgrupo B y D y son más específicamente del adenovirus de serotipo 16, 24, 33, 36, 38, 39, 42, y 50. Esto último se debe a que estos serotipos son raramente aislados de humanos indicando que se encuentran presentes títulos bajos de anticuerpos neutralizadores circulantes contra estos serotipos.

En otro aspecto esta invención describe adenovirus quiméricos y métodos para generar estos virus que tienen un tropismo alterado diferente del de un adenovirus de serotipo 5. Por ejemplo, virus basados en el adenovirus de serotipo 5 pero que presentan cualquier fibra de adenovirus existente en la naturaleza. Este adenovirus quimérico de serotipo 5 es capaz de infectar tipos celulares más eficazmente, o menos eficazmente in vitro e in vivo que el adenovirus de serotipo 5. Entre tales células se incluyen pero no están limitadas a, células endoteliales, células de músculo liso, células dendríticas, células neuronales, células gliales, células sinoviales, células epiteliales de pulmón, células del tallo hematopoyético, células monocíticas/macrófagos etc.

En otro aspecto en esta invención se describen métodos que identifican adenovirus quiméricos que presentan una amplificación in vitro mejorada en cultivos celulares estáticos o en suspensión. Los adenovirus derivados de diferentes subgrupos, pero también dentro de un subgrupo, presentan una elevada variabilidad en la infección productiva en tipos de células que se utilizan para la producción de adenovirus recombinantes. En la Tabla 2 se registra una visión de conjunto de diferentes serotipos de adenovirus y su asociación con enfermedades humanas, demostrando que la replicación de un serotipo de adenovirus dado es intensificada en ciertos tipos celulares. Para la producción de adenovirus recombinantes para los fines de la terapia génica, se encuentran disponibles numerosas líneas celulares. Entre estas se incluyen pero no están limitadas a PER.C6, 911, 293, y E1 A549. Estas células productoras de adenovirus pueden no ser los tipos celulares más adecuados para amplificar virus basados en el adenovirus de serotipo 5. Por lo tanto, en este aspecto de la invención los autores de la presente invención seleccionan adenovirus de diferentes serotipos basados en su capacidad para propagarse por ejemplo en PER.C6 y utilizan sus genes tempranos (sin E1) y sus ITR para construir virus quiméricos que son superiores en términos de propagación y por tanto rinden títulos más elevados en comparación con los adenovirus de serotipo 2 o 5 utilizados comúnmente.

En otro aspecto la invención describe la construcción y utilización de bancos que constan de distintas partes de adenovirus de serotipo 5 en los cuales uno o más genes o secuencias han sido remplazados por ADN derivado de serotipos humanos o animales alternativos. Este grupo de constructos, que abarcan en total el genoma del adenovirus completo, permite la construcción de adenovirus quiméricos únicos a medida para un cierto grupo de pacientes o incluso de un único individuo.

En todos los aspectos de la invención los adenovirus quiméricos pueden, o no, contener deleciones en la región E1 e inserciones de genes heterólogos conectados o no a un promotor. Además, los adenovirus quiméricos pueden, o no, contener deleciones en la región E3 e inserciones de genes heterólogos conectados a un promotor. Además, los adenovirus quiméricos puede, o no, contener deleciones en la región E2 y/o E4 e inserciones de genes heterólogos conectados a un promotor. En el último caso se requieren líneas celulares que complementen E2 y/o E4 para generar adenovirus recombinantes.

Ejemplo 1

Generación de clones plasmídicos genómicos de adenovirus de serotipo 5

El genoma completo del adenovirus de serotipo 5 ha sido clonado en diversos plásmidos o cósmidos para permitir una fácil modificación de partes del genoma del adenovirus de serotipo 5, a la vez que todavía conservan la capacidad para producir virus recombinante. Para este propósito se generaron los siguientes plásmidos:

1. PBr/Ad.Bam-rITR (consigna ECACC P97082122)

Con el fin de facilitar la clonación de extremos romos de las secuencias ITR, se trató ADN de adenovirus de tipo 5 humano de tipo salvaje (Ad5) con la enzima de Klenow en presencia de dNTP en exceso. Tras la inactivación de la enzima de Klenow y la purificación mediante extracción con fenol/cloroformo seguida de precipitación con etanol, el ADN fue digerido con BamHI. Esta preparación de ADN fue utilizada sin purificación adicional en una reacción de ligadura con el ADN del vector derivado de pBr322 preparado como sigue: se digirió el ADN de pBr322 con EcoRV y BamHI, se desfosforiló mediante tratamiento con la enzima ISAP (Life Techonologies) y se purificó en gel de LMP agarosa (SeaPlaque GTG). Tras la transformación en E. coli DH5\alpha competente (Life Technologies) y el análisis de las colonias resistentes a ampicilina, se seleccionó un clon que mostraba un patrón de digestión como se esperaba para un inserto que se extendía desde el sitio BamHI de Ad5 la ITR derecha.

El análisis de la secuencia de la frontera de clonación de la ITR derecha revelaba que la mayor parte de los restos G 3' de la ITR se habían perdido, se encontró que el resto de la ITR era correcto. Dicho resto G perdido es complementado por la otra ITR durante la replicación.

2. PBr/Ad.Sal-rITR (consigna ECACC P97082119)

PBr/Ad.Bam-rITR fue digerido con BamHI y SalI. El fragmento vector que incluía el inserto de adenovirus fue aislado en agarosa LMP (SeaPlaque GTG) y ligado a un fragmento SalI-BamHI de 4,8 kb obtenido a partir de ADN de Ad5 wt y purificado con el estuche de Genclean II (Bio 101, Inc.). Se seleccionó un clon y se determinó la integridad de las secuencias de Ad5 mediante análisis con enzimas de restricción. El clon pBr/Ad.Sal-rITR contiene secuencias de adeno de tipo 5 desde el sitio SalI en el pb 16746 hasta e incluyendo la rITR (perdiendo la mayor parte de los restos G 3').

3. PBr/Ad.Cla-Bam (consigna ECACC P97082117)

Se digirió ADN de adeno de tipo 5 wt con ClaI y BamHI, y se aisló el fragmento de 20,6 kb del gel mediante electro-elución. Se digirió pBr322 con las mismas enzimas y se purificó a partir del gel de agarosa mediante Geneclean. Ambos fragmentos fueron ligados y transformados en DH5\alpha competente. El clon resultante pBr/Ad.Cla-Bam fue analizado mediante digestión con enzimas de restricción y se demostró que contenía un inserto con secuencias de adenovirus desde el pb 919 al 21566.

4. PBr/Ad.AflII-Bam (consigna ECACC P97082114)

El clon pBr/Ad.Cla-Bam fue linealizado con EcoRI (en pBr322 y digerido parcialmente con AflII. Tras la inactivación con calor de AflII durante 20' a 65ºC los extremos del fragmento fueron rellenados con la enzima de Klenow. Después el ADN fue ligado a un oligoligador de doble hebra de extremos romos que contenía un sito PacI (5'-AATTGTCTTAATTAACCGCTTAA-3'). Este ligador fue elaborado recociendo los siguientes dos oligonucleótidos: 5'-AATTGTCTTAATTAACCGC-3' Y 5'-AATTGCGGTTAATTAAGAC-3', seguido de formación de extremos romos con la enzima de Klenow. Tras la precipitación del ADN ligado para cambiar el tampón, las ligaduras fueron digeridas con un exceso de enzima PacI para separar los concatámeros del oligo. El fragmento parcial de 22016 pb que contenía las secuencias de Ad5 desde el pb 3534 hasta el 21566 y las secuencias vectoras, fue aislado en agarosa LMP (SeaPlaque GTG), religado y transformado en DH5a competente. Se seleccionó un clón que se había encontrado que contenía el sitio PacI y que había conservado el fragmento de adeno grande y se secuenció en el extremo 5' para verificar la inserción correcta del ligador PacI en el sitio AflII (perdido).

5. PBr/Ad.Bam-rITRpac#2 (consigna ECACC P97082120) y PBr/Ad.Bam-rITRpac#8 (consigna ECACC P97082121)

Para permitir la inserción de un sitio PacI cerca de la ITR de Ad5 en el clon pBr/Ad.Bam.rITR se separaron aproximadamente 190 nucleótidos entre el sitio ClaI del esqueleto de pBr322 y el inicio de las secuencias ITR. Esto se realizó como sigue: pBr/Ad.Bam-rITR fue digerido con ClaI y tratado con la nucleasa Bal31 durante diferentes intervalos de tiempo (2', 5', 10' y 15'). Se siguió el grado de separación de nucleótidos para separar las reacciones del ADN de pBr322 (también digerido en el sitio ClaI), utilizando tampones y condiciones idénticos. La enzima Bal31 fue inactivada por incubación a 75ºC durante 10', el ADN fue precipitado y resuspendido en un volumen más pequeño de tampón TE. Para asegurar los extremos romos, los ADN se trataron adicionalmente con ADN polimerasa de T4 en presencia de dNTP en exceso. Tras la digestión del ADN de pBr322 (control) con SalI, se observó una degradación satisfactoria (150 pb) en la muestra tratada durante 10' o 15'. Las muestras de pBr/Ad.Bam-rITR tratadas 10' o 15' fueron ligadas después a los ligadores PacI de extremos romos descritos antes (Ver pBr/Ad.AflII-Bam). Las ligaduras fueron purificadas por precipitación, digeridas con PacI en exceso y separadas de los ligadores en gel de agarosa LMP. Tras la religadura, los ADN fueron transformados en DH5a competentes y se analizaron las colonias. Se seleccionaron diez clones que mostraban una deleción de aproximadamente la longitud deseada y estos fueron analizados adicionalmente mediante secuenciación "T-Track" (estuche secuenciador de T7, Pharmacia Biotech). Se encontraron dos clones con el ligador PacI insertado inmediatamente aguas abajo de la rITR. Tras la digestión con PacI, el clon #2 tiene 28 pb y el clon #8 tiene 27 pb anclados a la ITR.

PWE/Ad.AflII-rITR (consigna ECACC P97082116)

Se utilizó el vector cosmídico pWE15 (Clontech) para clonar insertos de Ad5 más grandes. Primero, se insertó un ligador que contenía un sitio PacI único en los sitios EcoRI de pWE15 creando pWE.pac. En este punto, se utilizó el oligo PacI de doble hebra descrito para pBr/Ad.AflII-BamHI pero ahora con sus extremos EcoRI sobresalientes. Después se aislaron los siguientes fragmentos mediante electroelución en gel de agarosa: pWE.pac digerido con PacI, pBr/AflII-Bam digerido con PacI y BamHI y pBr/Ad.Bam-rITR#2 digerido con BamHI y PacI. Estos fragmentos fueron ligados entre sí y empaquetados utilizando extractos de empaquetamiento del fago 1 (Stratagene) según el protocolo del fabricante. Tras la infección en bacterias huésped, se desarrollaron colonias sobre las placas y se analizaron en cuanto a la presencia del inserto completo. PWE/Ad.AflII-rITR contiene todas las secuencias de adenovirus de tipo 5 desde el pb 3534 (sitio AflII) hasta la ITR derecha inclusive (perdiendo la mayor parte de los restos G 3').

PBr/Ad.lITR-Sal(9.4) (consigna ECACC P97082115)

Se trató ADN de adeno 5 wt tratado con enzima de Klenow en presencia de dNTP en exceso y con posterioridad se digirió con SalI. Dos de los fragmentos resultantes, denominados ITR izquierda-Sal (9.4) y Sal(16.7)-ITR derecha, respectivamente, fueron aislados en agarosa LMP (SeaPlaque GTG). Se digirió ADN de pBr322 con EcoRV y SalI y se trató con fosfatasa (Life Technologies). El fragmento vector fue aislado utilizando el método Geneclean (BIO 101, Inc.) y ligado a los fragmentos SalI de Ad5. Sólo la ligadura con el fragmento de 9,4 kb producía colonias con un inserto. Tras el análisis y la secuenciación de la frontera de clonación se seleccionó un clon que contenía la secuencia ITR en toda su longitud y se prolongó hasta el sitio SalI en el pb 9462.

PBr/Ad.lITR-Sal(16.7) (consigna ECACC P97082118)

PBr/Ad.lITR-Sal(9.4) es digerido con SalI y desfosforilado (TSAP, Life Technologies). Para prolongar este clon hasta el tercer sitio SalI de Ad5, se linealizó pBr/Ad.Cla-Bam con BamHI y se digirió parcialmente con SalI. Se aisló un fragmento SalI de 7,3 kb que contenía secuencias de adenovirus desde 9462-16746 en gel de agarosa LMP y se ligó al fragmento vector pBr/Ad.lITR-Sal(9.4) digerido con SalI.

PWE/Ad.AflII-EcoRI

PWE.pac fue digerido con ClaI y los extremos 5' sobresalientes fueron rellenados utilizando la enzima de Klenow. El ADN fue digerido después con PacI y aislado en gel de agarosa. PWE/AflII-rITR fue digerido con EcoRI y tras el tratamiento con la enzima de Klenow fue digerido con PacI. El fragmento grande de 24 kb que contenía las secuencias adenovirales fue aislado en gel de agarosa y ligado al vector pWE.pac de extremos romos y digerido con ClaI utilizando el LigationExpres® de Clontech. Tras la transformación de células Ultracompetent XL10-Gold de Stratagene, se identificaron los clones que contenían el inserto esperado. PWE/AflII-EcoRI contiene secuencias de Ad5 de los pb 3534-27336.

Construcción de nuevos plásmidos adaptadores

La ausencia de solapamiento de la secuencia entre el adenovirus recombinante y las secuencias de E1 en la línea celular de empaquetamiento es esencial para la generación libre de RCA segura y la propagación de nuevos virus recombinantes. El plásmido adaptador pMLPI.TK (figura 1) es un ejemplo de un plásmido adaptador diseñado para su uso según la invención en combinación con las líneas celulares de empaquetamiento mejoradas de la invención. Este plásmido fue utilizado como sustancia de partida para elaborar un nuevo vector en el cual las moléculas de ácido nucleico que comprenden un promotor específico y secuencias de genes puede ser fácilmente intercambiadas.

