DE60008133T2

DE60008133T2 - Farbstoff-markierte imidazochinolin-verbindungen

Info

Publication number: DE60008133T2
Application number: DE60008133T
Authority: DE
Inventors: Ai-Ping Wei; A. Mark TOMAI; J. Michael RICE
Original assignee: 3M Innovative Properties Co
Current assignee: 3M Innovative Properties Co
Priority date: 1999-11-05
Filing date: 2000-11-03
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2020-11-04
Also published as: EP1228147A1; EP1228147B1; US20020120141A1; AU1756601A; NO20021974L; CA2390163A1; NO20021974D0; ES2211650T3; DE60008133D1; WO2001034709A1; DK1228147T3; US6630588B2; US6376669B1; ATE258963T1; JP2004500347A; PT1228147E

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Imidazonaphthyridin-, Imidazopyridin- und Imidazochinolinverbindungen, die eine immunreaktionsmodulierende Wirkung haben und die eine Farbstoffeinheit, insbesondere eine fluoreszente Farbstoffeinheit, enthalten. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung der Farbstoff-markierten Verbindungen.
Hintergrund der Erfindung
Verbindungen, die markiert oder etikettiert sind, werden in den chemischen und biologischen Wissenschaften bereits lange verwendet. Solche Verbindungen können auf verschiedene Weise verwendet werden. Man kann, zum Beispiel, durch Markieren einer Verbindung, die als biologisch aktiv bekannt ist, leichter Metaboliten der Verbindung identifizieren, man kann die Bindungs- und/oder Rezeptorseiten für das Molekül bestimmen, man kann bestimmen, wie lange die Verbindung im Körper oder einem anderen System bleibt und so weiter.
Ein bekannter Weg zum Markieren von Verbindungen ist die Anbringung einer Farbstoffinarkierung an die Verbindung. Das wird typischerweise durch Pfropfen einer Farbstoffeinheit auf das biologisch wirksame Molekül oder durch Einbringen der Farbstoffeinheit in das biologisch wirksame Molekül während seiner Synthese erfolgen. Es ist wichtig, dass die markierte Verbindung die entscheidenden Eigenschaften der nicht markierten Verbindung, wie die selektive Bindung an einen Rezeptor oder eine Nucleinsäure, die Aktivierung oder Hemmung eines besonderen Enzyms oder die Fähigkeit, sich in eine biologische Membran einzuschließen, behält. Es ist dafür eine breite Vielfalt von Farbstoffeinheiten, einschließlich, zum Beispiel, Dipyrromethenbordifluoridfarbstoffe, Fluorescein, Fluoresceinderivate, Rhodamin, Rhodaminderivate und Texasrot, verfügbar.
Die Imidazonaphthyridine, Imidazopyridine und Imidazochinoline sind Teil einer einzigartigen Klasse von immunreaktionsmodifizierenden Verbindungen, die die Fähigkeit haben, die Biosynthese von Interferon und anderen Zytokinen auszulösen. Vgl., zum Beispiel, Gerster, U.S. Patent Nr. 4,689,338; Gerster et al., U.S. Patent Nr. 4,929,624; Gerster, U.S.
Patent Nr. 5,268,376; Gerster et al., U.S. Patent Nr. 5,389, 640; Nikolaides et al., U.S. Patent Nr. 5,352,784; Lindstrom et al:, U.S. Patent Nr. 5,494,916; und International Publication WO 99/29693. Farbstoffe, besonders fluoreszente Farbstoffe, sind typischerweise relativ große, sperrige Moleküle und es ist möglich, dass ein solcher großer Substituent die Fähigkeit der Verbindung zur Bindung oder einer anderen Wechselwirkung mit den betreffenden Zellen, auf eine Weise beeinträchtigen kann, die eine biologische Reaktion bewirkt.
Zusammenfassung der Erfindung
Wir haben eine Klasse von Farbstoff-markierten Imidazonaphthyridin-, Imidazopyridin- oder Imidazochinolinverbindungen gefunden, die ihre Fähigkeit behalten, Zytokine zu induzieren.
Diese Verbindungen verwenden eine Abstandsgruppe, um die Farbstoffeinheit von dem aktiven Kern der Verbindung zu trennen, sodass der sperrige Farbstoffrest die biologische Wirkung des Moleküls nicht beeinträchtigt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben die allgemeine Formel I
wobei: R₁ eine Abstandsgruppe ist; R₂ Wasserstoff, Alkyl, Hydroxyalkyl, Halogenalkyl, Aminoalkyl. Alkylaminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Amidoalkyl, Alkylamidoalkyl, Dialkylamidoalkyl, Alkanoylalkyl, Azidoalkyl, Carbamoylalkyl, gegebenenfalls durch ein Heteroatom unterbrochenes Alkyl; Alkenyl, Alkenyloxyalkyl; Cycloalkylalkyl, Heterocycloalkyl; Aryl, Aralkyl, Aralkenyl, Heteroarylalkyl, wobei Aryl gegebenenfalls durch A1ky1 mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogen, Amino, Alkylamino oder Dialkylamino substituiert ist; Aroylalkyl oder Heteroaroylalkyl ist; R₃ und R₄ jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogen, Amino, Alkylamino, Dialkylamino sind, oder falls zusammengenommen, R₃ und R₄ einen kondensierten Aryl- oder Heteroarylrest bilden, der gegebenenfalls durch ein oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogen, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxy und Alkoxymethyl, substituiert ist; oder R₃ und R₄ einen kondensierten 5- bis 7-gliedrigen gesättigten Ring bilden, welcher gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthält und gegebenenfalls durch ein oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Amino, Halogen oder Halogenalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, substituiert ist; und DYE eine Farbstoffeinheit ist, mit der Maßgabe, dass die Farbstoffeinheit nicht Dansyl ist; oder ein pharmazeutisch verträgliches Additionssalz davon.
Die Erfindung stellt außerdem Verfahren zur Herstellung der Farbstoff-markierten Imidazonaphthyridin-, Imidazopyridin und Imidazochinolinverbindungen bereit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Histogramm der Fluoreszenzintensität von Zellen, die nur mit einem fluoreszenten Farbstoff inkubiert sind.
2 ist ein Histogramm der Fluoreszenzintensität von Zellen, die mit einer markierten erfindungsgemäßen Verbindung inkubiert wurden, wobei die Markierung der bei der Inkubation in 1 verwendete Farbstoff ist.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen Wie vorstehend erwähnt, stellt die Erfindung Farbstoff-markierte immunreaktionsmodifizierende Verbindungen der Formel (I) bereit:
wobei: R₁ eine Abstandsgruppe ist; R₂ Wasserstoff, Alkyl, Hydroxyalkyl, Halogenalkyl, Aminoalkyl. Alkylaminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Amidoalkyl, Alkylamidoalkyl, Dialkylamidoalkyl, Alkanoylalkyl, Azidoalkyl, Carbamoylalkyl, gegebenenfalls durch ein Heteroatom unterbrochenes Alkyl; Alkenyl, Alkenyloxyalkyl; Cycloalkylalkyl, Heterocycloalkyl; Aryl, Aralkyl, Aralkenyl, Heteroarylalkyl, wobei Aryl gegebenenfalls durch Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogen, Amino, Alkylamino oder Dialkylamino substituiert ist; Aroylalkyl oder Heteroaroylalkyl ist; R₃ und R₄ jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogen, Amino, Alkylamino, Dialkylamino sind, oder falls zusammengenommen, R₃ und R₄ einen kondensierten Aryl- oder Heteroarylrest bilden, der gegebenenfalls durch ein oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogen, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxy und Alkoxymethyl, substituiert ist; oder R₃ und R₄ einen kondensierten 5- bis 7-gliedrigen gesättigten Ring bilden, welcher gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthält und gegebenenfalls durch ein oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Amino, Halogen und Halogenalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, substituiert ist; und DYE eine Farbstoffeinheit ist, mit der Maßgabe, dass die Farbstoffeinheit nicht Dansyl ist; oder ein pharmazeutisch verträgliches Additionssalz davon.
