DE69213739T2

DE69213739T2 - Osteogene proteine enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE69213739T2
Application number: DE69213739T
Authority: DE
Inventors: Benjamin S. Tewksbury Ma 01876 Isaacs; Richard A. Andover Ma 01810 Kenley; Himakshi Tewksbury Ma 01876 Patel; Eyal Lexington Ma 02173 Ron; Thomas J. Boston Ma 02124 Turek
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1991-06-21
Filing date: 1992-06-22
Publication date: 1997-02-20
Anticipated expiration: 2012-06-23
Also published as: ES2094359T3; CA2111199C; WO1993000050A1; AU2254292A; EP0591392A1; EP0591392B1; MX9203083A; NO307402B1; KR0145278B1; GR3021627T3; FI109274B; FI935732L; DK0591392T3; NO934573D0; US5597897A; JPH06508777A; CA2111199A1; JP3351525B2; ATE142460T1; NO934573L

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet osteogener Proteine und pharmazeutische Formulierungen davon. Insbesondere umfaßt die Erfindung pharmazeutische Formulierungen, die zum Sequestrieren eines osteogenen Proteins in situ für einen ausreichenden Zeitraums entwickelt wurden, um dem Protein die Induktion der Knorpel- und/oder Knochenbildung zu ermöglichen.
Osteogene Proteine sind jene Proteine, welche die Knorpel- und/oder Knochenbildung induzieren oder die Induktion unterstützen können. Viele solcher osteogener Proteine wurden in den letzten Jahren isoliert und charakterisiert, und einige wurden durch gentechnische Verfahren hergestellt. Beispielsweise wurden sogenannte knochenmorphogene Proteine (BMP) aus demineralisiertem Knochengewebe isoliert (vgl. z.B. Urist US-4,455,256); eine Anzahl solcher BMP-Proteine wurden durch gentechnische Verfahren hergestellt (vgl. z.B. Wang et al., US-4,877,864, und Wang et al.. US-5,013,549); eine Familie transformierender Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β) wurde als potentiell wertvoll bei der Behandlung von Knochenerkrankungen identifiziert (vgl. z.B. Derynck et al., EP-154,434) es wurde festgestellt, daß ein als Vgr-1 bezeichnetes Protein in großen Mengen in osteogenen Zellen exprimiert wird (vgl. Lyons et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 4554-4558); und es wurde ausdrücklich gezeigt, daß als OP-1, COP-5 und COP-7 bezeichnete Proteine eine die Knochenbildung induzierende Aktivität besitzen (vgl. Opperman et al.. US- 5,001,691).
Verschiedene Versuche wurden zur Entwicklung von Formulierungen unternommen, die zur Verabreichung osteogener Proteine an einer Stelle, wo die Induktion der Knochenbildung erwünscht ist entwickelt wurden. Beispielsweise wurden bestimmte polymere Matrices wie das Acrylesterpolymer (Urist, US-4,526,909) und das Milchsäurepolymer (Urist, US-4,563,489) verwendet, jedoch sequestrieren diese Formulierungen das osteogene Protein nicht für einen zur optimalen Induktion der Knochenbildung ausreichenden Zeitraum und außerdem wurde festgestellt, daß sie für eine optimale Knochenbildung zu langsam erodieren.
Eine biologisch abbaubare Matrix poröser Partikel zur Verabreichung eines als OP bezeichneten osteogenen Proteins wird bei Kuberasampath, US-5,108,753, offenbart. Obwohl die US-5,108,753 offenbart, daß ein geeigneter Träger für OP das Protein binden, als Verabreichungssystem mit langsamer Wirkstofffreisetzung wirken, sich jedem Schritt der zellulären Antwort während der Knochenentwicklung anpassen und das Protein vor unspezifischer Proteolyse schützen muß, werden keine Formulierungen vorgeschlagen, die Komponenten enthalten, die OP besonders an der Stelle sequestrieren, wo eine Knochenbildung erwünscht ist.