Primero, se generó un fragmento de PCR generado a partir de un ADn molde pZi\DeltaMo+PyF101(N^{-}) (descrito en PCT/NL96/00195) con los siguientes cebadores: LTR-1: 5'-CTG TAC GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3' y LTR-2: 5'-GCG GAT CCT TCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA ATC G-3'. Se utilizó ADN polimerasa Pwo (Boehringer Mannheim) según el protocolo del fabricante con los siguientes ciclos der temperatura: una vez 5' a 95ºC; 3' a 55ºC; y 1' a 72ºC, y 30 ciclos de 1' a 95ºC, 1' a 60ºC, 1' a 72ºC, seguido de una vez 10' a 72ºC. El producto de la PCR fue digerido después con BamHI y ligado en el vector pMLP10 (Levrero y col., 1991) digerido con PvuII y BamHI, generando de ese modo el vector pLTR10. Este vector contiene secuencias adenovirales del pb 1 hasta el pb 454 seguido de un promotor consistente en una parte de la LTR Mo_MuLV que tenía sus secuencias intensificadoras de tipo salvaje remplazadas por el intensificador de un virus de polioma mutante (PyF101). El fragmento promotor fue designado L420. A continuación, la región codificadora del gen HSA murino fue insertado. PLTR10 fue digerido con BstBI seguido de tratamiento de Klenow y digestión con NcoI. El gen HSA fue obtenido mediante amplificación por PCR en pUC18-HSA (Kay y col., 1990) utilizando los siguientes cebadores: HSA1, 5'-GCG CCA CCA TGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3' y HSA2, 5'-GTT AGA TCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATG TGA AA-3'. El fragmento de 269 pb amplificado fue subclonado en un vector lanzadera utilizando los sitios NcoI y BglII. La secuenciación confirmó la incorporación de la secuencia codificadora correcta del gen BSA, pero con una inserción de TAG extra inmediatamente después del codón de terminación TAG. La región codificadora del gen HSA, incluyendo la duplicación de TAG fue separada cortando después en forma de un fragmento NcoI (cohesivo)-SalI (romo) y clonado en el fragmento NcoI(cohesivo)/BstBI(romo) de 3,5 kb a partir de pLTR10, dando como resultado pLTR-HSA10.

Finalmente, pLTR-HSA10 fue digerido con EcoRI y BamHI después de lo cual el fragmento que contenía la ITR izquierda, señal de empaquetamiento, el promotor L420 y el gen HSA fue insertado en el vector pMLP1.TK digerido con las mismas enzimas y remplazando de ese modo las secuencias promotora y génica. Esto dio como resultado el nuevo plásmido adaptador pAd/L420-HSA (figura 2) que contiene los sitios de reconocimiento convenientes para diversas enzimas de restricción entorno a las secuencias promotora y génica. SnaBI y AvrII pueden ser combinadas ocn HpaI, NheI, KPnI, HindIII para intercambiar las secuencias promotoras, mientras los últimos sitios puede ser combinados con los sitios ClaI o BamHI 3' de la región codificadora de HSA para remplazar los genes de este constructo.

Otro plásmido adaptador que fue diseñado para permitir el fácil intercambio de moléculas de ácido nucleico fue elaborado remplazando las secuencias promotoras, génicas y poli A en pAd/L420-HSA por el promotor de CMV, un sitio de clonación múltiple, un intrón y una señal poli A. Para este fin, se digirió pAd/L420-HSA con AvrII y BglII seguido de tratamiento con Klenow para obtener extremos romos. El fragmento de 5,1 kb con el vector pBr322 y las secuencias adenovirales fue aislado y ligado a un fragmento de 1570 pb romo de pcDNA1/amp (Invitrogen) obtenido mediante digestión con HhaI y AvrII seguido de tratamiento con ADN polimerasa de T4. Este plásmido adaptador fue denominado pCLIP.Luc (figura 3).

Generación de adenovirus recombinante

Para generar adenovirus recombinante con E1 suprimida con el nuevo sistema basado en plásmidos, se preparan los siguientes constructos:

a) Un constructo adaptador que contiene la casete de expresión con el gen de interés linealizado con una enzima de restricción que corta en el lado 3' del fragmento de genoma adenoviral solapante, que no contenga preferiblemente ninguna de las secuencias del vector pBr322, y

b) Un constructo de genoma adenoviral complementador pWE/Ad.AflII-rITR digerido con PacI.

Estas dos moléculas de ADN son purificadas adicionalmente mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con EtOH. La transfección simultánea de estos plásmidos en una línea celular de empaquetamiento de adenovirus, preferiblemente una línea celular según la invención, genera adenovirus de replicación deficiente recombinantes por medio de una recombinación homóloga de una etapa entre el adaptador y el constructo complementador (figura 4).

Alternativamente, en lugar de pWE/Ad.AflII-rITR se pueden utilizar otros fragmentos, v.g., se pueden combinar pBr/Ad.Cla-Bam digerido con EcoRI y BamHI o pBr/Ad.AflII-BamHI digerido con PacI y BamHI con pBr/Ad.Sal-rITR digerido con SalI. En este caso, se combinan tres plásmidos y se necesitan dos recombinaciones homólogas para obtener un adenovirus recombinante (figura 5). Los expertos en la técnica deben entender que se pueden utilizar otras combinaciones de plásmidos adaptadores y complementadores sin apartarse de la presente invención. Se ha realizado un protocolo general esbozado más abajo y representado como un ejemplo no limitante de la presente invención para producir algunos adenovirus recombinantes utilizando diversos plásmidos adaptadores y el fragmento Ad.AflII-rITR. Se sembraron células de empaquetamiento de adenovirus (PER.C6) en matraces de \sim25 cm^{2} y al día siguiente cuando se encontraban en una confluencia de \sim80%, fueron transfectados con una mezcla de ADN y un agente de lipofectamina (Life Techn.) como describe el fabricante. Rutinariamente, se utilizan 40 \mul de lipofectamina, 4 \mug de plásmido adaptador y 4 \mug del fragmento del genoma del adenovirus complementador AflII-rITR (o 2 \mug de los tres plásmidos para la doble recombinación homóloga). En estas condiciones se obtienen eficacias de transfección transitorias de \sim50% (48 horas después de la transfección) como se determina con transfecciones de control utilizando un adaptador pAd/CMV-LacZ. Dos días más tarde, las células se hacen pasar a matraces de \sim80 cm^{2} y adicionalmente se cultivan. Aproximadamente cinco (para la única recombinación homóloga) a once días (para la doble recombinación homóloga) más tarde se observa un efecto citopatogénico (CPE), indicando que se ha formado adenovirus funcional. Las células y el medio se recogen tras un CPE completo y el virus recombinante se libera mediante congelación-descongelación. Rutinariamente se realiza una etapa de amplificación extra en un matraz de 80 cm^{2} para incrementar el rendimiento puesto que se ha encontrado en la fase inicial que los títulos son variables a pesar de la aparición de un CPE completo. Tras la amplificación, los virus son recogidos y la placa purificada sobre células PER.C6. Las placas individuales son sometidas a ensayo en cuanto a los virus con transgenes activos.

Además de los reemplazos en la región E1 es posible suprimir o remplazar (parte de) la región E3 en el adenovirus debido a que las funciones de E3 no son necesarias para la replicación, el empaquetamiento y la infección del virus (recombinante). Esto crea la oportunidad de utilizar un inserto mayor o de insertar más de un gen sin exceder el tamaño de empaquetamiento máximo (aproximadamente 105% en peso de la longitud del genoma). Este caso puede ser realizado, v.g., suprimiendo parte de la región E3 en el clon pBr/Ad.Bam-rITR mediante digestión con XbaI y religadura. Esto separa las secuencias del Ad5 wt 28592-30470 incluyendo todas las regiones codificadoras de E3 conocidas. Otro ejemplo es el preciso reemplazo de la región codificadora de gp19K en la región E3 con un poliligador permitiendo la inserción de nuevas secuencias. Esto, 1) deja todas las demás regiones intactas y 2) obvia la necesidad de un promotor heterólogo puesto que el transgen es conducido por las secuencias promotoras de E3 y pA, dejando más espacio para las secuencias codificadoras.

En este punto, el fragmento EcoRI de 2,7 kb de Ad5 wt que contenía la porción 5' de la región E3 fue clonado en el sitio EcoRI de pBluescript (KS^{-}) (Stratagene). A continuación, el sitio Hind III del poliligador fue separado mediante digestión con EcoRV y HincII y posterior religadura. El clon pBS.Eco-Eco/ad5DHIII resultante fue utilizado para suprimir la región codificadora gp19K. Los cebadores 1 (5'-GGG TAT TAG GCC AA AGG CGC A-3') y 2 (5'-GAT CCC ATG GAA GCT TGG GTG GCG ACC CCA GCG-3') fueron utilizados para amplificar una secuencia de pBS.Eco-Eco/Ad5DHIII correspondiente a las secuencias 28511 a 28734 del ADN de wt Ad5. Los cebadores 3 (5'-GAT CCC ATG GGG ATC CTT TAC TAA GTT ACA AAG CTA-3') y 4 (5'-GTC GCT GTA GTT GGA CTG G-3') fueron utilizados sobre el mismo ADN para amplificar las secuencias de Ad5 desde 29217 a 29476. Los dos fragmentos de PCR resultantes fueron ligados entre sí en virtud del nuevo sitio NcoI introducido y posteriormente digeridos con XbaI y MunI. Este fragmento fue ligado después en el vector pBS.Eco-Eco/ad5\DeltaHIII que fue digerido con XbaI (parcialmente) y MunI generando pBS.Eco-Eco/ad5\DeltaHIII.\Deltagp19K. Para permitir la inserción de genes foráneos en el sitio HindIII y BamHI, se realizó una deleción XbaI en pBS.Eco-Eco/ad5\DeltaHIII.\Deltagp19K para separar el sitio BamHI en el poliligador Bluescript. El plásmido resultante pBS.Eco-Eco/ad5\DeltaHIII\Deltagp19K\DeltaXbaI, contiene sitios HindIII y BamHI únicos correspondientes a las secuencias 28733 (HindIII) y 29218 (BamHI) en Ad5. Tras la introducción de un gen foráneo en estos sitios, o bien el fragmento con XbaI suprimido es re-introducido, o bien el inserto es reclonado en pBS.Eco-Eco/ad5\DeltaHIII.\Deltagp19K utilizando HindIII y por ejemplo MunI. Utilizando este procedimiento, los autores de la presente invención han generado plásmidos que expresan HSV-TK, hIL-1a, IL-3 de rata, luciferasa o LacZ. Los sitios SrfI y NotI únicos del plásmido pBS.Eco-Eco/Ad5\DeltaHIII.\Deltagp19K (con o sin gen de interés insertado) son utilizados para transferir la región que comprende el gen de interés a la correspondiente región de pBr/Ad.Bam-rITR, rindiendo el constructo pBr/Ad.Bam-rITR\Deltagp19K (con o sin el gen de interés insertado). Este constructo se utiliza como se ha descrito antes para producir adenovirus recombinantes. En el contexto viral, la expresión de los genes de interés es conducida por el promotor E3 de adenovirus.

Los virus recombinantes que tienen tanto E1 como E3 suprimidas son generados mediante un procedimiento de doble recombinación homóloga como se ha descrito antes para los vectores con el reemplazo de E1 utilizando un sistema basado en plásmidos que consta de:

a) un plásmido adaptador para el reemplazo de E1 según la invención, con o sin la inserción de un primer gen de interés,

b) el fragmento pWE/Ad.AflII-EcoRI, y

c) el plásmido pBr/Ad.Bam-rITR\Deltagp19K con o sin la inserción de un segundo gen de interés.

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Además de las manipulaciones en la región E3, se pueden completar fácilmente cambios en la región E4 (o partes de ella) en pBr/Ad.Bam-rITR. La generación y propagación de tales virus, no obstante, demanda en algunos casos una complementación en trans.

Ejemplo 2

Generación de virus basados en adenovirus de serotipo 5 con proteínas de la fibra quiméricas

El método descrito más abajo para generar adenovirus recombinantes mediante co-transfección de dos, o más secuencias adenovirales clonadas por separado. Estas secuencias adenovirales clonadas fueron utilizadas con posterioridad para separar secuencias de adenovirus de serotipo 5 específicas con el fin de generar clones molde que permitan la fácil introducción de secuencias de ADN derivadas de otros serotipos de adenovirus. Como ejemplo de estos clones molde, se proporciona más abajo la construcción de plásmidos que permiten el intercambio de ADN que codifican la proteína de la fibra.