In dieser Beschreibung haben die nachstehenden Ausdrücke die Bedeutungen, die ihnen nachstehend gegeben werden, wenn es nicht anders bezeichnet wird: Alkyl- und Alkenylreste enthalten 1 bis 8 (oder 2 bis 8) Kohlenstoffatome und sie können geradkettig oder verzweigt sein. Cycloalkykeste können 3 bis 8 Ringglieder enthalten und sie können gegebenenfalls durch Alkylreste substituiert sein. Heterocyclische Reste können 3 bis 8 Ringglieder und 1 bis 3 Heteroatome enthalten, die unabhängig aus O, S und N ausgewählt sind.
Arylreste sind carbocyclische aromatische Ringe oder Ringsysteme. Heteroarylreste sind aromatische Ringe oder Ringsysteme, die 1 bis 6 Heteroatome enthalten, die unabhängig aus O, S und N ausgewählt sind. Ein bevorzugter Arylrest ist Benzol. Bevorzugte Heteroarylreste sind Einzelringe, die 5 oder 6 Glieder und 1 bis 4 Heteroatome, die unabhängig aus O, S und N ausgewählt sind, aufweisen.
Heteroatome sind O, S oder N.
Der Ausdruck "oyl" wird verwendet, um das Vorhandensein einer Carbonylgruppe in dem Rest anzuzeigen. Zum Beispiel wird "aroyl" verwendet, um auf einen aromatischen Rest hinzuweisen, der durch eine Carbonylgruppe an den Rest der Struktur gebunden ist.
Die Abstandsgruppe ist ein organischer bindender Rest, der einer Farbstoffeinheit ermöglicht, an eine Imidazonaphthyridin-, Imidazopyridin- oder Imidazochinolinverbindung gebunden zu werden, ohne ihre biologische Wirkung im wesentlichen zu vermindern. Obwohl die Erfindung nicht durch eine Wirkungstheorie gebunden ist, wird angenommen, dass die Abstandsgruppe eine genügende Distanz zwischen dem aktiven Kern des Moleküls und der sperrigen Farbstoffeinheit schafft, sodass die Farbstoffeinheit nicht auf die Wechselwirkungen zwischen dem aktiven Kern und den Zellen, die die Zytokininduktion bewirken, störend einwirkt. Die Abstandsgruppe kann deshalb jeder zweiwertige organische bindende Rest sein, der nicht selbst die biologische Wirkung des Moleküls beeinträchtigt und der einer Farbstoffeinheit ermöglicht, ohne wesentliche Verminderung der biologischen Wirkung der Verbindung in das Molekül eingeschlossen zu werden. In diesem Zusammenhang wurde die biologische Wirkung einer Verbindung nicht wesentlich verschlechtert, wenn die markierte Verbindung die Interferon- oder die Tumor-Nekrose-Faktor- Biosynthese induziert, wenn sie bei einer Konzentration von geringer oder gleich von etwa 50 μg/ml gemäß dem nachstehend bereitgestellten Testverfahren 1 geprüft wurde.
Eine bevorzugte Abstandsgruppe hat die Strukturformel (II):
Wenn die Abstandsgruppe die Formel (II) hat, ist die Methylengruppe, die außerhalb der Klammern ist, vorzugsweise an die Farbstoffeinheit gebunden.
Eine andere bevorzugte Abstandsgrppe hat die Strukturformel (II):
Die Farbstoffeinheit kann aus jedem bekannten Farbstoff, besonders fluoreszenten Farbstoffen, stammen, mit der Maßgabe, dass die Farbstoffeinheit nicht Dansyl ist. Beispiele für geeignete Typen von Farbstoffen schließen Dipyrromethenbordifluoridfarbstoffe, Fluorescein, Fluoresceinderivate, Rhodamin, Rhodaminderivate und Texasrot ein. Viele Dipyrromethenbordifluorid (4,4-difluoro-4)-borg-3a,4a-diaza-s-indacen)-Farbstoffe sind bekannt, vgl. zum Beispiel, Haugland et al., U.S. Patent Nr. 4,774,339; Kang et al., U.S. Patent Nr. 5,187,288; Haugland et al., U.S. Patent Nr. 5,248,782; und Kang et al., U.S. Patent Nr. 5,274,113. Viele Dipyrromethenbordifluorid-Farbstoffe sind von Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon unter der Marke BODIPY^®-Fluorophore im Handel erhältlich. Bevorzugte Farbstoffeinheiten schließen Fluoroscein und 4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-sindacen ein, das die nachstehende Struktur aufweist:
Bevorzugte Verbindungen der Formel (I) schließen N-[2-(4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethyl]-6-[(4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)amino]hexanoamid, das die nachstehende Struktur hat:
5-{ [( {4-[4-Amino-2-(2-methoxyethyl)-1 H-imidazo[4,5-c]-chinolin-1-yl]butyl } amino)carbonthioyl]amino}-2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)benzoesäure, die die nachstehende Struktur hat:
und 5-{[({2-[4-Amino-2-butyl-1H-imidazo[4,5-c]-chinolin-yl]ethyl}amino)carbonthioyl]amino}-2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)benzoesäure ein, die die nachstehende Struktur hat:
Erfindungsgemäße Verbindungen können nach dem Verfahren hergestellt werden, das in dem nachstehenden Reaktionsschema I gezeigt ist. Ein Imidazonaphthyridin, Imidazopyridin oder Imidazochinolin der Formel IV wird mit einem Farbstoffderivat der Formel V umgesetzt, wobei eine Verbindung der Formel I bereitgestellt wird. Sowohl R_A als auch R_B enthalten funktionelle Gruppen, die ausgewählt sind, um miteinander zu reagieren. Wenn, zum Beispiel, R_A ein primäres Amin enthält, dann wird ein Farbstoffderivat, in welchem R_B ein Acylazid, Aldehyd, Anhydrid, Carbonylhalogenid, Halogenid, Halogenacetamid, Imidoester, Isocyanat, Isothiocyanat, Maleinimid, Succinimidylester oder Sulfonylchlorid ist, ausgewählt. R_A und R_B werden so ausgewählt, dass sie sich umsetzen, wobei die gewünschte Abstandsgruppe R₁ bereitgestellt wird (z. B. wenn R_A -CH₂CH₂NH₂ und R_B -(CH₂)₂C(O)NH(CH₂)₅COOH ist, dann wird R₁ -CH₂CH₂NHC(O)(CH₂)₅NHC(O)(CH₂)₂- sein). Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel IV, in welchen R_A eine funktionelle Gruppe enthält, sind bekannt. Vgl., zum Beispiel, Gerster, U.S. Patent Nr. 4,689,338; Gerster et al., U.S. Patent Nr. 4,929,624; Gerster, U.S. Patent Nr. 5,268,376; Gerster et al., U.S. Patent Nr. 5,389,640; Nikolaides et al., U.S. Patent Nr. 5,352,784; Lindstrom et al., U.S. Patent Nr. 5,494,916; Andre et al., U.S. Patent Nr. 4,988,815; Gerster, U.S. Patent Nr. 5,367,076; Gerster, U.S. Patent Nr. 5,175,296; Nikolaides et al., U.S. Patent Nr. 5,395,937; Gerster et al., U.S. Patent Nr. 5,741, 908; Lindstrom, U.S. Patent Nr. 5,693,811; Nanba et al., U.S. Patent Nr. 6,069,149, deren Offenbarungen als Bezugnahme hierin aufgenommen sind. Vgl. auch die internationale Veröffentlichung WO 99/29693. Viele Farbstoffderivate, die eine reaktive funktionelle Gruppe enthalten, sind im Handel erhältlich (z. B. BODIPY^®-Fluorophore, Fluoresceinisothiocyanat, 5-Carboxyfluorescein) oder können nach bekannten synthetischen Wegen hergestellt werden. Vgl., zum Beispiel, Haugland et al., U.S. Patent Nr. 4,774,339; Kang et al., U.S. Patent Nr. 5,187,288; Haugland et al., U.S. Patent Nr. 5,248,782; und Kang et al., U.S. Patent Nr. 5,274,113, deren Offenbarungen als Bezugnahme hierin aufgenommen sind. Die Umsetzung wird im allgemeinen durch Vereinigen einer Lösung der Verbindung der Formel IV in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Pyridin oder Dimethylsulfoxid, mit einer Lösung des Farbstofferivats der Formel V in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Pyridin oder Dimethylsulfoxid, durchgeführt. Die Umsetzung kann bei Umgebungstemperatur oder einer erhöhten Temperatur durchgeführt werden. Das Produkt der Formel I wird dann unter Verwendung üblicher Verfahren isoliert und gereinigt.
Reaktionsschema I
Die nachstehenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung zu veranschaulichen, aber sie sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken.
Zytokininduktion in menschlichen Zellen – Testverfahren 1 Ein in vitro menschliches Blutzellensystem wurde verwendet, um die Zytokininduktion durch erfindungsgemäße Verbindungen zu beurteilen. Die Aktivität wird auf die Messung von Interferon und des Tumor-Nekrose-Faktors (α) (IFN beziehungsweise TNF) gestützt, die in das Kulturmedium abgeschieden werden, wie von Testerman et al. in "Cytokine Induction by the Immunomodulators Imiquimod and S27609", Journal of Leukocyte Biology, 58, 365-372 (September 1995) beschrieben.
Herstellung der Blutzellen für die Kultur Reines Blut von gesunden menschlichen Spendern wird durch Venenpunktion in EDTA-Vakuumröhren gesammelt. Einkernige periphere Blutzellen (PBMC) werden durch Histopaque^®-1077 (Sigma Chemicals, St. Louis, MO)-Dichtegradientzentrifugieren von dem reinen Blut getrennt. Die PBMC werden zweimal mit Hank's Balanced Salts Solution (Sigma) gewaschen und dann bei 2 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI-Medium 1640 suspendiert, das 10 % fetales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 1 %-ige Penicillin/Streptomycin-Lösung (komplettes RPMI) enthält. Zu 12 oder 24 Behälterplättchen mit flachem Boden mit einer sterilen Gewebekultur werden 1 ml Portionen der PBMC-Suspension zugegeben.
Aufbereitung der Verbindung Die Verbindungen werden in Ethanol, Dimethylsulfoxid oder pyrogenfreiem Wasser solubilisiert, dann mit Gewebekulturwasser, 0,01 N Natriumhydroxid oder 0,01 N Salzsäure verdünnt (die Wahl des Lösungsmittels hängt von den chemischen Eigenschaften der geprüften Verbindung ab). Die Ethanol- oder DMSO-Konzentration sollte eine Endkonzentration von 1 % zur Zugabe zu den Kulturbehältern nicht überschreiten. Die Verbindungen werden im allgemeinen unter Verwendung eines Konzentrationsbereiches von etwa 0,01 μg/ml bis etwa 50 μg/ml geprüft.
Inkubation
Die Lösung der Testverbindung wird zu den Behältern, die 1 ml PBMC im Medium enthalten, zugegeben. Die Plättchen werden mit Kunststoffdeckeln bedeckt, vorsichtig gemischt und dann 24 Stunden bei 37°C in einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre inkubiert.
Trennung
Nach der Inkubation wird die überstehende zellfreie Kultur mit einer sterilen Polypropylenpipette entfernt und in ein 12 × 75 mm Polypropylenrohr übertragen. Die Röhrchen werden dann bei 1000 rpm (⁓ 800 xg) bei 4°C 10 bis 15 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird entfernt und in sterile 2 ml Gefrierfläschchen gebracht. Die Proben werden bis zur Analyse der Zytokine bei –70°C gehalten.
Interferonanalyse / Berechnung
Die Interferonkonzentrationen werden durch Bioassay unter Verwendung von A549 menschlichen Lungenkarzinomzellen bestimmt, die mit Enzephalomyocarditis angeregt wurden. Die Einzelheiten des Bioassay-Verfahrens wurden von G.L Brennan und L.H. Kronenberg in "Automated Bioassay of Interferons in Micro-test Plates", Biotechniques, Juni/Juli, 78, 1983 beschrieben, das hier als Bezugnahme aufgenommen ist. Kurz erklärt, wird das Verfahren wie folgt durchgeführt: A549-Zellen werden mit Verdünnungen von IFN-Standard oder Testproben bei 37°C 24 Stunden inkubiert. Die inkubierten Zellen werden dann mit einem Inokulum von Enzephalomyocarditis-Virus infiziert. Die infizierten Zellen werden weitere 24 Stunden bei 37°C inkubiert, bevor sie auf die virale zytopathische Wirkung quantitativ bestimmt werden. Die virale zytopathische Wirkung wird durch Färbung der Gefäße mit einem aktivierenden Farbstoff, wie Kristallviolett, und anschließend durch visuelle Bewertung der Plättchen quantifiziert. Die Ergebnisse werden in Alfa-Bezugnahmeeinheiten / ml ausgedrückt, bezogen auf den Wert, der für einen NIH menschlichen Leukozyten IFN-Standard erhalten wird.
Tumor-Nekrose-Faktor (a)-Analyse
Die Tumor-Nekrose-Faktor (a) (TNF)-Konzentration wird unter Verwendung eines ELISA-Geräts, erhältlich von Genzyme, Cambridge, MA, bestimmt. Die Ergebnisse werden in pg/ml ausgedrückt.
