DE69928121T2 - Verwendungen von sulfatierten fuko-oligosacchariden zum pflanzenschutz - Google Patents

Description

• Die Erfindung beschreibt Endofukanasen, die zur Herstellung von Fuko-Oligosacchariden durch emzymatische Hydrolyse von Fukanen geeignet sind.
• Sie beschreibt außerdem ein Endofukanasen produzierendes Bakterium und die Herstellung dieses Enzyms durch dieses Bakterium.
• Des weiteren betrifft sie Endofukanase-Gene.
• Schließlich betrifft sie die Verwendung der Fuko-Oligosaccharide zum Pflanzenschutz.
• Fukane sind Polysaccharide, die aus α-L-Fukose-Einheiten bestehen.
• Sie können aus den Zellwänden von Braunalgen extrahiert werden.
• Sie können ebenso aus Echinodermen extrahiert werden.
• Durch saure Hydrolyse oder radikale Hydrolyse wurden bereits Oligosaccharidfraktionen, ausgehend von Fukanen, hergestellt.
• Es wurden verschiedene biologische Aktivitäten, teils betreffend die Fukane, teils betreffend bestimmte Fraktionen mit niedrigerem Molekulargewicht, untersucht.
• Aus den Japanischen Patentzusammenfassungen Vol. 95, Nr. 6, 31. Juli 1995, und JP 07 059563 A (TOUSA KOGAKU KENKYUSHO), 7. März 1995, sind bereits ein gereinigtes Fukoidan abbauendes Enzym und ein Extrakt aus der Tierart Echinoidea bekannt.
• Das Patent US-A-5 588 254 beschreibt das Abbauprodukt von Fukoidan durch eine Säure oder ein Enzym als ein Oligosaccharid mit einem Polymerisationsgrad von 2 bis 10, wobei das Oligosaccharid die Eigenschaft besitzt, das Wachstum von Pflanzen zu beschleunigen.
• Die Japanischen Patentzusammenfassungen Vol. 95, Nr. 11, 26. Dezember 1995, und JP 07 215990 A beschreiben eine Zusammensetzung, enthaltend ein Fukoidan-Oligosaccharid mit niedrigem Molekulargewicht (unter 5.000, das heißt, enthaltend 26 sulfatierte Fukoseeinheiten), wobei dieses Oligosaccharid eine ausgezeichnete Löslichkeit/Absorptionsfähigkeit im lebenden Organismus aufweist und die biologischen Aktivitäten von Fukoidan bewahrt; dieses Fukoidan mit geringem Molekulargewicht wird durch saure Hydrolyse von natürlichem Fukoidan erhalten.
• Die Erfindung bezieht sich auf bestimmte Fuko-Oligosaccharide, ein Enzym für ihre Herstellung und ihre Verwendungen im Bereich des Pflanzenschutzes.
• Die betreffenden Fuko-Oligosaccharide sind sulfatiert und haben einen Polymerisationsgrad von 4 bis 100, bevorzugt von 4 bis 20 α-L-Fukose-Einheiten; zwei von ihnen sind durch die in 1 dargestellten Strukturformeln I und II charakterisiert.
• Erfindungsgemäß werden sie durch enzymatische Hydrolyse, ausgehend von Fukanen, durch Einwirkung von Endofukanasen, das heißt, Enzymen, die von der Gesellschaft der Anmelderin isoliert wurden, hergestellt.
• Diese Enzyme werden durch einen bakteriellen Stamm mit fukanolytischer Aktivität sekretiert, welche die Gesellschaft der Anmelderin, ausgehend von Industrieschlämmen, die für die Behandlung von Abwässern, die reich an sulfatierten Fukanen sind, verwendet werden, in einer Alginat-Extraktionsanlage erhalten hat.
• Dazu wird folgendermaßen verfahren.
• Schlämme, die Oxidationsbecken entnommen und in einer Reinigungsstufe stromabwärts einer Alginat-Extraktionsanlage einer Klärung unterzogen wurden, werden als Inokulum für ein Mangelmedium auf Grundlage von filtriertem Meerwasser, welches 2 g/l Fukan enthält, verwendet.
• Anhand von Aliquots des so zusammengesetzten Kulturmediums wird jeden Tag der so genannte "Kälberserum-Albumin (BSA)-Test" durchgeführt.
• Das Prinzip dieses Tests basiert darauf, dass sich die anionischen Polysaccharide in saurem Milieu mit positiv geladenem Albumin verbinden und somit eine Ausfällung der gesamten gebildeten Komplexe hervorrufen.
• Im Gegensatz dazu werden die Oligosaccharide und die Osen nicht ausgefällt oder ausgeflockt, da sie zu geringe Molekulargewichte besitzen, um zur Bildung von unlöslichen Komplexen beitragen zu können.
• Im Verlauf dieses BSA-Tests werden 600 μl Kulturüberstand in ein 1-ml-Mikroröhrchen eingeführt und zentrifugiert.
• Der Überstand (etwa 500 μl) wird in ein weiteres Röhrchen überführt und mit 2 ml saurer BSA-Lösung, bestehend aus 3,26 g Natriumacetat, 4,56 ml Eisessigsäure und 1 g BSA in 1 l destilliertem Wasser, wobei der pH-Wert 3,72 bis 3,78 beträgt, gemischt.
• Parallel wird eine Kontrolle, der aus 500 μl Kulturüberstand ohne Inokulum besteht, behandelt.
• Entsprechend den obigen Ausführungen zeigt die Entstehung einer Trübung, die identisch zu der ist, die in der Kontrolle entsteht, dass diese nicht vom Abbau des Polymeren herrührt; im Gegensatz dazu wird in dem Fall, in dem die Trübung geringer ist oder nicht vorliegt, auf die Anwesenheit einer Fukan-spezifischen enzymatischen Aktivität in der bakteriellen Kultur geschlossen.
• Der Test fällt am Ende von 7 Inkubationstagen des Fukans in Gegenwart des oben beschriebenen Inokulums positiv aus.
• Ein Aliquot des entsprechenden Kulturmediums wird dann auf einer Petrischale, enthaltend das unter der Bezeichnung Zobell-Fukan bekannte Medium, welches aus dem Zobell-Medium (1941), versetzt mit 2 g/l Fukan und verfestigt durch 15 g/l Agar, besteht, verteilt.
• Das Zobell-Medium [Zobell CE (1941) "Studies on marine bacteria. I. The cultural requirements of heterotrophic aerobes" erschienen in J. Mar. Res., 4: 41-75] ist folgendermaßen zusammengesetzt:

  Bacto-Pepton Difco	5,0 g
  Difco-Hefeextrakt	1,0 g
  filtriertes Meerwrasser	800 ml
  destilliertes Wasser q.s.p.	1 l

• Es wird die Bildung einer bestimmten Anzahl verschiedener Kolonien in der Petrischale festgestellt, die den jeweiligen Stämmen entsprechen.
• Jede dieser Kolonien, anders ausgedrückt, jeder dieser Stämme, wird ausgehend von diesem Medium isoliert und in ein Zobell-Fukan-Flüssigmedium, bestehend aus 1/2 Volumen Zobell und 1/2 Volumen einer 4g/l-Fukanlösung in filtriertem Meerwasser, eingeführt.
• An jedem dieser derart isolierten und in das Zobell-Fukan-Medium eingeführten Stämme wird der BSA-Test durchgeführt, um fukanolytische Stämme nachzuweisen.
• Wenn der Test positiv ausfällt, wird der Stamm wieder auf Zobell-Fukan-Medium übertragen, um zu verifizieren, dass er die Hydrolyse der Fukane des neuen Mediums fortsetzt; wenn dies der Fall ist, bedeutet das, dass die gesamte genetische Ausstattung, die für die Herstellung der Fukanasen notwendig ist, vorliegt; man sagt dann, dass der Stamm durch das Substrat induziert wird; anders ausgedrückt, induziert die Gegenwart von Fukanen in dem Medium die Produktion der Enzyme durch den Stamm. Aus diesem Grund wird der BSA-Test nochmals an der neuen Kultur durchgeführt.
• Indem wie oben beschrieben verfahren wurde, wurde ein Stamm isoliert, der als SW5 bezeichnet wurde; dieser ergibt nach 3 bis 4 Tagen einen positiven BSA-Test, wenn er auf Zobell-Fukan-Medium kultiviert wird.
• Der oben bezeichnete Stamm SW5, der auf die beschriebene Weise selektioniert wurde, wurde unter der Nr. 12171 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt.
• Der Stamm ist als Stäbchen Gram-negativ, streng aerob, chemoorganotroph und heterotroph. Am Ende der dreitägigen Kultur sind die Kolonien auf festem Zobell-Fukan-Medium klein (1 mm Durchmesser) und orangefarben pigmentiert. Der Stamm SW5 benötigt Meerwrasser für sein Wachstum, wobei die optimale Wachstumstemperatur bei etwa 18–20°C liegt. Unter 15°C und über 25°C wird kein Wachstum festgestellt. Weitere phänotypische Eigenschaften des Stammes SW5 sind in der folgenden Tabelle I wiedergegeben.
• Tabelle I Physiologische und biologische Eigenschaften des Stammes SW5