Generación de clones molde de adenovirus que carecen de ADN que codifica la fibra

La secuencia codificadora de la fibra del adenovirus de serotipo 5 está localizada entre los nucleótidos 31042 y 32787. Para separar el ADN del adenovirus de serotipo 5 que codifica la fibra los autores de la presente invención empezaron con el constructo pBr/Ad.Bam-rITR. Primero se separó un sitio NdeI de este constructo. Para este fin, el ADN del plásmido pBr322 fue digerido con NdeI después de lo cual los extremos sobresalientes fueron rellenados utilizando la enzima de Klenow. Este plásmido pBr322 fue re-ligado después, digerido con NdeI y transformado en E. coli DH5\alpha. El plásmido pBr/\DeltaNdeI obtenido fue digerido con ScaI y SalI y el vector de 3198 pb resultante fue ligado al fragmento ScaI-SalI de 15349 pb derivado de pBr/Ad.BamrITR, dando como resultado el plásmido pBr/Ad.Bam-rITR\DeltaNdeI que contenía por tanto un único sitio NdeI. A continuación se realizó la PCR con los oligonucleótidos NY-up: 5'-CGA CAT ATG TAG ATG CAT TAG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG-3' y NY-down: 5'-GGA GAC CAC TGC CAT GTT-3' (figura 6). Durante la amplificación, se introdujeron un sitio de restricción NdeI (negrita) y uno NsiI (subrayado) para facilitar la clonación de los ADN de las fibras amplificados. La amplificación consistía en 25 ciclos de 45 segundos a 94ºC, 1 minuto a 60ºC, y 45 segundos a 72ºC cada uno. La reacción de PCR contenía 25 pmoles de oligonucleótidos NY-up o NY-down, dNTP 2 mM, tampón para PCR con MgCl_{2} 1,5 mM, y 1 unidad de polimerasa estable al calor Elongase (Gibco, Holanda). Una décima parte del producto de la PCR se hizo circular sobre un gel de agarosa lo que demostró que el fragmento de ADN esperado de \pm 2200 pb había sido amplificado. Este fragmento de la PCR fue purificado con posterioridad utilizando el sistema del estuche Geneclean (Bio101 Inc.). Después, tanto el constructo pBr/Ad.Bam-rITR\DeltaNdeI como el producto de la PCR fueron digeridos con las enzimas de restricción NdeI y SbfI. El fragmento de la PCR fue clonado con posterioridad utilizando la enzima ligasa de T4 en el pBr/Ad.Bam-rITR\DeltaNdeI digerido con NdeI y SbfI, generando pBr/Ad.BamR\DeltaFib. Este plásmido permite la inserción de cualquier secuencia de la fibra amplificada mediante PCR a través de los sitios NdeI y NsiI únicos que son insertados en lugar de la secuencia de la fibra separada. Los virus pueden ser generados mediante una doble recombinación homóloga en células de empaquetamiento descritas más abajo utilizando un plásmido adaptador, un constructo pBr/Ad.AflII-EcoRI digerido con PacI y EcoRI y un constructo pBr/Ad.BamR\DeltaFib en el cual han sido insertadas las secuencias de la fibra heteróloga. Para incrementar la eficacia de la generación de virus, el constructo pBr/Ad.BamR\DeltaFib fue modificado para generar un sitio PacI flanqueando la ITR derecha. A este fin, pBr/Ad.BamR\DeltaFib era digerido con AvrII y el fragmento de adeno de 5 kb fue aislado e introducido en el vector pBr/Ad.Bam-rITR.pac#8 remplazando el correspondiente fragmento AvrII. El constructo resultante fue denominado pBr/Ad.BamR\DeltaFib.pac. Una vez que la secuencia de la fibra heteróloga es introducida en pBr/Ad.BamR\DeltaFib.pac, se puede introducir el clon de adenovirus con la fibra modificada a mano derecha en un clon cosmídico grande como se describe para pWE/Ad.AflII-rITR en el ejemplo 1. Semejante clon cosmídico grande permite la generación de adenovirus solamente mediante una recombinación homóloga haciendo el procedimiento extremadamente eficaz.

Amplificación de las secuencias de la fibra de serotipos de adenovirus

Para permitir la amplificación de los ADN que codifican la proteína de la fibra derivada de serotipos alternativos se sintetizaron oligonucleótidos degenerados. Para este fin, primero se alinearon las secuencias de ADN conocidas que codificaban la proteína de la fibra de serotipos alternativos para identificar las regiones conservadas tanto en la región de la cola como en la región de la protuberancia de la proteína de la fibra. A partir del alineamiento, que contenía la secuencia de nucleótidos de 19 serotipos diferentes que representaban los 6 subgrupos, se sintetizaron oligonucleótidos (degenerados) (ver la tabla 3). Asimismo se muestra en la tabla 3 la combinación de oligonucleótidos utilizada para amplificar el ADN que codifica la proteína de la fibra de un serotipo específico. La reacción de amplificación (50 \mul) contenía dNTP 2 mM, 25 pmoles de cada oligonucleótido, 1 x tampón para PCR normalizado, MgCl_{2} 1,5 mM, y 1 Unidad de polimerasa estable al calor Pwo (Boehringer) por reacción. El programa de ciclación contenía 20 ciclos, constando cada uno de 30 segundos a 94ºC, 60 segundos a 60-64ºC, 120 segundos a 72ºC. Se hizo circular una décima parte del producto de la PCR sobre un gel de agarosa lo que demostró que un fragmento de ADN había sido amplificado. De cada molde diferente, se realizaron dos reacciones de PCR independientes después de lo cual los fragmentos de la PCR independientes obtenidos fueron secuenciados para determinar la secuencia de nucleótidos. A partir de los 11 serotipos diferentes, la secuencia de nucleótidos pudo ser comparada con las secuencias presentes en GenBank. De todos los demás serotipos, se desconocía hasta la fecha el ADN que codificaba la proteína de la fibra y por lo tanto se alineaba con secuencias conocidas de otros miembros del subgrupo para determinar la homología es decir la divergencia en la secuencia. De los 51 serotipos humanos conocidos hasta la fecha, todas las secuencias de fibras, excepto las de los serotipos 1, 6, y 26, han sido amplificadas y secuenciadas. Las secuencias de la proteína de la fibra de diferentes serotipos de adenovirus se dan en la figura 7.

Generación de constructos de ADN adenovirales quiméricos de la fibra

Todos los ADN de la fibra amplificados así como el vector (pBr/Ad.BamR\DeltaFib) fueron digeridos con NdeI y NsiI. Los ADN digeridos se hicieron circular con posterioridad sobre un gel de agarosa después de lo cual los fragmentos fueron aislados del gel y purificados utilizando el estuche GeneClean (Bio101 Inc). Los fragmentos de la PCR fueron clonados después en los sitios NdeI y NsiI de pBr/AdBamR\DeltaFib, generando de ese modo pBr/AdBamRFibXX (donde XX representa el número de serotipo del cual se había aislado el ADN de la fibra). Hasta este punto ha sido clonada la secuencia de la fibra de los serotipos 5/ 7/ 8/ 9/ 10/ 11/ 12/ 13/ 14/ 16/ 17/ 19/ 21/ 24/ 27/ 28/ 29/ 30/ 32/ 33/ 34/ 35/ 36/ 37/ 38/ 40-S( 40-L/ 41-S/ 42/ 45/ 47/ 49/ 51 en pBr/AdBamRFibXX. A partir de pBr/AdBamRFibXX (donde XX es 5/ 8/ 9/ 10/ 11/ 13/ 16/ 17/ 24/ 27/ 30/ 32/ 33/ 34/ 35/ 38/ 40-S/ 40-L/ 45/ 47/ 49/ 51) se aisló un fragmento AvrII de 6 kb que abarcaba la secuencia de la fibra por medio de electroforesis en gel y GeneClean. Este fragmento AvrII fue clonado con posterioridad en el plásmido pBr/Ad.Bam-rITR.pac (ver el ejemplo 1) que había sido digerido por completo con AvrII y desfosforilado como se ha descrito previamente, conduciendo a la generación del plásmido pBr/Ad.Bam-rITR.pac.fibXX. Este plásmido fue utilizado con posterioridad para generar un clon cosmídico con una fibra modificada utilizando los constructos pWE.pac, pBr/AflII-Bam y pBr/Ad.Bam-rITR.pac.fibXX. Esta clonación del cósmido dio como resultado la formación del constructo pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX (donde XX representa el número de serotipo del cual se había aislado el ADN de la fibra).

Generación de pAd5/L420.HSA, pAd5/Clip y pAd5/Clipsal

Se utilizó pMLPI.TK para elaborar un nuevo vector en el cual las moléculas de ácido nucleico que comprenden el promotor específico y las secuencias génicas puedan ser fácilmente intercambiadas.

Primero, se generó un fragmento de PCR a partir del ADN molde pZip\DeltaMo+PyF101(N^{-}) (descrito en PCT/NL96/
00195) con los siguientes cebadores: LTR-1: 5'-CTG TAC GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3' Y LTR-2: 5'-GCG GAT CCT TCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGG CGC ACT CAG TCA ATC G-3'. Se utilizó ADN polimerasa Pwo (Boehringer Mannheim) según el protocolo del fabricante con los siguientes ciclos de temperatura: una vez 5' a 95ºC; 3' a 55ºC; y 1' a 72ºC, y 30 ciclos de 1' a 95ºC, 1' a 60ºC, 1' a 72ºC, seguido de una vez 10' a 72ºC. El producto de la PCR fue digerido después con BamHI y ligado en el vector pMLP10 (Levrero y col., 1991) digerido con PvuII y BamHI, generando de ese modo el vector pLTR10. Este vector contiene secuencias adenovirales desde el pb 1 al pb 454 seguido de un promotor que constaba de una parte de la LTR Mo-MuLV cuyas secuencias intensificadoras de tipo salvaje estaban remplazadas por el intensificador de un virus de polioma mutante (PyF101). El fragmento promotor fue denominado L420. La secuenciación confirmó la amplificación correcta del fragmento LTR no obstante la mayor parte de las bases 5' del fragmento de la PCR se habían perdido de manera que el sitio PvuII no era restaurado. A continuación, se insertó la región codificadora del gen HSA murino. Se digirió pLTR10 con BstBI seguido de tratamiento de Klenow y digestión con NcoI. El gen HSA fue obtenido mediante amplificación por PCR en pUC18-HSA (Kay y col., 1990; J.Immunol.145, 1952-1959) utilizando los siguientes cebadores: HSA1, 5'-GCG CCA CCA TGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3' y HSA2, 5'-GTT AGA TCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATG TAG AA-3'. El fragmento amplificado de 269 pb fue subclonado en un vector lanzadera utilizando los sitios NcoI y BglII. La secuenciación confirmó la incorporación de la secuencia codificadora correcta del gen HSA, pero con una inserción de TAG extra directamente después del codón de terminación TAG. La región codificadora del gen HSA, incluyendo la duplicación de TAG fue separada después por corte en forma de un fragmento NcoI(cohesivo)-SalI(romo) y clonado en el fragmento NcoI(cohesivo)/BstBI(romo) de 3,5 kb de pLTR10, dando como resultado pLTR-HSA10.

Finalmente, se digirió pLTR-HSA10 con EcoRI y BamHI después de lo cual se insertó el fragmento que contenía la ITR izquierda, la señal de empaquetamiento, el promotor L420 y el gen HSA en el vector pMLP1.TK digerido con las mismas enzimas y remplazando de ese modo el promotor y las secuencias génicas. Esto daba como resultado el nuevo plásmido pAd/L420-HSA adaptador que contiene los sitios de reconocimiento convenientes para diversas enzimas de restricción próximos al promotor y las secuencias génicas. SnaBI y AvrII pueden ser combinados con HpaI, NheI, KpnI, HindIII para intercambiar las secuencias promotoras, mientras los últimos sitios pueden ser combinados con los sitios ClaI o BamHI 3' de la región codificadora de HSA para remplazar los genes de este constructo.

Otro plásmido adaptador que fue diseñado para permitir el fácil intercambio de moléculas de ácido nucleico fue elaborado remplazando las secuencias promotoras, génicas y poli A en pAd5/L420-HSA por el promotor de CMV, un sitio de clonación múltiple, un intrón y una señal poli A. Para este fin, se digirió pAd5/L420-HSA con AvrII y BglII seguido de tratamiento con Klenow para obtener extremos romos. El fragmento de 5,1 kb con el vector pBr322 y las secuencias adenovirales fue aislado y ligado a un fragmento de 1570 pb romo de pcDNA1/amp (Invitrogen) obtenido mediante digestión con HhaI y AvrII seguido de tratamiento con ADN polimerasa de T4. Este plásmido adaptador fue denominado pAd5/CLIP. Para permitir la separación de secuencias vectoras del fragmento adenoviral pAd5/Clip fue parcialmente digerido con EcoRI y el fragmento lineal fue aislado. Se recoció un oligo de la secuencia 5' TTAAGTCGAC-3' consigo mismo dando como resultado un ligador con un sitio SalI y EcoRI sobresaliente. El ligador fue ligado al vector pAd5/Clip parcialmente digerido y se seleccionaron los clones que tenían el ligador insertado en el sitio EcoRI 23 pb aguas arriba de la ITR de adenovirus izquierda en pAd5/Clip dando como resultado pAd5/Clipsal.

Generación de pAd5ClipLacZ, pAd5Clip.Luc, pAd5Clip.TK y pAdClipsal.Luc

El plásmido adaptador pAd5/Clip.LacZ fue generado como sigue: El gen LacZ de E. coli fue amplificado a partir del plásmido pMLP.nlsLacZ (EP 95-202 213) mediante PCR con los cebadores 5'GGGGTGGCCAGGGTACCTC
TAGGCTTTTGCAA y 5'GGGGGGATCCATAAACAAGTTCAGAATCC. La reacción de PCR fue realizada Ex Taq (Takara) según el protocolo de los proveedores en el siguiente programa de amplificación: 5 minutos 94ºC, 1 ciclo; 45 segundos 94ºC y 30 segundos 60ºC y 2 minutos 72ºC, 5 ciclos; 45 segundos 94ºC y 30 segundos 65ºC y 2 minutos 72ºC, 25 ciclos; 10 minutos 72; 45 segundos 94ºC y 30 segundos 60ºC y 2 minutos 72ºC, 5 ciclos, I ciclo. El producto de la PCR fue digerido con posterioridad con Kpn1 y BamHI y el fragmento de ADN digerido fue ligado en pcDNA3 digerido con KpnI/BamHI (Invitrogen), dando lugar a pcDNA3.nlsLacZ. A continuación, el plásmido pAd5/Clip fue digerido con SpeI. El fragmento grande que contenía parte de la porción 5' del promotor de CMV y las secuencias adenovirales fue aislado. El plásmido pcDNA3.nlsLacZ fue digerido con SpeI y el fragmento que contenía la porción 3' del promotor de CMV y el gen lacZ fue aislado. Con posterioridad, los fragmentos fueron ligados, dando lugar a pAd/Clip.LacZ. La reconstitución del promotor de CMV fue confirmada por la digestión con enzimas de restricción.

El plásmido adaptador pAd5/Clip.Luc fue generado como sigue: El plásmido pCMV.Luc (EP 95-202 213) fue digerido con HindIII y BamHI. El fragmento de ADN que contenía el gen de la luciferasa fue aislado. El plásmido adaptador pAd5/Clip fue digerido con HindIII y BamHI, y el fragmento grande fue aislado. A continuación, los fragmentos de ADN aislados fueron ligados, dando lugar a pAD5/Clip.Luc. El adaptador pClipsal.Luc fue generado de la misma manera pero utilizando el adaptador pClipsal digerido con HIII y BamHI como fragmento vector. Del mismo modo, el fragmento HIII-BamHI que contenía TK de pCMV.TK (EP 95-202 213) fue insertado en pClipsal para generar pAd5/Clip.TK. La presencia del sitio SalI inmediatamente aguas arriba de la ITR izquierda permite la liberación de secuencias vectoras del inserto de adeno. La separación de estas secuencias vectoras intensifica la frecuencia de generación del vector durante la recombinación homóloga en PER.C6.

