DE60016614T2

DE60016614T2 - Zusammensetzungen zur abgabe osteogener proteine

Info

Publication number: DE60016614T2
Application number: DE60016614T
Authority: DE
Inventors: Rebecca Li; Howard Seeherman; John Wozney
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1999-10-15
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2020-10-14
Also published as: DE60016614D1; WO2001028603A1; EP1220693B1; AU1086601A; EP1220693A1; ATE284230T1; PT1220693E; ES2233469T3; JP2003512097A

Description

Verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht das Vorrecht der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/159703, eingereicht am 15. Oktober 1999 und der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/185734, eingereicht am 29. Februar 2000.
Hintergrund der Erfindung
Die gegenständliche Erfindung betrifft den Bereich der osteogenen Proteine und pharmazeutische Formulierungen daraus. Insbesondere betrifft die gegenständliche Erfindung injizierbare pharmazeutische Formulierungen, welche Gelatine enthalten, zur Abgabe von osteogenen Proteinen.
Osteogene Proteine sind jene Proteine, welche in der Lage sind, die Induktion von Knorpel- und/oder Knochenbildung zu induzieren oder zu unterstützen. Viele solcher osteogenen Proteine sind in den letzten Jahren isoliert und gekennzeichnet worden und einige sind durch rekombinante Verfahren hergestellt worden. Zum Beispiel sind die sogenannten Knochen-morphogenetischen Proteine (BMP) aus entmineralisiertem Knochengewebe isoliert worden (siehe z.B. Urist US-4455256); eine Anzahl solcher BMP-Proteine ist durch rekombinante Techniken hergestellt worden (siehe z. B. Wang et al., US-4877864 und Wang et al. US-5013549); eine Familie von transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β) ist als potentiell brauchbar bei der Behandlung von Knochenerkrankung identifiziert worden (siehe z.B. Derynck et al., EP-154434); von einem Protein mit der Bezeichnung Vgr-1 ist gefunden worden, dass es in hohen Graden in osteogenen Zellen exprimiert wird (siehe Lyons et al. (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86, 4554–4558); und Proteine mit der Bezeichnung OP-1, COP-5 und COP-7 haben wie man sagt Knochen-induktive Wirksamkeit gezeigt (siehe Oppermann et al., US-5001691).
Verschiedene Formulierungen, entworfen um osteogene Proteine an einer Stelle abzugeben, wo Induktion von Knochenbildung erwünscht ist, sind entwickelt worden. Zum Beispiel sind bestimmte polymere Matrizes wie Acrylesterpolymer (Urist, US-4526909) und Milchsäurepolymer (Urist, US-4563489) genutzt worden.
Brekke et al., US-Patente 4186448 und 5133755 beschreiben Verfahren zum Bilden von hochgradig porösen, biologisch abbaubaren Materialien, zusammengesetzt aus Polymeren von Milchsäure („OPLA").
Okada et al., US-4652441, US-4711782, US-4917893 und US-5061492 und Yamamoto et al., US-4954298 offenbaren eine Mikrokapsel mit verlängerter Abgabe, welche ein Polypeptid-Arzneimittel und eine Arzneimittel zurückbehaltende Substanz umfasst, eingekapselt in einer inneren wässerigen Schicht, umgeben durch eine Polymerwandsubstanz in einer äußeren öligen Schicht.
Yamazaki et al., Clin. Orthop. and Related Research, 234: 240–249 (1988) offenbaren die Verwendung von Implantaten, welche 1 mg Knochen-morphogenetisches Protein, gereinigt von Knochen, und 5 mg Gips umfassen. US-Patent 4645503 offenbart Verbundstoffe aus Hydroxylapatit und Gips als Knochenimplantat-Materialien.
Collagen-Matrizes sind ebenfalls als Abgabevehikel für osteogene Proteine verwendet worden (siehe z.B. Jeffries, US-4394370).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung sieht injizierbare Formulierungen vor, welche perkutane Abgabe von osteogenen Proteinen erlauben. In einer Ausführungsform umfasst die Erfindung Zusammensetzungen, welche eine pharmazeutisch annehmbare Beimischung aus einem osteogenen Protein zusammen mit einer Formulierung aus hämostatischem Gelatine-Schaum umfassen. Die injizierbaren Formulierungen der Erfindung erlauben es geschlossenen Brüchen ohne ein Verfahren der offenen Reduktion (open reduction procedure) behandelt zu werden, wie es bei implantierbaren Vorrichtungen notwendig ist. Hämostatischer Gelatine-Schaum erhält ein untereinander verbundenes, makroporöses Netzwerk aufrecht, was für Zellinfiltration und Angiogenese förderlich ist. Er absorbiert ebenfalls Blut und kann eine angereicherte Population von Osteoprogenitorzellen an der Traumastelle konzentrieren, wo rhBMP-2 vorhanden ist, um auf die Zellen zu wirken. Die injizierbare Formulierung umfasst osteogenes Protein, injizierbare Pasteformulierung von hämostatischem Gelatine-Schaum, zusammen mit Tricalciumphosphat.
Injizierbare Pasten von Gelfoam oder TCP/Gelfoam verstärken Heilung bei Defekten. Retention von rhBMP-2 (und vielleicht weiteren Knochen induktiven Proteinen) an der Stelle wird bei Abgabe in Gelfoam oder TCP/Gelfoam-Paste im Vergleich zur Abgabe in Puffer verstärkt. Zugabe von TCP verstärkt Retention des rhBMP-2 an der örtlichen Stelle.
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind für die Herstellung von Formulierungen von osteoinduktiven Proteinen brauchbar, welche neben anderen Verwendungen verwendet werden können, um die Bildung von Knorpel und/oder Knochen zu fördern, für Reparatur von Gewebeschaden und Frakturen. Die Erfindung sieht ferner Verfahren zum Behandeln von Patienten vor, welche einen Bedarf an Knorpel und/oder Knochenreparatur und/oder Wachstum haben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die Wirkung von 6 ml Gelfoam in MFR00842 + 200 μl BMP (heiß + kalt) dar.
2 und 3 vergleichen Retention von I¹²⁵-rhBMP-2 nach Injektion im Kaninchen-Osteotomie-Modell verglichen mit in einem Puffer abgegebenem rhBMP-2.
4, 5, 6 und 7 stellen biomechanische und Kallus-Bereich Testergebnisse in den Kaninchen-Osteotomie-Studien dar.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung sieht injizierbare Zusammensetzungen zur Abgabe von osteogenen Proteinen vor. Die Zusammensetzungen umfassen osteogenes Protein, eine injizierbare Formulierung, welche hämostatischen Gelatine-Schaum umfasst und Tricalciumphosphat. Die Erfindung sieht ferner ein Verfahren zum Herstellen des injizierbaren Gelatine-Schaums vor und die Erfindung schließt die Zusammensetzung ein, welche durch diese Zusammensetzung aus injizierbarem Gelatine-Schaum hergestellt wird.
Gelfoam-Formulierungen der Erfindung besitzen die Vorteile von (1) einfachem Herstellungsverfahren, (2) leichter Injizierbarkeit durch 18 g und 20 g Nadeln, (3) keinen zusätzlichen Vernetzungsmitteln, (4) langer medizinischer Geschichte als Implantat-Material, (5) relativ niedrigen Kosten und (6) keiner Einschränkung bezüglich Einsatzdauer (welche andere Materialien einschränken kann, die sich quervernetzen oder „verfestigen"). Ein zusätzlicher Hauptvorteil ist, dass Gelfoam-Paste als einheitliches Produkt formuliert und gelagert werden kann.
Die osteogenen Proteine, welche bei den kondensierten Schwämmen, hergestellt gemäß der gegenständlichen Erfindung, brauchbar sind, sind den Fachleuten gut bekannt und schließen die oben diskutierten ein. Die bevorzugten osteogenen Proteine zur Verwendung hierin sind jene der BMP-Klasse, identifiziert als BMP-1 bis BMP-12 in US-9877864; US-5013649; WO-90/11366, veröffentlicht am 4. Oktober 1990; WO-91/18098, veröffentlicht am 28. November 1991; WO-93/00432, veröffentlicht am 7. Januar 1993; US-Seriennummern 08/247908 und 08/247904, beide eingereicht am 20. Mai 1994; und US-Seriennummer 08/217780, eingereicht am 25. März 1994. Das am meisten bevorzugte ist BMP-2, deren cDNA-Sequenz in voller Länger detailliert im '649 Patent beschrieben wird. Natürlich können Kombinationen aus zwei oder mehr solcher osteogenen Proteine verwendet werden, wie auch Fragmente solcher Proteine, die ebenfalls osteogene Wirksamkeit aufweisen. Von solchen osteogenen Proteinen ist bekannt, dass sie homodimere Arten sind, aber auch Wirksamkeit als gemischte Heterodimere aufweisen. Heterodimere Formen von osteogenen Proteinen können ebenfalls bei der Praxis der gegenständlichen Erfindung verwendet werden. BMP-Heterodimere werden in WO-93/09229 beschrieben, dessen Offenbarung hiermit durch Verweis eingeschlossen wird. Rekombinante Proteine werden gegenüber natürlich vorkommenden, isolierten Proteinen bevorzugt. Die Menge an hierin brauchbarem osteogenen Protein ist die Menge, welche wirksam ist, erhöhte osteogene Wirksamkeit von infiltrierenden Progenitorzellen zu stimulieren und wird von der Größe und Art des behandelten Defekts, als auch dem eingesetzten Träger abhängen.
Die Formulierungen können zum Beispiel in Sehnen, Ligamente und/oder ihrer Anhaftungsstelle an Knochen injiziert werden. Injizierbare Formulierungen können auch an anderen Knochenstellen Anwendung finden, wie Knochenzysten und geschlossenen Frakturen.
Der Dosierungsplan wird durch klinische Indikation bestimmt, welche angesprochen wird, als auch durch verschiedene Patientenvariablen (z.B. Gewicht, Alter, Geschlecht) und klinische Präsentation (z.B. Ausmaß der Verletzung, Stelle der Verletzung usw.). Im Allgemeinen wird die Dosierung von osteogenem Protein im Bereich von etwa 0,1 bis 4 mg/ml sein.
Das injizierbare osteogene Protein kann der Klinik als einzelne Formulierung geliefert werden, oder die Formulierung kann als ein Multikomponenten-Kit geliefert werden, worin z.B. das osteogene Protein in einer Viale vorgesehen wird und der poröse, partikuläre, polymere, kondensierte Schwamm getrennt vorgesehen wird.
Die Formulierungen der gegenständlichen Erfindung erlauben es, therapeutisch wirksame Mengen an osteoinduktivem Protein an einer Verletzungsstelle abzugeben, wo Knorpel und/oder Knochenbildung gewünscht wird. Die Formulierungen können als Ersatz für autologes Knochentransplantat bei frischen und Non-Union Frakturen, spinalen Fusionen und Knochendefekt-Reparatur im orthopädischen Feld; bei kranio/maxillofazialen Rekonstruktionen; für Prothesenintegration, insbesondere als Oberflächenüberzug, um Befestigung von prothetischen Implantaten zu verbessern, wie mit Hydroxylapatite überzogene Prothesen; bei Osteomyelitis zur Knochenregeneration; und im dentalen Bereich für Erhöhung des Alveolarkamms und Periodontaldefekte und Zahnextraktionshöhlen verwendet werden. Die Verfahren und Formulierungen der vorliegenden Erfindung können bei der Behandlung und/oder Verhinderung von Osteoporose oder der Behandlung von osteoporotischem oder osteopenischem Knochen brauchbar sein. In einer weiteren Ausführungsform können Formulierungen der vorliegenden Erfindung in dem Verfahren verwendet werden, welches als Distraktionsosteogenese bekannt ist. Wenn es verwendet wird, um Osteomyelitis zu behandeln, oder für Knochenreparatur mit minimaler Infektion, kann das osteogene Protein in Kombination mit porösen Mikropartikeln und Antibiotika mit der Zugabe von Protein-Maskierungsmitteln wie Alginat, Cellulosen, insbesondere Carboxymethylcellulose, verdünnt unter Verwendung von wässerigem Glycerol verwendet werden. Das Antibiotikum wird hinsichtlich seiner Fähigkeit ausgewählt, Infektion zu verringern, während es eine minimale nachteilige Wirkung auf Knochenbildung hat. Bevorzugte Antibiotika zur Verwendung in den Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung schließen Vancomycin und Gentamycin ein. Das Antibiotikum kann jede pharmazeutisch annehmbare Form haben, wie Vancomycin-HCl oder Gentamycinsulfat. Das Antibiotikum ist vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis etwa 10 mg/ml vorhanden. Die traditionelle Herstellung von Formulierungen in pharmazeutisch annehmbarer Form (also Pyrogen-frei, angemessener pH und Isotonie, Sterilität usw.) ist gut innerhalb der Fähigkeiten nach Stand der Technik und ist auf die Formulierungen der Erfindung anwendbar.
Die folgenden Beispiele sind für die vorliegende Erfindung veranschaulichend und in keiner Weise eingrenzend. Modifikatio nen, Variationen und kleinere Verbesserungen werden erwogen und sind innerhalb der vorliegenden Erfindung.
BEISPIEL 1
EKTOPISCHE STUDIE MIT RATTEN
A. Herstellung von hämostatischer Gelatine-Schaummatrix
Gelfoam^®-Paste wurde am Tag der Implantation durch Hydratisieren einer Packung (1 g) Gelfoam-Pulver (Pharmacia/Upjohn) mit 5 ml MFR00842 Puffer formuliert. Puffer wurde direkt zum sterilen Gelfoam-Pulver Gefäß durch eine Pipette unter Verwendung aseptischer Technik in einem Bio-Sicherheitsschrank zugegeben. Das sich ergebende hydratisierte Pulver wurde dann mit einem sterilen Spatel für annähernd zwei Minuten gemischt, bis eine kohäsive, homogene, dicke, teigige Pastenkonsistenz erreicht wurde. Das Pastenvolumen nach Hydratation und Mischen betrug annähernd 6 ml. Formulierung von 0,1 mg/ml rhBMP-2 enthaltender Paste wurde durch Zugabe von 142 μl rhBMP-2 Masseflüssigkeit durchgeführt, zugegeben durch eine sterile Pipette gleichmäßig über der Paste. Die Paste wurde dann wieder gemischt, um das Protein gleichmäßig durch das gesamte Volumen zu verteilen. Die rhBMP-2 Endkonzentration in der Paste betrug 0,1 mg/ml.
Für injizierbare Proben, welche lyophilisiertes FN enthielten, wurden 5 mg lyophilisiertes FN in 0,5 ml bereitgestelltem Verdünnungsmittel gelöst. Das 0,5 ml FN enthaltende Volumen wurde dann zur Gelfoam-Paste (dem gesamten 6 ml Volumen) zugegeben und mit einem sterilen Spatel vor dem Aliquotieren in Spritzen gemischt. Die Endkonzentration von rhFN betrug 770 μg/ml.
Die Gelfoam-Paste wurde in das rückwärtige Ende einer 10 ml Spritze unter Verwendung eines sterilen Spatels eingebracht. Ein steriler Luer-Lock-Anschluss wurde dann an der 10 ml Spritze befestigt, um Ladung von drei ein-ml Spritzen mit Luer-Lock (Becton Dickonson) zu erleichtern.
B. Bewertung von rhBMP-2 Ladungsreproduzierbarkeit in injizierbare Aliquoten
Die Gleichförmigkeit von rhBMP-2 Ladung in Aliquoten von Gelfoam-Paste (hergestellt wie oben beschrieben) wurde unter Verwendung von radiomarkiertem I¹²⁵-rhBMP-2 getestet. Bei dieser Bewertung wurden 40 ml von I¹²⁵-rhBMP-2 (0,5 mCi/ml) mit 300 ml rhBMP-2 Masseflüssigkeit (kaltes Protein) gemischt. 200 ml die ser Proteinlösung (heißes und kaltes rhBMP-2) wurden dann gleichmäßig zu der 6 ml Gelfoam-Paste zugegeben. Die Paste wurde dann in eine 10 ml Spritze platziert und dann in fünf ein-ml Spritzen (gekennzeichnet Nr. 1–5) aliquotiert. Diese Bewertung simuliert eine 30-fache Verdünnung von rhBMP-2 Lösung in Gelfoam-Paste und das nachfolgende Misch- und Aliquotierverfahren.
Zum Simulieren eines typischen Injektionsverfahrens wurden vier aufeinander folgende 100 ml Proben von jeder der fünf Spritzen (18 g Nadeln) in einzelne Eppendorf-Röhren injiziert. Die Röhren wurden dann in einen Gammazähler (Wallac 1470 Wizard Automatic Gamma Counter) zur Bewertung der I¹²⁵-Zählungen pro Minute (CPM) platziert. Die Daten wurden bezüglich der Reproduzierbarkeit des Misch- und Aliquotierverfahrens analysiert.
C. Chirurgisches Verfahren
Die Gelfoam-Paste wurde bezüglich Wirksamkeit im ektopischen Knocheninduktionsmodell von Ratten getestet. 4–5 Wochen alte männliche Long Evans Ratten wurden in dieser Studie verwendet.
Es wurde Standardprotokollen bezüglich Tierversorgung, Implantation und Explantatanalyse gefolgt. Nach dem Rasieren, Markieren und Wiegen wurden die Tiere durch Inhalation von Isofluran in einer Glasglocke anästhetisiert.
Subkutane Injektionen wurden im Bauch-, Brust- oder Schulterblattbereich durchgeführt. Intramuskuläre Injektionen wurden im Quadrizeps/Wadenmuskel durchgeführt und am kontralateralen Bein wiederholt. Für alle Injektionen wurde eine 18 g, 1½" Nadel verwendet. Bei Beendigung der Studie (14 Tage) wurden die Tiere durch CO₂ Inhalation euthanasiert. Nach dem Tod wurden die Vorrichtungen entfernt, gewogen und bezüglich Konsistenz (Härte), Form, Gegenwart von Flüssigkeiten und Vaskularität untersucht. Explantierte Vorrichtungen wurden dann in markierte Gewebekassetten platziert und in 70% Ethanol getränkt.
D. Histologische Verarbeitung und Bewertungen
Proben wurden in 70% Ethanol erhalten, inventarisiert und für unentkalkte Histologie verarbeitet (Schenk et al.). Kurz: Proben wurden mit Gradienten von Alkohol dehydratisiert, in Xylol geklärt, unter Verwendung von Sakura VIP Tissue Processor. Proben wurden in Methylmethacrylat durchtränkt und eingebettet und durften für 3–5 Tage bei Raumtemperatur polymerisieren. Nach vollständiger Polymerisation wurden Blöcke bei 5 Mikron unter Verwendung eines Riechert-Jung Polycut oder Lecia 2065 Supercut unterteilt. Alle Objektträger wurden mit einem modifizierten Goldner's-Trichrome (Schenk et al.) befleckt. Die Fleckergebnisse sind: Nuklei violett-schwarz, Cytoplasma und Osteoid rot, mineralisierter Knochen und Collagen grün, Erythrozyten orange.
Die Größe des Explantats und der Prozentsatz an Knochen und rückständiger Matrix wurde unter Verwendung von Histomorphometrietechniken berechnet. Zelluläre Antwort falls vorhanden wurde ebenso vermerkt wie die Art der Antwort und das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Entzündung.
Jeder Objektträger wurde ähnlich bezüglich Prozentsatz Knochen und rückständiger Matrix bewertet. Unter dem Mikroskop wurde der Prozentsatz von Knochen und Matrix geschätzt und unter Verwendung der folgenden Skala bewertet.
E. Reproduzierbarkeit von rhBMP-2 Gelfoam-Paste Formulierung
Deskriptive Standardstatistiken wurden für alle Ergebnisvariablen errechnet. Die Wirkung von rhBMP-2 Behandlung und Zugabe von FN auf ektopische Knochenbildung wurde unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests verglichen. Die Tests waren zweiseitig und Unterschiede bei p < 0,05 als signifikant angesehen. Bewertung des Gesamtmittels der 20 Aliquoten (5 Spritzen) zeigte eine Standardabweichung von ± 13%. CPM pro Aliquote wird in 1 gezeigt. Es wurde kein offensichtlicher Trend als Funktion von Aliquotenzahl beobachtet.
G. Histologische Bewertung
Kontrollgruppen (kein rhBMP-2): Histologische Beobachtungen zeigten, dass die Matrix nur innerhalb von zwei Wochen resor biert wird, wenn rhBMP-2 vorhanden ist. Typische histologische Merkmale des ektopischen Gelfoam-Kontrollimplantats nach 14 Tagen waren eine partikuläre Struktur, umgeben von Riesenzellen und Spindelzellen an seiner Peripherie. Blutgefäße werden leicht durch die im Allgemeinen gut vaskularisierten Implantate beobachtet. Histologische Merkmale schienen zwischen allen Kontrollen ähnlich zu sein, einschließlich Gelfoam allein, mit Fibronectin und SQ oder IM implantiert.
rhBMP-2 Gruppen: Gelfoam/rhBMP-2 induzierter Knochen schien hauptsächlich durch den endochondralen Ossifikationsweg gebildet zu werden, da Chondrozyten und Knorpelmatrix durchwegs an der Knochenbildungsvorderseite gesehen wurden, wo der Knochen und die Trägermatrix getrennt wurden. Einige Bereiche an Knochen, welche durch den direkten Mechanismus gebildet wurden, waren vorhanden. Knochenbildung mit Gelfoam wurde von der Peripherie initiiert und erstreckte sich zum Zentrum des ektopischen Implantats. Daher wurde eine knochige Hülle im frühen Stadium der Knochenbildung gebildet.
Signifikante Unterschiede wurden zwischen SQ und IM Explantaten bei allen histologischen Merkmalen gefunden. Es wurde sehr wenig Knochenbildung bei SQ-Explantaten beobachtet, während wesentliche Knochenbildung bei IM-Explantaten gefunden wurde. Im Allgemeinen schienen Proben an der IM-Stelle eine bessere Gesamtantwort, größeren Grad der Matrixresorption und Knochenbildung im Vergleich zu den SQ-Proben zu haben. Knochenresorption ist sowohl bei IM-, als auch SQ-Proben vorhanden. IM-Proben zeigen signifikant mehr reifen Knochen, Knochenmark und weniger verbleibende Matrix. Minimaler Muskelabbau wurde bemerkt. IMzelluläre Infiltration des Trägers war größer als bei den SQ-Proben und bestand aus zahlreichen Lymphozyten und Riesenzellen.
Subkutane Proben zeigten zelluläre Infiltration von Matrix, bestehend aus überwiegend Lymphozyten. Riesenzellen waren an der Peripherie des Materials reichlich vorhanden und ein paar wurden zum Zentrum hin bemerkt. Matrix schien nicht vollständig in vielen Bereichen resorbiert zu sein, wo SQ-Knochenbildung vorhanden ist. Knochen wird angrenzend an den Träger gebildet.
Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen mit Gelfoam allein und mit Fibronectin formulierten Implantaten gefunden werden, außer dass Gelfoam allein einen leicht höheren Knochenwert hat. Beide Formulierungen leisteten schlecht an der SQ-Stelle aber sehr gut an der IM-Stelle.
Diese Beobachtungen spiegeln sich in den durchschnittlichen Knochenwerten (Tabelle 1) unten wider.
Tabelle 1: Histologische durchschnittliche Knochenwerte
Die injizierbare Gelfoam-Paste mit rhBMP-2 induzierte reifen Knochen innerhalb von zwei Wochen an sowohl intramuskulären, als auch subkutanen Stellen. Die Antwort an der intramuskulären Stelle war viel robuster im Vergleich zur subkutanen Stelle. Große, gut-vaskularisierte, knochige Explantate wurden aus der IM-Stelle gewonnen. Die durchschnittlichen Knochenwerte waren 3,4 ± 0,7 für IM-Explantate und 1,3 ± 1 für SQ-Explantate, welche rhBMP-2 enthielten. Gelfoam-Paste allein induzierte weder Knochen, noch resorbierte es signifikant im zweiwöchigen Implantatzeitraum. Dies ist kein unerwartetes Ergebnis, da vollständige Resorption in 4–6 Wochen in weichen Geweben und Verflüssigung in 2–5 Tagen unter reichlichen Blutungsbedingungen die normale Erwartung für das Gelfoam-Material ist.
Die Zugabe von FN zum Gelfoam verbesserte nicht die Rate der Zellmigration, Adhäsion oder Ausbreitung signifikant, um die Knochenbildung zu verbessern. Es ist möglich, dass die in diesem Versuch verwendete Konzentration an FN (770 mg/ml) nicht angemessen oder nicht gleichmäßig in der Paste dispergiert war. Eine Alternative kann sein, RGD-Peptide zu nutzen, um die Zelladhäsivität und Migration von Zellen zur Matrix zu erhöhen. Eine alternative Hypothese ist, dass die Wirkung von rhBMP-2 bei dieser Dosierung im ektopischen Modell von Ratten jede FN-Wirkung überwältigt, die in einem weniger reaktiven Modell nachweisbar werden kann.
Die Studie bewertete ebenfalls die Dosis-Reproduzierbarkeit des gegenwärtigen Formulierungsverfahrens. Ergebnisse mit gekennzeichnetem Protein zeigen an, dass das Verfahren angemessen ist, rhBMP-2 gleichförmig innerhalb der Pastenmasse zu verteilen. Insgesamt war in einer injizierbaren Gelfoam-Paste abgegebenes rhBMP-2 wirksam beim Induzieren von Knochen in sowohl den intramuskulären, als auch subkutanen Stellen dieses Modells.
BEISPIEL 2
KANINCHEN-ULNA OSTEOTOMIE-STUDIE
A. Herstellung von hämostatischer Gelatine-Schaum Matrix
16,7 Gew.-% Gelfoam-Paste, welche rhBMP-2 enthielt, wurde durch Hydratisieren von Gelfoam-Pulver (Pharmacia/Upjohn) mit Glutaminsäurepuffer (pH = 4,5; 400 mg rhBMP-2) wie oben für die ektopische Studie bei Ratten beschrieben hergestellt. In Ausführungsformen, welche TCP umfassen, wurde der TCP/Gelfoam (70:30 Gew.-Verhältnis), welcher rhBMP-2 enthielt, durch Hydratisieren von Verbundpaste hergestellt, TCP (gesiebt auf 45–125 Mikron Gelfoam-Pulver mit Glutaminsäurepuffer Partikelgröße) wurde gleichmäßig in die Paste dispergiert. Diese Formulierungen wurden als gut geeignet für die Injektion durch eine 18er Nadel bestimmt, während sie es der Paste ermöglichten, die kohäsive Konsistenz zu bewahren, welche zur Lokalisation an der defekten Stelle notwendig ist. Zusätzlich wurde eine Indikatormenge an I¹²⁵-rhBMP-2 in die Paste eingearbeitet, um Bestimmung des lokalen Retentionsprofils unter Verwendung von szintigraphischen Abbildungstechniken zu erlauben.
B. Kaninchen-Ulna Osteotomie-Modell
Beidseitige Mittel-Ulna 1 mm Osteotomie-Defekte wurden in 8 erwachsenen, männlichen New Zealand White Kaninchen erzeugt. Ein Glied in jedem Kaninchen erhielt eine Injektion aus rhBMP-2 in Gelfoam-Paste; das gegenüber liegende Glied diente als chirurgische Kontrolle. Die Gelfoam-Paste (0,2 ml, welche 400 μg rhBMP-2 enthielt) wurde durch eine Spritze in und um den Defekt unter Verwendung einer 18er Nadel injiziert. Nach 4 Wochen wurden die Kaninchen geopfert und die Glieder operativ entfernt. Kallus-Bildung wurde unter Verwendung von peripherer quantitativer Computertomographie (pQCT) bestimmt. Biomechanische Tests wurden durch Einbetten der Glieder und Testen bis zum Versagen in Torsion unter Verwendung eines servohydraulischen Materialtestsystems (Model 8500, Instron, Corp.) durchgeführt. Histologie wurde an repräsentativen Proben und Abschnitten, befleckt mit Goldners Trichrom durchgeführt.
In der Gelfoam/TCP Studie wurden beidseitige Mittel-Ulna 1 mm Osteotomie-Defekte in 24 erwachsenen, männlichen New Zealand White Kaninchen (8 Kaninchen pro Gruppe) erzeugt. Ein Glied in jedem Kaninchen erhielt eine Injektion aus rhBMP-2/Träger; das gegenüber liegende Glied diente als chirurgische Kontrolle. Jeder Träger oder Puffer (0,15 ml, welcher 100 μg rhBMP-2 enthielt) wurde durch eine Spritze in und um den Defekt injiziert. In vivo Bioverteilung von I¹²⁵-rhBMP-2 wurde unter Verwendung von Gamma-Radiographie quantifiziert. Nach vier Wochen wurden in vivo Bioverteilung und Wirksamkeit wie oben beschrieben getestet.
C. Retention von I¹²⁵-rhBMP-2 im Kaninchen Osteotomie-Modell
Retention von I¹²⁵-rhBMP-2 nach Injektion im Bereich des Defekts (2) wurde mit rhBMP-2, abgegeben in einem Puffervehikel, für 3 Kaninchen verglichen. Die mittlere Verweilzeit (MRT) betrug 4,43 Tage, bzw. 1,72 Tage für rhBMP-2, abgegeben in Gelfoam bzw. Puffer. Entsprechend war die rhBMP-2 Halbwertszeit (t1/2) 3,44 Tage, bzw. 1,11 Tage für Gelfoam, bzw. Puffer. Nach 7 Tagen war das in Puffer abgegebene rhBMP-2 nicht länger nachweisbar; jedoch war in Gelfoam abgegebenes rhBMP-2 14 Tage nach Injektion nachweisbar.
Retention von I¹²⁵-rhBMP-2 in Gelfoam und TCP/Gelfoam-Pasten nach Injektion im Bereich des Defekts (3) wurde mit rhBMP-2, abgegeben im Puffervehikel, für 3 Kaninchen/Gruppe verglichen. Die mittlere Verweilzeit (MRT) betrug 4,4 Tage, 5,9 Tage bzw. 1,7 Tage für rhBMP-2, abgegeben in Gelfoam, TCP/Gelfoam bzw. Puffer. Entsprechend betrug die rhBMP-2 Halbwertszeit (t1/2) 3,4 Tage, 4,1 Tage bzw. 1,1 Tage für Gelfoam, TCP/Gelfoam bzw. Puffer. Nach 7 Tagen war das in Puffer abgegebene rhBMP-2 an der Stelle nicht länger nachweisbar; jedoch war in Gelfoam oder TCP/Gelfoam-Paste abgegebenes rhBMP-2 13–14 Tage nach Injektion nachweisbar.
D. Biomechanische und Kallus-Bereich Bewertung
16 Glieder (8 Kontrolle und 8 rhBMP-2 behandelte) wurden bezüglich Kallus-Bereich und biomechanischer Stärke (maximales Drehmoment) bewertet. Ein gepaarter t-Test bestimmte, dass sowohl Kallus-Bereich, als auch biomechanische Stärke größer in den mit rhBMP-2 behandelten Gliedern, als in den Kontrollgliedern waren (4, 5). Der mittlere % Unterschied zwischen behandelter und Kontrollgruppe betrug 51% bzw. 84% für Kallus-Bereich, bzw. maximales Drehmoment.
In der Gelfoam/TCP-Studie bestimmte ein gepaarter t-Test, dass sowohl Kallus-Bereich, als auch biomechanische Stärke in den mit rhBMP-2 behandelten Gliedern signifikant größer waren, als in den Kontrollgliedern für Gelfoam-Paste und TCP/Gelfoam-Paste (p < 0,05). Jedoch waren bei in Puffervehikel abgegebenem rhBMP-2 die behandelten Glieder nicht statistisch anders als die Kontrollgliedergruppe. Der mittlere % Anstieg gegenüber der Kontrolle wurde für Kallus-Bereich und maximales Drehmoment berechnet (6–7). Der % Anstieg im Kallus-Bereich und maximalem Drehmoment war beides für die TCP/Gelfoam-Gruppe am höchsten und für Abgabe von rhBMP-2 in Puffer am niedrigsten.
E. Histologie-Bewertung
Histologische Bewertung von 3 repräsentativen Gliederpaaren in der Gelfoam-Studie zeigte, dass der Defekt zu 100 mit knochigem Kallus zur Zeit der Opferung (4 Wochen) für die mit rhBMP-2 behandelten Glieder überbrückt war, während der Defekt bei den unbehandelten Kontrollgliedern nur teilweise überbrückt war. Diese Beobachtung wurde durch Röntgenaufnahmen bestätigt, welche nach 4 Wochen aufgenommen worden.
Histologische Bewertung von repräsentativen Gliedern in der Gelfoam/TCP-Studie zeigte, dass der Defekt zu 100 für die mit Gelfoam und TCP/Gelfoam rhBMP-2 behandelten Glieder überbrückt war, während der Defekt bei den unbehandelten Kontroll- und Puffergliedern nur teilweise überbrückt war.
Die vorhergehenden Beschreibungen zeigen detailliert gegenwärtig bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Es wird von den Fachleuten erwartet, dass bei Erwägen dieser Beschreibungen zahlreiche Modifikationen und Variationen in der Praxis davon stattfinden werden. Von diesen Modifikationen wird angenommen, dass sie innerhalb der hieran angehängten Ansprüche umfasst werden.

Claims

Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen, welche eine ein pharmazeutisch annehmbare Beimischung umfasst, welche umfasst: (a) ein osteogenes Protein; (b) eine hämostatische Gelatine-Schaumpaste; und (c) Tricalciumphosphat.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das osteogene Protein ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Mitgliedern der BMP-Familie.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das osteogene Protein BMP-2 ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, welche poröse Mikropartikel und eines oder mehrere Antibiotika umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, welche ein Protein-Maskierungsmittel umfasst, ausgewählt aus Alginat und Cellulosederivat.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das osteogene Protein OP-1 ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Verletzungsstelle, wobei Knorpel- und/oder Knochenbildung erwünscht ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von einem oder mehreren Zuständen, ausgewählt aus der Gruppe umfassend frische und Non-Union Frakturen, spinale Fusionen, orthopädische Knochendefekte, Osteomyelitis, osteoporotischen und osteopenischen Knochen, Periodontaldefekte, Zahnextraktionshöhlen und Distraktions-Osteogenese.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Medikaments für kranio/maxillofaziale Rekonstruktionen und/oder Prothesenintegration.