Okada et al., US-4,652,441, US-4,711,782, US-4,917,893 und US-5,061,492, und Yamamoto et al., US-4,954,298, offenbaren eine Mikrokapsel mit anhaltender Wirkstofffreisetzung, umfassend einen Polypeptidwirkstoff und einen Wirkstoff-festhaltenden Stoff, eingekapselt in einer von einer Polymerwandsubstanz in einer äußeren Ölschicht umgebenen inneren wäßrigen Schicht. Obwohl das knochenmorphogene Protein als Polypeptid aufgeführt wird, das in einer solchen Form vorliegen kann, verhindert die Mikroeinkapselung osteogener Proteine die für eine optimale Knochenbildung ausreichende kontrollierte Freisetzung eines solchen Proteins.
EP-A2-0 145 420 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln. Die Mikrokapseln werden als Wasser-in-Öl-Emulsion hergestellt, umfassend eine innere wäßrige Schicht mit einem Wirkstoff und einem Wirkstoff-festhaltenden Stoff und eine Ölschicht mit einem Polymermaterial. Die Mikrokapseln enthalten kein ein osteogenes Protein sequestrierendes Mittel.
Kollagenmatrices wurden ebenfalls als Verabreichungsmittel für osteogene Proteine verwendet (vgl. z.B. Jeffries, US-4,394,370), jedoch verursacht Kollagen häufig bei Patienten unerwünschte antigene Reaktionen. Deshalb besteht ein Bedarf für eine pharmazeutische Formulierung, die osteogene Proteine an einer Stelle sequestrieren kann, wo die Induktion der Knochenbildung für einen ausreichenden Zeitraum erwünscht ist, um eine sichere, wirksame Induktion einer solchen Knochenbildung zu ermöglichen.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein pharmazeutisch verträgliches Gemisch aus einem osteogenen Protein; einer Polymermatrixkomponente. ausgewählt aus Polymilchsäure, Polyglykolsäure und Copolymeren aus Milchsäure und Glykolsäure; und einer ein osteogenes Protein sequestrierenden Alkylcellulose.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein pharmazeutisch verträgliches Gemisch aus einem osteogenen Protein; einer Polymermatrixkomponente, ausgewählt aus Polymilchsäure, Polyglykolsäure und Copolymeren aus Milchsäure und Glykolsäure; und einem ein osteogenes Protein sequestrierenden Mittel, ausgewählt aus Hyaluronsäure, Alginat, Polyethylenglykol, Polyoxyethylenoxid, Carboxyvinylpolymer und Polyvinylalkohol.
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend Polymerpartikel mit einem Kugeldurchmesser zwischen etwa 150 und 850 µm (Mikron) und einer Porosität, so daß die Oberfläche der Partikel etwa 0,02 bis 4 m²/g beträgt, wobei das Polymer aus Polymuchsäure, Polyglykolsäure und Copolymeren von Milchsäure und Glykolsäure ausgewählt ist; gegebenenfalls im Gemisch mit einem osteogenen Protein.
Nach einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein pharmazeutisch verträgliches Gemisch aus einem osteogenen Protein und einer wirksamen solubilisierenden Menge eines Mitglieds, ausgewählt aus Arginin, Histidin, Dextransulfat, -Aminobuttersäure, β-Aminopropionsäure, Glycin-Glycin, Glycinethylester, Histidinethylester, Lysinmethylester, Argininmethylester, Guanidin, Natriumchlorid, Heparin, Lysin, β-Alaninethylester und Agmatin.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die erfindungsgemäß nützlichen osteogenen Proteine sind dem Fachmann gut bekannt und schließen die vorstehend diskutierten ein. Die bevorzugten osteogenen Proteine für die erfindungsgemäße Verwendung umfassen diejenigen der BMP-Klasse, die in US- 4,877,864; US-5,013,649; WO-90/11366, veröffentlicht am 4. Oktober 1990, und WO- 91/18098, veröffentlicht am 28. November 1991, als BMP-1 bis BMP-8 identifiziert wurden. Das am meisten bevorzugte ist BMP-2, worin die reife Proteinsequenz mit der Aminosäure Gln bei Nucleotid 1202 beginnt und mit der Aminosäure Arg bei Nucleotid 1543 endet, wie ausführlich in dem '649-Patent beschrieben. Selbstverständlich können Kombinationen von zwei oder mehreren solcher osteogener Proteine verwendet werden, sowie Fragmente solcher Proteine, die auch eine