DE3851221T2

DE3851221T2 - Nichttrennender festphasen-enzymtest.

Info

Publication number: DE3851221T2
Application number: DE3851221T
Authority: DE
Inventors: Imo-Jean Ford; Pyare Khanna; Patricia Porreca
Original assignee: Microgenics Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Corp
Priority date: 1987-09-21
Filing date: 1988-09-19
Publication date: 1995-03-02
Anticipated expiration: 2008-09-20
Also published as: EP0338045B1; EP0338045A1; WO1989002597A1; ATE110469T1; JP3282129B2; EP0338045A4; JPH02501859A; DE3851221D1; AU610281B2; AU2537688A; CA1335173C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Messung von Analyten unter Verwendung eines homogenen Systems, das einen Enzymdonor/Enzymakzeptor und eine feste Oberfläche umfaßt.
Es besteht ein stetig wachsendes Interesse an der Bestimmung einer Vielfalt verschiedener Analyten in Medikamenten, der chemischen Verarbeitung, Schadstoffen u.ä. Es werden unterschiedliche Systeme entwickelt, die auf bestimmte Märkte angepaßt sind. Die Erfordernisse der verschiedenen Märkte variieren und hängen von der Anzahl der Assays, die durchzuführen sind, der Art der Assays, der Verfügbarkeit der Hilfe durch eine geschulte Person, der erforderlichen Sensitivität sowie von anderen einzelnen Faktoren ab. Auch die Systeme variieren: sie reichen von jenen, die im allgemeinen für eine Vielzahl an Instrumenten anwendbar sind, z. B. Spektrophotometer und Fluorometer, bis zu jenen, die nur für ein bestimmtes Instrument geeignet sind.
Assays können die Verwendung einer Lösung, einer chromatographischen Säule oder eines saugfähigen Streifens vorsehen, worin eine Anzahl an Schritten wie Waschungen und Trennungen erforderlich sein können oder ein System lediglich das Hinzufügen der Probe und das anschließende visuelle oder instrumentale Ablesen des Ergebnisses umfaßt. Verschiedene Assays variieren in ihrer Sensitivität, Reaktion auf andere in der Probe vorhandene Komponenten, wie z. B. Lipide, und in ihrem Grad an Komplexität bei der Erzielung eines Ergebnisses. Es besteht an der Entwicklung neuer Assays kontinuierliches Interesse, was das Repertoire an Vorschriften und Reagenzien erweitert, die der Öffentlichkeit bei der Auswahl der Durchführung von Assays zur Verfügung stehen.
Die US PS Nr.4.378.428 beschreibt die Verwendung von Enzymfragmenten im Assay. In der US PS 4.378.428 ist ein homogener Assay beschrieben, worin die Aktivität eines Enzyms, die zu einem nachweisbaren Signal führt, mit zunehmender Analytmenge abnimmt - zwei Polypeptidpartner werden verwendet, die nicht fähig sind, einen Komplex zu bilden, um ein aktives Enzym in Gegenwart eines Analyten zu bilden.
Langley und Zabin, "Biochemistry", (1976) 15 : 4866-4875 und Langley et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" (1975) 72: 1254-1257 beschreiben die Komplementierung zwischen β-Galaktosidasefragmenten. WO86/02666 und Prioritätsanmeldungen davon beschreiben die Verwendung von β-Galaktosidasefragmenten in Assays.
Verfahren und Zusammensetzungen sind zur Bestimmung von Analyten vorgesehen, worin ein Enzymdonor an ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares (Mip) konjugiert ist, worin ein komplementäres oder kreuzreaktives Mitglied an einen festen Träger oder Makromolekül gebunden ist. Das Binden des Mip/ED-Konjugats an den festen Träger oder das Makromolekül hemmt im wesentlichen die Bildung eines enzymatisch aktiven Komplexes. Der Analyt wird mit den Reagenzien kombiniert und der Enzymakzeptor fortlaufend oder anschließend hinzugefügt. Die Enzymaktivität des Mediums kann dann mit der Analytmenge in der Probe in Beziehung gebracht werden. Sets sind zur Durchführung des Assays vorgesehen.
Verfahren und Zusammensetzungen sind zum Nachweis von Analyten unter Verwendung einer Vorschrift vorgesehen, die keine Trennungsschritte erfordert. Das Verfahren umfaßt ein spezifisches Bindungspaar, worin eines der Mitglieder des spezifischen Bindungspaars an ein festes Substrat gebunden ist. Ein detektierbares Signal wird durch ein signalerzeugendes System bereitgestellt, das zwei Abschnitte eines Enzyms umfaßt; ein kleinerer Abschnitt wird als Enzymdonor ("ED") bezeichnet und weist weniger als etwa 100 Aminosäuren auf. Der Enzymdonor wirkt als Markierung, die an ein spezifisches Bindungspaarelement gebunden ist. Der andere Abschnitt ist ein Enzymakzeptormolekül, der mit dem Enzymdonor komplexiert, um einen aktiven Enzymkomplex zu bilden. Der Enzymakzeptor ist wesentlich größer als der Enzymdonor.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein Beispiel eines signalerzeugenden Systems β-Galaktosidase, worin der Enzymdonor das N-terminale Fragment ist, das innerhalb der ersten 75 Aminosäuren von β-Galaktosidase enthalten ist, wobei üblicherweise eine Sequenz von zumindest etwa 35 Aminosäuren enthalten ist, die zum CNBr2-Fragment analogisiert sein kann. Der Enzymdonor kann eine identische Sequenz zu der natürlich vorkommenden β-Galaktosidase aufweisen oder kann durch eine oder mehrere Mutationen modifiziert sein. Die Mutationen können aus praktischen Gründen bei der Herstellung des Enzymdonors, z. B. durch rekombinante Verfahren mit Restriktionsstellen, erfolgen, um eine geeignete Verbindungsgruppe einzuführen, wie z. B. ein Cystein oder Lysin, um ein verschmolzenes Protein zu bilden, worin die Verschmelzung am N- oder am C-Terminus auftreten kann, worin das verschmolzene Peptid mit dem Analyten konkurriert, z. B. ein Epitop aufweist, das mit einem Epitop des Analyten o. ä. immunologisch konkurriert. Der Enzymakzeptor ist im allgemeinen der C- terminale Abschnitt des Enzyms, wobei er im allgemeinen zumindest etwa 100 Aminosäuren umfaßt und bildet mit dem Enzymdonor einen aktiven Enzymkomplex. Details betreffend den Enzymdonor und den Enzymakzeptor finden sich in der US Anmeidungsseriennummer 721.267, eingereicht am 8. April 1985, nunmehr US PS 4.708.929.
