[go: up one dir, main page]

DK202300035U3 - Blanding af fukosylerede HMO'er - Google Patents

Blanding af fukosylerede HMO'er Download PDF

Info

Publication number
DK202300035U3
DK202300035U3 DKBA202300035U DKBA202300035U DK202300035U3 DK 202300035 U3 DK202300035 U3 DK 202300035U3 DK BA202300035 U DKBA202300035 U DK BA202300035U DK BA202300035 U DKBA202300035 U DK BA202300035U DK 202300035 U3 DK202300035 U3 DK 202300035U3
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
component
mol
components
mixture
transfucosidase
Prior art date
Application number
DKBA202300035U
Other languages
English (en)
Inventor
Seifert Nicole
Matwiejuk Martin
Original Assignee
Dsm Ip Assets Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dsm Ip Assets Bv filed Critical Dsm Ip Assets Bv
Application granted granted Critical
Publication of DK202300035U3 publication Critical patent/DK202300035U3/da
Publication of DK202300035U9 publication Critical patent/DK202300035U9/da

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/065—Microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/30—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols, e.g. xylitol; containing starch hydrolysates, e.g. dextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/28—Oligosaccharides
    • A23V2250/284—Oligosaccharides, non digestible
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/113—Acidophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/125—Casei
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/145—Gasseri
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/149—Jensenii
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/165—Paracasei
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/169—Plantarum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/173—Reuteri
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/175—Rhamnosus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/51—Bifidobacterium
    • A23V2400/513—Adolescentes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/51—Bifidobacterium
    • A23V2400/515—Animalis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/51—Bifidobacterium
    • A23V2400/517—Bifidum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/51—Bifidobacterium
    • A23V2400/519—Breve
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/51—Bifidobacterium
    • A23V2400/529—Infantis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/51—Bifidobacterium
    • A23V2400/531—Lactis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/51—Bifidobacterium
    • A23V2400/533—Longum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Den foreliggende opfindelse angår en blanding af humane mælkeoligosakkarider ("HMO'er"), som omfatter fem fukosylerede HMO'er, såvel som en enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af blandingen, hvor syntesen omfatter en α1-3/4-transfukosidase-enzymreaktion mellem HMO-donorer og -acceptorer.

Description

DK 202300035 U3 1
Blanding af fukosylerede HMO'er
OPFINDELSENS OMRADE
Den foreliggende opfindelse angår en blanding af humane mælkeoligosakkarider ("HMO'er"), som omfatter fem fukosylerede HMO'er, såvel som en enzymatisk fremgangsmåde til fremstilling af blandingen, hvor syntesen omfatter en a1-3/4-transfukosidase-enzymreaktion mellem HMO-donorer og -acceptorer.
BAGGRUND
HMO'er har været genstand for stor interesse i de seneste ar som følge af deres rolle i talrige — biologiske processer, der finder sted i den menneskelige organisme. Pattedyrmælk indeholder mindst 130 af disse komplekse oligosakkarider (se Urashima et al: Milk Oligosaccharides. Nova
Science Publisher (2011); eller Chen, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)).
Der foreligger flere og flere beviser for, at det mikrobesamfund, kaldet mikrobiomet, som befinder sig i menneskets fordøjelseskanal, har væsentlig betydning for sundhed og sygdom.
Nar mikrobiomets normale sammensætning bringes ud af balance, kan det få konsekvenser for den menneskelige vært. Den nyeste forskning har udpeget mikrobiom-ubalancer som medvirkende årsag i så forskellige sygdomme som cancer, fedme, inflammatorisk tarmsygdom, psoriasis, astma og måske endda autisme. HMO'er menes at modulere mikrobiomet positivt, og der er stigende interesse for dem til dette formål. Den bemærkelsesværdige mangfoldighed af > HMO'er har dog sammen med den manglende tilgængelighed af dem, særligt af de mere komplekse HMO'er, vanskeliggjort undersøgelser af de enkelte HMO'ers specifikke funktioner og således begrænset udforskningen af deres fulde potentiale til anvendelse til fremme af menneskers sundhed.
Den naturlige kilde til HMO'er er pattedyrmælk, som hovedsagelig indeholder vand sammen med 55-70 g/llaktose, 24-59 g/l lipider, ca. 13 g/l proteiner, 5-15 g/l HMO'er og ca. 1,5 g/l mineraler.
Indsatsen for at udvikle fremgangsmåder til fremstilling af HMO'er i industriel skala er øget væsentligt i de seneste år. Der er designet fremgangsmåder til fremstilling af HMO'er ved mikrobiel fermentering, enzymatiske fremgangsmåder, kemiske synteser eller kombinationer af disse teknologier.
Navnlig fermentering i E. coli er blevet anvendt med succes til industriel fremstilling af HMO'er i stor skala. | WO 01/04341 beskrives fremstilling af centrale humane mælkeoligosakkarider, som eventuelt er substitueret med fukose, under anvendelse af genmodificeret E. coli.
DK 202300035 U3 2
I WO 2012/158517 og WO 2013/154725 beskrives præbiotiske præparater, som indeholder 3-
FL, 2’-FL og DFL, og i WO 2012/112777 beskrives en blanding af 3-FL, 2’-FL, DFL og laktose, som er fremstillet i en genmodificeret E. coli. bestræbelse på at kunne fremstille blandinger af HMO'er syntetisk, uden at skulle syntetisere alle de i blandingen omfattede oligosakkarider, er der udviklet enzymatiske fremgangsmåder til enzymatisk syntese af HMO-oligosakkaridblandinger, og disse fremgangsmåder er beskrevet i
WO 2012/156897 og WO 2012/156898. Som videreudvikling beskrives i WO 2016/063261 og
WO 2016/063262 optimerede enzymer og enzymatiske fremgangsmåder til dannelse af fukosylerede HMO'er. Sådanne fremgangsmåder har tilvejebragt reaktionsblandinger — indeholdende en flerhed af forskellige HMO-oligosakkarider.
Disse fremgangsmåder indbefatter dog anvendelse af højt specialiserede enzymer, som igen fremkalder et behov for følsom støkiometri og følsomme reaktionsbetingelser samt behov for at standse reaktioner ved det ønskede ligevægtspunkt for reaktionerne og fjernelse af sekundære uønskede metabolitter.
Der er således stadig et klart behov for yderligere specifikke HMO'er eller kombinationer af
HMO-'er til at modulere et mikrobiom på en ønsket måde for at løse specifikke problemer vedrørende menneskers sundhed samt for forenklede og mere præcise fremgangsmåder til fremstilling af dem.
SAMMENDRAG AF OPFINDELSEN
Det første aspekt af opfindelsen angår en blanding, som består af eller i det væsentlige består af en bestanddel A, der er 3-FL, en bestanddel B, der er LNFP-I, en bestanddel C, der er 2'-FL, en bestanddel D, der er LNDFH-I, en bestanddel E, der er DFL, og eventuelt en bestanddel F, der er laktose.
Det andet aspekt af opfindelsen angår et præparat, som omfatter blandingen, der består af eller i det væsentlige består af 2'-FL, 3-FL, LNFP-I, DFL, LNDFH-I og eventuelt laktose. Præparatet kan være e næringspræparat, et farmaceutisk præparat eller et kosmetisk præparat.
Det tredje aspekt af opfindelsen angår en fremgangsmåde til enzymatisk syntese af ovennævnte blanding af HMO'er, fortrinsvis under i det væsentlige bufferfrie betingelser. Den enzymatiske syntese omfatter en a1-3/4-transfukosidase-enzymreaktion mellem ét fukosyleret — donor-HMO og to fukosylerede acceptor-HMO'er. Den enzymatiske syntese til fremstilling af en blanding af HMO'er ifølge den foreliggende opfindelse omfatter trinene til omsætning af en bestanddel A, en bestanddel B og en bestanddel C i nærværelse af en a1-3/4-transfukosidase for at fremstille en reaktionsblanding og fjernelse af a1-3/4-transfukosidasen og eventuelt laktose fra reaktionsblandingen. Den foreliggende opfindelse angår dermed også en blanding,
DK 202300035 U3 3 som består af eller i det væsentlige består af 2'-FL, 3-FL, LNFP-I, DFL, LNDFH-I og eventuelt laktose, der er opnået ved eller kan opnås ved den aktuelt beskrevne enzymatiske syntese.
Et særligt træk ved den enzymatiske syntese ifølge den foreliggende opfindelse er, at den kan udføres under i det væsentlige bufferfrie betingelser. Den enzymatiske syntese ifølge den — foreliggende opfindelse udføres typisk i et pH-interval fra pH 4,5 til pH 7, såsom fortrinsvis i et pH-interval fra pH 5,0 til pH 6,0.
Den a1-3/4-transfukosidase, som anvendes ved den enzymatiske syntese ifølge den foreliggende opfindelse, er fortrinsvis uden hydrolytisk aktivitet eller har i det mindste en væsentligt reduceret hydrolytisk aktivitet. | étaspekt af den foreliggende opfindelse omfatter den enzymatiske syntese ifølge den foreliggende opfindelse endvidere et fjernelsestrin, som indeholder et trin til deaktivering af a1- 3/4-transfukosidasen. Inaktiveringstrinet kan omfatte opvarmning af reaktionsopløsningen til temperaturer i intervallet fra 60 °C til 100 °C i et tidsrum i intervallet fra 5 minutter til 180 minutter.
Ved den enzymatiske syntese ifølge den foreliggende opfindelse fjernes a1-3/4- transfukosidasen ved f.eks. mikrofiltrering, nanofiltrering, centrifugering eller ultracentrifugering.
Den enzymatiske syntese kan omfatte mere end ét trin til fjernelse af a1-3/4-transfukosidasen.
Ét trin kan bestå af fjernelse af a1-3/4-transfukosidasen ved hjælp af pulverformigt aktivt kul i batchtilstand. Alternativt kan trinet bestå af fjernelse af a1-3/4-transfukosidasen ved hjælp af — pulverformigt aktivt kul i kolonnetilstand.
Et yderligere aspekt af opfindelsen angår en blanding, som består af eller i det væsentlige består af 2'-FL, 3-FL, LNFP-I, DFL, LNDFH-I og eventuelt laktose, til anvendelse ved, eller et præparat, der omfatter blandingen, som består af eller i det væsentlige består af 2'-FL, 3-FL,
LNFP-I, DFL, LNDFH-I og eventuelt laktose, til anvendelse ved behandling, forebyggelse — og/eller lindring af en sygdom og/eller tilstand relateret til mikrobiom-ubalance.
Et yderligere aspekt af opfindelsen angår anvendelsen af en blanding, som består af eller i det væsentlige består af 2’-FL, 3-FL, LNFP-I, DFL, LNDFH-I og eventuelt laktose, til forbedring af levedygtigheden af probiotika i vandig opløsning.
Et yderligere aspekt af opfindelsen angår en anvendelse af en blanding, som består af eller i det væsentlige består af 2'-FL, 3-FL, LNFP-I, DFL, LNDFH-I og eventuelt laktose, eller et præparat, der omfatter blandingen, som består af eller i det væsentlige består af 2'-FL, 3-FL, LNFP-I, DFL,
LNDFH-I! og eventuelt laktose, ved ernæringsmæssig behandling af et menneske eller ved en kosmetisk anvendelse.
DK 202300035 U3 4
KORT BESKRIVELSE AF FIGUREN
Opfindelsen vil i det følgende blive beskrevet mere detaljeret med henvisning til den medfølgende figur 1, som viser kolonitælling for L. rhamnosus efter 3 h inkubation med eller uden HMO'er ved 37 °C ved pH 3,0.
DETALJERET BESKRIVELSE
Generelt skal alle heri anvendte termer fortolkes i overensstemmelse med deres seedvanlige betydning på det tekniske område, og gældende for alle aspekter og udførelsesformer af opfindelsen, medmindre andet udtrykkeligt er defineret eller angivet.
Alle referencer til "en/et/den/det [sekvens, enzym, trin osv.]" skal fortolkes åbent som henvisende til mindst én forekomst af sekvensen, enzymet, trinet osv., medmindre andet udtrykkeligt er angivet.
Trinene i en hvilken som helst fremgangsmåde, som er beskrevet heri, skal ikke udføres i nøjagtig den beskrevne rækkefølge, medmindre andet udtrykkeligt er angivet.
Ordene "omfattende", "som omfatter" og "der omfatter" anvendes i betydningen "indbefattende", "som indbefatter" og "der indbefatter" snarere end "bestående af", "som består af" og "der består af".
I forbindelse med opfindelsen betyder termen "oligosakkarid" en sakkaridpolymer, som indeholder et antal monosakkaridenheder, der er bundet til hinanden via bindinger mellem glycosider. Foretrukne oligosakkarider ifølge opfindelsen er humane mælkeoligosakkarider — (HMO'er).
Termen "humant mælkeoligosakkarid" eller "HMO" betyder i den foreliggende forbindelse et komplekst kulhydrat, som findes i human brystmælk (der henvises til Urashima et al.: Milk
Oligosaccharides. Nova Science Publisher (2011); eller Chen, Adv. Carbohydr. Chem.
Biochem. 72, 113 (2015)). — Specifikt er 2'-FL 2'-fukosyllaktose (Fuca1-2GalB1-4GIc), 3-FL er 3-fukosyllaktose (GalB1- 4[Fuca1-3]Glc), DFL er difukosyllaktose (Fuca1-2GalB1-4[Fuca1-3]GIc), LNFP-I er lakto-N- fukopentaose | (Fuca1-2GalB1-3GIcNAcB1-3GalB1-4GIc), og LNDFH-I er lakto-N- difukohexaose (Fuca1-2GalpB1-3[Fuca1-4]GIcNAcB1-3GalB1-4GIc). | ovennævnte strukturer betyder Fuc L-fukopyranosyl, Gal betyder D-galaktopyranosyl, Glc betyder D-glukopyranose, og
GIcNAc betyder D-(2-acetylamino)-2-deoxy-glukopyranosylenhed. | forbindelse med den foreliggende opfindelse anses laktose ikke for at være en type HMO.
I forbindelse med opfindelsen vedrører termen "donor" et fukosyleret sakkarid, hvor et a1-3- fukosyl via en enzymkatalyseret reaktion overføres til et andet sakkarid, hvorefter det dannede
DK 202300035 U3 produkt er et a1-3-fukosyl- eller a1-4-fukosylholdigt sakkarid. Termen “acceptor” vedrører sakkaridet, hvortil fukosylgruppen fra donoren overføres. "Ernæringsmæssig behandling" betyder opfyldelse af hele eller en del af ernæringsbehovet hos patienter, som på grund af en sygdom, lidelse eller medicinsk tilstand, de lider af: 5 - — enten har en begrænset eller nedsat eller forstyrret evne til at indtage, fordøje, absorbere, metabolisere eller udskille almindelige fødevarer eller bestemte næringsstoffer deri, eller metabolitter, - — eller har andre lægeligt bestemte ernæringsmæssige behov (se: Kommissionens meddelelse om klassificering af fødevarer til særlige medicinske formål fra
Europa-Kommissionen, Den Europæiske Unions Tidende C 401, 25.11.2017, s. 10-11). "Mikrobiota", "mikroflora" og "mikrobiom" betyder et samfund af levende mikroorganismer, som typisk findes i et kropsorgan eller en kropsdel, navnlig mave-tarm-organerne hos mennesker.
De mest dominerende medlemmer af mave-tarm-mikrobiotaen indbefatter mikroorganismer af rækkerne Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Synergistetes,
Verrucomicrobia, Fusobacteria, og Euryarchaeota, på slægtniveau Bacteroides,
Faecalibacterium, Bifidobacterium, Roseburia, Alistipes, Collinsella, Blautia, COprococcus,
Ruminococcus, Eubacterium og Dorea, på artsniveau Bacteroides uniformis, Alistipes putredinis, Parabacteroides merdae, Ruminococcus bromii, Dorea longicatena, Bacteroides caccae, Bacteroides thetaiotaomicron, Eubacterium hallii, Ruminococcus torques,
Faecalibacterium prausnitzii, Ruminococcus lactaris, Collinsella aerofaciens, Dorea formicigenerans, Bacteroides vulgatus og Roseburia intestinalis. Mave-tarm-mikrobiotaen indbefatter den slimhinde-associerede mikrobiota, som befinder sig i eller er bundet til det slimlag, der dækker mave-tarm-kanalens epitel, og den lumen-associerede mikrobiota, som findes i mave-tarm-kanalens lumen. — "Modulering af mikrobiom" betyder udøvelse af en modificerende eller regulerende indvirkning på mikrobiota, for eksempel en indvirkning, som fører til en forøgelse af tarmens medfødte bestandsstørrelse af Bifidobacterium, Barnesiella, Faecalibacterium og/eller butyratproducerende bakterier. I et andet eksempel kan indvirkningen føre til en reduktion af tarmens bestandsstørrelse af Ruminococcus gnavus og/eller Proteobacteria. "Proteobacteria" er en række af gramnegative bakterier og indbefatter en mangfoldighed af forskellige patogene bakterier såsom Escherichia, Salmonella, Vibrio, Helicobacter, Yersinia og mange andre bemærkelsesværdige slægter. "Oral administration" betyder en hvilken som helst konventionel form for tilførsel af et præparat til et menneske gennem munden.
DK 202300035 U3 6 "Forebyggende behandling" eller "forebyggelse" betyder behandling, som gives, eller en handling, som udføres, for at mindske risikoen for opståen eller recidiv af en sygdom. "Behandle" betyder at sætte ind over for en medicinsk tilstand eller en sygdom med det formål at forbedre eller stabilisere et resultat hos den person, som behandles, eller at sætte ind over for et underliggende ernæringsbehov. Behandle indbefatter derfor ernæringsmæssig behandling af den medicinske tilstand eller sygdommen ved at sætte ind over for ernæringsbehov hos den person, som behandles. "At behandle" (treating) og "behandling" (treatment) har samme grammatiske betydning.
Al læren fra tidligere, som angivet ovenfor, hvortil der hermed henvises, skal i sin helhed — betragtes som en del af nærværende ansøgning. Ingen angivelse heri af noget tidligere offentliggjort dokument skal opfattes som en erklæring eller indrømmelse af, at læren derfra var alment kendt viden på datoen herfor.
Den hidtil ukendte HMO-blanding
Ifølge den foreliggende opfindelse har det overraskende vist sig, at en hidtil ukendt blanding af 5 fukosylerede HMO'er kan fremstilles ved en enzymatisk syntese under anvendelse af én
HMO-startdonor og to HMO-startacceptorer. Reaktionen kan fortrinsvis gennemføres under i det væsentlige bufferfrie betingelser. Ligeledes fortrinsvis har enzymet en begrænset eller ingen hydrolytisk aktivitet.
Den hidtil ukendte blanding, som består af eller i det væsentlige består af 5 fukosylerede — HMO-'er, har en unik hidtil ukendt kombination af egenskaber og biologiske aktiviteter.
Blandingen kan specifikt anvendes til modulering af mikrobiomet hos et menneske, såsom for at øge bestandsstørrelsen af Bifidobacterium og bestandsstørrelsen af Barnesiella i mikrobiomet hos et menneske. Blandingen kan endvidere reducere bestandsstørrelsen af Firmicutes i det menneskelige mikrobiom, især Clostridia. Blandingen kan også anvendes til at behandle — og/eller reducere risikoen for en lang række bakterie- og virusinfektioner hos mennesker. Den heri beskrevne hidtil ukendte blanding af HMO'er er anti-infektiøs. Når blandingen er kombineret med et probiotikum, forbedrer den endvidere levedygtigheden af probiotikummet i vandig opløsning væsentligt.
Ét aspekt af den foreliggende opfindelse angår en blanding, som består af eller i det væsentlige m— består af: a) en bestanddel A, som er 3-FL, b) en bestanddel B, som er LNFP-I, c) enbestanddel C, som er 2'-FL,
DK 202300035 U3 7 d) en bestanddel D, som er LNDFH-I, e) en bestanddel E, som er DFL, og eventuelt f) en bestanddel F, som er laktose.
Én udførelsesform af opfindelsen er dermed en blanding, som består af eller i det væsentlige består af: a) en bestanddel A, som er 3-FL, b) en bestanddel B, som er LNFP-I, c) enbestanddel C, som er 2'-FL, d) en bestanddel D, som er LNDFH-I, og e) en bestanddel E, som er DFL.
En anden udførelsesform af opfindelsen er en blanding, som består af eller i det væsentlige består af: a) en bestanddel A, som er 3-FL, b) en bestanddel B, som er LNFP-I, c) enbestanddel C, som er 2'-FL, d) en bestanddel D, som er LNDFH-I, e) en bestanddel E, som er DFL, og f) en bestanddel F, som er laktose.
En enzymatisk syntese til fremstilling af blandingen af HMO'er ifølge opfindelsen | de følgende afsnit svarer udtrykket "kan bære" til udtrykket "bærer eventuelt", og udtrykket "kan være substitueret" svarer til udtrykket "er eventuelt substitueret”.
Den ovenfor beskrevne hidtil ukendte blanding af fukosylerede HMO'er fremstilles ved en enzymatisk syntese, som omfatter en fukosyl-HMO-donor, der er bestanddel A (3-FL), to fukosyl-HMO-acceptorer, der er bestanddel B (LNFP-I) og bestanddel C (2'-FL), og en — transfukosidase, fortrinsvis under i det væsentlige bufferfrie betingelser. Ligeledes fortrinsvis har enzymet i reaktionen en begrænset eller ingen hydrolytisk (det vil sige fukosidase-) aktivitet.
Denne opfindelse angår dermed også en fremgangsmåde til fremstilling af en blanding af
HMO'er, som består af eller i det væsentlige består af en bestanddel A, der er 3-FL, en bestanddel B, der er LNFP-I, en bestanddel C, der er 2’-FL, en bestanddel D, der er LNDFH-I, en bestanddel E, der er DFL, og en bestanddel F, der er laktose, ved at omsætte
DK 202300035 U3 8 bestanddelene A, B og C i nærværelse af en a1-3/4-transfukosidase for at fremstille en reaktionsblanding, som indeholder bestanddelene A, B, C, D, E og laktose, og derefter fjerne a1-3/4-transfukosidasen fra reaktionsblandingen. a1-3/4-transfukosidasen kan fjernes på konventionel vis, f.eks. ved at denaturere reaktionsblandingen efterfulgt af centrifugering eller — ultrafiltrering af den.
Desuden angår et aspekt af denne opfindelse en fremgangsmåde til opnåelse af en blanding af
HMO'er, som består af eller i det væsentlige består af en bestanddel A, der er 3-FL, en bestanddel B, der er LNFP-I, en bestanddel C, der er 2’-FL, en bestanddel D, der er LNDFH-I, og en bestanddel E, der er DFL, hvilken fremgangsmåde omfatter trinene, der går ud på at omsætte bestanddelene A, B og C i nærværelse af en a1-3/4-transfukosidase for at fremstille en reaktionsblanding, som indeholder bestanddelene A, B, C, D, E og laktose, og derefter fjerne laktose og a1-3/4-transfukosidasen fra reaktionsblandingen. a1-3/4-transfukosidasen kan fjernes ved f.eks. at denaturere den efterfulgt af centrifugering eller ultrafiltrering. Laktosen kan separeres fra bestanddelene A, B, C, D og E ved f.eks. kaskade-ultra- og/eller nanofiltrering, eller laktosen kan først behandles med lactase for at nedbryde den til glukose og galaktose, som derefter kan separeres fra bestanddelene A, B, C, D og E ved ultra- og/eller nanofiltrering.
Det egnede enzym (protein) til udførelse af ovennævnte enzymreaktion er en a1-3/4-fukosidase eller en a1-3/4-transfukosidase. Disse enzymer har evnen til at overføre en fukosylrest fra en fukosyldonor, hvor fukosylresten er bundet med en a1-3-binding, til en acceptor. Hvis — acceptoren er et HMO, overføres fukosylresten specifikt til 4-positionen i et GlcNAc i HMO- acceptoren eller, hvis enten den position ikke er fri, eller der ikke er noget GIcNAc i HMO- acceptorstrukturen, til 3-positionen i Glc. a1-3/4-(trans)fukosidasen er en naturlig a1-3/4-L-fukosidase som klassificeret i henhold til EC 3.2.1.111 eller dens modificerede mutant. Helt naturlig a1-3/4-L-fukosidase kan fungere som en — transfukosidase i et vist omfang.
En foretrukken a1-3/4-(trans)fukosidase, som er egnet til udførelse af enzymreaktionen ifølge opfindelsen, er en a1-3/4-(trans)fukosidase, der udviser mindst 60 %, fortrinsvis mindst 70 %, mere fortrinsvis mindst 80 %, navnlig mindst 90 %, identitet med aminosyrepositionerne 56 til 345 i a1-3/4-fukosidasen fra Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697 som anført i — US-patent 8361756 som protein ifølge SEQ ID NO: 18 (omtalt som SEQ ID NO: 1 i den foreliggende ansøgning).
Ved den enzymatiske syntese ifølge opfindelsen kan hydrolysen af bestanddelene blive væsentlig som følge af stigende koncentrationer af de fremstillede bestanddele af reaktionsblandingen, hvor de a3/4-fukosylerede bestanddele så hydrolyseres til de ikke-a3/4-
DK 202300035 U3 9 fukosylerede bestanddele, laktose, 2’-FL og LNFP-I og fri fukose. a1-3/4-transfukosidasen ifølge den foreliggende opfindelse har således fortrinsvis en begrænset eller ingen hydrolytisk aktivitet. a1-3/4-transfukosidasens begrænsede eller ikke-tilstedeværende hydrolytiske aktivitet muliggør længere reaktionsvarigheder end det, der ellers ville være muligt. — En endnu foretrukken (even preferred) a1-3/4-transfukosidase til fremstilling af HMO- blandingerne ifølge denne opfindelse er således en a1-3/4-transfukosidase, som er uden hydrolytisk aktivitet eller i det mindste har en væsentligt reduceret hydrolytisk aktivitet.
En sådan a1-3/4-transfukosidase kan fremstilles ved at ændre aminosyresekvensen i en eller flere aminosyrepositioner, således at den muterede aminosyresekvens resulterer i forbedret — transfukosidase-aktivitet og/eller reduceret hydrolytisk aktivitet. Ifølge denne opfindelse er a1- 3/4-transfukosidasen a) muteret i mindst en eller flere af følgende aminosyrepositioner ifølge SEQ ID NO: 1: 134, 135, 168, 170, 174, 216, 221, 236, 237, 244, 245, 282 og 413, fortrinsvis i mindst en eller flere af følgende aminosyrepositioner: 134, 135, 174, 216, 221, 282 og 413; og b) tilvejebringer derved et omdannelsesniveau på mindst 20 % op til 70 %, såsom mindst 35 % eller såsom mindst 40 % eller såsom mindst 50 %, for enzymreaktionen ifølge den foreliggende opfindelse.
De muterede fukosidaser, som anvendes i opfindelsen, er passende ikke-naturlige fukosidaser, det vil sige de er ikke fremstillet i naturen eller naturligt forekommende, men er fremstillet som et — resultat af kemisk syntese, genmanipulation eller tilsvarende fremgangsmåder i laboratoriet, som resulterer i syntetiske muterede fukosidaser.
Den muterede a1-3/4-transfukosidase omfatter eller består fortrinsvis af polypeptidet ifølge SEQ
ID NO: 1 og en aminosyremutation i mindst en eller flere af følgende aminosyrepositioner: 134, 135, 174, 216, 221 og 282. — a1-3/4-transfukosidasen ifølge dette første aspekt omfatter eller består mere fortrinsvis af polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 1 og en aminosyremutation i mindst aminosyreposition 174 og i en eller flere af følgende aminosyrepositioner: 134, 135, 170, 216, 221, 236, 237, 241, 244, 245 og 282, fortrinsvis i en eller flere af følgende aminosyrepositioner: 134, 135, 216, 221 og 282.
Ligeledes mere fortrinsvis omfatter eller består a1-3/4-transfukosidasen af polypeptidet ifølge
SEQ ID NO: 1 og en aminosyremutation i mindst aminosyreposition 135 og i en eller flere af følgende aminosyrepositioner: 134, 170, 174, 216, 221, 236, 237, 241, 244, 245 og 282, fortrinsvis i en eller flere af følgende aminosyrepositioner: 134, 135, 216, 221 og 282.
Endnu mere fortrinsvis omfatter eller består a1-3/4-transfukosidasen af polypeptidet ifølge SEQ
ID NO: 1 og en aminosyremutation i mindst aminosyrepositionerne 135 og 174 og i en eller flere
DK 202300035 U3 10 af følgende aminosyrepositioner: 134, 170, 216, 221, 236, 237, 241 og 282, fortrinsvis i en eller flere af følgende aminosyrepositioner: 134, 216, 221 og 282. a1-3/4-transfukosidasen omfatter eller består eventuelt af polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 1 og en aminosyremutation i mindst aminosyrepositionerne 135 og/eller 174 og i en eller flere af følgende aminosyrepositioner: 134, 170, 216, 221, 236, 237, 241 og 282, fortrinsvis i en eller flere af følgende aminosyrepositioner: 134, 216, 221 og 282, og der er en yderligere mutation i en eller flere af følgende aminosyrepositioner: 165, 168, 232, 237, 258, 260 eller 274.
Fortrinsvis omfatter a1-3/4-transfukosidasen, og den består mere fortrinsvis af, sekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 med mutationer: - iaminosyreposition 135 og/eller 174 og - mindst i en aminosyreposition valgt blandt 168, 237 og 413. dette aspekt er Trp (W) i position 135 fortrinsvis substitueret med Ala, Asp, Asn, Glu, Gin, His,
Phe, Leu, Lys, Val eller Tyr, mere fortrinsvis Phe eller Tyr; i position 168 er Ser (S) fortrinsvis substitueret med Glu (E); i position 174 er Ala (A) fortrinsvis substitueret med Arg, Asn, Cys,
Glu, Ile, His, Leu, Lys, Met, Phe, Trp, Tyr eller Val, mere fortrinsvis Asn, His eller Phe; i position 237 er Glu (E) fortrinsvis substitueret med His (H); og i position 413 er Glu (E) substitueret med
Arg (R).
Endnu mere fortrinsvis omfatter a1-3/4-transfukosidasen, og den består mere fortrinsvis af, sekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 som beskrevet ovenfor med mutationer: - iaminosyreposition 174, - en aminosyreposition 135 eller 168, og - i aminosyreposition 413 - og eventuelt i aminosyreposition 165, 232, 258, 260 eller 274.
Ovennævnte kombination af mutationer bibringer ikke kun det muterede enzym en yderligere — forbedret transfukosidase-synteseydeevne, men en yderligere forøget stabilitet, navnlig temperaturstabilitet, samtidig med bibeholdelse af yderligere forbedret transfukosidase- synteseydeevne. Mutationerne i 135, 165, 174, 232, 258, 260 og 274 er fortrinsvis følgende: - position 135 som W135F eller W135Y, - position 165 som P165E, - position 174 som A174F, A174H eller A174N, - position 232 som R232A, - position 258 som Q258R,
DK 202300035 U3 11 - i position 260 som D260P, - position 274 som N274A.
Ligeledes fortrinsvis tilvejebringer den muterede a1-3/4-transfukosidase, som omfatter eller består af polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 1 og en mutation i mindst aminosyreposition 174 eller — 282, fortrinsvis mindst i begge aminosyrepositioner, væsentligt eller fuldstændigt undertrykt hydrolytisk aktivitet. I denne henseende er Ala (A) i position 174 fortrinsvis erstattet af Phe (F),
Asn (N) eller His (H), og/eller Val (V) i position 282 er fortrinsvis erstattet af Arg (R), Glu (E), His (H) eller Lys (K). Den undertrykte hydrolytiske aktivitet er gavnlig, fordi det muterede enzym så ikke nedbryder donoren og/eller produktet væsentligt ved hydrolyse. Som følge heraf er —transfukosidase-reaktionen ikke længere kinetisk kontrolleret, og der kan opnås et meget bedre syntese/hydrolyse-forhold (det vil sige en bedre synteseydeevne). Mutation i den ene eller begge, fortrinsvis begge, de ovennævnte aminosyrepositioner kan tilvejebringe mindst en 100 gange, fortrinsvis mindst en 1000 gange, mere fortrinsvis mindst en 10000 gange reduceret hydrolytisk aktivitet over for de fukosylerede produkter.
Den muterede a1-3/4-transfukosidase har dermed a) polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 1 og en mutation i mindst aminosyreposition 174 eller 282 og b) en væsentligt eller fuldstændigt undertrykt hydrolytisk aktivitet i sammenligning med proteinet ifølge SEQ ID NO: 1.
Desuden, ifølge en bestemt udførelsesform, omfatter den muterede a1-3/4-transfukosidase, eller den består fortrinsvis af, polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 1 og en mutation i - mindst aminosyrepositionen 174 eller 282 og - mindst aminosyrepositionen 165, 168, 232, 237, 258, 260 eller 274. — Kombinationen af mutationer som beskrevet ovenfor bibringer ikke kun en væsentligt reduceret, fortrinsvis praktisk talt ikke-detekterbar, hydrolyse af det fukosylerede produkt, men en forøget stabilitet, navnlig temperaturstabilitet.
Den muterede a1-3/4-transfukosidase har derfor a) polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 1 med mutation mindst ved aminosyren i position 174 eller 282 og mindst i aminosyrepositionen 165, 168, 232, 237, 258, 260 eller 274 og b) væsentligt eller fuldstændigt undertrykt hydrolytisk aktivitet og/eller
DK 202300035 U3 12 c) forøget stabilitet, navnlig temperaturstabilitet, i sammenligning med proteinet ifølge SEQ ID NO: 1.
Det er fortrinsvis sådan, at den muterede a1-3/4-transfukosidase omfatter eller fortrinsvis består af aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 1, en mutation af mindst aminosyren i position 174 eller 282, mere fortrinsvis er Ala (A) i position 174 fortrinsvis erstattet af Phe (F), Asn (N) eller
His (H), og eller Val (V) i position 282 er fortrinsvis erstattet af Arg (R), Glu (E), His (H) eller Lys (K).
En særligt foretrukken modificeret a1-3/4-transfukosidase omfatter eller består af aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 med følgende mutationer: W135F-A174N-N274A- — EA413R, idet aminosyrenummereringen er i overensstemmelse med SEQ ID NO: 1.
Ved udførelse af fremgangsmåden ifølge denne opfindelse er bestemte relative koncentrationer af bestanddel A-donoren, bestanddel B- og C-acceptorerne, a1-3/4-transfukosidasen, det vandige opløsningsmiddel og inkubationsbufferen ikke kritiske. I denne henseende kan fremgangsmåden passende udføres ved stuetemperatur (f.eks. 15-50, fortrinsvis 20-37 °C) ved en pH på 4-7, fortrinsvis 5-6, i 15 minutter til 24 timer. Reaktionen gennemføres typisk således, at der nås en ligevægt.
Ved enzymreaktionen tilvejebringes bestanddel A som fukosyldonor, og bestanddelene B og C tilvejebringes som fukosylacceptorer. Under reaktionen, a1-3/4-transfukosidasen, overføres en fukosylrest fra donoren til begge acceptorer, hvilket derved resulterer i dannelsen af bestanddel
D, bestanddel E og laktose. Den nyligt dannede bestanddel E kan imidlertid også fungere som fukosyldonor, hvilket resulterer i en a1-3/4-transfukosidase-enzymreaktion mellem bestanddel E og bestanddel B til dannelse af bestanddel D og bestanddel C, eller mellem bestanddel E og laktose til dannelse af bestanddel A og bestanddel C, i yderligere subligevægtsreaktioner. a1-3/4-transfukosidasen, med fordel W135F-A174N-N274A-E413R-mutanten (idet — aminosyrenummereringen er i overensstemmelse med SEQ ID NO: 1), anvendes i en mængde på omkring 0,09-0,11 % vægt/vægt baseret på den indledende samlede vægt af bestanddelene
A, B og C. Mængden af enzym påvirker ikke HMO'ernes endelige andel i det opnåede præparat, men har kun indvirkning på, hvornår ligevægten nås (højere enzymkoncentration medfører, at ligevægten nås på kortere tid). — Hvad angår fremstillingen af blandingen, som består af eller i det væsentlige består af bestanddelene A, B, C, D, E og eventuelt laktose, fortrinsvis blandingerne ifølge en hvilken som helst af udførelsesformerne i) til iv), der er beskrevet nedenfor, gennemføres den enzymatiske syntese ifølge opfindelsen i nærværelse af en egnet buffer, men fortrinsvis under i det væsentlige bufferfrie betingelser.
DK 202300035 U3 13
I lyset af opfindelsen er en bufret opløsning en opløsning, som indeholder et buffermiddel, kendetegnet ved, at opløsningens pH modstår ændringer i koncentrationen af frie hydrogenioner som følge af interne og/eller miljømæssige faktorer. En bufret opløsning bibeholder endvidere i det væsentlige pH for et reaktionssystem inden for et specifikt pH- interval afhængigt af det anvendte buffermiddel. Det er desuden almindeligt kendt, at burede opløsninger til enzymreaktioner tilvejebringer væsentlige cofaktorer til enzymdrevne reaktioner, f.eks. kritiske salte, samt at de generelt modstår ændringer i koncentrationen af hydrogenioner og tilvejebringer forhold, der stabiliserer proteiner. Ved gennemførelse af en enzymreaktion forventer en fagmand dermed, at der er behov for at tilføre buffermidler og/eller komponenter til — reaktionsmiljøet, som normalt anses for at være væsentlige for enzymets funktionsevne.
Inden yderligere forarbejdning af reaktionsprodukterne skal disse yderligere midler og/eller komponenter og/eller deres restprodukter dog fjernes fra reaktionsblandingen, hvilket kan være både tidskrævende og vanskeligt, og det tilføjer uønskede omkostninger til fremstillingsprocessen.
Det har overraskende vist sig, at den enzymatiske syntese ifølge den foreliggende opfindelse kan gennemføres under i det væsentlige bufferfrie betingelser, hvilket således fjerner behovet for at tilvejebringe og fjerne buffermidlerne og/eller komponenterne.
I ét aspekt af den foreliggende opfindelse gennemføres den heri beskrevne enzymatiske syntese i renset vand, hvor rensningstrinet kan omfatte en eller flere af fremgangsmåderne til — rensning valgt fra gruppen bestående af: omvendt osmose, filtrering, ultrafiltrering, sedimentering, chlorering, iodtilsætning, elektrodialyse, kogning, afsaltning og flokkulering.
I et aktuelt foretrukket aspekt af opfindelsen gennemføres den enzymatiske syntese i vand med en ledningsevne før anvendelse ved den enzymatiske syntese på under 10 uS/cm, såsom under 5 uS/cm, såsom under 1 uS/cm, såsom under 0,1 uS/cm, og/eller et silicaindhold under 0,05 mg/l, såsom under 0,04 mg/l, såsom under 0,02 mg/l eller såsom under 0,01 mg/l.
Ved en enzymatisk syntese ifølge den foreliggende opfindelse er i det væsentlige bufferfrie betingelser betingelser, hvor der ikke tilsættes noget/nogen yderligere buffermiddel/buffermidler til det rensede vand.
I den foreliggende forbindelse indbefatter termen "i det væsentlige bufferfrie" også en opløsning, — hvor der er tilsat uorganiske salte for at rense vandet med tidligere specificerede ledningsevne- og renhedsintervaller med henblik på at fungere som stabiliseringsmidler for enzymet, hvor saltene ikke har bufferevne. Eksempler på salte indbefatter almindeligt forekommende salte såsom, men ikke begrænset til, natriumchlorid (NaCl), calciumchlorid (CaCl), magnesiumchlorid (MgCI>), kaliumchlorid (KCI) og natriumsulfat (Na,SO,).
DK 202300035 U3 14
I et aspekt af en enzymatisk syntese ifølge den foreliggende opfindelse kan i det væsentlige bufferfrie betingelser omfatte en saltmængde i et interval fra 1 mikromolær til 1 molær, i et foretrukket interval såsom 100 mikromolær til 500 millimolær eller i et endnu mere foretrukket interval fra 1 millimolær til 300 millimolær. | et andet aspekt refererer de i det væsentlige — bufferfrie betingelser til tilstedeværelsen af sporioner i vand i en koncentration, som resulterer i en ledningsevne på under 5 uS/cm. et andet aspekt af opfindelsen indbefatter termen "i det væsentlige bufferfrie" også anvendelse af postevand.
Tilstedeværelse af ioner i en opløsning, med eller uden tilsætning af salte til opløsningen, kan — påvirke opløsningens pH, selv i sporkoncentrationer, hvilket resulterer i en ledningsevne pa over 5 uS/cm, stadig uden tilføjelse af bufferevne til de i det væsentlige bufferfrie betingelser.
Derudover kan tilsætning af reaktanter til en opløsning under i det væsentlige bufferfrie betingelser også ændre opløsningens pH såvel som ledningsevnen. | den foreliggende forbindelse anses betingelserne efter tilsætningen af ioner og/eller reaktanter til — reaktionsopløsningen dermed stadig for at være i det væsentlige bufferfrie.
I et foretrukket aspekt af en enzymatisk syntese ifølge den foreliggende opfindelse gennemføres syntesen i en i det væsentlige bufferfri opløsning, hvor pH ligger i intervallet fra pH 4 til pH 7, fortrinsvis ved pH 5 til pH 6.
Inden anvendelse af en blanding af HMO'er ifølge opfindelsen som en behandling eller på > anden måde er fjernelse af uønskede reaktionskomponenter nødvendig. Uønskede produkter i det endelige produkt er f.eks. enzymer, såsom a1-3/4-transfukosidasen, laktose, yderligere sporprodukter og/eller tilsvarende uønskede produkter.
En enzymatisk syntese ifølge den foreliggende opfindelse kan derudover omfatte et eller flere trin til deaktivering og separation af a1-3/4-transfukosidasen fra den resterende — reaktionsblanding.
Den enzymatiske syntese gennemføres i en reaktionsbeholder, og i nogle tilfælde kan det være fordelagtigt at overføre opløsningen fra reaktionsbeholderen, som kan være en procestank eller en plastbeholder eller en hvilken som helst anden egnet beholder til at gennemføre syntesen i, til en anden beholder, med f.eks. trykstyring, temperaturstyring og/eller styring af et væskemiljø — og/eller gasmiljø. En enzymatisk syntese kan således udføres på en måde, hvor reaktionsbeholderen og inaktiverings-/deaktiveringsbeholderen er den samme, eller den kan udføres på en måde, hvor reaktionsbeholderen og inaktiverings-/deaktiveringsbeholderen ikke er den samme.
DK 202300035 U3 15
Deaktiveringstrinet kan indebære opvarmning til en temperatur i intervallet fra 60 °C til 100 °C i et tidsinterval fra 1 minut til 180 minutter, såsom 5 minutter til 150 minutter, 10 minutter til 120 minutter, 15 minutter til 90 minutter og 30 minutter til 60 minutter. | et foretrukket aspekt indebærer deaktiveringstrinet opvarmning af reaktionsblandingen til en temperatur i intervallet fra 60 °C til 100 °C i et tidsrum på mindst 1, 5, 10, 30 eller 60 minutter.
Efter trinet eller trinene til deaktivering af a1-3/4-transfukosidasen fra den resterende reaktionsblanding omfatter en enzymatisk syntese ifølge den foreliggende opfindelse endvidere et eller flere trin til fjernelse af den deaktiverede a1-3/4-transfukosidase fra den syntetiserede
HMO-blanding, idet der derved tilvejebringes blandingen, som består af eller i det væsentlige består af bestanddelene A, B, C, D, E og laktose, fortrinsvis blandingerne ifølge en hvilken som helst af udførelsesformerne i) og ii), der er beskrevet nedenfor, herunder deres foretrukne og mere foretrukne udførelsesformer. a1-3/4-transfukosidasen kan generelt fjernes fra den syntetiserede blanding af HMO'er ved hjælp af konventionelle separationsmetoder, såsom filtrering (nano-, ultra- eller mikrofiltrering), — fjernelse ved centrifugering eller ultracentrifugering, behandling af reaktionsblandingen med pulverformigt aktivt kul i batchtilstand og/eller i kolonnetilstand og/eller kromatografiske metoder, såsom ionbytning, affinitetskromatografi, størrelseseksklusionskromatografi, normal fase- eller omvendt fase-kromatografi, fortrinsvis efter at enzymet, som blev anvendt til syntesen, er blevet denatureret eller deaktiveret. Separationsmetoder kan kombineres til en — flertrinsseparation. ét aspekt af opfindelsen behandles reaktionsblandingen, som indeholder en a1-3/4- transfukosidase, med aktivt kul, idet reaktionsblandingen for eksempel ledes gennem en søjle pakket med aktivt kul under anvendelse af en peristaltisk strømning, højtryksstrømning eller gravitationsstrømning. | et andet aspekt af opfindelsen kan separationen, nar der anvendes ultrafiltrering eller mikrofiltrering til separationen af en a1-3/4-transfukosidase fra reaktionsblandingen, involvere et tidligere trin, hvor den (inaktiverede) a1-3/4-transfukosidase har dannet partikler, såsom aggregater, krystaller og/eller bundfald, hvilket muliggør en mere bekvem separation ved filtrering. Ultra- eller mikrofiltreringsmembranens porestørrelse vælges således, at det er muligt for kulhydratbestanddelene at passere gennem membranen, samtidig med at det sikres, at den (inaktiverede) a1-3/4-transfukosidase tilbageholdes. et andet aspekt af opfindelsen kan separationen, når der anvendes ultracentrifugering eller centrifugering til fraseparationen af a1-3/4-transfukosidasen, involvere et tidligere trin, hvor den
DK 202300035 U3 16 (inaktiverede) a1-3/4-transfukosidase har dannet partikler, såsom aggregater, krystaller og/eller bundfald, hvilket muliggør en mere bekvem separation ved (ultra)centrifugering.
De ovenfor beskrevne oprensningstrin resulterer i en oprenset vandig opløsning, hvorfra en fast blanding, som består af eller i det væsentlige består af bestanddelene A, B, C, D, E og laktose, — fortrinsvis blandingerne ifølge en hvilken som helst af udførelsesformerne i) og ii), der er beskrevet nedenfor, herunder deres foretrukne og mere foretrukne udførelsesformer, kan opnås efter fjernelse af vand, f.eks. ved inddampning, spraytørring eller frysetørring.
For at opnå blandingen, som består af eller i det væsentlige består af bestanddelene A, B, C, D og E, fortrinsvis blandingerne ifølge en hvilken som helst af udførelsesformerne iii) og iv), der er beskrevet nedenfor, herunder deres foretrukne og mere foretrukne udførelsesformer, bør laktose separeres fra bestanddelene A, B, C, D og E. En egnet metode hertil er for eksempel gelfiltrering eller membranfiltrering under anvendelse af en membran, som sikrer tilbageholdelse af bestanddelene A, B, C, D og E og lader laktose passere. En anden fremgangsmåde er, før eller efter fjernelse af a1-3/4-transfukosidasen fra reaktionsmiljøet som beskrevet ovenfor, men — førfjernelse af vand, at tilsætte en B-galaktosidase for at nedbryde laktose til glukose og galaktose og derefter fraseparere disse monosakkarider under anvendelse af en membran, som sikrer tilbageholdelse af bestanddelene A, B, C, D og E og lader glukose og galaktose passere.
Fjernelsen af B-galaktosidasen kan udføres før eller efter denne membranfiltrering under anvendelse af et af de trin, der er beskrevet for fjernelse af a1-3/4-transfukosidasen. — Udførelsesformer af det første aspekt af opfindelsen
Hvad angår blandingen, som består af eller i det væsentlige består af bestanddelene A, B, C, D,
E og F, foretrækkes det, i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set, at i) -bestanddel D er 8-13 mol-% eller 14-22 % vægt/vægt, og/eller - bestanddel E er 9,5-17,5 mol-% eller 11,5-19 % vægt/vægt, og/eller - bestanddelene D+E er 17,5-30,5 mol-% eller 25,5-41 % vægt/vægt, eller ii) - bestanddel D er 2-22 mol-% eller 5-34 % vægt/vægt, eller - bestanddel E er 7-24 mol-% eller 6-29 % vægt/vægt, forudsat at bestanddelene D+E er 23,5-33 mol-% eller 30,5-43 % vægtvægt. — Blandingen ifølge udførelsesform i) kan typisk opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) ligger i intervallet fra omkring 3:1 til 1:3, og hvor acceptorbestanddelene er cirka ækvimolære. Blandingen ifølge udførelsesform ii) kan
DK 202300035 U3 17 typisk opnas, nar molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og
C) er cirka ækvimolært, og hvor, i acceptoren, molforholdet mellem bestanddel B og bestanddel
C ligger i intervallet fra omkring 3,5:1 til 1:3,9.
Hvad angår den ovenfor beskrevne udførelsesform i), foretrækkes det, at bestanddelene
ZA+B+C er 41,5-67 mol-% eller 41-66 % vægt/vægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set, hvor der især er mere til stede af bestanddel B end bestanddel C.
I en mere foretrukken udførelsesform i) - er bestanddel A 52-58 mol-% eller 47-52 % vægtvægt, - bestanddel B er 4-6 mol-% eller 6,5-8,5 % vægt/vægt, - bestanddel C er 1-2 mol-% eller 1-2 % vægt/vægt, - bestanddel D er 8,5-10 mol-% eller 15,5-17,5 % vægt/vægt, - bestanddelE er 10-11,5 mol-% eller 11,5-13 % vægt/vægt, og - bestanddel F er 17,5-20,5 mol-% eller 12-13,5 % vægt/vægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set.
Denne blanding kan opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er omkring 3:1, og hvor acceptorbestanddelene er cirka ækvimolære.
Ligeledes i en mere foretrukken udførelsesform i) - er bestanddel A 42-46 mol-% eller 36-40 % vægtvægt, - bestanddel B er 7-9 mol-% eller 11,5-13,5 % vægt/vægt, - bestanddel C er 3-4 mol-% eller 2,5-3,5 % vægt/vægt, - bestanddel D er 9-11 mol-% eller 16,5-19 % vægt/vægt, - bestanddel E er 11-13,5 mol-% eller 13-16 % vægt/vægt, og - bestanddel F er 20,5-23,5 mol-% eller 13-16 % vægt/vægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set.
Denne blanding kan opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er omkring 2:1, og hvor acceptorbestanddelene er cirka ækvimolære.
Ligeledes i en mere foretrukken udførelsesform i) - er bestanddel A 7,5-9,5 mol-% eller 5-7,5 % vægt/vægt, - bestanddel B er 21-24 mol-% eller 30-33 % vægtvægt,
DK 202300035 U3 18 - bestanddel C er 16-19 mol-% eller 12,5-15,5 % vægt/vægt, - bestanddel D er 10-12 mol-% eller 16,5-19,5 % vægt/vægt, - bestanddel E er 14-16,5 mol-% eller 14,5-17 % vægt/vægt, og - bestanddel F er 23-27 mol-% eller 13-16 % vægt/vægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set.
Denne blanding kan opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er omkring 1:2, og hvor acceptorbestanddelene er cirka ækvimolære.
Ligeledes i en mere foretrukken udførelsesform i) - er bestanddel A 3-5,5 mol-% eller 2,5-4 % vægtvægt, - bestanddel B er 26-30 mol-% eller 36-40 % vægt/vægt, - bestanddel C er 22,5-25,5 mol-% eller 17-20 % vægt/vægt, - bestanddel D er 8,5-11 mol-% eller 14-16,5 % vægt/vægt, - bestanddel E er 11-14 mol-% eller 11-14 % vægtvægt, og - bestanddel F er 20-23 mol-% eller 11-13,5 % vægt/vægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set.
Denne blanding kan opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er omkring 1:3, og hvor acceptorbestanddelene er cirka ækvimolære.
I en særligt mere foretrukken udførelsesform i) - er bestanddel A 19-24,5 mol-% eller 15-20 % vægt/vægt, - bestanddel B er 12,5-15,5 mol-% eller 19-22 % vægt/vægt, - bestanddel C er 7-10 mol-% eller 6-8 % vægt/vægt, - bestanddel D er 11-14 mol-% eller 18-22 % vægt/vægt, - bestanddel E er 14,5-17,5 mol-% eller 16-19 % vægt/vægt, og - bestanddel F er 25-30 mol-% eller 15-19 % vægt/vægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set.
Denne blanding kan opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er omkring 1:1, og hvor acceptorbestanddelene er cirka ækvimolære.
DK 202300035 U3 19
Hvad angar den ovenfor beskrevne udførelsesform ii), foretrækkes det, at bestanddelene
A+B+C er 40,5-54,5 mol-% eller 41-54 % vægt/vægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og
F samlet set, især hvor bestanddel A er 21-27 mol-%.
I en mere foretrukken udførelsesform ii) - er bestanddel A 21,5-25,5 mol-% eller 16-19,5 % vægtvægt, - bestanddel B er 18-22 mol-% eller 24,5-28,5 % vægt/vægt, - bestanddel C er 2-4 mol-% eller 1,5-3,5 % vægt/vægt, - bestanddel D er 18-22 mol-% eller 30-34 % vægt/vægt, - bestanddel E er 6,5-9,5 mol-% eller 6-9 % veegt/veegt, og - bestanddel F er 23-27 mol-% eller 13-15,5 % veegt/veegt i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set.
Denne blanding kan opnas, nar molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er cirka ækvimolært, og hvor, i acceptoren, molforholdet mellem bestanddel B og bestanddel C er omkring 3,5:1. — Ligeledes i en mere foretrukken udførelsesform ii) - er bestanddel A 21-24,5 mol-% eller 16,5-20 % vægt/vægt, - bestanddel B er 15-18 mol-% eller 21-25 % vægtvægt, - bestanddel C er 5,5-7,5 mol-% eller 4-6 % vægt/vægt, - bestanddel D er 13-16,5 mol-% eller 22-26 % vægt/vægt, - bestanddel E er 12-15 mol-% eller 12,5-15,5 % vægt/vægt, og - bestanddel F er 24-28 mol-% eller 14-17 % vægt/vægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set.
Denne blanding kan opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er cirka ækvimolært, og hvor, i acceptoren, molforholdet mellem — bestanddel B og bestanddel C er omkring 1,4:1.
Ligeledes i en mere foretrukken udførelsesform ii) - er bestanddel A 21-24,5 mol-% eller 17-20,5 % vægtvægt - bestanddel B er 10,5-13,5 mol-% eller 16,5-20 % veegt/veedt, - bestanddel C er 9-12 mol-% eller 8-10 % vægt/vægt,
DK 202300035 U3 20 - bestanddel D er 8-10 mol-% eller 14-17 % vægt/vægt, - bestanddel E er 17,5-20,5 mol-% eller 19,5-23 % veegt/veegt, og - bestanddel F er 24,5-28,5 mol-% eller 14,5-17,5 % veegt/vaegt i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set.
Denne blanding kan opnas, nar molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er cirka ækvimolært, og hvor, i acceptoren, molforholdet mellem bestanddel B og bestanddel C er omkring 1:1,5.
Ligeledes i en mere foretrukken udførelsesform ii) - er bestanddel A 23-27 mol-% eller 21-25 % vægtvægt, - bestanddel B er 6-8 mol-% eller 10-12,5 % vægtvægt, - bestanddel C er 15-19,5 mol-% eller 14-16,5 % vægt/vægt, - bestanddel D er 2,5-4,5 mol-% eller 5,5-7,5 % vægtvægt, - bestanddel E er 21-24,5 mol-% eller 25-28,5 % vægt/vægt, og - bestanddel F er 23,5-27,5 mol-% eller 16-19 % vægt/vægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set.
Denne blanding kan opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er cirka ækvimolært, og hvor, i acceptoren, molforholdet mellem bestanddel B og bestanddel C er omkring 1:3,9.
I en særligt mere foretrukken udførelsesform ii) - er bestanddel A 19-24,5 mol-% eller 15-20 % vægt/vægt, - bestanddel B er 12,5-15,5 mol-% eller 19-22 % vægt/vægt, - bestanddel C er 7-10 mol-% eller 6-8 % vægt/vægt, - bestanddel D er 11-14 mol-% eller 18-22 % vægt/vægt, - bestanddel E er 14,5-17,5 mol-% eller 16-19 % vægt/vægt, og - bestanddel F er 25-30 mol-% eller 15-19 % veegt/veegt i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set.
Denne blanding kan opnas, nar bade molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) og molforholdet mellem bestanddel B og bestanddel C er cirka ækvimolært.
DK 202300035 U3 21
Hvad angar blandingen, som bestar af eller i det væsentlige består af bestanddelene A, B, C, D og E, foretrækkes det, i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set, at lii) - bestanddel D er 10-17,5 mol-% eller 16-25,5 % vægt/vægt, og/eller - bestanddel E er 12-23,5 mol-% eller 13-22 % vægt/vægt, og/eller - bestanddelene D+E er 22-41 mol-% eller 29-47,5 % vægt/vægt, eller iv) - bestanddel D er 3,5-29,5 mol-% eller 6-39 % vægt/vægt, og/eller - bestanddel E er 9-32 mol-% eller 7,5-34,5 % vægt/vægt, forudsat at bestanddelene D+E er 31,5-41 mol-% eller 36,5-49 % vægt/vægt. — Blandingen ifølge udførelsesform iii) kan typisk opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) ligger i intervallet fra omkring 3:1 til 1:3, hvor acceptorbestanddelene er cirka ækvimolære, og hvor laktose er i alt væsentligt fjernet fra det således opnåede præparat. Blandingen ifølge udførelsesform iv) kan typisk opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er cirka — ækvimolært, hvor, i acceptoren, molforholdet mellem bestanddel B og bestanddel C ligger i intervallet fra omkring 3,5:1 til 1:3,9, og hvor laktose er i alt væsentligt fjernet fra det således opnåede præparat.
Hvad angår den ovenfor beskrevne udførelsesform iii), foretrækkes det, at der er mere til stede af bestanddel B end bestanddel C i blandingen. | en mere foretrukken udførelsesform iii) - er bestanddel A 65-71 mol-% eller 53,5-59,5 % vægt/vægt, - bestanddel B er 5-7 mol-% eller 7,5-9,5 % vægt/vægt, - bestanddel C er 1,5-2,5 mol-% eller 1-2 % veegt/iveegt, - bestanddel D er 10-12,5 mol-% eller 18-20,5 % vægt/vægt, og - bestanddel E er 12-14,5 mol-% eller 13-15,5 % vægtvægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set.
Denne blanding kan opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er omkring 3:1, hvor acceptorbestanddelene er cirka ækvimolære, og hvor laktose er i alt væsentligt fjernet fra det således opnåede præparat. — Ligeledes i en mere foretrukken udførelsesform iii)
DK 202300035 U3 22 - er bestanddel A 54-58,5 mol-% eller 42-46,5 % vægt/vægt, - bestanddel B er 9-11,5 mol-% eller 13-15,5 % vægt/vægt, - bestanddel C er 4-5 mol-% eller 3-4 % vægt/vægt, - bestanddel D er 11,5-14 mol-% eller 19-23 % vægt/vægt, og - bestanddel E er 15-18 mol-% eller 15-18,5 % vægt/vægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set.
Denne blanding kan opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er omkring 2:1, hvor acceptorbestanddelene er cirka ækvimolære, og hvor laktose er i alt væsentligt fjernet fra de således opnåede præparat.
Ligeledes i en mere foretrukken udførelsesform iii) - er bestanddel A 10-12,5 mol-% eller 6,5-9 % vægt/vægt, - bestanddel B er 28,5-32 mol-% eller 34,5-38,5 % veegt/veedt, - bestanddel C er 22-25 mol-% eller 15-17,5 % vægt/vægt, - bestanddel D er 13,5-16 mol-% eller 19,5-22,5 % vægt/vægt, og - bestanddel E er 19-21,5 mol-% eller 17-19,5 % vægtvægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set.
Denne blanding kan opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er omkring 1:2, hvor acceptorbestanddelene er cirka ækvimolære, og hvor laktose er i alt væsentligt fjernet fra det således opnåede præparat. — Ligeledes i en mere foretrukken udførelsesform iii) - er bestanddel A 4,5-6,5 mol-% eller 2,5-4,5 % vægt/vægt, - bestanddel B er 34-38 mol-% eller 41,5-45,5 % vægt/vægt, - bestanddel C er 29-32,5 mol-% eller 19-22,5 % vægt/vægt, - bestanddel D er 11-13,5 mol-% eller 16-19 % vægt/vægt, og - bestanddel E er 14,5-17,5 mol-% eller 13-16 % vægtvægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set.
Denne blanding kan opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er omkring 1:3, hvor acceptorbestanddelene er cirka ækvimolære, og hvor laktose er i alt væsentligt fjernet fra det således opnåede præparat.
DK 202300035 U3 23
I en særligt mere foretrukken udførelsesform iii) - er bestanddel A 29-33 mol-% eller 20-24,5 % vægt/vægt, - bestanddel B er 18-21,5 mol-% eller 23-25,5 % vægt/vægt, - bestanddel C er 10-12,5 mol-% eller 7,5-9,5 % vægt/vægt, - bestanddel D er 15-17,5 mol-% eller 22-25,5 % vægt/vægt, og - bestanddel E er 20,5-23,5 mol-% eller 19,5-22 % vægtvægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set.
Denne blanding kan opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er omkring 1:1, hvor acceptorbestanddelene er cirka ækvimolære, og — hvor laktose er i alt væsentligt fjernet fra det således opnåede præparat.
Hvad angår den ovenfor beskrevne udførelsesform iv), foretrækkes det, at bestanddelene
A+B+C er 57-70 mol-% eller 51-64,5 % vægt/vægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set, især hvor bestanddel A er 29-35,5 mol-%.
I en mere foretrukken udførelsesform iv) - er bestanddel A 29,5-33,5 mol-% eller 19-22,5 % vægtvægt, - bestanddel B er 25-28,5 mol-% eller 29-33 % vægt/vægt, - bestanddel C er 3-5 mol-% eller 2-3,5 % vægt/vægt, - bestanddel D er 26-29,5 mol-% eller 35-39 % vægt/vægt, og - bestanddel E er 9-11,5 mol-% eller 7,5-10 % vægt/vægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set.
Denne blanding kan opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er cirka ækvimolært, hvor, i acceptoren, molforholdet mellem bestanddel B og bestanddel C er omkring 3,5:1, og hvor laktose er i alt væsentligt fjernet fra det således opnåede præparat. — Ligeledes i en mere foretrukken udførelsesform iv) - er bestanddel A 29-32,5 mol-% eller 20,5-23 % vægt/vægt, - bestanddel B er 21-24,5 mol-% eller 26-29,5 % vægt/vægt, - bestanddel C er 7,5-10 mol-% eller 5-7 % vægt/vægt, - bestanddel D er 18-21,5 mol-% eller 27-29,5 % vægt/vægt, og
DK 202300035 U3 24 - bestanddel E er 17-19,5 mol-% eller 15,5-18 % vægtvægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set.
Denne blanding kan opnas, nar molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er cirka ækvimolært, hvor, i acceptoren, molforholdet mellem bestanddel B og bestanddel C er omkring 1,4:1, og hvor laktose er i alt væsentligt fjernet fra det således opnåede præparat.
Ligeledes i en mere foretrukken udførelsesform iv) - er bestanddel A 29-33 mol-% eller 22-24,5 % vægt/vægt, - bestanddel B er 15-18 mol-% eller 20,5-23 % vægt/vægt, - bestanddel C er 13-15,5 mol-% eller 9,5-12 % vægt/vægt, - bestanddel D er 11-13,5 mol-% eller 17-20 % vægt/vægt, og - bestanddel E er 24,5-27,5 mol-% eller 24-27 % vægtvægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set.
Denne blanding kan opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor — (bestanddelene B og C) er cirka ækvimolært, hvor, i acceptoren, molforholdet mellem bestanddel B og bestanddel C er omkring 1:1,5, og hvor laktose er i alt væsentligt fjernet fra det således opnåede præparat.
Ligeledes i en mere foretrukken udførelsesform iv) - er bestanddel A 31,5-35,5 mol-% eller 26-29,5 % vægtvægt, - bestanddel B er 8,5-10,5 mol-% eller 12,5-15 % vægt/vægt, - bestanddel C er 21-24 mol-% eller 17-20 % vægt/vægt, - bestanddel D er 3,5-5,5 mol-% eller 6-9,5 % vægt/vægt, og - bestanddel E er 28-32 mol-% eller 30,5-34,5 % vægt/vægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set.
Denne blanding kan opnås, når molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) er cirka ækvimolært, hvor, i acceptoren, molforholdet mellem bestanddel B og bestanddel C er omkring 1:3,9, og hvor laktose er i alt væsentligt fjernet fra det således opnåede præparat.
I en særligt mere foretrukken udførelsesform iv) - er bestanddel A 29-33 mol-% eller 21-24,5 % vægt/vægt,
DK 202300035 U3 25 - bestanddel B er 18-21,5 mol-% eller 23-25,5 % vægt/vægt, - bestanddel C er 10-12,5 mol-% eller 7,5-9,5 % vægt/vægt, - bestanddel D er 15-17,5 mol-% eller 23-25,5 % vægt/vægt, og - bestanddel E er 20,5-23,5 mol-% eller 19,5-22 % vægtvægt i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set.
Denne blanding kan opnås, når både molforholdet mellem donor (bestanddel A) og acceptor (bestanddelene B og C) og molforholdet mellem bestanddel B og bestanddel C er cirka ækvimolært, og hvor laktose er i alt væsentligt fjernet fra det således opnåede præparat.
Farmaceutisk, kosmetisk og/eller næringspræparat
En blanding ifølge den foreliggende opfindelse, som består af eller i det væsentlige består af 3-
FL, LNFP-I, 2-FL, LNDFH-I, DFL og eventuelt laktose, kan formuleres som et farmaceutisk, kosmetisk og/eller næringspræparat, der kan indeholde en farmaceutisk, kosmetisk og/eller næringsmæssigt acceptabel bærer, såsom en fosfatbufret saltvandsopløsning, ubufret saltvandsopløsning, blandinger af ethanol i vand, vand og emulsioner såsom en olie/vand- eller — vand/olie-emulsion, samt forskellige befugtningsmidler og/eller excipienser. Præparatet, som er farmaceutisk, kosmetisk og/eller et næringspræparat, kan også indeholde andre materialer, som ikke frembringer en bivirkning, allergisk reaktion eller på anden måde uønsket reaktion, når den administreres til en patient.
Bærere og andre materialer, der indgår i præparatet, som er farmaceutisk, kosmetisk og/eller et — næringspræparat, kan indbefatte en eller flere af følgende: opløsningsmidler, dispergeringsmidler, overtræk, absorptionsfremmende midler, midler til kontrolleret frigivelse og et eller flere inerte excipienser, såsom stivelser, polyoler, granuleringsmidler, mikrokrystallinske celluloser, fortyndingsmidler, smøremidler, bindemidler og desintegrationsmidler.
Tabletdoseringer af de anti-infektiøse blandinger kan om ønsket overtrækkes ved hjælp af — vandige eller ikke-vandige teknikker, som er kendt af en fagmand.
Et farmaceutisk, kosmetisk og/eller næringspræparatifølge den foreliggende opfindelse kan administreres oralt, bukkalt, sublingualt, topisk og/eller rektalt. Den kan formuleres som en tablet, en kapsel, et suppositorium, en brusetablet, en pellet, en sugetablet, en pastil, en gel, en pasta, en opløsning, en suspension, en emulsion, en syrup, en bolus, en latværge, en — opslæmning, i en vandig eller ikke-vandig væske, som et pulver eller som et granulat, der indeholder en forudbestemt koncentration af blandingen af HMO'er.
Et farmaceutisk, kosmetisk og/eller næringspræparatifølge den foreliggende opfindelse kan også indbefatte bindemidler, smøremidler, inerte fortyndingsmidler, aromastoffer og
DK 202300035 U3 26 fugtighedsbevarende stoffer. En tablet, en kapsel, et suppositorium eller en pellet, der indeholder præparatet, som er farmaceutisk, kosmetisk og/eller et næringspræparat, ifølge den foreliggende opfindelse, kan eventuelt overtrækkes for eller formuleres til at tilvejebringe langvarig, forsinket eller kontrolleret frigivelse af den anti-infektiøse blanding af HMO'er.
Blandingen af HMO'er ifølge opfindelsen kan suppleres med yderligere farmaceutiske midler, aktive farmaceutiske bestanddele eller midler med virkning på ugunstige helbredstilstande hos den patient, hvortil præparatet administreres. én udførelsesform kan præparatet foreligge i form af et næringspræparat. Næringspræparatet kan for eksempel være et fødevarepræparat, en rehydreringsopløsning, en medicinsk fødevare eller en fødevare til særlige medicinske formål, et næringstilskud og lignende.
Næringspræparatet kan indeholde kilder til protein, lipider og/eller fordøjelige kulhydrater og kan foreligge på pulver- eller væskeform. Præparatet kan designes til at være den eneste kilde til ernæring eller som et næringstilskud.
Egnede proteinkilder indbefatter mælkeproteiner, sojaprotein, risprotein, ærteprotein og — havreprotein eller blandinger deraf. Mælkeproteiner kan foreligge i form af mælkeproteinkoncentrater, mælkeproteinisolater, valleprotein eller casein, eller blandinger af dem begge. Proteinet kan være helt protein eller hydrolyseret protein, enten delvist hydrolyseret eller omfattende hydrolyseret. Hydrolyseret protein har den fordel, at det er lettere at fordøje, hvilket kan være væsentligt for mennesker med betændt eller kompromitteret mave-tarm-kanal. — Proteinet kan også være tilvejebragt i form af frie aminosyrer. Proteinet kan omfatte ca. 5 % til ca. 30 % af næringspræparatets energi, normalt ca. 10 % til 20 %. Proteinkilden indbefatter ideelt set ikke overdrevent store mængder af laktose.
Proteinkilden kan være en kilde til glutamin, threonin, cystein, serin, prolin eller en kombination af disse aminosyrer. Glutaminkilden kan være et glutamindipeptid og/eller et glutaminberiget protein. Glutamin kan indbefattes som følge af enterocytters anvendelse af glutamin som energikilde. Threonin, serin og prolin er aminosyrer, som er vigtige for fremstillingen af mucin.
Mucin dækker mave-tarm-kanalens inderside og kan forbedre tarmbarrierefunktion og slimhindeheling. Cystein er et væsentligt forstadie for glutathion, som er afgørende for kroppens antioxidantforsvar. — Egnede fordøjelige kulhydrater indbefatter maltodextrin, hydrolyseret eller modificeret stivelse eller majsstivelse, glukosepolymerer, majssirup, majssiruptørstof, majssirup med højt fruktoseindhold, kulhydrater fra ris, kulhydrater fra ært, kulhydrater fra kartoffel, tapioka, sakkarose, glukose, fruktose, sakkarose, honning, sukkeralkoholer (f.eks. maltitol, erythritol, sorbitol), eller blandinger deraf. Præparatet har fortrinsvis et reduceret indhold af eller er fri for
DK 202300035 U3 27 tilsat laktose eller andre FODMAP-kulhydrater. Fordøjelige kulhydrater tilvejebringer generelt ca. 35 % til ca. 55 % af næringspræparatets energi. Et egnet fordøjeligt kulhydrat er et maltodextrin med en lav dextroseækvivalent (DE).
Egnede lipider indbefatter mellemkædede triglycerider (MCT) og langkædede triglycerider (LCT). Lipidet er fortrinsvis en blanding af MCT'er og LCT'er. MCT'er kan for eksempel omfatte ca. 30 til ca. 70 vægt-% af lipiderne, mere specifikt ca. 50 til ca. 60 vægt-%. MCT'er har den fordel, at de er lettere at fordøje, hvilket kan være væsentligt for mennesker med betændt eller kompromitteret mave-tarm-kanal. Lipiderne tilvejebringer generelt ca. 35 % til ca. 50 % af næringspræparatets energi. Lipiderne kan indeholde essentielle fedtsyrer (omega-3 og omega- — 6 fedtsyrer). Disse polyumættede fedtsyrer tilvejebringer fortrinsvis mindre end ca. 30 % af lipidkildens samlede energi.
Egnede kilder til langkædede triglycerider er rapsolie, solsikkeolie, palmeolie, sojaolie, mælkefedt, majsolie, olier med højt oliesyreindhold og sojalecithin. Fraktionerede kokosolier er en egnet kilde til mellemkædede triglycerider. Lipidprofilen for næringspræparatet er fortrinsvis — designet til at have et forhold mellem polyumættede omega-6 (n-6) og omega-3 (n-3) fedtsyrer på ca. 4:1 til ca. 10:1. Forholdet mellem n-6 og n-3 fedtsyrer kan for eksempel være ca. 6:1 til ca. 9:1.
Næringspræparatet kan også indbefatte vitaminer og mineraler. Hvis næringspræparatet er beregnet til at være den eneste kilde til ernæring, indbefatter den fortrinsvis en komplet vitamin- og mineralprofil. Eksempler på vitaminer indbefatter A-vitamin, B-vitaminkomplekset (såsom B1,
B2, B6 og B12), C-vitamin, D-vitamin, E-vitamin og K-vitamin, niacin og syrevitaminer såsom pantothensyre, folsyre og biotin. Eksempler på mineraler indbefatter calcium, jern, zink, magnesium, iod, kobber, phosphor, mangan, kalium, chrom, molybden, selen, nikkel, tin, silicium, vanadium og bor. — Næringspræparatet kan også indbefatte et carotenoid, såsom lutein, lycopen, zeaxanthin og beta-caroten. Den samlede indbefattede mængde af carotenoid kan variere fra ca. 0,001 ug/ml til ca. 10 ug/ml. Lutein kan indbefattes i en mængde fra ca. 0,001 ug/ml til ca. 10 ug/ml, fortrinsvis fra ca. 0,044 ug/ml til ca. 5 ug/ml lutein. Lycopen kan indbefattes i en mængde fra ca. 0,001 ug/ml til ca. 10 ug/ml, fortrinsvis ca. 0,0185 ug/ml til ca. 5 ug/ml lycopen. Beta-caroten kan omfatte fra ca. 0,001 pg/ml til ca. 10 mg/ml, for eksempel ca. 0,034 pg/ml til ca. 5 ug/ml beta-caroten.
Næringspræparatet indeholder fortrinsvis også reducerede koncentrationer af natrium, for eksempel fra ca. 300 mg/l til ca. 400 mg/l. De resterende elektrolytter kan være til stede i koncentrationer, som er fastsat til at opfylde behov, uden at det indebærer en unødig belastning
DK 202300035 U3 28 på nyrefunktionen fra opløste stoffer i nyrerne. For eksempel er kalium fortrinsvis til stede i et interval fra ca. 1180 til ca. 1300 mg/l; og chlorid er fortrinsvis til stede i et interval fra ca. 680 til ca. 800 mg/l.
Næringspræparatet kan også indeholde forskellige andre konventionelle bestanddele, såsom — konserveringsmidler, emulgatorer, fortykningsmidler, buffere, fibre og præbiotika (f.eks. fruktooligosakkarider, galaktooligosakkarider), probiotika (f.eks. B. animalis subsp. lactis BB-12,
B. lactis HNO19, B. lactis Bi07, B. infantis ATCC 15697, L. rhamnosus GG, L. rhamnosus LGG
DSM 33156, L. rhamnosus HNOOI, L. acidophilus LA-5, L. acidophilus NCFM, L. fermentum
CECT5716, B. longum BB536, B. longum AH1205, B. longum AH1206, B. breve M-16V, L. reuteri ATCC 55730, L. reuteri ATCC PTA-6485, L. reuteri DSM 17938), antioxidanter/antiinflammatoriske forbindelser, som indbefatter tocopheroler, carotenoider, ascorbat/C-vitamin, ascorbylpalmitat, polyphenoler, glutathion og superoxiddismutase (melon), andre bioaktive faktorer (f.eks. væksthormoner, cytokiner, TFG-B), farvemidler, aromastoffer og stabilisatorer, smøremidler og så videre.
Neeringspreeparatet kan formuleres som et opløseligt pulver, et væskekoncentrat eller en brugsklar formulering. Præparatet kan tilføres til et menneske med behov derfor via en nasogastrisk slange eller oralt. Forskellige aromastoffer og andre tilsætningsstoffer kan også være til stede.
Næringspræparaterne kan fremstilles ved hjælp af hvilke som helst almindeligt anvendte m— fremstillingsteknikker til fremstilling af næringspræparater på fast form eller væskeform.
Præparatet kan for eksempel fremstilles ved at kombinere forskellige fødeopløsninger. En [protein-i-fedt]-fødeopløsning kan fremstilles ved at opvarme og blande lipidkilden og derpå tilsætte en emulgator (f.eks. lecithin), fedtopløselige vitaminer og mindst en del af proteinkilden under opvarmning og omrøring. En kulhydrat-fødeopløsning fremstilles derefter ved at tilsætte — mineraler, spor- og ultraspormineraler, fortyknings- eller opslæmningsmidler til vand under opvarmning og omrøring. Den resulterende opløsning bibeholdes i 10 minutter under fortsat varme og omrøring inden tilsætning af kulhydrater (f.eks. HMO'erne og fordøjelige kulhydratkilder). De resulterende fødeopløsninger blandes derefter med hinanden under opvarmning og omrøring, og pH justeres til 6,6-7,0, hvorefter præparatet underkastes kortvarig — højtemperaturforarbejdning, hvorunder præparatet varmebehandles, emulgeres og homogeniseres, og derefter får den lov at køle af. Vandopløselige vitaminer og ascorbinsyre tilsættes, pH justeres om nødvendigt til det ønskede interval, aromastoffer tilsættes, og der tilsættes vand for at opnå det ønskede samlede indhold af faste stoffer.
Til opnåelse af et flydende produkt kan den resulterende opløsning derefter pakkes aseptisk for — at danne et aseptisk emballeret næringspræparat. | denne form kan næringspræparatet
DK 202300035 U3 29 foreligge pa tilførselsklar form eller koncentreret væskeform. Alternativt kan præparatet spraytørres og forarbejdes og emballeres som rekonstituerbart pulver.
Når næringsproduktet er en tilførselsklar næringsvæske, foretrækkes det måske, at den samlede koncentration af HMO'er i væsken, baseret på vægten af væsken, udgør fra ca. 0,1 % til ca. 1,5 %, herunder fra ca. 0,2 % til ca. 1,0 %, for eksempel fra ca. 0,3 % til ca. 0,7 %. Når næringsproduktet er en koncentreret næringsvæske, foretrækkes det måske, at den samlede koncentration af HMO'er i væsken, baseret på vægten af væsken, udgør fra ca. 0,2 % til ca. 3,0 %, herunder fra ca. 0,4 % til ca. 2,0 %, for eksempel fra ca. 0,6 % til ca. 1,5 %.
I en anden udførelsesform foreligger næringspræparatet i enhedsdosisform.
Enhedsdosisformen kan indeholde en acceptabel bærer af fødevarekvalitet, f.eks. fosfatbufret saltvandsopløsning, blandinger af ethanol i vand, vand og emulsioner, såsom en olie/vand- eller vand/olie-emulsion, samt forskellige befugtningsmidler eller excipienser. Enhedsdosisformen kan også indeholde andre materialer, som ikke frembringer en bivirkning, allergisk reaktion eller på anden måde uønsket reaktion, når den administreres til et menneske. Bærerne og de andre — materialer kan indbefatte opløsningsmidler, dispergeringsmidler, overtræk, absorptionsfremmende midler, midler til kontrolleret frigivelse og et eller flere inerte excipienser, såsom stivelser, polyoler, granuleringsmidler, mikrokrystallinsk cellulose, fortyndingsmidler, smøremidler, bindemidler og desintegrationsmidler. Enhedsdosisformen omfatter fortrinsvis primært HMO'er med en minimumsmængde af bindemidler og/eller excipienser.
Enhedsdosisformer er navnlig egnede, nar de er ernæringsmæssigt ufuldstændige eller ikke beregnet til at være den eneste kilde til ernæring.
En enhedsdosisform kan administreres oralt, f.eks. som en tablet, kapsel eller pellet, som indeholder en forudbestemt mængde af blandingen, eller som et pulver eller granulat, som indeholder en forudbestemt koncentration af blandingen, eller en gel, pasta, opløsning, suspension, emulsion, sirup, bolus, latværge eller opslæmning, i en vandig eller ikke-vandig væske, som indeholder en forudbestemt koncentration af blandingen. Et oralt administreret præparatkan indbefatte et eller flere bindemidler, smøremidler, inerte fortyndingsmidler, aromastoffer og fugtighedsbevarende stoffer. Et oralt administreret præparatsåsom en tablet kan eventuelt overtrækkes for og kan formuleres til at tilvejebringe langvarig, forsinket eller — kontrolleret frigivelse af HMO'erne.
En enhedsdosisform kan også administreres ved hjælp af en nasogastrisk slange eller ved direkte infusion i mave-tarm-kanalen eller mavesækken.
En enhedsdosisform kan også indbefatte terapeutiske midler, såsom antibiotika, probiotika, analgetika og antiinflammatoriske midler.
DK 202300035 U3 30
Den korrekte dosering af et næringspræparattil et menneske kan bestemmes på konventionel vis baseret på faktorer såsom koncentrationen af HMO'er, menneskets tilstand, immunstatus, kropsvægt og alder. Den krævede mængde HMO-'er vil generelt ligge i intervallet fra ca. 1 g til ca. 15 g dagligt, i visse udførelsesformer fra ca. 2 g til ca. 10 g dagligt, for eksempel ca. 3 g til ca. 7 g dagligt. Passende dosisregimer kan bestemmes ved metoder, som er kendt af fagfolk.
I en yderligere udførelsesform kan blandingen af HMO'er være formuleret som et farmaceutisk præparat. Det farmaceutiske præparatkan indeholde en farmaceutisk acceptabel bærer, f.eks. fosfatbufret saltvandsopløsning, blandinger af ethanol i vand, vand og emulsioner, såsom en olie/vand- eller vand/olie-emulsion, samt forskellige befugtningsmidler eller excipienser. Det farmaceutiske præparatkan også indeholde andre materialer, som ikke frembringer en bivirkning, allergisk reaktion eller på anden måde uønsket reaktion, når den administreres til et menneske. Bærerne og de andre materialer kan indbefatte opløsningsmidler, dispergeringsmidler, overtræk, absorptionsfremmende midler, midler til kontrolleret frigivelse og et eller flere inerte excipienser, såsom stivelser, polyoler, granuleringsmidler, mikrokrystallinsk cellulose, fortyndingsmidler, smøremidler, bindemidler og desintegrationsmidler.
De farmaceutiske præparater kan administreres oralt, f.eks. som en tablet, kapsel eller pellet, som indeholder en forudbestemt mængde, eller som et pulver eller granulat, som indeholder en forudbestemt koncentration, eller en gel, pasta, opløsning, suspension, emulsion, syrup, bolus, latværge eller opslæmning, i en vandig eller ikke-vandig væske, som indeholder en — forudbestemt koncentration. Oralt administrerede præparater kan indbefatte bindemidler, smøremidler, inerte fortyndingsmidler, aromastoffer og fugtighedsbevarende stoffer. Oralt administrerede præparater såsom tabletter kan eventuelt overtrækkes for og kan formuleres til at tilvejebringe langvarig, forsinket eller kontrolleret frigivelse af blandingen deri.
De farmaceutiske præparater kan også administreres ved hjælp af rektalt suppositorium, — aerosolslange eller nasogastrisk slange eller ved direkte infusion i mave-tarm-kanalen eller mavesækken.
De farmaceutiske præparater kan også indbefatte terapeutiske midler, såsom antibiotika, probiotika, analgetika og antiinflammatoriske midler. Den korrekte dosering af ety farmaceutisk præparatkan bestemmes på konventionel vis baseret på faktorer såsom koncentrationen af — HMO-'erne, patientens tilstand, immunstatus, kropsvægt og alder. Den krævede mængde
HMO-'er vil generelt ligge i intervallet fra ca. 1 g til ca. 15 g dagligt, i visse udførelsesformer fra ca. 2 g til ca. 10 g dagligt, for eksempel ca. 3 g til ca. 7 g dagligt. Passende dosisregimer kan bestemmes ved metoder, som er kendt af fagfolk.
DK 202300035 U3 31
Anvendelsen af en blanding af HMO'er ifølge den foreliggende opfindelse
Den foreliggende opfindelse angår også anvendelsen af en blanding, som består af eller i det væsentlige består af 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL og eventuelt laktose, til medicinske formål.
De enkelte HMO'er vides at have gavnlige helbredsrelaterede virkninger og vides at indvirke på bakterie- og virusinfektioner. Mens de isolerede enkelte HMO'er er gavnlige i sig selv, har kombinationsblandinger af HMO'er, som beskrevet heri, en synergistisk virkning ved behandling af infektioner i sammenligning med de isolerede enkelte bestanddele.
Ét aspekt af opfindelsen angår en blanding, som består af eller i det væsentlige består af 3-FL,
LNFP-I, 2’-FL, LNDFH-I, DFL og eventuelt laktose, indbefattende de tidligere beskrevne foretrukne og mere foretrukne udførelsesformer, eller et præparat, der omfatter blandingen, som består af eller i det væsentlige består af 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL og eventuelt laktose, indbefattende de tidligere beskrevne foretrukne og mere foretrukne udførelsesformer, til anvendelse ved behandling, forebyggelse og/eller lindring af en sygdom og/eller en tilstand — relateret til mikrobiom-ubalance. Alternativt angår ét aspekt af opfindelsen en fremgangsmåde til behandling, forebyggelse og/eller lindring af en sygdom og/eller en tilstand relateret til mikrobiom-ubalance hos et menneske, hvilken fremgangsmåde omfatter administration til mennesket af en blanding, som består af eller i det væsentlige består af 3-FL, LNFP-I, 2'-FL,
LNDFH-I, DFL og eventuelt laktose, eller et præparat, der omfatter blandingen, som består af eller i det væsentlige består af 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL og eventuelt laktose. En blanding af 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I og DFL ifølge den foreliggende opfindelse kan typisk anvendes til modulering af mikrobiomet hos et menneske, f.eks. for at øge bestandsstørrelsen af Bifidobacterium og bestandsstørrelsen af Barnesiella, hvilken modulering reducerer bestandsstørrelsen af Firmicutes, især Clostridia. — Derudover angår et andet aspekt af opfindelsen en blanding, som består af eller i det væsentlige består af 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL og eventuelt laktose, indbefattende de tidligere beskrevne foretrukne og mere foretrukne udførelsesformer, eller et præparat, der omfatter blandingen, som består af eller i det væsentlige består af 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-
I, DFL og eventuelt laktose, indbefattende de tidligere beskrevne foretrukne og mere foretrukne — udførelsesformer, til anvendelse ved behandling af og/eller reduktion af risikoen for en lang række bakterie- eller virusinfektioner hos et menneske. Alternativt angår ét aspekt af opfindelsen en fremgangsmåde til behandling af og/eller reduktion af risikoen for en lang række bakterie- eller virusinfektioner hos et menneske, hvilken fremgangsmåde omfatter administration til mennesket af en blanding, som består af eller i det væsentlige består af 3-FL,
LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL og eventuelt laktose, eller et præparat, der omfatter blandingen,
DK 202300035 U3 32 som bestar af eller i det væsentlige består af 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL og eventuelt laktose. Infektioner kan opstå i flere kropsdele, ikke kun begrænset til tarmmikrobiomet, men også i andre dele af kroppen, som udsættes for det ydre miljø, såsom hud, hår, ører, øjne, næse og åndedrætssystemet. Et eller flere HMO'er i blandingen ifølge den foreliggende — opfindelse kan hæmme adhæsionen af patogene bakterier, såsom Pseudomonas aeruginosa eller Campylobacter jejuni, uropatogene og enteropatogene Escherichia coli, visse Salmonella- arter og/eller det pneumoni-forårsagende patogen Pseudomonas aeruginosa, samt virusser såsom norovirus. Et eller flere HMO'er i blandingen ifølge den foreliggende opfindelse kan også binde sig direkte til patogene toksiner, såsom toksiner fra Clostridium difficile. Et eller flere
HMO'er i blandingen ifølge den foreliggende opfindelse kan fungere som immunsystemmodulator og påvirke tarmsundheden gennem stimulering af bifidobakterier. Et eller flere HMO'er i blandingen ifølge den foreliggende opfindelse kan hæmme væksten af gruppe B-Streptococcus både hos spædbørn og i brystmælk. Gruppe B-Streptococcus er en af de hyppigste årsager til neonatal sepsis, pneumoni og meningitis. Et eller flere HMO'er i — blandingen ifølge den foreliggende opfindelse kan binde sig direkte til shigatoksinerne Stx2 og
Stx1B5 fra Shigella dysenteriae. Et eller flere HMO'er i blandingen ifølge den foreliggende opfindelse har potentiale til at reducere risikoen for infektionssygdomme forårsaget af enten bakterielle eller virale patogener, sandsynligvis som følge af bindingen til bakterielle eksotoksiner. > Derudover angår et andet aspekt af opfindelsen en ikke-medicinsk anvendelse af en blanding, som består af eller i det væsentlige består af 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL og eventuelt laktose, indbefattende de tidligere beskrevne foretrukne og mere foretrukne udførelsesformer, eller et præparat, der omfatter blandingen, som består af eller i det væsentlige består af 3-FL,
LNFP-I, 2’-FL, LNDFH-I, DFL og eventuelt laktose, indbefattende de tidligere beskrevne — foretrukne og mere foretrukne udførelsesformer, til opretholdelse af den kommensale homøostase i tarmmikrobiotaen hos et menneske.
Derudover angår et andet aspekt af opfindelsen en ikke-medicinsk anvendelse af en blanding, som består af eller i det væsentlige består af 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL og eventuelt laktose, indbefattende de tidligere beskrevne foretrukne og mere foretrukne udførelsesformer, eller et præparat, der omfatter blandingen, som består af eller i det væsentlige består af 3-FL,
LNFP-I, 2’-FL, LNDFH-I, DFL og eventuelt laktose, indbefattende de tidligere beskrevne foretrukne og mere foretrukne udførelsesformer, ved ernæringsmæssig behandling af et menneske.
Blanding, som består af eller i det væsentlige består af 3-FL, LNFP-I, 2’-FL, LNDFH-I, DFL og — eventuelt laktose, indbefattende de tidligere beskrevne foretrukne og mere foretrukne
DK 202300035 U3 33 udførelsesformer, forbedrer desuden levedygtigheden af nyttige probiotika i vandige præparater. Det har vist sig, at probiotiske stammer, f.eks. Lactobacillus rhamnosus-stammer, nar de er blandet med HMO'er, har en væsentligt forøget regeneration og levedygtighed, når de kommer i kontakt med et væskemiljø med lav pH, såsom mavesyre eller sure drikkevarer. — Kombinationen af blandingen af HMO'er ifølge den foreliggende opfindelse med probiotiske stammer, fortrinsvis frysetørrede probiotika, kan således både give mulighed for pålidelig tilførsel af en kvantificerbar mængde probiotika til en vært (et menneske eller et dyr), som enten i lægemiddellignende former, i næringspræparater eller i fødevarebaseret form.
Selvom opfindelsen er blevet beskrevet med henvisning til udførelsesformer, vil det være — indlysende, at forskellige modifikationer er mulige inden for omfanget af opfindelsen.
Følgende nummererede aspekter af opfindelsen tilvejebringes: 1. En blanding, som i det væsentlige består af 3-FL som bestanddel A, LNFP-I som bestanddel B, 2'-FL som bestanddel C, LNDFH-I som bestanddel D, DFL som bestanddel E og eventuelt laktose som bestanddel F. 2. Blandingen ifølge aspekt 1, som i det væsentlige består af 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-
I, DFL og laktose, fortrinsvis hvor - bestanddel D er inden for 8-13 mol-% eller inden for 14-22 % vægt/vægt, og/eller - bestanddel E er inden for 9,5-17,5 mol-% eller inden for 11,5-19 % vægt/vægt, og/eller - bestanddelene D+E er inden for 17,5-30,5 mol-% eller inden for 25,5-41 % vægt/vægt, i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set, eller - bestanddel D er inden for 2-22 mol-% eller inden for 5-34 % vægt/vægt, eller - bestanddel E er inden for 7-24 mol-% eller inden for 6-29 % vægt/vægt, i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set, forudsat at bestanddelene D+E er inden for 23,5-33 mol-% eller inden for 30,5-43 % vægt/vægt. 3. Blandingen ifølge aspekt 1 eller 2, hvor - bestanddelene A+B+C er inden for 41,5-67 mol-% eller inden for 41-66 % vægt/vægt, fortrinsvis hvor der er mere til stede af bestanddel B end bestanddel C, eller - bestanddelene A+B+C er inden for 40,5-54,5 mol-% eller inden for 41-54 % vægt/vægt, fortrinsvis hvor bestanddel A er inden for 21-27 mol-%.
DK 202300035 U3 34 4. Blandingen ifalge et hvilket som helst af de foregaende aspekter, hvor - bestanddel A er inden for 19-24,5 mol-% eller inden for 15-20 % vægt/vægt, - bestanddel B er inden for 12,5-15,5 mol-% eller inden for 19-22 % veegt/veegt, - bestanddel C er inden for 7-10 mol-% eller inden for 6-8 % vægt/vægt, - bestanddel D er inden for 11-14 mol-% eller inden for 18-22 % vægtvægt, - bestanddel E er inden for 14,5-17,5 mol-% eller inden for 16-19 % vægt/vægt, og - bestanddel F er inden for 25-30 mol-% eller inden for 15-19 % vægt/vægt. 5. Blandingen ifølge aspekt 1, som i det væsentlige består af 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I og DFL, fortrinsvis hvor - bestanddel D er inden for 10-17,5 mol-% eller inden for 16-25,5 % vægt/vægt, og/eller - bestanddel E er inden for 12-23,5 mol-% eller inden for 13-22 % vægt/vægt, og/eller - bestanddelene D+E er inden for 22-41 mol-% eller inden for 29-47,5 % vægt/vægt, i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set eller - bestanddel D er inden for 3,5-29,5 mol-% eller inden for 6-39 % vægt/vægt, og/eller - bestanddel E er inden for 9-32 mol-% eller inden for 7,5-34,5 % vægt/vægt, i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set, forudsat at bestanddelene D+E er inden for 31,5-41 mol-% eller inden for 36,5-49 % vægt/vægt. 6. Blandingen ifølge aspekt 5, hvor - der er mere til stede af bestanddel B end bestanddel C i blandingen eller - bestanddelene A+B+C er inden for 57-70 mol-% eller inden for 51-64,5 % vægt/vægt, fortrinsvis hvor bestanddel A er inden for 29-35,5 mol-%. 7. Blandingen ifølge aspekt 1, 5 eller 6, hvor - bestanddel A er inden for 29-33 mol-% eller inden for 20-24,5 % vægt/vægt, - bestanddel B er inden for 18-21,5 mol-% eller inden for 23-25,5 % vægt/vægt, - bestanddel C er inden for 10-12,5 mol-% eller inden for 7,5-9,5 % vægt/vægt, - bestanddel D er inden for 15-17,5 mol-% eller inden for 22-25,5 % vægt/vægt,
DK 202300035 U3 35 - bestanddel E er inden for 20,5-23,5 mol-% eller inden for 19,5-22 % vægt/vægt. 8. Præparat, som omfatter blandingen ifølge et hvilket som helst af de foregående aspekter, hvilket præparatfortrinsvis endvidere omfatter et probiotikum, mere fortrinsvis L. rhamnosus, især L. rhamnosus LGG DSM 33156. 9 En fremgangsmåde til opnåelse af præparatet ifølge et hvilket som helst af aspekterne 1-7, hvor fremgangsmåden omfatter omsætning af 3-FL, LNFP-I og 2”-FL i nærværelse af en a1-3/4-transfukosidase for at fremstille en reaktionsblanding og derefter fjernelse af a1-3/4- transfukosidasen og eventuelt laktose fra reaktionsblandingen, fortrinsvis hvor a1-3/4- transfukosidasen omfatter eller består af aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 med — følgende mutationer: W135F-A174N-N274A-E413R. 10. En blanding eller et præparat ifølge et hvilket som helst af aspekterne 1-8 til anvendelse som lægemiddel, fortrinsvis - hvor mikrobiomet hos et menneske moduleres, eller - hvor anvendelsen er behandling og/eller reduktion af risikoen for en lang række bakterie- eller virusinfektioner hos et menneske. 11. En anvendelse af blandingen ifølge et hvilket som helst af aspekterne 1-8 til forbedring af levedygtigheden af probiotika, fortrinsvis L. rhamnosus, mere fortrinsvis L. rhamnosus LGG
DSM 33156, i et vandigt præparat. > EKSEMPLER
Eksempel 1
En opløsning af 3-FL (4,278 kg, assaykorrigeret, 8,76 mol), LNFP-I (3,807 kg, assaykorrigeret, 4,46 mol) og 2'-FL (2,072 kg, assaykorrigeret, 4,24 mol) i vand (17,5 kg) blev overført til en 20- liters fermentor. Opløsningens pH blev justeret til 6,0 med en 7 % HCI-opløsning. Frysetørret — pulver (11,6 g) af W135F-A174N-N274A-E413R-mutanten af Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC15697 (idet aminosyrenummereringen er i overensstemmelse med SEQ ID NO: 1, se WO 2016/063261) blev opløst i vand (100 g) og tilsat til ovennævnte opløsning, derefter blev reaktionsblandingen omrørt ved 25 °C i 18 timer, efterfulgt af opvarmning af den til 55 °C i løbet af 4 timer, og omrøringen blev fortsat ved denne temperatur i 2 timer. Blandingens pH blev — efterfølgende indstillet til 5,0 med en 7 % HCI-opløsning, og blandingen blev opvarmet til 70 °C i løbet af 1 time og holdt ved denne temperatur i 2 timer. Blandingen fik derefter lov at køle af til 15 °C, mens enzymet blev udfældet. Den opnåede suspension blev derefter ultrafiltreret (15 kDa keramisk membran, 0,5 m?, transmembrantryk: 5,8-5,9 bar, temperatur: 19-24 °C), og
DK 202300035 U3 36 28,05 kg permeat blev indsamlet. Permeatet blev mikrofiltreret (0,2 um PES-membran) og frysetørret til opnåelse af 10,57 g pulver (sakkarider ved HPLC: 95 % vægt/vægt, hvoraf 3-FL er 16 % vægt/vægt, LNFP-I er 19 % vægt/vægt, 2'-FL er 7 % vægt/vægt, LNDFH-I er 18 % vægt/vægt, DFL er 17 % vægt/vægt, og laktose er 18 % vægt/vægt; proteinindhold ved — Bradford-test: < 6 ppm).
Eksempel 2 overensstemmelse med den i eksempel 1 beskrevne protokol blev der opnået følgende præparater ved forskellige donor-acceptor-forhold: relativt molforhold
LNFP-I LNFP-I LNDFH- 052 99 4023 0,16 0,15 |0,14| 0,26 052 |—248 4023 0,12 | 0,10 0,19| 0,27 050 95 — 1Jo21 0,13 0,11 |0,16| 0,30 076 92 dos 0,05 |0,02 0,10| 0,19 0,26 0,04| 0,28 |0,24| 0,10 |0,13| 0,21
Eksempel 3 — Opløsninger af lyofiliseret Lactobacillus rhamnosus (Probio-Tec® LGG®, Chr. Hansen, deponeret i kultursamlingen DSMZ under accessionsnummeret DSM 33156, 0,4 mg/ml) og
HMO'er (henholdsvis 2'-FL, 2'-FL/DFL i vægtforholdet 6,1:1 og HMO-blandingen fra eksempel 1, 5 % vægt/vol.) i steril fosfatbufret saltvandsopløsning (PBS, pH = 3) blev opvarmet til 37 °C og blandet kraftigt i ca. 30 s, indtil der ikke var nogen synlige klumper tilbage. Kontrollen — indeholdt kun probiotikummet. Rørene blev inkuberet ved 37 °C i 3 h. Prøverne blev fortyndet yderligere, og 100 ul blev spredt ud i to eksemplarer på MRS-agarplader, som blev inkuberet i 48 h ved 37 °C i anaerobe kamre. Resultaterne er udtrykt som gennemsnitsværdier med
DK 202300035 U3 37 standardafvigelse af kolonidannende enheder (CFU) pr. milliliter beregnet ud fra LGG-kolonier pa agarplader (figur 1).
Frysetørret LGG opløst med HMO-blanding ifølge opfindelsen udviste stærkt signifikant forbedret regeneration og overlevelsesevne i sammenligning med kontrol eller nogle af — bestanddelene af HMO-blandingen efter 3 h inkubation ved 37 °C under sure betingelser med pH 3,0 som vurderet ved kolonitælling. Dataene tyder på, at den reducerede regeneration og levedygtighed af L. rhamnosus efter eksponering for betingelser med lav pH, f.eks. i mavesækken eller i en sur drikkevare, kan forhindres ved tilstedeværelse af HMO'er.

Claims (19)

DK 202300035 U3 38 PATENTKRAV
1. Blanding, som omfatter, i det væsentlige består af eller består af 3-FL som bestanddel A, LNFP-I som bestanddel B, 2’-FL som bestanddel C, LNDFH-I som bestanddel D, DFL som bestanddel E og eventuelt laktose som bestanddel F.
2. Blanding ifølge krav 1, som omfatter, i det væsentlige består af eller består af 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I, DFL og laktose.
3. Blanding ifølge krav 1 eller 2, hvor - bestanddel D er 8-13 mol-% eller 14-22 % vægt/vægt, og/eller - bestanddel E er 9,5-17,5 mol-% eller 11,5-19 % vægt/vægt, og/eller - bestanddelene D+E er 17,5-30,5 mol-% eller 25,5-41 % vægt/vægt, i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set.
4. Blanding ifølge krav 1 eller 2, hvor - bestanddel D er 2-22 mol-% eller 5-34 % vægt/vægt, eller - bestanddel E er 7-24 mol-% eller 6-29 % vægt/vægt, i forhold til bestanddelene A, B, C, D, E og F samlet set, forudsat at bestanddelene D+E er 23,5-33 mol-% eller 30,5-43 % vægt/vægt.
5, Blanding ifølge krav 3, hvor bestanddelene A+B+C er inden for 41,5-67 mol-% eller inden for 41-66 % vægt/vægt, fortrinsvis hvor der er mere til stede af bestanddel B end bestanddel C.
6. Blanding ifølge krav 4, hvor bestanddelene A+B+C er inden for 40,5-54,5 mol-% eller inden for 41-54 % vægt/vægt, fortrinsvis hvor bestanddel A er inden for 21-27 mol-%.
7. Blanding ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor - bestanddel A er 19-24,5 mol-% eller 15-20 % vægt/vægt, - bestanddel B er 12,5-15,5 mol-% eller 19-22 % vægt/vægt, - bestanddel C er 7-10 mol-% eller 6-8 % vægt/vægt, - bestanddel D er 11-14 mol-% eller 18-22 % vægt/vægt, - bestanddel E er 14,5-17,5 mol-% eller 16-19 % vægt/vægt, og - bestanddel F er 25-30 mol-% eller 15-19 % vægt/vægt.
DK 202300035 U3 39
8. Blanding ifølge krav 1, som omfatter, i det væsentlige består af eller består af 3-FL, LNFP-I, 2'-FL, LNDFH-I og DFL.
9. Blanding ifølge krav 1 eller 8, hvor - bestanddel D er 10-17,5 mol-% eller 16-25,5 % vægt/vægt, og/eller - bestanddel E er 12-23,5 mol-% eller 13-22 % vægt/vægt, og/eller - bestanddelene D+E er 22-41 mol-% eller 29-47,5 % vægt/vægt, i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set.
10. Blanding ifølge krav 1 eller 8, hvor - bestanddel D er 3,5-29,5 mol-% eller 6-39 % vægt/vægt, og/eller - bestanddel E er 9-32 mol-% eller 7,5-34,5 % vægt/vægt, i forhold til bestanddelene A, B, C, D og E samlet set, forudsat at bestanddelene D+E er 31,5-41 mol-% eller 36,5-49 % vægt/vægt.
11. Blanding ifølge krav 9, hvor der er mere til stede af bestanddel B end bestanddel Ci blandingen.
12. Blanding ifølge krav 10, hvor bestanddelene A+B+C er inden for 57-70 mol-% eller inden for 51-64,5 % vægt/vægt, fortrinsvis hvor bestanddel A er inden for 29-35,5 mol-%.
13. Blanding ifølge et hvilket som helst af kravene 1 og 8-12, hvor - bestanddel A er 29-33 mol-% eller 20-24,5 % vægt/vægt, - bestanddel B er 18-21,5 mol-% eller 23-25,5 % vægt/vægt, - bestanddel C er 10-12,5 mol-% eller 7,5-9,5 % vægt/vægt, - bestanddel D er 15-17,5 mol-% eller 22-25,5 % vægtvægt, - bestanddel E er 20,5-23,5 mol-% eller 19,5-22 % vægt/vægt.
14. Præparat, som omfatter blandingen ifølge et hvilket som helst af de foregående krav.
15. Præparat ifølge krav 14, som endvidere omfatter et probiotikum, fortrinsvis L. rhamnosus, mere fortrinsvis L. rhamnosus LGG DSM 33156.
16. Præparat ifølge krav 14 eller 15, som er et næringspræparat, farmaceutisk præparat eller kosmetisk præparat.
17. Blanding ifølge et hvilket som helst af kravene 1-13, som er opnået ved eller kan opnås ved en fremgangsmåde, der omfatter omsætning af 3-FL, LNFP-I og 2'-FL i nærværelse af en
DK 202300035 U3 40 a1-3/4-transfukosidase for at fremstille en reaktionsblanding og derefter fjernelse af a1-3/4- transfukosidasen og eventuelt laktose fra reaktionsblandingen.
18. Blanding ifølge krav 17, hvor a1-3/4-transfukosidasen omfatter eller består af aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 med følgende mutationer: W135F-A174N-N274A- E413R.
19. Blanding ifølge krav 17 eller 18, hvor fremgangsmåden udføres under i det væsentlige bufferfrie betingelser.
DKBA202300035U 2022-06-20 2023-06-20 Blanding af fukosylerede HMO'er DK202300035U3 (da)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA202200588A DK202200588A1 (en) 2022-06-20 2022-06-20 Mixture of fucosylated HMOs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DK202300035U3 true DK202300035U3 (da) 2023-09-22
DK202300035U9 DK202300035U9 (da) 2024-07-05

Family

ID=87059739

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DKPA202200588A DK202200588A1 (en) 2022-06-20 2022-06-20 Mixture of fucosylated HMOs
DKBA202300035U DK202300035U3 (da) 2022-06-20 2023-06-20 Blanding af fukosylerede HMO'er

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DKPA202200588A DK202200588A1 (en) 2022-06-20 2022-06-20 Mixture of fucosylated HMOs

Country Status (9)

Country Link
EP (4) EP4539678A1 (da)
KR (1) KR20250024846A (da)
CN (1) CN119403457A (da)
AU (1) AU2023286780A1 (da)
DE (1) DE202023103382U1 (da)
DK (2) DK202200588A1 (da)
ES (1) ES1317021Y (da)
FR (1) FR3136650B3 (da)
WO (4) WO2023247483A1 (da)

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2796082B1 (fr) 1999-07-07 2003-06-27 Centre Nat Rech Scient Procede de production d'oligosaccharides
CN101415834B (zh) 2006-03-09 2014-09-24 国家科学研究中心 生产涎化低聚糖的方法
EP2069520A4 (en) 2006-09-15 2010-05-05 Univ California GENESQUES FROM BIFIDOBACTERIA AND THEIR USE
CA2805499A1 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Glycom A/S Derivatization of oligosaccharides
US9453230B2 (en) 2011-02-16 2016-09-27 Glycosyn LLC Biosynthesis of human milk oligosaccharides in engineered bacteria
US20140057868A1 (en) 2011-02-21 2014-02-27 Glycom A/S Catalytic hydrogenolysis of a composition of a mixture of oligosaccharide precursors and uses thereof
US20140228554A1 (en) 2011-03-18 2014-08-14 Glycom A/S Synthesis of new fucose-containing carbohydrate derivatives
WO2012156897A1 (en) * 2011-05-13 2012-11-22 Glycom A/S METHOD FOR GENERATING HUMAN MILK OLIGOSACCHARIDES (HMOs) OR PRECURSORS THEREOF
BR112013029203A2 (pt) 2011-05-13 2016-08-09 Glycom As método para a preparação de um ou mais oligossacarídeos de leite humano, e, uso de oligossacarídeos de leite humano
EP2707379A4 (en) * 2011-05-13 2014-10-08 Glycosyn LLC USE OF PURIFIED 2'-FUCOSYLLACTOSIS, 3-FUCOSYLLACTOSIS AND LACTODIFUCOTETRAOSE AS PREBIOTICS
WO2013154725A1 (en) 2012-04-13 2013-10-17 Trustees Of Boston College Prebiotic compositions and methods of use
CA2960835A1 (en) 2014-09-09 2016-03-17 Glycosyn LLC Alpha (1,3) fucosyltransferases for use in the production of fucosylated oligosaccharides
US10314852B2 (en) * 2014-10-24 2019-06-11 Glycom A/S Mixtures of HMOs
US10415021B2 (en) * 2014-10-24 2019-09-17 Glycom A/S Mutated fucosidase
EP3425052A1 (en) 2017-07-07 2019-01-09 Jennewein Biotechnologie GmbH Fucosyltransferases and their use in producing fucosylated oligosaccharides
AU2018305183A1 (en) 2017-07-26 2020-02-13 Chr. Hansen HMO GmbH Sialyltransferases and their use in producing sialylated oligosaccharides
US20220282262A1 (en) 2018-12-04 2022-09-08 Glycom A/S Synthesis of the fucosylated oligosaccharide lnfp-v
EP3848471A1 (en) 2020-01-10 2021-07-14 Chr. Hansen HMO GmbH Sequential fermentative production of oligosaccharides
CN116171329A (zh) * 2020-08-10 2023-05-26 因比奥斯公司 通过细胞培养或微生物发酵产生的寡糖溶液的纯化方法
CN116234919A (zh) 2020-08-10 2023-06-06 因比奥斯公司 借由细胞制造中性岩藻糖基化寡糖的混合物
CN112189850A (zh) * 2020-09-17 2021-01-08 合生元（广州）健康产品有限公司 益生元在促进胃肠道中益生菌存活的应用
DK181242B1 (en) 2021-05-17 2023-05-30 Dsm Ip Assets Bv GENETICALLY ENGINEERED CELLS COMPRISING A RECOMBINANT NUCLEIC ACID SEQUNCE ENCODING AN α-1,2-FUCOSYLTRANSFERASE CAPABLE OF PRODUCING LNFP-I, NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING SAME AND METHODS FOR USE OF SAME

Also Published As

Publication number Publication date
FR3136650A3 (fr) 2023-12-22
WO2023247577A1 (en) 2023-12-28
DE202023103382U1 (de) 2023-11-29
EP4539678A1 (en) 2025-04-23
EP4539681A1 (en) 2025-04-23
WO2023247483A1 (en) 2023-12-28
ES1317021U (es) 2025-04-10
KR20250024846A (ko) 2025-02-19
WO2023247578A1 (en) 2023-12-28
AU2023286780A1 (en) 2025-01-02
WO2023247579A1 (en) 2023-12-28
DK202300035U9 (da) 2024-07-05
ES1317021Y (es) 2025-07-01
FR3136650B3 (fr) 2024-06-28
EP4539680A1 (en) 2025-04-23
CN119403457A (zh) 2025-02-07
DK202200588A1 (en) 2024-02-23
EP4539679A1 (en) 2025-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2707570C1 (ru) Композиции для применения в профилактике или лечении инфекций вдп у подверженных риску детей грудного возраста или детей младшего возраста
US11432578B2 (en) Mixture of HMOs
EP3264923B1 (en) Compositions for use in the prevention or treatment of gastrointestinal infections in infants or young children
AU2022203298B2 (en) Nutritional compositions and infant formulas comprising a mix of oligosaccharides and optionally bifidobacterium lactis for preventing, treating or reducing the severity of non-rota virus-associated diarrhoea
TW200936147A (en) Prevention and treatment of secondary infections following viral infection
US10864224B2 (en) Synthetic composition for treating antibiotic associated complications
WO2015071402A1 (en) Compositions for use in the prevention or treatment of necrotizing enterocolitis in infants and young children
KR20250058077A (ko) 밀 민감증을 치료하기 위한 hmo 혼합물
DK202300035U3 (da) Blanding af fukosylerede HMO&#39;er
EP4634377A1 (en) Mutated lacto-n-biosidase
RU2772955C2 (ru) Смесь олигосахаридов человеческого грудного молока
HK40101334A (en) Compositions for use in the prevention or treatment of gastrointestinal infections in infants or young children
JP2024179871A (ja) ビフィズス菌増殖促進剤、ならびにこれを含む食品および医薬品

Legal Events

Date Code Title Description
UME Utility model registered

Effective date: 20230922