ES2252967T3

ES2252967T3 - Aplicacion de fuco-olisacaridos sulfatados para la proteccion de las plantas.

Info

Publication number: ES2252967T3
Application number: ES99943019T
Authority: ES
Inventors: Valerie Descamps; Olivier Klarszinsky; Tristan Barbeyron; Bernard Cloarec; Bernard Fritig; Jean-Marie Joubert; Bertrand Plesse; Jean-Claude Yvin
Original assignee: Laboratoires Goemar SA
Current assignee: Laboratoires Goemar SA
Priority date: 1998-09-21
Filing date: 1999-09-21
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2019-09-21
Also published as: EP1124835A1; CA2343937A1; DE69928121T2; ATE308550T1; AU5630999A; WO2000017215A1; DK1124835T3; FR2783523B1; EP1124835B1; JP2002526057A; US6984630B1; DE69928121D1; FR2783523A1

Abstract

Utilización para el tratamiento de protección de las plantas, de fuco-oligosacáridos sulfatados, cuyo grado de polimerización, es de 4 a 100, de una forma preferente, de 4

Description

Aplicación de fuco-olisacáridos sulfatados para la protección de las plantas.

La presente invención, describe endofucanasas propias para la preparación de fuco-oligosacáridos por hidrólisis enzimática de los fucanos.

Ésta describe igualmente una bacteria productora de endofucanasas y la preparación de esta enzima, a partir de la bacteria.

Ésta tiene además como objetivo, genes de endofucanasas.

Finalmente, ésta tiene como objetivo la aplicación de estos fuco-oligosacáridos en cuestión, a la protección de las plantas.

Los fucanos, son polisacáridos a base de \alpha-L-fucosa.

Éstos pueden extraerse de la pared de las algas marrones.

Éstos pueden igualmente extraerse de los equinodermos.

Se ha procedido ya a preparar, mediante hidrólisis ácida o radical, fracciones oligosacáridas, a partir de fucanos.

Se han estudiado ya diversas actividades biológicas, tanto en relación con los fucanos, como en relación con ciertas fracciones de peso molecular más reducido.

Se conoce ya, por la Patent Abstracts of Japain (Resumen de patentes del Japón), vol. 95, nº6, del 31 de Julio de 1995 y la Patente Japonesa JP 07 059 563 (TOUSA KOGAKU KENHYUSHO), del 7 de Marzo de 1995, una enzima que descompone el fucoidano purificado y extraído de un animal de la especie Echinoidea.

La patente estadounidense US - A - 5 588 254, indica el hecho de que, el producto de descomposición del fucoidano, por un ácido o enzima, es un oligosacárido que tiene un grado de polimerización de 2 a 10, teniendo, este oligosacárido, la propiedad de acelerar el crecimiento de las plantas.

La Patent Abstracts of Japain (Resumen de patentes del Japón), vol. 95, nº11, del 26 de Diciembre de 1995 y la Patente Japonesa JP 07 215 990 A, describen una composición que comprende un oligosacárido de fucoidano de bajo peso molecular (inferior a 5000, es decir, que comprende 26 unidades de fucosa sulfato), teniendo, este oligosacárido, una excelente solubilidad / absorbancia en el ser viviente, y conserva las actividades biológicas de fucoidano; este fucoidano de reducido peso molecular, se obtiene por hidrólisis ácida del fucoidano natural.

La invención, tiene como objetivo fuco-oligosacáridos particulares, una enzima para su preparación, y sus aplicaciones en el sector de la protección de plantas.

Los fuco-oligosacáridos en cuestión, se sulfatan, y tienen un grado de polimerización de 4 a 100, de una forma preferente, de 4 a 20 unidades de \alpha-L fucosa; dos de entre ellos, se caracterizan por las fórmulas desarrolladas I y II, representadas en la figura 1.

En conformidad con la presente invención, éstos se preparan por hidrólisis enzimática, a partir de los fucanos, haciendo actuar endofucanasas sobre éstos, es decir, enzimas que, la empresa solicitante, a tenido el mérito de aislar.

Estas enzimas, se secretan mediante una cepa bacteriana de actividad fucanolítica, que la empresa solicitante ha obtenido a partir de lodos industriales, utilizados para el tratamiento de efluentes, ricos en fucanos sulfatados, de una fábrica de extracción de alginatos.

Para realizar este cometido, ésta ha procedido de la forma que sigue a continuación.

Se procede a utilizar lodos, extraídos de las piscinas de oxigenación y de decantación de una estación de depuración, situada aguas debajo de una fábrica de extracción de alginatos, como inóculo de un medio pobre a base de agua de mar filtrada, que contiene 2 g/l de fucano.

Procediendo a trabajar sobre partes alícuotas del medio de cultivo de esta forma constituido, se efectúa, cada día, el test de ensayo denominado "a la albúmina sérica bovina" (o BSA).

El principio de este test de ensayo, se funda sobre el hecho de que, los polisacáridos aniónicos, se asocian, en medio ácido, con la albúmina cargada positivamente, provocando, de esta forma, una precipitación del conjunto de los complejos formados.

Por el contrario, los oligosacáridos y los huesos, no se precipitan o se floculan, debido al hecho de que, éstos, son de un peso molecular demasiado bajo, para dar lugar a la formación de un complejo insoluble.

En vistas del test de ensayo de BSA, se procede a introducir 600 \mul del sobrenadante de cultivo, en un microtubo de 1 ml, y se procede a centrifugar.

El sobrenadante, es decir, 500 \mul, se transfiere a otro tubo, y se mezcla a 2 ml de una solución de BSA ácida, constituido por 3,26 g de acetato de sodio, 4,56 ml de ácido acético glacial y 1 g de BSA, en 1 l de agua destilada, siendo, el pH, de una valor de 3,72 a 3,78.

Paralelamente, se procede a tratar un testigo que se encuentra constituido por 500 \mul de sobrenadante de cultivo sin inóculo.

Teniendo en cuenta las explicaciones precedentes, la formación de una turbidez idéntica a la que se produce en el testigo, indica el hecho de que no ha habido degradación del polímero; por el contrario, en el caso en donde, la turbidez, es inferior o inexistente, se concluye la presencia, en el cultivo bacteriano, de una actividad enzimática del fucano.

El test de ensayo, se ha evidenciado como positivo, al cabo de 7 horas de incubación del fucano, en presencia del inóculo descrito más arriba.

Se procede, a continuación, a extender una parte alícuota del medio de cultivo correspondiente, sobre una placa de Petri, que contiene el medio conocido con la denominación Zobell-Fucano, el cual se encuentra constituido por el medio Zobell (1941), al cual se le añade fucano, a una concentración de 2 g/l, y se solidifica mediante agar, a una concentración de 15 g/l.

La composición del medio Zobell [Zobell CE (1941) "Studies on marine bacteria. I. The cultural requirements of heterotrophic aerobes", - Estudios sobre las bacterias marinas. I. Los requerimientos de cultivo de los aerobios heterotróficos -, aparecido en J. Mar. Res. , 4: 41 -75], es de la forma que sigue:

Bacto-petona Difco	5,0 g
Extracto de levadura Difco	1,0 g
Agua de mar filtrada	800 ml
Agua destilada \hskip2cm q.s.p	1 l

Se constata la formación, en la placa de Petri, de un cierto número de colonias diferentes las unas con respecto a las otras, y que corresponde a otras tantas cepas.

Cada una de estas colonias, o dicho de otro forma, cada una de las cepas, se aísla a partir de este medio, y se introduce en un medio líquido Zobell-Fucano, constituido por 1/2 de volumen de Zobell y 1/2 de una solución de fucano, a una concentración de 4 g/l, en agua de mar filtrada.

Sobre cada una de estas cepas de esta forma aisladas e introducidas en el medio de Zobell-Fucano, se procede a efectuar el test de ensayo de BSA, para detectar las cepas fucanolíticas.

Cuando el test de ensayo es positivo, la cepa, se replica sobre medio de Zobell-Fucane, para verificar que, ésta, continúa hidrolizando los fucanos del nuevo medio; si éste es el caso, esto significa el hecho de que, todo el dispositivo genético necesario para la producción de los fucanos, se pone en su lugar; dicho de otra forma, la presencia de los fucanos en el medio, induce la producción de las enzimas mediante la cepa. Debido a este estado de cosas, el test de ensayo de la BSA, se efectúa de nuevo sobre el nuevo cultivo.

Procediendo de este modo, se ha aislado una cepa que se ha denominado SW5, y que proporciona un test de ensayo de la BSA positivo, al cabo de 3 a 4 días, cuando ésta se cultiva sobre el medio Zobell-Fucano.

La citada cepa SW5, seleccionada de la forma que se acaba de describir, se ha depositado con el número 12171, en la colección DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), cuya dirección, es la siguiente: Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania.

La cepa, es en bastoncillo Gram negativo, aerobia estricta, quimioorganotrofa y heterotrofa. Al cabo de tres días de cultivo, las colonias sobre el medio Zobell-Fucano sólido, son pequeñas (1 mm de diámetro), y pigmentadas en color naranja. La cepa SW5, necesita agua de mar para su crecimiento, situándose, su temperatura óptima de crecimiento, a un valor de 18 - 20°C. No se constató ningún crecimiento por debajo de una temperatura de 15°C, y por encima de 25°C. Otras características fenotípicas de la cepa SW5, se muestran en la tabla I que se facilita a continuación.

TABLA I Caracteres fisiológicos y biológicos de la cepa SW5

Caracteres positivos	Caracteres negativos	Caracteres negativos (continuación)
catalasa	oxidasa	\alpha-hidroxibutirato
\alpha-ciclodextrina	fexirubina	\beta-hidroxibutirato
dextrina	reducción de los	\gamma-hidroxibutirato
glicógeno	nitratos	p-hidroxifenilacetato
celobiosa	formación de índole	itaconato
D-fructuosa	fermentación	\alpha-cetobutirato
L-fucosa	arginina dihidrol	\alpha-cetoglutarato
D-galactosa	ureasa	\alpha-cetovutarato
gentobiosa	tween 40	malonato
\alpha-D-glucosa	twenn 80	propianato
\alpha-D-lactosa	N-acetil-D-galacto-	quinato
maltosa	samina	D-sacarato
D-manosa	N-acetil-D-gluco-	sebacato
B-metil-D-glucósido	samida	succinato
turanosa	adonitol	bromosuccinato
mono-metil-succinato	L-arabinosa	succinamato
D-galacturonato	D-arabitol	glucuronamato
D-glucuronato	eritritol	alinamida
D.L.lactato	m-inositol	D-alanina
L-alanina	lactulosa	L-histidina
L-alanil-glicina	D-manitol	D.L-carnitina
L-asparagina	D-metibiosa	\Gamma-aminobutirato
aspartato	D-psicosa	inosina
L-glutamato	D-rafinosa	uridina
glicil-L-aspartato	L-ramnosa	timidina
glicil-L-glutamato	D-sorbitol	feniletilamina
L-ornitina	sucrosa	putrescina
L-prolina	D-trehalosa	2-aminoetanol
L-treonina	xilitol	2,3-butanodiol
urocanato	metil piruvato	glicerol
glucoso-1-fosfato	acetato	D.,L-a-glicerol
glucoso-6-fosfato	cis-aconitato	fosfato
	citrato
	formato
	D-galactanato lactona
	D-gluconato
	D-glucoxaminato

Las relaciones filogenéticas de la cepa SW5, se establecieron mediante la secuencia nucleótida ID Nº 1, del gen codificante para el ARN 165.

La comparación de la secuencia de este gen con los genes homólogos nacidos de la bacterias del grupo CFB (Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides) ha permitido el construir un árbol filogenético, en el cual resulta que, la cepa, pertenece a la familia de la Flavobacteriaceae (Bernardet et al, 1996, International Journal of Sytematic Bacteriology, Jan; 128 - 148), y que ésta se encuentra próxima a la Gelidibacter algens (Bowman et al. 1997, International Journal of Systematic Bacteriology, July: 670 - 677), una cepa aislada de los hielos de la Antártica.

De ello se desprende el hecho de que, el procedimiento en conformidad con la presente invención, para la preparación de los anteriormente mencionados fuco-oligosacáridos, se caracteriza por el hecho de que se procede a someter un substrato constituido por una materia prima a base de fucanos, a una hidrólisis enzimática, con la ayuda de una enzima fucanolítica o endofucanasa, susceptible de obtenerse a partir de una cepa bacteriana depositada con el nº 12171, en la colección DSMZ.

La bacteria SW5, secreta, en su medio de cultivo, una cantidades insignificantes de actividad fucanasa, la cual puede utilizarse a la temperatura ambiente, en medio tamponado, a un valor pH de 7,5, incluso en agua.

La preparación del substrato, o dicho de otro modo, de los fucanos que deben someterse a la acción de la actividad enzimática, se efectúa de la forma que sigue a continuación.

Se procede a someter 150 kg del alga marrón Pelvetia caniculata, a una trituración, con objeto de obtener fragmentos de 2,5 a 3 mm, utilizando un dispositivo designado como Comitrol 2100 y comercializado por la Sociedad Urshel.

Estos fragmentos, se someten a una extracción mediante 800 l de ácido clorhídrico 0,01 N, con un contenido de un 4%, en peso, de CaCl_{2}, y manteniendo una agitación durante 3 horas a 70°C.

La suspensión de fragmentos de alga de esta forma tratados, se decanta durante un tiempo de 2 horas y 30 minutos y, el retenido de esta forma obtenido, se centrifuga; el sobrenadante de la operación de centrifugación, se somete a una ultrafiltración tangencial, sobre membranas de 50 kDa. El retenido obtenido en la salida de esta ultrafiltración tangencial, se atomiza con la ayuda de un dispositivo designado mediante la denominación Miro, y que se comercializa por parte de la Sociedad Minor Production.

El resultado de esta atomización, es una materia en forma de polvo, constituido, mayoritariamente, por fucanos.

Esta materia en forma de polvo, se somete a una purificación suplementaria mediante la puesta en solución, centrifugación, precipitación del sobrenadante con etanol, puesta en solución del precipitado en agua, y ultrafiltración tangencial de la solución acuosa sobre membranas de 30000 Da.

El retenido resultante de esta ultrafiltración, se somete a una liofilización, y constituye el substrato buscado, éste se designa por FS28EtOH.

Este substrato, es decir, esta materia en polvo de fucanos, se somete a la actividad enzimática obtenida a partir de la bacteria SW5.

Para realizar este cometido, se procede a preparar una solución de 1 g/l de substrato FS28EtOH, en tampón tris (20 mM, pH 7,5); se extraen 50 \mul de esta solución, y se mezclan a 10 \mul de la fracción protéica a someter a test de ensayo, que contiene la actividad enzimática obtenida a partir de la bacteria SW5.

La mezcla, se mantiene durante 1 hora a la temperatura ambiente.

El hidrolizado final, contiene la mezcla de fuco-oligosacáridos en cuestión.

Este hidrolizado, se somete a una electroforesis, en vistas a evidenciar, de una forma cuantitativa, la presencia de fracciones oligosacáridas; esta electroforesis, se efectúa sobre gel de poliacrilamida, utilizando la técnica denominada D-PAGE, descrita por Zablackis E. y Perez J. (1990), en el artículo titulado ``A partially pyruvated carragenan from Hawiian Grateyoua filicina (Cyptoremianales, Rodohphyta) aparedecido, "bit. Mar." 33: 273 - 276.

Los perfiles de degradación de los fucanos obtenidos con la ayuda de la enzima producida por la bacteria SW5, muestran el hecho de que, la actividad enzimática de la cepa en cuestión, es del tipo endolítico; se ha remarcado, durante el transcurso de los ensayos, el hecho de que, los fucanos, presentaban elementos de estructura semejantes, sea cual fuere el alga marrón de la que éstos han sido extraídos.

La actividad endo-fucanasa de la cepa SW5, se purificó mediante la hogeneidad electroforética; se determinó el hecho de que, la proteína en cuestión, tiene una masa molecular de aproximadamente 105 kDa.

Se microsecuenciarion, entonces, tres péptidos internos.

Se obtuvieron, de esta forma, las microsecuencias ID Nº2, ID nº 3 e ID Nº 4.

La invención, tiene igualmente como objetivo, las endofucanasas caracterizadas por el hecho de que, éstas, contienen secuencias análogas a los péptidos ID Nº 2, ID Nº 3, ID Nº 4, y / o ID Nº 6, así como los genes de endofucanasas, caracterizados por el hecho de que, éstos, contienen secuencias análogas a la secuencia nucleótida ID Nº 5.

La purificación de la actividad endo-fucanasa de la cual se ha tratado anteriormente, arriba, se efectuó con la ayuda de un sistema comercializado con la denominación FPLC®, por la Sociedad Pharmacia; este sistema, se emplazó a una temperatura de 4°C.

Después de cinco días de cultivo de la cepa SW5, en 6 l de medio Zobell-Fucano, se procede a una microfiltración sobre un dispositivo del tipo Pellicon de la Sociedad Millipore, equipado con una casete de 0,45 \mum, (Millipore) y, a continuación, a una utrafiltración tangencial sobre una casete PTGC de 30 000 Da.

Para el fraccionamiento de las proteínas, se procede de la siguiente forma:

Para el primer fraccionamiento de 0 a 40%, se procede a añadir, a la solución protéica, (NH_{4})_{2}SO_{4}, a 242 g/l, poco a poco y bajo régimen de agitación lenta, a una temperatura de 4°C. Cuando se ha disuelto todo el sulfato de amonio, se procede a centrifugar la solución; la torta residual, la cual representa la fracción entre un 0 y un 40%, no se conserva, mientras que, el sobrenadante, se somete a un nuevo fraccionamiento de 40 a 60%. Este fraccionamiento, se realiza mediante la adición de (NH_{4})_{2}SO_{4}, a 130 g/l, poco a poco, y bajo régimen de agitación lenta, a una temperatura de 4°C. Cuando se han disuelto los cristales, la solución se centrifuga; la torta residual, la cual representa la fracción protéica entre 40 y 60% de saturación de sulfato amónico, se conserva y se resolubiliza en el tampón Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, CaCl_{2} 5 mM, MgCL_{2} 5mM.

La fracción entre 40 y 60% de saturación del sulfato amónico, se disuelve 20 veces en tampón Tris 20 mM, pH 7,5, y se resatura a un 40% de (NH_{4})_{2}SO_{4}.

La muestra de esta forma obtenida, se inyecta sobre una columna de cromatografía de interacción hidrófoba a base de Fenil Sefarosa CL4B Pharmacia, a razón de 1 ml/minuto.

La columna, se equilibra previamente, con tampón Tris pH 7,5; (NH_{4})_{2}SO_{4} a 40%. El gradiente, se efectúa mediante disminución de la concentración en (NH_{4})_{2}SO_{4}, de 1,8 M (40%) a 0 M, en tampón Tris, en 3 volúmenes de columna; a continuación, por 2 volúmenes de tampón, sin (NH_{4})SO_{4}.

Cada fracción protéica, se utiliza para hidrolizar el fucano FS28EtOH. El hidrolizado, se prepara tal y como se ha descrito previamente, arriba, mediante la adición de la citada fracción, a una solución de fucano a 1 g/l, en tampón Tris 20 mM pH 7,5, que contiene sales. El hidrolizado, se somete a continuación a test de ensayo, mediante la técnica C-PAGE. Las fracciones denominadas "positivas sobre C-PAGE", son aquéllas que generan un perfil electroforético que contiene fracciones de oligo-fucosacáridos.

Las fracciones que generan un perfil de degradación positivo sobre gel de poliacrilamida, se reúnen y se diluyen 5 veces en tampón Tris 20 mM pH 7,5; NaCl 5 mM, antes de inyectarse sobre una columna de cromatografía de intercambio de iones, cargados en DEAE Sefarosa CL6B, comercializado por la Sociedad Pharmacia.

Las proteínas, se eluyen mediante un gradiente de NaCl de 5 mM a 1 M, en 3 volúmenes de columna, a 1 ml/minuto.

Estas fracciones, se inyectan, a continuación, a razón de 100 \mul, sobre una columna de filtración, cargada con gel Superdex 200, comercializada por la Sociedad Pharmacia y previamente equilibrada a razón de 0,5 ml/minuto en tampón fosfato de sodio 50 mM pH 7,0; NaCl 150 mM.

La fracción activa, identificada por la técnica C-PAGE, se recoge y, la pureza de la proteína, se determina sobre un gel SDS a un 12,5%, utilizando el dispositivo Phast-System®, de la Sociedad Pharmacia. Los marcadores moleculares, son los standard, de 14,5 a 200 kDa, comercializado bajo la denominación "broad-range", por la Sociedad Biorad.

A partir de las microsecuencias protéicas SEQ ID Nº 3 y SEQ ID Nº 4, se sintetizaron oligonucleótidos; se utilizaron estos oligonucleótidos como cebadores, con el fin de sintetizar por PCR (Polymersa Chain Reaction), un fragmento del gen que codifica para la fucanasa, sirviendo, el ADN purificado de la cepa AW5, como matriz para la reacción.

Se procedió a secuenciar los productos de PCR específicos de las parejas de cebadores.

Uno de ellos, presenta la secuencia nucleótida SEQ ID Nº 5.

La secuencia protéica deducida, de una longitud de 67 aminoácidos, contiene las microsecuencias SEQ ID Nº 3 y SEQ ID Nº 4, indicando que se trata de un fragmento de la fucanasa de la cepa SW5.

La secuencia nucleótida SEQ ID Nº 5, es por lo tanto una porción del gen, de una longitud de 203 nucleótidos, que codifica par ala fucanasa de la cepa SW5.

Para la preparación de los fuco-oligosacáridos, se puede recurrir a varios procedimientos, de los cuales, dos de ellos, se describen a continuación.

En un primer procedimiento, se deja actuar la enzima, hasta el consumo completo del substrato; se procede a incubar durante un transcurso de tiempo de 24 horas, un fucoidano de Pelvetia canaliculata, en presencia de la enzima parcialmente purificada y, a continuación, se procede a ultrafiltrar los productos de hidrólisis sobre membrana de 500 Da. Se obtiene, de esta forma, una fracción designada por I27.

Desde el punto de vista práctico, se procede a hidrolizar un fucano extraído de Pelvetia canaliculata (fracción FS28EtOH), a la temperatura ambiente, durante un transcurso de tiempo de 24 horas, añadiendo 1 litro de substrato de una concentración de 5 g/l en el tampón Tris 20 mM, pH 7,5; NaCl 50 Mm; MgCl_{2} 5 mM; CaCl_{2} 5 mM, una cantidad de 30 ml de precipitado de enzima al sulfato de amonio 40- 60% (3,02 mg de proteínas).

El hidrolizado de esta forma obtenido, se completa mediante agua destilada, hasta un volumen de 10 l y, a continuación, se destila sobre un sistema de ultrafiltración tangencial de 10 000 Da, utilizando una casete de 0,46 m^{2} PTGC, de la Sociedad Millipore, con una presión de entrada de 6,5 bars, y una presión de salida de 5,5 bars.

El ultrafiltrado de esta forma obtenido, se recupera, y se ultrafiltra de nuevo, sobre 500 Da, utilizando el dispositivo comercializado mediante la marca Omega Centraset OM500DC05, por parte de la Sociedad Pall Filtron, con una presión de 1 bar de entrada en el circuito, y una presión de salida cero; esta nueva ultrafiltración tangencial, tiene como objetivo el desalar el ultrafiltrado.

En vistas a fraccionar los oligómeros, el retenido, se ultrafiltra de nuevo, sobre 500 Da, pero con presiones de entrada de 2,5 bar, y 2 bar en la salida.

El filtrado que pasa el umbral de corte de 500 Da (aproximadamente 20 l) de la membrana, se concentra, a continuación, sobre evaporador rotativo, se neutraliza con carbonato de amonio y, a continuación, se liofiliza utilizando el dispositivo comercializado bajo la marca Lyolab A LS, por parte de la Sociedad Secfroid. El liofilizado de esta forma obtenido, contiene los oligofucanos denominados I27.

Los oligofucanos de la fracción I27 de esta forma obtenidos, se sometieron a un fraccionamiento suplementario, mediante cromatografía de intercambio de iones y cromatografía de exclusión.

El cromatograma de exclusión obtenido sobre un gel de la marca BIOGEL P6, se reproduce sobre el gráfico de la figura 2, el cual muestra, en la abcisa, el volumen de elución (Ve), expresado en ml, y en la ordenada, el índice refractomérico (RI) del eluído.

La estructura de los oligosacáridos de esta forma obtenidos (picos 1A a 4A del cromatograma), se analizó mediante RMN bidimensional.

Se trata, en el caso de los picos 4A y 3A, respectivamente, de un tetrasacárido y de un hexasacárido, formados por residuos de fucosa, alternativamente unidos por los enlaces \alpha(1->3) y \alpha(1->), y sulfatados sobre su carbono 2 (figura 1).

Los picos 2A y 1A, en cuanto a ellos, se encuentran constituidos por mezclas de DP variable de oligosacáridos de la misma serie homóloga, pero que puede comportar ramificaciones.

Este resultado, sugiere el hecho de que, los polisacáridos de partida, se encuentran constituidos, por lo menos parcialmente, por la repetición de formaciones \alpha-L-Fuc-2-sulfato-1->3-\alpha-L-Fuc-2-sulfato-1->4, no descritos hasta la fecha.

Un segundo procedimiento, comporta una hidrólisis en continuo; ésta consiste, con la ayuda de una membrana de ultrafiltración de 30 kDa, en sustraer los oligofucanos, mediante la acción de la enzima, a medida de que se produzca su formación. La fracción de esta forma obtenida, se designa mediante la "fracción I25", y contiene oligofuranos de masa molecular más elevada que aquéllos que constituyen la fracción I27.

Desde el punto de vista práctico, se procede a disolver el substrato (50 g de FS28EtOH), en 10 litros de agua destilada.

Para efectuar el hidrolizado, se procede a añadir 25 ml de enzima, en forma de una fracción precipitada con sulfato amónico, entre un 40 y un 60% de saturación, en 2 litros de substrato; la ultrafiltración en continuo, entra en acción después de 30 minutos.

Para esta ultrafiltración tangencial, se utiliza un aparato de la marca Pellicon, que comporta una casete de 30 000 Da, regulándose, el citado aparato, sobre una presión de 1 bar, en la entrada, y a 0 bar en la salida, durante toda la duración de la hidrólisis.

La salida del filtrado, se cierra parcialmente, para mantener el caudal de filtración, a 2 l/h.

Las características del recinto reactivo, se eligen de tal forma que se permita una aprovisionamiento de la enzima en substrato, hasta un agotamiento de 20 litros, y el mantenimiento de un volumen fijo de hidrólisis a 2 litros.

La hidrólisis, se continúa procediendo a añadir agua destilada (8 l), en continuo, hasta que, el filtrado, no contenga oligómeros.

Se obtienen 18 litros de un ultrafiltrado, el cual se concentra hasta aproximadamente 1 litro de agua, de aparato Pellicon, equipado con una casete de 500 Da, siendo, la presión de entrada, de 3 bar y, la presión de salida, de 0, se efectúa una concentración suplementaria, hasta 200 ml, por evaporación rotativa y, a continuación, el concentrado, se neutraliza y se liofiliza.

\newpage

No se procede a conservar el filtrado, el cual contiene las fracciones de reducido peso molecular (es decir, capaces de pasar sobre una membrana o umbral de corte de 500 Da).

La fracción I25, designa los oligofucanos retenidos entre los umbrales de corte de 500 Da y 30000 Da.

Se procedió a estudiar la actividad biológica de las fracciones I27 e I25, sobre las plantas.

Se procedió a estudiar el efecto elicitor directo de estas fracciones, sobre cultivos de células de Tabac BY.

Se sometieron a test de ensayo, de una forma independiente, cinco marcadores de las reacciones de defensa, a saber:

- la alcalinización del medio de cultivo (respuesta precoz usualmente observada, cuando las plantas se incuban en presencia de elicitores oligosacáridos),

- los niveles de actividad "fhenylamonia lysa" (fenilamonio liasa) (PAL), la cual es una enzima clave para la síntesis de las fitoalexinas, en las plantas.

- los niveles de actividad O-metil transferasa (OMT), la cual es una enzima implicada en la síntesis de la lignina,

- Los niveles de actividad lipoxigenasa (LOX), la cual es una enzima implicada en la generación del jasmonato de metilo, un elemento de las cascadas de señalización que desembocan en la activación de los genes de defensa, y

- los contenidos de ácido salicílico (SA), el cual es otro mensajero secundario, implicado en las reacciones de defensa.

La fracción I27, administrada a una dosis de 200 mg/l, induce a una alcalinización del medio de cultivo de las células del tabaco, de 1 a 1,5 unidades pH. Con relación a las células no tratadas, las actividades PAL y OMT, se estimulan, respectivamente, en un factor de 50 a 500 y de 2,0 a 2,8, entre 4 horas y 8 horas, después de la adición de I27, al medio de cultivo.

La actividad LOX, medida 18 horas después de la adición de I27, a la dosis de 200 mg/l, es 7 veces más importante que en las células testigo. Al mismo tiempo, 3 horas después del inicio del tratamiento, los contenidos en ácido salicílico, son 70 veces más importantes que en las células no tratadas.

Se han observado resultados análogos, con la fracción I25. Se nota, de todos modos, una estimulación más fuerte de la actividad LOX, hasta un factor multiplicativo de 55, con relación a las células testigo.

La figura 3, ilustra la influencia de la fracción I25, sobre la estimulación de la actividad PAL, en las células de Tabac BY; ésta muestra la variación de la actividad, expresada pico-katal por g (pkat/g), de masa fresca de suspensión celular, en función del tiempo expresado en horas, para tres concentraciones, a saber, 200 mg/l, 50 mg/l, y 10 mg/l, y para un testigo.

El examen de la figura 3, muestra el hecho de que, las concentraciones de 10 mg/l, son suficientes para revelar una estimulación significativa, con relación a las células testigos no ilicitados, y se observa una saturación, en respuesta para las concentraciones superiores a 50 mg/l.

Los resultados de estas experiencias, muestran el hecho de que, los oligofucanos en conformidad con la presente invención, se reconocen como elicitores, para las células del tabaco.

Con relación a las células no tratadas, éstos estimulan muy fuertemente (es decir, en proporciones que son del todo comparables a las de otros elicitores, como las oligopectinas, y los oligo-\beta1-3-glucanos), las actividades PAL, LOX y OMT, así como los contenidos de SA.

El efecto elicitor de la fracción I25, se analizó igualmente, sobre suspensiones celulares de trigo.

Se muestra el hecho de que, esta fracción, induce la actividad PAL.

Así, de esta forma, a la concentración de 200 mg/l, I25, estimuló en un factor de 15 a 20,, la actividad PAL, entre 2 y 6 horas, después del tratamiento.

La dosis de 50 mg/l, estimula también la activad PAL, en un factor de 4, en un tiempo de 4 horas después del tratamiento.

La I25, induce igualmente la actividad PAL, en las suspensiones celulares del perejil.

A 200 mg/l, I25, estimuló en un factor de 15 a 30, la actividad PAL, entre y 4 y 6 horas después del tratamiento.

Una dosis de 20 mg/l, estimula todavía la actividad PAL, en un factor de 5, un tiempo de 4 horas después del tratamiento.

Mediante otra serie de experiencias, se muestra que, infiltradas en las hojas del tabaco, los fuco-oligosacáridos, protegen contra el VMT (virus del mosaico del tabaco). Las experiencias, se realizaron de la forma que sigue.

La fracción de fuco-oligosacáridos denominada I25 (200 mg/l), se infiltra con la ayuda de una jeringa, en tres hojas de tabaco (hojas 4, 5 y 6, partiendo de la parte de abajo), de 2 meses de edad.

Cinco días después de la infiltración, se procede a realizar una inoculación en el VMT en las hojas 5, 6 y 7, sirviendo, la hoja 4, como testigo.

Una semana después de la inoculación, se procede a determinar el número de lesiones (NL) y el tamaño de estas lesiones (TL), sobre las hojas de las plantas tratadas, así como sobre las plantas tratadas con agua, únicamente.

En la tabla II que se facilita a continuación, se representan los porcentajes de protección, según los criterios que se definen anteriormente, arriba.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA II Protección del tabaco, contra el VMT, mediante los fuco-oligosacáridos

	% protección (NL)	% protección (TL)
Hoja 5	65	25
Hoja 6	65	35
Hoja 7	40	26

\vskip1.000000\baselineskip

La hoja 4, no necesita ninguna lesión.

Los resultados reunidos en esta tabla, han podido concluir el hecho de que se ha inducido bien una protección en las hojas infiltradas por I25 (hojas 5 y 6), pero, también, en la hoja 7, la cual no había recibido fuco-sacáridos.

Puede pues hablarse de una protección sistemática.

En estas dos series de experiencias sobre el trigo, el perejil y el tabaco, resalta el hecho de que, los fuco-oligosacáricos, estimulan actividades enzimáticas marcadoras de las defensas naturales, no únicamente en el caso del tabaco, sino igualmente, también, en el caso del trigo y del perejil.

Esta estimulación, culmina en una protección sistemática contra el VMT y, probablemente, contra otras agentes fitopatógenos.

A título ilustrativo, se facilitan dos ejemplos, a continuación.

Ejemplo 1

Concentrado líquido para la agricultura, a base de oligofucanos:

\vskip1.000000\baselineskip

Oligofucano I25	0,200 kg
Twenn 801	0,005 kg
Metilparabeno sodado	0,005 Kg
Agua	0,790 kg
\hskip3.5cm Total	1,000 kg

\vskip1.000000\baselineskip

Este concentrado, se utiliza, después de dilución, en 1000 litros de agua, de una cantidad comprendida entre 10 g y 10 kg, de una forma preferente, entre 20 g y 5 kg y, de una forma más preferente, entre 100 g y 1 kg; esta dilución, presenta un contenido en oligofucanos I25, comprendido entre 2 y 2000 g, de una forma preferente, entre 20 y 200 g, para 1000 litros de agua.

Ejemplo 2

Materia en forma de polvo soluble, que contiene, en calidad de materia activa, el hidrolizado I27, así como adyuvantes.

Para 1 kg en peso / peso, la constitución de esta materia en forma de polvo, se define de la forma que sigue:

Oligofucano I27	0,200 kg
Kaolin	0,495 kg
Manosa	0,050 kg
Metilparabeno sodado	0,005 Kg
Almidón purificado	0,250 kg
\hskip3.5cm Total	1,000 kg

Este concentrado, se utiliza, después de dilución, en 1000 litros de agua suficiente como para obtener una composición, cuyo contenido en oligofucano I27, comprendido entre 2 y 5000 g, de una forma preferente, entre 20 y 100 g, para 1000 litros de agua.

(1) INFORMACIONES GENERALES

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Laboratoires GOËMAR S.A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: ZAC de la Madeleine

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: SAINT MALO

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: FRANCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 35400

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO: +33 2 99 21 53 70

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELEFAX: +33 2 99 8256 17

\vskip0.500000\baselineskip

(g): TÉLEX

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Fuco-oligosacáridos, enzima para la preparación a partir de fucanos, bacteria productora de la enzima y aplicación de los fuco-oligosacáridos a la producción de plantas.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA DESCIFRABLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE SOPORTE: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): LOGICIAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(v): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.800000\baselineskip

: FECHA DE DEPOSICIÓN: 21 de Septiembre de 1998

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1474 nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: secuencia nucleótida

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: doble hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: gen del ARN 16S

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: CNRS, Station Biologique, Laboratoire de Biologie cellulaire et moleculaire des algues, 29682 Roscof Cedex

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: SW5

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 1:

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: secuencia polipéptida

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: simple hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: SW5

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Thr Ala Asn Thr Thr Tyr Gly Ile Asn Thr Val Ala Ser Met}

\vskip1.000000\baselineskip

(4) INFORMACIONES PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: secuencia polipéptida

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: simple hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Gly Pro Asp Trp Leu Thr Ile Gln Gln Thr Asp Ala Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\sac{Ser Gly Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(5) INFORMACIONES PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: secuencia polipéptida

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: simple hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Thr Val Asp His Val Ala Gly Phe Thr Asn Leu Trp Asn Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\sac{Ala Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(6) INFORMACIONES PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 203 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: secuencia nucleótida

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: doble hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: gen parcial de la fucanasa

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: SW5

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 5:

2

\vskip1.000000\baselineskip

(7) INFORMACIONES PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 67 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: secuencia protéica

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: simple hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: SW5

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 6:

3

Claims

1. Utilización para el tratamiento de protección de las plantas, de fuco-oligosacáridos sulfatados, cuyo grado de polimerización, es de 4 a 100, de una forma preferente, de 4 a 20 unidades de \alpha-L-fucosa sulfatadas sobre su carbono 2.

2. Utilización, según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que, el fuco-oligosacárido utilizado, es un tetrasacárido formado por residuos de fucosa sulfatados, alternativamente unidos por los enlaces \alpha(1-3) y \alpha(1-4).

3. Utilización, según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que, el fuco-oligosacárido utilizado, es un hexasacárido formado por residuos de fucosa sulfatados, alternativamente unidos por los enlaces \alpha(1-3) y \alpha(1-4).

4. Utilización para un tratamiento de protección de las plantas, de una composición farmacéutica que comporta fuco-oligosacáridos sulfatados, cuyo grado de polimerización, es de 4 a 100, de una forma preferente, de 4 a 20 unidades de \alpha-L-fucosa sulfatadas sobre su carbono 2.

5. Utilización, según la reivindicación 4, caracterizada por el hecho de que, el fuco-oligosacárido comportado por la composición farmacéutica, es un tetrasacárido formado por residuos de fucosa sulfatados, alternativamente unidos por los enlaces \alpha(1-3) y \alpha(1-4).

6. Utilización, según la reivindicación 4, caracterizada por el hecho de que, el fuco-oligosacárido utilizado, es un hexasacárido formado por residuos de fucosa sulfatados, alternativamente unidos por los enlaces \alpha(1-3) y \alpha(1-4).