Zytokininduktion in menschlichen Zellen – Testverfahren 2 Um die Zytokininduktion zu beurteilen, wird ein in vitro menschliches Blutzellensystem verwendet. Die Aktivität wird auf die Messung von Interferon und des Tumor-Nekrose-Faktors (α) (IFN beziehungsweise TNF) gestützt, die in das Kulturmedium abgeschieden werden, wie von Testerman et al. in "Cytokine Induction by the Immunomodulators Imiquimod und 5-27609", Journal of Leukocyte Biologx, 58, 365-372 (September 1995) beschrieben.
Herstellung der Blutzellen für die Kultur Reines Blut von gesunden menschlichen Spendern wird durch Venenpunktion in EDTA-Vakuumröhrchen gesammelt. Einkernige periphere Blutzellen (PBMC) werden unter Verwendung von Histopaque^®-1077 durch Dichtegradientzentriguieren getrennt. Die PBMC werden zweimal mit Hank's Balanced Salts Solution gewaschen und dann bei 3-4 × 10⁶ Zellen/ml in komplettem RPMI suspendiert. Die PBMC-Suspension wird zu 48 Gefäßplatten mit flachem Boden mit steriler Gewebekultur zugegeben (Costar, Cambridge, MA oder Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ), die ein gleiches Volumen von komplettem, RPMI-Medium enthalten, das die Testverbindung enthält.
Aufbereitung der Verbindung
Die Verbindungen werden in Dimethylsulfoxid (DMSO) solubilisiert. Die DMSO-Konzentration sollte eine Endkonzentration von 1 % zur Zugabe zu den Kulturgefäßen nicht überschreiten. Die Verbindungen werden im allgemeinen bei Konzentrationen im Bereich von 0,12 bis 30 μM geprüft.
Inkubation Die Lösung der Testverbindung wird mit 60 μM zu dem ersten Gefäß zugegeben, das komplettes RPMI enthält, und es werden Reihen mit 3-fachen Verdünnungen in den Gefäßen durchgeführt. Die PBMC-Suspension wird dann zu den Gefäßen in einem gleichen Volumen zugegeben, wobei die Konzentrationen der Testverbindung in den gewünschten Bereich (0,12 bis 30 μM) gebracht werden. Die Endkonzentration der PBMC-Suspension ist 1,5-2 x 10⁶ Zellen/ml. Die Plättchen werden mit sterilen Kunststoffdeckeln bedeckt, vorsichtig gemischt und dann bei 37°C 18 bis 24 Stunden in einer 5%-igen Kohlendioxidatmosphäre inkubiert.
Trennung
Nach der Inkubation werden die Plättchen 5-10 Minuten bei 1000 rpm (200 xg) bei 4°C zentrifugiert. Die überstehende zellfreie Kultur wird mit einer sterilen Polypropylenpipette entfernt und in sterile Polypropylenröhrchen übertragen. Die Proben werden bis zur Analyse bei –30 bis –70°C gehalten. Die Proben werden durch ELISA auf Interferon (α) und den Tumor-Nekrose-Faktor (α) analysiert.
Interferon (α)- und Tumor-Nekrose-Faktor (α)-Analyse durch ELISA Die Interferon (α)-Konzentration wird durch ELISA unter Verwendung eines Human Multi-Species-Geräts von PBL Biomedical Laboratories, New Brunswick, NJ bestimmt. Die Ergebnisse sind in pg/ml ausgedrückt.
Die Tumor-Nekrose-Faktor(α)(TNF)-Konzentration wird unter Verwendung von ELISA-Geräten, erhältlich von Genzyme, Cambridge, MA; R&D-Systems, Minneapolis, MN, oder Pharmingen, San Diego, CA bestimmt. Die Ergebnisse werden in pg/ml ausgedrückt.
Herstellung einer nicht markierten Verbindung der Formel IV 2=(4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethanamintrihydrochlorid
Teil A
Zu einer Suspension von 4-Hydroxy-3-nitrochinolin (75 g, 0,3944 Mol) in Dichlormethan (750 ml) wurden nacheinander Thionylchlorid (32,3 ml, 0,4338 Mol) und N,N-Dimethylformamid (32 ml, 0,4338 Mol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde etwa 2,5 Stunden unter Rückfluss erwärmt und dann über Nacht bei Umgebungstemperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad abgekühlt und dann wurde langsam ein Gemisch von Triethylamin (82,5 ml, 0,5916 Mol) und Ethanolamin (35,7 ml, 0,5916 Mol) in Dichlormethan zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde einige Stunden unter Rückfluss erwärmt und dann wurden weitere 0,5 Äquivalente von sowohl Triethylamin als auch Ethanolamin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde eine weitere Stunde unter Rückfluss erwärmt und dann über Nacht bei Umgebungstemperatur gehalten. Der erhaltene Feststoff wurde durch Filtrieren isoliert, zuerst mit Dichlormethan, dann mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei 75 g 2-[(3-Nitro-4-chinolinyl)amino]ethanol bereitgestellt wurden.
Teil B
2-[(3-Nitro-4-chinolinyl)amino]ethanol (6 g) wurde mit Ethanol (200 ml) und einem Platinauf-Kohle-Katalysator vereinigt. Das Gemisch wurde auf einem Parr-Apparat hydriert. Das Verfahren wurde fünf weitere Male unter Verwendung von insgesamt 30 g Ausgangsmaterial wiederholt. Die Gemische aller fünf Hydrierungen wurden vereinigt und dann durch eine Schicht von Celite®-Filterhilfe filtriert, um den Katalysator zu entfernen. Das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei rohes 2-[(3-Amino-4-chinolinyl)amino]ethanol bereitgestellt wurde.
Teil C
Das rohe Material des Teils B wurde mit Ethoxyessigsäure (13,4 g) vereinigt. Das Gemisch wurde unter Verwendung eines Ölbads erwärmt, bis die Umsetzung beendet war. Das Gemisch wurde auf Umgebungstemperatur gekühlt, dann mit Wasser verdünnt und mit Natriumhydroxid (6N) basisch gemacht. Das Gemisch wurde dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und dann filtriert. Das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei 30,8 g rohes 2-Ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-ethanol bereitgestellt wurden.
Teil D
Zu einem Gemisch des Materials von Teil C und Methylacetat (350 ml) wurde Peressigsäure (25 ml, eines 32%-igen Materials) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 54°C erwärmt, bis Dünnschichtchromatographie zeigte, dass das gesamte Ausgangsmaterial verbraucht war. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur gekühlt. Durch Filtrieren wurde ein Feststoff isoliert, mit Methylacetat gewaschen und dann getrocknet, wobei 28,5 g 2-Ethoxymethyl-1-(2-hydroxyethyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-S-N-oxid (Ausbeute 1) bereitgestellt wurden. Das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde mit wässrigem Natriumbicarbonat verdünnt und dann dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, einmal mit wässrigem Natriumbicarbonat gewaschen, zweimal mit Wasser gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und dann unter Vakuum konzentriert, wobei 1,6 g weiteres Produkt (Ausbeute 2) bereitgestellt wurden.