Generación de adenovirus recombinante quimérico para la proteína de la fibra

Para generar virus Ad5 recombinante que porta la fibra del serotipo 12, 16, 28, 40-L, 51, y 5, se transfectaron tres constructos, pCLIP.Luc, pWE/AdAflII-Eco y pBr/AdBamrITR.pac/fibXX (XX = 12, 16, 28, 40-L, 51, y 5) en células productoras de adenovirus. Para generar virus Ad5 recombinante que portaba la fibra de 5/ 7/ 8/ 9/ 10/ 11/ 12/ 13/ 14/ 16/ 17/ 19/ 21/ 24/ 27/ 28/ 29/ 30/ 32/ 33/ 34/ 35/ 36/ 37/ 38/ 40-S/ 40-L/ 41-S/ 42/ 45/ 47/ 49/ 51, se transfectaron dos constructos pCLIP.Luc y pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX en células productoras de adenovirus.

Para la transfección, se diluyeron 2 \mug de pCLIP.Luc, y 4 \mug de pWE/AdAflII-Eco y pBr/AdBamrITR.pac/fibXX (o en caso de los cósmidos: 4 \mug de pCLIP.Luc más 4 \mug de pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX) en DMEM libre de suero a un volumen total de 100 \mul. A esta suspensión de ADN se añadieron 100 \mul de 1x lipofectamina diluida (Gibco). Después de 30 minutos a la temperatura ambiente se añadió la solución de complejo de ADN-lipofectamina a 2,5 ml de DMEM libre de suero que se añadió con posterioridad a un matraz para el cultivo de tejidos de T25 cm^{2}. Este matraz contenía 2x10^{6} células PER.C6 que se habían sembrado 24 horas antes de la transfección. Dos horas más tarde, el medio que contenía el complejo de ADN-lipofectamina fue diluido una vez mediante la adición de 2,4 ml de DMEM suplementado con suero de ternera fetal al 20%. De nuevo 24 horas más tarde el medio fue remplazado por DMEM de nueva aportación suplementado con suero de ternera fetal al 10%. Las células fueron cultivadas durante 6-8 días, con posterioridad cosechadas, y congeladas/descongeladas 3 veces. El desecho celular fue separado mediante centrifugación durante 5 minutos a 3000 rpm a la temperatura ambiente. Del sobrenadante (12,5 ml) 3-5 ml fueron utilizados para infectar de nuevo células PER.C6 infectadas (matraces para el cultivo de tejidos T80 cm^{2}). Esta re-infección produce un efecto citopatogénico (CPE) completo al cabo de 5-6 días después de lo cual el adenovirus es cosechado como se ha descrito antes. Con el lote de virus generado se realizaron rutinariamente dos análisis. 1) se utilizaron 20 \mul de sobrenadante de virus, diluido 10 veces mediante la adición de 1980 \mul de DMEM para infectar células A549 que fueron sembradas 24 horas antes de la infección a una concentración de 10^{5} células por pocillo de placas de 6 pocillos. Cuarenta y ocho horas más tarde se prepararon productos lisados de proteína que fueron utilizados con posterioridad para medir la expresión del gen marcador (actividad luciferasa). 2) se utilizan 20 \mul de sobrenadante de virus para determinar el título de virus en células 911 humanas. Para este fin, se siembran 911 células a una concentración de 4 x 10^{4} células por pocillo en placas de 96 pocillos. Tres a cuatro horas después de la siembra, el medio fue remplazado por sobrenadante de adenovirus (intervalo de dilución: 2 \mul - 5 x 10^{-9} \mul). Los títulos de virus del adenovirus de fibra quimérica de serotipo 5 siempre excedían las 1 x 10^{8} unidades infecciosas por ml.

Ejemplo 3

Producción, purificación, y titulación de adenovirus quiméricos

Del sobrenadante obtenido de las células PER.C6 transfectadas se utilizaban típicamente 10 ml para inocular un fermentador de 1 litro que contenía 1 - 1,5 x 10^{6} células/ml PER.C6 que estaban específicamente adaptadas al crecimiento en suspensión. Tres días después de la inoculación, las células fueron cosechadas y sedimentadas mediante centrifugación durante 10 minutos a 1750 rpm a la temperatura ambiente. Los adenovirus quiméricos presentes en las células sedimentadas fueron extraídos con posterioridad y purificados utilizando el siguiente protocolo de tratamiento aguas abajo. El sedimento se disolvió en 50 ml de NaPO_{4} 10 mM y se congeló a -20ºC. Después de descongelar a 37ºC, se añadieron 5,6 ml de desoxicolato (5% p/v) después de lo cual la solución se homogeneizó. La solución se incubó con posterioridad durante 15 minutos a 37ºC para romper las células. Tras homogeneizar la solución, se añadieron 1875 \mul de MgCl_{2}^{-} (1M) y 5 ml de glicerol al 100%. Tras la adición de 375 \mul de DNAsa (10 mg/ml) la solución se incubó durante 30 minutos a 37ºC. El desecho celular se separó por centrifugación a 1880 x g durante 30 minutos a la temperatura ambiente sin interrupción. El sobrenadante se purificó con posterioridad a partir de las proteínas cargando sobre 10 ml de freon. Tras la centrifugación durante 15 minutos a 2000 rpm sin detenerse a la temperatura ambiente eran visibles tres bandas de las cuales la banda superior representa el adenovirus. Esta banda fue aislada pipeteando después de lo cual se cargó en un gradiente en bloque de cloruro de cesio tamponado con Tris/HCl (1M) (intervalo: 1,2 a 1,4 g/ml). Tras la centrifugación a 21000 rpm durante 2,5 horas a 10ºC el virus fue purificado de la proteína restante y el desecho celular puesto que el virus, en contraste con los otros componentes, no migraba en una solución de cloruro de cesio de 1,4 g/ml. La banda de virus fue aislada después de lo cual se realiza una segunda purificación utilizando un gradiente continuo tamponado con Tris/HCl (1M) de 1,33 g/ml de cloruro de cesio. Después de cargar el virus sobre la parte superior de este gradiente el virus fue centrifugado durante 17 horas a 55000 rpm a 10ºC. Con posterioridad la banda de virus fue aislada y tras la adición de 30 \mul de sacarosa (50 p/v) se separa el exceso de cloruro de cesio mediante tres rondas de diálisis, comprendiendo cada ronda 1 hora. Para la diálisis el virus es transferido a portas de diálisis (Slide-a-lizer, corte a 10000 kDa, Pierce, USA). Los tampones utilizados para la diálisis son PBS que están suplementados con una concentración creciente de sacarosa (ronda 1 a 3: 30 ml, 60 ml, y 150 ml de sacarosa (50% p/v)/1,5 litros de PBS, todos suplementados con 7,5 ml de CaMgCl_{2} al 2% (p/v)). Tras la diálisis, el virus es separado del slide-a-lizer después de lo cual se forman alícuotas en porciones de 25 y 100 \mul después de lo cual el virus es almacenado a -85ºC.

Para determinar el número de partículas de virus por mililitro, se hacen circular 50 \mul del lote de virus en columnas de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). El adenovirus se une a la columna (intercambio aniónico) después de lo cual se hace eluir utilizando un gradiente de NaCl (intervalo 300-600 mM). Determinando el área bajo el pico del virus se puede calcular el número de partículas de virus. Para determinar el número de unidades infecciosas (UI) por ml presentes en un lote de virus, se realizan titulaciones sobre células 911. Para este fin, se siembran 4 x 10^{4} células por pocillo de placas de 96 pocillos en las hileras B, D, y F en un volumen total de 100 \mul por pocillo. Tres horas después de la siembra, las células están ancladas al soporte de plástico después de lo cual se puede separar el medio. Se añade a las células un volumen de 200 \mul, por duplicado, conteniendo diferentes diluciones de virus (intervalo: diluido 10^{2} veces a 2 x 10^{9}). Rastreando en cuanto a CPE se considera que la mayor dilución de virus que todavía rinde CPE al cabo de 14 días contiene al menos una unidad infecciosa. La utilización de esta observación, junto con la cantidad calculada de volumen de virus presente en estos pocillos rinde el número de unidades infecciosas por ml de un lote de virus dado. Los resultados de la producción es decir las partículas de virus por ml y las UI por ml o aquellos adenovirus quiméricos que habían sido producidos hasta entonces, se muestran en la tabla 4.

Ejemplo 4

Infección re-dirigida de adenovirus quiméricos

Para demostrar la infección re-dirigida in vitro de los adenovirus quiméricos para la proteína de la fibra, se utilizó un panel de líneas celulares humanas de diferentes orígenes. En este panel se incluían entre otras células hepáticas humanas, fibroblastos primarios, líneas celulares derivadas hematopoyéticas, células musculares lisas primarias, sinoviocitos primarios, y células primarias derivadas de líquido amniótico tales como amniocitos y villi coriónicos. Estos tipos celulares fueron infectados con un panel de adenovirus quiméricos que diferían en la proteína de la fibra. Para este fin se sembraron células diana a una concentración de 10^{5} células por pocillo de placas de 6 pocillos en 2 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Life Technologies, Holanda) suplementado con suero de ternera fetal al 10%. Veinticuatro horas más tarde el medio es remplazado por medio de nueva aportación conteniendo los adenovirus quiméricos diferentes a una MOI creciente de 0, 10, 50, 250, 1250, 2500, 5000 (MOI basado en partículas de virus por célula). Aproximadamente 2 horas después de la adición de virus el medio que contenían el virus se descarta, las células se lavan una vez con PBS, y con posterioridad se añaden 2 ml de medio de nueva aportación (no conteniendo virus) a cada pocillo. Cuarenta y ocho horas más tarde las células son cosechadas, lavadas y sedimentadas mediante centrifugación 5 minutos a 1500 rpm. Las células son lisadas con posterioridad en 0,1 ml de tampón de lisis (Tritón-X-100 al 1%, Glicerol al 15%, EDTA 2 mM, DTT 2 mM, y MgCl_{2} 25 mM en tampón Tris-fosfato pH 7,8) después de lo cual se mide la concentración de proteína total del producto lisado (Biorad, patrón de proteína II). Para determinar la expresión del gen marcador (actividad luciferasa) se mezclan 20 \mul de la muestra de proteína con 100 \mul de sustrato de luciferasa (Luciferine, Promega, Holanda) y con posterioridad se mide en un aparato Lumat LB 9507 (EG & G Berthold, Holanda). Los resultados de estos experimentos de infección, dados como la cantidad de actividad luciferasa (RLU) por \mug de proteína, se muestran en la Tabla 5. estos resultados demuestran claramente que la alteración de la proteína de la fibra produce una alteración de la gama de huésped del adenovirus de serotipo 5.

Ejemplo 5

Uso del receptor de los adenovirus quiméricos para la fibra

Para determinar qué moléculas celulares son utilizadas por los adenovirus quiméricos para la fibra se midió la expresión de proteínas que se sabe que están implicadas en la infección por adenovirus de serotipo 5 es decir receptor del adenovirus de Coxsackie (CAR), MHC de clase I, e integrinas (\alphaV\beta3, \alphav\beta5). Para este fin se transfirieron 1 x 10^{5} células diana a tubos (4 tubos por tipo celular) diseñados para la citometría de flujo. Las células fueron lavadas una vez con PBS/BSA al 0,5% después de lo cual las células fueron sedimentadas mediante centrifugación durante 5 minutos a 1750 rpm a la temperatura ambiente. Con posterioridad, se añadieron 10 \mul de un anticuerpo \alpha_{v}\beta3 diluido 100 veces (Mab 1961, Brunswick Chemie, Amsterdam, Holanda), un anticuerpo \alpha_{v}\beta5 diluido 100 veces (anticuerpo Mab 1976, Brunswick Chemie, Amsterdam, Holanda), o un anticuerpo CAR diluido 2000 veces (una amable donación del Dr. Bergelson, Harvard Medical School, Boston, USA (Hsu y col.)) al sedimento celular después de lo cual las células fueron incubadas durante 30 minutos a 4ºC en un entorno oscuro. Tras esta incubación, las células fueron lavadas dos veces con PBS/BSA al 0,5% y de nuevo sedimentadas mediante centrifugación durante 5 minutos a 1750 rpm a la temperatura ambiente. Para marcar las células, se añadieron 10 \mul de IgG1 anti-ratón de rata marcada con ficoeritrina (PE) al sedimento celular después de lo cual las células fueron incubadas de nuevo durante 30 minutos a 4ºC en un entorno oscuro. Finalmente las células fueron lavadas dos veces con PBS/BSA al 0,5% y analizadas en un citómetro de flujo. Los resultados de estos experimentos se muestran en la tabla 6. Asimismo, en la tabla 6 se incorpora la eficacia de infección de un adenovirus del subgrupo A, B, C, D, y F. Estos datos muestran claramente que la infección de un adenovirus del subgrupo C se corresponde con la expresión de CAR. Los datos también demuestran que los adenovirus quiméricos que portan una fibra de adenovirus del subgrupo B, D, o F pueden infectar células que no expresan niveles medibles de la proteína CAR siendo por tanto capaces de infectar las células por rutas diferentes (independiente de CAR).

Ejemplo 6

Radiomarcaje de partículas de adenovirus

Para permitir el rastreo de la infección de los serotipos de adenovirus de tipo salvaje, se marcaron estos virus con I^{123}/I^{125} radiactivo o con sondas fluorescentes antes de la infección. Utilizando la microscopía fluorescente o midiendo la radiactividad, se determina la eficacia de la infección de diferentes serotipos en tipos celulares concretos. Para demostrar la infección re-dirigida in vivo de adenovirus quiméricos para la proteína de la fibra, se inyectaron 1 x 10^{9} partículas infecciosas a través de la vena de la cola en ratones CBA/ca (2 ratones por cada adenovirus quimérico). La detección de la infección por adenovirus en tejidos específicos es controlada a dos niveles diferentes: 1) La unión de adenovirus quimérico es controlada mediante marcaje radiactivo del adenovirus (Eisenlohr y col., 1987; Matlin y col., 1981; Richman y col. 1998). Una hora después del reparto sistémico in vivo a través de la vena de la cola los ratones son sacrificados después de lo cual se investiga midiendo la radiactividad en diversos órganos c.q. tejidos. 2) La infección exitosa es controlada mediante la expresión del gen de adenovirus del gen marcador es decir actividad lacZ o luciferasa. Cuatro días después de la administración los ratones son sacrificados después de lo cual los órganos y tejidos son aislados. Entre las muestras se incluían hígado, bazo, tracto gastrointestinal, sangre periférica, médula ósea, aorta, músculo etc. Utilizando esta estrategia, se puede investigar la unión preferida de adenovirus quiméricos con los tejidos de interés. Por otra parte, utilizando esta estrategia, se pueden determinar los adenovirus quiméricos de infección preferida en células específicas de órganos concretos.