Das spezifische Bindungspaarmitglied/ED-Konjugat kann durch jedes beliebige herkömmliche Mittel hergestellt werden. Das spezifische Bindungspaar oder "Mip" ("Mip" ist ein Akronym eines Mitglieds eines immunologischen Paars) ist ein Ligand und sein komplementärer Rezeptor, üblicherweise ein Immunoglobulin. In einigen Fällen werden jedoch als Mitglieder des spezifischen Bindungspaares andere Moleküle als Immunoglobuline verwendet, und in dieser Hinsicht umfaßt Mip nicht nur Immunogiobuline sondern auch andere Moleküle, die fähig sind, sich spezifisch an eine räumliche Konformation und hydrophobe/hydrophile Verteilung zu binden. Zum Einführen von aktiven Stellen auf dem Mip gibt es verschiedene Verfahren, worin solche Stellen nicht natürlich bestehen, wie z. B. die Einführung von aktiven Olefinen, Sulfhydrylgruppe-Aktivestern, Azogruppen, usw. Die jeweilige Verbindungsart ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend, und es können herkömmliche Verbindungsgruppen verwendet werden. Üblicherweise wird das Mip/ED-Konjugat entweder direkt durch eine Bindung oder durch eine Verbindungsgruppe von nicht mehr als etwa 20 Atomen in der Kette, üblicherweise nicht mehr als etwa 10 Atomen in der Kette, verbunden, wobei im Falle zyklischer Verbindungen der längste Weg gezählt wird. Zu Verbindungsfunktionalitäten gehören Thioäther, Amide, Azo, usw. Das Verhältnis von Mip zu ED ist üblicherweise 0,2-1 : 1-0,2, noch mehr üblich etwa 0,3-1:1-0,3 und vorzugsweise durchschnittlich von etwa 0,3-1 : 1. Wünschenswerterweise sind das gesamte Mip und der gesamte ED als Konjugat vorhanden.
Die Liganden können entweder Haptene oder Antigene sein, während die Rezeptoren zumeist Bindungsproteine sind, z. B. Immunoglobuline, Fragmente, insbesondere einwertige Fragmente, von Immunoglobulinen, z. B. Fab, Fv, usw., Enzymen, natürlich auftretenden Rezeptoren, z. B. T-Zellrezeptoren, Hormon Rezeptoren, Oberflächenmembranrezeptoren, Lectine, usw. Eine Offenbarung spezifischer Liganden und Rezeptoren findet sich in der US PS Nr.3.996.345, Spalten 10-17.
Andere interessierende Analyten umfassen menschliche Retrovirus-Antigene, z. B. H IV-1 und -2, Antikörper für solche Antigene, HTLV-1 und -2, Cytokinine, usw.
Eines der Mitglieder des spezifischen Bindungspaares ist an ein Makromolekül gebunden, üblicherweise eine feste Oberfläche. Das Makromolekül weist üblicherweise ein größeres Molekulargewicht als etwa 250 kDa, noch mehr üblich ein größeres Molekulargewicht als etwa 500 kDa auf. Zumeist sind die Makromoleküle wasserlöslich wie z. B. Polysaccharide, z. B. Dextran. Die feste Oberfläche kann viele Formen annehmen, darunter Wände, Teilchen, Streifen, Membranen o. ä. Eine Vielfalt an Feststoffen kann als Immobilisierungsträger verwendet werden. Zu Feststoffen zählen Sepharose, Sephadex, Agarose, Polystyrol, Polyacrylat, Glas mit gesteuerten Poren, usw. Von besonderem Interesse sind Teilchen, die unter den Bedingungen des Assays im wesentlichen transparent sind, wie z. B. Latexteilchen. Die Behälter, in denen die Assays durchgeführt werden, können Mikrotiter-Plattennäpfe, Reagenzgläser, Microfuge-Röhrchen, usw. sein.
Entweder der Rezeptor oder der Ligand kann auf dem festen Träger immobilisiert oder am Makromolekül gebunden sein. Zum Binden eignet sich jedes beliebige geeignete Konjugationsverfahren. Für die Immobilisierung kann der Rezeptor oder Ligand direkt durch kovalente Konjugation an der Oberfläche, üblicherweise durch eine Verbindungsgruppe, oder indirekt durch einen Rezeptor, immobilisiert werden, der an den Liganden oder den Rezeptor bindet, ohne die Verfügbarkeit von zumindest einem Epitop oder zumindest einer Bindungsstelle zu beeinträchtigen. Z.B. kann Avidin kovalent an die Oberfläche konjugiert und der Ligand oder Rezeptor kovalent an Biotin gebunden sein, so daß der Biotin-Avidin-Komplex als Verbindung zwischen dem Mip und der Oberfläche dient.
Das Mip kann an verschiedene Abschnitte des Gefäßes oder Behälters des Assays immobilisiert oder an Teilchen, insbesondere dispergierbare Teilchen, wie z. B. Latexteilchen, Polysaccharidteilchen oder andere Teilchen, welche die Ablesung des Ergebnisses nicht beeinträchtigen, oder an eine andere feste Oberfläche immobilisiert werden, die dazu dient, die Aktivität des ED-Konjugats zu verringern, um ein aktives Enzym bereitzustellen. Viele Teilchen, wie z. B. Latexteilchen, erscheinen im Assaymedium durchsichtig, so daß der Assay als homogen gelten kann. Diagnostische Verfahrensweisen und homogene Assays beziehen sich normaierweise auf ein Verfahren, das keinen Trennungsschritt zwischen gebundener und ungebundener Markierung vorsieht. In den vorliegenden Assays können die Assays sowohl hinsichtlich des Mediums als auch hinsichtlich des Verfahrens als homogen angesehen werden.
Verfahren zum Konjugieren einer Vielfalt an Verbindungen an eine feste Oberfläche sind anhand von Beispielen in der Literatur ausführlich beschrieben. Siehe z. B. die US Psen 4.366.241 und 4.533.629. Die Menge an komplementärem Mip, das auf einer Oberfläche immobilisiert vorhanden ist, reicht aus, um sicherzustellen, daß das gesamte im Assaymedium vorhandene Mip/ED-Konjugat im wesentlichen an die Oberfläche gebunden ist, um den Hintergrundwert zu minimieren. Auf diese Weise sollte ein relativ niedriger reproduzierbarer Wert in Abwesenheit jegliches Analyten erzielt werden. In Gegenwart eines Analyten steigt der beobachtete Wert.