Teil E
Die Ausbeuten 1 und 2 von Teil D wurden vereinigt und mit Dichlormethan (600 ml) gemischt. Es wurde konzentriertes Ammoniumhydroxid (450 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad gekühlt und dann wurde zu dem Gemisch langsam p-Toluolsulfonylchlorid (22 g) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Dünnschichtchromatographie zeigte das Vorhandensein einer Spur des Ausgangsmaterials an, deshalb wurde 1 g p-Toluolsulfonylchlorid zugegeben und das Reaktionsgemisch 1 Stunde weiter gerührt. Durch Filtrieren wurde ein Feststoff isoliert, mit Dichlormethan gewaschen und dann getrocknet, wobei 20,2 g rohes 4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-ethanol bereitgestellt wurden. Eine 1 g-Portion dieses Materials wurde in Aceton (etwa 10 ml) gelöst. Chlorwasserstoff/Methanol (1 g/5 ml) wurden zugegeben bis die Lösung sauer reagierte. Es bildete sich sofort ein Niederschlag. Das Gemisch wurde 10 Minuten auf einem Dampfbad erwärmt. Der Feststoff wurde durch Filtrieren isoliert, mit Aceton gewaschen und dann aus Methanol/Aceton umkristallisiert, wobei 0,7 g 4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-ethanolhydrochlorid als schwach weißer Feststoff bereitgestellt wurden. Analyse: berechnet für C₁₅H₁₉ClN₄O: % C: 55,81; % H: 5,93; % N: 17,36. Gefunden: % C: 55,91; % H: 5,90; % N: 17,35.
Teil F
Thionylchlorid (5 ml) und 4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-ethanol (1 g) wurden vereinigt und auf einem Dampfbad erwärmt bis die Dünnschichtchromatographie (20 % Methanol/Ethylacetat) das Verschwinden des Ausgangsmaterials zeigte. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur gekühlt und dann langsam in ein Gemisch von Eis und Wasser gegossen. Das Gemisch wurde mit Natriumbicarbonat neutralisiert und dann dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, dreimal mit wässrigem Natriumbicarbonat gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und dann unter Vakuum konzentriert. Zu dem Rückstand wurde Aceton (etwa 10 ml) und anschließend methanolischer Chlorwasserstoff (etwa 1 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde unter Rückfluss erwärmt und es bildete sich ein Niederschlag. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur gekühlt. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren isoliert und dann mit Aceton gewaschen. Der Feststoff wurde in heißem Methanol gelöst und dann durch Zugabe von Aceton ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren isoliert, mit Wasser gewaschen und dann getrocknet, wobei 1-(2-Chlorethyl)-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-4-aminhydrochlorid bereitgestellt wurde. Analyse: berechnet für C₁₅H₁₈ClN₄: % C: 52,80; % H: 5,32; % N: 16,42. Gefunden: % C: 52,67; % H: 5,21; % N: 16,29.
Teil G
Zu einer Lösung von 1-(2-Chlorethyl)-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-4-amin (22 g, hergestellt nach dem Verfahren des Teils F) in N,N-Dimethylformamid (75 ml) wurde Natriumazid (14,7 g) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde mehrere Stunden unter Rückfluss erwärmt und dann über Nacht auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde in Wasser (100 ml) gegossen und dann dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, dreimal mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und dann unter Vakuum zur Trockene konzentriert, wobei rohes 1-(2-Azidoethyl)-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-4-amin als Öl bereitgestellt wurde.
Teil H
Zu einer Lösung des rohen Materials aus Teil G in Ethanol (250 ml) wurde ein Platin-auf-Kohle-Katalysator zugegeben. Das Gemisch wurde auf einem Parr-Apparat reduziert. Die Flasche wurde mehrere Male evakuiert, um Stickstoff zu entfernen, und der Fortschritt der Umsetzung wurde durch Dünnschichtchromatographie überwacht. Das Reaktionsgemisch wurde durch eine Schicht von Celite®-Filterhilfe filtriert, wobei der Katalysator entfernt wurde, und das Filterkissen wurde mit warmem Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei ein Öl bereitgestellt wurde, das durch Säulenchromatographie (Silikagel, mit Methanol/Ethylacetat eluiert) gereinigt wurde. Ein Versuch, das gereinigte Öl auszukristallisieren, ergab einen Niederschlag, der durch Filtrieren isoliert wurde. Das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei ein Öl bereitgestellt wurde. Das Öl wurde in Ethanol gelöst. Ein Teil wurde zur späteren Verwendung entfernt. Der Rest wurde mit 10%-igem Chlorwasserstoff in Ethanol vereinigt und unter Rückfluss erwärmt. Das Gemisch wurde in einem Eisbad gekühlt und dann filtriert, wobei der erhaltene Feststoff isoliert wurde. Der Feststoff wurde aus Ethanol umkristallisiert, wobei 2-(4-Amino-2-ethoxymethyl-1Himidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethanamintrihydrochlorid bereitgestellt wurde. Analyse: berechnet für C₁₅H₂₂Cl₃N₅O: % C: 45,64; % H: 5,62; % N: 17,74. Gefunden: % C: 46,14; % H: 5,64; % N: 17,83.
Beispiel 1 – Herstellung einer markierten Verbindung der Formel I
N-[2-(4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethyl]-6-[(4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)amino]hexanoamid Eine Lösung, enthaltend 6-((4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)amino)hexansäure, Succinimidylester (5 mg, BODIPY^®FL-X.SE von Molekular Probes) gelöst in Dimethylsulfoxid (1 ml), wurde mit 2-(4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethanamintrihydrochlorid (2,5 mg) vereinigt. Pyridin (5 Tropfen) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch bei Umgebungstemperatur über Nacht geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung einer Bondapak C18 12,5 nm Umkehrphasensäule (erhältlich von Waters, Milford, MA) gereinigt, wobei mit einem Verbundgradienten von Acetonitril in Wasser eluiert wurde. Bei einer typischen Eluierung wurde der Acetonitrilgehalt während der ersten 15 Minuten von 5 % auf 30 % erhöht, anschließend 10 Minuten isokratisch bei 30 % Acetronitril eluiert, ein 5 Minuten Gradient auf 50 % Acetonitril, dann eine 5 Minuten lange isokratische Elution bei 50 % Acetonitril durchgeführt. Alle Lösungsmittel enthielten 0,1 % Trifluoressigsäure. Die Fraktionen, die die markierte Verbindung enthielten, wurden zuerst durch einen Vergleich der Chromatogramme des freien Fluorophors und der nicht markierten Verbindung mit der des Reaktionsgemisches identifiziert. Die Fraktionen, die die markierte Verbindung enthielten, wurden dann gesammelt, vereinigt und gefriergetrocknet. Die markierte Verbindung hatte ein durch Elektrospraymassenspektroskopie bestimmtes Molekulargewicht von 672,08. Das berechnete Gewicht ist 672,35, bezogen auf die vorgeschlagene empirische Formel C₃₅H₄₅N₈BF₂. Das UV-sichtbare Absorptionsspektrum zeigte Absorptionsbanden bei 505 nm und 325 nm, die für die Fluoreszenzmarkierung beziehungsweise für die nicht markierte Verbindung charakteristisch sind.