Se activo I^{123} (Cygne BV, Holanda) o I^{125} (Amersham) de 80 \muCi mediante incubación durante seis minutos a la temperatura ambiente en un tubo pre-cubierto Iodogen (Pierce) en 100 \mul de tampón de yodación (Tris 25 mM, pH 8, NaCl 0,4 M). La reacción de radiomarcaje se inició transfiriendo el Yodo activado a un tubo Eppendorf conteniendo 1,5 x 10^{10} partículas de adenovirus en 100 \mul de tampón de yodación. Se dejó que la reacción prosiguiera durante nueve minutos a la temperatura ambiente, después de lo cual la marca incorporada fue separada de la marca libre mediante filtración en gel, utilizando una columna Sephadex 25 (P-10, Pharmacia). En este punto, la columna P-10 fue pre-lavada con 10 ml de tampón PBS y con posterioridad cargada con la reacción de radiomarcaje, suplementada con dos ml de tampón de yodación. Tras descartar el primer flujo, la columna se hizo eluir con tampón PBS en etapas de 0,5 ml, y las diferentes fracciones se recogieron en tubos separados. La marca libre, que es ralentizada por la columna, se concentró en las fracciones 10-16. Las partículas de virus radiomarcadas se acumulaban predominantemente en las fracciones 4, 5 y 6, correspondientes a un volumen eluido total de 2-3 ml. La radiactividad de estas fracciones que contenían virus fue medida y expresada como cuentas por minuto (cpm), dando como resultado hasta 5 x 10^{6} cpm por 10^{10} partículas de virus.

Se realizaron numerosos experimentos de control para asegurar la integridad de las partículas de virus tras las diversas manipulaciones. Por ejemplo, se incluía una reacción en la que las partículas de virus experimentaban un tratamiento idéntico pero con la omisión de Yodo radiactivo. Las partículas de virus eluido fueron utilizadas con posterioridad para infectar células A549. La cantidad de células infectadas fue establecida mediante la expresión de un gen marcador visual tal como LacZ. Además, se utilizaron pequeñas alícuotas de aquellas fracciones eluidas que representaban adenovirus radiomarcado para infectar células A549 para someter a ensayo la expresión del transgen, que se tomó como una indicación de la viabilidad del virus del lote de virus específico utilizado.

Las partículas de virus radiomarcadas pueden ser utilizadas con posterioridad para diversos estudios in vitro e in vivo para determinar la afinidad por los diferentes tipos celulares o por los diferentes órganos. Para los estudios in vitro, se siembran diferentes líneas celulares tales como por ejemplo HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humana) o SMC (células de músculo liso) en placas de 24 pocillos en el medio de cultivo apropiado, y se infectan con partículas de adenovirus radiomarcadas a una multiplicidad de infección de 10, 100 y 1000. Como control, se incuban las células con una cantidad similar de todo libre. Dos horas después de la infección, las células son lavadas extensamente con tampón PBS, y se mide la radiactividad restante. La cantidad de radiactividad que queda asociada con las células, corregida para la cantidad de radiactividad de las células de control incubadas con la marca libre, es una medida directa de la cantidad de virus que está anclado a o ha penetrado en las células.

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Para los estudios in vivo, se comparó la biodistribución de adenovirus que difieren solamente en el origen de sus proteínas de la fibra. En este punto, se colocaron ratas bajo anestesia general y se les administraron intravenosamente (iv) 0,1-2 MBq de partículas de adenovirus radiomarcadas en la vena de la cola. Como control, una rata recibía una dosis comparable de todo libre solamente. Los animales fueron colocados con posterioridad sobre un escáner gamma y escaneados durante 10 minutos, para localizar la fuente de radiación gamma y determinar de este modo la biodistribución in vivo de los adenovirus introducidos sistémicamente. Al cabo de una hora, los animales fueron sacrificados y la mayor parte de los órganos separados para pesarlos y para la cuantificación exacta de la radiactividad utilizando un contador de centelleo. La distribución de la radiactividad en los diversos órganos tras la administración iv es expresada como cpm por gramo de tejido, y se muestra en la figura 8.

Ejemplo 7

Infección de células primarias humanas de líquido amniótico

En la Tabla 5 (ejemplo 4) se muestran los resultados de la infección tanto en células amnióticas como en villi coriónicos. Estos tipos celulares son aislados de líquido amniótico y cultivados ex vivo en condiciones normalizadas (Roest y col. 1996). Tales células sin dianas ideales para su uso en la diagnosis prenatal. Por ejemplo, en algunos casos (aproximadamente 50-100 anualmente) es imposible la diagnosis prenatal de la distrofina muscular utilizando los mecanismos normalizados tales como la PCR transcrita inversa o la PCR del ADN debido a que las mutaciones del gen de la distrofina son desconocidas y el nivel de distrofina producida en las células de los villi coriónicos no diferenciados o de las células de los villi amnióticos es muy bajo. En estos casos se realiza el aislamiento y la rápida diferenciación de las células de los villi coriónicos predominantemente. Estos villi coriónicos son infectados con posterioridad con un retrovirus (Roest y col. 1996) o un adenovirus que porta el ADNc de MyoD (Roest y col. 1999) que, tras la transducción, desencadena la diferenciación de los villi coriónicos en células musculares estriadas en una semana. Una vez completada la diferenciación estas células pueden ser utilizadas después para el análisis Western, o inmunohistoquímicamente para determinar si la proteína distrofina es expresada. Hasta la fecha, la eficacia de la infección de las células de los villi coriónicos ha sido decepcionante con solamente un 2-5% de células transducidas con un retrovirus (Roest y col. 1996). Utilizando un adenovirus de serotipo 5 para repartir el ADNc de MyoD a los villi coriónicos aproximadamente el 10%-20% (Roest y col. 1999) de las células pueden ser transducidas pero solamente cuando se utiliza una elevada multiplicidad de infección (MOI) que da como resultado una toxicidad no deseada y por lo tanto muerte celular. Los resultados de la Tabla 5 demuestran claramente que el adenovirus de serotipo 5 no es el candidato ideal para transducir las células de los villi coriónicos puesto que solamente se mide la actividad luciferasa marginal (75 RLU/\mug de proteína) a la MOI más alta sometida a ensayo (MOI = 5000 partículas de virus/\mug de proteína). Estos resultados son confirmados utilizando la citometría de flujo para la presencia de receptor del adenovirus de Coxsackie (CAR) y de las integrinas que demuestra que los receptores para el adenovirus de serotipo 5 están presentes sólo marginalmente en los villi coriónicos (Tabla 6). Sorprendentemente, el vector basado en el adenovirus de serotipo 5 que contiene una fibra de cualquier subgrupo B (fibra 16 y/o 51) o del subgrupo F (fibra 40-L) transduce los villi coriónicos con una elevada eficacia. El vector que mejor lo hace, basado en la actividad luciferasa es el adenovirus 5 con la fibra 40-L que produce 1.688.028 unidades de luz relativa por \mug de proteína, una expresión transgénica incrementada >20.000 veces en comparación con el adenovirus de serotipo 5. Este vector puede ser utilizado por tanto para transducir las células presentes en el líquido amniótico para permitir una rápida diferenciación para los fines descritos antes, para inhibir la expresión génica durante el desarrollo prenatal, o para transferir y expresar el ácido nucleico de interés en el fluido amniótico.

Ejemplo 8

Generación de virus basados en el adenovirus de serotipo 5 con proteína de la hexona quimérica.

El método descrito más abajo para generar adenovirus recombinantes mediante co-transfección de dos, o más secuencias de adenovirus clonadas separadas. Estas secuencias adenovirales clonadas fueron utilizadas con posterioridad para separar secuencias de adenovirus de serotipo 5 específicas con el fin de generar clones molde que permitan la fácil introducción de las secuencias de ADN derivadas de otros serotipos de adenovirus. Como ejemplo de estos clones molde, se proporciona la construcción de plásmidos que permiten el intercambio de ADN que codifica la proteína de la hexona.

Generación de clones molde de adenovirus que carecen de ADN que codifica la hexona

Las secuencias codificadoras de la hexona del adenovirus de serotipo 5 están localizadas entre los nucleótidos 18841 y 21697. Para facilitar el fácil intercambio de las secuencias codificadoras de la hexona de serotipos de adenovirus alternativos al esqueleto del adenovirus de serotipo 5, primero se generó un vector lanzadera. Este subclon, codificado pBr/Ad.Eco-PmeI, fue generado digiriendo primero el plásmido pBr322 con EcoRI y EcorW e insertando el fragmento PmeI-EcoI de pWE/Ad.AflII-Eco. En este vector lanzadera se realizó una deleción de un fragmento SanDI de 1430 pb mediante digestión con SanDI y religadura para dar pBr/Ad.Eco-PmeI\DeltaSanDI. El fragmento separado contiene sitios SpeI y MunI únicos. A partir de Pbr/Ad.Eco-PmeI\DeltaSanDI se suprimió el ADN del adenovirus de serotipo 5 que codificaba la hexona. A este fin, las secuencias que flanqueaban la hexona fueron amplificadas mediante PCR y conectadas entre sí generando de ese modo sitios de restricción únicos que remplazaban la región codificadora de la hexona. Para estas reacciones de PCR se requerían cuatro oligonucleótidos diferentes: \Deltahex1-\Deltahex4.

: \Deltahex1: 5'-CCT GGT GCT GCC AAC AGC-3'

: \Deltahex2: 5'-CCG GAT CC A CTA GTG GAA AGC GGG CGC GCG-3'

: \Deltahex3: 5'-CCG GAT CC A ATT GAG AAG CAA GCA ACA TCA ACA AC-3'

: \Deltahex4: 5'-GAG AAG GGC ATG GAG GCT G-3' (ver la figura 9).

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El producto de ADN amplificado de \pm 1100 pb obtenido con los oligonucleótidos \Deltahex1 y \Deltahex2 fue digerido con BamHI y FseI. El producto de ADN amplificado de \pm 1600 pb obtenido con los oligonucleótidos \Deltahex3 y \Deltahex4 fue digerido con BamHI y SbfI. Estos fragmentos de PCR digeridos fueron purificados con posterioridad en gen de agarosa y en una reacción de ligadura de tres partes utilizando la enzima ligasa de T4 conectada a pBr/Ad.Eco-PmeI \DeltaSanDI digerido con FseI y SbfI. El constructo resultante fue codificado pBr/Ad.Eco-Pme\DeltaHexon. Este constructo fue secuenciado en parte para confirmar la secuencia de nucleótidos correcta y la presencia de los sitios de restricción únicos MunI y SpeI.

Amplificación de secuencias de la hexonas de los serotipos de adenovirus

Para permitir la amplificación de los ADN que codifican la proteína de la hexona derivada de serotipos alternativos se sintetizaron oligonucleótidos degenerados. Para este fin, fueron alineadas las primeras secuencias de ADN conocidas que codificaban la proteína de la hexona de los serotipos alternativos para identificar las regiones conservadas tanto del extremo N como del extremo C de la proteína de la hexona. A partir del alineamiento, que contenía la secuencia de nucleótidos de 9 serotipos diferentes que representaban 5 de los 6 subgrupos conocidos, (se sintetizaron oligonucleótidos (degenerados). Estos oligonucleótidos fueron codificados HEX-up (5'-GG ACGTGT AAG ATG GCY ACC CCH TCG ATG MTG-3') y HEX-down (5'-CCA TCG ATG GTT ATG TKG TKG CGT TRC CGG C-3'). La reacción de amplificación (50 \mul) contenía dNTP 2 mM, 25 pmoles de cada oligonucleótido, 1 x tampón para PCR estándar, MgCl_{2} 1,5 mM, y 1 Unidad de polimerasa estable al calor Pwo (Boehringer) por reacción. El programa de ciclación contenía 20 ciclos, constando cada uno de 30 segundos a 94ºC, 60 segundos a 60-64ºC, y 120 segundos a 72ºC. Se hizo circular una décima parte del producto de la PCR sobre un gel de agarosa lo que demostró que un fragmento de ADN se había amplificado. De cada molde diferente, se realizaron dos reacciones de PCR independientes después de lo cual los fragmentos de las independientes obtenidos fueron secuenciados para determinar la secuencia de nucleótidos. A partir de los 9 serotipos diferentes, se pudo comparar la secuencia de nucleótidos con las secuencias presentes en GenBank. De todos los demás serotipos, se desconoce la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína De la hexona. A este fin, se ha amplificado mediante PCR la secuencia de la hexona de cada serotipo, excepto de los serotipos 1, 8, 13, y 18. La secuencia de la proteína de la hexona de los serotipos 34, 35, 36, y 41 se proporciona en la
figura 10.