Zum Bestimmen des Analyten können verschiedene Vorschriften verwendet werden. Je nach Vorschrift können verschiedene andere Reagenzien in beträchtlichem Überschuß der maximalen Menge des Analyten im interessierenden Bereich verwendet werden. Eine Vorschrift sieht das Binden des Mip an die feste Oberfläche vor, worin das an die feste Oberfläche gebundene Mip in begrenzter Menge vorhanden ist und normalerweise nicht mehr als ein Fünffaches der größten Analytenmenge im interessierenden Analytenbereich beträgt. Die Probe und das immobilisierte Mip werden über einen geeigneten Zeitraum inkubiert, üblicherweise zumindest etwa eine Minute und üblicherweise nicht länger als etwa 12 Stunden, noch mehr üblich nicht länger als etwa 6 Stunden und vorzugsweise nicht länger als etwa 30 Minuten. Das Enzymdonorkonjugat wird dann hinzugefügt, worin das Mip das reziprokale Mitglied oder komplementäre Mitglied des immobilisierten Mip ist. Auf Wunsch können die Probe und das Enzymdonorkonjugat gleichzeitig und nicht hintereinander hinzugefügt werden, um Konkurrenz zu ermöglichen. Nach einer ausreichenden Zeit des Bildens von Komplexen zwischen den komplementären Mips, so daß sich das Enzymdonorkonjugat an verfügbare Stellen des immobilisierten Mips binden kann, können der Enzymakzeptor und das Substrat hinzugefügt werden, und es kann die Enzymaktivität des Mediums bestimmt werden, entweder in einem Gleichgewichtszustand oder als Veränderungsrate der Enzymaktivität, worin sich die Menge des immobilisierten Enzymdonors mit fortlaufender Zeit verändert.
Die Konzentration des Konjugats kann in weitem Bereich variieren und hängt von der Bindungsaffinität der komplementären Mips, dem interessierenden Konzentrationsbereich, der Zeit des Assays u.ä. ab. Üblicherweise weist das Konjugat nicht weniger als etwa 0,5 der niedrigsten Konzentration im interessierenden Bereich des Analyten auf, vorzugsweise nicht weniger als das etwa Einfache der niedrigsten Konzentration des Analyten im interessierenden Bereich, und es kann, wie bereits erwähnt, in beträchtlichem Überschuß vorhanden sein (bis zu einem zehnfachen Überschuß oder mehr), wobei dies von der jeweiligen Vorschrift abhängt. In jeder Vorschrift können die jeweiligen Konzentrationen empirisch optimiert werden. Verschiedene Verfahren zum Optimieren von Reagenskonzentrationen finden sich in der Literatur, z. B. "Principles of Competitive Protein Binding Assays", William Odell Hrsg. (1983) John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, insbesondere S. 141-147, und Eruk et al., "Ann. Clin. Biochem." (1984) 21: 434-443.
Eine alternative Vorschrift würde das Kombinieren der Probe und des komplementären Mip-Enzymdonorkonjugats in beträchtlichem Überschuß vorsehen, so daß sich im wesentlichen der gesamte Analyt bindet. Nach einer ausreichenden Zeit, um im wesentlichen die Komplexbildung zwischen komplementären Mips abzuschließen, wird das Medium mit dem immobilisierten Mip kombiniert, das zum Mip des Mip/Enzymdonorkonjugats komplementär ist. In dieser Situation kann es wünschenswert sein, einen einwertigen Rezeptor zu verwenden, wie z. B. ein Fab- Fragment. Nach einer ausreichenden Zeit für das Binden des verfügbaren Enzymdonorkonjugats an das immobilisierte Mip, worin ein beträchtlicher Überschuß an immobilisiertem Mip vorhanden ist, werden der Enzymakzeptor und das Substrat hinzugefügt, und es wird die Enzymaktivität des Mediums bestimmt, wie dies vorher beschrieben wurde.
Wie oben kann das Mip/ED-Konjugat einen Liganden oder ein Rezeptormip enthalten. Wenn der Analyt ein Rezeptor ist, ist das Mip des Mip/ED-Konjugats ein Ligand. Wenn alternativ der Analyt ein Ligand ist (Antikörper können auch als Liganden dienen), wird üblicherweise ein Rezeptor verwendet. Es werden verschiedene Rezeptoren verwendet, welche Rezeptoren einwertig sind. D.h. die Rezeptoren weisen nur eine spezifische Bindungsstelle auf. Geeigneterweise kann man zum Binden Fab-Fragmente verwenden. Alternativ dazu kann man natürlich vorkommende Rezeptoren verwenden, wie z. B. Enzyme, Serumproteine u. a.
Das Mip/ED-Konjugat wird in beträchtlichem Überschuß bezogen auf die Höchstkonzentration des zu messenden Analyten hinzugefügt. Demzufolge ist ausreichend Mip/ED-Konjugat vorhanden, um den Analyten im wesentlichen zu sättigen. Üblicherweise beträgt das Verhältnis des Mip/ED-Konjugats zum höchsten Wert des interessierenden Analytenbereichs zumindest etwa 1,5 : 1, noch mehr üblich etwa 2 : 1 und kann bis zu 20 : 1 oder mehr betragen. Die Menge des Mip/ED- Konjugats bei den höheren Werten ist nicht entscheidend, doch je größer der Überschuß, desto mehr muß an das immobilisierte komplementäre Mip gebunden sein und desto größer ist der beobachtete Hintergrundwert. Somit wählt man den Überschußwert aus, um die Inkubationsdauer zu minimieren und eine ausreichende Reaktion mit dem Analyten zu bewirken, um im interessierenden Bereich ein genaues Ergebnis zu erzielen, während die Überschußmenge beschränkt wird, um den Hintergrundwert zu minimieren.