osteogene Aktivität zeigen, und heterodimere Formen solcher Proteine. Rekombinate Proteine werden natürlich vorkommenden, isolierten Proteinen vorgezogen. Die Menge des hier nützlichen osteogenen Proteins entspricht der Menge, die zur Stimulierung einer verstärkten osteogenen Aktivität infiltrierender Stammzellen wirksam ist, und hängt von der Größe und Art des behandelten Zustands ab, wie nachstehend ausführlicher beschrieben; solche Mengen liegen in Größenordnungen in einer Höhe von weniger als der Menge des verwendeten Polymergrundstoffs vor, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 50 µg Protein für je 10 mg des verwendeten Polymergrundstoffs und stärker bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 5 µg Protein für jedes mg des verwendeten Polymergrundstoffs.
Die osteogenen Proteine können in Form einer pharmazeutisch verträglichen Lösung oder in gefriergetrockneter Form verwendet werden. In jedem Fall ist es optimal, das osteogene Protein zu stabilisieren und solubilisieren, vorzugsweise in Konzentrationen von mindestens 1 mg/ml, so daß eine pharmazeutisch wirksame Menge des Proteins verabreicht werden kann, ohne daß übermäßige Volumen der Trägerlösung erforderlich sind. Jedoch besteht ein Problem insofern als osteogene Proteine, besonders jene der BMP-Familie, nachweislich schwierig zu solubilisieren sind. Wie in den nachstehenden Beispielen ausführlich beschrieben, wurde festgestellt, daß Aminosäuren mit einer positiven Nettoladung (z.B. Netto-1+-Arten wie Arginin, Histidin, Lysin und die Ethylester von Glycin und β-Alanin), vorzugsweise einer 2+-Nettoladung (z.B. der Ethylester von Histidin, die Methylester von Lysin und Arginin und Agmatin), in dieser Hinsicht nützlich sind. In dieser Hinsicht sind Aminosäuren mit einer Nettoladung von Null nützlich, mit der Maßgabe, daß die positive Ladung der Verbindung ausreichend (zumindest 2-3 CH&sub2;-Einheiten entfernt) von der neutralisierenden negativen Ladung entfernt ist (z.B. Netto-neutrale Arten wie -Aminobuttersäure, β-Aminopropionsäure und das Glycin-Glycin-Dipeptid). Andere hier nützliche Solubilisierungsmittel umfassen Dextransulfat, Guanidin, Heparin und Natriumchlorid. Zur Solubilisierung von BMP-2 sind die bevorzugten Solubilisierungsmittel Arginin und Histidin (einschließlich von Estern davon). Arginin wird in Konzentrationen von etwa 50 bis 600 mM, vorzugsweise 300 bis 500 mM, verwendet. Histidin kann zu Arginin zur Solubilisierung von BMP-2 in Konzentrationen von etwa 1 bis 100 mM, vorzugsweise 10 bis 50 mM, zugegeben werden. Wird Histidin allein als Solubilisierungsmittel verwendet, wird es in Konzentrationen von etwa 50 bis 600 mM, vorzugsweise 300 bis 500 mM, verwendet. Verschiedene gut bekannte Verfahren können zur Verbindung des osteogenen Proteins und der hier verwendeten Solubilisierungsmittel angewendet werden. einschließlich. ohne Einschränkung darauf, Ultrafiltration, Dialyse, Gelfiltration und hydrophobe Wechselwirkungschromatographie.
Die erfindungsgemäß nützliche Polymermatrixkomponente ist ein Polymermaterial, das wie nachstehend beschrieben zu porösen Partikeln geformt werden kann, wodurch in situ ein Gerüst für das osteogene Proteine bereitgestellt wird, während es biologische Abbaueigenschaften besitzt, die das Ersetzen durch neues Knochenwachstum ermöglichen. Beispiele sind Polymere aus Aminosäuren, Orthoestem, Anhydriden, Propylen-Co-Fumaraten oder ein Polymer aus einem oder mehreren α-Hydroxycarbonsäure-Monomeren, z.B. α-Hydroxyessigsäure (Glykolsäure) und/oder α-Hydroxypropionsäure (Milchsäure). Die letztere kann in ihrer d- oder 1-Form oder als racemisches Gemisch verwendet werden, wobei das racemische Gemisch bevorzugt wird. Bei der Verwendung eines Copolymers aus Milchsäure und Glykolsäure (PLGA) kann das Molverhältnis der Monomere im Bereich von 1:99 bis 99:1 liegen, abhängig von der gewünschten Lebensdauer aufgrund Bioerosion, die wiederum von dem angesprochenen klinischen Symptom abhängt, z.B. folgt aus einer Konzentration von mehr als 50% jedes Monomers eine längere Lebensdauer aufgrund Bioerosion (langsamerer biologischer Abbau). Das Molekulargewicht des Polymers kann im Bereich von etwa 1000 bis 100 000 liegen, wobei bei der Verwendung eines 50:50-Copolymers ein Molekulargewicht von 30 000 bis 50 000 bevorzugt wird. Je höher das Molekulargewicht ist, desto langsamer erfolgt der biologische Abbau.
Die erfindungsgemäße Polymermatrixkomponente wird in Form von stark porösen bis hohlen (mit einer Oberflächenporosität) Partikeln verwendet, die nachstehend gemeinsam als "poröse Partikel" bezeichnet werden. Diese porösen Partikel sind im allgemeinen kugelförmig mit Durchmessern von 150 bis 850 µm (Mikron). Diese Partikelgröße erzeugt einen ausreichenden Abstand zwischen den Partikeln, um zu ermöglichen, das Säuger-Knochenstammzellen infiltrieren und positiv durch das osteogene Protein beeinflußt werden (nachgewiesen durch eine Steigerung der osteogenen Aktivität/Knochenwachstumsrate).
Obwohl allgemein gefordert wurde, daß die als Matrices zur Verabreichung osteogener Proteine geeigneten Partikel porös sein sollten, wurde der Umfang der zur optimalen Induktion der Knochenbildung erforderlichen Porosität bisher nicht untersucht. Die hier genannten Erfinder haben entdeckt, daß die durchschnittliche Oberfläche pro porösem Partikel für die Optimierung der Knochenbildung kritisch ist. Insbesondere sollten bei der Knochenbildung nützliche erfindungsgemäße poröse Partikel eine durchschnittliche Oberfläche von etwa 0,02 bis 4 m²/g aufweisen. Die Erfinder haben außerdem entdeckt, daß die Herstellung von porösen Partikeln mit der gewünschten Oberfläche durch Einbringen eines "Porosigens" (Zusammensetzung, die durch die Vergrößerung der Partikeloberfläche eine Porosität verleihen kann) in die zur Herstellung der porösen Partikel verwendeten Lösung möglich ist. Es ist auch möglich, die Bioerosionsrate zu kontrollieren, indem die porösen Partikel sterilisierenden -Strahlungsdosen ausgesetzt werden. Je höher die -Strahlungsdosis ist, desto schneller ist die Bioerosion.
Das erfindungsgemäße und nachstehend diskutierte Verfahren zur Herstellung poröser Partikel ergibt Partikel mit einer Porosität, so daß die Oberfläche der Partikel um etwa das 2- bis 250fache der Oberfläche nicht-poröser Partikel vergleichbarer Größe vergrößert wird. Insbesondere weisen z.B. nicht-poröse PLGA-Partikel mit einer durchschnittlichen Größe von 400 µm eine Oberfläche von 0,018 m²/g auf. Im Gegensatz dazu weisen erfindungsgemäße, unter Verwendung von 50% NaCl als Porosigen hergestellte PLGA-Partikel eine Oberfläche von etwa 0,2 bis 0,6 m²/g auf, und unter Verwendung von Saccharose als Porosigen hergestellte Partikel weisen eine Oberfläche zwischen etwa 0,04 und 0,09 m²/g auf, wie in Beispiel 1 beschrieben. Erfindungsgemäße, unter Verwendung eines flüssigen Porosigens durch Homogenisieren hergestellte PLGA-Partikel, wie in Beispiel 2 beschrieben, weisen eine Oberfläche zwischen etwa 0,02 und 4 m²/g auf.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen porösen Partikel ist, allgemein ausgedrückt, ein Lösungsmittelabdampfverfahren, umfassend Lösen des Polymers (in z.B. CH&sub2;Cl&sub2;) und Zugabe eines Porosigens, z.B. NaCl, Mannit oder Saccharose, in fester und/oder flüssiger Form. Bei der Zugabe des Porosigens in fester Form nimmt die Matrix-Porosigen-Lösung die Form einer Suspension an. Ein anderes bevorzugtes Herstellungsverfahren der erfindungsgemäßen porösen Partikel ist ein Lösungsmittelextraktionsverfahren, wobei das Porosigen in flüssiger Form unter gleichzeitigem Homogenisieren zugegeben wird. Bei der Zugabe des Porosigens in flüssiger Form unter Homogenisieren nimmt die Matrix-Porosigen-Lösung die Form einer Emulsion an. Bei jedem Verfahren wird die Matrix-Porosigen-Emulsion einem Überschuß einer wäßrigen Lösung mit einem grenzflächenaktiven Mittel wie Polyvinylalkohol unter kontrolliertem Rühren und bei kontrollierter Temperatur zugegeben. Die erhaltenen porösen Partikel werden durch Extrahieren oder Abdampfen des restlichen Lösungsmittel gehärtet und getrocknet.
Der poröse Charakter der erfindungsgemäßen Partikel erzeugt eine ausreichend große Oberfläche zur Proteinadsorption und verbessert den biologischen Abbau, wobei der gewunschte Umfang von beidem von dem angesprochenen klinischen Symptom abhängt. Die Oberfläche kann durch jedes herkömmliche Verfahren gemessen werden. Beispielsweise kann die BET-Oberflächenanalyse unter Verwendung eines Micrometrics ASAP 2000-Systems angewendet werden, wie nachstehend in den Beispielen 1 und 2 ausführlicher erläutert wird. Die zur Behandlung eines bestinunten Defektes verwendete Menge poröser Partikel hängt natürlich von der Größe des behandelten Defekts und von der wirksamen, zur Adsorption des osteogenen Proteins erforderlichen Menge ab.
Das erfindungsgemäß nützliche, ein osteogenes Protein sequestrierende Material ist ein pharmazeutisch verträglicher Stoff mit einer Viskosität und Polarität, so daß bei der Zugabe zu einer Kombination aus osteogenem Protein/porösem Partikel eine formbare (Kittähnliche) Zusammensetzung hergestellt wird, die für eine chirurgische Implantation an einer Verletzungsstelle geeignet ist. Die Zugabe des sequestrierenden Mittels zur Kombination aus biologisch erodierbaren porösen Partikeln plus osteogenem Protein hält das adsorbierte Protein innerhalb der Matrix für einen ausreichenden Zeitraum, um dem Protein die Erhöhung der sonst natürlichen Rate der osteogenen Aktivität infiltrierender Säuger-Stammzellen zu ermöglichen. Das sequestrierende Mittel ermöglicht dem osteogenen Protein außerdem die Diffusion aus der formbaren Zusammensetzung über einen zur optimalen Erhöhung der osteogenen Aktivitätsrate der Stammzellen geeigneten Zeitraum. In Abwesenheit eines solchen sequestrierenden Stoffs wird das adsorbierte osteogene Protein aus den PLGA-Partikeln in situ in einer solchen Rate entfernt, daß die die Knochenbildung induzierende Wirkung des Proteins klinisch nicht signifikant ist.
Eine bevorzugte Familie sequestrierender Mittel sind Cellulosematerialien, wie Alkylcellulose (einschließlich Hydroxyalkylcellulose), umfassend Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Carboxymethylcellulose, wobei die am meisten bevorzugten die kationischen Salze von Carboxymethylcellulose (CMC) sind. Andere bevorzugte sequestrierende Mittel umfassen Hyaluronsäure, Natriumalginat, Polyethylenglykol, Polyoxyethylenoxid, Carboxyvinylpolymer und Polyvinylalkohol. Die Menge des hier nützlichen sequestrierenden Mittels beträgt 0,5 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der gesamten Formulierung, die der zur Vorbeugung vor einer Desorption des osteogenen Proteins aus der Polymermatrix und zur Bereitstellung einer geeigneten Handhabung der Zusammen- Setzung erforderlichen Menge entspricht, die jedoch nicht so groß, daß die Stammzellen am Infiltrieren der Matrix gehindert werden, wodurch dem Protein die Gelegenheit gegeben wird, die osteogene Aktivität der Stammzellen zu fördern.
Zusätzliche zur Durchführung der Anmeldung nützliche wahlweise Komponenten umfassen z.B. Gefrierschutzstoffe, wie Mannit, Saccharose, Lactose, Glucose oder Glycin (zum Schutz des osteogenen Proteins vor einem Abbau wällrend des Gefriertrocknens), antimikrobielle Konservierungsmittel, wie Methyl- und Propylparabene und Benzylalkohol; Antioxidationsmittel, wie EDTA, Citrat und BHT (butyliertes Hydroxytoluol); und grenzflächenaktive Mittel, wie Polysorbate und Polyoxyethylene; etc.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das osteogene Protein nicht in der PLGA- Polymerisierungslösung eingeschlossen oder in PLGA-Mikrokapseln eingekapselt, sondern wird den bereits polymerisierten porösen Partikeln zugegeben. Es wird bevorzugt, die porösen Partikel der Lösung des osteogenen Proteins vor der Zugabe des sequestrierenden Mittels zuzugeben, um dem Protein die Adsorption an die Partikel zu ermöglichen. Selbstverständlich ist die herkömmliche Herstellung von Formulierungen in einer pharmazeutisch verträglichen Form (d.h. pyrogenfrei, geeignete(r) pH-Wert und Isotonizität, Sterilität, etc.) dem Fachmann gut bekannt und auf die erfindungsgemäßen Formulierungen anwendbar. Die Formulierungen können der Klinik als Einzelfläschchen-Formulierungen bereitgestellt werden, entweder als Lösung oder in gefriergetrockneter Form, oder die Formulierung kann als Mehrkomponenten-Kit bereitgestellt werden, wobei z.B. das osteogene Protein in einem Fläschchen bereitgestellt wird, und die porösen Partikel und das sequestrierende Mittel in einem oder mehren separaten Fläschchen bereitgestellt werden.
Wie in den nachstehenden Beispielen 4 und 5 gezeigt, stellen die erfindungsgemäßen Formulierungen formbare Implantate bereit, welche die Verabreichung von therapeutisch wirksamen Mengen des die Knochenbildung induzierenden Proteins an eine Verletzungsstelle ermöglichen, wo eine Knorpel- und/oder Knochenbildung erwünscht wird. Ein solches Implantat kann als Ersatz für ein autologes Knochentransplantat bei frischen und nicht-zusammenwachsenden Frakturen, Wirbelsäulenfusionen und der Ausbesserung von Knochendefekten in der Orthopädie; bei Schädel/Kiefer- und Gesichtsrekonstruktionen; zur Prothesemntegration. insbesondere als Oberflächenbedeckung; bei Knochenmarksentzündung zur Knochenregenerierung und in der Zahnheilkunde bei einer Erosion des Alveolarsaums und einer das Periodontium betreffenden Krankheit verwendet werden. Bei bestimmten dieser Anwendungen können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in Verbindung mit verschiedenen Knochenzementen verwendet werden, einschließlich erodierbaren Knochenzementen wie Polypropylen-Co-Fumarat. Formulierungen mit geringer Viskosität können auch als percutane Injektion zur Beschleunigung der Heilung geschlossener Frakturen verwendet werden. Wie vorstehend angeführt, wird das Dosierungsschema durch das angesprochene klinische Symptom sowie durch verschiedene Patientenvariablen (z.B. Gewicht, Alter, Geschlecht) und die klinische Darstellung (z.B. Ausmaß der Verletzung, Verletzungsstelle, etc.) bestimmt.
Gegenwärtig wird frisches autogenes Knochengewebe häufig als Knochentransplantatmaterial verwendet. Der begrenzte Vorrat an autogenem Knochengewebe zusammen mit der Notwendigkeit für ein zusätzliches chirurgisches Entnahmeverfahren stellen die Hauptnachteile bei der Verwendung von autogenem Knochengewebe zur Knochentransplantation dar. Gemäß der vorliegenden Erfindung können die erfindungsgemäßen porösen Partikel dem autogenen Knochengewebe zugegeben werden, um die Menge des zur Knochentransplantation verfügbaren Materials zu vergrößern. Die porösen Partikel können auch in Verbindung mit einem sequestrierenden Mittel als Ersatz für Knochenwachs an der Stelle einer Knochenverletzung verwendet wurden, wobei sie als biologisch erodierbarer Hämostat wirksam sind.