Die markierte Verbindung des Beispiels 1 und das nicht markierte Zwischenprodukt (2-(4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethanamintrihydrochlorid) wurden Seite an Seite auf ihre Fähigkeit geprüft, die Zytokinbiosynthese zu induzieren, wobei das vorstehend verwendete Testverfahren I verwendet wurde. Die Verbindung des Beispiels 1 wurde in Ethanol solubilisiert. Das nicht markierte Zwischenprodukt wurde in Gewebekulturwasser solubilisiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt.
Fließzytometrieanalyse
Reines Blut wurde durch Venenpunktion von gesunden menschlichen Spendern in EDTA-Vakuumröhrchen gesammelt. PBMC wurden von dem reinen Blut durch Ficoll-Hypaque (Sigma Chemicals, St. Louis, Mo) Dichtegradientzentrifugieren, wie von Testerman beschrieben, abgetrennt. Die PBMC wurden bei 2 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640 Medium suspendiert, das 10 % fetales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin-Lösung (komplettes RPMI) enthielt. Die Zellen wurden dann in 12 × 75 mm Polypropylenröhrchen 1 Stunde bei 37°C mit entweder der markierten Verbindung des Beispiels 1 oder dem BODIPY-Fluorophor, der zur Herstellung der markierten Verbindung verwendet wurde, inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit färbendem Puffer (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline ohne Calcium und Magnesium, 1 % wärmeinaktiviertem fetalen Rinderserum und 0,1 % Natriumazid) gewaschen. Die Zellen wurden in färbendem Puffer suspendiert und in 12 x 75 mm Polystyrolröhrchen zur Analyse durch Fließzytometrie übertragen. Die Bindung an einkernige Zellen wurde durch Fluoreszenz unter Verwendung eines FACScan Fließzytometers (von Becton Dickinson gekauft) bestimmt.
Die Histogramme der 1 und 2 stellen die Fluoreszenzintensität dar, wobei die stärker fluoreszierenden Zellpopulationen weiter rechts zu sehen sind. Der Peakbereich, der in den Histogrammen als M3 markiert ist, zeigt die Fluoreszenzbindung zu der Monozytenpopulation in den peripheren, einkernigen Blutzellen. Diese Monozyten haben sich als Hauptzellen erwiesen, die Zytokine als Reaktion zu den Imidazochinolinen produzieren (Gibson et al. in "Cellular Requirements for Cytokine Production in Response to the Immunomodulators Imiquimod and S-27609", Journal of Interferon and Cytokine Research, 15, 537-545 (1995)). Das Histogramm der 1 wurde von Zellen erhalten, die mit dem BODIPY-Fluorophor inkubiert waren. Das Histogramm der 2 wurde von Zellen erhalten, die mit der durch BODIPY markierten Verbindung des Beispiels 1 inkubiert waren. Diese Histogramme zeigen, dass die markierte Verbindung des Beispiels 1 sich an einkernige periphere menschliche Blutzellen bindet, während das BODIPY-Fluorophor selbst sich nicht daran bindet und dass Monozyten wirksamer binden als andere PBMC.
Die markierte Verbindung des Beispiels 1 zeigte keine bedeutende Bindung an Monozyten, wenn sie 1 Stunde bei 4°C mit menschlichen PBMC inkubiert war. Es wurde ein dem in 1 ähnliches Histogramm erhalten, was zeigt, dass die Bindung wahrscheinlich intrazellulär ist.
Herstellung einer nicht markierten Verbindung der Formel IV 4-(4-Amino-2-(2-methoxyethyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)butanamin
Teil A
Zu einer Lösung von 3-Nitrochinolin-4-ol (50 g, 0,26 Mol) in N,N-Dimethylformamid (150 ml) wurde langsam innerhalb 1 Stunde Phosphoroxychlorid (30 ml, 0,32 Mol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde eine halbe Stunde auf einem Dampfbad erwärmt und dann über ein Gemisch von Eis und Wasser gegossen. Der erhaltene Feststoff wurde durch Filtrieren isoliert und dann in Chloroform (750 ml) suspendiert. Die Suspension wurde auf einem Dampfbad erwärmt und dann filtriert, während sie noch warm war. Das Filtrat wurde in einen Scheidetrichter gegossen und die Chloroformschicht von dem Wasser getrennt. Zu der Chloroformschicht wurde Triethylamin (29 ml) und anschließend langsam tert-Butyl-N-(4-aminobutyl)carbamat zugegeben. Die Umsetzung wurde durch Dünnschichtchromatographie überwacht. Als das gesamte Ausgangsmaterial verbraucht war, wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser gewaschen, über Magneisumsulfat getrocknet und dann unter Vakuum konzentriert, wobei 66 g 1,1-Dimethylethyl N-{4-[(3-Nitrochinolin-4-yl)amino]butyl}carbamat als gelber Feststoff bereitgestellt wurden.
Teil B
Zu einer Lösung von 1,1-Dimethylethyl N-{4-[(3-Nitrochinolin-4-yl)amino]butyl}carbamat (36,1 g, 100 mMol) in Toluol (1,5 1) wurde Platin-auf-Kohle (3,6 g 5%-iges Material) zugegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei 50 psi (3,5 kg/cm2) hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde durch eine Schicht von Celite^®-Filterhilfe filtriert, wobei der Katalysator entfernt wurde. Das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei 30,1 g rohes 1,1-Dimethylethyl N-{4-[(3-Aminochinolin-4-yl)amino]butyl}carbamat als klebriger organefarbener Sirup bereitgestellt wurden.
Teil C Unter einer Stickstoffatmosphäre wurde eine Lösung des Materials aus Teil B in Dichlormethan (1l) auf 0°C gekühlt. Triethylamin (13 ml, 93,3 mMol) wurde zugegeben. Innerhalb von 10 Minuten wurde Methoxypropionylchlorid (11,5 g, 91,2 mMol) zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt. Nach 1 Stunde wurde das Reaktionsgemisch konzentriert, wobei ein blassorangefarbener Feststoff bereitgestellt wurde. Das Material wurde mit Ethanol (1l) und Triethylamin (39 ml) vereinigt. Das Gemisch wurde über Nacht bei etwa 75°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen und dann unter Vakuum konzentriert, wobei ein Öl bereitgestellt wurde. Das Öl wurde mit Diethylether (750 ml) vereinigt, etwa 15 Minuten gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei 34,5 g rohes 1,1-Dimethylethyl N-[4-(2-(2-Methoxyethyl)-1Himidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)butyl]carbamat als brauner Sirup bereitgestellt wurden.
Teil D
Zu einer Lösung von 1,1-Dimethylethyl N-[4-(2-(2-Methoxyethyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)butyl]carbamat (21,3 g, 53,5 mMol) in Dichlormethan (200 ml) wurde unter einer Stickstoffatmosphäre 3-Chlorperbenzoesäure (12,86 g, eines >77%-igen Materials) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Weitere 3-Chlorperbenzoesäure (200 mg, eines >77%-igen Materials) wurde zugegeben. Nach etwa 2 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser, wässrigem Natriumbicarbonat, Wasser und zuletzt mit Salzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und dann unter Stickstoff konzentriert, wobei 22 g rohes 1-{4-[(1,1-Dimethylethylcarbonyl)amino]butyl }-2-(2-methoxyethyl)-1 H-imidazo[4,5-c]chinolin-5N-oxid als klebriger Sirup bereitgestellt wurden.