Da der Analyt und das Mip/ED-Konjugat beide in Lösung sind, wobei das Mip/ED- Konjugat in großem Überschuß vorhanden ist (selbst bei relativ niedrigen Analytkonzentrationen), können relativ kurze Inkubationszeiten verwendet werden. Somit beträgt die Inkubationszeit üblicherweise zumindest etwa 1 Minute und nicht mehr als etwa 30 Minuten, vorzugsweise nicht mehr als etwa 1 5 Minuten und in vielen Fällen sind 5 Minuten ausreichend. Die Inkubationstemperatur kann in hohem Maße variieren und hängt von der Beschaffenheit des Analyten ab; sie beträgt üblicherweise nicht weniger als 4ºC, vorzugsweise nicht weniger als etwa 15ºC und nicht mehr als 40ºC, wobei sie im allgemeinen von etwa 25-37ºC reicht. Während es nicht erforderlich ist, den Analyten und das Mip/ED-Konjugat vor der Zugabe der anderen Reagenzien zu inkubieren, ist es üblicherweise wünschenswert, den Assay in Abfolge durchzuführen, um eine Komplexbildung des komplementären Mip sicherzustellen, anstatt eine Konkurrenz zwischen dem immobilisierten Mip auf der Oberfläche und dem Analyten um das Mip/ED-Konjugat zu bewirken.
Sobald die Reaktion zwischen dem Analyten und dem Mip/ED-Konjugat eingetreten ist, kann das Assaymedium mit dem immobilisierten Mip in Kontakt gebracht werden, das zum Mip/ED-Konjugat komplementär ist. Somit weist das an das immobilisierte Mip gebundene Mip/ED-Konjugat eine wesentlich geringere Fähigkeit auf, ein aktives Enzym mit dem Enzymakzeptor (EA) zu bilden. Das Kombinieren mit dem immobilisierten Mip kann das Übertragen des Assaymediums auf einen anderen Behälter, das Hinzufügen von Teilchen zum Assaymedium (üblicherweise unter Rühren), das Hindurchschicken des Assaymediums durch eine Säule u.ä. umfassen. Die Menge des immobilisierten Mip reicht aus, um im wesentlichen das gesamte Mip/ED-Konjugat zu binden, das mit dem Analyten nicht komplexierte. Somit sollte das Assaymedium, in dem die Messung vorgenommen wird, im wesentlichen wenn nicht gänzlich frei von nicht komplexiertem Mip/ED-Konjugat sein.
Große Überschüsse an immobilisiertem Mip im Vergleich zur Menge des vorhandenen Mip/ED-Konjugats können verwendet werden. Üblicherweise beträgt der Überschuß zumindest etwa das Zehnfache, mehr üblich zumindest etwa das 50fache, zweckmäßigerweise das 100fache oder mehr und kann bis zum 1000fachen oder mehr betragen. Da das immobilisierte Mip erfordert, daß das Mip/ED-Konjugat zur Oberfläche diffundiert, hängt die Überschußmenge von der Art der Immobilisierung des Mip und seiner Verfügbarkeit für das in Lösung befindliche Mip/ED-Konjugat ab.
Es ist zwar nicht wesentlich, aber wünschenswert, das Assaymedium mit dem immobilisierten Mip über einen ausreichenden Zeitraum zu inkubieren, um es dem nicht komplexierten Mip/ED-Konjugat zu ermöglichen, an das immobilisierte Mip zu binden. Üblicherweise erfordert dies etwa 1 Minute, mehr üblich zumindest etwa 2 Minuten und nicht mehr als etwa 30 Minuten, üblicherweise nicht mehr als etwa 15 Minuten und vorzugsweise etwa 5 Minuten.
Nach der Inkubationszeit werden die übrigen Reagenzien hinzugefügt. Die übrigen Reagenzien sind üblicherweise nur der Enzymakzeptor und das Substrat. Die zusätzlichen Reagenzien können hinzugefügt und Ablesungen über einen vorbestimmten Zeitraum vorgenommen werden, üblicherweise innerhalb von etwa 5 Sekunden, mehr üblich innerhalb von etwa 10 Sekunden, vorzugsweise innerhalb von etwa 20 Sekunden; anschließend werden die Ablesungen aus 10-60- Sekundenintervallen zur Bestimmung übernommen. Die Menge an hinzugefügtem EA reicht aus, um im wesentlichen das gesamte nicht immobilisierte Mip/ED-Konjugat zu komplexieren, wobei sie im allgemeinen zumindest etwa dem höchsten interessierenden Konzentrationswert des Analyten entspricht, üblicherweise größer als diese Menge ist, üblicherweise nicht mehr als etwa 1000 Mal größer, noch mehr üblich nicht mehr als etwa 500 Mal größer, im allgemeinen zumindest etwa zweimal größer ist. Sobald der EA und das Substrat hinzugefügt wurden, erfolgt der Assay als herkömmlicher ED/EA Beta-Galactosidaseassay.
Bei Verwendung von Teilchen sind relativ kleine Teilchen erwünscht, deren Größe im allgemeinen von etwa 20 - 200 nm, vorzugsweise von etwa 50 bis 100 nm reicht.
Da die Enzymaktivität an der festen Oberfläche wesentlich niedriger als die Enzymaktivität in Lösung ist, variiert die beobachtete Rate je nach Analytenmenge im Medium.
Unter Verwendung von Standards mit bekannten Analytenmengen können Enzymaktivitäten für eine bestimmte Vorschrift bestimmt werden. Auf diese Weise kann eine Standardkurve unter bestimmten Bedingungen erstellt werden, worin die mit einer unbekannten Probe erzielten Ergebnisse mit der Standardkurve in Beziehung gebracht werden können, um eine quantitative Bestimmung des Analyten zu ermöglichen.
Für spektrophotometrische oder fluorimetrische Bestimmungen können verschiedene Substrate verwendet werden. O-Nitrophenyl-β-Galactosid, β-Galactosidylumbelliferon, di-β-Galactosidylfluorescein, Resorufin-β-galactosid können verwendet werden. Die Konzentration des Substrats weist einen beträchtlichen Überschuß auf, um die Rate nicht zu beschränken.
Zur zweckmäßigen Kombination von Reagenzien können Sets bereitgestellt werden. Die Sets enthalten das immobilisierte Mip, das Enzymdonor-Mipkonjugat, den Enzymakzeptor und zweckmäßig das Substrat. Die verschiedenen Komponenten können als lyophilisierte Pulver, Dispersionen, wie Behälter, z. B. Mikrotiterplatten, o. ä. bereitgestellt werden. Die Reagenzienmengen können so bereitgestellt werden, daß sie zu den speziellen Vorschriften in relativen Verhältnissen stehen. Andere Additive können vorhanden sein, wie z. B. Stabilisatoren, Puffer, Bakteriozide, Exzipienten, usw. Mit Ausnahme der Füller sind die Additive im allgemeinen in relativ kleinen Mengen vorhanden, üblicherweise zu weniger als etwa 2 bis 8%.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sind nicht einschränkend.