Beispiele

Alle in diesen Beispielen verwendeten Komponenten weisen eine pharmazeutische Qualität auf. Die Polymerpartikelkomponente wurde aus einem 50:50 (molar), statistisch angeordnetem Copolymer aus Milchsäure und Glykolsäure (PLGA) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 30 000 bis 50 000, einem Molekulargewichtszahlenmittel von etwa 20 000 (bestimmt durch Gelpermeationschromatographie, verglichen mit Polystyrolstandards) und einer arteigenen Viskosität von 0.35 bis 0,45 dl/g hergestellt. Das verwendete osteogene Protein war rBMP-2. Die Herstellung und Charakterisierung von rBMP-2 wird in dem vorstehend erwähnten US-Patent 5,013,649 ausführlich beschrieben. Die verwendeten sequestrierenden Mittel umfaßten Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumalginat, Hyaluronsäure und Polyethylenglykol. Die verwendete Carboxymethylcellulose (CMC) wies einen Substitutionsgrad von 0,7 (Carboxymethylgruppen pro Hydroxygruppe der Cellulose) und eine Viskosität von 2480 cps auf.

Beispiel 1: Herstellung poröser Partikel durch das Lösungsmittelabdampfverfahren

PLGA wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (15 Gew.-%/Vol.) gelöst und 10 g Porosigen (7,5 Gew.-%/Vol.) wurden in dieser Lösung suspendiert. Die resultierende Lösung wurde zu einem Überschuß wäßriger Polyvinylalkohollösung (0,1% Gew./Vol.) zugegeben. Nach einigen Stunden Rühren unter einem Teilvakuum (24 Inches Hg) wurden die Partikel in einem Überschuß von kaltem Ethanol (95%ig) gehärtet. Die erhaltenen Partikel wurden mit Wasser zur Injektion gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei ein freifließendes Produkt erhalten wird. Die BET-Oberflächenanalyse wurde unter Verwendung eines Micrometrics ASAP 2000-Systems durchgeführt. Die Bestimmung der Oberfläche wird auf die Adsorption und Desorption von Kryptongas auf der Oberfläche und in den Poren der festen Probe bezogen. Die Berechnung der Einheiten und der Oberfläche wurde wie folgt durchgeführt:
V = Volumenaufnahme bei Druck P P&sub0; = Sättigungsdruck
P/P&sub0; = relativer Druck P = Druck
C = Konstante A = Gasquerschnittsfläche
Vm = Einschicht-Kapazität Bei graphischer Darstellung von gegen P/P&sub0;, wobei die Neigung und der Achsenabschnitt ist, beträgt die Oberfläche wobei N = Avogadro-Zahl und V = Molvolumen bedeuten.
Einzelheiten der Reaktanten und die Ergebnisse werden in Tabelle 1 bzw. Tabelle 2 veranschaulicht. Tabelle 1 Tabelle 2

Beispiel 2: Herstellung poröser Partikel durch das Lösungsmittelextraktionsverfahren

Eine 100 g-Probe von PLGA wurde in 670 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst. Die Porosigenlösung wurde durch Lösen von 5 g NaCl in 50 ml einer 0,2%igen, wäßrigen Polyvinylalkohollösung hergestellt. Ein 50 ml-Aliquot der Porosigenlösung wurde einem Homogenisator zugegeben und bei 3300 Upm gerührt. Dann wurde die PLGA-Lösung dem Homogenisator (unter Rühren) zugegeben. Eine 77 mM NaCl-Lösung in 10 Liter 0,2%igem, wäßrigem Polyvinylalkohol wurde zu einem 12 Liter-Reaktor zugegeben und bei 175 Upm gerührt. Die PLGA/ Porosigen-Suspension wurde dem Reaktor über einen Zeitraum von 90 Minuten zugegeben. Eine 77 mM NaCl-Lösung in 0,2%igem, wäßrigem Polyvinylalkohol wurde dann in den 12 Liter-Reaktor hinein- und herausgepumpt, wodurch das Methylenchlorid aus dem Gemisch extrahiert wurde. Nach der Beendigung der Lösungsmittelextraktion wurde das Rühren eingestellt, man ließ die porösen Partikel sich absetzen, der Überstand wurde dekantiert und die Partikel wurden mit Ethanol (95%ig) gehärtet und anschließend mit Wasser oder einer Lösung von Polysorbat 20 (0,05%) in Wasser gewaschen. Die gewaschenen Partikel wurden unter vermindertem Druck oder durch herkömmliche Verfahren getrocknet. Die gemäß diesem Verfahren hergestellten Partikel weisen üblicherweise eine spezifische Dichte von 0,09 g/cm³ und eine Gesamtoberfläche von 4 m²/g auf. Die getrockneten Partikel können durch Exposition mit Ethylenoxid oder -Strahlung sterilisiert werden. Wie vorstehend angemerkt, beeinflußt die -Strahlungsdosis die biologische Erosionsrate. Tabelle 3 gibt Beispiele der durch das vorstehende Verfahren hergestellten porösen Partikel an. Tabelle 3

Beispiel 3: Solubilisierung des Proteins

Die Löslichkeit von rBMP-2 in den nachstehend in Tabelle 4 aufgeführten Excipienten wurde durch Dialyse gemäß der fölgenden Beschreibung bestimmt. Die Konzentrationen wurden durch Absorptionsmessungen bei 280 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,62 bestimmt. Eine Proteinlösung (1 ml) mit 2-3 mg/ml Protein, 0,5 M Arginin und 10 mM Phosphat (pH 6,5) wurde gegen 1000 ml Puffer mit 0,5 M des ausgewählten Excipienten (vgl. Tabelle 4) und 0,5 M Arginin (pH 6,5) dialysiert. Die Dialyse wurde bei Raumtemperatur ausgeführt. Man ließ die Excipienten sich mit der Proteinlösung äquilibrieren. Die Proteinlösung wurde dann zweimal gegen 1000 ml einer Arginin-armen Pufferlösung einer sonst identischen Zusammensetzung dialysiert. Die Löslichkeitsergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Excipienten bei Standardkonzentrationen von 500 mM getestet. Tabelle 4