  
• Die philogenetischen Beziehungen vom Stamm SW5 wurden durch die Nukleotidsequenz ID No. 1 des die 16S-RNA kodierenden Gens festgelegt.
• Der Vergleich dieser Gensequenz mit den homologen Genen aus den Bakterien der Gruppe CFB (Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides) ermöglicht die Konstruktion eines philogenetischen Stammbaums mit dem Ergebnis, dass der Stamm zur Familie der Flavobacteriaceae (Bernadet et al., 1996, International Journal of Syste matic Bacteriology, Jan: 128-148) gehört und nahe verwandt ist mit Gelidibacter algens (Bowman et al., 1997, International Journal of Systematic Bacteriology, July: 670-677), einem aus dem antarktischen Eis isolierten Stamm.
• Daraus ergibt sich, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Fuko-Oligosaccharide dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Substrat, bestehend aus einem ersten Stoff auf Basis von Fukanen einer enzymatischen Hydrolyse mit Hilfe eines fukanolytischen Enzyms oder einer Endofukanase unterworfen wird, das/die ausgehend von einem bakteriellen Stamm, welcher unter der Nr. 12171 in der Stammsammlung DSMZ hinterlegt ist, erhältlich ist/sind bzw. erhalten werden kann/können.
• Das Bakterium SW5 sekretiert in sein Kulturmedium signifikante Mengen an Fukanase-Aktivität, die bei Umgebungstemperatur in gepuffertem Medium mit pH 7,5 und sogar in Wasser verwendet werden können.
• Die Herstellung des Substrats, bzw. der Fukane, welche der Wirkung der enzymatischen Aktivität unterworfen werden sollen, wird folgendermaßen durchgeführt.
• 150 kg der Braunalge Pelvetia canaliculata werden unter Verwendung einer als Comitrol 2100 bezeichneten Vorrichtung, die durch die Gesellschaft Urschel vertrieben wird, zerkleinert, um Fragmente von 2,5–3 mm zu erhalten.
• Diese Fragmente werden mit 800 l 0,01 N Salzsäure, enthaltend 4 Gew.-% CaCl₂, unter Rühren über 3 Stunden bei 70°C extrahiert.
• Die Suspension der so behandelten Algenfragmente wird nach 2,5 Stunden dekantiert und der erhaltene Rückstand zentrifugiert; der Überstand des Zentrifugationsvorgangs wird einer tangentialen Ultrafiltration auf 50-kDa-Membranen unterworfen. Der am Ende dieser tangentialen Ultrafiltration erhaltene Rückstand wird mit Hilfe einer als "Miro" bezeichneten Vorrichtung, vertrieben durch die Gesellschaft Minor Production, zerstäubt.
• Das Ergebnis dieser Zerstäubung ist ein Pulver, welches hauptsächlich aus Fukanen besteht.
• Dieses Pulver wird einer zusätzlichen Aufreinigung durch Wiedereinbringen in Lösung, Zentrifugation, Ausfällen des Überstands mit Ethanol, Lösen des Niederschlags in Wasser und tangentiale Ultrafiltration der wässrigen Lösung auf 30.000-Da-Membranen unterzogen.
• Das aus dieser Ultrafiltration stammende Retentat wird einer Lyophilisation unterworfen und bildet das gesuchte Substrat, welches als FS28EtOH bezeichnet wird.
• Dieses Substrat, bzw. dieses Fukanpulver, wird enzymatischer Aktivität, die ausgehend von dem Bakterium SW5 erhalten wird, ausgesetzt.
• Dazu wird eine 1-g/l-Lösung des Substrats FS28EtON in Tris-Puffer (20 mM, pH 7,5) hergestellt; 50 μl dieser Lösung werden entnommen und mit 10 μl der zu testenden Proteinfraktion, welche die enzymatische Aktivität, die ausgehend von dem Bakterium SW5 erhalten wurde, enthält, gemischt.
• Die Mischung wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gehalten.
• Das am Ende erhaltene Hydrolysat enthält die betreffende Fuko-Oligosaccharid-Mischung.
• Dieses Hydrolysat wird einer Elektrophorese unterzogen, um die Gegenwart von Oligosaccharid-Fraktionen qualitativ nachzuweisen; diese Elektrophorese wird auf Polyacrylamid-Gel unter Verwendung der als C-PAGE bezeichneten Technik, welche durch Zablackis E. und Perez J. (1990) in dem Artikel "A partially pyruvated carrageenan from Hawaiin Grateloupia filcina (Cryptonemiales, Rhodophyta), erschienen in "Bot. Mar." 33: 273-276, beschrieben ist, durchgeführt.
• Die Abbauprofile der erhaltenen Fukane, die mit Hilfe des durch das Bakterium SW5 produzierten Enzyms erhalten wurden, zeigen, dass die enzymatische Aktivität des betreffenden Stammes vom endolytischen Typ ist; im Verlauf der Untersuchungen stellte sich heraus, dass die Fukane Strukturelemente aufweisen, die denen der Braunalge ähneln, aus denen sie extrahiert wurden.
• Die Endofukanase-Aktivität des Stammes SW5 wurde elektrophoretisch bis zur Homogenität aufgereinigt; dabei wurde bestimmt, dass das betreffende Protein eine Molekularmasse von etwa 105 kDa aufweist.
• Somit handelt es sich bei drei internen Peptiden um Mikrosequenzen.
• Auf diese Weise wurden die Mikrosequenzen ID No. 2, ID No. 3 und ID No. 4 erhalten.
• Die Erfindung betrifft ebenso Endofukanasen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie Sequenzen enthalten, die analog zu den Peptiden ID No. 2, ID No. 3, ID No.4 und/oder ID No.6 sind, sowie Endofukanase-Gene, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie Sequenzen enthalten, die analog zu der Nukleotidsequenz ID No. 5 sind.
• Die Aufreinigung der oben erwähnten Endofukanase-Aktivität wird mit Hilfe eines Systems, welches kommerziell unter der Bezeichnung FPLC^® von der Gesell schaft Pharmacia vertrieben wird, durchgeführt; dieses System wird bei 4°C gehalten.
• Nach fünf Tagen Kultivierung des Stammes SW5 in 6 l Zobell-Fukan-Medium wird eine Mikrofiltation auf einer Vorrichtung des Typs Pellicon der Gesellschaft Millipore, ausgestattet mit einer 0,45-μm-Kassette (Millipore), und anschließend eine tangentiale Ultrafiltration auf einer PTGC-Kassette von 30.000 Da durchgeführt.
• Für die Fraktionierung der Proteine wird folgendermaßen verfahren:
  Für die erste Fraktionierung von 0 bis 40% wird der Proteinlösung schrittweise 242 g/l (NHa)₂SO₄ unter langsamem Rühren bei 4°C zugegeben. Nachdem das gesamte Ammoniumsulfat gelöst ist, wird die Lösung zentrifugiert; der Rückstand, der die Fraktion zwischen 0 und 40% darstellt, wird nicht aufgehoben, während der Überstand einer erneuten Fraktionierung von 40 bis 60% unterworfen wird. Diese Fraktionierung wird durch schrittweise Zugabe von 130 g/l (NH₄)₂SO₄ unter langsamem Rühren bei 4°C bewirkt. Nachdem die Kristalle gelöst sind, wird die Lösung zentrifugiert; der Rückstand, der die Proteinfraktion zwischen 40- und 60-%iger Sättigung mit Ammoniumsulfat darstellt, wird aufbewahrt und in 20 mM Tris-Puffer, pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂ wieder gelöst.
• Die Fraktion zwischen 40- und 60%iger Ammoniumsulfatsättigung wird 20-fach in 20 mM Tris-Puffer pH 7,5 verdünnt und wieder mit 40% (NH₄)₂SO₄ gesättigt.
• Die so erhaltene Probe wird auf eine Chromatographie-Säule mit hydrophober Wechselwirkung auf Phenyl-Sepharose-Basis, CL4B Pharmacia, in einer Menge von 1 ml/Min. aufgetragen.
• Die Säule wurde zuvor mit Tris-Puffer pH 7,5, 40% (NH₄)₂SO₄, äquilibriert. Der Gradient stellt sich durch Abnahme der (NHa)₂SO₄-Konzentration von 1,8 M (40%) auf 0 M in Tris-Puffer durch drei Säulenvolumina und anschließend durch zwei Puffervolumina ohne (NH₄)₂SO₄ ein.
• Jede Proteinfraktion wird zur Hydrolyse des Fukans FS28EtOH verwendet. Das Hydrolysat wird wie zuvor beschrieben durch Zugabe der bezeichneten Fraktion zu einer 1-g/l-Fukan-Lösung in 20 mM Tris-Puffer pH 7,5, enthaltend die genannten Salze, hergestellt. Das Hydrolysat wird dann durch C-PAGE-Technik getestet. Die als "positiv auf C-PAGE" bezeichneten Fraktionen sind diejenigen, die ein elektrophoretisches Profil, enthaltend Oligofukosaccharid-Fraktionen, erzeugen.
• Die Fraktionen, die ein positives Abbauprofil auf Polyacrylamid-Gel erzeugen, werden vereinigt und 5-fach in 20 mM Tris-Puffer pH 7,5, 5 mM NaCl, verdünnt, be vor sie auf eine Anionenaustausch-Chromatographie-Säule, beladen mit DEAE-Sepharose CL6B, vertrieben durch die Gesellschaft Pharmacia, aufgetragen werden.
• Die Proteine werden durch einen NaCl-Gradienten von 5 mM bis 1 M durch 3 Säulenvolumina mit 1 ml/Min. eluiert.
• Diese Fraktionen werden anschließend in einer Menge von 100 μl auf eine mit Superdex200-Gel beladene Filtrationssäule, kommerziell vertrieben von der Gesellschaft Pharmacia, die zuvor mit 0,5 ml/min in 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0, 150 mM NaCl, äquilibriert wurde, aufgetragen.
• Die durch C-PAGE-Technik identifizierte, aktive Fraktion wird aufgefangen und die Reinheit des Proteins auf 12,5-%igem SDS-Gel unter Verwendung der Phast-System^®-Vorrichtung der Gesellschaft Pharmacia bestimmt. Die verwendeten molekularen Marker sind Standards von 14,5 bis 200 kDa, vertrieben unter der Bezeichnung "Broad-Range" durch die Gesellschaft Biorad.
• Ausgehend von den Protein-Mikrosequenzen SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4 wurden Oligonukleotide synthetisiert; diese Oligonukleotide wurden als "Primer" verwendet, um durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ein Genfragment zu synthetisieren, welches die Fukanase kodiert, wobei die aus dem Stamm SW5 aufgereinigte DNA als Matrize für die Reaktion diente.
• Die spezifischen PCR-Produkte der Primerpaare wurden sequenziert.
• Eines von ihnen stellt die Nukleotidsequenz SEQ ID No. 5 dar.
• Die daraus abgeleitete Proteinsequenz mit einer Länge von 67 Aminosäuren enthält die Mikrosequenzen SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4, was zeigt, dass es sich um ein Fragment der Fukanase des Stammes SW5 handelt.
• Die Nukleotidsequenz SEQ ID No. 5 ist somit ein Teil des Gens, mit einer Länge von 203 Nukleotiden, welches die Fukanase des Stammes SW5 kodiert.
• Zur Herstellung von Fuko-Oligosacchariden können verschiedene Verfahren angewendet werden, von denen zwei im Folgenden beschrieben werden.
• In einem ersten Verfahren lässt man das Enzym bis zum vollständigen Verbrauch des Substrats einwirken; es wird 24 Stunden ein Fukoidan von Pelvetia canaliculata in Gegenwart des teilweise aufgereinigten Enzyms inkubiert; anschließend werden die Hydrolyseprodukte auf einer 500-Da-Membran einer Ultrafiltration unterzogen. Auf diese Weise wird eine als I27 bezeichnete Fraktion erhalten.
• Aus praktischen Gründen wird ein Fukan-Extrakt von Pelvetia canaliculata (Fraktion FS28EtOH) bei Raumtemperatur 24 Stunden hydrolysiert, indem zu 1 l des Substrats mit einer Konzentration von 5 g/l in 20 mM Tris-Puffer pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂, eine Menge von 30 ml des Enzympräzipitats in 40–60% Ammoniumsulfat (3,02 mg Protein) zugegeben wird.
• Das so erhaltene Hydrolysat wird mit destilliertem Wasser auf 20 l aufgefüllt, anschließend auf einem tangentialen Ultrafiltrationssystem von 10.000 Da unter Verwendung einer 0,46-m²-Kassette PTGC der Gesellschaft Millipore mit einem Eingangsdruck von 6,5 bar und einem Ausgangsdruck von 5,5 bar einer Ultrafiltration unterzogen.
• Das so erhaltene Ultrafiltrat wird gesammelt und erneut einer Ultrafiltration auf 500 Da unter Verwendung einer Vorrichtung, kommerziell vertrieben unter der Marke Omega Centraset OM500DC05 von der Gesellschaft Pall Filtron, mit einem Druck von 1 bar am Eingang des Kreislaufs und 0 bar am Ausgang, unterzogen, wobei diese erneute tangentiale Ultrafiltration dazu dient, das Ultrafiltrat zu entsalzen.
• Im Hinblick auf die Fraktionierung der Oligomeren wird das Retentat erneut einer Ultrafiltration auf 500 Da, jedoch mit einem Eingangsdruck von 2,5 bar und einem Ausgangsdruck von 2 bar, unterzogen.
• Das Filtrat, das die Abtrennungsschwelle von 500 Da der Membran passiert (etwa 20 l), wird anschließend auf einem Rotationsverdampfer konzentriert, mit Ammoniumcarbonat neutralisiert und unter Verwendung einer Vorrichtung, vertrieben unter der Marke Lyolab A LSL durch die Gesellschaft Secfroid, lyophilisiert. Das so erhaltene Lyophilisat enthält die als I27 bezeichneten Oligofukane.
• Die so erhaltenen Oligofukane der Fraktion I27 werden einer ergänzenden Fraktionierung durch Ionenaustausch-Chromatographie und Ausschluss-Chromatographie unterzogen.
• Das auf einem Gel der Marke BIOGEL P6 erhaltene Ausschluss-Chromatogramm ist in der Grafik von 2 wiedergegeben, welche auf der Abszisse das Elutionsvolumen (Ve), ausgedrückt in ml, und auf der Ordinate den Brechungsindex (RI) des Eluats zeigt.
• Die Struktur der so erhaltenen Oligosaccharide (Peaks 1A und 4A des Chromatogramms) wurden durch zweidimensionale NMR analysiert.
• Bei den Peaks 4A und 3A handelt es sich um ein Tetrasaccharid bzw. ein Hexasaccharid, welche durch Fukose-Reste gebildet werden, die abwechselnd durch α(1 → 3)- und α(1 → 4)-Bindungen verbunden und auf ihrem Kohlenstoff 2 sulfatiert sind (1).
• Die Peaks 2A und 1A bestehen jeweils aus Mischungen von DP-variablen Oligosacchariden der gleichen homologen Reihe, können jedoch Verzweigungen aufweisen.
• Dieses Ergebnis zeigt, dass die Ausgangspolysaccharide zumindest teilweise durch die Wiederholung der Motive α-L-Fuc-2-sulfat-1→3-α-L-Fuc-2-sulfat-1→4, die bisher nicht beschrieben waren, zusammengesetzt sind.
• Ein zweites Verfahren umfasst eine kontinuierliche Hydrolyse; es besteht darin, dass mit Hilfe einer 30-kDa-Ultrafiltrationsmembran die Oligofukane in dem Maß ihrer Bildung von der Enzymwirkung abgezogen werden. Die so erhaltene Fraktion wird als "Fraktion I25" bezeichnet und enthält Oligofukane mit einer höheren Molekularmasse als die der Oligofukane, die die Fraktion I27 bilden.
• Aus praktischen Gründen wird das Substrat (50 g FS28EtOH) in 10 l destilliertem Wasser gelöst.
• Um die Hydrolyse zu bewirken, werden 25 ml des Enzyms in Form einer mit Ammoniumsulfat zwischen 40- und 60%iger Sättigung ausgefällten Fraktion zu 2 l des Substrats gegeben; die kontinuierliche Ultrafiltration wird nach 30 Minuten begonnen.
• Für diese tangentiale Ultrafiltration wird eine Vorrichtung der Marke Pellicon, enthaltend eine 30.000-Da-Kassette, verwrendet, wobei die Vorrichtung während der gesamten Dauer der Hydrolyse auf 1 bar am Eingang und 0 bar am Ausgang eingestellt wird.
• Der Filtratausgang wird teilweise verschlossen, um den Filtrationsdurchsatz bei 2 l/Std.1 zu halten.
• Die Eigenschaften des Reaktionsraums werden derart ausgewählt, dass eine Versorgung des Enzyms mit Substrat bis zu einem Verbrauch von 10 l ermöglicht wird und das Fixvolumen der Hydrolyse bei 2 l gehalten wird.
• Die Hydrolyse wird durchgeführt, indem destilliertes Wasser (8 l) kontinuierlich zugegeben wird, bis das Filtrat keine Oligomeren mehr enthält.
• Es werden 18 l eines Ultrafiltrats erhalten, welches mit Hilfe einer Pellicon-Vorrichtung, ausgestattet mit einer 500-Da-Kassette, auf etwa 1 l konzentriert wird, wobei der Eingangsdruck 2 bar und der Ausgangsdruck 0 bar betragen; eine zusätz liche Konzentration auf 200 ml wird durch Rotationsverdampfung bewirkt; anschließend wird das Konzentrat neutralisiert und lyophilisiert.
• Das Filtrat, welches die Fraktionen mit geringem Molekulargewicht enthält (d. h., die durch eine Membran mit einer Abtrennungsschwelle von 500 Da passieren können) wurde nicht aufgehoben.
• Die Fraktion I25 bezeichnet die Oligofukane, die zwischen den Abtrennungsschwellen von 500 Da und 30.000 Da zurückgehalten werden.
• Es wurde die biologische Wirkung der Fraktionen I27 und I25 auf Pflanzen untersucht.
• Die direkte, eine (Abwehr)reaktion hervorrufende Wirkung dieser Fraktionen wurde an Tabak-BY-Zellkulturen analysiert.
• Es wurden fünf Marker für (Abwehr)reaktionen unabhängig voneinander getestet, nämlich:
• – Alkalisierung des Kulturmediums (eine frühe Antwort, die gewöhnlich beobachtet wird, wenn Pflanzen in Gegenwart von oligosaccharidischen, eine (Abwehr)reaktion hervorrufenden Molekülen ("éliciteurs") inkubiert werden,
• – "Phenylammoniak-Lyase"-Aktivitätslevel (PAL), welches ein Schlüsselenzym für die Synthese von Phytoalexinen bei Pflanzen ist,
• – O-Methyltransferase (OMT)-Aktivitätslevel, welches ein Enzym ist, das bei der Synthese von Lignin eine Rolle spielt,
• – Lipoxygenase (LOX)-Aktivitätslevel, welches ein Enzym ist, das bei der Erzeugung von Methyljasmonat eine Rolle spielt, ein Element der Signalkaskaden, welches zur Aktivierung von Abwehrgenen führt, und
• – der Gehalt an Salicylsäure (SA), welche ein weiterer "second Messenger" ist, der bei den (Abwehr)reaktionen eine Rolle spielt.
• Die Fraktion I27, welche mit einer Dosis von 200 mg/l verabreicht wurde, induzierte eine Alkalisierung des Kulturmediums der Tabakzellen von 1 bis 1,5 pH-Einheiten. Im Verhältnis zu den nicht behandelten Zeilen wurden die PAL- und OMT-Aktivitäten jeweils um den Faktor 50 bis 600 bzw. 2,0 bis 2,8 zwischen 4 und 8 Stunden nach Zugabe von I27 in das Kulturmedium stimuliert.
• Die LOX-Aktivität, die 18 Stunden nach Zugabe von I27 mit einer Dosis von 200 mg/l gemessen wurde, ist im Vergleich zu den Vergleichs- bzw. Kontrollzellen um das 7-fache erhöht. Gleichermaßen ist 3 Stunden nach Ende der Behandlung der Gehalt an Salicylsäure um das 70-fache höher als in den nicht behandelten Zellen.
• Analoge Ergebnisse wurden mit der Fraktion I25 beobachtet. Jedes Mal wurde eine stärkere Stimulation der LOX-Aktivität beobachtet, bis zu einem Multiplikationsfaktor von 55 in Bezug auf die Vergleichs- bzw. Kontrollzellen.
• Die 3 zeigt den Einfluss der Fraktion I25 auf die Stimulation der PAL-Aktivität in den Tabak-BY-Zellen; sie zeigt die Änderung der Aktivität, ausgedrückt in Pico-Katal pro Gramm (pKat/g) Frischmasse der Zellsuspension in Abhängigkeit der Zeit, ausgedrückt in Stunden, für drei Konzentrationen, nämlich 200 mg/l, 50 mg/l, 10 mg/l, und für Vergleich bzw. Kontrolle.
• Durch 3 wird deutlich, dass Konzentrationen von 10 mg/l ausreichen, um eine signifikante Stimulation im Vergleich zu den keine (Abwehr)reaktion zeigenden Vergleichs- bzw. Kontrollzellen nachzuweisen, wobei eine Sättigung der Antwort bei Konzentrationen über 50 mg/l beobachtet wird.
• Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass die erfindungsgemäßen Oligofukane von den Tabakzellen als (Abwehr)reaktionen hervorrufende Moleküle ("éliciteurs") erkannt werden.
• Im Vergleich zu den nicht behandelten Zellen stimulieren sie sehr stark (d. h., in Verhältnissen, die vollständig mit denen anderer (Abwehr)reaktionen hervorrufender Substanzen vergleichbar sind, wie Oligopektine und Oligo-β1-3-glucane) PAL-, LOX- und OMT-Aktivitäten sowie den Gehalt an SA.
• Die (Abwehr)reaktionen induzierende Wirkung der Fraktion I25 wurde ebenso anhand von Weizen-Zellsuspensionen analysiert.
• Es wurde gezeigt, dass diese Fraktion PAL-Aktivität induziert.
• Bei einer Konzentration von 200 mg/l stimulierte I25 PAL-Aktivität um einen Faktor von 15 bis 20 zwischen 2 und 6 Stunden nach der Behandlung.
• Eine Dosis von 50 mg/l stimuliert PAL-Aktivität noch um einen Faktor 4, vier Stunden nach der Behandlung.
• Ebenso induziert I25 PAL-Aktivität in Petersilien-Zellsuspensionen.
• 200 mg/l I25 stimulierten PAL-Aktivität um einen Faktor von 15 bis 30 zwischen 4 und 6 Stunden nach der Behandlung.
• Eine Dosis von 20 mg/l stimuliert PAL-Aktivität 4 Stunden nach der Behandlung noch um den Faktor 5.
• Durch eine weitere Reihe von Experimenten wurde gezeigt, dass die Fuko-Oligosaccharide, eingebracht in Tabakblätter, gegen VMT (Tabakmosaikvirus) schützen. Diese Experimente wurden folgendermaßen durchgeführt.
• Die als I25 bezeichnete Fuko-Oligosaccharid-Fraktion (200 mg/l) wurde mit Hilfe einer Spritze in drei, 2 Monate alte Tabakblätter (Blätter 4, 5 und 6 von unten) eingebracht.
• Fünf Tage nach dem Einbringen wurde eine Impfung mit VMT in die Blätter 5, 6 und 7 durchgeführt, wobei das Blatt 4 als Vergleich bzw. Kontrolle diente.
• Eine Woche nach der Impfung wurde die Anzahl der Schädigungen/Läsionen (NL) und das Ausmaß/die Größe dieser Schädigungen/Läsionen (TL) bei den behandelten Pflanzenblättern sowie bei den lediglich mit Wasser behandelten Pflanzen bestimmt.
• In der folgenden Tabelle II ist der prozentuale Schutz gemäß der zwei oben definierten Kriterien wiedergegeben.
• Tabelle II Schutz von Tabak gegen VMT durch Fuko-Oligosaccharide

  
• Das Blatt 4 wies keinerlei Schädigung/Läsion auf.
• Die in dieser Tabelle zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass in den mit I25 behandelten Blättern (Blätter 5 und 6) ein guter Schutz induziert wurde, jedoch auch in Blatt 7, welches keine Fuko-Oligosaccharide erhalten hatte.
• Somit kann von systemischem Schutz ausgegangen werden.
• Aus diesen zwei Experimentreihen bei Weizen, Petersilie und Tabak geht hervor, dass die Fuko-Oligosaccharide enzymatische Aktivitäten von natürlichen Abwehrmarkern nicht nur im Fall von Tabak, sondern ebenso im Fall von Weizen und Petersilie stimulieren.
• Diese Stimulierung führt zu einem systemischen Schutz gegen VMT und wahrscheinlich gegen andere phytopathogene Agenzien.
• Zur Veranschaulichung werden im Folgenden zwei Beispiele angegeben.
• Beispiel 1
• Flüssigkonzentrat für die Landwirtschaft auf Oligofukan-Basis:

  Oligofukan I25	0,200 kg
  Tween 801	0,005 kg
  Natrium enthaltendes Methylparaben	0,005 kg
  Wasser	0,790 kg
  Gesamt	1,000 kg

• Dieses Konzentrat wird nach Verdünnung in 1.000 l Wasser in einer Menge von 10 g bis 10 kg, bevorzugt von 20 g bis 5 kg, besonders bevorzugt von 100 g bis 1 kg, verwendet; diese Verdünnung führt zu einem Gehalt an Oligofukanen I25 von 2 bis 2000 g, bevorzugt von 20 bis 200 g, pro 1.000 l Wasser.
• Beispiel 2
• Konzentriertes lösliches Pulver, welches als aktiven Wirkstoff das Hydrolysat I27 sowie Zusatzstoffe enthält.
• Für 1 kg wird die Zusammensetzung dieses Pulvers (Gewicht/Gewicht) folgendermaßen definiert:

  Oligofukan I27	0,200 kg
  Kaolin	0,495 kg
  Mannose	0,050 kg
  Natrium enthaltendes Methylparaben	0,005 kg
  aufgereinigtes Amidon	0,250 kg
  Gesamt	1,000 kg

• Dieses Pulver wird nach Verdünnung in einer ausreichenden Menge Wasser zum Erhalt einer Zusammensetzung, deren Gehalt an Oligofukan I27 von 2 bis 5.000 g, bevorzugt von 20 g bis 100 g, pro 1.000 l Wasser beträgt, verwendet. SEQUENZLISTE

  

  

  

  

Claims (6)

1. Verwendung von sulfatierten Fuko-Oligosacchariden für eine Pflanzenschutz-Behandlung, wobei der Polymerisationsgrad der sulfatierten Fuko-Oligosaccharide 4 bis 100, bevorzugt 4 bis 20, α-L-Fukose-Einheiten, die auf ihrem Kohlenstoff 2 sulfatiert sind, beträgt.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Fuko-Oligosaccharid ein Tetrasaccharid ist, das durch sulfatierte Fukose-Reste gebildet wird, die abwechselnd durch α(1 → 3)- und α(1 → 4)-Bindungen verbunden sind.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Fuko-Oligosaccharid ein Hexasaccharid ist, das durch sulfatierte Fukose-Reste gebildet wird, die abwechselnd durch α(1 → 3)- und α(1 → 4)-Bindungen verbunden sind.
4. Verwendung einer phytopharmazeutischen Zusammensetzung für eine Pflanzenschutz-Behandlung, wobei die Zusammensetzung sulfatierte Fuko-Oligosaccharide enthält, deren Polymerisationsgrad 4 bis 100, bevorzugt 4 bis 20, α-L-Fukose-Einheiten, die auf ihrem Kohlenstoff 2 sulfatiert sind, beträgt.
5. Verwendung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das in der phytopharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Fuko-Oligosaccharid ein Tetrasaccharid ist, das durch sulfatierte Fukose-Reste gebildet wird, die abwechselnd durch α(1 → 3)- und α(1 → 4)-Bindungen verbunden sind.
6. Verwendung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Fuko-Oligosaccharid ein Hexasaccharid ist, das durch sulfatierte Fukose-Reste gebildet wird, die abwechselnd durch α(1 → 3)- und α(1 → 4)-Bindungen verbunden sind.