VERSUCHSTEIL

Um einen homogenen Festphasenassay darzustellen, wurde ein Assay für Digoxin unter Verwendung von anti-Digoxin Sepharose entwickelt (Sepharose, Superose, Sephadex und Tween sind Markennamen).
Die allgemeine Verfahrensweise besteht darin, das Antidigoxin über Nacht bei 4ºC und in 2 l Kopplungspuffer (0,1 M Natriumbikarbonat, pH-Wert 8,3, 0,5 M NaCl) zu dialysieren, wobei der Puffer am nächsten Morgen ausgewechselt und die Dialyse zumindest 30 Minuten lang fortgesetzt wird. Die Proteinkonzentration wird danach bei OD280nM gemessen und der Kopplungspuffer hinzugefügt, um die erwünschte Konzentration zu erreichen. Sepharose (1 g trockene Sepharose entspricht etwa 3,5 ml hydratisierter Sepharose) wird gewogen und einem gesinterten Glastrichter zugegeben, anschließend erfolgt die Waschung mit kalter 1 mM HCl bei 200 ml HCl/g Sepharose.
Das Waschen wird 15 Minuten lang fortgesetzt, wobei aufeinanderfolgende Zugaben der HCl-Lösung erfolgen. Die Sepharose wird dann im Kopplungspuffer gespült und auf das Antidigoxin-hältige Reagenzglas übertragen.
Das Reagenzglas wird bei RT 2 Stunden lang über Nacht bei 4ºC gerüttelt. Nicht umgesetzte Stellen auf der Sepharose werden durch Zugabe von Rinderserumalbumin bei einer Konzentration von 5 mg/ml BSA blockiert. Die Mischung wird 2 Stunden lang bei RT inkubiert. Die Sepharose wird pelletiert, der Überstand entfernt und die Pellets in 0,2 M Glycin, pH-Wert 8,0, dispergiert und anschließend 2 Stunden lang bei RT über Nacht bei 4ºC gerüttelt. Überschüssiges absorbiertes Protein wird durch das Aufbringen der Sepharose auf einem gesinterten Glastrichter entfernt. Anschließend erfolgen Waschungen mit verschiedenen Volumina Acetatpuffer (0,1 M Natriumacetat, 0,5 M NaCl, pH-Wert 4,0), danach mit verschiedenen Volumina des Kopplungspuffers, wobei die Pufferwaschlösungen abwechseln. Die resultierenden Teilchen werden dann im Assaypuffer suspendiert, der 5 mg/ml BSA und 0,1% Natriumazid enthält, und bei 4ºC gelagert.
Der Assaypuffer wird zubereitet, indem 2,5 g einbasisches-Kaliumphosphat, 23 g zweibasisches Kaliumphosphat, 1,7 g einbasisches Natriumphosphat, Monohydrat, 12,5 g zweibasisches Natriumphosphat, 0,644 g Magnesiumacetattetrahydrat, 1,3 g Natriumazid, 12,25 ml Äthylenglykol und 100 ml 10X EGTA-Lösung (7,6 g EGTA, 1,6 g Natriumhydroxid in 200 ml Wasser) und 5 ml 10% Tween 20 in 10 mM Dithiothreitol kombiniert werden; die Lösung wird auf 1 Liter gebracht. (EGTA ist Äthylen-bisoxyäthylennitrilotetraessigsäure.)
Die folgende Tabelle zeigt die Menge an Materialien, die in der obigen Vorschrift verwendet werden. Tabelle 1 Charge Nr. aktivierte Sepharose gekoppeltes Anti-Digoxin Kopplungslösung hinzugefügtes BSA**
* BSA (Rinderserumalbumin) wurde zur Kopplungslösung zu einer Gesamt- Proteinkonzentration von 2 mg/ml hinzugefügt.
** BSA nach 2 Stunden hinzugefügt.
Zur Durchführung des Assays wurden verschiedene Digoxin-Konzentrationen (sie reichten von 5 ng/ml bis 0,025 ng/ml) entweder mit Antidigoxin-Sepharose oder BSA- Sepharose als Kontrolle vorinkubiert. Eine fixe Konzentration ED-Digoxinkonjugat wurde den Digoxin/Antidigoxin-Sepharosetests hinzugefügt und inkubiert. In einigen Fällen wurde Ziegen-Antikaninchen-Immunoglobulin (GARS) hinzugefügt, um die Auswirkung des Antikörpers zu bestimmen.
Die spezielle Verfahrensweise war wie folgt Antidigoxin-Sepharose Charge IV im 5 mg/ml BSA enthaltenden Assaypuffer wurde als eine 50%ige Aufschlämmung angefertigt. Danach wurden 35 ul Aufschlämmung mit 165 ul Trägersepharose vermischt und auf ein 1,5 ml Microfuge-Röhrchen übertragen. Dem Röhrchen wurden anschließend 100 ul Digoxin mit der erwünschten Konzentration zugegeben und das Röhrchen 30 Minuten lang bei RT gerüttelt. Dem Röhrchen wurden danach 100 ul Enzymdonor- (ED-4) Digoxin zugegeben (siehe Anmeldung Seriennummer 721.267), um eine Endkonzentration von 8·10&supmin;¹&sup0; M zu ergeben. Zu diesem Zeitpunkt wurde GARS in geeigneter Weise hinzugefügt, um eine endgültige Verdünnung im Röhrchen von 1 : 750 zu ergeben. Die Tests wurden dann mit 100 ul Entwickler (2,5·10&supmin;&sup6; M Enzymakzeptor und 3,05 mg/ml o-Chlorphenol rotes-β-Galactosid (CPRG)) entwickelt, um eine Endkonzentration von Enzymakzeptor 5,0·10&supmin;&sup7; M und CPRG von 0,61 mg/ml zu ergeben. Nach dem Rütteln jedes Röhrchens über einen Zeitraum von 22 Minuten bei RT wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 ul Isopropylthiogalactosid (240 mM) (IPTG) abgebrochen, um eine Endkonzentration von 40 mM zu erreichen. Die Sepharose wurde dann in der Microfuge pelletiert, und 100 ul Überstand wurden auf einen Mikrotiternapf übertragen und die dekad. Extinktion bei 577 nM in einem Titertek-Spektrophotometer abgelesen. Alternativ dazu konnte die dekad. Extinktion durch das Röhrchen ohne jegliche Trennung unter Verwendung eines geeigneten Spektrophotometers gemessen werden.
Die folgende Tabelle gibt die Ergebnisse an. Tabelle 2 Digoxin OD bei 577 nM -GARS +GARS keine Sepharose
Die obigen Ergebnisse zeigten, daß man die Enzymaktivität in einem Digoxinkonzentrationsbereich von 0 bis 5 ng/ml modulieren kann, wobei man imstande ist, eine so geringe Menge wie 0,025 ng/ml Digoxin nachzuweisen. Weiters scheint die Gegenwart eines Antikörpers zum Antidigoxin keinen bedeutenden Einfluß auf die Enzymaktivität zu haben. Das Hintergrundsignal kann durch einzelnes oder gleichzeitiges Variieren einer Anzahl von Faktoren verringert werden, und zwar durch geringere EA-Konzentration, Variieren der Entwicklungszeit und Verwendung reinerer Enzymdonor-Mipkonjugate.