Beispiel 4: Implantatanalyse

rBMP-2 (22 µg), Mannit (8 mg) und &epsi;-Aminocapronsäure (2 M, 20 µl) wurden zu PLGA-Partikeln (10 mg, 20% Porosität, 325 mm) gefriergetrocknet. CMC (5,5 mg, 9%) wurde zugegeben und das feste Pulver wurde unter Verwendung von Ethylenoxid sterilisiert. Wasser zur Injektion (60 µl) wurde zur Herstellung eines formbaren Implantats der Zusammensetzung zugegeben. Als Kontrolle wurde die gleiche Formulierung ohne CMC hergestellt, in diesem Fall wurde eine Gelatinekapsel verwendet, um die Formulierung an der vorgesehen Stelle zu halten. Beide Formulierungen wurden in einen 5 mm großen Rattenoberschenkelknochendefekt implantiert. Die Ratten wurden nach zwölf Wochen getötet. Die ex vivo-Analyse des neuen Knochengewebes wurde im Verhältnis zum gegenüberliegenden Oberschenkeiknochen röntgenographisch durchgeführt. Überraschenderweise zeigten 83% (10 von 12) der Oberschenkelknochendefekte unter Verwendung der erfindungsgemäßen Formulierungen eine Vereinigung, verglichen mit nur 50% (4 von 8) der Kontrolle.

Beispiel 5: Implantatanalyse

Ein 300 µl-Aliquot einer rBMP-2-Lösung mit einer Konzentration von 0,12 mg/ml (in 0,25 M Arginin, 10 mM Histidin (pH 6,5) plus 20 mM Calciumchlorid) wurde zu 9,6 mg der porösen Partikel (Dichte 0,16 g/cm³, Oberfläche = etwa 0,8 m²/g, sterilisiert mit 2,5 Mrad -Strahlung) zugegeben. Diesem Gemisch wurden 15 mg Natriumalginat zugegeben. Vorsichtiges Mischen ergab eine formbare Zusammensetzung. Ahnliche Formulierungen wurden unter Verwendung von 9 mg Hydroxypropylmethylcellulose oder 9 mg Carboxymethylcellulose hergestellt, mit dem Unterschied, daß die 0,12 mg/ml rBMP-2 in 0,25 M Arginin plus 10 mM Histidin (pH 6,5) (kein zugesetztes Calciumchlorid) solubilisiert wurden. Als Kontrollen wurden formbare Formulierungen mit 0,25 M Arginin plus 10 mM Histidin mit 0 mg/ml rBMP-2 hergestellt. Die Formulierungen wurden in kreisförmige Defekte der Schädeldecke von Ratten mit einem kritischen Durchmesser von 8 mm implantiert. Nach 21 Tagen wurden die Tiere getötet und die Knochenregenerierung wurde durch Radiomorphometrie bewertet (X-OMATL-Hochkontrast-Röntgenfilm unter Verwendung des Cambridge 520 Bildanalyse-Systems). Die Kontrollproben für Alginat-, CMC- bzw. Hydroxypropylmethylcellulose-Formulierungen zeigten nur eine Strahlenundurchlässigkeit von 18%, 10% bzw. 10%. Der Vergleich mit den Alginat-, CMC- und. Hydroxypropylmethylcellulose-Formulierungen (mit zugesetztem rBMP-2), die eine Strahlenundurchlässigkeit von 72%, 70% bzw. 67% aufwiesen, zeigte ein signifikantes neues Knochenwachstum.

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend ein pharmazeutisch verträgliches Gemisch aus

(i) einem osteogenen Protein;

(ii) einer Polymermatrixkomponente, ausgewählt aus Polymilchsäure, Polyglykolsäure und Copolymeren aus Milchsäure und Glykolsäure; und

(iii) ein osteogenes Protein sequestrierender Alkylcellulose oder einem ein osteogenes Protein sequestrierenden Mittel, ausgewählt aus Hyaluronsäure, Natriumalginat, Polyethylenglykol, Polyoxyethylenoxid, Carboxyvinylpolymer und Polyvinylalkohol.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das osteogene Protein ausgewählt ist aus den Mitgliedern der BMP-Familie.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das osteogene Protein BMP-2 ist.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Cellulosematerial ausgewählt ist aus Hydroxypropylmethylcellulose und Carboxymethylcellulose.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Polymermatrixkomponente ein Copolymer aus Milchsäure und Glykolsäure ist.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Polymermatrixkomponente in Form von porösen Partikeln vorliegt.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die porösen Partikel einen Durchmesser zwischen etwa 150 und 850 µm (Mikron) haben und eine Porosität besitzen, so daß die Oberfläche der Partikel etwa 0,02 bis 4 m²/g beträgt.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das osteogene Protein TGF-β ist.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das osteogene Protein Vgr-1 ist.

10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das osteogene Protein OP-1 ist.

11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das osteogene Protein ausgewählt ist aus COP-5 und COP- 7.