ES2181822T5 - Procedimiento para el analisis de la expresion de genes. - Google Patents
Procedimiento para el analisis de la expresion de genes.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA EL ANALISIS GENERAL DE EXPRESION GENICA Y UN PROCEDIMIENTO PARA EL ANALISIS DIFERENCIAL DE LA EXPRESION DE COMPONENTES DE UNA FAMILIA DE GENES.
Description
Procedimiento para el análisis de la expresión de
genes.
El presente invento se refiere a un procedimiento
para el análisis general de la expresión de genes, así como a un
procedimiento para el análisis diferencial de la expresión de
miembros de una familia de genes.
El fundamento molecular de numerosos procesos
biológicos es la activación o desactivación coordinada de
determinados genes o grupos de genes en una célula, un órgano o un
organismo. En este caso, la célula, el órgano o el organismo se
encuentran en un determinado estado fisiológico, en un grado de
diferenciación, y en el caso de determinadas influencias externas,
se caracterizan por un estado específico de la expresión. El
conocimiento de este estado de la expresión, es decir, del grado de
activación de todos los genes o de determinados grupos de genes,
tiene una gran importancia para la respuesta de muchas
interrogaciones biológicas. El objetivo de un método, mediante el
que se deben poder obtener informaciones acerca del estado de la
expresión, es con ello por consiguiente comprobar, por una parte,
la actividad de todos los genes, así como también la actividad de
una determinada cantidad parcial de genes. Como cantidades
parciales de genes entran en cuestión en particular familias de
genes. Las familias de genes son grupos de genes, que se distinguen
con frecuencia funcionalmente por un determinado tipo de misiones,
las de recibir los productos de los genes en una célula, y las de
apropiarse estructuralmente en común de una o varias zonas
conservadas (dominios). Ejemplos de familias de genes, son las
familias de genes MADS-box (cajas MADS) y Homeobox
(homeo-cajas), así como otras familias de factores
de la transcripción. Por ejemplo, presentan un interés médico las
familias de genes de ciclinas, citocinas y globinas.
Por el estado de la técnica se conoce el análisis
del estado de la expresión de genes. La PCR [de Polymerase Chain
Reaction = reacción en cadena de polimerasa] de transcripción
inversa con presentación visual diferencial (DDRT de Differential
Display RT) es, por ejemplo, un procedimiento para el análisis de la
expresión diferencial de genes, en el que un ARNm (ácido
ribonucleico mensajero) procedente de un tejido se transcribe
mediante utilización de un cebador de ADNc (ácido
desoxirribonucleico complementario) con una prolongación en 3'
(preferiblemente de dos bases), por transcripción inversa (RT, de
Reverse Transcription), en (preferiblemente 12) subpoblaciones de
un ADNc. A partir de este ADNc, mediante utilización de cebadores
cortos, de manera preferida con una longitud de diez nucleótidos,
que tienen una secuencia aleatoria, se generan productos de PCR con
una longitud específica para los transcritos, que se pueden separar
en geles de secuenciación. Si es suficientemente grande el número
de las combinaciones de cebadores que se utilizan, se pueden
detectar de manera estadítica prácticamente todos los transcritos
(productos de transcripción) que están presentes en un tejido. Si se
aplican sobre un gel, unos junto a otros, los productos de PCR
obtenidos a partir de dos o más tejidos, se pueden hacer visibles
directamente de esta manera las diferencias en la expresión. Las
bandas que aparecen de manera diferencial pueden ser recortadas
desde el gel, amplificadas de nuevo y clonadas, para su análisis
adicional.
Además, para el enriquecimiento de los productos
de amplificación para un determinado subgrupo de todas las
moléculas de ARNm, p.ej. los miembros de una determinada familia de
genes, se puede combinar un cebador, que tiene una secuencia
específica para la familia de genes, con un cebador aleatorio. Esta
técnica de la DDRT ha sido descrita, por ejemplo, en las citas de
Liang y Pardee (1992) Science 257, 967-971; Liang y
colaboradores (1993), Nucleic Acids Res. 21,
3.269-3.275; Bauer y colaboradores (1993) Nucleic
Acids Res. 21, 4272-4280; Stone y Wharton (1994),
Nucleic Acids Res. 22, 2.612-2.618 y Wang y
Feuerstein (1995) Biotechniques 18, 448-452, así
como en el documento de solicitud de patente internacional WO
93/18176 y en el documento de patente alemana
DE 43 17 414.
DE 43 17 414.
El diseño experimental de la DDRT conduce sin
embargo a una serie de desventajas. Así, los modelos patrones de
bandas, con frecuencia, sólo se pueden reproducir mal. Tampoco el
empleo de cebadores aleatorios más largos, por ejemplo con una
longitud de 20 bases, pudo resolver de manera satisfactoria el
problema de la mala reproducibilidad (Ito y colaboradores, (1994),
FEBS Lett. 351, 231-236). Además, debido al alto
número de las combinaciones necesarias de cebadores, así como
debido a la necesidad de aumentar la reproducibilidad mediante
tandas de repetición, se requiere un esfuerzo extremado.
Adicionalmente, con frecuencia, se obtiene una elevada proporción de
resultados falsamente positivos. Además de esto, se pudo demostrar
que los transcritos raros (poco frecuentes) no se pueden detectar
en muchos experimentos de DDRT (Bertioli y colaboradores. (1995),
Nucleic Acids Res. 23,
4.520-4523).
4.520-4523).
También plantea problemas la secuenciación de
bandas escogidas, que se ha descrito en el estado de la técnica, ya
que los productos de la DDRT están flanqueados con frecuencia en
ambos extremos por el mismo cebador, de tal manera que no es
posible llevar a cabo una secuenciación directa y se necesita una
etapa de clonación adicional. Por causa de la utilización de
cebadores cortos, es necesario llevar a cabo otra etapa de
amplificación renovada con moléculas de cebadores prolongadas por
el lado 5' con respecto a los cebadores de DDRT, incluso cuando el
producto está flanqueado por dos cebadores diferentes. Finalmente, a
causa de la utilización de cebadores aleatorios, tampoco se puede
partir jamás con seguridad de que todos los transcritos de una
célula se puedan reconocer por las combinaciones empleadas de
cebadores. Esto resulta válido - incluso en el caso de la
utilización de una gran cantidad de cebadores - tanto para una tanda
que ha de determinar y abarcar la totalidad de los transcritos,
como también para una tanda que está orientada al análisis de una
subpoblación de los transcritos, por ejemplo de una familia
de
genes.
genes.
Song y Osborn describen en Plant Molecular
Biology 26 (1994), 1.065-1.071, un procedimiento
para la investigación de la expresión de genes homólogos en
poliploides de plantas, en el que se combinan entre sí las técnicas
de la RT-PCR y del análisis del polimorfismo de
longitud de un fragmento de restricción (RFLP = Restriction
Fragment Lenght Polymorphism). En este caso, a partir de un ARN se
prepara mediante transcripción inversa un ADNc, que se amplifica
mediante la utilización de dos cebadores específicos para un gen.
Los productos de amplificación son acortados de manera específica
para un transcrito mediante disociación con endonucleasas, se
separan de acuerdo con sus longitudes y se analizan mediante
clonación y secuenciación subsiguientes. También este procedimiento
tiene la desventaja de una pequeña sensibilidad, puesto que para la
identificación de los productos de expresión se necesita una etapa
de clonación adicional. Otra desventaja de este procedimiento
consiste en el hecho de que dentro de los genes analizados deben
estar presentes informaciones acerca de secuencias específicas para
un gen, a lo largo de por lo menos dos regiones, para poder diseñar
cebadores apropiados.
La misión que constituye el fundamento del
presente invento consistió, por consiguiente, en poner a disposición
un procedimiento para el análisis de la expresión de genes, con el
que las desventajas del estado de la técnica se puedan evitar por
lo menos de una manera parcial, en particular un procedimiento, con
el que se obtengan resultados reproducibles, que tenga una
sensibilidad suficiente con el fin de detectar también transcritos
raros, y que haga posible una identificación de productos de
amplificación sin una etapa de clonación adicional.
Para resolver el problema planteado por esta
misión se pone a disposición, en el marco del presente invento, un
procedimiento para el análisis de la expresión de genes,
caracterizado por las etapas de:
- (a)
- aislar moléculas de ARNm desde una o varias muestras de tejidos que se han de analizar,
- (b)
- sintetizar moléculas de primeras cadenas de ADNc a partir de las moléculas de ARNm,
- (c)
- sintetizar moléculas de segundas cadenas de ADNc,
- (d)
- disociar las moléculas de ADNc procedentes de (c) con por lo menos una endonucleasa de restricción,
- teniendo la endonucleasa de restricción una secuencia de reconocimiento de cuatro bases,
- (e)
- adosar enlazadores a los fragmentos de ADNc obtenidos mediante la digestión por restricción,
- (f)
- amplificar selectivamente una parte de los productos de la ligación procedentes de (e),
- efectuándose la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa y empleándose por lo menos un cebador dirigido hacia el enlazador adosado, así como por lo menos un cebador dirigido hacia la secuencia del cebador de ADNc empleado en la etapa (b), y siendo prolongados los cebadores empleados eventualmente en su extremo 3' por una prolongación de una o varias bases selectivas,
- (g)
- separar los productos de amplificación de acuerdo con su longitud, conteniendo los productos de amplificación junto a sus extremos unas secuencias, a las que se pueden fijar los cebadores utilizados en la etapa (f), y
- (h)
- analizar los productos de amplificación.
De manera preferida, se utilizan en el caso de
este procedimiento cebadores aleatorios degenerados, que tienen
p.ej. una longitud de aproximadamente 15 a 25 nucleótidos. De manera
especialmente preferida, estos cebadores aleatorios degenerados
poseen un grado de degeneración lo suficientemente alto como para
fijarse estadísticamente a una matriz de ADN con tanta frecuencia
como un cebador no degenerado, que tiene una longitud de 8 a 12
nucleótidos. El grado de degeneración de los cebadores aleatorios
se puede conseguir mediante utilización de mezclas de
oligonucleótidos o/y mediante una incorporación de nucleótidos que
se hibridan degeneradamente, tales como inosina.
Una modificación del procedimiento de acuerdo con
el invento consiste en que se utiliza durante la primera ronda de
amplificación un cebador que está dirigido hacia una secuencia de
anclaje, que está fijada al extremo 5' del ARNm o bien al extremo
3' del ADNc de primera cadena. De manera preferida, en esta
modificación, después de haber separado la estructura de cabeza
(cap), en una ligación de una única cadena se liga al extremo 5'
del ARNm un oligonucleótido de ARN, que tiene p.ej. una longitud de
20 - 30 bases y lleva de manera preferida un sitio de corte para
una o varias enzimas de restricción empleadas a continuación.
Después de haberse realizado la etapa de corte por restricción del
ADNc bicatenario y de haberse realizado la ligación del enlazador,
para la amplificación renovada se emplean entonces un cebador
enlazador y un cebador que se deriva de la secuencia del cebador de
ADNc o de la secuencia del mencionado oligonucleótido de ARN.