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Materialien

Zur Herstellung von ED-Fab-Konjugaten stammten alle (Ascites) Antikörper von Beckman Instruments Inc., Irvine, CA. Der Enzymakzeptor (EA) und lyophilisierte Enzymdonor (ED) stammten von Microgenics Inc., Concord, CA. Carboxyl-modifizierte Polystyrol-Mikroteilchen stammten von Polysciences Inc., Warrington, PA und von Polymer Laboratories, Großbritannien. hCG zur Herstellung von Latexkonjugaten stammte von Sigma, St.Louis, MO. hCG von Scripps, San Diego, CA wurde in den Probeneichern verwendet. Gesammeltes, von Lipid befreites menschliches Vollserum stammte von Biocell, Carson, CA. CPRG von Peninsula Labs, Burlingame, CA wurde als Substrat verwendet.

Herstellung des Enzymdonor-Fab-Fragment-Konjugates. Antikörper-Auswahl

Charakterisierung Digerierung und Reinigung
Anti-hCG monoklonale Antikörper wurden hinsichtlich Kreuzreaktivität mit LH und TSH durch Immunblotting-Verfahren gescreent. Die Affinität wurde durch die Scatchard- Analyse bewertet. Ausgewählte Antikörper wurden auf einer 90·2,5 cm Hydroxylapatit -(Calbiochem) Säule unter Verwendung einer linearen Gradienteneluierung von 20 bis 300 mM KPO4, pH-Wert 6,8 gereinigt. Jeder gereinigte Antikörper wurde dann beim Digerieren mit Mercuripapain (Sigma) hinsichtlich optimaler Fab-Ausbeute charakterisiert. Die Digeste wurden auf einer 10·2,5 cm DEAE-Säule gereinigt (Ionenaustauschzellulose mit hoher Kapazität, Pierce), mit Tris-HCl, pH-Wert 8, äquilibriert und mit einem 0 bis 300 mM NaCl-Gradienten eluiert. Fraktionen wurden durch Immunoelektrophorese analysiert und die reines Fab enthaltenden vereinigt, unter Verwendung von PEG konzentriert und in 100 mM Natriumphosphat, 4 mM EDTA, pH- Wert 7,4 dialysiert.

ED Iodierung und Reinigung

Herstellungsqualitäts-ED4 (siehe US PS Nr. 4.708.929) wurde mit radiomarkiertem ED4- TNB vermischt (erfolgte durch Standardverfahren) und unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie gereinigt. ED wurde vereinigt und die Konzentration und Radiokonjugabilität bestimmt. Aliquote wurden lyophilisiert und bei -20ºC gelagert.

Konjugation: kovalentes heterobifunktionelles Koppeln durch Sulfosuccinimidylmaleimidomethylcyclohexan-1-carboxylat (SMCC).

jedes Konjugat wurde wie folgt hergestellt: 1 mg reines Fab wurde 1 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 2 mM Sulfo-SMCC (Pierce Chemical Co.) in 10 mM Natriumphosphat, 1 50 mM NaCl (PBS), pH-Wert 7,3, aktiviert. Das aktivierte Fab wurde vom überschüssigen SMCC auf einer in entgaster PBS äquilibrierter Sephadex G-25 PD- 10 Säule (Pharmacia) getrennt. Die Ergebnisse von Rücktitrierungen zeigten, daß etwa 2 bis 3 Maleimide pro Fab nach der Aktivierung vorhanden waren. Um sicherzustellen, daß ausreichend überschüssiger ED in der Konjugationsreaktion vorhanden ist, wird ein Verhältnis von 3 Mol ED zu 1 Maleimid verwendet. Sobald die Menge an erforderlichem ED bestimmt ist, wird lyophilisierter ED mit dem aktivierten Fab rekonstituiert und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur umsetzen gelassen. Die Konzentration des Rohkonjugats wird durch OD&sub2;&sub8;&sub0; und durch Daten aus Zählungen/Min. ermittelt. Um überschüssigen ED zu entfernen, wird das Konjugat unter Verwendung einer Superose- 12 (Pharmacia) Säule auf FPLC gereinigt. Vereinigte, das Endprodukt enthaltende Fraktionen wurden aliquot aufgeteilt und bei -20ºC gelagert.

Herstellung von hCG-Latexkonjugaten

Kovalentes Koppeln von hCG an carboxylierte Polystyrolmikroteilchen durch das "Carbodiimid"-Verfahren

Die verwendete Vorschrift ist eine Adaptierung einer in "Polysciences" veröffentlichten Vorschrift. Die hCG-Latexkonjugate werden wie folgt hergestellt: 2 ml einer 10% Feststoffstammsuspension von 70 nm Polystyrolteilchen (Polysciences) werden unter Verwendung einer Amicon Ym100 Filtervorrichtung mit 100 ml 100 mM Karbonatpuffer, pH-Wert 9,6 gewaschen. Die Amicon-Waschung wurde wiederholt, diesmal unter Verwendung von 100 ml eines 20 mM Natriumphosphatpuffers, pH-Wert 4,5. Das Latex wird erneut in 5 ml des Phosphatpuffers suspendiert, und 10 ml einer frischen 2%igen 4-(3-Dimethylaminopropyl)-3-äthylcarbodiimidhydrochlorid- (EDAC) Phosphatpufferlösung werden tröpfchenweise hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Rütteltisch gerührt. Nach diesem (EDAC) Aktivierungsschritt wird der 70 nm Latex in einer Microfuge pelletiert. Die Mischung wird in Eppendorf Zentrifugenröhrchen aufgeteilt, 10 Minuten lang abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Zur Entfernung des nicht umgesetzten Carbodiimids werden die Pellets erneut in 200 mM Boratpuffer, pH-Wert 8,5, suspendiert und dreimal auf die gleiche Weise gewaschen. Die Pellets werden dann erneut suspendiert und in 20 ml Boratpuffer vereinigt. Das Kopplungsprotein, hCG, wird mit etwa 3 mg/ml Latex hinzugefügt und die Reaktion über Nacht auf einer Rüttelvorrichtung bei -5ºC vermischt. Als nächstes werden 800 ul 250 mM Äthanolamin in Boratpuffer hinzugefügt, um nicht reagierte Stellen auf den Mikroteilchen zu blockieren. Nach einer 30minütigen Inkubation auf einer Rüttelvorrichtung bei Raumtemperatur wird das Latex in einer Microfuge pelletiert. Der Überstand wird für die Proteinbestimmung aufgespart. Um jegliche verbleibende nichtspezifische proteinbindende Stellen zu blockieren, wird der Latex in Boratpuffer suspendiert, der 10 mg/ml L-α-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester (APM) und PVP-40 bei 1 mg/ml enthielt. Die Reaktion wird weitere 4 Stunden lang bei Raumtemperatur fortsetzen gelassen. Der Latex wird unter Verwendung des Amicon Ym100 Filters mit PBS, pH-Wert 7,4, (etwa 200 ml) gründlich gewaschen. Das Endpräparat wird erneut in 2 ml PBS suspendiert, die 10 mg/ml BSA, 5% Glyzerin und 0,1% Natriumazid enthält (Lagerungspuffer).
Vor der Verwendung im Cobas Bio-Assay wird der Latex unter Verwendung der Amicon-Filtervorrichtung mit etwa 200 ml des Assaypuffers gewaschen: 200 mM Kaliumphosphat, 100 mM Natriumphosphat, 3 mM Magnesiumacetat, 20 mM Natriumazid, 50 mM Äthylenglykol, 160 mM EGTA, 0,01% Tween-20, pH-Wert 7,0.

Cobas Bio-Anwendung für einen homogenen hCG-lmmunoassay unter Verwendung eines Latexinhibitors

Assayvorschrift

a. Vorinkubation. Patientenproben werden mit ED-Fab-Konjugat 5 Minuten lang bei 37ºC inkubiert.
b. Cobas-Bioassay. (1) 50 ul vorinkubierte Probe wird mit 150 ul hCG-Latexreagens 5 Minuten lang vermischt.
(2) 30 ul Startreagens (5,0·10&supmin;&sup7; M EA 22; 0,61 mg/ml CPRG) wird hinzugefügt und 30-sek Ablesungen bei OD 574 vorgenommen.
¬. Interpretation. Die Komplementierungsaktivität ist eine Funktion steigender Serum hCG-Werte. Mit steigendem hCG bindet im Vorinkubationsschritt mehr ED-Fab den Analyten an hCG. Daher ist weniger ED-Fab zum Inhibitionsbinden durch hCG-Latex verfügbar.
Die folgende Tabelle gibt die Ergebnisse an: Tabelle 3 Mlu/ml M [Probe] M [System] OD&sub5;&sub7;&sub4; (mAU/min)
Aus den obigen Ergebnissen geht deutlich hervor, daß ein wirkungsvoller sensitiver Assay entwickelt wurde, der den Nachweis einer Vielfalt an Analyten bei niedrigen Konzentrationen ermöglicht. Der Assay kann über relativ kurze Zeiträume in einer einfachen Vorschrift ohne einen Trennungsschritt oder eine Waschung durchgeführt werden, um Fehler durch Handhabung und unterschiedliche Verarbeitung zu minimieren. Auf diese Weise kann man genaue und reproduzierbare Ergebnisse erzielen, worin eine Vielfalt an Spektrophotometern oder Fluorimetern verwendet werden kann, so als ob der Assay tatsächlich homogen wäre.
Alle in der vorliegenden Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen legen Zeugnis über die Kompetenz der Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ab.
Nach dieser ausführlichen Beschreibung der Erfindung ist es für einen Fachmann auf dem Gebiet offenkundig, daß viele Veränderungen und Modifizierungen dazu vorgenommen werden können.

Claims

1. Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins eines Analyten in einer Probe, wobei der genannte Analyt ein Element eines spezifischen Bindungspaares ("Mip") ist, wobei bei dem Verfahren als Reagenzien Fragmente von β-Galaktosidase verwendet werden, die ein N-terminales Enzymdonorfragment ("ED") und ein C-terminales Enzymakzeptorfragment ("EA") umfassen, worin die genannten Akzeptor- und Donorfragmente einen aktiven Enzymkomplex bilden können und der genannte Enzymdonor an ein Mip konjugiert ist, um ein Mip/ED-Konjugat zu bilden, das zum genannten Analyten kreuzreaktiv oder komplementär ist, und worin ein zum genannten Mip/ED-Konjugat und genannten Analyten oder genannten Mip/ED-Konjugat komplementäres Mip an einem Makromolekül mit einem Molekulargewicht von zumindest etwa 250 kda oder an einer festen Oberfläche befestigt ist, um immobilisiertes Mio zu bilden;

wobei das genannte Verfahren umfaßt:

das In-Kontakt-Bringen der genannten Probe, des genannten Mip/EP-Konjugats, des genannten EA, des genannten immobilisierten Mip und von Enzymsubstrat in einem Assaymedium, worin das genannte immobilisierte Mip und das genannte Mip/ED-Konjugat komplementär sind und an das genannte immobilisierte Mip gebundenes Mip/ED-Konjugat im wesentlichen bei der Bildung eines enzymatisch wirksamen Komplexes gehemmt wird; und

das Bestimmen der Enzymaktivität des genannten Assaymediums im Vergleich zu einem Assaymedium mit einer bekannten Analytmenge.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das genannte In-Kontakt-Bringen das Kombinieren der genannten Probe, des genannten Mio/ED Konjugates und des genannten immobilisierten Mips und das Inkubieren vor der Zugabe des genannten Enzymakzeotors umfaßt, worin das genannte immobilisierte Bio zum genannten Analyten komplementär ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das genannte in Kontakt Bringen das Kombinieren der genannten Probe und des genannten immobilisierten Mip und das Inkubieren in einem ersten Schritt, das Zugeben des genannten Mip/ED-Konjugates und das Inkubieren in einem zweiten Schritt; und das Zugeben des genannten EA und Substrats in einem dritten Schritt umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das genannte In-Kontakt-Bringen das Kombinieren der genannten Probe und des genannten Mip/ED-Konjugats in einem ersten Schritt umfaßt, worin der/das genannte Analyt und Mip/ED-Konjugat komplementär sind und das genannte Mip/ED-Konjugat in Bezug auf das genannte immobilisierte Mip einwertig ist und im wesentlichen Bindungsüberschuß, zum genannten Analyten vorliegt, sowie das Inkubieren für einen Zeitraum, der ausreicht, damit Komplexbildung auftritt; das Zugeben von immobilisiertem Mip in wesentlichem Bindungsüberschuß zum genannten Mip/ED-Konjugat und das Inkubieren für einen Zeitraum, der ausreicht, damit Komplexbildung auftritt: und das Zugeben von EA und Substrat.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das genannte immobilisierte Mip an Teilchen mit von etwa 20 bis 200 nm gebundenes Mip ist.

6. Verfahren zum Feststellen des Vorhandenseins eines Analyten in einer Probe, wobei der genannte Analyt ein Element eines spezifischen Bindungspaares ("Mip") ist, wobei bei dem genannten Verfahren als Reagenzien Fragmente von β-Galaktosidase eingesetzt werden, die ein N- terminales Enzymdonorfragment ("ED") und ein C-terminaies Enzymakzeptorfragment ("EA") umfassen, worin die genannten Fragmente einen aktiven Enzymkomplex bilden können und der genannte Enzymdonor an ein Mip konjugiert ist, um ein Mio/ED-Konjugat zu bilden, das mit dem genannten Analyten bei Bindung an sein komplementäres Mip kreuzreaktiv ist; und worin ein Mip, das zum genannten Mip/ED-Konjugat und zum genannten Analyten komplementär ist, immobilisiert ist;

wobei das genannte Verfahren umfaßt:

das In-Kontakt-Bringen der genannten Probe, des genannten Mip/ED-Konjugates und von immobilisiertem Mip in einem Assaymedium und das Inkubieren über einen Zeitraum, der ausreicht, damit die Komplexbildung im wesentlichen vollständig erfolgt, um eine erste Mischung zu schaffen;

das Zugeben des genannten EA, von Substrat und aller zusätzlichen Reagenzien, die zur Herstellung eines nachweisbaren Produktes notwendig sind; und

das Bestimmen der Enzymaktivität des genannten Assaymediums durch das genannte nachweisbare Produkt im Vergleich zu einem Assaymedium mit einer bekannten Analytmenge.

7. Verfahren zum Feststellen des Vorhandenseins eines Analyten in einer Probe, wobei der genannte Analyt ein Element eines spezifischen Bindungspaares ("Mip") ist, wobei bei dem genannten Verfahren als Reagenzien Fragmente von β-Galaktosidase eingesetzt werden, die ein N-terminales Enzymdonorfragment ("ED"- und ein C-terminales Enzymakzeptorfragment ("EA") umfassen, worin die genannten Fragmente einen aktiven Enzymkomplex bilden können und der genannte Enzymdonor an ein Mip konjugiert ist, um ein Mip/ED-Konjugat zu bilden, das zum genannten Analyten komplementär ist; und worin ein zum genannten Mip/ED-Konjugat komplementäres Mip immobilisiert ist;

wobei das genannte Verfahren umfaßt:

das In-Kontakt-Bringen der genannten Probe und des genannten Mip/ED- Konjugats im wesentlichen Bindungsüberschuß gegenüber dem genannten Analyten in einem Assaymedium, und das Inkubieren über einen Zeitraum, der ausreicht, damit die Komplexbildung im wesentlichen vollständig erfolgt, um ein erstes Assaymedium zu bilden;

das Kombinieren des genannten ersten Assaymediums mit dem genannten immobilisierten Mip, wobei das genannte immobilisierte Mip im wesentlichen Bindungsüberschuß gegenüber dem genannten Mip/ED-Konjugat vorliegt, um ein zweites Assaymedium zu bilden;

das Kombinieren von EA, Substrat und allen zusätzlichen zur Herstellung eines nachweisbaren Produktes notwendigen Reagenzien entweder gleichzeitig mit oder folgend auf das genannte immobilisierte Mip; und

das Bestimmen der Enzymaktivität des genannten Assaymediums mittels des genannten nachweisbaren Produkts im Vergleich zu einem Assaymedium mit einer bekannten Analytmenge.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das genannte immobilisierte Mip an Teilchen mit von etwa 20 bis 200 nm gebunden ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, worin das genannte Mip ein einwertiges Antikörperfragment ist.

10. Bei einem Verfahren nach Anspruch 1 nützliches Set, umfassend ein an ein Mip konjugiertes ED, EA, an einem Makromolekül oder einem festen Träger immobilisiertes Mip, worin das genannte Mip komplementär zu oder kreuzreaktiv mit Analyt zur Bindung an ein spezifisches Bindungselement ist und das genannte ED-Konjugat und das genannte immobilisierte Mip komplementär sind.

11. Set nach Anspruch 10, worin das genannte gebundene Mip an Teilchen mit von etwa 20 bis 200 nm gebundenes Mip umfaßt.

12. Set nach Anspruch 10, worin das genannte ED-Konjugat ein für den genannten Analyten spezifisches Fab-Fragment umfaßt.