Teil E
Zu einer Lösung des Materials aus Teil D in Dichlormethan (200 ml) wurde konzentriertes Ammoniumhydroxid (⁓ 50 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter einer Stickstoffatmosphäre auf 0°C gekühlt. Während 10 Minuten wurde unter kräftigem Rühren Tosylchlorid (10,2 g, 53,5 mMol) zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt und das Reaktionsgemisch bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Schichten wurden getrennt. Die organische Schicht wurde mit 1 %-igem Natriumcarbonat (3X), Wasser und Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und dann unter Vakuum konzentriert, wobei 20,0 g rohes 1,1-Dimethylethyl N-[4-(4-Amino-2-(2-methoxyethyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-lyl)butyl]caxbamat als senfgelber Feststoff bereitgestellt wurden.
Teil F
Ein Gemisch von 1,1-Dimethylethyl N-[4-(4-Amino-2-(2-methoxyethyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)butyl]carbamat (18,0 g) und Chlorwasserstoff/Ethanol (40 ml von 2M) wurde auf etwa 70°C erwärmt. Nach 90 Minuten wurden weitere 40 ml Chlorwasserstoff/Ethanol zugegeben. Nach etwa einer weiteren Stunde wurde das Reaktionsgemisch abkühlen gelassen, wobei es mit Stickstoff gespült wurde, um überschüssigen Chlorwasserstoff zu entfernen. Das Reaktionsgemisch wurde fast zur Trockene . konzentriert. Der Rückstand wurde mit Diethylether verrieben. Der erhaltene Feststoff wurde durch Filtrieren isoliert und dann unter Hochvakuum getrocknet, wobei 15,8 g des Dihydrochloridsalzes als hellbrauner Feststoff bereitgestellt wurden.
Ein Teil des Salzes (10 g) wurde in Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch Zugabe von Ammoniumhydroxid auf pH 11 eingestellt und dann mehrere Male mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde mit Toluol aufgeschlämmt und dann zur Trockene (3x) konzentriert, wobei 6,6 g 4-(4-Amino-2-(2-methoxyethyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)butanamin als braungelber Feststoff bereitgestellt wurden.
Beispiel 2 – Herstellung einer markierten Verbindung der Formel I
5- { [( {4-[4-Amino-2-(2-methoxyethyl)1-H-imidazo [4,5-c]chinolin-1-yl]butyl } amino)-carbonthioyl]amino}-2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)benzoesäure Eine Lösung von 4-(4-Amino-2-(2-methoxyethyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)butanamin (0,11 g, 0,35 mMol) in warmem Pyridin (2 ml) wurde langsam zu einer Lösung von Fluorescein-5-isothiocyanat (0,138 g, 0,35 mMol) in warmem Pyridin (2 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde mit Methanol (15 ml) gequencht und dann 1 Stunde gerührt. Der erhaltene Feststoff wurde durch Filtrieren isoliert, mit siedendem Methanol aufgeschlämmt und dann getrocknet, wobei 0,12 g des gewünschten Produkts als organgefarbener Feststoff, Schmp.: >245°C, bereitgestellt wurde. Die Analyse sowohl durch Dünnschichtchromatographie als auch durch Hochleistungsflüssigchromatographie zeigte das reine Produkt. Analyse: berechnet für C₃₈H₃₄N₆O₆S: % C: 64,94; % H: 4,88; % N: 11,96. Gefunden: % C: 61,33; % H: 5,09; % N: 11,39. Hochauflösungsmassenspektroskopie: TM = 703,2339 Da., MM = 703,2315 Da.
Herstellung einer nicht markierten Verbindung der Formel IV
2-(4-Amino-2-buty1-1 H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethanamin
Teil A
Zu einer Lösung von tert-Butyl(N-2-aminoethyl)carbamat (55,0 g, 0,34 mMol) in wasserfreiem Dichlormethan (500 ml) wurde Triethylamin (66,8 g, 0,66 mMol) zugegeben. 4-Chlor-3-nitrochinolin (68,2 g, 0,33 mMol) wurde langsam zugegeben. Das Reaktionsgemisch zeigte eine exotherme Reaktion. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Filtrieren isoliert und mit Wasser abgespült, wobei ein gelber Feststoff bereitgestellt wurde. Das Filtrat wurde mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und dann konzentriert, wobei ein gelber Feststoff bereitgestellt wurde. Die beiden Feststoffmengen wurden vereinigt, mit Hexan aufgeschlämmt, filtriert und dann getrocknet, wobei 101 g 1,1-Dimethylethyl N-{2-[(3-Nitrochinolin-4-yl)amino]ethyl)carbamat als gelber Feststoff bereitgestellt wurden.
Teil B
Zu einer Aufschlämmung von 1,1-Dimethylethyl N-{2-[(3-Nitrochinolin-4-yl)amino]ethyl}carbamat (100 g, 0,30 Mol) in Toluol (500 ml) wurden Platin-auf-Kohle (1,0 g eines 10%-igen Materials) und Natriumsulfat (2 g) zugegeben. Das Reaktionsgefäß wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur auf einen Parr-Apparat unter 50 psi (3,5 kg/cm²) Wasserstoffdruck gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde durch eine Schicht von Celite = Filterhilfe filtriert, wobei der Katalysator entfernt wurde. Das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei 73 g 1,1-Dimethylethyl N-{2-[(3-Aminochinolin-4-yl)amino]ethyl}carbamat als dunkelgoldfarbenes Öl bereitgestellt wurden. Die Dünnschichtchromatographie (Silikagel; 10 % Methanol in Dichlormethan)-Analyse zeigte, dass das Material rein war.
Teil C Zu einer Lösung von 1,1-Dimethylethyl N-{2-[(3-Aminochinolin-4-yl)amino]ethyl}carbamat (10,0 g, 33,1 mMol) in wasserfreiem Toluol (100 ml) wurde unter Rühren Trimethylorthovalerat (5,9 g, 36,4 mMol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss erwärmt. Eine 10 ml Portion von Toluol wurde unter Verwendung eines Dean Stark-Abscheiders entfernt und das Reaktionsgemisch 36 Stunden bei der Temperatur gehalten. Es wurden weitere 40 ml Toluol entfernt und die Umsetzung wurde dann unter kontinuierlichem Rühren auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Filtrieren isoliert und getrocknet, wobei 6,2 g 1,1-Dimethylethyl N[2-(2-Butyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-l-yl)ethyl]carbamat als gelbbrauner Feststoff bereitgestellt wurden. Die Dünnschichtchromatographie (Silikagel; 10 % Methanol in Dichlormethan)-Analyse zeigte, dass das Material rein war.
Teil D
Zu einer Lösung von 1,1-Dimethylethyl N-[2-(2-Butyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-lyl)ethyl]carbamat (6,0 g, 16,3 mMol) in Chloroform (60 ml) wurde langsam unter kräftigem Rühren 3-Chlorperbenzoesäure (5,15 g 60%-iges Material, 17,9 mMol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gehalten und dann mit wässrigem Natriumcarbonat (250 ml eines 1 %-igen Materials) gequencht. Die Schichten wurden getrennt. Die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und dann unter Vakuum konzentriert, wobei ⁓ 6,3 g 1-{2-[(1,1-Dimethylethylcarbonyl)amino]ethyl}-2-butyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-5-N-oxid als gelbbrauner Schaum bereitgestellt wurden.