Generación de constructos de ADN adenoviral quiméricos para la Hexona

Todos los ADN de las hexonas amplificados así como el vector (pBr/Ad.Eco-Pme\DeltaHexon) fueron digeridos con MunI y SpeI. Los ADN digeridos se hicieron circular en gel de agarosa después de lo cual los fragmentos se aislaron del gel y se purificaron utilizando el estuche GeneClean (Bio101 Inc.). Los fragmentos de la PCR fueron clonados después en los sitios MunI y SpeI de pBr/Ad.Eco-Pme\DeltaHexon, generando de este modo pBr/Ad.Eco-Pme\DeltaHexXX (donde XX representa el número del serotipo del cual se ha aislado el ADN de la fibra). A este fin la secuencia de la hexona de los serotipos 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 14, 15, 16, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 46, 47, 48, 49, 50, 51 han sido clonadas en pBr/Ad.Eco-Pme\DeltaHexXX. A partir de pBr/Ad.Eco-Pme\DeltaHexXX (donde XX es 20, 25, 26, 28, 30, 34, 35) se aisló un fragmento AscI de 9,6 kb que abarcaba la secuencia de la hexona por medio de electroforesis en gel y un protocolo con agarasa (Boehringer Mannheim, Holanda). Este fragmento AscI fue clonado con posterioridad en el cósmido pWE/AD.AflII-rITRsp (ver el ejemplo 1) que fue digerido por completo con AscI y desfosforilado como se ha descrito previamente. Esta clonación cosmídica dio como resultado la formación del constructo pWE/Ad.AflII-rITR/HexXX (donde XX representa el número del serotipo del cual se ha aislado el ADN de la hexona).

Generación de adenovirus recombinante quimérico para la proteína de la hexona

Para generar virus Ad5 recombinante que portara la hexona de serotipos alternativos, se transfectaron dos constructos, pCLIP.Luc, pWE/Ad.AflII-rITR/HexXX en células productoras de adenovirus. Para la transfección, se diluyeron 4 \mug de pCLIP.Luc, y 4 \mug de pWE/Ad.AflII-rITR/HexXX en DMEM libre de suero hasta 100 \mul de volumen total. A esta suspensión de ADN se añadieron 100 \mul de 2/3 x lipofectamina diluida (Gibco). Al cabo de 30 minutos a la temperatura ambiente la solución de complejo de ADN-lipofectamina se añadió a 2,5 ml de DMEM libre de suero que se añadieron con posterioridad a un matraz para el cultivo de tejidos T25 cm^{2} (las células lavadas con 5 ml de medio libre de suero antes de la adición del complejo de ADN-lipofectamina). Este matraz contenía 3 x 10^{6} células PER.C6 que fueron sembradas 24 horas antes de la transfección. Dos horas más tarde, el medio que contenía el complejo de ADN-lipofectamina fue diluido una vez mediante la adición de 2,5 ml de DMEM suplementado con suero de ternera fetal al 20%. De nuevo 24 horas más tarde el medio fue remplazado por DMEM de nueva aportación suplementado con suero de ternera fetal al 10%. Las células fueron cultivadas durante 6-8 días, cosechadas con posterioridad, y congeladas/descongeladas. El desecho celular se separó mediante centrifugación durante 5 minutos a 3000 rpm a la temperatura ambiente. Del sobrenadante (12,5 ml) se utilizaron 3-5 ml para infectar de nuevo las células PER.C6 (matraces para el cultivo de tejidos T80 cm^{2}).

Neutralización re-dirigida hacia los adenovirus quiméricos para la hexona

Para demostrar una respuesta inmune alterada hacia los adenovirus quiméricos, los autores de la presente invención sometieron a ensayo primero 75 sueros derivados de pacientes humanos (25 pacientes con cáncer, 50 pacientes con artritis reumatoide) en cuanto a la toxicidad sobre las células humanas 911. Para este fin, se sembraron células 911 a una concentración de 3 x 10^{4} células por pocillo en placas de microtitulación de 96 pocillos. Veinticuatro horas más tarde el medio de todos los pocillos, excepto para los pocillos A1-H1, A5-H5 y A9-H9, fue remplazado por 50 \mul de DMEM suplementado con suero de ternera fetal al 5%. A los pocillos A1, A2, B1, y B2, se añadieron 50 \mul de suero del paciente 1. Del mismo modo, a los pocillos C1, C2, D1, y D2, se añadieron 50 \mul de suero del paciente 2 etc. Con posterioridad, se transfirieron 50 \mul de los pocillos A2-H2 a A3-H3 después de lo cual se transfirieron 50 \mul de los pocillos A3-H3 a A4-H4. De este modo este programa de ensayo dio como resultado una dilución de suero de 0x, 2x, 4x, y 8x para el suero de cada paciente. Un tratamiento idéntico de los pocillos A5-H5 a A8-H8, y A9-H9 a A12-H12 da como resultado 12 sueros sometidos a ensayo por placa de microtitulación de 96 pocillos. De 75 sueros de pacientes humanos sometidos a ensayo en total, 25 sueros sin aparente toxicidad sobre las células 911 humanas fueron sometidos a ensayo con posterioridad en cuanto a la presencia de anticuerpos capaces de neutralizar la infección por adenovirus quimérico. Para este fin, se llenaron placas de microtitulación de 96 pocillos con 50 \mul de DMEM suplementado con suero de ternera fetal al 5% excepto los pocillos A1-H1. A los pocillos A1, A2, B1, y B2, se añadieron 50 \mul de suero del paciente 1. Del mismo modo, a los pocillos C1, C2, D1, y D2, se añadieron 50 \mul del suero del paciente 2 etc. Con posterioridad, se transfirieron 50 \mul de los pocillos A2-H2 a pocillos A3-A4 después de lo cual se transfirieron 50 \mul de A3-H3 a A4-H4 etc. hasta A12-H12 (intervalo de dilución: 0 - 1/2048). De los pocillos A12-H12, se descartaron 50 \mul. A continuación se añadieron 50 \mul de virus después de lo cual las placas de microtitulación se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Tras la adición de 50 \mul de suspensión de células 911 (3 x 10^{4} células/pocillo) las placas fueron incubadas durante 7-9 días después de lo cual se puntuó la capacidad neutralizadora mediante la ausencia, presencia, o gravedad del CPE. Como controles durante estos experimentos se tomaron la ausencia de suero, la ausencia de virus, y la ausencia de suero y virus. Basándose en estos experimentos se identifican diversos virus quiméricos para los cuales son generados pocos anticuerpos neutralizadores por los humanos. Se realizan experimentos similares a los descritos antes con serotipos de adenovirus de tipo salvaje tanto de humanos como de animales para rastrear los serotipos que son menos propensos a la neutralización debido al sistema de defensa del huésped. Estos experimentos aunque similares se desarrollan de tal manera que permiten un rastreo de elevado rendimiento de muchas muestras de una vez. Este análisis se describe más abajo.

Un análisis de elevado rendimiento para la detección de la actividad neutralizadora en suero humano

Para permitir el rastreo de una gran cantidad de suero humano en cuanto a la presencia de anticuerpos neutralizadores contra todos los serotipos de adenovirus, se desarrolló un análisis de 96 pocillos automatizado.

Sueros humanos

Se seleccionó un panel de 100 individuos. Los voluntarios (50% hombres, 50% mujeres) eran individuos sanos entre 20 y 60 años de edad sin restricción de raza. Todos los voluntarios firmaron un impreso con su consentimiento. Se excluyeron las personas profesionalmente implicadas en la investigación de adenovirus.

Se recogieron aproximadamente 60 ml de sangre en tubos secos. A las dos horas de la toma de las muestras, la sangre fue centrifugada a 2500 rpm durante 10 minutos. Se transfirieron aproximadamente 30 ml de suero a tubos de polipropileno y se almacenaron congelados a -20ºC hasta un nuevo uso.

El suero fue descongelado e inactivado con calor a 56ºC durante 10 minutos y después se tomaron alícuotas para evitar ciclos repetidos de congelación descongelación. Parte fue utilizada para realizar cinco etapas de diluciones a la mitad en medio (DMEM, Gibco BRL) en una cantidad suficiente para llenar aproximadamente 70 placas de 96 pocillos. Las alícuotas de suero no diluido y diluido fueron pipeteadas en placas de pocillos profundos (formato 96 pocillos) y utilizando una PlateMate programada se dispensaron en alícuotas de 100 \mul en placas de 96 pocillos. De este modo las placas fueron cargadas con ocho sueros diferentes por duplicado (100 \mul/pocillo) según el siguiente esquema:

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S1/2	S1/4	S1/8	S1/16	S1/32	S5/2	S5/4	S5/8	S5/16	S5/32	-	-
S1/2	S1/4	S1/8	S1/16	S1/32	S5/2	S5/4	S5/8	S5/16	S5/32	-	-
S2/2	S2/4	S2/8	S2/16	S2/32	S6/2	S6/4	S6/8	S6/16	S6/32	-	-
S2/2	S2/4	S2/8	S2/16	S2/32	S6/2	S6/4	S6/8	S6/16	S6/32	-	-
S3/2	S3/4	S3/8	S3/16	S3/32	S7/2	S7/4	S7/8	S7/16	S7/32	-	-
S3/2	S3/4	S3/8	S3/16	S3/32	S7/2	S7/4	S7/8	S7/16	S7/32	-	-
S4/2	S4/4	S3/8	S3/16	S3/32	S8/2	S8/4	S8/8	S8/16	S8/32	-	-
S4/2	S4/4	S3/8	S3/16	S3/32	S8/2	S8/4	S8/8	S8/16	S8/32	-	-

Donde S1/2 a S8/2 en las columnas 1 y 6 representan sueros diluidos 1x y Sx/4, Sx/8, Sx/16 y Sx/32 las diluciones seriadas a la mitad. Las últimas placas también contenían cuatro pocillos llenos con 100 \mul de suero de ternera fetal como control negativo. Las placas fueron mantenidas a -20ºC hasta nuevo uso.

Preparación de soluciones de partida de adenovirus humano

Los prototipos de todos los adenovirus humanos conocidos fueron inoculados en matraces T25 con células PER.C6 (Fallaux y col. 1998) y cosechados tras un CPE completo. Tras congelar/descongelar se utilizaron 1-2 ml de productos lisados brutos para inocular un matraz T80 con células PER.C6 y el virus fue cosechado a un CPE completo. El marco temporal entre la inoculación y la aparición de CPE así como la cantidad de virus necesaria para re-infectar un nuevo cultivo, diferían entre los serotipos. Las soluciones de partida de adenovirus fueron preparadas mediante congelación/ descongelación y se utilizaron para inocular 3-4 matraces de tres capas T175 cm^{2} con células PER.C6. Tras la aparición de CPE, las células se cosecharon golpeando el matraz con los dedos, se sedimentaron y el virus se aisló y se purificó mediante un gradiente en CsCl de dos etapas como sigue. Los sedimentos celulares fueron disueltos en 50 ml de tampón NaPO_{4} 10 mM (pH 7,2) y congelados a -20ºC. Después de descongelar a 37ºC, se añadieron 5,6 ml de desoxicolato de sodio (5% p/v). La solución se mezcló suavemente y se incubó durante 5-15 minutos a 37ºC para lisar completamente las células. Después de homogeneizar la solución, se añadieron 1875 \mul de MgCl_{2} 1M. Tras la adición de 375 \mul de ADNasa (10 mg/ml) la solución se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Los restos celulares se separaron por centrifugación a 1880xg durante 30 minutos a la temperatura ambiente sin interrupción. El sobrenadante se purificó con posterioridad de las proteínas mediante extracción con freón (3x). El sobrenadante aclarado se cargó en un gradiente por bloques de cloruro de cesio tamponado con Tris/HCl 1 M (intervalo: 1,2/1,4 gr/ml) y se centrifugó a 21.000 rpm durante 2,5 horas a 10ºC. La banda de virus se aisla después de lo cual se realiza una segunda purificación utilizando un gradiente continuo tamponado con Tris/HCl 1M de 1,33 gr/ml de cloruro de cesio. El virus fue centrifugado después durante 17 horas a 55.000 rpm a 10ºC. La banda de virus se aisla y se añade sacarosa (50% p/v) a una concentración final del 1%. El exceso de cloruro de cesio se separa mediante diálisis (tres veces 1 hora a la temperatura ambiente) en portas para diálisis (Slide-a-lizer, corte 10.000 kDa, Pierce, USA) frente a 1,5 litros de PBS suplementado con CaCl_{2} (0,9 mM), MgCl_{2} (0,5 mM) y una concentración creciente de sacarosa (1, 2, 5%). Después de la diálisis, el virus es separado del "slide-a-lizer" después de lo cual se toman alícuotas en porciones de 25 y 100 \mul tras lo cual el virus es almacenado a -85ºC.

Para determinar el número de partículas de virus por mililitro, se hacen pasar 50 \mul del lote de virus por una cromatografía líquida de alta presión (HPLC) como describen Shabram y col. (1997). Los virus se hicieron eluir utilizando un gradiente de NaCl que oscilaba de 0 a 600 mM. Como se representa en la tabla I, la concentración de NaCl a la cual eluían los virus difería significativamente entre los serotipos.

La mayor parte de los adenovirus humanos replicaban bien en las células PER.C6 con pequeñas excepciones. Los adenovirus de tipo 8 y 40 se hicieron crecer en células 911-E4 (He y col., 1998). Las soluciones de partida purificadas contenían entre 5 x 10^{10} y 5 x 10^{12} partículas de virus/ml (VP/ml).

Titulación de soluciones de partida de adenovirus humano purificado

Los adenovirus fueron titulados en células PER.C6 para determinar la cantidad de virus necesaria para obtener un CPE completo en cinco días, la duración del análisis de neutralización. A este fin, se dispensaron 100 \mul de medio en cada pocillo de las placas de 96 pocillos. Se añadieron 25 \mul de soluciones de partida de adenovirus prediluidas 10^{4}, 10^{5}, 10^{6} o 10^{7} veces a la columna 2 de una placa de 96 pocillos y se mezclaron pipeteando arriba y abajo 10 veces. Después se llevaron 25 \mul de la columna 2 a la columna 3 y de nuevo se mezclaron. Esto se repitió hasta la columna 11 después de lo cual se descartaron 25 \mul de la columna 11. De este modo se obtuvieron diluciones seriadas en etapas de 5 partiendo de una solución de partida prediluida. Después se añadieron 3x10^{4} células PER.C6 en un volumen de 100 \mul y las placas se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante cinco o seis días. Se controló microscópicamente el CPE. Se utilizó el método de Reed y Muensch para calcular la dosis inhibidora del cultivo celular en un 50% (DICC50).

Análogamente se crearon placas idénticas que fueron analizadas utilizando el análisis MTT (Promega). En este análisis se cuantifican células vivas mediante tinción colorimétrica. A este fin, se añadieron 20 \mul de MTT (7,5 mgr/ml en PBS) a los pocillos y se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante dos horas. El sobrenadante fue separado y se añadieron a los pocillos 100 \mul de una solución 20:1 de isopropanol/tritón-X100. Las placas se pusieron en un sacudidor de 96 pocillos durante 3-5 minutos para solubilizar la tinción precipitada. Se midió la absorbancia a 540 nm y a 690 nm (fondo). Mediante este análisis se pueden distinguir los pocillos con CPE en marcha o con CPE completo.

Análisis de neutralización

Se descongelaron placas de 96 pocillos con muestras de suero humano diluido a 37ºC, CO_{2} al 5%. Se prepararon soluciones de partida de adenovirus diluidas a 200 DICC50 por 50 \mul y se añadieron alícuotas de 50 \mul a las columnas 1-11 de las placas con suero. Las placas fueron incubadas durante 1 hora a 37ºC, CO_{2} al 5%. Después se dispensaron 50 \mul de células PER.C6 a 6 x 10^{5}/ml en todos los pocillos y se incubaron durante 1 día a 37ºC, CO_{2} al 5%. El sobrenadante se separó utilizando puntas de pipeta nuevas para cada fila y se añadieron 200 \mul de medio fresco a todos los pocillos para evitar los efectos tóxicos del suero. Las placas fueron incubadas durante otros 4 días a 37ºC, CO_{2} al 5%. Además, se establecieron placas de control paralelas por duplicado con sueros de control positivos diluidos generados en conejos y específicos para cada serotipo que se iba a someter a ensayo en las filas A y B y con suero de control negativo (FCS) en las filas C y D. Asimismo, en cada una de las filas E-H se realizó una titulación como se ha descrito antes con etapas de dilución a la quinta parte partiendo de una DICC50 de 200 de cada virus que iba a ser sometido a ensayo. El día 5 una de las placas de control fue analizada microscópicamente y con el análisis MTT. Se calculó el título experimental a partir de la placa de titulación de control observada microscópicamente. Si se encontraba que el CPE era completo, es decir la primera dilución en el experimento de titulación de control analizada mediante MTT muestra una clara muerte celular, todas las placas de análisis eran tratadas. Si no, se dejaba continuar el análisis durante uno o más días hasta que el CPE completo era evidente después de lo cual se trataban todas las placas. En la mayoría de los casos el análisis terminaba el día 5. Se considera que una muestra de suero no es neutralizadora cuando a la concentración de suero más elevada se observa una protección máxima del 40% en comparación con los controles sin suero.

Ejemplo 9

Generación de virus basados en Ad5 con proteínas de la pentona quimérica

El método descrito más abajo para generar adenovirus recombinantes mediante co-transfección de dos, o más secuencias de adenovirus clonadas por separado. Estas secuencias adenovirales clonadas fueron utilizadas con posterioridad para separar secuencias de adenovirus de serotipo 5 específicas con el fin de generar clones molde que permitan la fácil introducción de secuencias de ADN derivadas de los otros serotipos de adenovirus. Como ejemplo de estos clones molde, se proporciona la construcción de plásmidos que permiten el intercambio de ADN que codifica la proteína pentónica.

Generación de clones molde de adenovirus que carecen de ADN que codifica la pentona

Primero se elaboró un vector lanzadera para las secuencias de la pentona mediante inserción del fragmento NheI-EcoRV de 7,2 kb del constructo pWE/Ad.AflII-EcoRI (descrito en el ejemplo 1) en pBr322 digerido con las mismas enzimas. El vector resultante fue denominado pBr/XN. De este plásmido se suprimieron las secuencias de la pentona de Ad5 y se remplazaron por sitios de restricción únicos que se utilizaron después para introducir nuevas secuencias de la pentona de otros serotipos. A este fin, se amplificaron las secuencias limítrofes izquierdas de la pentona en pBr/XN mediante PCR utilizando los siguientes cebadores:

: DP5-F: 5'-CTG TTG CTG CTG CTA ATA GC-3' y

: MDP5-R: 5'-CGC GGA TCC TGT ACA ACT AAG GGG AAT ACA AG-3'

DP5-R tiene un sitio BamHI (subrayado) para la ligadura a la secuencia limítrofe derecha y también introduce un sitio BsrGI único (negrita) en el extremo 5' de la primera región de la pentona de Ad5.

La secuencia limítrofe derecha fue amplificada utilizando:

: DP3-F: 5'-CGC GGA TCC CTT AAG GCA AGC ATG TCC ATC CTT-3' y

: DP3-3R: 5'-AAA ACA CGT TTT ACG CGT CGA CCT TTC-3'

DP3-F tiene un sitio BamHI (subrayado) para la ligadura a la secuencia limítrofe izquierda y también introduce un sitio AflII único (negrita) en el extremo 3' de la primera región de la pentona de Ad5.

Los dos fragmentos resultantes de la PCR fueron digeridos con BamHI y ligados entre sí. Después esta mezcla de ligadura fue digerida con AvrII y BglII. pBr/XN también fue digerido con AvrII y BglII y el fragmento vector fue ligado a los fragmentos de PCR ligados digeridos. El clon resultante fue denominado pBr/Ad. \Deltapenton. Las secuencias codificadoras de la pentona de serotipos distintos de Ad5 fueron amplificadas mediante PCR de manera que los extremos 5' y 3' contuvieran los sitios BsrGI y AflII respectivamente. La introducción de estas secuencias de la pentona heterólogas en pBr/Ad.\Deltapenton genera constructos denominados pBr/Ad.pentonXX donde XX representa el número del serotipo correspondiente al serotipo utilizado para amplificar las secuencias de la pentona insertadas. Con posterioridad se introdujeron las secuencias de la nueva pentona en el constructo pWE/Ad.AflII-rITR intercambiando el fragmento FseI común. Importantemente, en lugar de pWE/Ad.AflII-rITR también es posible insertar el fragmento FseI de pBr/Ad.pentonXX en el vector pWE/Ad.AflII-rITR/HexXX o pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX que tiene una secuencia de hexona modificada y/o fibra modificada respectivamente. De este modo el sistema basado en plásmidos para generar adenovirus permite un diseño flexible de cualquier adenovirus con cualquier característica deseada relacionada con la eficacia y la especificidad de infección de las células diana así como con la inmunogenicidad.

Amplificación de secuencias de la pentona de los serotipos de adenovirus

Para permitir la amplificación de los ADN que codifican la proteína de la pentona derivada de serotipos alternativos se sintetizaron oligonucleótidos. De cada subgrupo de adenovirus hasta la fecha solamente se conoce la secuencia de la pentona de un miembro. Por lo tanto, se diseñaron oligonucleótidos basándose en las secuencias conocidas. De este modo, para la amplificación de las secuencias de la pentona del subgrupo C se utilizaron los oligonucleótidos P5-for (5'-gctcgatgtacaatgcggcgcgcggcgatgtat-3') y P5-rev (5'-gctcgacttaagtcaaaaagtgcggctcgatag-3'). Para la amplificación de las secuencias de la pentona del subgrupo B se utilizaron los oligonucleótidos P3-for (5'-gctcgatgtacaatgaggagacgagccgtgcta-3') y P3-rev (5'-gctcgacttaagttagaaagtgcggcttgaaag-3'). Para la amplificación de las secuencias de la pentona del subgrupo D se utilizaron los oligonucleótidos P17-for (5'-gctcgatgtacaatgaggcgtgcggtggtgtcttc-3') y P17-rev (5'-gctcgacttaagttagaaggtgcgactggaaagc-3'). Para la amplificación de las secuencias de la pentona del subgrupo P se utilizaron los oligonucleótidos PF-for (5'-gctcgatgtacaatgagacgtgcggtgggagtg-3') y PF-rev (5'-gctcgacttaagttaaaacgtgcggctagacag-3'). Todos los oligonucleótidos directos ("forward") contienen un sitio de restricción BsrGI en su extremo 5' y todos los oligonucleótidos inversos ("reverse") contienen un sitio de restricción AflII en el extremo 5'.

La reacción de amplificación (50 \mul) contenía dNTP 2 mM, 25 pmoles de cada oligonucleótido, 1 x tampón de PCR normalizado, MgCl_{2} 1,5 mM, y 1 Unidad de polimerasa estable al calor Pwo (Boehringer) por reacción. El programa de ciclación contenía 20 ciclos, constando cada uno de 30 segundos a 94ºC, 60 segundos a 60-64ºC, y 120 segundos a 120 segundos a 72ºC. Una décima parte del producto de la PCR se hizo circular sobre un gel de agarosa lo que demostró que se había amplificado un fragmento de ADN. De cada molde diferente, se realizaron dos reacciones de PCR independientes después de lo cual los fragmentos de PCR independientes obtenidos son secuenciados para determinar la secuencia de nucleótidos. De los 51 serotipos humanos se han amplificado 20 secuencias de pentona.

Generación de constructos de ADN adenovirales quiméricos para la pentona

Todos los ADN de las pentonas amplificados así como el vector (pBr/Ad.\Deltapenton) fueron digeridos con BsrGI y AflII. Los ADN digeridos se hicieron circular con posterioridad sobre un gel de agarosa después de lo cual los fragmentos fueron aislados del gel y purificados utilizando el estuche Geneclean (Bio101 Inc.). Los fragmentos de la PCR fueron clonados después en los sitios BsrGI y AflII de pBr/Ad.\Deltapenton, generando de este modo pBr/Ad.pentonXX (donde XX representa el número del serotipo del cual se ha aislado el ADN de la pentona). Hasta aquí se ha clonado la secuencia de la pentona de los serotipos 2, 3, 5, 6, 7, 11, 21, 26, 35, 39, 40, 41, 42, 47, 48, 49 y 51 en pBr/Ad.pentoXX. A partir de pBr/Ad.pentonXX se aisló un fragmento FseI de 5,1 kb que abarcaba la secuencia de la pentona por medio de electroforesis en gel y Geneclean. Este fragmento FseI fue clonado con posterioridad en el cósmido pWE/Ad.AflII-rITR (ver ejemplo 1) que había sido digerido por completo con FseI y desfosforilado como se ha descrito previamente. Esta clonación cosmídica dio como resultado la formación del constructo pWE/Ad.AflII-rITR/PentonXX (donde XX representa el número del serotipo del cual se había aislado el ADN de la pentona).

Generación de adenovirus recombinante quimérico para la proteína de la pentona

Para generar virus Ad 5 recombinante que portara la Pentona de serotipos alternativos se transfectaron dos constructos, pCLIP.Luc y pWE/Ad.AflII-rITR/PenXX en células productoras de adenovirus.

Para la transfección, se diluyeron 4 \mug de pCLIP.Luc y 4 \mug de pWE/Ad.AflII/PentonXX) en DMEM libre de suero a 100 \mul de volumen total. A esta suspensión de ADN se añadieron 100 \mul de 1x lipofectamina diluida (Gibco). Al cabo de 30 minutos a la temperatura ambiente se añadió la solución de complejo de ADN-lipofectamina a 2,5 ml de DMEM libre de suero que con posterioridad se añadió a un matraz para el cultivo de tejidos T25 cm^{2}. Este matraz contenía 2 x 10^{6} células PER.C6 que fueron sembradas 24 horas antes de la transfección. Dos horas más tarde, se diluyó el medio que contenía el complejo de ADN-lipofectamina una vez mediante la adición de 2,5 ml de DMEM suplementado con suero de ternera fetal al 20%. De nuevo 24 horas más tarde el medio fue remplazado por DMEM de nueva aportación suplementado con suero de ternera fetal al 10%. Las células fueron cultivadas durante 6-8 días, cosechadas con posterioridad, y congeladas/descongeladas 3 veces. Se separó el desecho celular mediante centrifugación durante 5 minutos a 3000 rpm a la temperatura ambiente. Del sobrenadante (12,5 ml) se utilizaron 3-5 ml para infectar de nuevo las células PER.C6 (matraces para el cultivo de tejidos T80 cm^{2}). Esta re-infección produce un efecto citopatogénico (CPE) completo al cabo de 5-6 días después de lo cual el adenovirus es cosechado como se ha descrito antes.

Los ejemplos 1-9 descritos antes abarcan la construcción de vectores adenovirales recombinantes, quiméricos o bien para la proteína de la fibra o bien para la proteína de la hexona que produce una gama de huésped de infección alterada o una respuesta inmune alterada hacia los vectores adenovirales. Estos vectores adenovirales quiméricos son generados para la transferencia génica y las vacunas de ADN recombinante. Se debe recalcar que de una manera análoga a la descrita en el ejemplo 1-9 se construyen vectores adenovirales quiméricos para la pentona y pueden ser construidos para todas las demás proteínas de adenovirus incluyendo pero no limitadas al ADN que codifica las proteínas pequeñas requeridas para el ensamblaje del adenovirus y las secuencias requeridas para la replicación del adenovirus. Por otra parte, se debe subrayar que con esta tecnología se pueden construir vectores adenovirales quiméricos dobles, triples, cuádruples, etc. con el propósito de combinar partes de adenovirus de serotipos de adenovirus existentes para generar vectores adenovirales con características preferidas para cualquier célula diana dada o enfermedad diana.

Leyendas de las figuras y las tablas

Tabla 1: Resumen de la clasificación de los serotipos de adenovirus humanos conocidos basada en el principio de hemaglutinación.

Tabla 2: Asociación de serotipos de adenovirus humanos con enfermedades humanas.

Tabla 3: Oligonucleótidos y oligonucleótidos degenerados utilizados para la amplificación del ADN que codifica la proteína de la fibra derivada de serotipos de adenovirus humanos alternativos. Las letras en negrita en los oligonucleótidos A-E representan un sitio de restricción NdeI. Las letras en negrita en los oligonucleótidos 1-6 y 8 representan un sitio de restricción NsiI. Las letras en negrita en el oligonucleótido 7 representan un sitio de restricción PacI.

Tabla 4: Resultados de la producción de adenovirus quiméricos para la fibra. El número de partículas de virus por ml fue determinado utilizando la HPLC. El número de unidades infecciosas (UI) por mililitro fue determinado por medio de titulación en células 911 humanas. Para los experimentos de infección, se toma el número de partículas de virus por mililitro de todos los adenovirus quiméricos puesto que UI/ml refleja un procedimiento mediado por receptor.