Tal procedimiento para el análisis general de la
expresión de genes comprende de manera preferida las etapas de:
- (a)
- aislar moléculas de ARNm desde una o varias muestras que se han de analizar,
- (aa)
- fijar una secuencia de anclaje al extremo 5' de las moléculas de ARNm,
- (b)
- sintetizar moléculas de primeras cadenas de ADNc a partir de las moléculas de ARNm,
- (c)
- amplificar de las moléculas de primeras cadenas de ADNc y marcar los productos de amplificación,
- (d)
- acortar específicamente para un transcrito los productos de amplificación mediante disociación con una o varias endonucleasas de restricción,
- (g)
- separar los productos de amplificación de acuerdo con su longitud, y
- (h)
- analizar los productos de amplificación separados.
Alternativamente, se pone a disposición otro
procedimiento preferido para el análisis general de la expresión de
genes, que está caracterizado por las etapas de:
- (a)
- aislar moléculas de ARNm desde una o varias muestras,
- (aa)
- fijar una secuencia de anclaje al extremo 5' de las moléculas de ARNm,
- (b)
- sintetizar moléculas de primeras cadenas de ADNc a partir de las moléculas de ARNm,
- (c)
- amplificar las moléculas de primeras cadenas de ADNc,
- (d)
- acortar específicamente para un transcrito los productos de amplificación mediante disociación con una o varias endonucleasas de restricción,
- (e)
- adosar moléculas de enlazadores a los extremos de los fragmentos de restricción,
- (f)
- amplificar renovadamente y marcar los fragmentos de restricción, utilizándose un cebador dirigido hacia la molécula enlazadora adosada en la etapa (e), y (i) un cebador dirigido hacia la secuencia de anclaje adosada en la etapa (aa), o (ii) un cebador dirigido hacia la secuencia del cebador de ADNc que se emplea en la etapa (b),
- (ff)
- eventualmente amplificar renovadamente y marcar de nuevo, utilizándose cebadores "anidados" [es decir, desplazados hacia dentro],
- (fff)
- eventualmente hibridar substractivamente dos agrupaciones de productos de amplificación que se han de comparar entre sí,
- (g)
- separar los productos de amplificación de acuerdo con su longitud, y
- (h)
- analizar los productos de amplificación separados.
La etapa (a) del procedimiento de acuerdo con el
invento comprende el aislamiento de moléculas de ARNm a partir de
muestras que se han de analizar, p.ej. muestras de tejidos, que
pueden proceder de animales, plantas o microorganismos. De manera
preferida, se parte de varias, es decir de por lo menos dos muestras
de tejidos, con el fin de poder llevar a cabo un análisis
diferencial de la expresión de genes a partir de las diferentes
muestras de tejidos. El aislamiento del ARNm se puede efectuar de
acuerdo con procedimientos conocidos (compárese p.ej. la cita de
Sambrook y colaboradores, Molecular cloning: A Laboratory Manual
[Clonación molecular: Un manual de laboratorio, 20 edición (1989),
Cold Spring Harbor Laboratory Press, en particular el capítulo
7).
La etapa (aa) comprende la fijación de una
secuencia de anclaje escogida al extremo 5' de las moléculas de
ARN. Esta secuencia de anclaje comprende, de manera preferida, un
oligonucleótido de ARN y se puede fijar a las moléculas de ARNm
mediante una eliminación de la cabeza [cap], referida seguidamente
como descabezamiento [decapping], del ARNm y una subsiguiente
ligación de una cadena única mediante una ligasa de ARN de T4. En
este caso, se puede pasar a emplear también un oligonucleótido
modificado de manera apropiada, que se hibrida específicamente con
la estructura de cabeza [cap] y que produce una incorporación de la
secuencia complementaria a su secuencia propia, en la etapa de la
transcripción inversa. De manera preferida, la secuencia de anclaje
contiene un sitio de corte para una enzima de restricción que se ha
de utilizar más tarde, con el fin de asegurar que se abarque cada
uno de los transcritos, incluso en el caso de que falte un sitio de
corte interno.
La etapa (b) del procedimiento de acuerdo con el
invento comprende la síntesis de moléculas de ADNc de primeras
cadenas a partir de ARNm. Para ello, se hibrida de manera preferida
un cebador de oligo-dT con la cola de
poli(A) de ARNm y se prolonga mediante una enzima apropiada,
tal como una transcriptasa inversa o polimerasa de Tth. El cebador
de oligo-dT puede contener prolongaciones en el
extremo 5' o/y en el extremo 3'. La prolongación en el extremo 5'
puede ser por ejemplo una secuencia aleatoria que tiene de manera
preferida de 20 a 30 nucleótidos, p.ej. 24 nucleótidos. La
prolongación en el extremo 3' puede ser una secuencia de uno o
varios nucleótidos, de manera preferida de 1 a 3 nucleótidos, p.ej.
1 ó 2 nucleótidos. En lugar de un cebador de
oligo-dT, para la síntesis de ADNc se pueden
emplear también cebadores aleatorios, que son de manera preferida
muy cortos, p.ej. con una longitud de 6 a 10 nucleótidos, o que
poseen un alto grado de degeneración, con el fin de fijarse
estadísticamente con suficiente frecuencia al ARNm, o bien
oligonucleótidos dirigidos hacia una secuencia conocida, p.ej. un
dominio específico para una familia de genes.
La etapa (c) del procedimiento de acuerdo con el
invento abarca la síntesis de la segunda cadena de un ADNc.
En vinculación con la etapa (c) se puede llevar a
cabo también una marcación de los productos de amplificación. Para
ello, puede(n) estar marcado(s) uno o ambos de los
cebadores empleados o la marcación puede efectuarse mediante
utilización de nucleótidos marcados. Para la marcación se adecuan,
por una parte, grupos de marcación radiactivos, tales como por
ejemplo ^{32}P, ^{33}P ó ^{35}S, así como colorantes
fluorescentes, biotina o antígenos, p.ej. digoxigenina. La
marcación puede efectuarse también en una etapa separada de una
prolongación de un cebador ("PCR lineal") con los productos de
amplificación o de amplificación renovada como moldes.
En el caso de la variante del procedimiento para
el análisis general de la expresión de genes, no tiene lugar
ninguna amplificación selectiva, sino una amplificación de todas las
moléculas presentes de primeras cadenas de ADNc.
Para ello, se utiliza de manera preferida un
cebador dirigido hacia la secuencia de anclaje adosada en la
eta-
pa (aa). Como cebador antagonista se utiliza de manera preferida un cebador que se deriva de la secuencia del cebador de ADNc utilizado en la etapa (b), p.ej. se utiliza un cebador dirigido hacia una prolongación en 5' del cebador de ADNc. Mediando utilización de esta combinación de cebadores se lleva a cabo una primera ronda de amplificación con algunos, p.ej. diez ciclos de amplificación, de manera preferida en condiciones de PCR de largo alcance [Long Range PCR].
pa (aa). Como cebador antagonista se utiliza de manera preferida un cebador que se deriva de la secuencia del cebador de ADNc utilizado en la etapa (b), p.ej. se utiliza un cebador dirigido hacia una prolongación en 5' del cebador de ADNc. Mediando utilización de esta combinación de cebadores se lleva a cabo una primera ronda de amplificación con algunos, p.ej. diez ciclos de amplificación, de manera preferida en condiciones de PCR de largo alcance [Long Range PCR].
La etapa (d) del procedimiento de acuerdo con el
invento comprende el acortamiento específico para un transcrito de
los productos de amplificación, mediante disociación con una o
varias enzimas de restricción. De manera preferida, se utiliza una
enzima de restricción, o una combinación de enzimas de restricción,
que corta al producto de amplificación con una probabilidad
estadísticamente alta, de manera preferida se utilizan enzimas de
restricción con una secuencia de reconocimiento de cuatro bases,
tales como por ejemplo Mse I, Hinf I o Sau3A I.
Cuando se considera una recuperación de los
productos de la PCR, se lleva a cabo, como etapa (e), una ligación
de moléculas de un enlazadores o adaptadores bicatenarios a los
extremos de los fragmentos de restricción producidos en la etapa
(d). De manera preferida, se utilizan moléculas de enlazadores que
tienen extremos diferentes, siendo complementario un extremo del
enlazador con los extremos de los fragmentos de restricción
producidos por la enzima de restricción, mientras que el otro
extremo, p.ej. por medio de una apropiada parte sobresaliente
monocatenaria, está estructurado de tal manera que no es posible
ninguna ligación (ni una ligación autónoma ni una ligación ajena).
Además de esto, los extremos de los fragmentos de restricción pueden
ser adaptados mediante una modificación subsiguiente, p.ej.
mediante relleno de extremos sobresalientes, en los extremos de las
moléculas de enlazador empleadas en cada caso.
La etapa (f) del procedimiento de acuerdo con el
invento abarca la amplificación renovada y - siempre y cuando que
esto no se haya efectuado todavía - la marcación de los fragmentos
de restricción. En este caso, se utiliza de manera preferida una
combinación de cebadores, que comprende (i) un cebador dirigido
hacia la molécula de enlazador y (ii) un cebador dirigido hacia la
secuencia del oligonucleótido de anclaje adosado en la etapa (aa)
al extremo 5' del ARNm, o un cebador dirigido hacia la secuencia del
cebador de ADNc empleado en la etapa (b). Todos los cebadores
empleados pueden ser idénticos a los cebadores utilizados
precedentemente en la etapa (c) o pueden tener una prolongación de
una o varias bases adicionales en su extremo 3'. La marcación de los
productos de amplificación renovada se efectúa tal como se describe
en la etapa (c).
Cuando se emplean cebadores marcados por
fluorescencia, se puede utilizar el color de la fluorescencia para
codificar el respectivo cebador; a modo de ejemplo, la última base
de un cebador prolongado en una base en su extremo 3' se puede
caracterizar mediante uno de varios, p.ej. cuatro colores. Si en la
etapa (c) se emplean cebadores marcados con biotina, antes de la
amplificación renovada se puede llevar a cabo una purificación de
los productos de amplificación mediante fijación a partículas
magnéticas revestidas con estreptavidina o a recipientes de
reacción revestidos con estreptavidina.
Para hacer posible una subdivisión de los
aproximadamente 15.000 diferentes productos de PCR obtenidos en
esta etapa (en el caso de utilizarse cebadores no específicos para
las familias), los cebadores de PCR llevan en su extremo 3' de
manera preferida una prolongación. Es adecuada por ejemplo, una
prolongación con dos bases junto al cebador de enlazador, siendo
posibles 16 combinaciones distintas, y una prolongación con una base
junto al cebador antagonista (A, C ó G, siendo posibles tres
combinaciones distintas), de tal manera que por cada muestra a
investigar se han de llevar a cabo 3 x 16 = 48 reacciones de
amplificación con diferentes combinaciones de cebadores. Además, de
manera alternativa a esta " tanda de 3' " es posible efectuar
amplificación en el extremo 5', combinando el cebador - enlazador
con un cebador dirigido hacia la secuencia de anclaje. Esta
variante del procedimiento tiene una ventaja, a saber que se uno se
puede contentar sin un cebador que contenga una secuencia de
oligo(dT).
La etapa (ff) facultativa del procedimiento de
acuerdo con el invento comprende una amplificación renovada de los
productos de amplificación obtenidos en la etapa (f) mediando
utilización de cebadores "anidados", es decir con cebadores
que están prolongados en su extremo 3' con una o varias bases con
respecto a los cebadores utilizados en la etapa (f). A través de
esta nueva amplificación renovada, los productos "raros" de
amplificación presentes en una concentración más pequeña, pueden
ser amplificados hasta llegar a una concentración detectable y a
continuación detectados (McClelland y Welsh (1994), PCR Methods
Appl. 4, 66-81; Ralph y colaboradores (1993), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90, 10.710-10.714).
La etapa (fff) facultativa del procedimiento de
acuerdo con el invento comprende una hibridación substractiva de
dos agrupaciones de productos de amplificación que se han de
comparar, con el fin de investigar seguidamente por electroforesis
en gel solamente aquéllos productos cuya frecuencia sea diferente
entre las dos agrupaciones. Estos productos representan entonces en
las dos muestras de partida genes expresados diferencialmente y son
por lo tanto de interés especial, mientras que en muchos casos se
puede prescindir del conocimiento de genes no expresados
diferencialmente. El método de la hibridación substractiva se
describe, por ejemplo, en las citas bibliográficas de Bautz y
Reilly (1966), Science 151, 328-330, y de Zimmermann
y colaboradores. (1980), Cell 21, 709-715. Para
llevar a cabo una de tales hibridaciones substractivas, una de las
agrupaciones ("impulsora") de productos de amplificación que
se han de comparar, puede ser marcada, p.ej. biotinilar, p.ej.
mediante utilización de cebadores biotinilados y luego hibridada
con un defecto de la otra agrupación ("ensayadora"). A
continuación, los productos de hibridación marcados, p.ej. en el
caso de una marcación con biotina, se pueden separar mediante
fijación a partículas magnéticas revestidas con estreptavidina
(compárese p.ej. la cita de Wang y Brown (1991), Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88, 11.505-11.509). Si es necesario, esta
etapa de substracción se puede llevar a cabo también múltiples
veces unas tras de otras. Los productos de amplificación que
permanecen en disolución se pueden someter entonces de nuevo a una
amplificación, con el fin de tener a disposición cantidades de ADN
suficientes para la subsiguiente detección. Si después de la
substracción se lleva a cabo una de tales amplificaciones, un grupo
de marcación apropiado para la detección se introduce de manera
preferida tan sólo en esta etapa. De esta manera, p.ej. una
marcación con biotina para la separación de productos híbridos
después de la substracción, se puede diferenciar con respecto a una
marcación para la visualización de fragmentos.
Esta variante del procedimiento de acuerdo con el
invento se puede aplicar tanto para la detección de estados de
expresión de "sí" o "no" (hay un alto exceso de ADN
marcado, y pocas rondas de hibridación), como también se puede
aprovechar para la detección de la regulación en sentido ascendente
o descendente de genes (hay un pequeño exceso de un ADN marcado, y
más rondas de hibridación) (Fargnoli y colaboradores (1990), Analyt.
Biochem. 187, 364-373).
A la substracción le puede seguir eventualmente
también una normalización, es decir una nivelación de las
diferentes concentraciones de los productos de amplificación
individuales. Esta normalización asegura que en la subsiguiente
etapa (h), es decir el análisis de los productos de amplificación
separados, también se puedan reconocer productos de amplificación
que están presentes en una pequeña concentración y que representan
a transcritos raros. Tal normalización puede efectuarse antes de,
después de, o durante la amplificación subsiguiente a, la
substracción. Un procedimiento apropiado para la normalización se
describe, por ejemplo, en la cita de Ko (1990) Nucleic Acids Res.
19, 5.705-5.711.
La etapa (g) del procedimiento de acuerdo con el
invento comprende la separación de los productos de amplificación o
de amplificación renovada de acuerdo con su longitud en un sistema
apropiado, p.ej. mediante electroforesis o una HPLC (de High
Performance Liquid Chromatography = cromatografía de líquido de alto
rendimiento). Se prefiere especialmente la electroforesis en un gel
de poli(acrilamida) desnaturalizante o no desnaturalizante.
Esta separación puede realizarse con una única tanda de reacción o
paralelamente con múltiples tandas de reacción, que se pueden
comparar unas con otras. La visualización de los productos separados
se efectúa según sea el grupo de marcación introducido, p.ej.
mediante autorradiografía, quimioluminiscencia o detección
específica de las moléculas marcadas por coloración o irradiación
con luz ultravioleta (UV). La detección de los productos puede
efectuarse en el gel (no tratado, o fijado y secado) o después de su
transferencia a un soporte apropiado, de manera preferida a una
membrana de hibridación. Para tal transferencia es especialmente
apropiado el procedimiento de la electroforesis con reproducción
directa de borrones [Direct Blotting Electrophoresis]. La detección
puede llevarse a cabo también mediante una coloración no específica
del ADN mediante compuestos de plata o colorantes apropiados (p.ej.
SYBR Green I) o mediante hibridación con una sonda apropiada de la
membrana que lleva los productos. En el caso de emplearse grupos
fluorescentes para la marcación, la separación y la detección
pueden efectuarse por medio de un equipo automático de secuenciación
o/y la detección puede efectuarse por medio de un escáner de geles
con fluorescencia o con un generador de imágenes fluorescentes.
La etapa (h) comprende el análisis de los
productos de amplificación o de amplificación renovada separados.
En este caso, las bandas que interesan se pueden aislar y amplificar
de nuevo. En el caso de una amplificación renovada, se pueden
utilizar los mismos cebadores que en el caso de la amplificación
renovada según la etapa (f). El aislamiento de las bandas puede
llevarse a cabo p.ej. mediante recorte con un bisturí desde el gel
o desde el soporte, al que se habían transferido los productos
separados. Las bandas recortadas se pueden incubar a continuación
en una tanda de PCR para la amplificación renovada. Los productos
obtenidos en este caso se pueden emplear para la secuenciación
directa sin ninguna etapa de clonación. El procedimiento de
secuenciación cíclica (Cycle Sequencing) es especialmente apropiado
para ello. Como cebadores de secuenciación se pueden emplear los
cebadores de PCR utilizados previamente. De manera alternativa, para
la amplificación renovada o/y para la secuenciación se pueden
utilizar cebadores prolongados en su extremo 3', con el fin de
descartar posibles impurificaciones de una banda mediante otros
productos de amplificación. La necesaria prolongación en 3' de los
cebadores utilizados para ello se puede descubrir e investigar, por
ejemplo, cuando la detección de las bandas se haya efectuado con
cebadores marcados por fluorescencia y en la etapa (f) o (ff) se
hayan empleado mezclas de diferentes cebadores marcados por
fluorescencia, cuya(s) última(s)
base(s) sea(n) codificada(s) por su respectiva marcación.
base(s) sea(n) codificada(s) por su respectiva marcación.
Antes de su empleo para la secuenciación, los
productos de amplificación renovada se pueden comprobar en cuanto a
su pureza, de manera preferida mediante una nueva electroforesis en
un gel de poli(acrilamida) desnaturalizante. Si todavía
aparecen productos de amplificación, que se diferencian en cuanto a
su tamaño con respecto del deseado producto de amplificación, se
puede efectuar una purificación adicional mediante un recorte
renovado de las bandas deseadas y una subsiguiente amplificación
renovada. Los productos de amplificación renovada se pueden emplear
además en experimentos de transferencia Southern, Northern o de
hibridación in situ. Además de esto, - siempre y cuando que
contengan una secuencia todavía desconocida de ácido nucleico -
ellos se pueden utilizar para el aislamiento de pertinentes clones
genómicos o de ADNc a partir de bancos correspondientes.
Si el número de productos distintos, que se
obtienen en el caso de una reacción de amplificación, es
suficientemente pequeño, la amplificación renovada de productos
individuales se puede efectuar directamente a partir de la reacción
global, empleando cebadores selectivos apropiados, los cuales tienen
en su extremo 3' una prolongación de por lo menos una base, por
ejemplo, frente a los cebadores empleados previamente. Tal situación
se presentará en particular en el caso de que se haya llevado a
cabo una substracción de acuerdo con la etapa (fff) en varias
tandas paralelas. Cada reacción de substracción contendrá entonces
todavía solamente unos pocos, por ejemplo 5-10
productos de amplificación distintos. Para poder obtener
selectivamente cada uno de éstos individualmente mediante
amplificación a partir de la reacción de substracción, es útil el
conocimiento de la identidad de algunas de las bases que delimitan
con los cebadores de amplificación empleados previamente. Este
conocimiento se puede obtener, por ejemplo, empleando para la
amplificación que se realiza después de la substracción, mezclas,
en cada caso, de cuatro cebadores, que están prolongados en su
extremo 3' con una de las cuatro bases posibles y que llevan una
marcación de fluorescencia, cuyo color codifica de manera inequívoca
la respectiva última base de un cebador. Si se separan seguidamente
los productos de amplificación y se investigan en la luz UV, el
color de la fluorescencia de una banda permite sacar conclusiones
acerca del cebador que se ha incorporado en el producto
correspondiente, que se puede emplear seguidamente para la
amplificación renovada selectiva. Con el fin de obtener un número
suficiente de posibilidades de codificación (por ejemplo, 4^{1},
4^{2} = 16, 4^{3} = 64, etc.), se pueden combinar apropiados
cebadores codificados por fluorescencia en varias tandas paralelas,
en cada caso con cebadores antagonistas no marcados, y se pueden
emplear para la amplificación.
Además, es concebible una serie de modificaciones
para el procedimiento de acuerdo con el invento. Así, en la etapa
(b) el ADNc de primera cadena puede ser provisto de una secuencia de
ácido nucleico p.ej. en su extremo 3', y en el caso de la
subsiguiente amplificación en la etapa (c) se puede utilizar un
oligonucleótido dirigido hacia esta secuencia específica de ácido
nucleico. La secuencia específica de ácido nucleico comprende, por
ejemplo, un homopolímero o una secuencia aleatoria con una longitud
de preferiblemente 20 a 30 nucleótidos.
Otra modificación adicional del procedimiento de
acuerdo con el invento podría consistir por ejemplo en que se
transforma el ADNc de primera cadena mediante una ligación autónoma
(auto-ligación), p.ej. en una tanda de ligación con
una ligasa de ARN, en moléculas oligómeras o/y circulares, y en que
para la subsiguiente amplificación en la etapa (c), junto al
cebador específico para la familia de genes, se utiliza como cebador
antagonista un oligonucleótido dirigido secuencia abajo
("downstream") que es por lo menos parcialmente complementario
con el cebador de ADNc, y que tiene en su extremo 3' eventualmente
una prolongación de 1 a 3 nucleótidos, preferiblemente.
Todavía otra modificación adicional del
procedimiento de acuerdo con el invento consiste en llevar a cabo
la eta-
pa (d) de la disociación por restricción, ya sin una previa amplificación, junto a un ADNc bicatenario. Por medio de este modo de proceder se puede evitar la pérdida de transcritos muy largos con una longitud de varias kb (kilobases), que podrían perderse en el caso de una amplificación del ADNc completo de primera cadena.
pa (d) de la disociación por restricción, ya sin una previa amplificación, junto a un ADNc bicatenario. Por medio de este modo de proceder se puede evitar la pérdida de transcritos muy largos con una longitud de varias kb (kilobases), que podrían perderse en el caso de una amplificación del ADNc completo de primera cadena.
Además, se prefiere que los cebadores de
oligonucleótidos empleados en el procedimiento de acuerdo con el
invento y en las modificaciones de este procedimiento que se
discuten más adelante, tengan una longitud de preferiblemente por
lo menos 15 nucleótidos, de manera especialmente preferida de por lo
menos 18 nucleótidos, con el fin de mejorar la reproducibilidad de
los modelos patrones de bandas que se han obtenido. Además de ello,
los cebadores de oligonucleótidos se pueden reemplazar también por
compuestos análogos a, o derivados sintéticos de, ácidos nucleicos,
p.ej. con ácidos nucleicos peptídicos (PNA), presuponiendo que éstos
han de tener en su extremo 3' un grupo 3'-OH
aceptado por la polimerasa.
Además de ello, los oligonucleótidos empleados en
el procedimiento de acuerdo con el invento y en sus variantes y
modificaciones, es decir oligonucleótidos de anclaje, cebadores de
ADNc, cebadores de amplificación, etc., pueden contener uno o
varios sitios de reconocimiento o corte para enzimas de restricción.
De esta manera se puede evitar la pérdida de productos de
amplificación que no hayan sido cortados por la enzima de
restricción, cuando antes de la ligación del enlazador no se ha
llevado a cabo ningún relleno de los extremos.
El procedimiento de acuerdo con el invento posee
unas sorprendentes ventajas frente a la conocida técnica de
presentador diferencial DD (Differential Display Technique), puesto
que aquí se pueden emplear cebadores perfectamente adaptados con
una longitud óptima para las reacciones de amplificación. Esto
conduce a una alta reproducibilidad del procedimiento. Por el
contrario, en los experimentos de DD del estado de la técnica, con
los cebadores que allí se utilizan, con frecuencia muy cortos y que
se fijan mediando tolerancia de emparejamientos erróneos (Bertioli
y colaboradores, véase más arriba), solamente se obtiene una
reproducibilidad insuficiente, ya que el procedimiento depende de
manera extremada de determinados parámetros del procedimiento, p.ej.
de la temperatura de reanillado o apareamiento durante la PCR. Esta
mala reproducibilidad que se puede observar en los experimentos de
DDRT tiene como consecuencia el hecho de que por cada reacción se
tengan que llevar a cabo por lo menos uno o dos experimentos de
repetición para poder reconocer a los artefactos (las aberraciones)
como tales. Junto con el elevado número de diferentes combinaciones
de cebadores, que se necesitan para poder detectar con una cierta
probabilidad por lo menos una gran parte de todos los transcritos
(Bauer y colaboradores, véase más arriba), la ejecución de la DDRT
del estado de la técnica es muy costosa. A pesar de todo, debido al
comportamiento estadístico de fijación de cebadores aleatorios, no
hay allí ningún número definido de combinaciones de cebadores, que
pudieran garantizar la determinación de todos los transcritos. Por
el contrario, en el procedimiento de acuerdo con el invento los
experimentos de repetición son superfluos, y el número de las
combinaciones de cebadores que se necesitan para una investigación
completa se puede calcular fácilmente a partir del número esperado
de transcritos en un tejido investigado (por ejemplo, 15.000) y del
número de productos que se deben de admitir en una reacción de
amplificación individual (por ejemplo, 100). En este caso, la
determinación de cada transcrito se puede asegurar, mediante el
recurso de que los oligonucleótidos que se emplean como cebadores
de ADNc o como anclajes contienen sitios de corte para la enzima de
restricción utilizada en la etapa (d). Además de esto, la renuncia
a las reacciones de repetición hace posible la investigación
simultánea de 30 o más diferentes muestras de ARN en un único
gel.
Una ventaja adicional del procedimiento de
acuerdo con el invento con respecto a la técnica de DD, consiste en
que se podría confirmar la expresión diferencial de todas las bandas
investigadas mediante experimentos de transferencia Northern. En el
caso de los experimentos de DD del estado de la técnica, al
contrario de ello, por ejemplo, de 15 bandas obtenidas en total, se
pudieron confirmar solamente cinco como expresadas
diferencialmente, mientras que cuatro mostraban una señal falsamente
positiva y otras seis no proporcionaban absolutamente ninguna señal
en el borrón de transferencia Northern (compárese la cita de Liang y
colaboradores, mencionada más arriba).
Además, el procedimiento de acuerdo con el
invento excluye la determinación múltiple de un transcrito. Esto
resulta del hecho de que en el caso de utilizarse oligonucleótidos
no fosforilados para la preparación de los enlazadores, una
amplificación puede tener lugar siempre solamente entre una zona
definida del transcrito (su extremo 3', su extremo 5' o un dominio
específico para una familia) y un enlazador, pero nunca entre dos
enlazadores ligados adosadamente. En los experimentos de DDRT del
estado de la técnica, por el contrario, un transcrito dado puede
ser reconocido por diferentes combinaciones de cebadores y de esta
manera puede ser detectado múltiples veces. Así, a modo de ejemplo,
el mismo transcrito era representado por 15 diferentes bandas de
DDRT, las cuales habían sido generadas por combinación de diversos
cebadores de 5' con diversos cebadores de 3' (Linskens y
colaboradores (1995), Nucleic Acids Res. 23,
3.244-3.251).
Además de esto, los productos obtenidos con el
procedimiento de acuerdo con el invento pueden ser secuenciados de
una manera sencilla directamente después de la amplificación
renovada, sin que sea necesaria una etapa de clonación. Esta
secuenciación se efectúa de manera preferida mediante la técnica de
secuenciación cíclica. Esta técnica no es apropiada para los
cebadores utilizados en los experimentos de DD, que tienen una
longitud de aproximadamente 10 nucleótidos. Por lo demás, los
productos de la DDRT del estado de la técnica están flanqueados
frecuentemente por dos moléculas del mismo cebador, lo que excluye
la utilización del respectivo cebador de amplificación como cebador
de secuenciación (Guimaraes y colaboradores. (1995), Nucleic Acids
Res. 23, 1.832-1.833).
Una ventaja adicional del procedimiento de
acuerdo con el invento, si se lleva a cabo la etapa (fff) de una
hibridación substractiva, es una gran disminución del número de las
reacciones individuales que se han de llevar a cabo, así como del
número de los productos de amplificación que se han de investigar.
Mientras que para llevar a cabo experimentos de DD del estado de la
técnica se requieren varios cientos de tandas de PCR, que tienen
que separarse a continuación en varios cientos de pistas de geles de
poli(acrilamida) (Liang y Pardee, véase más arriba; Bauer y
colaboradores, véase más arriba), en el caso del procedimiento de
acuerdo con el invento es posible subdividir las agrupaciones de
ADNc generadas en la etapa (b), mediante utilización en la etapa
(f) de cebadores, que están prolongados en su extremo 3' en cada
caso con una o dos bases con respecto a la secuencia de su sitio
común de fijación, en múltiples, por ejemplo, ocho o 12
subagrupaciones. Las subagrupaciones correspondientes entre sí son
substraídas luego de manera paralela y los productos de cada una de
las substracciones son analizados en una pista propia del gel.
Frente al conocido procedimiento del
"ADNc-RDA" (del inglés, Representational
Difference Analysis of
cDNA = análisis diferencial representativo de ADNc; Hubank y Schatz (1994), Nucleic Acids Res. 22, 5.640-5.648), el procedimiento de acuerdo con el invento tiene varias ventajas: en primer lugar, que cada transcrito es representado aquí exactamente por un producto de amplificación, lo que impide tanto la pérdida indeseada de algunos transcritos como también la detección múltiple de un mismo transcrito, en segundo lugar, que la complejidad de las reacciones de hibridación que ha disminuido tanto en comparación con el ADNc-RDA como también en comparación con la hibridación substractiva de moléculas de ADNc enteras, conduce a un transcurso más completo y más rápido de las reacciones (Sargent (1987), Methods in Enzymol. 152, 423-432), y en tercer lugar, que las etapas previstas dentro del marco del procedimiento de acuerdo con el invento permiten una detección planificada de transcritos raros.
cDNA = análisis diferencial representativo de ADNc; Hubank y Schatz (1994), Nucleic Acids Res. 22, 5.640-5.648), el procedimiento de acuerdo con el invento tiene varias ventajas: en primer lugar, que cada transcrito es representado aquí exactamente por un producto de amplificación, lo que impide tanto la pérdida indeseada de algunos transcritos como también la detección múltiple de un mismo transcrito, en segundo lugar, que la complejidad de las reacciones de hibridación que ha disminuido tanto en comparación con el ADNc-RDA como también en comparación con la hibridación substractiva de moléculas de ADNc enteras, conduce a un transcurso más completo y más rápido de las reacciones (Sargent (1987), Methods in Enzymol. 152, 423-432), y en tercer lugar, que las etapas previstas dentro del marco del procedimiento de acuerdo con el invento permiten una detección planificada de transcritos raros.
Además, la secuenciación de los productos de una
DD es obstaculizada por la presencia, con frecuencia simultánea, de
moléculas contaminantes de ADNc con el mismo tamaño. Por estas
razones, para los productos de una DD se requiere un costoso
proceso de purificación para el análisis ulterior (Liang et Pardee,
véase más arriba; Bauer y colaboradores, véase más arriba; Li y
colaboradores (1994), Nucleic Acids Res. 22,
1.764-1.765).
Además de esto, el procedimiento de acuerdo con
el invento, al contrario que en método de DD del estado de la
técnica, permite un análisis por lo menos semicuantitativo de los
resultados en lo que se refiere a la intensidad de la señal de un
transcrito dado. Esto lo pone de manifiesto una comparación del
procedimiento de acuerdo con el invento con hibridaciones de
transferencia Northern llevadas a cabo como testigo.
A causa de su sensibilidad, el procedimiento de
acuerdo con el invento se puede emplear también con el fin de
analizar transcritos interesantes a partir de pocas células o
incluso desde células individuales. Por lo tanto, esta técnica se
puede emplear, por ejemplo, en la biología del desarrollo para el
aislamiento de nuevos genes, para la identificación de nuevos
miembros de familias interesantes de genes, para la definición
exacta de estadios de vida diferentes de un organismo y para la
investigación del ciclo de vida de una célula y, por consiguiente,
también para la investigación de desviaciones con respecto al ciclo
de vida normal, p.ej. en el caso de la investigación del cáncer,
tal como ya se describe en la cita bibliográfica de Kotsinas y
colaboradores, (Int. J. Oncology 315 (1993),
841-855).
Un objeto adicional del presente invento son
modificaciones del procedimiento precedentemente descrito. Una de
estas modificaciones consiste en que en la forma de ejecución para
el análisis general de la expresión, la síntesis de segundas
cadenas de ADNc se efectúa de otra manera factible. Por ejemplo, se
puede aprovechar la tendencia de un ADNc monocatenario por
formación de bucles en horquilla terminales, o se puede adosar al
ADNc de primera cadena una secuencia específica de ácido nucleico,
por ejemplo un homopolímero o un oligonucleótido monocatenario,
para poner a disposición un sitio de fijación de un cebador para la
síntesis de segundas cadenas (véase, a modo de ejemplo, la cita de
Sambrook y colaboradores, más arriba, en particular el capítulo 8;
Troutt y colaboradores. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,
9.823-9.825).
Todavía una modificación adicional del
procedimiento descrito consiste en que el ADNc de primera cadena,
tal como se ha descrito precedentemente, se provee de una secuencia
específica de ácido nucleico, y en el caso de la amplificación en
la etapa (c) se utiliza como primer cebador un oligonucleótido
dirigido hacia la secuencia específica adosada de ácido nucleico, y
como cebador antagonista un oligonucleótido que se deriva de la
secuencia del cebador de ADNc. El cebador antagonista puede tener
eventualmente una prolongación en 3'. La secuencia específica de
ácido nucleico puede comprender un homopolímero o una secuencia
aleatoria. La secuencia específica de ácido nucleico se liga al
ADNc de primera cadena, de manera preferida por ligación, p.ej.
mediante una ligasa de ARN. Esta secuencia puede estar modificada
en su extremo 3' (p.ej. mediante introducción de un grupo amino),
para reprimir la ligación de más de una molécula de oligonucleótido
al ADNc.
En una modificación todavía adicional del
procedimiento de acuerdo con el invento, el ADNc de primera cadena
se transforma mediante una ligación autónoma, p.ej. con una ligasa
de ARN, en moléculas oligómeras o/y circulares, y en la
subsiguiente amplificación en la etapa (c) se utilizan como
cebadores dos oligonucleótidos dirigidos hacia el cebador de ADNc,
uno de los cuales está orientado secuencia arriba ("upstream")
y el otro secuencia abajo ("downstream"). La amplificación
renovada, que se lleva a cabo después de la etapa de restricción y
ligación, puede efectuarse, además de con el cebador dirigido hacia
el enlazador y con el cebador secuencia arriba o/y con el cebador
secuencia abajo. Cada uno de los dos cebadores puede tener una
prolongación en su extremo 3', es decir que puede estar prolongado
en una o varias bases. De manera preferida, los cebadores secuencia
arriba y secuencia abajo se seleccionan de tal manera que no se
solapen o se solapen solamente poco, para evitar una hibridación de
ambos cebadores durante la amplificación.
Frente a los procedimientos conocidos, que están
basados en una hibridación substractiva para el análisis
diferencial de la expresión de genes, el procedimiento de acuerdo
con el invento se distingue por una reproducibilidad mejorada y
puede emplearse por lo tanto de una manera rutinaria. Esta
reproducibilidad mejorada se debe a que en el estado de la técnica
se empleaban moléculas de ADNc que tenían frecuentemente una
longitud de varios miles de pares de bases (pb) y que además de
esto se utilizaban agrupaciones completas de ARNm y ADNc. Estos
problemas no se presentan cuando se utiliza la hibridación
substractiva para el análisis de productos de amplificación, que se
habían obtenido mediante el procedimiento de acuerdo con el invento.
Los productos de amplificación están, en efecto, grandemente
acortados en comparación con las moléculas de ADNc del estado de la
técnica, y mediante el diseño de los cebadores (p.ej. la elección
de diferentes prolongaciones en 3' para cebadores que por lo demás
son idénticos), una agrupación de productos de amplificación se
puede subdividir enteramente sin problemas en múltiples, p.ej. 8,
12 ó 16 subagrupaciones. Las subagrupaciones que se corresponden
entre sí pueden ser substraídas entonces de una manera
paralela.
Todavía un objeto adicional del presente invento
es un estuche de reactivos para el análisis de la expresión de
genes, en particular para su utilización en un procedimiento de
acuerdo con el invento. Este estuche de reactivos comprende de
manera preferida, en una disposición separada en el espacio:
- (a)
- una enzima para la síntesis de primeras cadenas de ADNc,
- (b)
- por lo menos una enzima para la síntesis de segundas cadenas de ADNc y para la amplificación de fragmentos de ADN,
- (c)
- eventualmente por lo menos una enzima de restricción,
- (d)
- eventualmente por lo menos una molécula de enlazador de ADN bicatenario y agentes para la fijación de la molécula de enlazador a fragmentos de ADN,
- (e)
- eventualmente por lo menos un oligonucleótido de ARN monocatenario y un agente para la fijación del oligonucleótido de ARN al extremo 5' de moléculas de ARNm,
- (f)
- moléculas de cebadores de ácidos nucleicos monocatenarios, que se seleccionan entre el grupo que comprende (i) por lo menos un nucleótido de oligo-dT, (ii) cebadores de acuerdo con (i) con una prolongación en 3' o/y una prolongación en 5', llevando uno de los cebadores de acuerdo con (i ó ii) un grupo de marcación escogido entre colorantes fluorescentes, biotina o antígenos, y (iii) cebadores de acuerdo con (i ó ii), que contienen una prolongación en 3' codificada por el tipo de su marcación, p.ej. el color de una marcación con fluorescencia,
- (g)
- agentes para la marcación y para la detección de ácidos nucleicos, y
- (h)
- eventualmente otros reactivos adicionales tales como un inhibidor de RNasa, nucleótidos, tampones, recipientes de reacción revestidos con estreptavidina o partículas magnéticas.
Algunos reactivos individuales del estuche se
pueden adquirir en determinadas circunstancias también por separado.
Junto a los reactivos, el estuche puede contener todavía tampones
apropiados para las enzimas utilizadas en cada caso.
Además, el presente invento se debe explicar por
medio de las Figuras, los Protocolos de secuencias y los Ejemplos
que se presentan seguidamente. Así,
la Figura 1 muestra una representación
esquemática de una forma de ejecución del procedimiento de acuerdo
con el invento para el análisis general de la expresión de
genes;
la Figura 2 muestra una representación
esquemática de otra forma de ejecución del procedimiento de acuerdo
con el invento para el análisis general de la expresión de genes
mediando inclusión de una etapa de substracción y mediando empleo
de cebadores codificados por fluorescencia para la amplificación
renovada;
la Figura 3 muestra una representación
esquemática de otra forma de ejecución del procedimiento de acuerdo
con el invento para el análisis de la expresión de familias de
genes;
la Figura 4 muestra la reproducibilidad del
procedimiento, demostrada por diez experimentos independientes;
la Figura 5 muestra el resultado del
aislamiento de genes de cajas MADS, expresados de manera
diferencial, mediando utilización del procedimiento de acuerdo con
el invento,
la Figura 6 muestra la asociación de los
genes identificados mediante el procedimiento de acuerdo con el
invento a subfamilias de genes de cajas MADS.
SEQ ID No. 1 muestra la secuencia de un
oligonucleótido de ARN,
SEQ ID No. 2 muestra la secuencia del cebador
CT29V,
SEQ ID No. 3 muestra la secuencia del cebador
AP23,
SEQ ID No. 4 muestra la secuencia del cebador
LT20,
SEQ ID No. 5 muestra la secuencia del cebador
LT24,
SEQ ID No. 6 muestra la secuencia del cebador
P038,
SEQ ID No. 7 muestra la secuencia del cebador
P041,
SEQ ID No. 8 muestra la secuencia del cebador
P042,
SEQ ID No. 9 muestra la secuencia del cebador
P043,
SEQ ID No. 10 muestra la secuencia del cebador
LR32,
SEQ ID No. 11 muestra la secuencia del cebador
BLT18,
SEQ ID No. 12 muestra la secuencia del cebador
P046,
SEQ ID No. 13 muestra la secuencia del cebador
P009 y
SEQ ID No. 14 muestra la secuencia de consenso de
los dominios MADS
Plantas de maíz (Zea mays ssp. mays), linaje de
la misma especie T232, y plantas de teosinte (Zea mays ssp.
parviglumis) de la raza Central Balsas, se cultivaron durante
7-8 semanas en un invernadero. Al cabo de este
período de tiempo, las plantas presentan los estadios de desarrollo
I y J definidos por Cheng y colaboradores (Am. J. Bot. 70 (1983),
450-462).
Inflorescencias masculinas y femeninas se
cosecharon, se congelaron en nitrógeno líquido y se utilizaron para
la obtención del ARN total de acuerdo con el método de aislamiento
con cloruro de guanidinio según Sambrook y colaboradores (Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2^{a} edición (1989), Cold Spring
Harbor Laboratory
Press).
Press).
La calidad de las preparaciones de ARN se ensayó
mediante una hibridación de transferencia Northern (Sambrook y
colaboradores, véase más arriba) con una sonda de deshidrogenasa de
gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) de
maíz. Para eliminar el ADN genómico, se incubaron durante 15 min. a
37ºC 50 \mug de un ARN total con 1 \mul del inhibidor de RNasa
RNasin (Promega, 40 U/\mul) y 5 \mul de la DNasa libre de RNasa
RQ1 (Promega, 1 U/\mul) en 100 \mul de un tampón para la
transcriptasa inversa (RT) (Frohman y colaboradores, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85 (1988), 8.998-9.002). Las muestras
se extrajeron mediante fenol saturado con una mezcla de Tris y EDTA
(TE), y mediante una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico
(24:1), y se precipitaron con etanol. Después de haber centrifugado
durante 30 min. a 20.000 x g y a 0ºC, el ARN total se disolvió en
EDTA 1 mM (de pH 7,5). El ARNm poli (A)^{+} se aisló
mediando utilización de perlas Dynabeads de oligo(dT) (Dynal,
Oslo).
El ARN total aislado en el Ejemplo 1 a partir de
inflorescencias masculinas y femeninas, se desfosforiló en primer
lugar, 50 \mug del ARN precipitado se disolvieron para ello en una
mezcla de 40 \mul de agua tratada con pirocarbonato de dietilo
("agua DEPC"), 5 \mul de 10 x tampón AP (Boehringer
Mannheim), 1 \mul de ditiotreitol 50 mM y 1,5 \mul de RNasin
(Promega). Después de la adición de 4 \mul de una fosfatasa
alcalina (AP; 1 U/\mul; Boehringer Mannheim), se incubó durante 1
h a 37ºC. Para la desactivación de la fosfatasa se mezcló con 1
\mug de proteinasa K (Boehringer Mannheim) y se incubó durante 1 h
a 37ºC. Las muestras se extrajeron, tal como se ha descrito más
arriba, con fenol saturado con TE y con una mezcla de cloroformo y
alcohol isoamílico, y se precipitaron con etanol. Los precipitados
se disolvieron en cada caso en 40 \mul de agua DEPC.
Después de la adición de 5 \mul de 10 x tampón
TAP, 1,25 \mul de RNasin, 1 \mul de ATP 100 mM y 3 \mul de
pirofosfatasa ácida procedente de tabaco (TAP; 5 U/\mul;
Epicentre), se incubó durante 1 h a 37ºC, para producir un
"descabezamiento". Las tandas de reacción se extrajeron
primeramente con fenol, luego con una mezcla de cloroformo y
alcohol isoamílico y se precipitaron con etanol. El ARN se disolvió
a continuación en 100 \mul de un tampón de elución (Dynal), y se
aisló el ARNm poli(A)+ mediando empleo de perlas Dynabeads
de oligo(dT) (Dynal).
Después de la elución en 4,2 \mul de agua, se
mezcló con 1,8 \mul de una mezcla de ligación (preparada a partir
de 3 \mul de 10 x tampón para ligasa de ARN [Boehringer Mannheim],
0,75 \mul de RNasin, 1,5 \mul de ATP 2 mM, 1,5 \mul de ligasa
de ARN de T4 [10 U/\mul; Boehringer Mannheim] y 1 \mug del
oligonucleótido de ARN de anclaje 5' - CAC GAU CUG AGG CCG AUC GAU
UCA - 3' en 1 \mul de H_{2}O) y se ligó durante 20 h a 16ºC. La
tanda de ligación se precipitó con etanol y el precipitado se
recogió en 2,8 \mul de agua DEPC.
Para la transcripción inversa se añadieron a ello
1,5 \mul de una mezcla de 4,3 \mul de 5 x tampón para RT
(Boehringer Mannheim). 1 \mul de una solución 20 mM de dATP, dTTP,
dGTP y dCTP, 1 \mul del cebador de ADNc CT29V
(30 pmol/\mul; 5' - ACC TAC GTG CAG AT_{15}V - 3' con V = G, A ó C) y 1 \mul de la transcriptasa inversa M-MuL V
(20 U/\mul; Boehringer Mannheim), y se incubó durante 1 h a 37ºC y seguidamente durante 30 min. a 42ºC. Las tandas de reacción se completaron hasta 20 \mul con el tampón TE.
(30 pmol/\mul; 5' - ACC TAC GTG CAG AT_{15}V - 3' con V = G, A ó C) y 1 \mul de la transcriptasa inversa M-MuL V
(20 U/\mul; Boehringer Mannheim), y se incubó durante 1 h a 37ºC y seguidamente durante 30 min. a 42ºC. Las tandas de reacción se completaron hasta 20 \mul con el tampón TE.
Para la síntesis de segundas cadenas de ADNc y la
amplificación se mezclaron en cada caso 2 \mul de las
"agrupaciones de ADNc de anclaje", obtenidas de esta manera,
con 28,5 \mul de H_{2}0, 5 \mul de 10 x tampón para PCR
(Tris/HCl 670 mM, pH 8,8; (NH_{4})_{2}SO_{4} 170 mM;
Tween 20 al 1%), 5 \mul de una solución 1 mM de dATP, dTTP, dGTP
y dCTP, 8 \mul de MgCl_{2} 10 mM, en cada caso 0,1 pmol de los
cebadores CT29V y AP23 (5' - CAC GAT CTG AGG CCG ATC GAT TC - 3')
en 1 \mul de H_{2}O y 0,5 \mul de la polimerasa de ADN Taq (5
U/\mul; Boehringer Mannheim) sobre hielo. Las tandas de reacción
se cubrieron con un aceite de parafina y se colocaron dentro de un
termociclador Trioblock (Biometra) calentado previamente a 95ºC.
Después de una desnaturalización inicial durante 5 min. a 95ºC, se
llevaron a cabo 20 ciclos del siguiente programa de amplificación:
desnaturalización a 95ºC durante 30 s (segundos), reanillado y
prolongación a 72ºC durante 2 min. Las tandas de reacción se
purificaron en columnas QiaQuick (Quiagen); la elución se efectuó
con 20 \mul de TE. Después de haber añadido 2,3 \mul de 10 x
tampón A (Boehringer Mannheim ) y
1 \mul de Sau3AI (4 U/\mul; Boehringer Mannheim), se disoció durante 1,5 h a 37ºC. Las tandas de reacción se precipitaron con etanol.
1 \mul de Sau3AI (4 U/\mul; Boehringer Mannheim), se disoció durante 1,5 h a 37ºC. Las tandas de reacción se precipitaron con etanol.
En cada caso 1,5 nmol de los oligonucleótidos
LT20 (5' - TCA CAT GCT AAG TCT CGC GA - 3') y LT24
(5' - GAT CTC GCG AGA CTT AGC ATG TGA C - 3') se mezclaron entre sí en un volumen de 50 \mul de H_{2}O, y se calentaron a 90ºC durante 3 min. La mezcla de reacción se ajustó a una concentración de Tris/HCl 50 mM (de
pH 7,5) y de MgCl_{2} 10 mM y se enfrió lentamente a 4ºC para generar enlazadores bicatenarios.
(5' - GAT CTC GCG AGA CTT AGC ATG TGA C - 3') se mezclaron entre sí en un volumen de 50 \mul de H_{2}O, y se calentaron a 90ºC durante 3 min. La mezcla de reacción se ajustó a una concentración de Tris/HCl 50 mM (de
pH 7,5) y de MgCl_{2} 10 mM y se enfrió lentamente a 4ºC para generar enlazadores bicatenarios.
Los fragmentos de restricción precipitados se
recogieron mediando adición de 0,5 \mul de los enlazadores, que
se habían preparado como se ha descrito, en un volumen total de 4
\mul de una mezcla de ligación según Cobianchi y Wilson (Methods
Enzymol. 152 (1987), 95-110), y se ligaron durante
16 h a 16ºC. Los enlazadores no ligados se eliminaron en columnas
QiaQuick.
Para la amplificación subsiguiente se reunió en
cada caso una quinta parte de la tanda de reacción de ligación
purificada con 10 \mul de 10 x tampón para PCR, 16 \mul de
MgCl_{2} 10 mM, 5 \mul de dATP, dTTP, dGTP y dCTP 1 mM, en cada
caso 20 pmol de CT29V y LT24 en un volumen total de 100 \mul.
Después de haber calentado a 95ºC durante 5 min. en un
termociclador, se añadieron a ello 5 U de la polimerasa de ADN Taq y
se realizaron 20 ciclos de una amplificación en las siguientes
condiciones: desnaturalización durante 30 s a 95ºC, reanillado y
prolongación a 72ºC durante 90 s.
En cada caso 1 \mul del producto de
amplificación se empleó para una segunda ronda de amplificación.
Ésta se efectuó según las condiciones antes mencionadas, pero en un
volumen total de 30 \mul durante 30 ciclos y mediando combinación
en cada caso de uno de los cebadores marcados con digoxigenina
DIG-CT29A (idéntico al CT29V en cuanto a la
secuencia, pero que en lugar de la última base degenerada "V"
tiene una "A" como última base inequívoca),
DIG-CT29C o DIG-CT29G, en cada caso
con uno de los 16 posibles cebadores LT24NN, prolongado en dos
bases con respecto a LT24. Se mezclaron en cada caso 3 \mul de una
tanda de reacción con 1,5 \mul de la solución de interrupción de
la secuenciación cíclica Cycle Sequencing Stop de Promega.
Luego, preparaciones correspondientes entre sí de
los tejidos que se habían de comparar se cargaron unas junto a
otras en dos pistas de un gel desnaturalizante de
poli(acrilamida) al 3,5%. Sobre una pista libre se aplicó
como patrón de longitud el marcador VIII de pesos moleculares de ADN
marcado con DIG (Boehringer Mannheim). La separación por
electroforesis y la transferencia a una membrana de Nylon se
efectuaron con un equipo de secuenciación GATC 1500 (MWG Biotech)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La membrana de
Nylon se trató en estado sin fijar de acuerdo con el protocolo del
fabricante para la detección por quimioluminiscencia de ácidos
nucleicos. Después de una exposición sobre una película para rayos X
(Kodak X-Omat), la membrana y la película se
llevaron a cubrimiento coincidente, y las bandas que aparecieron
diferencialmente se recortaron comediante un bisturí desde la
membrana. El trocito correspondiente de la membrana se incubó en una
tanda de reacción de amplificación renovada de 50 \mul en las
condiciones anteriormente indicadas; en tal caso se utilizaron
30-40 ciclos. Se comprobaron mediante una
electroforesis en gel de agarosa la amplificación renovada
satisfactoria así como la pureza del producto de amplificación
renovada.
El ARNm aislado en el Ejemplo 1 a partir de
inflorescencias masculinas y femeninas se transformó, de acuerdo
con el protocolo de RACE (Frohman y colaboradores, véase más
arriba), en un ADNc de primera cadena, obteniéndose agrupaciones de
ADNc. Con las agrupaciones de ADNc se llevó a cabo una PCR mediando
utilización del ceba-
dor - adaptador de RACE descrito en Frohman y colaboradores, véase más arriba, y de una mezcla de cebadores de cajas MADS específicos para familias de genes. Todos los cebadores de cajas MADS estaban dirigidos hacia secuencias específicas para familias de genes, que codificaban derivados de un motivo muy conservado de aminoácidos, y abarcaban todas las variaciones conocidas de las plantas. Para conseguir una especificidad lo más alta que sea posible, se mantuvo el grado de degeneración a un nivel lo más pequeño que era posible. Los cebadores utilizados en este trabajo fueron los siguientes:
dor - adaptador de RACE descrito en Frohman y colaboradores, véase más arriba, y de una mezcla de cebadores de cajas MADS específicos para familias de genes. Todos los cebadores de cajas MADS estaban dirigidos hacia secuencias específicas para familias de genes, que codificaban derivados de un motivo muy conservado de aminoácidos, y abarcaban todas las variaciones conocidas de las plantas. Para conseguir una especificidad lo más alta que sea posible, se mantuvo el grado de degeneración a un nivel lo más pequeño que era posible. Los cebadores utilizados en este trabajo fueron los siguientes:
P038 (dirigido hacia la secuencia de aminoácidos
"IKRIEN") 5' - GAT CAA G(A/C)G (G/C)AT
CGA
GAA - 3'; P041 (dirigido hacia "MKRIEN"), 5' - GAT GAA G(A/C)G (G/C)AT CGA GAA - 3'; P042 (dirigido hacia "IKHIEN"), 5' - GAT CAA GCA (C/T)AT CGA GAA - 3'; P043 (dirigido hacia "IKKIEN"), 5' - GAT CAA GAA GAT CGA GAA - 3'.
GAA - 3'; P041 (dirigido hacia "MKRIEN"), 5' - GAT GAA G(A/C)G (G/C)AT CGA GAA - 3'; P042 (dirigido hacia "IKHIEN"), 5' - GAT CAA GCA (C/T)AT CGA GAA - 3'; P043 (dirigido hacia "IKKIEN"), 5' - GAT CAA GAA GAT CGA GAA - 3'.
Con el cebador P038 se llevó a cabo la
amplificación de la siguiente manera:
Primeramente se reunieron con pipeta sobre hielo
50 \mul de una mezcla de reacción, que contenía Tris/HCl 67 mM,
de pH 8,8; (NH_{4})_{2}SO_{4} 17 mM; Tween 20 al 0,1%;
MgCl_{2} 0,8 mM; cada uno de los dNTP's con 20 \muM; 1,5 pmol
del cebador P038 y 1 \mul de la respectiva agrupación de ADNc.
Después de haber cubierto con un aceite de parafina, se calentaron
las mezclas de reacción en un termociclador Trioblock (Biometra,
Göttingen) durante 5 min. a 95ºC. Después de haber enfriado a 65ºC,
se añadieron 2,5 U de polimerasa de ADN Taq (Boehringer Mannheim).
Se llevaron a cabo 30 ciclos de la amplificación lineal mediando
utilización de los siguientes parámetros: desnaturalización a 95ºC
durante 30 s, reanillado a 54ºC durante 100 s, prolongación a 72ºC
durante 2 min. A continuación, las mezclas de reacción se enfriaron
a 65ºC.
Para una amplificación exponencial, a las tandas
de reacciones de amplificación lineales se les añadieron 50 \mul
de una mezcla de reacción previamente calentada a 65ºC, que contenía
100 \muM de los dNTP's, 15 pmol del ceba-
dor - adaptador RACE y del cebador P038 y 2,5 U de la polimerasa de ADN Taq. Luego se llevó a cabo una PCR mediando utilización de los parámetros anteriormente mencionados durante 24 ciclos, seguida por una prolongación final a 72ºC durante 10 min. Los productos de la PCR se purificaron en columnas QiaQuick (Quiagen, Hilden). Porciones de 1/5 (10 \mul) del material eluido se incubaron con 15 U de las enzimas de restricción Mse I (New England Biolabs), Hinf I o Sau3A I (Boehringer Mannheim) en 50 \mul del respectivo tampón de restricción durante 3 h a 37ºC. Después de una subsiguiente incubación durante 10 min. a 65ºC, los ácidos nucleicos se precipitaron con etanol y se aislaron mediante centrifugación (durante 30 min., con 20.000 x g a 4ºC). El residuo se volvió a suspender en
5 \mul de TE.
dor - adaptador RACE y del cebador P038 y 2,5 U de la polimerasa de ADN Taq. Luego se llevó a cabo una PCR mediando utilización de los parámetros anteriormente mencionados durante 24 ciclos, seguida por una prolongación final a 72ºC durante 10 min. Los productos de la PCR se purificaron en columnas QiaQuick (Quiagen, Hilden). Porciones de 1/5 (10 \mul) del material eluido se incubaron con 15 U de las enzimas de restricción Mse I (New England Biolabs), Hinf I o Sau3A I (Boehringer Mannheim) en 50 \mul del respectivo tampón de restricción durante 3 h a 37ºC. Después de una subsiguiente incubación durante 10 min. a 65ºC, los ácidos nucleicos se precipitaron con etanol y se aislaron mediante centrifugación (durante 30 min., con 20.000 x g a 4ºC). El residuo se volvió a suspender en
5 \mul de TE.
Si es que se desea, en este estadio ya se pueden
llevar a cabo reacciones radiactivas de prolongación de cebadores,
tal como se describen más adelante. Por otra parte, para la
amplificación renovada se puede efectuar una ligación del
enlazador, tal como se describe seguidamente. Para ello, porciones
de ½ \mul de los fragmentos de restricción suspendidos
renovadamente se incubaron durante 1 h a 37ºC en 10 \mul de tandas
de relleno (Tris/HCl 50 mM, de pH 8,0; MgCl_{2}
6 mM; ditiotreitol 10 mM; cada uno de los dNTP's con 100 \muM; 40 \mug de albúmina de suero bovino por ml; 0,5 U de la polimerasa de ADN de T4 (Boehringer Mannheim). Los fragmentos se precipitaron luego con etanol y se aisla-
ron - tal como se ha descrito más arriba -. Los sedimentos se suspendieron renovadamente en 2 \mul del tampón TE.
6 mM; ditiotreitol 10 mM; cada uno de los dNTP's con 100 \muM; 40 \mug de albúmina de suero bovino por ml; 0,5 U de la polimerasa de ADN de T4 (Boehringer Mannheim). Los fragmentos se precipitaron luego con etanol y se aisla-
ron - tal como se ha descrito más arriba -. Los sedimentos se suspendieron renovadamente en 2 \mul del tampón TE.
A partir de, en cada caso, 1,25 nmol de los
oligonucleótidos LR32 (5' - ACT CGA TTC TCA ACC CGA AAG TAT AGA TCC
CA - 3') y BTL18 (5' - TGG GAT CTA TAC TTT CAA - 3') se prepararon
enlazadores bicatenarios, tal como se describe en el Ejemplo 2. La
ligación de los enlazadores junto a los fragmentos de restricción
rellenos en sus extremos se efectuó tal como se describe en el
Ejemplo 2; en tal caso se incubaron en cada caso 0,5 \mul de los
enlazadores y 2 \mul de la tanda de reacción de relleno final,
suspendida de nuevo. Los enlazadores no ligados se eliminaron en
columnas QiaQuick.
Luego se realizó una amplificación renovada en
las condiciones de PCR antes citadas, mediando utilización de 5
\mul de una mezcla de ligación purificada como matriz, en total
por 15 ciclos. De acuerdo con la prescripción que acompaña al
sistema de secuenciación a escala de fmol de ADN "fmol DNA
sequencing system" (de Promega), se marcó con ^{32}P el
respectivo cebador de caja MADS (p.ej., el P038). Luego se utilizó
medio microlitro de los productos de amplificación renovada para la
preparación de 10 \mul de una mezcla para la prolongación de
cebadores, que contenía 50 \muM de los dNTP's, 1 U de la
polimerasa de ADN Taq y 0,4 \mul de cebadores de cajas MADS
marcados. Las mezclas de reacción se añadieron a las cavidades de un
termociclador previamente calentado (a 95ºC) e inicialmente se
desnaturalizó durante 3 min. a 95ºC, seguido por un programa de 30 s
a 95ºC, 30 s a 54ºC y 1 min. a 72ºC a lo largo de 30 ciclos.
Después de la prolongación final, se añadieron 5 \mul de la
Solución de interrupción de la secuenciación cíclica de Promega.
Como patrón de longitud se produjo una escala de 10 pb
"Sequamark" (Research Genetics, Huntsville AL). Para el
análisis por electroforesis en gel, la mezcla de prolongación se
calentó durante
2 min. a 70ºC y se añadieron 2 \mul a un gel de acrilamida al 5% desnaturalizante. Los geles se dejaron en tratamiento durante 3 h a 45 W, se fijaron en una mezcla de ácido acético al 5% y etanol al 10% y se secaron al aire. Luego los geles se expusieron a radiación de rayos X durante 4 - 12 h sobre una película de rayos X Kodak X-Omat.
2 min. a 70ºC y se añadieron 2 \mul a un gel de acrilamida al 5% desnaturalizante. Los geles se dejaron en tratamiento durante 3 h a 45 W, se fijaron en una mezcla de ácido acético al 5% y etanol al 10% y se secaron al aire. Luego los geles se expusieron a radiación de rayos X durante 4 - 12 h sobre una película de rayos X Kodak X-Omat.
En la Figura 3 se indica una representación
esquemática del protocolo de reacción llevado a cabo en el Ejemplo
3.
El ADN aislado en el Ejemplo 1 a partir de
inflorescencias femeninas de maíz y de teosinte se transcribió en
un ADNc de primera cadena como se describe en el Ejemplo 3 y se
empleó para la síntesis de productos de amplificación con una
longitud específica para un transcrito. En este caso pasó a
emplearse, para la amplificación selectiva de moléculas de ADNc,
que representan a miembros de la familia de genes de cajas MADS, una
mezcla de los oligonucleótidos P038, P041, P042 y P043, que
llevaban en este caso un grupo de biotina en su extremo 5'. Después
de la incubación con Mse I como enzima de restricción, los productos
de prolongación marcados con biotina se separaron mediante
partículas magnéticas revestidas con estreptavidina (Dynal) y se
emplearon tal como se describe en los Ejemplos 2 y 3 para la
ligación de enlazadores. Para la amplificación renovada pasó a
emplearse el oligonucleótido P046 5' - (A/C)G(G/C) CAG
GT(G/C) AC(C/G) T (A/T)C - 3' (dirigido hacia
"RQVT(F/Y)"). Los productos de amplificación así
obtenidos se marcaron radiactivamente tal como se describe
precedentemente y se separaron en un gel de secuenciación al 6%.
Las bandas que interesaban se recortaron desde
los geles obtenidos en los Ejemplos 3 y 4. Los ácidos nucleicos
contenidos allí se eluyeron en 25 \mul del tampón TE. En cada caso
5 \mul de un material eluido en un volumen de
50 \mul se amplificaron de nuevo en 30 ciclos mediando utilización de las condiciones de PCR antes mencionadas. Como cebadores se utilizaron el respectivo cebador de caja MADS y el oligonucleótido LR21, que es idéntico a las bases
1-21 de LR32. Para el análisis de las secuencias se secuenciaron 0,5 \mul de la banda amplificada de nuevo, de acuerdo con las prescripciones del estuche de secuenciación cíclica a escala de pmol (picomoles) de Promega, utilizándose como cebadores o bien el LR32, el cebador de PCR de caja MADS utilizado en cada caso, o el cebador interno de caja MADS P009 (5' - GAA GGC GTA CGA GCT CTC GGT GCT - 3'). Las temperaturas de reanillado eran de 70ºC para los LR32 y P009 o bien 50ºC para los otros cebadores de cajas MADS. La información acerca de las secuencias de las bandas recortadas se utilizó entonces para la identificación de los correspondientes clones en bancos de ADNc o de genes.
50 \mul se amplificaron de nuevo en 30 ciclos mediando utilización de las condiciones de PCR antes mencionadas. Como cebadores se utilizaron el respectivo cebador de caja MADS y el oligonucleótido LR21, que es idéntico a las bases
1-21 de LR32. Para el análisis de las secuencias se secuenciaron 0,5 \mul de la banda amplificada de nuevo, de acuerdo con las prescripciones del estuche de secuenciación cíclica a escala de pmol (picomoles) de Promega, utilizándose como cebadores o bien el LR32, el cebador de PCR de caja MADS utilizado en cada caso, o el cebador interno de caja MADS P009 (5' - GAA GGC GTA CGA GCT CTC GGT GCT - 3'). Las temperaturas de reanillado eran de 70ºC para los LR32 y P009 o bien 50ºC para los otros cebadores de cajas MADS. La información acerca de las secuencias de las bandas recortadas se utilizó entonces para la identificación de los correspondientes clones en bancos de ADNc o de genes.
En la Figura 5 se muestra el resultado del
aislamiento dependiente del sexo de genes de cajas MADS expresados.
Las pistas con números impares corresponden a transcritos de
inflorescencias masculinas, y las pistas con números pares
corresponden a transcritos femeninos. El gen ZMM1 se obtuvo mediando
utilización del cebador P038 y de la enzima de restricción Sau3AI,
la escala de secuencia muestra una parte de la secuencia de ZMM1,
que se había obtenido mediante secuenciación directa de las bandas
recortadas y amplificadas de nuevo con LR32 como cebador de
secuenciación. Para la identificación de ZMM2 se utilizaron el
cebador P042 y la enzima Hinf I. Los ZMM3 y ZAG1 se obtuvieron
mediando utilización del cebador P041 y de la enzima Mse I. Los ZMM7
y ZAG2 se obtuvieron con el cebador P043 y con la enzima Mse I. La
pista designada con M representa al marcador de longitudes de
ácidos nucleicos.
En la Figura 6 se muestra una asignación de los
genes identificados mediante el procedimiento de acuerdo con el
invento. Una comparación de 101 secuencias conocidas de dominios
MADS procedentes de levaduras, animales y plantas dio como
resultado la secuencia de consenso de los dominios MADS que se
indica en la línea 1. Además, se encontraron diversas subfamilias
que se diferencian en lo que se refiere a la secuencia total de los
genes, al modelo patrón de expresión, y a la función. Las
secuencias de MADS de maíz, identificadas mediante el procedimiento
de acuerdo con el invento, son miembros de dos de estas subfamilias,
la subfamilia del tipo AG y la del tipo AGL2. Las secuencias de
comparación AGAMOUS (Yanofsky y colaboradores, Nature 346 (1990),
35-39) y AGL2 (Ma y colaboradores, Genes Dev. 5
(1991), 484-495) proceden de Arabidopsis
thaliana (At). Las secuencias de comparación FBP6 (Angenent y
colaboradores, Plant J., 4 (1993), 101-102) y FBP2
(Angenent y colaboradores, Plant J. 4 (1992),
983-993) proceden de Petunia hybrida (Ph).
Además, se indican como secuencias de comparación las TAG1 (Pnueli
y colaboradores, Plant Cell 6 (1994), 163-167) y TM5
(Pnueli y colaboradores, Plant J. 1 (1991), 255-266)
procedentes de Lycopersicon esculentum (Le). En el presente
experimento se identificaron los genes ZAG1, ZAG2, ZMM1 y ZMM2
(Schmidt y colaboradores), Plant Cell 5 (1993),
729-737; Theissen y colaboradores, Gene 156 (1995),
155-166), así como otras secuencias nuevas ZMM3 y
ZMM7 de Zea mays (Zm). Para las secuencias individuales de los
dominios MADS en la Figura 6 se indican solamente las desviaciones
con respecto a la secuencia de consenso, mostrando los guiones una
identidad con la secuencia de consenso. Los aminoácidos subrayados
en la secuencia de consenso muestran el sitio de fijación para los
cebadores específicos para familias de genes.
En la totalidad de los seis genes de cajas MADS
identificados a partir de maíz, la expresión diferencial comprobada
mediante el procedimiento de acuerdo con el invento se pudo
confirmar mediante experimentos independientes de borrón de
transferencia Northern Blot o de hibridación in situ. Una
comparación de las intensidades de bandas de los productos de
amplificación con datos correspondientes obtenidos a partir de los
borrones de transferencia Northern pone de manifiesto que el
procedimiento de acuerdo con el invento hace posible una
determinación por lo menos semicuantitativa de la expresión de
miembros individuales de familias de genes en muestras
diferentes.
Además, el procedimiento de acuerdo con el
invento posee una alta reproducibilidad, puesto que 10 experimentos
independientes de repetición que partieron del ADNc proporcionaron
exactamente el mismo modelo patrón de bandas.
En total, mediante el procedimiento de acuerdo
con el invento se pudieron identificar seis genes de cajas MADS
diferentes, de los cuales 4 ya eran conocidos. De los genes ya
conocidos se pudo identificar la expresión de ZAG2 y ZMM1 como
específica para plantas femeninas. El ZAG1 es expresado más
intensamente en plantas femeninas que en plantas masculinas. El
ZMM2 es expresado, por el contrario, más intensamente en las
inflorescencias masculinas que en las femeninas.
Los dos nuevos genes de cajas MADS, aislados
mediante el procedimiento de acuerdo con el invento, pertenecen a
la subfamilia de los genes del tipo de AGL2. Uno de estos genes,
designado como ZMM3, es expresado más intensamente en las
inflorescencias masculinas que en las femeninas. La expresión del
nuevo gen ZMM7 parece tener lugar, por el contrario,
específicamente en plantas femeninas.
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften e.v. Berlín
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Hofgartenstr. 2
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Munich
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: DE (ALEMANIA)
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- NÚMERO DE CÓDIGO POSTAL: 80539
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DENOMINACIÓN DEL INVENTO: Procedimiento para el análisis de la expresión de genes
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- VERSIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (EPA)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ORIGINAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: DE 19518505.6
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE LA SOLICITUD: 19 DE MAYO DE 1995
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAUCUGA GGCCGAUCGA UUCA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCTACGTGC AGATTTTTTT TTTTTTTTV
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACGATCTGA GGCCGATCGA TTC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCACATGCTA AGTCTCGCGA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTCGCGA GACTTAGCAT GTGAC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCAAGMGS ATCGAGAA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGAAGMGS ATCGAGAA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCAAGCAY ATCGAGAA
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAAGAAG ATCGAGAA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTCGATTCT CAACCCGAAA GTATAGATCC CA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGGATCTAT ACTTTCAA
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipMGSCAGGTSA CSTWC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: cadena única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGCGTAC GAGCTCTCGG TGCT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS ACERCA DE LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Procedimiento para el análisis de la
expresión de genes, que comprende las siguientes etapas:
- (a)
- aislar moléculas de ARNm desde una o varias muestras de tejidos que se han de analizar,
- (b)
- sintetizar moléculas de primeras cadenas de ADNc a partir de las moléculas de ARNm,
- (c)
- sintetizar moléculas de segundas cadenas de ADNc,
- (d)
- disociar las moléculas de ADNc procedentes de (c) con por lo menos una endonucleasa de restricción,
- teniendo la endonucleasa de restricción una secuencia de reconocimiento de cuatro bases,
- (e)
- adosar enlazadores a los fragmentos de ADNc obtenidos mediante la digestión por restricción,
- (f)
- amplificar selectivamente una parte de los productos de la ligación procedentes de (e),
- efectuándose la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa y empleándose por lo menos un cebador dirigido hacia el enlazador adosado, así como por lo menos un cebador dirigido hacia la secuencia del cebador de ADNc empleado en la etapa (b), y siendo prolongados los cebadores empleados eventualmente en su extremo 3' por una prolongación de una o varias bases selectivas,
- (g)
- separar los productos de amplificación de acuerdo con su longitud, conteniendo los productos de amplificación en sus extremos unas secuencias, a las que se pueden fijar los cebadores utilizados en la eta- pa (f), y
- (h)
- analizar los productos de amplificación.
2. Procedimiento según la reivindicación
1,
caracterizado porque
en la etapa (c) se efectúa una amplificación de
las moléculas de ADNc.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, que comprende además una etapa de:
- (i)
- comparar las mezclas de productos de amplificación que se han obtenido a partir de diversas preparaciones de ARNm.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque
el cebador de oligo(dT) empleado para la
síntesis en la etapa (b), tiene una prolongación en su extremo 3'
y/o en su extremo 5'.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque
la separación de los productos de amplificación
se efectúa en la etapa (g) mediante electroforesis con transferencia
de borrón directa.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5
caracterizado porque
los productos de amplificación procedentes de la
etapa (f) llevan grupos de marcación fluorescentes, y la separación
y la detección se realizan mediante un aparato automático de
secuenciación.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque
los oligonucleótidos empleados contienen uno o
varios sitios de reconocimiento para enzimas de restricción.
8. Utilización de fragmentos de
restricción de ADNc preparados según la reivindicación 1, etapas
(a) hasta (g), para el análisis comparativo de la expresión de dos o
más muestras, comparándose entre sí las mezclas de fragmentos
obtenidas de distintas muestras, e identificándose los fragmentos
que son detectados apareciendo como diferentes entre las muestras
que se han de comparar.
9. Estuche de reactivos para el análisis
de la expresión de genes en un procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende:
- (a)
- una enzima para la síntesis de primeras cadenas de ADNc,
- (b)
- por lo menos una enzima para la síntesis de segundas cadenas de ADNc y para la amplificación de fragmentos de ADN,
- (c)
- moléculas de cebadores de ácidos nucleicos monocatenarios, seleccionadas entre el grupo que comprende (i) por lo menos un nucleótido de oligo(dT), (ii) un cebador de acuerdo con (i), con una prolongación en 3' o/y una prolongación en 5', llevando uno de los cebadores de acuerdo con (i ó ii) un grupo de marcación seleccionado entre colorantes fluorescentes, biotina o antígenos, y (iii) cebadores de acuerdo con (i) ó (ii), que contienen una prolongación en 3' codificada por el tipo de su marcación, p.ej. el color de una marcación de fluorescencia, y
- (d)
- agentes para la marcación y para la detección de ácidos nucleicos.
10. Estuche de reactivos según la
reivindicación 9, que comprende además:
- (e)
- por lo menos una enzima de restricción,
- (f)
- por lo menos una molécula de enlazador de ADN bicatenario y agentes para la fijación de la molécula de enlazador a los extremos de fragmentos de ADN,
- (g)
- por lo menos un oligonucleótido de ARN monocatenario y agentes para la fijación del oligonucleótido de ARN al extremo 5' de moléculas de ARNm, o/y
- (h)
- otros reactivos adicionales tales como el inhibidor de la RNasa, tampones, recipientes de reacción o partículas magnéticas que se han revestido con estreptavidina.
11. Aplicación del procedimiento según una
de las reivindicaciones 1 a 7 para el aislamiento de nuevos
genes.
12. Aplicación del procedimiento según una
de las reivindicaciones 1 a 7 para la identificación de nuevos
miembros de familias de genes.
13. Aplicación del procedimiento según una
de las reivindicaciones 1 a 7 para la determinación del estadio de
vida de una célula o de un organismo.
14. Aplicación del procedimiento según una
de las reivindicaciones 1 a 7 para la investigación del ciclo de
vida de una célula o de un organismo.
15. Utilización según una de las
reivindicaciones 11 a 14 para la investigación acerca del cáncer o
del envejecimiento.
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