ES2281138T3 - Bibliotecas de acido nucleico normalizadas y metodos de produccion de las mismas. - Google Patents
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Abstract
Método para la normalización de una biblioteca de ácido nucleico que comprende: (a) incubar una biblioteca de ácido nucleico que va normalizarse con moléculas de ácido nucleico haptenilado sintéticas complementarias a todas o a una parte de las moléculas de ácido nucleico de dicha biblioteca en condiciones que favorecen la hibridación de las moléculas más abundantes de dicha biblioteca con dichas moléculas de ácido nucleico haptenilado; y b) eliminar dichas moléculas hibridadas mediante interacciones ligando-hapteno, produciendo así una biblioteca normalizada.
Description
Bibliotecas de ácido nucleico normalizadas y
métodos de producción de las mismas.
La presente invención pertenece al campo de la
biología molecular y la genética. La invención se refiere
generalmente a métodos para producir bibliotecas de ácido nucleico
normalizadas, tales que la variación en la abundancia de las
moléculas de ácido nucleico individuales disminuye sustancialmente
(por ejemplo, hasta no más de aproximadamente dos órdenes de
magnitud). La invención también se refiere a bibliotecas
normalizadas producidas por estos métodos, a las moléculas de ácido
nucleico aisladas a partir de estas bibliotecas, a los constructos
genéticos (por ejemplo, vectores) que comprenden estas moléculas de
ácido nucleico, y a las células huésped que comprenden dichas
bibliotecas normalizadas.
La aclaración de los mecanismos que dictan el
funcionamiento normal de las células vivas requiere un entendimiento
detallado de la información codificada en todos los genes (también
denominado en el presente documento a modo de sinónimo, el genoma).
Para mapear y secuenciar los genes contenidos en los genomas de
diferentes organismos, las secuencias del ARN mensajero (ARNm), que
son representativas de los genes del genoma, se usan normalmente
para evaluar la creación de una célula particular u organismo de
interés. Sin embargo, los ARNm (que se calcula que alcanzan un
número de 100.000 en los seres humanos) se producen a diferentes
niveles dentro de los distintos tipos de célula a diferentes puntos
en desarrollo (por ejemplo, hay menos de una copia por célula de
algunos ARNm y hay millones de copias por célula de otros). Estos
ARNm, su desarrollo y su expresión regulada específica de tipo
celular, y su traducción en proteínas es lo que produce el carácter
único de un tipo de célula particular. Por ejemplo, las células de
músculo adulto producen altos niveles de ARNm de mioglobina,
mientras que los glóbulos rojos maduros contienen altos niveles de
hemoglobina. En el feto, la hemoglobina se produce por el hígado;
sin embargo, tras el nacimiento, el tipo de hemoglobina producida y
la fuente tisular cambian, debido a cambios en la expresión
génica.
Un entendimiento de los detalles moleculares del
funcionamiento normal de las células es esencial para entender y
tratar enfermedades heredadas en las que la regulación y la
expresión de uno o más genes pueden haber cambiado. En este
objetivo se integra la producción de bibliotecas de ácidos nucleicos
clonados, a partir de las cuales pueden aislarse todos o
sustancialmente todos los miembros de las bibliotecas con
aproximadamente la misma probabilidad.
Una biblioteca normalizada con un menor
intervalo de concentraciones relativas de sus miembros, por ejemplo
tan bajo como aproximadamente 2-4 veces, tendrá la
ventaja de permitir que esencialmente todos los ARNm estén
disponibles para el aislamiento y posterior análisis. Este tipo de
biblioteca ampliaría el entendimiento de la función normal de genes
individuales y del genoma en general. Sin embargo, ninguno de los
métodos notificados hasta el momento han dado como resultado la
producción de bibliotecas de ácido nucleico normalizadas en las que
esencialmente se representan todas las moléculas de ácido nucleico o
genes expresados en un tipo de célula o tejido particular y pueden
aislarse con una alta probabilidad. Aunque algunos investigadores
han intentado normalizar (es decir, reducir la variación en la
abundancia relativa de los componentes de la población de moléculas
de ácido nucleico), ninguno ha tenido éxito al llevar la abundancia
relativa de la población total hasta un intervalo de dos órdenes de
magnitud (Bonaldo, M., Lennon, G., Soares, M.B., Genome Res.
6:791-866 (1996); Ko, M.S.H., Nucl. Acids Res.
18:5705-5711 (1990); Pantanjali, S.R., et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1943-1947
(1991); Soares, M.B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:9228-9232 (1994)). Las bibliotecas resultantes
"normalizadas" no han podido proporcionar la cantidad de
información novedosa necesaria para entender la expresión de la
mayoría de los genes. Por tanto, existe una necesidad actual de
métodos de producción de bibliotecas de ácido nucleico
normalizadas, y de bibliotecas de ácido nucleico normalizadas
producidas mediante tales métodos.
El documento WO 95/08647 describe un método para
la construcción de bibliotecas de ADNc normalizadas, y usos de las
mismas.
Bonaldo Fatina de M et al., Genome
Research, Vol. 6, Nº 9, 1 de septiembre de 1996, Págs.
791-806, describe la "normalización" y
"sustracción": dos enfoques para facilitar el descubrimiento de
genes.
Ko, Nucleic Acids Research, Vol. 18, Nº 19,
1990, págs. 5705-5711, describe una "biblioteca de
ADNc equiparada" mediante la reasociación de ADNc de doble
cadena cortos.
El documento WO 95/11986 describe un método para
generar una biblioteca de ADNc sustraída, y usos de la
biblioteca.
Hongping Jiang et al., Molecular and
Cellular Differentiation, Vol. 1, Nº 3, 1993, págs.
285-299, describe el uso de un protocolo de
hibridación de sustracción sensible y eficaz para la identificación
de genes regulados diferencialmente durante la inducción de la
diferenciación en células de melanoma humanas.
Sankhavaram et al., P.N.A.S. (USA), Vol.
88, Nº 5, 1 de marzo de 1991, págs. 1943-1947,
describe la construcción de una biblioteca de ADNc (normalizada) de
abundancia uniforme.
La presente invención proporciona un método para
la normalización de una biblioteca de ácido nucleico que
comprende:
- (a)
- incubar una biblioteca de ácido nucleico que va normalizarse con moléculas de ácido nucleico haptenilado sintéticas complementarias a todas o a una parte de las moléculas de ácido nucleico de dicha biblioteca en condiciones que favorecen la hibridación de las moléculas más abundantes de dicha biblioteca con dichas moléculas de ácido nucleico haptenilado; y
- (b)
- eliminar dichas moléculas hibridadas mediante interacciones ligando-hapteno, produciendo así una biblioteca normalizada.
La presente invención, por tanto, satisface esta
necesidad proporcionando métodos para producir bibliotecas de ácido
nucleico normalizadas (por ejemplo, bibliotecas de moléculas de
ácido nucleico clonadas de las cuales cada molécula de ácido
nucleico miembro puede aislarse con aproximadamente una probabilidad
equivalente). En particular, la invención se refiere a métodos para
normalizar una biblioteca de ácido nucleico, que puede ser una
biblioteca de ADNc de cadena sencilla o cadena doble, tal como se
proporciona en las reivindicaciones.
En un aspecto preferido de la invención, la
concentración relativa de todos los miembros de la biblioteca
normalizada se encuentra dentro de uno a dos órdenes de magnitud. En
otro aspecto preferido, la invención permite la supresión o
eliminación de la molécula de ácido nucleico contaminante de la
biblioteca normalizada. Tal contaminación puede incluir vectores
dentro de la biblioteca que no contienen insertos (por ejemplo,
ruido de fondo). De esta manera, toda o una parte sustancial de la
biblioteca normalizada comprenderá vectores que contienen moléculas
de ácido nucleico insertadas de la biblioteca.
La invención también hace referencia a tales
métodos en los que las condiciones que favorecen la hibridación de
las moléculas más abundantes de la biblioteca con las moléculas
hapteniladas se seleccionan del grupo que consiste en: (a) una Cot
igual a o superior a 25; (b) una Cot igual a o superior a 50; (c)
una Cot igual o superior a 100; (d) una Cot igual a o superior a
1.000; (e) una Cot igual a o superior a 2.000; (f) una Cot igual a
o superior a 5.000; (g) una Cot desde aproximadamente 10 hasta
10.000; (h) una Cot desde aproximadamente 25 hasta 10.000; (i) una
Cot desde aproximadamente 50 hasta 10.000; (j) una Cot desde
aproximadamente 1.000 hasta 10.000; (k) una Cot desde
aproximadamente 5.000 hasta 10.000; (l) una Cot desde
aproximadamente 500 hasta 5.000; (m) una Cot desde aproximadamente
100 hasta 1000; y (n) una Cot de menos de 10.000.
En un aspecto preferido de la invención, se
incuba una población de ARNm en condiciones suficientes para
producir una población de moléculas de ADNc complementarias a todas
o a una parte de dichas moléculas de ARNm. Preferiblemente, tal
población de moléculas de ADNc (por ejemplo ADNc de cadena sencilla)
se produce mezclando la población de moléculas de ARNm (moléculas
molde) con uno o más polipéptidos que tienen actividad transcriptasa
inversa que incuban dicha mezcla en condiciones suficientes para
producir una población de moléculas de ADNc de cadena sencilla
complementarias a todas o a una parte de dichas moléculas de ARNm.
Las moléculas de ADNc de cadena sencilla pueden usarse entonces
como moléculas molde para crear moléculas de ADNc de cadena doble
incubando la mezcla en las condiciones apropiadas en presencia de
una o más ADN polimerasas. La población resultante de bibliotecas
de ADNc de cadena doble o cadena sencilla puede normalizarse según
la invención. Preferiblemente, tales bibliotecas de ADNc se
insertan en uno o más vectores antes de la normalización.
Alternativamente, las bibliotecas de ADNc pueden normalizarse antes
de la inserción en uno o más vectores y tras la normalización
pueden clonarse en uno o más vectores.
En un aspecto particularmente preferido de la
invención, la biblioteca que va a normalizarse está contenida en
(insertada en) uno o más vectores, que pueden ser un plásmido, un
cósmido, un fagémido y similar. Tales vectores preferiblemente
comprenden uno o más promotores que permiten la síntesis de al menos
una molécula de ARN a partir de todas o una parte de las moléculas
de ácido nucleico (preferiblemente moléculas de ADNc) insertadas en
el vector. Así, mediante el uso de los promotores, pueden crearse y
usarse moléculas de ARN hapteniladas complementarias a todas o a
una parte de las moléculas de ácido nucleico de la biblioteca para
normalizar la biblioteca según la invención. Tales moléculas de ARN
sintetizadas (que se han haptenilado) serán complementarias a todos
o a una parte de los insertos de vector de la biblioteca. Las
moléculas más abundantes en la biblioteca pueden eliminarse
entonces preferentemente mediante la hibridación de las moléculas
de ARN hapteniladas con la biblioteca, produciendo de esta manera la
biblioteca normalizada de la invención. Sin ser limitadas, se
piensa que las moléculas de ARN sintetizadas son representativas de
la biblioteca; es decir, la especie más abundantes en la biblioteca
da como resultado un ARN haptenilado más abundante usando el método
anterior. La abundancia relativa de las moléculas dentro de la
biblioteca, y por tanto, dentro del ARN haptenilado determina la
tasa de eliminación de una especie particular de la biblioteca; si
la abundancia de una especie particulares es alta, tal especie
altamente abundante se eliminará más fácilmente mientras que una
especie poco abundante se eliminará menos fácilmente de la
población. La normalización mediante este proceso permite por tanto
equiparar sustancialmente el nivel de cada especie dentro de la
biblioteca.
En otro aspecto preferido de la invención, la
biblioteca que va a normalizarse no necesita insertarse en uno o
más vectores antes de la normalización. En tal aspecto de la
invención, las moléculas de ácido nucleico de la biblioteca pueden
usarse para sintetizar moléculas de ácido nucleico hapteniladas
usando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, moléculas de ácido
nucleico hapteniladas pueden sintetizarse en presencia de una o más
ADN polimerasas, uno o más cebadores o sondas apropiados o uno o más
nucleótidos (los nucleótidos y/o cebadores o sondas pueden ser
haptenilados). De esta manera, se producirán moléculas de ADN
hapteniladas y podrán usarse para normalizar la biblioteca según la
invención. Alternativamente, pueden añadirse uno o más promotores a
(o ligarse a) las moléculas de la biblioteca, permitiendo de esta
manera la síntesis de moléculas de ARN hapteniladas para usarse
para normalizar la biblioteca según la invención. Por ejemplo, los
adaptadores que contienen uno o más promotores se añaden a (o se
ligan a) uno o más extremos de moléculas de cadena doble de la
biblioteca (por ejemplo, una biblioteca de ADNc preparada a partir
de una población de moléculas de ARNm). Tales promotores pueden
usarse entonces para preparar moléculas de ARN hapteniladas
complementarias a todas o a una parte de las moléculas de ácido
nucleico de la biblioteca. Según la invención, la biblioteca puede
normalizarse entonces y, si se desea, insertarse en uno o más
vectores.
Mientras el ARN haptenilado se usa
preferiblemente para normalizar bibliotecas, otras moléculas de
ácido nucleico haptenilado pueden usarse según la invención. Por
ejemplo, puede sintetizarse ADN haptenilado a partir de la
biblioteca y usarse según la invención.
Haptenos adecuados para usarse en los métodos de
la invención incluyen, pero no se limitan a, avidina,
estreptavidina, proteína A, proteína G, un receptor Fc de la
superficie celular, un antígeno específico de anticuerpo, un
sustrato específico de enzima, polimixina B, proteína neutralizante
de endotoxina (ENP), Fe^{+++}, un receptor de transferrina, un
receptor de insulina, un receptor de citocina, CD4, espectrina,
fodrina, ICAM-1, ICAM-2, C3bi,
fibrinógeno, Factor X, anquirina, una integrina, vitronectina,
fibronectina, colágeno, laminina, glicoforina,
Mac-1, LFA-1,
\beta-actina, gp120, una citocina, insulina,
ferrotransferrina, apotransferrina, lipopolisacárido, una enzima,
un anticuerpo, biotina y combinaciones de los mismos. Un hapteno
particularmente preferido es biotina.
Según la invención, pueden aislarse moléculas
hibridadas producidas por los métodos anteriormente descritos, por
ejemplo, mediante extracción o mediante interacciones
ligando-hapteno. Preferiblemente, se usan métodos
de extracción (por ejemplo, usando disolventes orgánicos. Puede
lograrse el aislamiento mediante interacciones
ligando-hapteno incubando las moléculas hapteniladas
con un soporte sólido que comprende al menos un ligando que se une
al hapteno. Los ligandos preferidos para usar en tales métodos de
aislamiento corresponden al hapteno particular usado, e incluyen,
pero no se limitan a, biotina, un anticuerpo, una enzima,
lipopolisacárido, apotransferrina, ferrotransferrina, insulina, una
citocina, gp120, \beta-actina,
LFA-1, Mac-1, glicoforina,
laminina, colágeno, fibronectina, vitronectina, una integrina,
anquirina, C3bi, fibrinógeno, Factor X, ICAM-1,
ICAM-2, espectrina, fodrina, CD4, un receptor de
citocina, un receptor de insulina, un receptor de transferrina,
Fe^{+++}, polimixina B, proteína que neutraliza endotoxina (ENP),
un sustrato específico de enzima, proteína A, proteína G, un
receptor Fc de la superficie celular, un antígeno específico de
anticuerpo, avidina, estreptavidina o combinaciones de los mismos.
El soporte sólido usado en estos métodos de aislamiento puede ser
nitrocelulosa, diazocelulosa, vidrio, poliestireno,
poli(cloruro de vinilo), polipropileno, polietileno,
dextrano, Sepharose, agar, almidón, nylon, una perla de látex, una
perla magnética, una perla paramagnética, una perla supramagnética
o una placa de microtitulación. Los soportes sólidos preferidos son
perlas magnéticas, perlas paramagnéticas y perlas supramagnéticas,
y particularmente preferidas son las perlas que comprenden una o más
moléculas de estreptavidina o avidina.
En otro aspecto de la invención, se somete a las
bibliotecas normalizadas a un aislamiento adicional o etapas de
selección que permiten la eliminación de contaminación o ruido de
fondo no deseado. Tal contaminación o ruido de fondo puede incluir
ácidos nucleicos no deseados. Por ejemplo, cuando una biblioteca que
va a normalizarse se construye en uno o más vectores, puede estar
presente un bajo porcentaje de vector (sin inserto) en la
biblioteca. Con la normalización, tal baja abundancia de moléculas
(por ejemplo, ruido de fondo de vector) puede volverse un
constituyente más significativo como resultado del proceso de
normalización. Es decir, puede aumentarse el nivel relativo de tal
baja abundancia de ruido de fondo como parte del proceso de
normalización.
Puede lograrse la eliminación de tales ácidos
nucleicos contaminantes incubando una biblioteca normalizada con
una o más sondas hapteniladas que son específicas para las moléculas
de ácido nucleico de la biblioteca (por ejemplo sondas específicas
de diana). En particular, la eliminación de secuencias contaminantes
puede lograrse seleccionando aquellos ácidos nucleicos que tienen
la secuencia de interés o eliminando aquellas moléculas que no
contienen secuencias de interés. Según la invención, la eliminación
de moléculas de ácido nucleico contaminantes puede realizarse sobre
cualquier biblioteca normalizada (ya esté o no la biblioteca
construida en un vector). Por tanto, las sondas se diseñarán de
manera que no reconozcan o hibriden los ácidos nucleicos
contaminantes (como en la realización preferida que usa sonda de
biotina oligodA-NotI 3'). Con la hibridación de la sonda
haptenilada con moléculas de ácido nucleico de la biblioteca, las
sondas hapteniladas se unirán a y seleccionarán las secuencias
deseadas en la biblioteca normalizada y dejarán las moléculas de
ácido nucleico contaminantes, dando como resultado una biblioteca
normalizada. La biblioteca normalizada seleccionada puede entonces
aislarse. En un aspecto preferido, tales bibliotecas normalizadas
seleccionadas aisladas son de cadena sencilla, y pueden convertirse
en cadena doble tras la selección incubando la biblioteca de cadena
sencilla en condiciones suficientes como para hacer que las
moléculas de ácido nucleico sean de cadena doble. Las moléculas de
cadena doble pueden transformarse entonces en una o más células
huésped. Alternativamente, la biblioteca normalizada puede
convertirse en cadena doble usando la sonda o cebador haptenilado
(preferiblemente específico de diana) y luego seleccionado mediante
extracción o interacciones ligando-hapteno. Tales
moléculas de cadena doble seleccionadas pueden transformarse en una
o más células huésped.
En otro aspecto de la invención, pueden
reducirse o eliminarse los ácidos nucleicos contaminantes incubando
la biblioteca normalizada en presencia de uno o más cebadores
específicos para secuencias de biblioteca (específicos para clones
que contienen insertos, por ejemplo oligodA-NotI). Este
aspecto de la invención puede comprender incubar la biblioteca
normalizada de cadena sencilla con uno o más nucleótidos
(preferiblemente nucleótidos que confieren resistencia a nucleasa a
las moléculas de ácido nucleico sintetizadas), y uno o más
polipéptidos que tienen actividad polimerasa, en condiciones
suficientes como para hacer que las moléculas de ácido nucleico
sean de cadena doble. Las moléculas de cadena doble resultantes
pueden transformarse entonces en una o más células huésped.
Alternativamente, las moléculas de cadena doble resultantes que
contienen nucleótidos que confieren resistencia a nucleasa pueden
digerirse con tal nucleasa y transformarse en una o más células
huésped.
En todavía otro aspecto, la eliminación o
supresión del ácido nucleico contaminante puede lograrse antes de
la normalización de la biblioteca, dando como resultado de esta
manera la biblioteca normalizada seleccionada de la invención. En
tal método, la biblioteca que va a normalizarse puede someterse a
cualquiera de los métodos descritos en el presente documento para
eliminar moléculas de ácido nucleico no deseadas y luego la
biblioteca puede normalizarse mediante el proceso de la invención
para proporcionar las bibliotecas normalizadas seleccionadas de la
invención.
Según la invención, las moléculas de ácido
nucleico de cadena doble se convierten en cadena sencilla antes de
la hibridación. Así, los métodos de la invención pueden comprender
además tratar las moléculas de ácido nucleico de cadena doble de la
biblioteca anteriormente descritas en condiciones suficientes como
para hacer que las moléculas de ácido nucleico sean de cadena
sencilla. Tales condiciones pueden comprender la degradación de una
cadena de las moléculas de ácido nucleico de cadena doble
(preferiblemente usando proteína de gen II y exonucleasa III), o la
desnaturalización de las moléculas de ácido nucleico de doble cadena
usando calor, condiciones alcalinas y similares.
La invención también hace referencia a
bibliotecas de ácido nucleico normalizadas, bibliotecas de ácido
nucleico normalizadas seleccionadas y células huésped transformadas
mediante los métodos anteriormente descritos.
La figura 1 es una representación esquemática
del fagémido que se ha usado para construir una biblioteca de ADNc
clonada direccionalmente.
La figura 2 es un diagrama esquemático de la
producción de bibliotecas de fagémido normalizadas usando
hibridación sustractiva con un controlador de ARN de biblioteca
total biotinilada denominada a modo de sinónimo molécula de ácido
nucleico haptenilado.
La figura 3 es un diagrama que muestra como
pueden usarse las sondas específicas de diana biotiniladas en 3'
para producir bibliotecas de fagémido normalizadas de ruido de fondo
bajo también denominadas en el presente documento como bibliotecas
normalizadas seleccionadas.
La figura 4 es un diagrama que muestra como
puede usarse una sonda específica de diana biotinilada en 5' para
reducir el ruido de fondo en bibliotecas de fagémido normalizadas
también denominadas en el presente documento bibliotecas
normalizadas seleccionadas.
La figura 5 es un diagrama que muestra como los
nucleótidos resistentes a nucleasa y una nucleasa dan bibliotecas
de fagémido normalizadas de ruido de fondo bajo, también denominadas
en el presente documento bibliotecas normalizadas
seleccionadas.
La figura 6 es una fotografía de un gel teñido
con bromuro de etidio del enriquecimiento de varios ADNc de
TGF\beta, que están presentes en abundancias considerablemente
diferentes en una biblioteca de ADNc no normalizada, a diferentes
Cot de sustracción en una biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano
normalizada para la que se han aplicado dos métodos de eliminación
de ruido de fondo diferentes.
La figura 7 es una representación esquemática de
la normalización de una biblioteca usando promotores que comprenden
adaptadores. Tras la normalización, puede clonarse la biblioteca en
un vector. En este método, la eliminación de secuencias de vector
contaminantes puede ser innecesaria, dado que la selección de
secuencias de ruido de fondo puede realizarse antes de la
clonación.
En la siguiente descripción, se usan ampliamente
varios términos empleados en la tecnología de ADN recombinante.
Para proporcionar un entendimiento más claro y consistente de la
memoria descriptiva y reivindicaciones, incluyendo el alcance que
va a darse a tales términos, se proporcionan las siguientes
definiciones.
Biblioteca. Tal como se usa en el
presente documento, el término "biblioteca" o "biblioteca de
ácido nucleico" significa un conjunto de moléculas de ácido
nucleico (circulares o lineales) representativas de todo o una
parte significativa del contenido de ADN de un organismo (una
"biblioteca genómica"), o un conjunto de moléculas de ácido
nucleico representativas de todos o una parte significativa de los
genes expresados (una "biblioteca de ADNc") en una célula,
tejido, órgano u organismo. Tales bibliotecas pueden o no estar
contenidas en uno o más vectores.
Normalizado. Tal como se usa en el
presente documento, el término "normalizado" o "biblioteca
normalizada" significa una biblioteca de ácido nucleico que se
ha manipulado, preferiblemente usando los métodos de la invención,
para reducir la variación relativa en abundancia entre moléculas de
ácido nucleico miembro en la biblioteca hasta un intervalo no
superior a aproximadamente 25 veces, no superior a aproximadamente
20 veces, no superior a aproximadamente 15 veces, no superior a
aproximadamente 10 veces, no superior a aproximadamente 7 veces, no
superior a aproximadamente 6 veces, no superior a aproximadamente 5
veces, no superior a aproximadamente 4 veces, no superior a
aproximadamente 3 veces o no superior a aproximadamente 2 veces.
Controlador. Tal como se usa en el
presente documento, el término "controlador" se refiere a una
población de moléculas de ácido nucleico (preferiblemente ARN) que
son complementarias a todas o a una parte de moléculas de ácido
nucleico de una biblioteca. Tal controlador comprende
preferiblemente uno o más haptenos y preferiblemente están en
exceso molar (superior a 10, preferiblemente superior a 20 veces)
comparado con la biblioteca de interés. Según la invención, el
controlador se sintetiza preferiblemente a partir de la biblioteca
que va a normalizarse y luego se usa el controlador para normalizar
esa biblioteca.
Ruido de fondo. Tal como se usa en el
presente documento, ruido de fondo hace referencia a moléculas de
ácido nucleico contaminantes que pueden estar presentes en una
biblioteca construida. Las moléculas de ácido nucleico
contaminantes típicas son vectores en los que se ha construido la
biblioteca pero que han perdido la molécula de ácido nucleico
insertada (mediante deleción o de otra manera) o que no contienen
insertos de ácido nucleico. Las sondas o cebadores específicos de
diana descritos en el presente documento no se hibridarán con las
secuencias de ruido de fondo o contaminantes.
Vector. Tal como se usa en el presente
documento, un "vector" es un ADN de plásmido, cósmido, fagémido
o fago u otra molécula de ADN que puede replicarse de manera
autónoma en una célula huésped, y que se caracteriza por uno o un
número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasa de
restricción en los que tales secuencias de ADN pueden cortarse de
una manera determinada sin pérdida de una función biológica esencial
del vector, y en los que puede insertarse ADN para provocar su
replicación y clonación. El vector también puede contener un
marcador adecuado para su uso en la identificación de células
transformadas con el vector. Los marcadores, por ejemplo, incluyen,
pero no se limitan a, resistencia a tetraciclina o resistencia a
ampicilina.
Cebador. Tal como se usa en el presente
documento, "cebador" se refiere a un oligonucleótido de cadena
sencilla que se extiende mediante unión covalente de monómeros de
nucleótido durante la amplificación o polimerización de una
molécula de ADN.
Sonda. Tal como se usa en el presente
documento, "sonda" se refiere a un oligonucleótido de cadena
sencilla que puede usarse para hibridar y/o aislar una o más
moléculas de ácido nucleico de interés. Tales sondas pueden o no
comprender uno o más haptenos.
Molde. El término "molde" tal como
se usa en el presente documento se refiere a moléculas de ácido
nucleico de cadena doble o de cadena sencilla que van a
amplificarse, sintetizarse o secuenciarse. En el caso de moléculas
de cadena doble, la desnaturalización de sus cadenas para formar una
primera y segunda cadena se realiza preferiblemente antes de que
estas moléculas puedan amplificarse, sintetizarse o secuenciarse, o
la molécula de cadena doble molécula puede usarse directamente como
molde. Para moldes de cadena sencilla, un cebador, complementario a
una parte del molde, se hibrida en condiciones apropiadas y entonces
una o más polimerasas pueden sintetizar una molécula de ácido
nucleico complementaria a todo o a una parte de dicho molde.
Alternativamente, para los moldes de cadena doble, pueden usarse
uno o más promotores (por ejemplo promotor) en combinación con una
o más polimerasas para crear moléculas de ácido nucleico
complementarias a todo o a una parte del molde. Las moléculas
recientemente sintetizadas, según la invención, pueden ser iguales o
más cortas en longitud que el molde
original.
original.
Que incorpora. El término "que
incorpora" tal como se usa en el presente documento significa
formar parte de un cebador o molécula de ADN y/o ARN.
Amplificación. Tal como se usa en el
presente documento "amplificación" se refiere a cualquier
método in vitro para aumentar el número de copias de una
secuencia de nucleótidos con el uso de una polimerasa. La
amplificación de ácido nucleico da como resultado la incorporación
de nucleótidos en un cebador o molécula de ADN y/o ARN formando así
una molécula nueva complementaria a un molde. La molécula de ácido
nucleico formada y su molde pueden usarse como moldes para
sintetizar moléculas de ácido nucleico adicionales. Tal como se usa
en el presente documento, una reacción de amplificación puede
consistir en muchas rondas de replicación. Las reacciones de
amplificación de ADN incluyen, por ejemplo, reacciones en cadena de
la polimerasa (PCR). Una reacción de PCR puede consistir en de 5 a
100 "ciclos" de desnaturalización y síntesis de una molécula de
ADN.
Oligonucleótido. "Oligonucleótido"
se refiere a una molécula sintética o natural que comprende
secuencias de nucleótidos unidas covalentemente que están unidas
mediante un enlace fosfodiéster entre la posición 3' de la
desoxirribosa o ribosa de un nucleótido y la posición 5' de la
desoxirribosa o ribosa del nucleótido adyacente. Un oligonucleótido
bloqueante se refiere a oligonucleótidos que se usan para evitar la
hibridación de moléculas de ácido nucleico (por ejemplo sonda o
cebador) con moléculas no queridas o no deseadas. Por ejemplo, el
oligonucleótido bloqueante puede que evitar las secuencias de
extremo 5' y en algunos casos 3' de los componentes controladores
se hibriden con el vector de la biblioteca.
Nucleótido. Tal como se usa en el
presente documento "nucleótido" se refiere a una combinación de
base-azúcar-fosfato. Los
nucleótidos son unidades monoméricas de una secuencia de ácido
nucleico (ADN y ARN). El término nucleótido incluye ribonucleósido
trifosfato ATP, UTP, CTP, GTP y desoxirribonucleósidos trifosfato
tales como dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, o derivados de los
mismos. Tales derivados incluyen, por ejemplo,
[\alphaS]dATP,
7-desaza-dGTP y
7-desaza-dATP, y derivados de
nucleótido que confieren resistencia a nucleasa sobre la molécula
de ácido nucleico que los contiene. El término nucleótido tal como
se usa en el presente documento también se refiere a
didesoxirribonucleósidos trifosfato (ddNTPs) y sus derivados.
Ejemplos ilustrados de didesoxirribonucleósidos trifosfato
incluyen, pero no se limitan a, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP, y ddTTP.
Según la presente invención, un "nucleótido" puede no estar
marcado con etiqueta o estar marcado con etiqueta detectable
mediante técnicas bien conocidas. Etiquetas detectables incluyen,
por ejemplo, isótopos radiactivos, etiquetas fluorescentes,
etiquetas quimioluminiscentes, etiquetas bioluminiscentes y
etiquetas de enzima.
Hibridación. Los términos
"hibridación" e "hibridante" se refieren a apareamiento de
bases de dos moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla
complementarias (ARN y/o ADN) para dar una molécula de cadena doble.
Tal como se usa en el presente documento, pueden hibridarse dos
moléculas de ácido nucleico, aunque el apareamiento de bases no es
completamente complementario. Consecuentemente, bases con
apareamiento erróneo no evitan la hibridación de dos moléculas de
ácido nucleico siempre que se usen condiciones apropiadas, bien
conocidas en la técnica. En la presente invención, el término
"hibridación" se particularmente refiere a hibridación de un
controlador con la biblioteca que va a normalizarse. Otros términos
usados en los campos de tecnología de ADN recombinante y biología
celular y molecular tal como se usan en el presente documento se
entenderán generalmente por un experto en la técnica aplicable.
La presente invención se refiere generalmente a
métodos para producir bibliotecas de ácido nucleico normalizadas, y
a bibliotecas normalizadas producidas por estos métodos. En una
realización preferida de la invención, la biblioteca normalizada
producida es una biblioteca de ADNc, que puede ser de cadena
sencilla o de cadena doble. Según la invención, la normalización de
una biblioteca de ácido nucleico se logra usando moléculas de ácido
nucleico haptenilado (es decir, moléculas de ácido nucleico que
tienen acopladas covalentemente a las mismas una o más moléculas de
hapteno, tal como las descritas a continuación) que se hibridarán
más rápidamente con las moléculas de ácido nucleico más sumamente
abundantes de la biblioteca. Tales moléculas de ácido nucleico
haptenilado se denominan controlador. Esta hibridación forma
complejos de moléculas de ácido nucleico que pueden entonces
eliminarse (reduciendo de esta manera la abundancia de moléculas de
ácido nucleico unidas en la biblioteca), preferiblemente por medio
de interacciones ligando-hapteno o mediante técnicas
de extracción. Se ha descubierto que, mediante los métodos de la
invención, pueden producirse bibliotecas de ácido nucleico
normalizadas que tienen una variación máxima en la abundancia de
moléculas de ácido nucleico miembro no superior a de
aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces. Además, los métodos de
la invención proporcionan bibliotecas normalizadas que tiene ruido
de fondo significativamente reducido. Por tanto, la invención
proporciona métodos para producir bibliotecas de ácido nucleico,
particularmente bibliotecas de ADNc, de las que cada molécula de
ácido nucleico miembro puede aislarse con probabilidad
aproximadamente equivalente, independientemente de su número de
copia en la biblioteca original.
Usando los métodos de la invención, pueden
prepararse bibliotecas de ácido nucleico normalizadas,
particularmente bibliotecas de ADNc normalizadas, a partir de una
variedad de bibliotecas de de ácido nucleico. Tales bibliotecas que
van a normalizarse pueden prepararse usando técnicas convencionales
o pueden obtenerse comercialmente (Life Technologies, Inc.,
Rockville, MD). Bibliotecas de ácido nucleico para su uso en la
presente invención incluyen aquellas que comprenden poblaciones de
moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla o cadena doble, o
preferiblemente poblaciones de moléculas de ADN de cadena sencilla o
de cadena doble. Bibliotecas de ácido nucleico más preferidas que
van a normalizarse según la invención incluyen aquellas que
comprenden bibliotecas de ADN (ADNc) complementario. Tales
bibliotecas de ADNc (de cadena doble o de cadena sencilla) pueden
prepararse usando técnicas bien conocidas que usan ARN mensajero o
ARN poliA+ o pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo de Life
Technologies, Inc. (Rockville, Maryland), u otras fuentes
comerciales que serán familiares para un experto en la técnica.
Bibliotecas de ADNc usadas según la invención se preparan
preferiblemente con transcriptasa inversa con actividad ARNasa H
sustancialmente reducida (véase más adelante). Se prefieren los
vectores pCMVSPORT para la construcción de biblioteca y las
bibliotecas de ADNc de Life Technologies, Inc. (Rockville, MD) se
almacenan en estos vectores. En un aspecto preferido de la
invención, las moléculas de ácido nucleico de la biblioteca pueden
estar contenidas en uno o más vectores, tales como plásmidos,
cósmidos o fagos.
Según la invención, pueden prepararse las
bibliotecas de ácido nucleico a partir de poblaciones de moléculas
de ácido nucleico obtenidas a partir de fuentes naturales, tales
como una variedad de células, tejidos, órganos u organismos. Las
células que pueden usarse como fuentes de moléculas de ácido
nucleico pueden ser procariotas (células bacterianas, incluyendo
las de la especie del género Escherichia, Bacillus, Serratia,
Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Chlamydia,
Neisseria, Treponema, Mycoplasma, Borrelia, Legionella,
Pseudomonas, Mycobacterium, Helicobacter, Erwinia, Agrobacterium,
Rhizobium, y Streptomyces) o eucariotas (incluyendo
hongos (especialmente levaduras), plantas, protozoos y otros
parásitos), y animales incluyendo insectos (particularmente células
de Drosophila spp.), nematodos (particularmente células de
Caenorhabditis elegans), y mamíferos (particularmente células
humanas)).
Las células somáticas de mamífero que pueden
usarse como fuentes de poblaciones o bibliotecas de ácidos nucleicos
incluyen células sanguíneas (reticulocitos y leucocitos), células
endoteliales, células epiteliales, células neuronales (de los
sistemas nervioso central o periférico), células de músculo
(incluyendo miocitos y mioblastos de músculo esquelético, liso o
cardíaco), células de tejido conectivo (incluyendo fibroblastos,
adipocitos, condrocitos, condroblastos, osteocitos y osteoblastos)
y otras células de estroma (por ejemplo, macrofágos, células
dendríticas, células Schwann). Las células germinales de mamíferos
(espermatocitos y ovocitos) también pueden usarse como fuentes de
ácidos nucleicos o bibliotecas para su uso en la invención, como
también pueden las células progenitoras, precursoras y madre que
dan lugar a las células somáticas y germinales anteriores. También
son adecuados para usar como fuentes de ácido nucleico son tejidos u
órganos de mamíferos tales como los derivados de fuentes de
cerebro, riñón, hígado, páncreas, sangre, médula ósea, músculo,
nervios, piel, tejido genitourinario, circulatorio, linfático,
gastrointestinal y conjuntivo, así como los derivados de un embrión
o feto de mamífero (incluyendo seres humanos).
Cualquiera de las células procariotas o
eucariotas, tejidos y órganos anteriores puede ser normales,
enfermos, transformados, establecidos, precursores, fetales o
embrionarios. Células enfermas pueden incluir, por ejemplo, las
implicadas en enfermedades infecciosas (causadas por bacterias,
hongos o levaduras, virus (incluyendo VIH) o parásitos), en
patologías genéticas o bioquímicas (por ejemplo, fibrosis quística,
hemofilia, enfermedad de Alzheimer, distrofia muscular o esclerosis
múltiple) o en procesos cancerosos. Líneas celulares animales
transformadas o establecidas pueden incluir, por ejemplo, células
COS, células CHO, células VERO, células BHK, células HeLa, células
HepG2, células K562, células F9 y similares. Otras células, líneas
celulares, tejidos, órganos y organismos adecuados como fuentes de
ácidos nucleicos para su uso en la presente invención resultarán
evidentes para un experto en la técnica. Estas células, tejidos,
órganos y organismos pueden obtenerse a partir de sus fuentes
naturales o pueden obtenerse comercialmente a partir de fuentes
tales como Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville,
Maryland) y otras que son conocidas para el experto en la
técnica.
Una vez se obtienen las células, tejidos,
órganos u otras muestras de partida, pueden aislarse moléculas de
ácido nucleico (tales como ARNm o ARN poliA+), y prepararse
bibliotecas de ácido nucleico (tales como bibliotecas de ADNc) a
partir de las mismas, mediante métodos que se conocen bien en la
técnica (véase, por ejemplo, Maniatis, T., et al., Cell 15:
687-701 (1978); Okayama, H., y Berg, P., Mol. Cell.
Biol. 2:161-170 (1982); Gubler, U., y Hoffman,
B.J., Gene 25:263-269 (1983)). Tal como se indicó
anteriormente, bibliotecas de ácido nucleico preparadas de tal
manera contendrán normalmente un amplio intervalo de abundancias de
moléculas de ácido nucleico miembro, dependiendo de la fuente de
célula, tejido u organismo, y de la fase de desarrollo o ciclo
celular de la fuente. Los métodos de la invención pueden usarse
entonces para normalizar, o estrechar o reducir las abundancias
relativas de moléculas de ácido nucleico en la biblioteca de ácido
nucleico.
En la práctica de la invención, se normalizan
las bibliotecas de ácido nucleico, para producir bibliotecas de
ácido nucleico normalizadas, mediante métodos que pueden comprender
una o más etapas. Un método preferido de la invención puede
comprender, por ejemplo:
- (a)
- sintetizar una o más moléculas de ácido nucleico complementarias a todas o una parte de las moléculas de ácido nucleico de la biblioteca, en las que las moléculas de ácido nucleico sintetizadas comprenden al menos un hapteno, produciendo de esta manera moléculas de ácido nucleico haptenilado (por ejemplo controlador);
- (b)
- incubar una biblioteca de ácido nucleico que va a normalizarse con las moléculas de ácido nucleico haptenilado en condiciones que favorecen la hibridación de las moléculas más sumamente abundantes de la biblioteca con las moléculas de ácido nucleico haptenilado; y
- (c)
- eliminar las moléculas hibridadas, produciendo de esta manera una biblioteca normalizada.
Según la invención, pueden producirse moléculas
de ácido nucleico haptenilado complementarias a todas o una parte
de moléculas de ácido nucleico de la biblioteca, por ejemplo,
incubando las moléculas de ácido nucleico de la biblioteca con al
menos un polipéptido que tiene actividad ácido nucleico polimerasa y
con al menos un nucleótido que comprende al menos un hapteno. Si se
usan uno o más cebadores para la síntesis, los cebadores pueden
comprender uno o más haptenos para producir las moléculas de ácido
nucleico haptenilado (sin o con el uso de nucleótidos haptenilados
durante la síntesis). Polipéptidos preferidos que tienen actividad
ácido nucleico polimerasa para su uso en este aspecto de la
invención incluyen aquellas que tienen actividad transcriptasa
inversa y aquellas que tienen actividad ADN polimerasa o ARN
polimerasa.
Polipéptidos preferidos que tienen actividad
transcriptasa inversa (es decir, aquellos polipéptidos que pueden
catalizar la síntesis de una molécula de ADN a partir de un molde de
ARN) incluyen, pero no se limitan a, transcriptasa inversa del
virus de leucemia murina Moloney (VLM-M),
transcriptasa inversa del virus de sarcoma de Rous (VSR),
transcriptasa inversa del virus de mieloblastosis aviar (VMA),
transcriptasa inversa del virus asociado de Rous (VAR),
transcriptasa inversa del virus asociado de mieloblastosis (VAM),
transcriptasa inversa del virus de inmunodeficiencia humano (VIH),
transcriptasa inversa retroviral, transcriptasa inversa de
retrotransposón, transcriptasa inversa de la hepatitis B,
transcriptasa inversa del virus de mosaico de la coliflor y
transcriptasa inversa bacteriana. Se prefieren particularmente
aquellos polipéptidos que tienen actividad transcriptasa inversa
que también tienen actividad ARNasa H sustancialmente reducida (es
decir, polipéptidos "ARNasa H-"). Por un polipéptido que tiene
"actividad ARNasa H sustancialmente reducida" se quiere decir
que el polipéptido tiene menos de aproximadamente el 20%, más
preferiblemente menos de aproximadamente el 15%, el 10% o el 5%, y
lo más preferiblemente menos de aproximadamente 2%, de actividad
ARNasa H de una enzima de tipo natural o ARNasa H+ tal como una
transcriptasa inversa de VLM-M de tipo natural. La
actividad ARNasa H puede determinarse mediante una variedad de
ensayos, tales como los descritos, por ejemplo, en la patente de los
EE.UU. Nº 5.244.797, en Kotewicz, M.L., et al., Nucl. Acids
Res. 16: 265 (1988) y en Gerard, G.F., et al., FOCUS 14
(5):91 (1992), las descripciones de todos los cuales se incorporan
en el presente documento como referencia. Polipéptidos ARNasa H-
adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se
limitan a, transcriptasa inversa H- de VLM-M,
transcriptasa inversa H- de VSR, transcriptasa inversa H- de VAM,
transcriptasa inversa H- de VAR, transcriptasa inversa H- de VAM,
transcriptasa inversa H- de VIH, y transcriptasa inversa
SUPERSCRIPT™ I y transcriptasa inversa SUPERSCRIPT™ II que están
disponibles comercialmente, por ejemplo de Life Technologies, Inc.
(Rockville, Maryland).
Otros polipéptidos que tienen actividad ácido
nucleico polimerasa adecuados para su uso en los presentes métodos
incluyen ADN polimerasas termófilas tales como ADN polimerasa I, ADN
polimerasa III, fragmento de Klenow, polimerasa de T7, y polimerasa
de T5, y ADN polimerasas termoestables que incluyen, pero no se
limitan a, ADN polimerasa de Thermus thermophilus
(Tth), ADN polimerasa de Thermus aquaticus
(Taq), ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana
(Tne), ADN polimerasa de Thermotoga maritima
(Tma), ADN polimerasa de Thermococcus litoralis
(Tli o VENT®), ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus
(Pfu o DEEPVENT®), ADN polimerasa de Pyrococcus
woosii (Pwo), ADN polimerasa de Bacillus
sterothermophilus (Bst), ADN polimerasa de Sulfolobus
acidocaldarius (Sac), ADN polimerasa de Thermoplasma
acidophilum (Tac), ADN polimerasa de Thermus
flavus (Tfl/Tub), ADN polimerasa de Thermus ruber
(Tru), ADN polimerasa de Thermus brockianus
(DYNAZYME®), ADN polimerasa de Methanobacterium
thermoautotrophicum (Mth), y mutantes, variantes y
derivados de las mismas.
Las ARN polimerasas usadas preferiblemente en la
invención pueden incluir ARN polimerasa de SP6, ARN polimerasa de
T7, ARN polimerasa de T3 y similares. Con el uso de ARN polimerasas,
se usan normalmente uno o más promotores (por ejemplo promotor SP6,
promotor T7, etc.). Por ejemplo, las moléculas de ADN de cadena
doble (o biblioteca de cadena doble) que contienen uno o más
promotores se usan en combinación con una o más ARN polimerasas para
crear moléculas de ARN haptenilado complementarias a toda o una
parte del molde de biblioteca de cadena doble. Preferiblemente,
tales moléculas de ARN se encuentran en gran exceso molar comparado
con los moldes. Según la invención, tales promotores pueden
proporcionarse por el vector en el que se clonan las moléculas de
biblioteca o mediante moléculas adaptadoras (por ejemplo
oligonucleótidos de cadena doble) que se añaden a las moléculas de
biblioteca. Cuando se usan tales moléculas adaptadoras, los
adaptadores, (que comprenden preferiblemente uno o más promotores)
se añaden a las moléculas de biblioteca. Preferiblemente, las
moléculas de biblioteca son moléculas lineales de cadena doble (por
ejemplo ADNc lineal de cadena doble producido tras la primera y
segunda síntesis), y los adaptadores pueden añadirse usando técnicas
convencionales (por ejemplo ligasas) a uno o ambos extremos de
tales moléculas.
Nucleótidos preferidos para su uso en los
métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a,
ribonucleósido trifosfatos tales como ATP, UTP, CTP, GTP y derivados
de los mismos, y desoxirribonucleótido trifosfatos tales como dATP,
dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, o derivados de los mismos. Tales
derivados incluyen [\alphaS]dATP,
7-desaza-dGTP y
7-desaza-dATP, o los ribonucleósido
trifosfatos correspondientes en los que la desoxirribosa se ha
sustituido por ribosa. Según la invención, los nucleótidos o
derivados de los mismos preferiblemente comprenden una o más
moléculas de hapteno unidas covalentemente a los mismos.
Moléculas de hapteno preferidas para su uso en
estos métodos incluyen, sin limitación: (i) biotina; (ii) un
anticuerpo; (iii) una enzima; (iv) lipopolisacárido; (v)
apotransferrina; (vi) ferrotransferrina; (vii) insulina; (viii)
citocinas (factores de crecimiento, interleucinas o factores
estimulantes de colonia); (ix) gp120; (x)
\beta-actina; (xi) LFA-1; (xii)
Mac-1; (xiii) glicoforina; (xiv) laminina; (xv)
colágeno; (xvi) fibronectina; (xvii) vitronectina; (xviii)
integrinas \alpha_{v}\beta_{1} y
\alpha_{v}\beta_{3}; (xix) integrinas
\alpha_{3}\beta_{1}, \alpha_{4}\beta_{1},
\alpha_{4}\beta_{7}, \alpha_{5}\beta_{1},
\alpha_{v}\beta_{1}, \alpha_{\Pi b}\beta_{3},
\alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{6}; (xx)
integrinas \alpha_{1}\beta_{1}, \alpha_{2}\beta_{1},
\alpha_{3}\beta_{1} y \alpha_{v}\beta_{3}; (xxi)
integrinas \alpha_{1}\beta_{1},
\alpha_{2}\beta_{1}, \alpha_{3}\beta_{1},
\alpha_{6}\beta_{1}, \alpha_{7}\beta_{1} y
\alpha_{6}\beta_{5}; (xxii) anquirina; (xxiii) C3bi,
fibrinógeno o factor X; (xxiv) ICAM-1 o
ICAM-2; (xxv) espectrina o fodrina; (xxvi) CD4;
(xxvii) un receptor de citocina (por ejemplo, factor de
crecimiento, interleucina, o factor estimulante de colonia);
(xxviii) un receptor de insulina; (xxix) un receptor de
transferrina; (xxx) Fe^{+++}; (xxxi) polimixina B o proteína
neutralizante de endotoxina (ENP); (xxxii) un sustrato específico de
enzima; (xxxiii) proteína A, proteína G, un receptor Fc de
superficie celular o un antígeno específico de anticuerpo; (xxxiv)
avidina y estreptavidina; y combinaciones de los mismas. Un hapteno
particularmente preferido para su uso en los métodos de la invención
es biotina. Las moléculas de ácido nucleico haptenilado, en las que
una o más moléculas de hapteno están unidas (preferiblemente de
manera covalente) a uno o más nucleótidos de la molécula de ácido
nucleico, pueden producirse usando métodos de síntesis orgánica
convencionales que serán familiares para el experto en la técnica.
Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede biotinilarse en el
extremo 5' produciendo en primer lugar grupos amino (NH_{2}) en
5' seguido de la adición de éster Cab-NHS (Langer,
P.R., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 78: 6633 (1981)). En
un aspecto particularmente preferido de la invención, se prepara una
molécula de ácido nucleico haptenilado que puede ser una molécula
de ARN o una molécula de ADN, que comprende una o más, dos o más,
tres o más, o cuatro o más moléculas de hapteno, lo más
preferiblemente moléculas de
biotina.
biotina.
Una vez se han producido moléculas de ácido
nucleico haptenilado que son complementarias a las moléculas de
ácido nucleico de la biblioteca, se usan para normalizar la
biblioteca de ácido nucleico mediante hibridación. Específicamente,
la biblioteca de ácido nucleico que va a normalizarse se incuba
preferiblemente con un exceso molar de la población de moléculas de
ácido nucleico haptenilado (por ejemplo superior o igual a 10 veces
o preferiblemente superior o igual a 20 veces el exceso molar),
preparado tal como se describió anteriormente, en condiciones que
favorecen la hibridación más rápida de las moléculas de ácido
nucleico haptenilado con las moléculas de ácido nucleico más
sumamente abundantes y se hibridan menos rápidamente con las
moléculas de ácido nucleico menos abundantes presentes en la
biblioteca. Tales condiciones que favorecen la hibridación pueden
comprender, por ejemplo, incubar la biblioteca que va a normalizarse
con las moléculas de ácido nucleico haptenilado en un intervalo de
Cot. Cot es el producto de la concentración inicial de ácido
nucleico (moles de nucleótido por litro, Co) y tiempo (segundos,
t). La Cot se obtiene convirtiendo la concentración de nucleótidos
que reaccionan y el tiempo de hibridación en unidades convencionales
(mol·s·l^{-1} o M·s). Tal como se describe en detalle en los
ejemplos a continuación, Cot particularmente preferidas para su uso
en los presentes métodos incluyen, pero no se limitan a: una Cot
igual a o superior a 25; una Cot igual a o superior a 50; una Cot
igual a o superior a 100, una Cot igual a o superior a 200; una Cot
igual a o superior a 250; una Cot igual a o superior a 500; una Cot
igual a o superior a 1000; y una Cot inferior a aproximadamente
10.000. Alternativamente, pueden usarse las condiciones de
hibridación que consisten en un intervalo de Cot, incluyendo una Cot
de desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 10.000: una Cot
de desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 10.000; una Cot
de desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 10.000; una Cot de
desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 10.000; una Cot de
desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 10.000; una Cot de
desde aproximadamente 250 hasta aproximadamente 10.000; y una Cot de
desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 10.000. Otras
condiciones de hibridación adecuadas para su uso con los presentes
métodos resultarán evidentes para un experto en la técnica y pueden
determinarse con sólo experimentación rutinaria.
En estas condiciones, las moléculas de ácido
nucleico haptenilado se hibridan más rápidamente con las moléculas
de ácido nucleico mas sumamente abundantes presentes en la
biblioteca y menos rápidamente con los miembros menos abundantes.
Los complejos de hibridación formados entre la biblioteca y las
moléculas de ácido nucleico haptenilado pueden eliminarse entonces
mediante una variedad de métodos, dando como resultado la reducción
en número de copia de las moléculas de ácido nucleico sumamente
abundantes en la biblioteca y produciendo de esta manera una
biblioteca de ácido nucleico normalizada.
Según la invención, la eliminación de complejos
se logra mediante interacciones ligando-hapteno
usando un ligando que se une específicamente al hapteno que está
unido a las moléculas de ácido nucleico haptenilado. En un método
preferido de este tipo, el ligando puede estar unido,
preferiblemente de manera covalente, a un soporte sólido tal como
nitrocelulosa, diazocelulosa, vidrio, poliestireno (incluyendo
placas de microtitulación), poli(cloruro de vinilo),
polipropileno, polietileno, dextrano, Sepharose, agar, almidón,
nylon, o perlas, que pueden ser perlas de látex, perlas magnéticas,
perlas paramagnéticas, superparamagnéticas o perlas de vidrio.
Soportes sólidos particularmente preferidos son perlas magnéticas,
perlas paramagnéticas, y perlas superparamagnéticas, que están
disponibles comercialmente, por ejemplo de Life Technologies, Inc.
(Rockville, MD), Dynal A.S. (Oslo, Noruega), o de Sigma (St. Louis,
Missouri).
Acoplados a estos soportes sólidos puede estar
cualquier ligando que pueda unir el hapteno usado para haptenilar
las moléculas de ácido nucleico. Ejemplos de ligandos adecuados para
su uso en los presentes métodos (que corresponden en orden a las
moléculas de hapteno enumeradas anteriormente) incluyen sin
limitación: (i) avidina y estreptavidina; (ii) proteína A, proteína
G, un receptor Fc de superficie celular, o un antígeno específico
de anticuerpo; (iii) un sustrato específico de enzima; (iv)
polimixina B o proteína neutralizante de endotoxina (ENP); (v)
Fe^{+++}; (vi) un receptor de transferrina; (vii) un receptor de
insulina; (viii) un receptor de citocina (por ejemplo, factor de
crecimiento, interleucina o factor estimulante de colonia); (ix)
CD4; (x) espectrina o fodrina; (xi) ICAM-1 o
ICAM-2; (xii) C3bi, fibrinógeno o factor X; (xiii)
anquirina; (xiv) integrinas \alpha_{1}\beta_{1},
\alpha_{2}\beta_{1}, \alpha_{3}\beta_{1},
\alpha_{6}\beta_{1}, \alpha_{7}\beta_{1} y
\alpha_{6}\beta_{5}; (xv) integrinas
\alpha_{1}\beta_{1}, \alpha_{2}\beta_{1},
\alpha_{3}\beta_{1} y \alpha_{v}\beta_{3}; (xvi)
integrinas \alpha_{3}\beta_{1},
\alpha_{4}\beta_{1}, \alpha_{4}\beta_{7},
\alpha_{5}\beta_{1}, \alpha_{v}\beta_{1},
\alpha_{\Pi b}\beta_{3}, \alpha_{v}\beta_{3} y
\alpha_{v}\beta_{6}; (xvii) integrinas
\alpha_{v}\beta_{1} y \alpha_{v}\beta_{3}; (xviii)
vitronectina; (xix) fibronectina; (xx) colágeno; (xxi) laminina;
(xxii) glicoforina; (xxiii) Mac-1; (xxiv)
LFA-1; (xxv) \beta-actina; (xxvi)
gp 120; (xxvii) citocinas (factores de crecimiento, interleucinas o
factores estimulantes de colonia); (xxviii) insulina; (xxix)
ferrotransferrina; (xxx) apotransferrina; (xxxi) lipopolisacárido;
(xxxii) una enzima; (xxxiii) un anticuerpo; (xxxiv) biotina; y
combinaciones de los mismos. Ligandos preferidos incluyen avidina y
estreptavidina. Por supuesto, la elección del ligando dependerá de
la elección del hapteno usado para la producción de molécula de
ácido nucleico haptenilado; ligandos apropiados para usar en los
métodos de la invención serán por tanto evidentes para un experto de
la técnica. La unión de la(s) molécula(s) de ligando
al soporte sólido puede realizarse mediante cualquier método de
acoplamiento de ligando tal como acoplamiento covalente, hidrófobo o
iónico (incluyendo recubrimiento) que resultarán familiares para un
experto en la técnica. Por ejemplo, en un aspecto preferido de la
invención en el que las moléculas de ácido nucleico haptenilado
comprenden biotina, un ligando de unión a biotina tal como avidina
o estreptavidina puede estar unido al soporte sólido. En un aspecto
particularmente preferido, el soporte sólido usado son perlas
magnéticas, paramagnéticas o superparamagnéticas acopladas con
avidina o
estreptavidina.
estreptavidina.
Normalmente, las condiciones que favorecen las
interacciones ligando-hapteno incluyen la incubación
en una solución salina tamponada, preferiblemente una disolución de
cloruro de sodio tamponada con TRIS, fosfato HEPES o carbonato, más
preferiblemente una disolución de cloruro de sodio tamponada con
TRIS, todavía más preferiblemente una disolución que comprende
TRIS-HCl aproximadamente 10-100 mM y
NaCl aproximadamente 300-2000 mM, y lo más
preferiblemente una disolución que comprende
TRIS-HCl aproximadamente 10 mM y NaCl
aproximadamente 1 M, a un pH de aproximadamente
6-9, más preferiblemente un pH de aproximadamente
7-8, todavía más preferiblemente un pH de
aproximadamente 7,2-7,6, y lo más preferiblemente un
pH de aproximadamente 7,5. La incubación se realiza preferiblemente
a de 0ºC hasta aproximadamente 25ºC, y lo más preferiblemente a
aproximadamente 25ºC, durante aproximadamente
30-120 minutos, de manera preferible aproximadamente
45-90 minutos, y de la manera más preferible
aproximadamente 60 minutos, para permitir la unión de moléculas de
ácido nucleico haptenilado (y por tanto las moléculas de ácido
nucleico de biblioteca complementaria a las que están hibridadas) al
soporte sólido acoplado a ligando.
Una vez los complejos haptenilados se han unido
al soporte en fase sólida, la biblioteca de ácido nucleico
normalizado, que comprende moléculas de ácido nucleico de un menor
intervalo de abundancias que la biblioteca de entrada, puede
recogerse a partir de los sobrenadantes o eluatos (es decir, los
materiales no unidos en disolución). Por ejemplo, en un aspecto
preferido en el que las moléculas de ácido nucleico están unidas a
avidina o estreptavidina; o una fase sólida acoplada a avidina o
estreptavidina, las moléculas de ácido nucleico que comprenden la
biblioteca de ácido nucleico normalizada, tal como una biblioteca de
ADNc normalizada, pueden obtenerse aspirando con cuidado y
recogiendo los sobrenadantes. En un aspecto particularmente
preferido en el que se usan perlas magnéticas, paramagnéticas o
superparamagnéticas acopladas a avidina o estreptavidina como
soporte sólido, las perlas que contienen ácido nucleico biotinilado
pueden segregarse a partir de los sobrenadantes usando un imán (tal
como un separador de partículas magnéticas
Magna-Sep; Life Technologies, Inc.) y pueden
retirarse los sobrenadantes usando una pipeta. La eliminación de
complejos haptenilados se logra preferiblemente extrayendo con un
disolvente orgánico (por ejemplo fenol, cloroformo etc.). Los
enfoques anteriormente descritos dan como resultado la producción
de una biblioteca de ácido nucleico normalizada, que puede ser de
cadena sencilla o de cadena doble y que puede usarse inmediatamente,
almacenarse hasta su uso, o tratarse y luego purificarse según la
invención o mediante técnicas que se conocen bien en la bibliografía
(véase, por ejemplo, Gubler, U., y Hoffman, B.J., Gene 25:
263-269 (1983); Krug, M.S., y Berger, S.L., Meth.
Enzymol. 152:316-325 (1987); Sambrook, J., et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring
Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, págs.
8.60-8.63 (1987)), y otras que serán familiares para
un experto en la técnica.
La invención también proporciona métodos para la
producción de biblioteca de ácido nucleico normalizada seleccionada
con un ruido de fondo de clones no recombinantes y transpuestos muy
bajo. Tal como se usa en el presente documento, una biblioteca
normalizada seleccionada es una biblioteca en la que una o más
moléculas de ácido nucleico específicas o conjuntos de moléculas de
ácido nucleico se han enriquecido en la biblioteca normalizada y
otras moléculas de ácido nucleico de menos interés se han eliminado
mediante uno o varios enfoques descritos en el presente documento.
Por tanto, la invención se refiere adicionalmente a la eliminación
de moléculas de ácido nucleico contaminantes o de fondo de la
biblioteca normalizada. Según la invención, tal supresión o
eliminación de ácidos nucleicos contaminantes puede realizarse antes
o después de la normalización. Moléculas de ácido nucleico
contaminantes típicas en una biblioteca son moléculas de vector que
no contienen moléculas de ácido nucleico de la biblioteca (en las
que el vector no pudo recibir un inserto o el vector perdió el
inserto mediante deleción durante la propagación de la biblioteca
fuente).
Según la invención, pueden usarse sondas
específicas de diana (por ejemplo oligodA-NotI) en varios
métodos para reducir o eliminar ácidos nucleicos contaminados de la
biblioteca de interés. Tales sondas son específicas de diana porque
reconocen y se hibridan con moléculas de las moléculas de biblioteca
pero no con secuencias de ácido nucleico contaminantes (tales como
vectores sin insertos de biblioteca). Uno de tales medios implica
usar una o más sondas específicas de diana hapteniladas para
capturar o aislar la biblioteca de interés. En tales métodos, la
biblioteca normalizada es preferiblemente de cadena sencilla (o, si
es de cadena doble, se convierte en cadena sencilla mediante
métodos descritos en el presente documento). Mediante hibridación
de las sondas hapteniladas con la biblioteca normalizada, la
biblioteca normalizada hibridada puede seleccionarse separada de
ácido nucleico contaminante usando, por ejemplo, interacciones
hapteno/ligando o extracción. La biblioteca normalizada
seleccionada de cadena sencilla resultante puede convertirse
entonces en cadena doble incubando la biblioteca con uno o más
polipéptidos que tienen actividad polimerasa en condiciones
suficientes para sintetizar biblioteca normalizada seleccionada de
cadena
doble.
doble.
Alternativamente, la biblioteca normalizada se
hibrida con un cebador haptenilado, especifico de diana, y las
moléculas pueden convertirse entonces en cadena doble incubándolas
con uno o más polipéptidos que tienen actividad polimerasa en
condiciones suficientes para sintetizar biblioteca normalizada de
cadena doble. Para convertir tales moléculas en cadena doble,
pueden usarse uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa. Entonces
pueden seleccionarse las moléculas de cadena doble separadas de las
moléculas de ácido nucleico contaminantes usando, por ejemplo,
interacciones hapteno/ligando o extracción.
En ambos casos, la biblioteca normalizada
seleccionada de cadena doble resultante de la invención puede
transformarse entonces en una o más células huésped en una etapa de
selección adicional. Según la invención, se transforman moléculas
de cadena sencilla con una frecuencia muy baja mientras que las
moléculas de cadena doble se transforman con una frecuencia muy
alta. Por tanto, la transformación permite una etapa de selección
adicional en la que se eliminan o suprimen moléculas contaminantes
de cadena sencilla. Por ejemplo, cuando se usa un cebador o sonda
específica de diana en la etapa de síntesis de cadena doble, no se
ceban ácidos nucleicos no específicos y por tanto no se convierten
en cadena doble y no estarán presentes en la biblioteca normalizada
seleccionada.
En otro aspecto de la invención, se convierte
una biblioteca normalizada seleccionada de cadena sencilla
seleccionada con sondas hapteniladas en cadena doble con cebadores
(preferiblemente cebadores específicos de diana) y uno o más
nucleótidos que confieren resistencia a la nucleasa a la molécula de
cadena doble sintetizada. La digestión con tal nucleasa de este
tipo permite la eliminación de moléculas de cadena sencilla que no
se han convertido en cadena doble por los cebadores. Tales
moléculas de cadena doble pueden transformarse entonces en una o
más células huésped como una etapa de selección adicional.
Aún en otro aspecto, la biblioteca normalizada
seleccionada puede prepararse incubando la biblioteca normalizada
de cadena sencilla con uno o más cebadores específicos de diana que
no están haptenilados en combinación con uno o más nucleótidos que
confieren resistencia a la nucleasa. La digestión de la mezcla prevé
la selección de las moléculas de ácido nucleico deseadas y, como
etapa de selección adicional, las moléculas de cadena doble
resultantes pueden transformarse en una o más células huésped.
Según la invención, pueden prepararse moléculas
de cadena sencilla a partir de cadena doble tratando moléculas de
cadena doble en condiciones suficientes para convertirlas en cadena
sencilla. Tales condiciones pueden comprender, por ejemplo,
degradación de una cadena de las moléculas de ácido nucleico de
cadena doble en la biblioteca, tal como usando una endonucleasa,
una exonucleasa, y similares, y preferiblemente usando proteína de
gen II y exonucleasa III (disponible de Life Technologies, Inc.,
Rockville, MD). Alternativamente, tales condiciones pueden
comprender desnaturalizar las moléculas de cadena doble con calor,
condiciones iónicas, pH (por ejemplo base) y simi-
lares.
lares.
Nucleótidos que confieren resistencia a la
nucleasa usados según la invención son preferiblemente análogos de
nucleótido. Tales análogos de nucleótido incluyen, pero no se
limitan a, nucleótidos metilados tales como
5-metildesoxicitosina,
3-metildesoxiadenosina,
7-metilguanina y similares. Los expertos en la
técnica reconocerán otros análogos de nucleótido que inhiben o
bloquean exonucleasas o endonucleasas de restricción (nucleasas).
También se conocen en la técnica combinaciones de análogos de
nucleótido y enzimas adecuadas que pueden usarse según la invención
(véase Life Technologies 1997-1998 Catalog y
Reference Guide, Capítulo 6).
La presente invención también proporciona kits
para su uso en la producción y aislamiento de bibliotecas
normalizadas seleccionadas y normalizadas. Los kits según este
aspecto de la invención comprenden un medio transportador, tal como
una caja, caja de cartón, tubo o similar, que tiene en confinamiento
cerrado en el mismo uno o más recipientes, tales como viales,
tubos, ampollas, botellas y similares. El kit de la invención puede
comprender el controlador para normalizar una biblioteca o los
componentes necesarios para preparar el controlador usado para
normalizar una biblioteca (por ejemplo, una o más polimerasas, uno o
más adaptadores que comprenden promotores, uno o más vectores que
comprenden promotores, uno o más nucleótidos haptenilados y/o uno o
más cebadores o sondas haptenilados). Tales kits pueden comprender
una o más sondas o cebadores específicos de diana (que están
haptenilados o no). En aspectos adicionales, los kits de la
invención pueden comprender uno o más nucleótidos (por ejemplo,
nucleótidos que confieren resistencia a la nucleasa y/o una o más
endonucleasas, exonucleasas o enzimas de restricción, tales como
proteína de gen II o exonucleasa III o HhaI, usadas para la
digestión de moléculas de ácido
nucleico.
nucleico.
Kits adicionales proporcionados por la invención
comprenden uno o más recipientes que contienen una o más de las
bibliotecas de ácido nucleico normalizadas o bibliotecas de ácido
nucleico normalizadas seleccionadas anteriormente descritas de la
invención. Las bibliotecas en estos kits de la invención pueden ser
de cadena sencilla o de cadena doble, y son preferiblemente
bibliotecas de ADNc.
Los kits abarcados por este aspecto de la
presente invención pueden comprender además uno o más reactivos
adicionales (por ejemplo, tampones adecuados) y compuestos
necesarios para usar las bibliotecas normalizadas y bibliotecas
normalizadas seleccionadas de la invención.
La presente invención puede usarse en una
variedad de aplicaciones que requieren la producción rápida y
aislamiento de bibliotecas de ácido nucleico normalizadas y
normalizadas seleccionadas, particularmente bibliotecas de ADNc. El
uso principal para tales bibliotecas es para el descubrimiento de
genes y para preparar bases de datos de genes. Las bibliotecas
preparadas por los métodos de la invención pueden usarse como
fuentes de moléculas de ácido nucleico molde para reacciones de
amplificación (tal como mediante PCR), para identificar rápidamente
y/o clonar moléculas de ácido nucleico de bajo número de copias, y
para producir polipéptidos mediante técnicas de ingeniería
genética.
Por tanto, la invención también se refiere a
métodos para la amplificación de una molécula de ácido nucleico, y
a moléculas de ácido nucleico amplificadas mediante estos métodos.
Según este aspecto de la invención, una molécula de ácido nucleico
puede amplificarse (es decir, prepararse copias adicionales de la
molécula de ácido nucleico) amplificando una molécula de ácido
nucleico (por ejemplo, una molécula de ADNc) contenida en una
biblioteca normalizada o biblioteca normalizada seleccionada de la
invención según cualquier método de amplificación conocido en la
técnica. Métodos de amplificación particularmente preferidos según
este aspecto de la invención incluyen la PCR (patentes de los
EE.UU. números 4.683.195 y 4.683.202), amplificación por
desplazamiento de cadena (SDA; patente de los EE.UU. número
5.455.166; documento EP 0 684 315), y amplificación basada en
secuencia de ácido nucleico (NASBA; patente de los EE.UU. número
5.409.818; documento EP 0 329 822). Los más preferidos son los
métodos que comprenden una o más amplificaciones por PCR.
La invención también se refiere a métodos que
pueden usarse para preparar vectores que comprenden las bibliotecas
normalizadas o normalizadas seleccionadas de la presente invención,
a las células huésped que comprenden esos vectores, a los métodos
para la producción de un polipéptido recombinante usando estos
vectores y células huésped, y a polipéptidos recombinantes
producidos usando estos métodos. Según este aspecto de la invención,
un polipéptido recombinante puede producirse cultivando cualquiera
de las células huésped recombinantes anteriores en condiciones que
favorecen la producción de un polipéptido de las mismas, y el
aislamiento del polipéptido. Métodos para cultivar células huésped
recombinantes, y para la producción y aislamiento de polipéptidos de
las mismas, se conocen bien por un experto en la técnica.
Se producen vectores según la invención mediante
inserción, usando métodos que se conocen en la técnica, una o más
de las moléculas de ácido nucleico de interés en un vector. El
vector usado en este aspecto de la invención puede ser, por
ejemplo, un plásmido, un cósmido o un fago. Se prefieren vectores
que comprenden regiones de control de acción en cis con respecto al
ácido nucleico que codifica para el polipéptido de interés. Pueden
suministrarse factores de acción en trans apropiados por el huésped,
suministrarse por un vector complementario o suministrarse por el
propio vector tras la introducción en el huésped.
En ciertas realizaciones preferidas, los
vectores son vectores de expresión que proporcionan expresión
específica de las moléculas de ácido nucleico contenidas en las
bibliotecas normalizadas o bibliotecas normalizadas seleccionadas
de la invención, vectores que pueden ser inducibles y/o específicos
del tipo celular. Se prefieren particularmente entre tales vectores
los que son pueden inducirse por factores ambientales que se
manipulan fácilmente, tales como la temperatura y aditivos de
nutrientes.
Los vectores de expresión útiles en la presente
invención incluyen vectores derivados de cromosomas, epitomas y
virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos o
bacteriófagos, y vectores derivados de combinaciones de los mismos,
tales como cósmidos y fagémidos, e incluirán preferiblemente al
menos un marcador seleccionable tal como gen de resistencia frente
a tetraciclina o ampicilina para cultivar en una célula huésped
bacteriana. Antes de la inserción en un vector de expresión de este
tipo, las moléculas de ácido nucleico contenidas en las bibliotecas
de la invención pueden unirse operativamente a un promotor
apropiado, tal como el promotor de fago lambda PL, los promotores
lac, trp y tac de E. coli. El experto en la
técnica conocerá otros promotores adecuados, Entre los vectores
preferidos para su uso en la presente invención se incluyen pQE70,
pQE60 y pQE-9, disponibles de Qiagen; vectores pBS,
vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A,
pNH46A, disponibles de Stratagene; pcDNA3 disponible de Invitrogen;
pGEX, pTrxfus, pTrc99a, pET-5,
pET-9, pKK223-3,
pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia; y
pSPORT1, pSPORT2, pCMVSPORT 2.0 y pSV·SPORT1, disponibles de Life
Technologies, Inc. Otros vectores adecuados resultarán fácilmente
evidentes para el experto en la
técnica.
técnica.
Células huésped representativas que pueden
usarse según la invención incluyen, pero no se limitan a, células
bacterianas, células de levadura, células vegetales y células
animales. Células huésped bacterianas preferidas incluyen células
de Escherichia spp. (particularmente células E. coli y
lo más particularmente cepas DH10B y Stbl2 de E. coli),
células de Bacillus spp. (particularmente células B.
subtilis y B. megaterium), células de Streptomyces
spp., células de Erwinia spp., células de Klebsiella
spp. y células de Salmonella spp. (particularmente
células S. typhimurium). Células huésped animales preferidas
incluyen células de insectos (lo más particularmente células de
Spodoptera frugiperda Sf9 y Sf21 y células de
Trichoplusa High-Five) y células de mamíferos
(lo más particularmente células CHO, COS, VERO, BHK y de seres
humanos). Éstas y otras células huésped adecuadas están
comercialmente disponibles, por ejemplo, de Life Technologies, Inc.
(Rockville, Maryland), Colección Americana de Cultivos Tipo
(Rockville, Maryland) e Invitrogen (San Diego, California).
En este ejemplo se describe el procedimiento
para construir una biblioteca de ADNc normalizada en el vector
pCMVSPORT 2.0 (figuras 1 y 2). Consiste en i) aislar ADN fagémido de
una biblioteca de ADNc clonada direccionalmente, ii) convertir el
ADN de la biblioteca de ADNc circular de cadena doble (cd) en a) un
molde de cd lineal para la producción con ARN polimerasa de
controlador de ARN biotilinado y b) ADN circular de cadena sencilla
(cs) usando Gen II y Exonucleasa III, iii) combinar el controlador
y ADN de biblioteca circular de cs con dos oligonucleótidos
bloqueantes en una hibridación de sustracción, iv) reparar el ADN
circular de cs no sustraído y v) transformarlo en células de E.
coli produciendo así una biblioteca de ADNc normalizada
primaria.
La producción de ADN de cs circular a partir de
una biblioteca de ADN de cd circular se realiza de la siguiente
manera. Digerir 10 \mug de ADNc de cd circular en 1 X tampón Gen
II Tris·HCl 20 mM (pH = 8), NaCl 80 mM, MgCl_{2} 25 mM,
\beta-mercaptoetanol 2 mM, glicerol al 5%, BSA 5
mg/ml con 8 \mul de Gen II a 30ºC durante 40 min en un volumen
final de 200 \mul. Terminar la reacción mediante incubación a 65ºC
durante 5 min. Añadir 12 \mul de exonucleasa III, e incubar a
37ºC durante 30 min. Añadir 8 \mul (10 U/\mul) de NotI e
incubar la mezcla durante 1 h a 37ºC. Añadir 2 \mul de
exonucleasa III, y seguir incubando durante 1 hora a 37ºC. Extraer
dos veces con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y
precipitar en etanol. Resuspender el ADNc de cs circular en 10
\mul de TE libre de ARNasa. Se convirtió la biblioteca de ADNc de
cerebro fetal (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) en cadena
sencilla mediante este procedimiento.
La producción de ADNc de cd linealizado a partir
de ADNc de cd circular es tal como sigue. Digerir 50 \mug de ADNc
de cd circular con 200 unidades de NotI (LTI) en 300 \mul de 1 X
tampón de reacción [Tris·HCl 5 mM, pH 8,0; MgCl_{2} 1 mM; NaCl 10
mM] durante 3 horas a 37ºC. Añadir 100 unidades de NotI, e incubar
durante otras 3 horas a 37ºC. Extraer dos veces con
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1 v/v) y precipitar en
etanol. Resuspender el ADNc de cd linealizado en 30 \mul de
tampón TE libre de ARNasa. Se linealizó la biblioteca de ADNc de
cerebro fetal humano (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) de
esta manera.
La producción de controlador de ARN biotinilado
a partir de ADN de biblioteca de ADNc de cd circular se realiza de
la siguiente manera. Preparar una mezcla de los siguientes
componentes: 1,214 ml de agua tratada con DEPC, 400 \mul de 5 X
tampón de transcripción [Tris-HCl 200 mM (pH 7,9),
MgCl_{2} 30 mM, espermidina-(HCl)_{3} 10 mM], 200 \mul
de mezcla de rNTP (10 \muM de cada ATP, GTP y UTP, CTP 5 \muM,
biotina-14-CTP 20 \muM), 16 \mul
(20 \mug) de cd linealizada de biblioteca de ADNc de cerebro
fetal humano (véase anteriormente), 100 \mul de DTT 0,1 M, y 70
\mul de ARN polimerasa de SP6 (350 unidades/\mul). Se construyó
la biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano (Life Technologies,
Inc., Rockville, MD) en vector pCMV·SPORT que contiene un promotor
de CMV, un promotor de polimerasa de SP6 y T7 que flanquea el sitio
de clonación múltiple (MSC) para la síntesis de controlador de ARN.
Mezclar e incubar a 37ºC durante 13 horas. Añadir 1 ml de acetato de
amonio 7,5 M y 8 ml de etanol. Enfriar sobre anhídrido carbónico
sólido durante 30 min, microcentrifugar durante 25 min a 4ºC y
resuspender el sedimento en 1 ml de TE. Calentar la disolución a
65ºC y volver a precipitar de nuevo. Lavar el sedimento en etanol
al 70%, secar y resuspender en 1,92 ml de agua, 40 \mul de
Tris-HCl 1 M, [pH 7,5], calentar a 65ºC para la
resuspensión. Añadir 20 \mul de MgCl_{2} 1 M, 20 \mul de
ADNasa I (2.660 unidades) al ARN resuspendido e incubar a 37ºC
durante 1 h. Transferir el ARN tratado a un tubo nuevo y añadir 40
\mul de EDTA 0,5 M, incubar a 65ºC durante 10 min. y precipitar
con 1 ml de acetato de amonio 7,5 M más 8 ml de etanol. Resuspender
el sedimento en 300 \mul de TE, calentar a 65ºC para ayudar a
dicha resuspensión y cargar sobre una columna de 1 cm x 18 cm
(Sephadex G-50) y recoger el primer pico detectado
mediante absorbancia UV a 260 nm. Precipitar el material recogido
(\sim4 ml) con 2 ml de acetato de amonio 7,5 M y 16 ml de etanol.
Resuspender el sedimento en 120 \mul de TE, lavar el tubo con 20
\mul de TE y combinar las 2 muestras. Este procedimiento
proporciona un controlador haptenilado de la biblioteca de ADNc de
cerebro fetal humano para su uso en la normalización de la
biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano.
La hibridación sustractiva se lleva a cabo
usando el siguiente procedimiento. Desnaturalizar una mezcla de los
siguientes componentes a 80ºC durante 1 min: 1 \mug de biblioteca
de ADNc de cs circular (véase anteriormente), 0,5 \mug del
oligonucleótido de oligodA 5'(A)_{40}3' (oligodA), 3 \mug
de oligonucleótido de sentido promotor de SP6-SalI
5' GAA GGT ACG CCT GCA GGT ACC GGT CCG GAA TTC CCG GGT CGA CCC ACG
3' (SEQ ID NO: 1) (SP6-SalI), NaCl 0,25 M en 22 \mul de
tampón de hibridación lx [HEPES 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM y SDS al
0,1%]. Tras la desnaturalización, incubar la mezcla a temperatura
ambiente durante 30 min.
Para la biblioteca de Cot = 500, se
desnaturalizan 85 \mug del controlador de ARN biotinilado (véase
anteriormente) en 22 \mul de 1 X tampón de hibridación a 90ºC
durante 2 min, enfriar sobre hielo durante 1 min, y añadir 1 \mul
de NaCl 5 M. Transferir el ADN cs circular prehibridado al
controlador de ARN biotinilado e incubar a 42ºC durante 24 h. Para
la biblioteca de Cot = 5, se hibridan 10,5 \mug de controlador de
ARN durante 2 h; para la biblioteca de Cot = 50, se hibridan 41
\mug de controlador de ARN durante 5 h; para la biblioteca de Cot
= 0, no se añade ningún controlador de ARN y se incuba la mezcla
durante 24 h.
Tras la incubación, transferir la mezcla a un
tubo nuevo, añadir 25 \mug de estreptavidina e incubar a
temperatura ambiente 5 min. Extraer la disolución con un volumen
igual de PCIA (fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, 25:24:1).
Realizar una extracción inversa de la fase orgánica con 15 \mul de
TE que contiene NaCl 1 M y combinar las extracciones acuosas.
Repetir la unión a estreptavidina y extracción con PCIA otras dos
veces. Precipitar la fase acuosa con acetato de sodio 0,3 M y
etanol. Resuspender el sedimento en 15 \mul de TE y dializar
frente a TE (10 mM:0,5 mM) durante 30 min. Transferir el ADN a un
tubo nuevo y medir el volumen. Este ADNc resultante es una
biblioteca de ADNc de cadena sencilla normalizada.
El análisis de clones tras la sustracción se
realiza de la siguiente manera. Cuando el ADN de cs circular que
permanece tras la sustracción se convierte en ADNc de cd usando un
cebador oligodA-NotI, dNTPs, como polimerasa de reparación y
se transforma en células E. coli, una gran fracción de los
transformantes contienen plásmidos que no contienen insertos (tabla
1).
Tras el análisis de los clones no contienen
insertos, se determinó que estaban presentes en la biblioteca
original con una frecuencia inferior al 1%, pero se enriquecieron
tras la sustracción ya que no tienen una molécula controladora
correspondiente para sustraerlos (figura 2). Se desarrollaron dos
enfoques para eliminar esto del ruido de fondo y se describen en
los ejemplos 2 y 3.
Como resultado del procedimiento de sustracción
descrito en el ejemplo 1, hay una tendencia a aumentar el ruido de
fondo que depende directamente de la Cot de la etapa de sustracción
(tabla 1). Ya que se usa un controlador de biblioteca total, se
enriquecerán los clones que no contienen un homólogo en el
controlador. Esto se observó en el procedimiento descrito en el
ejemplo 1 (figura 2). Para tratar este problema, se desarrollaron
dos métodos y se describe un tercero para eliminar prácticamente el
ruido de fondo. En el primer caso, descrito en este ejemplo, se usó
la selección de clones recombinantes usando una sonda biotinilada de
oligodA-NotI (figura 3) tal como sigue.
Tras la sustracción, reparación y
transformación, el 45% de los clones derivados del protocolo de Cot
= 500 eran recombinantes (tabla 1), sin embargo, usando selección
con sonda con un cebador oligodA-NotI biotinilado
(5'(A)_{15}GGG CGG CCG C 3') (SEQ ID NO: 2), se
seleccionaron los clones recombinantes separados de los no
recombinantes permitiendo la construcción de una biblioteca de ADNc
normalizada sin cambio significativo en el tamaño de inserto
promedio y la práctica eliminación de clones no recombinantes (tabla
2).
Más del 98% de los clones tomados aleatoriamente
contienen insertos que son, de promedio, tan grandes como la
biblioteca de ADNc no normalizada de la que se derivan. Además, el
análisis mediante PCR de amplicones de TGF-\beta
raros y abundantes indica que se ha logrado la normalización
sustancial (figura 6). Obsérvese que aunque el producto de PCR de
TGF-\beta1 no puede detectarse en las bibliotecas
no normalizadas y de baja Cot, se detecta en las bibliotecas de Cot
superior.
Se calentó el ADNc de cs circular normalizado
del ejemplo 1 a 70ºC durante 1 min y se enfrió sobre hielo durante
1 min. Se hibridaron 200 ng del cebador oligodA-NotI
biotinilado (véase anteriormente) a 37ºC durante 1 h. Se incubó la
mezcla de hibridación con 80 \mug de perlas magnéticas de
estreptavidina. Se marcaron las perlas tres veces con 100 \mul de
tampón de lavado (Tris·HCl 10 mM [pH 7,5], EDTA 1 mM). Se
resuspendieron las perlas en 20 \mul 1 X tampón de elución,
glicerina 10 mM y se guardó el eluato. Se repitió la etapa de
elución con 15 \mul de 1 X tampón de elución y se combinaron los
eluatos. Se repitió este protocolo tres veces y los eluatos.
Se reparó el ADNc de cadena sencilla capturado
tal como sigue: realizar una reparación combinando 4 \mul de 10 X
tampón de reparación [Tris-HCl 100 mM (pH 8,8 a
25ºC), MgCl_{2} 15 mM, KCl 500 mM, Triton X-100 al
1%], 1 \mul de dNTP 10 mM, 1 \mul de enzima de reparación
Dynazyme (2 m/\mul) (Thermus brockianus de Finnzymes) y 34
\mul de agua. Se mezcló esta mezcla y se almacenó sobre hielo
húmedo. Se preparó una mezcla de cebador de ADN añadiendo lo
siguiente a un tubo de microcentrífuga nuevo: 4 \mul de 10 X
tampón de reparación, 35 \mul de ADNc capturado de la etapa
anterior y 1 \mul (50 ng) de cebador oligodA-NotI no
biotinilado. Se centrifugó la mezcla de cebador a temperatura
ambiente durante 2 seg a 14.000 x g y se incubó a 95ºC durante 1
min. Al mismo tiempo, se incubó la mezcla de reparación a 70ºC. Se
transfirió la mezcla de cebador de ADN al baño a 70ºC y se incubó
durante 1 min. Se añadieron 40 \mul de la mezcla de reparación
previamente calentada al tubo que contenía la mezcla de cebador de
ADN. Se mezclaron los contenidos pipeteando y luego se incubó la
mezcla a 70ºC durante 15 min para permitir la extensión con cebador
(síntesis de ADNc de cadena doble). Se retiraron los tubos del baño
de agua y se centrifugaron a temperatura ambiente durante 2 s a
14.000 x g. Se precipitó el ADN reparado añadiendo 1 \mul de
glucógeno, 41 \mul de acetato de sodio 7,5 M, y 320 \mul de
etanol a -20ºC a cada tubo. Se agitaron con vórtex los tubos y se
colocaron en hielo durante 10 min o a 4ºC durante toda la noche.
Entonces se centrifugaron los tubos a 4ºC durante 30 min a 14.000 x
g. Se eliminó cuidadosamente el etanol del sedimento pequeño y se
cubrió con 100 \mul de etanol al 70% (-20ºC). Se centrifugaron los
tubos a 4ºC durante 2 min a 14.000 x g y se eliminó todo el etanol
y se secaron los sedimentos a temperatura ambiente durante 10 min o
hasta sequedad. Se disolvieron los sedimentos en 10 \mul de tampón
TE y se almacenaron a 4ºC. Se electroporaron 2 \mul de alícuotas
del ADN reparado por 20 \mul de alícuotas de E. coli
competente DH10B ElectroMax.
Usando el enfoque en el ejemplo 2 para eliminar
el ruido de fondo, construir una biblioteca de ADNc normalizada con
más de 1 x 10^{6} clones primarios requiere como mínimo tres
selecciones independientes y 15 electroporaciones (tabla 3).
Para tratar este problema, se desarrolló un
enfoque alternativo para reducir el ruido de fondo en bibliotecas
normalizadas. En este método, denominado síntesis de reparación
resistente a nucleasa, se usa la misma sonda descrita en el ejemplo
2, oligodA-NotI, pero en este caso no está biotinilada
(figura 5). Sin embargo, pueden usarse sondas biotiniladas tal como
se usan en el ejemplo 2 para incluir la etapa de selección adicional
del ejemplo 2. Cuando se compara con el método de selección del
ejemplo 2, puede construirse una biblioteca que es cuatro veces más
compleja y requiere un tercio del número de electroporaciones (tabla
3). Además, se elimina prácticamente el ruido de fondo de la
biblioteca y no se cambia el tamaño de inserto de la biblioteca
(tabla 4). Finalmente, cuando se examinaron genes sumamente
abundantes mediante hibridación de colonias, su abundancia
disminuyó de 15 a 18 veces (tabla 5) y la abundancia de genes raros
aumentó sustancialmente (figura 6).
Se reparó una biblioteca de ADNc de cadena
sencilla normalizada generada mediante sustracción (véase el ejemplo
1) tal como sigue: se preparó una mezcla de reparación combinando 3
\mul de 10 X tampón de reparación [Tris-HCl 100
mM (pH 8,8 a 25ºC), MgCl_{2} 15 mM, KCl 500 mM, Triton
X-100 al 1%], 1 \mul de dNTP 10 mM (que contenía
5-metil-dCTP 10 mM), 1 \mul de
enzima de reparación Dynazyme (2 u/\mul) (Thermus
brockianus de Finnzymes) y 25 \mul de agua, mezclar y
almacenar sobre hielo húmedo. Se preparó una mezcla de cebador de
ADN para cada reacción añadiendo lo siguiente a un tubo de
microcentrífuga nuevo: 11 \mul de agua destilada en autoclave, 3
\mul de 10 X tampón de reparación, 15 \mul de ADN dializado de
la etapa anterior, y 1 \mul (50 ng) de oligoA-NotI no
biotinilado. Se centrifugó la mezcla a temperatura ambiente durante
2 seg a 14.000 x g. Se incubó la mezcla de cebador de ADN a 95ºC
durante 1 min. Al mismo tiempo, se incubó la mezcla de reparación a
70ºC. Se transfirió la mezcla de cebador de ADN al baño a 70ºC y se
incubó durante 1 min. Se añadieron 30 \mul de la mezcla de
reparación previamente calentada al tubo que contenía la mezcla de
cebador. Se mezclaron los contenidos pipeteando y se incubaron a
70ºC durante 15 min para permitir la extensión de cebador (síntesis
de ADN de cadena doble). Se retiraron los tubos del baño de agua y
se centrifugaron a temperatura ambiente durante 2 seg a 14.000 x g.
Se precipitó el ADN reparado añadiendo 1 \mul de glucógeno, 32
\mul de acetato de amonio 7,5 M, y 250 \mul de etanol a -20ºC a
cada tubo. Se agitaron con vórtex los tubos y se colocaron en hielo
durante 10 min o a 4ºC durante toda la noche. Entonces se
centrifugaron los tubos a 4ºC durante 30 min a 14.000 x g. Se
eliminó cuidadosamente el etanol a partir del pequeño sedimento y
se recubrió con 100 \mul de etanol al 70% (-20ºC). Se centrifugó
el tubo a 4ºC durante 2 min a 14.000 x g. Se eliminó todo el etanol
y se dejaron los sedimentos a temperatura ambiente durante 10 min o
hasta sequedad. Se disolvieron los sedimentos en 10 \mul de tampón
TE y se almacenaron a 4ºC. Se digirió el reparado con 0,5 unidades
de HhaI en 20 \mul de 1 X tampón (Tris·HCl 5 mM, pH 8,0;
MgCl_{2} 1 mM; NaCl 5 mM) a 37ºC durante 30 min. Se precipitó en
etanol el ADN y se resuspendió el sedimento seco resuspendido en 8
\mul de TE. Se electroporaron alícuotas de 2 \mul de ADN
reparado por alícuota de 20 \mul de E. coli competente
DH10B ElectroMax.
<110> Life Technologies, Inc.
\hskip1cm9800 Medical Center Drive
\hskip1cmRockville, Maryland 20850-3321 EE.UU.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Bibliotecas de ácido nucleico
normalizadas y métodos de producción de las mismas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 0942,447PC01
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US (falta por asignar)
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
23-09-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/059,817
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
24-09-1997
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2,0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaggtacgc ctgcaggtac cggtccggaa ttcccgggtc gacccacg
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaaaaaa aaaaagggcg gccgc
\hfill25
Claims (46)
1. Método para la normalización de una
biblioteca de ácido nucleico que comprende:
- (a)
- incubar una biblioteca de ácido nucleico que va normalizarse con moléculas de ácido nucleico haptenilado sintéticas complementarias a todas o a una parte de las moléculas de ácido nucleico de dicha biblioteca en condiciones que favorecen la hibridación de las moléculas más abundantes de dicha biblioteca con dichas moléculas de ácido nucleico haptenilado; y
- (b)
- eliminar dichas moléculas hibridadas mediante interacciones ligando-hapteno, produciendo así una biblioteca normalizada.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha biblioteca de ácido nucleico es una biblioteca de ADNc.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
las moléculas de ácido nucleico de dicha biblioteca de ADNc son de
cadena sencilla.
4. Método según la reivindicación 2, en el que
las moléculas de ácido nucleico de dicha biblioteca de ADNc son de
cadena doble.
5. Método según la reivindicación 2, en el que
dicha biblioteca de ADNc se produce mediante un método que
comprende una población de moléculas de ARNm en condiciones
suficientes para producir una biblioteca de ADNc a partir de dicha
población de moléculas de ARNm.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
dichas moléculas de ácido nucleico haptenilado son moléculas de
ARN.
7. Método según la reivindicación 1, que
además comprende la reducción o eliminación de moléculas de ácido
nucleico contaminante de dicha biblioteca.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
dicha reducción o eliminación se realiza antes o después de la
normalización de dicha biblioteca.
9. Método según la reivindicación 7, en el que
las moléculas de ácido nucleico contaminante son uno o más
vectores.
10. Método según la reivindicación 7,
en el que dicha reducción o eliminación comprende incubar dicha
biblioteca con al menos una sonda haptenilada.
11. Método según la reivindicación 10,
en el que dicha sonda se hibrida con moléculas de ácido nucleico de
dicha biblioteca.
12. Método según la reivindicación 11,
en el que dicha sonda no puede hibridarse con secuencias de vector
de dicha biblioteca.
13. Método según la reivindicación 10,
en el que los haptenos de dicha sonda haptenilada se usan para
aislar una biblioteca normalizada que tiene moléculas de ácido
nucleico contaminante sustancialmente reducidas, produciendo así
una biblioteca normalizada seleccionada.
14. Método según la reivindicación 13,
en el que dichos haptenos se seleccionan del grupo que consiste en
avidina, estreptavidina, proteína A, proteína G, un receptor Fc de
la superficie celular, un antígeno específico para anticuerpo, un
sustrato específico para enzima, polimixina B, proteína
neutralizante de endotoxina (ENP), Fe^{+++}, un receptor de
transferrina, un receptor de insulina, un receptor de citocina, CD4,
espectrina, fodrina, ICAM-1,
ICAM-2, C3bi, fibrinógeno, factor X, anquirina, una
integrina, vitronectina, fibronectina, colágeno, laminina,
glicoforina, Mac-1, LFA-1,
\beta-actina, gp120, una citocina, insulina,
ferrotransferrina, apotransferrina, lipopolisacárido, una enzima,
un anticuerpo, biotina y combinaciones de los mismos.
15. Método según la reivindicación 14,
en el que dicho hapteno es biotina.
16. Método según la reivindicación 13,
en el que dicha biblioteca normalizada seleccionada se aísla
mediante interacciones hapteno-ligando y/o
extracción.
17. Método según la reivindicación 16,
en el que el aislamiento comprende el uso de un soporte sólido que
comprende al menos un ligando que se une a dicho hapteno.
18. Método según la reivindicación 13,
en el que dicha biblioteca normalizada seleccionada es de cadena
sencilla.
19. Método según la reivindicación 18,
que además comprende incubar dicha biblioteca normalizada
seleccionada de cadena sencilla en condiciones suficientes para
convertir dichas moléculas en cadena doble.
20. Método según la reivindicación 19,
en el que dichas condiciones comprenden incubar dicha biblioteca
normalizada seleccionada de cadena sencilla con uno o más
nucleótidos, uno o más polipéptidos que tienen actividad polimerasa
y uno o más cebadores.
21. Método según la reivindicación 20,
en el que dichos uno o más nucleótidos son análogos de nucleótido
que confieren resistencia a la nucleasa sobre dichas moléculas de
cadena doble.
22. Método según la reivindicación 21,
que además comprende digerir una muestra que comprende dichas
moléculas de cadena doble con dicha nucleasa.
23. Método según la reivindicación 22,
que además comprende transformar dichas moléculas de cadena doble
en una o más células huésped.
24. Método según la reivindicación 19,
que además comprende transformar dichas moléculas de cadena doble
en una o más células huésped.
25. Método según la reivindicación 20,
en el que dichos cebadores son cebadores específicos de diana.
26. Método según la reivindicación 25,
que además comprende transformar dichas moléculas de cadena doble
en una o más células huésped.
27. Método según la reivindicación 6,
en el que dichas moléculas de ARN se producen mediante una o más
ARN polimerasas.
28. Método según la reivindicación 27,
en el que dichas ARN polimerasas se seleccionan del grupo que
consiste en ARN polimerasas de SP6, T7 y T3.
29. Método según la reivindicación 6,
en el que dichas moléculas de ARN se producen con uno o más
promotores.
30. Método según la reivindicación 29,
en el que dichos promotores se proporcionan por uno o más vectores
o mediante uno o más adaptadores.
31. Método según la reivindicación 30,
en el que dichos promotores permiten la síntesis de al menos una
molécula de ARN a partir de todas o parte de las moléculas de ácido
nucleico de dicha biblioteca.
32. Método según la reivindicación 1,
en el que dichas moléculas hibridadas se eliminan mediante
interacciones hapteno-ligando y/o extracción.
33. Método según la reivindicación 32,
en el que dicha eliminación comprende el uso de un soporte sólido
que comprende al menos un ligando.
34. Método según la reivindicación 4,
que además comprende tratar dicha biblioteca de ADNc de cadena
doble en condiciones suficientes para hacer que dichas moléculas
sean de cadena sencilla.
35. Método según la reivindicación 34,
en el que dichas condiciones comprenden la degradación de una
cadena de dichas moléculas de cadena doble.
36. Método según la reivindicación 34,
en el que dichas condiciones comprenden desnaturalizar dichas
moléculas de cadena doble.
37. Método según la reivindicación 35,
en el que dicha degradación se logra con gen II y exonucleasa
III.
38. Método según la reivindicación 1,
en el que dichas condiciones de hibridación se seleccionan del
grupo que consiste en:
- (a)
- una Cot igual o superior a 25;
- (b)
- una Cot igual o superior a 50;
- (c)
- una Cot igual o superior a 100;
- (d)
- una Cot desde aproximadamente 10 hasta 10.000;
- (e)
- una Cot desde aproximadamente 25 hasta 10.000;
- (f)
- una Cot desde aproximadamente 50 hasta 10.000;
- (g)
- una Cot desde aproximadamente 100 hasta 10.000; y
- (h)
- una Cot inferior a 10.000;
en el que Cot es el producto de la
concentración inicial de ácido nucleico (moles de nucleótidos por
litro, Co) y el tiempo
(t).
39. Método según la reivindicación 7,
en el que dicha reducción o eliminación comprende incubar dicha
biblioteca con al menos un cebador y al menos un nucleótido que
confiere resistencia a la nucleasa en condiciones suficientes para
preparar moléculas de ácido nucleico de cadena doble.
40. Método según la reivindicación 39,
en el que dicho cebador se hibrida con moléculas de ácido nucleico
de dicha biblioteca.
41. Método según la reivindicación 39,
en el que dicho cebador no puede hibridarse con secuencias de
vector de dicha biblioteca.
42. Método según la reivindicación 39,
en el que dicho nucleótido es un análogo de nucleótido.
43. Método según la reivindicación 42,
en el que dicho nucleótido es un nucleótido metilado.
44. Método según la reivindicación 43,
en el que dicho nucleótido metilado es
5-metil-desoxicitosina.
45. Método según la reivindicación 39,
que además comprende digerir dichas moléculas de ácido nucleico de
cadena doble con una o más nucleasas.
46. Método según la reivindicación 45,
que además comprende transformar dichas moléculas digeridas en una
o más células huésped.
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