Tabla 5: Resultados de la transducción de líneas celulares humanas y células primarias. A549: Línea celular de carcinoma de pulmón humano (ATCC, CCL-1185). K562: Leucemia eritroide humana (ATCC, CCL-243). SupT1: Linfoblastos humanos híbridos B y T (ATCC, CRL-1991). GM09503: Fibroblastos primarios humanos. HEPG2: Carcinoma de hígado humano (ATCC, HB8065). CEM: células linfoblásticas humanas (ATCC, CRL-1992). HeLa: Carcinoma de cérvix humano (ATCC, CCL-2). Se obtuvieron amniocitos primarios y células de los villi coriónicos del departamento de antropogenética, Leiden, Holanda. Se obtuvieron células de músculo liso primario de TNO-PG, Leiden, Holanda. Se muestran las medias de la actividad luciferasa (en unidades luminosas relativas (RLU) por \mug de proteína) de células infectadas a un MOI de 5000 partículas de virus por célula.

Tabla 6: Expresión de las integrinas \alpha_{v}\beta3 y \alpha_{v}\beta5, del receptor del adenovirus de Coxsackie (CAR), y del MHC clase I en membranas de células diana. Además de las células descritas en la Tabla 5: HUVEC: se obtuvieron células endoteliales de vena umbilical humana de TNO-PG, Leiden, Holanda. Se muestra el porcentaje de células que expresan cualquier molécula en su membrana. El vector basado en Ad5 que porta una fibra de un representante de cada subgrupo y la eficacia de la infección a la derecha de la tabla. ND: no determinado. 0% representa expresión no detectable de la molécula sobre la membrana de la célula utilizando la citometría de flujo. 100% representa una elevada expresión media de la molécula sobre la membrana celular.

Figura 1: Presentación esquemática del plásmido adaptador pMLPI.TK.

Figura 2: Presentación esquemática del plásmido adaptador pAd/L420-HSA.

Figura 3: Presentación esquemática del plásmido adaptador pAd5/CLIP.

Figura 4: Presentación esquemática de un sistema de dos plásmidos para la generación de adenovirus recombinantes.

Figura 5: Presentación esquemática de un sistema de tres plásmidos para la generación de adenovirus recombinantes.

Figura 6: Presentación esquemática de la generación del plásmido pBr/AdBamRDeltaFib en el cual parte del ADN de la fibra del adenovirus de serotipo 5 es remplazado por un tramo corto de ADN que contiene un sitio NdeI único.

Figura 7: Secuencias de la proteína de la fibra de los adenovirus de serotipo 8, 9, 13, 14, 20, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, y 51. Las letras en negrita representan parte de la cola del adenovirus de serotipo 5. Si las letras en negrita no están presentes significa que se secuenció un fragmento de PCR que no contenía la cola de Ad5. Una X, presente en la secuencia representa un aminoácido no identificado debido a un nucleótido no identificado. Al final de la secuencia el codón de terminación de la fibra se presenta mediante un guión.

Figura 8: Comparación de la biodistribución in vivo de adenovirus de serotipo 5 marcado con I^{123} y adenovirus quimérico para la proteína de la fibra. El adenovirus radiomarcado (10^{10} partículas de virus, 0,1-2 MBq) fue administrado intravenosamente en la vena de la cola. Como control, se inyectó una cantidad similar de la marca libre en el animal de control. Las ratas fueron sacrificadas después de una hora y los órganos fueron calibrados. La radiactividad de la figura de los órganos indicados fue medida con un contador de centelleo y se expresa como cuentas por minuto por gramo de tejido.

Figura 9: Presentación esquemática de la generación del plásmido pBr/Ad.Eco-Pme\DeltaHexon. También se muestra la secuencia de los oligonucleótidos delta hex 1-4 utilizados para suprimir el ADN que codifica la proteína de la hexona del adenovirus de serotipo 5.

Figura 10: Secuencias de la proteína de la hexona de los adenovirus de serotipos 34, 35, 36, y 41. Una X, presente en la secuencia representa un aminoácido no identificado debido a un nucleótido no identificado. Al final de la secuencia el codón de terminación de la hexona se presenta mediante un guión.

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TABLA 1

Subgrupo	serotipos	Hemaglutinación rhesus	Hemaglutinación rata
A	12, 18, 31	-	+ / -
B	3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 51	+	-
C	1, 2, 5, 6	-	+ / -
D	8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30,	+ / -	+
	32, 33, 36-39, 42-47, 49, 50
E	4	-	+ / -
F	40, 41	-	+ / -

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

Síndrome	Subgénero	Serotipo
Enfermedad
Respiratoria	A	31
	B	3, 7, 11, 14, 21, 34, 35, 51
	C	1, 2, 5, 6
	D	39, 42-48
	E	4
Queratoconjuntivitis
(ojo)	B	11
	D	8, 19, 37, 50
Cistitis hemorrágica
(riñón) e infecciones
tracto urogenital	B	7, 11, 14, 16, 21, 34, 35
	C	5
	D	39, 42-48
Transmisión
Sexual	C	2
	D	19, 37
Gastroenteritis	A	31
	B	3
	C	1, 2, 5
	D	28
	F	40, 41
Enfermedad SNC	A	12, 31
	B	3,7
	C	2, 5, 6
	D	32, 49
Hepatitis	A	31
	C	1, 2, 5
Diseminado	A	31
	B	3, 7, 11, 21
	D	30, 43-47
Ninguna (??)	A	18
	D	9, 10, 13, 15, 17, 20, 22-29, 33, 36, 38

TABLA 3

1

TABLA 4

Adenovirus	Partículas de virus/ml	Unidades infecciosas/ml
Ad5Fib5	2,2 x 10^{12}	6,8 x 10^{11}
Ad5Fib12	4,4 x 10^{12}	1,9 x 10^{12}
Ad5Fib16	1,4 x 10^{12}	3,0 x 10^{10}
Ad5Fib17	9,3 x 10^{11}	9,5 x 10^{9}
Ad5Fib18	5,4 x 10^{10}	2,8 x 10^{8}
Ad5Fib32	2,0 x 10^{12}	1,1 x 10^{12}
Ad5Fib40-S	3,2 x 10^{10}	1,0 x 10^{10}
Ad5Fib40-L	2,0 x 10^{12}	6,4 x 10^{11}
Ad5Fib49	1,2 x 10^{12}	4,3 x 10^{11}
Ad5Fib51	5,1 x 10^{12}	1,0 x 10^{12}

2

3

<110> Introgene B.V.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Adenovirus quiméricos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> P21916EP01

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> 99202233.5

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1999-07-08

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 98202297.2

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-07-08

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligoligador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Ligador que contiene un sitio PacI"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattgtctta attaaccgct taa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descriptión de la Secuencia Artificial: oligoligador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Ligador que contiene un sitio PacI"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattgtctta attaaccgc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligoligador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Ligador que contiene un sitio PacI"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattgcggtt aattaagac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(47)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador LTR-1"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgtacgtac cagtgcactg gcctaggcat ggaaaaatac ataactg

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(64)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador LTR-2"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador HSA1"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgccaccat gggcagagcg atggtggc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(50)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador HSA2"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

400

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador 1"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggtattagg ccaaaggcgc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador 2"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcccatgg aagcttgggt ggcgacccca gcg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador 3"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcccatgg ggatccttta ctaagttaca aagcta

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador 4"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcgctgtag ttggactgg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(42)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador NY-up"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgacatatgt agatgcatta gtttgtgtta tgtttcaacg tg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador NY-down"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagaccact gccatgttg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligoligador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Ligador con sitio SalI y EcoRI"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttaagtcgac

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador LacZ 1"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggtggcca gggtacctct aggcttttgc aa

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(29)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador LacZ 2"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggggatcc ataaacaagt tcagaatcc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador de PCR delta Hex1"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctggtgctg ccaacagc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador de PCR delta Hex2"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggatccac tagtggaaag cgggcgcgcg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador de PCR delta Hex3"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggatccaa ttgagaagca agcaacatca acaac

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador de PCR delta Hex4"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagaagggca tggaggctg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador de PCR HEX-up"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacgtgtaa gatggcyacc cchtcgatgm tg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(31)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador de PCR HEX-down"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatcgatgg ttatgtkgtk gcgttrccgg c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador de PCR DP5-F"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgttgctgc tgctaatagc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador de PCR DP5-R"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatcct gtacaactaa ggggaataca ag

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador de PCR DP3-F"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatccc ttaaggcaag catgtccatc ctt

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Cebador de PCR DP3-3R"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaacacgtt ttacgcgtcg acctttc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "P5-for"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcgatgta caatgcggcg cgcggcgatg tat

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "P5-rev"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcgactta agtcaaaaag tgcggctcga tag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "P3-for"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcgatgta caatgaggag acgagccgtg cta

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "P3-rev"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcgactta agttagaaag tgcggcttga aag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "P17-for"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcgatgta caatgaggcg tgcggtggtg tcttc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(34)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "P17-rev"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcgactta agttagaagg tgcgactgga aagc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "PF-for"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcgatgta caatgagacg tgcggtggga gtg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cebador_unión

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "PF-rev"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcgactta agttaaaacg tgcggctaga cag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Oligonucleótido Cola"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgtgtatc catatgatgc agacaacgac cgacc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Oligonucleótido Cola"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgtctacc catatggcta cgcgcgg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Oligonucleótido Cola"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cckgtstacc catatgaaga tgaaagc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(31)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Oligonucleótido Cola"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgtctacc catatgacac ctyctcaact c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Oligonucleótido Cola"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgtttacc catatgaccc atttgacaca tcagac

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Oligonucleótido Protuberancia"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgatgcatt tattgttggg ctatatagga

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Oligonucleótido Protuberancia"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgatgcatt yattcttggg cratatagga

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Oligonucleótido Protuberancia"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgatgcatt tattcttggg raatgtawga aaagga

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Oligonucleótido Protuberancia"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgatgcatt cagtcatctt ctctgatata

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Oligonucleótido Protuberancia"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgatgcatt tattgttcag ttatgtagca

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Oligonucleótido Protuberancia"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccatgcatt tattgttctg ttacataaga

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(37)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Oligonucleótido Protuberancia"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgttaatta agcccttatt gttctgttac ataagaa

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgos_diversos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Oligonucleótido Protuberancia"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgatgcatt cagtcatcyt ctwtaatata

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 377

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(377)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del Serotipo 8"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 377

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(377)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del Serotipo 9"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 391

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(391)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína del Serotipo 13"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(290)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del Serotipo 14"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(345)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del Serotipo 20"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 346

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(346)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del Serotipo 23"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 390

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(390)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del Serotipo 24"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 375

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(375)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del Serotipo 25"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 335

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(335)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 27 "

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 374

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(374)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 28"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

25

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 343

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(343)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 29"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 386

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(386)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 30"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 391

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(391)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 32"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 391

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(390)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 33"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 338

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(337)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 34"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 338

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(337)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 35"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 392

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(392)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 36"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 380

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(380)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 37"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 391

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(391)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 38"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 339

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(338)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 39"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

48

49

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 380

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(379)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 42"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

51

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 328

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(328)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra de serotipo 43"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

53

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 341

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(341)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 44"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

55

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(345)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 45"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

57

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 340

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(340)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 46"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

59

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 389

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(389)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 47"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

61

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 343

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(343)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 48"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

63

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 394

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(394)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 49"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

65

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 353

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(353)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la fibra del serotipo 51"

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

67

\vskip1.000000\baselineskip

68

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 958

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CADENA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(958)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la hexona del serotipo 34"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

70

71

72

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 947

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CADENA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(947)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la hexona del serotipo 35"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

74

75

76

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 952

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CADENA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(952)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la hexona del serotipo 36"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

78

79

80

81

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 957

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> adenoviridae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CADENA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(957)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> /nota = "Proteína de la hexona del serotipo 41"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

83

84

85

86

Claims

1. Un adenovirus quimérico que establece una gama de huésped de infección alterada, comprendiendo dicho adenovirus quimérico una proteína de la fibra quimérica que comprende al menos el dominio de la protuberancia de una proteína de la fibra de un adenovirus seleccionado del grupo formado por: adenovirus de los serotipos 12,16, 32, 40-S, 40-L, 49 y 51.

2. Un adenovirus quimérico según la reivindicación 1, donde la parte restante de dicha fibra quimérica es de un segundo serotipo de adenovirus.

3. Un adenovirus quimérico según la reivindicación 1 o 2, donde dicho segundo serotipo de adenovirus es un serotipo 5 de adenovirus.

4. Un adenovirus quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho adenovirus quimérico comprende adicionalmente al menos una parte de una proteína de la pentona o la hexona o ambas, de un tercer serotipo de adenovirus, donde dichos segundo y tercer serotipos de adenovirus pueden ser iguales o diferentes.

5. Un vector adenoviral quimérico recombinante que comprende:

-: al menos una ITR;

-: una señal de empaquetamiento;

-: una secuencia de ácido nucleico de interés;

-: un gen que codifica una proteína de la fibra quimérica que comprende un dominio de la protuberancia de una proteína de la fibra de un serotipo de adenovirus seleccionado del grupo formado por: un serotipo de adenovirus 12, 16, 32, 40-S, 40-L, 49 y 51.

6. Un vector adenoviral quimérico recombinante según la reivindicación 5, que es un plásmido.

7. Un vector adenoviral quimérico recombinante según la reivindicación 5 o 6, donde dicha proteína de la fibra quimérica comprende adicionalmente una parte de la cola de la proteína de la fibra del adenovirus de serotipo 5.

8. Una célula de empaquetamiento para producir un adenovirus quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende un vector adenoviral quimérico recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, y todos los elementos en trans necesarios para la producción de adenovirus que no están presentes en dicho vector adenoviral quimérico recombinante.

9. Un estuche de partes de comprende un vector adenoviral quimérico recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 y una célula de empaquetamiento que proporciona todos los elementos en trans necesarios para la producción de adenovirus que no están presentes en dicho vector adenoviral quimérico recombinante, por medio del cual no hay esencialmente solapamiento que conduzca a la recombinación dando como resultado la producción de adenovirus de replicación competente entre dicha célula y dicho vector.