Teil E
Eine Lösung von 1-{2-[(1,1-Dimethylethylcarbonyl)amino]ethyl}-2-butyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-5-N-oxid (39 g, 101 mMol) in Chloroform (300 ml) wurde in einem Eisbad gekühlt. Unter Rühren wurde Trichloracetylisocyanat (21 g, 112 mMol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde mit konzentriertem Ammoniumhydroxid (40 ml) abgeschreckt und dann 4 Stunden bei Umgebungstemperatur gerüht. Zu dem Reaktionsgemisch wurde Wasser zugegeben. Die Schichten wurden getrennt. Die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und dann unter Vakuum konzentriert, wobei ein goldfarbenes Öl bereitgestellt wurde. Das Material wurde aus 90%-igem Isopropanol auskristallisiert, wobei 30,2 g 1,1-Dimethylethyl N-[2-(4-Amino-2-butyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethyl]carbamat erhalten wurden.
Teil F
Zu einer Lösung von 1,1-Dimethylethyl N-[2-(4-Amino-2-butyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethyl]carbamat (30,0 g, 78,2 mMol) in Acetonitril (100 ml) wurde unter Rühren Trifluoressigsäure (100 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Umgebungstemperatur gehalten und dann unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in einer ganz kleinen Menge Wasser gelöst und der pH der Lösung unter Verwendung von 10%-igem Natriumhydroxid auf pH 13 eingestellt. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Filtrieren isoliert und unter Hochvakuum getrocknet, wobei 18,1 g 2-(4-Amino-2-butyl-1Himidazo[4,5-c]chinolin-l-yl)ethanamin als schwachweißer Feststoff, Schmp.: 196-199°C, bereitgestellt wurden.
Beispiel 3 – Herstellung einer markierten Verbindung der Formel I 5- { [({2-[4-Amino-2-butyl-1 H-inudazo[4,5-c]chinolin-l-yl]ethyl } amino)carbonthioyl]amino } -2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)benzoesäure Zu einer Lösung von 2-(4-Amino-2-butyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-l-yl)ethanamin (566 mg, 2,0 mMol) in Pyridin (5 ml) wurde eine Lösung von Fluorescein-5-isothiocyanat (778 mg, 2,0 mMol) in Pyridin (5 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten unter Rückfluss erwärmt und dann in Wasser (50 ml) gegossen. Der erhaltene orangefarbene Feststoff wurde durch Filtrieren isoliert, unter Hochvakuum getrocknet und dann aus Pyridin umkristallisiert, wobei 0,76 g des gewünschten Produkts als orangefarbener Feststoff, Schmp.: >245°C, bereitgestellt wurden. Die Analyse durch Hochleistungsflüssigchromatographie zeigte, dass das Produkt rein war. Analyse: berechnet für C₃₇H₃₂N₆O₅S: % C: 66,06; % H: 4,79; % N: 12,49. Gefunden: % C: 63,03; % H: 4,89; % N: 12,59. Hochauflösungsmassenspektroskopie: TM = 673,2233 Da., MM = 673,2251 Da.
Die markierten Verbindungen der Beispiele 2 und 3 wurden auf ihre Fähigkeit geprüft, die Zytokinbiosynthese zu induzieren, wobei das vorstehend beschriebene Testverfahren 2 verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt, wobei ein "+" zeigt, dass die Verbindung das bezeichnete Zytokin bei der bestimmten Konzentration induzierte und ein "-" zeigt, dass die Verbindung das bezeichnete Zytokin bei der bestimmten Konzentration nicht induzierte.

Claims

Verbindung der Formel (I):
wobei: R₁ eine Abstandsgruppe ist; R₂ Wasserstoff, Alkyl, Hydroxyalkyl, Halogenalkyl, Aminoalkyl, Alkylaminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Amidoalkyl, Alkylamidoalkyl, Dialkylamidoalkyl, Alkanoylalkyl, Azidoalkyl, Carbamoylalkyl, gegebenenfalls durch ein Heteroatom unterbrochenes Alkyl; Alkenyl, Alkenyloxyalkyl; Cycloalkylalkyl, Heterocycloalkyl; Aryl, Aralkyl, Aralkenyl, Hetereoarylalky, wobei Aryl gegebenenfalls durch Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogen, Amino, Alkylamino oder Dialkylamino substituiert ist; Aroylalkyl oder Heteroaroylalkyl ist; R₃ und R₄ jeweils unabhängig Wasserstoff, Alky1, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogen, Amino, Alkylamino, Dialkylamino sind, oder R₃ und R₄ zusammengenommen einen kondensierten Aryl- oder Heteroarylrest bilden, der gegebenenfalls durch ein oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogen, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxy und Alkoxymethyl, substituiert ist; oder R₃ und R₄ einen kondensierten 5- bis 7-gliedrigen gesättigten Ring bilden, welcher gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthält und gegebenenfalls durch ein oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogen oder Halogenalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, substituiert ist; und DYE eine Farbstoffeinheit ist, mit der Maßgabe, dass die Farbstoffeinheit nicht Dansyl ist; oder ein pharmazeutisch verträgliches Additionssalz davon.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₁ die nachstehende Struktur aufweist:
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₁ die nachstehende Struktur aufweist:
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei DYE eine fluoreszente Farbstoffeinheit ist.
Verbindung gemäß Anspruch 4, wobei die fluoreszente Farbstoffeinheit ausgewählt ist aus Dipyrromethenbordifluoridfarbstoffen, Fluoreszein, Fluoreszeinderivaten, Rhodamin, Rhodaminderivaten und Texasrot.
Verbindung gemäß Anspruch 5, wobei die fluoreszente Farbstoffeinheit ein Dipyrromethenbordifluoridfarbstoff ist.
Verbindung gemäß Anspruch 6, wobei DYE die nachstehende Strukture aufweist:
Verbindung gemäß Anspruch 4, wobei die fluoreszente Farbstoffeinheit Fluoreszein ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₃ und R₄ zusammen einen kondensierten Arylrest bilden, welcher gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthält und gegebenenfalls durch ein oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogen, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxy und Alkoxymethyl, substituiert ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₃ und R₄ zusammen einen Benzolring bilden.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₃ und R₄ zusammen einen kondensierten 5-bis 7-gliedrigen gesättigten Ring bilden, welcher gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthält und gegebenenfalls durch ein oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Amino, Halogen und Halogenalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, substituiert ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₃ und R₄ jeweils unabhängig Wasserstoff, ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogen, Amino, Alkylamino oder Dialkylamino sind.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₂ Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Alkoxyalkyl ist, wobei der Alkoxyrest 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält und der Alkylrest 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält.
Verbindung gemäß Anspruch 1 der nachstehenden Struktur:
Verbindung gemäß Anspruch 1 der nachstehenden Struktur:
Verbindung gemäß Anspruch 1 der nachstehenden Struktur: