DE3850784T2

DE3850784T2 - Bestimmungsverfahren, seine verwendung und komponenten.

Info

Publication number: DE3850784T2
Application number: DE3850784T
Authority: DE
Inventors: Colin Self
Original assignee: Cambridge Patent Developments Ltd
Current assignee: Cambridge Patent Developments Ltd
Priority date: 1987-11-28
Filing date: 1988-11-23
Publication date: 1995-03-09
Anticipated expiration: 2008-11-24
Also published as: WO1989005453A1; GB2214295A; ATE108907T1; EP0396570B1; EP0396570A1; AU625815B2; AU2726388A; GB2214295B; JPH03504162A; GB8827347D0; DE3850784D1; JP2669703B2

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf eine Methode zur Bestimmung von Hapten, auf den Gebrauch dieser Methode und auf Komponenten einschließlich Kits, die für diese Methode nützlich sind.
Im Moment gibt es eine Anzahl von kommerziell verfügbaren Methoden zur Bestimmung von Hapten. Solche Methoden haben jedoch häufig den Nachteil, daß sie mit abnehmender Haptenkonzentration ein zunehmendes Signal abgeben. Dies ist oft unbequem und kann die Ursache für Variabilität, Rauschen und Irrtum sein.
Eine andere Schwierigkeit mit vielen kommerzionell verfügbaren Methoden zur Bestimmung von Hapten ist, daß sie empfindlich sein können zu der Menge von bestimmten verwendeten Reagenzen. Ich glaube, daß es wünschenswert wäre, eine Methode zur Verfügung zu stellen, die erlaubt Hapten auf eine Weise zu bestimmen, daß die Bestimmung eine Reaktion auslöst, die ansteigt wenn die Konzentrierung des Hapten ansteigt (im Gegensatz zum umgekehrten Verhältnis das oft gegeben ist). Es wäre ein zusätzlicher Vorteil, wenn eine solche Methode Überschußreagenzen verwenden könnte wie gewisse Antikörper, besonders markierte Antikörper, so daß die Präzision nicht nachteilig beeinflußt wird durch kleine Variationen in der Menge der verwendeten Reagenzen.
Viele der bereits erwähnten Vorteile werden von den Systemen angeboten, die beschrieben werden in Europäische Patentapplikationen Nr.85901495.3, 85903019.9 und 87308829.8 (Veröffentlichungen Nr. EP 177531A, WO 86/00140A und EP 26419A) in denen Antikörper beschrieben werden, die einen Komplex eines kleinen Moleküls und eines Antikörpers dazu binden, die aber nicht das kleine Molekül allein oder den Antikörper dazu allein binden. Leider wird die Vorbereitung der Antikörper, die in diesen Patentapplikationen enthüllt werden, oft als umständlich angesehen mit beträchtlichen repetitiven Verfahren, die befolgt erden müssen, wenn man Antikörper mit dem erwünschten Spezifizitätsgrad erhalten will. Es herrscht die Meinung, daß hohe Untergründe resultieren, wenn Spezifizität der einfachen Vorbereitung geopfert wird. UK Patentapplikation Nr. PCT/GB8700461 (Veröffentlichung Nr. WO 88/00240A) enthüllt eine weitere Klasse von Antikörpern, die den Komplex eines kleinen Moleküls und eines Antikörpers dazu binden können, und die den Antikörper gegen das kleine Molekül binden können, aber nicht das kleine Molekül allein. Diese könnten verwendet werden für Bestimmungsmethoden und können einfach hergestellt werden. Leider hieß es nicht, daß sie die Bestimmung von Hapten in irgendeiner anderen Weise erlaubten als mit begrenzten Methoden wie zum Beispiel durch den Gebrauch von markierten Hapten in kompetitiven Assays.
GB-A-2190490 enthüllt ein Enzymimmunoassay, das einen ersten, Festphase gebundenen Antikörper benutzt, einen zweiten Antikörper von einer anderen Tierart und einen dritten, Enzym gekennzeichneten Antikörper, welcher das Immunoglobulin des zweiten Antikörpers der anderen Tierart erkennt.
Der stand der Technik (der "prior art") kann deshalb nicht die vorliegende Erfindung vorschlagen, die einen sekundären Bindungspartner für den ungebundenen Bindungspartner des Hapten benutzt und einen Antikörper, der sich an der Hapten/Bindungspartner-Komplex bindet, aber nicht an den sekundären Bindungspartner/Bindungspartner Komplex bindet.
Ich glaube, daß es wünschenswert wäre, eine Methode zur Bestimmung von Hapten zur Verfügung zu stellen, die Antikörper benutzt die relativ leicht herzustellen sind, die aber dennoch Vorteile anbietet, die bisher genannt wurden und die auf verschiedene Weisen benutzt werden kann. Eine solche Methode ist jetzt entdeckt worden.
Die gegenwärtige Erfindung stellt eine Methode zur Bestimmung eines Hapten zur Verfügung die umfaßt (i) den Hapten mit einem Bindungspartner des Hapten in Kontakt zu bringen, wobei der Hapten zu einem Teil des Bindungspartners gebunden wird, (ii) den ungebundenen Teil des Bindungspartners mit einem sekundären Bindungspartner dafür in Kontakt zu bringen, (iii) den Bindungspartner mit einem Antikörper in Kontakt zu bringen, der den Bindungspartner bindet, welcher den Hapten an sich gebunden hat, der aber nicht den Bindungspartner bindet wo dieser sich mit dem sekundären Bindungspartner bindet; und (iv) die Bestimmung wieviel Antikörper an den Bindungspartner gebunden ist.
Der Antikörper, auf den in (iii) und (iv) verwiesen wird, wird von nun an oft als selektiver Antikörper bezeichnet werden. Der selektive Antikörper kann ein polyklonaler Antikörper sein, obwohl ich es vorziehe einen monoklonalen selektiven Antikörper zu benutzen.
Wenn die Bezeichnung "Antikörper" benutzt wird muß es klar sein, daß der Antikörper das ganze Immmunoglobulin oder Fragmente davon sein kann, die die Bindungsstelle enthalten (wie Fab, F(ab')&sub2;, Fv). Der Antikörper kann auch ein Aggregat oder eine Hybride sein, das ist aber normalerweise weniger vorzuziehen. Es kann besonders nützlich sein ein Fragment als Bindungspartner des Hapten zu benutzen (so wie ein Fab fragment).
Wenn hier benutzt, die Bezeichnung "Hapten" bedeutet normalerweise ein kleines Molekül, das nicht selbst immunogenetisch ist. Der Fachmann wird es würdigen, daß Materialien von geringem molekularen Gewicht wie kleine Moleküle zur Bestimmung mit dieser Methode normalerweise nicht immunogenetisch sind, aber daß die Antikörper gegen diese Hapten erhalten werden können indem man ein Tier mit einem Konjugat des nicht immunogenetischen Moleküls (oder manchmal einem sehr nahen Analog) und eines immunogenetischen Materials (sowie Rinderserum Album in oder ein äquivalenter Agent) immunisiert.
Es versteht sich, daß Haptens kleine Moleküle sind. Solche Haptens haben passenderweise ein molekulares Gewicht von z. B. 100 bis 1500, passender von 120 bis 1200 und günstigsterweise von 200 bis 1000. Haptens mit Molekulargewicht von weniger als 1000 sind oft von besonderem Interesse für diese Erfindung. Europäische Patent Applikation Nr.85901495.3 und 85903019.9 und GB Patent Applikation Nr.8700461 können konsultiert werden für die Typen von Hapten, die am passendsten sind für die Bestimmung mit der Methode dieser Erfindung. Europäische Patentapplikation Nr.87308829.8 kann ähnlicherweise konsultiert werden.
Hapten die von besonderem Interesse für die Bestimmung sind, können ausgewählt werden von Gruppen wie Medikamente, Drogen des Mißbrauchs, Metaboliten, industrielle Chemikalien (wie Polluten und Agrarchemikalien), Toxine und ähnliches.
Um die Bestimmung der Menge des selektiven Antikörpers, der an den Bindungspartner gebunden ist, zu ermöglichen ist es passend, daß entweder der selektive Antikörper oder der Bindungspartner immobilisiert ist. Präzipitation des Komplexes einschließlich des Bindungspartners und des selektiven Antikörpers ist auch vorgesehen, aber dies ist als weniger geschickt angesehen als die Benützung der Immobilisierung des selektiven Antikörpers oder des Bindungspartners. Die Immobilisierung, die verwendet wird, kann jegliche passende Methode sein, aber im allgemeinen wird die Anfügung an eine feste Oberfläche, z. B. die Oberfläche einer Platte, Rohrschlaufe, Dip-stick, Kapillar, Papier, Gel oder ähnliches begünstigt.
Der sekundäre Bindungspartner für den Bindungspartner des Hapten kann irgendeiner sein, der sich an diesen Bindungspartner bindet und der, wenn er einmal gebunden ist, eine signifikante Bindung des Antikörpers daran verhindert. Allgemein wird dieser Bindungspartner ein Analog oder ein Derivat des Hapten sein. Am passendsten wird der sekundäre Bindungspartner groß genug sein um die Bindung des Antikörpers durch einen sterischen Effekt zu verhindern. Ich glaube, daß eine besonders günstige Klasse von sekundären Bindungspartnern große Bindungspartner sind, und daß es vorzuziehen ist, daß diese große Derivate des Hapten sind, z. B. Konjugate des Hapten mit einem großen Molekül oder ein nahes Analog des Hapten mit einem großen Molekül. Solche großen Moleküle haben am passendsten ein Molekulargewicht größer als 500 und werden vorzugsweise Makromoleküle sein, z. B. Proteine. Normalerweise haben diese Makromoleküle ein Molekulargewicht größer als 10 000, treffender größer als 20 000 und vorzugsweise größer als 40 000. Ich glaube, daß konventionelle Makromoleküle wie Album in (z. B. Rinderserum Album in) passend für die Konjugation zu dem Hapten sind.
Wenn ein Konjugat des Hapten (oder ein nahes Analog) und ein großes Molekül benützt werden um den Bindungspartner herzustellen, dann ist dieses Konjugat oft ein besonders passender sekundärer Bindungspartner. Es ist oft von Vorteil, daß das benutzte Konjugat oder Bindungspartner sehr wasserlöslich sind (obwohl Konjugate mit geringerer Wasserlöslichkeit benützt werden können). Der Fachmann wird sich bewußt sein, daß solche Konjugate weit verbreitet sind und mit vielen konventionellen Konjugationsmethoden erhalten werden können.
Der sekundäre Bindungspartner kann vorteilhafterweise ein Antikörper gegen den Bindungspartner des Hapten sein, z. B. gegen die Hapten Bindungsstelle, z. B. ein anti-idiotyper Antikörper. Es kann besonders vorteilhaft sein ein Fragment des anti-idiotypen Antikörpers zu benutzen, wie schon vorher angedeutet wurde.
Der Fachmann wird anerkennen, daß die Bindungspartner normalerweise so ausgewählt werden, daß sie mit der höchsten Affinität binden, die bequem zu erhalten ist, aber so, daß die Affinität des selektiven Antikörpers für den sekundären Bindungspartner-Bindungspartner Komplex so niedrig ist wie bequem zu erreichen ist.
Die Bestimmung kann eine Markierung verwenden wenn es erwünscht ist. Ist das der Fall, dann wird es nicht auf dem immobilisierten Teil des selektiven Antikörper Bindungspartner Paares sein.
In manchen Aspekten der Erfindung ist eine Markierung nicht notwendig; z. B. wo die Assoziation des Hapten, des Primärpartners und des selektiven Antikörpers direkt gemessen wird, z. B. durch elektrische, optische und andere Mittel z. B. durch Modifikation einer Oberfläche wie eine Beugungstechnik in welcher sich reflektive Eigenschaften bei Ablagerung ändern.
Der Bindungspartner für den Hapten kann jedes passende Bindungsmaterial sein wie ein spezifisches Bindungsprotein oder Antikörper, aber ich glaube, daß beste Ergebnisse erhalten werden, wenn ein monoklonaler Antikörper als Bindungspartner für den Hapten benutzt wird.
Von dem, was bisher gesagt wurde, wird es klar sein, daß in einem begünstigten Aspekt diese Erfindung eine Methode zur Verfügung stellt zur Bestimmung eines Hapten, die umfaßt (i) den Hapten mit einem markierten monoklonalen Antikörper dazu in Kontakt zu bringen, wobei der Hapten zu einem Teil des markierten monoklonalen Antikörpers gebunden wird, (ii) den ungebundenen markierten monoklonalen Antikörper mit einem großen Bindungspartner dazu in Kontakt zu bringen, (iii)den immobilisierten monoklonalen Antikörper mit einem markierten Antikörper in Kontakt zu bringen, welcher den immobilisierten monoklonalen Antikörper bindet, der den Hapten gebunden hat, welcher aber nicht den immobilisierten monoklonalen Antikörper bindet, der seinen großen Bindungspartner gebunden hat; und (iv) die Menge ,des markierten Antikörpers zu bestimmen, der an den immobilisierten monoklonalen Antikörper gebunden ist. Die Bestimmung wird durchgeführt unter Benutzung der Markierung an dem markierten monoklonalen Antikörper. Normalerweise wird diese so immobilisierte Markierung getestet nach Abtrennung der flüssigen Phase und dem Waschen der festen Phase.
Von dem was bisher gesagt wurde ist es auch klar, daß in einem besonders günstigen Aspekt die vorliegende Erfindung eine Methode zur Bestimmung eines Hapten zur Verfügung stellt, die umfaßt (i) den Hapten mit einem immobilisierten monoklonalen Antikörper dazu in Kontakt zu bringen, wobei der Hapten an einen Teil des monoklonalen Antikörpers gebunden wird, (ii) den ungebundenen, immobilisierten monoklonalen Antikörper mit einem großen Bindungspartner dazu in Kontakt zu bringen, (iii) den immobilisierten monoklonalen Antikörper mit einem markierten Antikörper in Kontakt zu bringen, der den immobilisierten monoklonalen Antikörper bindet, der den Hapten gebunden hat, welcher aber nicht den immobilisierten monoklonalen Antikörper bindet, der seinen großen Bindungspartner gebunden hat; und (iv) die Menge des markierten Antikörpers zu bestimmen, die an den immobilisierten monoklonalen Antikörper gebunden worden ist. Die Bestimmung wird erreicht indem man die Markierung an dem markierten monoklonalen Antikörper benutzt und normalerweise das was an die feste Phase gebunden wurde. Normalerweise wird die so immobilisierte Markierung getestet nach Abtrennung der flüssigen und dem Waschen der festen Phase.
Die Menge des benutzten Bindungspartners für den Hapten (normalerweise ein monoklonaler Antikörper) ist normalerweise so bestimmt, daß sie nicht saturiert ist, wenn sie dem Hapten ausgesetzt wird; es ist vorteilhaft, wenn ein Überschuß vorhanden ist mit dem resultierenden Vorzug, daß das Assay nicht ungebührlich beeinflußt wird durch die Größe des Überschusses in vernünftigen Grenzen. Dies läßt sich leicht erreichen, indem man einen Überschuß an Bindungspartner benutzt über die wahrscheinliche Menge der zu testenden Probe. In der Praxis wird dies für den Fachmann nicht schwierig sein, da die wahrscheinliche Konzentration des Hapten in einer Probe generell bekannt ist (oder schätzbar ist) innerhalb weiter Grenzen und Bereichsexperimente können ausgeführt werden falls notwendig. Auf ähnliche Weise wird ein Überschuß von sekundärem Bindungspartner benutzt, und die kann von dem Fachmann ohne Schwierigkeiten geschätzt werden, obwohl Bereichsexperimente ausgeführt werden können.
Die Quelle des Hapten für diagnostische Tests kann Blut, Serum, Speichel, Urin oder andere Quellen sein die verdächtig sind Hapten zu enthalten. Man kann sich auch andere Quellen vorstellen wie Nahrungsproben, industrielle Proben, Laborproben. Falls gewünscht kann die Quelle bevor Gebrauch gereinigt oder konzentriert werden. So kann das Hapten, das in die Testmethode eingeführt wird, in seinem Originalmedium sein oder in einem darauffolgenden Medium. Eine solche Behandlung von Proben ist konventionell und ist kein Teil dieser Erfindung.
Der Antikörper, der den Bindungspartner des Hapten gebunden hat, welcher wirklich den Hapten gebunden hat (d. h. der selektive Antikörper) kann variierende Affinitätsgrade für den Bindungspartner des Hapten haben, welcher nicht Hapten an sich gebunden hat (d. h. der primäre Antikörper). In dem Fall, in dem die Bindung des Antikörpers zum Bindungspartner des Hapten, welcher Hapten an sich gebunden hat, hoch ist verglichen mit dem Bindungspartner des Hapten, welcher nicht Hapten gebunden hat, können der sekundäre Bindungspartner und der selektive Antikörper gleichzeitig hinzugefügt werden. Wenn das Verhältnis niedriger ist, wie normalerweise der Fall ist, ist es vorteilhaft, den sekundären Bindungspartner zuerst zuzufügen und den selektiven Antikörper danach zuzufügen.
Da ich glaube, daß es einfacher ist, Antikörper mit etwas Residualbindung des freien Bindungspartners für den Hapten herzustellen, ziehe ich es daher vor, eine Bestimmungsmethode zu benutzen, in der der selektive Antikörper nach dem sekundären Bindungspartner eingeführt wird.
Generell ist die Inkubationszeit in dieser Erfindung zwischen 1 Minute und 2 Stunden, gewöhnlich von 2 bis 100 Minuten, z. B. 10 bis 60 Minuten.
Die Methode zur Bestimmung der Menge von Antikörpern, die an den Bindungspartner des Hapten gebunden ist, kann jede Methode sein, die für die Bequemlichkeit des Benutzers gewählt wurde. Generel wird der Antikörper oder der Bindungspartner mit einer Signalsubstanz markiert. Diese Substanz mag von Anfang an vorhanden sein oder sie kann nachträglich hinzugefügt werden, z. B. mit Hilfe einer Sandwich-Technik wie der Benutzung eines anderen Antikörpers, welcher selbst markiert ist um den Antikörper oder den Bindungspartner zu binden. Ich ziehe es jedoch vor eine Markierung zu benützen, die während des gesamten Verlaufs der Methode am Antikörper oder Bindungspartner vorhanden war.
Die Methode zur Bestimmung der Menge des Antikörpers, der an den Bindungspartner des Hapten gebunden ist, kann indirekt sein (z. B. indem man die ungebundene Menge bestimmt und die Menge die gebunden ist durch die Differenz bestimmt) obwohl es vorgezogen wird, die Menge des Antikörpers, der an den Bindungspartner des Hapten gebunden ist, direkt zu bestimmen.
Die Bestimmung wird treffenderweise die Messung einer Markierung benützen, die am selektiven Antikörper präsent ist oder am Bindungspartner des Hapten. Die benützte Markierung kann irgendeine bequeme Markierung sein wie z. B. eine Radiomarkierung (z. B. C14 oder H3) oder eine Lumineszentmarkierung (z. B. eine biolumineszente, fluoreszente oder chemolumineszente Markierung) oder Enzymmarkierungen (wie eine Phosphatase, Peroxidase, beta- Galactosidase oder ähnliches) oder eine Koenzym Markierung. Die Markierung kann benutzt werden um einen amperometrischen Wechsel zu erzeugen falls gewünscht. Europäische Patentapplikationen Nr.85901 495.3, Nr. 8590301 9.9 und GB Patentapplikation Nr. 8700461 können konsultiert werden für passende Markierungen und ihre Messungen. Die feste Oberfläche, die ich vorzugsweise benütze, ist ein Mikrotiterwell. Die meiner Meinung nach passendste Markierung ist eine Enzym Markierung, von denen ich eine alkalische Phosphatase vorziehe. Dies kann auf die konventionelle Art bestimmt werden, z. B. durch Dephosphorylierung von p-Nitrophenylphosphat oder durch Dephosphorylierung von NADP oder NADPH, welches dann einen Amplifikationszyklus beginnt. Die Auswahl an solch einer Assaymethode ist groß und der Fachmann kann die für ihn passende Methode auswählen.
Die verschiedenen Stufen der Methode dieser Erfindung finden unter Bedingungen statt, die gewöhnlich für Immmunoassays benutzt werden. So z. B. wird die Temperatur nicht extrem sein, z. B. 4-40 C und am besten umgebend, die wäßrigen Lösungen benutzt können konventionelle Puffer enthalten und Isotonizität angleichende Agentien falls notwendig, so daß die Lösungen von nicht extremen PH's und Tonizitäten sind.
Besonders passende selektive Antikörper für den Gebrauch in dieser Erfindung können wie in GB Patentapplikation Nr. PCT/GB 8700461 (Veröffentlichung Nr. WO 88/00240A) beschrieben, erzeugt werden, weil sie leichter zu erhalten sind.
Jegliche bequeme Methode zur Markierung des selektiven Antikörpers kann benutzt werden, aber ich bevorzuge es die Methode von Voller oder jene von Ishikawa et al (J. Immunoassay 1983,4,209--327) zu benützen, besonders jene, die den Gebrauch von Agentien zur hetero-bifunktionellen Quervernetzung beinhalten.
Es kann von Vorzug sein, als einen sekundären Bindungspartner das Material zu benützen, das benutzt wurde um den Antikörper aufzuziehen ( normalerweise den monoklonalen Antikörper) gegen den Hapten (z. B. Hapten an BSA gekoppelt kann benutzt werden um anti-Hapten monoklonale Antikörper aufzuziehen und kann der sekundäre Bindungspartner sein).
Die selektiven Antikörper können aufgezogen werden mit den Methoden in den Patentapplikationen auf die bereits bezogen wurde und auch Patent Applikation Nr. PCT/GB87/00461 (Veröffentlichung Nr. WO 88/00240A). In manchen Fällen, besonders wo das Hapten natürlich vorhanden ist in dem Tier oder der Zelle, kann es genügen mit Hapten Bindungspartner zu immunisieren, obwohl ich es vorziehe, Hapten und Hapten Bindungspartner zu benützen. Das Hapten und Bindungspartner können zuerst in einen Komplex geformt werden falls gewünscht, und diese Komplex kann kovalent gebunden werden falls notwendig.
Die Methode dieser Erfindung bietet den Vorteil an, das ein Schritt zur Entfernung des Hapten gebundenen Bindungspartners vom Hapten ungebundenen Bindungspartner nicht notwendig ist. In gleicher Weise benötigt diese Erfindung nicht die Entfernung des vom Hapten gebundenen Bindungspartners bevor der Bestimmung der Menge des an den Bindungspartners gebundenen selektiven Antikörpers. In gleicher Weise bietet diese Erfindung den Vorteil, daß sie nicht speziell gewidmete Geräte benötigt falls dies unbequem ist.
In einem bevorzugten Aspekt gibt diese Erfindung eine Methode zur Bestimmung von Hapten, die umfaßt (a) einen monoklonalen Antikörper an einen Hapten zu absorbieren auf einer festen Oberfläche, (b) diesen so immobilisierten monoklonalen Antikörper mit einer Lösung des Hapten zu kontaktieren, wobei das Hapten zu einem Teil des monoklonalen Antikörpers gebunden wird, und dann mit einer Lösung des großen Derivats des Hapten, zu kontaktieren wobei der Rest des monoklonalen Antikörpers gebunden wird; (c) den so gebundenen immobilisierten monoklonalen Antikörper mit einem markierten Antikörper zu kontaktieren, das sich an den Haptengebundenen monoklonalen Antikörper bindet, aber nicht an das große Derivat des Hapten-gebundenen monoklonalen Antikörpers; (d) den immobilisierten markierten Antikörper von dem nicht immobilisierten markierten Antikörper zu trennen; und (e) zu bestimmen, wieviel Markierung immobilisiert wurde.
Die gegenwärtige Erfindung legt ein Kit für die Bestimmung von Hapten vor, welches einen Bindungspartner für den Hapten umfaßt, einen sekundären Bindungspartner für den Hapten und einen selektiven Antikörper.
Es ist am passendsten, wenn der Bindungspartner ein immobilisierter monoklonaler Antikörper ist. Es ist am passendsten, wenn der sekundäre Bindungspartner ein großes Derivat des Hapten ist. Es ist am passendsten, wenn der selektive Antikörper ein markierter monoklonaler Antikörper ist.
Günstigerweise kann das Kit auch Reagenzen für die Bindung des selektiven Antikörpers enthalten.
Selective Antikörper können gewählt werden indem man Antikörper durch die bisher beschriebenen Methoden erhält und indem man den Kohort von Antikörpern, der für die gewünschte Aktivität produziert wurde,durchmustert (screening).
Eine Methode für die Erhaltung von selektiven Antikörpern basiert auf einer Methode zur Bestimmung; ob die Kombination des Antikörpers unter Test mit dem primären Bindungspartner stattgefunden hat. Ein selektiver Antikörper ist der Antikörper, welcher mit dem primären Bindungspartner gebunden ist in der Gegenwart des Hapten, aber nicht, wenn der primäre Bindungspartner den sekundären Bindungspartner gebunden hat. Jegliche bequeme Methode kann benützt werden, aber ich bevorzuge es eine der folgenden Methoden zu benutzen. In solchen Methoden ist der benützte sekundäre Bindungspartner oft das Konjugat, das benutzt wurde,um den primären Bindungspartner zu erzeugen.
Der Antikörper unter Test wird an eine feste Oberfläche gebunden (z. B. durch Absorbierung auf die Oberfläche oder auf den Antikörper, der schon auf der Oberfläche ist). Dazu fügt man einen primären Bindungspartner hinzu, welcher entweder einem Hapten oder einem sekundären Bindungspartner ausgesetzt wurde. Der Assoziationsgrad zwischen dem markierten Antikörper und der Oberfläche wird bestimmt. Jene Testantikörper die einen höheren Bindungsgrad in Gegenwart des Hapten erzeugen als in Gegenwart des sekundären Bindungspartners werden als selektive Antikörper gewählt.
Je höher der Bindungsgrad je besser ist der selektive Antikörper. Normalerweise ist ein 10-facher Anstieg leicht zu erreichen und sogar höhere Ratios sind relativ leicht zu erzielen.
Als Alternative ist ein primärer Bindungspartner an eine feste Oberfläche gebunden. Entweder Hapten oder sekundärer Bindungspartner wird hinzugefügt. Der Testantikörper wird zugefügt und die Menge der Testantikörper, die an die feste Oberfläche gebunden ist, wird bestimmt. Jene Testantikörper, die einen höheren Bindungsgrad in der Gegenwart des Hapten vorweisen als in Gegenwart des sekundären Bindungspartners, werden als selektive Antikörper ausgewählt. Die Bindung kann bestimmt werden indem man einen weiteren markierten Antikörper benutzt.
Jene selektiven Antikörper, die einen hohen Bindungsgrad zum primären Bindungspartner in Abwesenheit des Hapten vorweisen, werden generell in Sequenz benutzt mit der Methode dieser Erfindung. Wenn der Bindungsgrad nicht so hoch ist kann ein Simultansystem benützt werden, aber dies ist generell nicht so leicht zu erreichen.
Wenn man einen selektiven Antikörper erhalten hat können die obengenannten Methoden benutzt werden um nach passenden alternativen Bindungspartners durchzumustern (screening).
Die Auswahl eines Antikörpers zum Gebrauch als ein anti-idiotyper Antikörper Bindungspartner in der Methode dieser Erfindung kann eine der vielen Methoden benützen, die vorhanden sind für die Demonstration von anti-idiotypen Antikörpern. Die Mehrzahl dieser Methoden beinhaltet die Demonstration der kompetitiven Bindung des Antikörpers mit Hapten für einen primären Rezeptor wie der primäre Bindungspartner hier beschrieben und wie ein Antikörper. Ein Beispiel einer Demonstration, daß ein Antikörper ein anti-idiotyper Antikörper für einen monoklonalen Antikörper gegen einen Hapten ist, folgt:
i) Oberflächengebundener monoklonaler Antikörper ist dem Antikörper ausgesetzt, der getestet wird.
ii) Markierter Hapten, zu dem der monoklonale Antikörper spezifisch ist, wird zu dem exponierten Antikörper hinzugefügt, sowie eine Duplikatpreparation des monoklonalen Antikörpers, das nicht dem getesteten Antikörper ausgesetzt wurde.
iii) Ungebundenes, markiertes Hapten wird weggewaschen.
iv) Die Menge der Markierung, assoziiert mit dem und ohne den Testantikörper, wird gemessen.
v) Wenn es eine signifikante Verringerung in der Menge der Markierung assoziiert nach der Hinzufügung von Testantikörper gibt (so wie eine 50%-ige Verringerung oder so eine größere Verringerung wie erreichbar ist), dann wird der Antikörper als antiidiotyper Antikörper betrachtet.
Dieser Antikörper kann dann getestet werden für seine Brauchbarkeit als sekundärer Bindungspartner. Dies beinhaltet die Bestimmung, ob der anti-idiotype Antikörper, wenn er den primären Bindungspartner bindet, die Bindung des selektiven Antikörpers hemmt. Es gibt wiederum viele Wege diese Bestimmung auszuführen:
i) Oberflächengebundener monoklonaler Antikörper (primärer Bindungspartner) wird dem anti-idiotypen Antikörper ausgesetzt.
ii) Markierter selektiver Antikörper wird diesem zugefügt und eine Duplikatpreparation des primären Bindungspartners, welcher nicht dem anti-idiotypen Antikörper ausgesetzt war.
iii) Ungebundener markierter Antikörper wird weggewaschen.
iv) Die Menge der Markierung assoziiert mit dem oder ohne den anti-idiotypen Antikörper wird weggewaschen.
v) Wenn der anti-idiotype Antikörper in einer signifikanten Verringerung der Markierung resultiert, die mit deprimären Antikörper assoziiert ist, dann wird er als nützlicher sekundärer Bindungspartner in der Methode dieser Erfindung angesehen. Eine 50%-ige Verringerung in dem gemessenen Kennzeichen mag einen nützlichen sekundären Bindungspartner andeuten, aber im allgemeinen sollte diese Zahl so groß sein wie erreichbar ist und Reduzierungen größer als 90% sollten angezielt werden, und Reduzierungen von mehr als 98% wären besonders nützlich. Andere sekundäre Bindungspartner können auf analoge Art ausgewählt werden.

Beispiel 1

Ein monoklonarer Antikörper der Maus gegen Oestradiol wird nach konventioneller Methodik gewonnen, wobei beta-Oestradiol 6-(O-carboxy-methyl)-oxim: BSA (Sigma Chem ical Company Ltd., Kat.Nr.:E5630) als Immunogen verwendet wird.
Nach Standardprozeduren werden gegen 300 ul Aliquots einer Lösung, die jeweils aus 100 ul der anti-Oestradiol-Antikörperlösung und 200 ul der Oestradiollösung bereitet wird, monoklonale Antikörper erzeugt. Das Durchmustern (screening) der klonierten Hybridomzellinien für die Produktion der benötigten monoklonalen Antikörper (SelAb) erfolgt folgendermaßen: Die Wells der Mikrotiterplatten (Nunc Immunoplate 1, Code 4-39454) werden mit 1 ug anti-Maus-IgG Antikörper (Sigma cat Nr. M 8642) in 50 mMBicarbonat Puffer pH 9,6 versetzt und durch Inkubation über Nacht bei Zimmertemperatur mit dem Antikörper überzogen. Danach wird die Flüssigkeit entfernt, die Wells werden mit 0,2% Casein im gleichen Puffer versetzt und eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Wells werden 4-mal mit 50mM Tris pH 7.4,0.02%Tween 20(TT) gewaschen. Quadruplikate von Wells werden sodann mit jeweils 100 ul der zu testenden Hybridom- Kulturflüssigkeit versetzt. Es wird für 2 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert, dann je 10 ul einer Lösung von 2 ug Maus-IgG in jedes Well zugesetzt und die Inkubation für weitere 30 Minuten fortgesetzt. Die Wells werden schließlich 4-mal mit TT gewaschen.
Ein Konjugat des monoklonalen anti-Oestradiol-Antikörpers mit alkalischer Phosphatase wurde aus 1,5 mg des monoklonalen Antikörpers und 5 mg der alkalischen Phosphatase, nach der Methode von Voller A., E. Bidwell und A. Barlett, Bull, World Health hergestellt. Die so erhaltene Lösung des Konjugats wird 1 : 200 verdünnt. Zu 40 ml dieser verdünnten Lösung wird 100 ug von beta-Oestradiol 6-(O-carboxy-methyl)oxim:BSA hinzugefügt (Lösung 1); ein 40 ml Aliquot wird mit der gleichen Menge (100ug)BSA versetzt (Lösung 2). In Quadruplikaten der Wells wird dann jeweils ein Duplikat mit je 100ul Lösung 1, das andere Duplikat mit je 100 ul Lösung 2 versetzt. Die Wells werden bei Zimmertemperatur für eine weitere Stunde unkubiert. Die Flüssigkeit wird dann verworfen, und die Wells und die Wells 4-mal mit TT gewaschen. Zu jedem der Wells werden anschließend 100 ul von 10 mM para- Nitrophenylphosphat,3,3mM MgCl in 50 mM Bicarbonat Puffer pH 10,3 zugegeben. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wird bei 405 nm bestimmt.
Die Hybridom-klone werden dann selektiert, so daß sie nach der obengenannten Bestimmung einer Kulturflüssigkeit mit dem folgenden Testergebnis liefern: die Duplikate von Wells mit Lösung 1 zeigen eine geringe Aktivität von alkalischer Phosphatase, während die Duplikate von Wells mit Lösung 2 eine hohe Aktivität der alkalischen Phosphatase zeigen.
Die Klone werden von kontaminierenden Klonen gereinigt und für die Gewinnung von Ascites nach konventionellen Techniken verwendet. Der so erhaltene monoklonale Antikörper wird mittels Protein-A Fractionierung gereinigt und, wie oben beschrieben, mit alkalischer Phosphatase konjugiert ("SelAb-Conj" wird auf diese Weise erhalten). Das auf diese Weise hergestellte Konjugat wird für die Oestradiol- Bestimmung folgendermaßen verwendet:
Die Mikrotiterplatten werden durch Versetzen der Wells mit 100 ul von 50 mM Bicarbonattpuffer pH 9.6, welcher 1 ug des monoklonalen anti- Oestradiol-Antikörpers enthält, überzogen. Es folgt eine Inkubation über Nacht bei Zimmertemperatur. Die Wells werden dann mit 100ul von 0.2% Casein im gleichen Puffer versetzt und für eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Danach wird 4-mal mit TT gewaschen. Eine serielle 1 : 2 Verdünnung des Oestradiol:BSA Konjugats in PBS, beginnend mit der Konzentration 1 ug/ml, wird durchgeführt. Die Wells werden in Duplikaten mit je 100ul dieser Verdünnung versetzt und für eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert; zu einem Well-Duplikat wird die Pufferlösung ohne Konjugat zugeben. Die Flüssigkeit wird verworfen und die Wells 4-mal mit TT gewaschen. 100ul einer 1 : 400 Verdünnung der Präperation von SelAb-Conj wird in jedes Well hinzugefügt und die Wells bei Zimmertemperatur für eine weitere Stunde inkubiert. Danach wird die Flüssigkeit verworfen und die Wells 4-mal mit TT gewaschen. 100ul von 10mM para-Nitrophenylphosphat in 50mM Bicarbonat pH 10.3 welches 3.3mM MgCl2 enthalt wird dann in jedes Well befördert und die Aktivität der Alkalischen Phosphatase bei 402nm bestimmt. Ein Diagramm der Oestradiol Konzentration gegen die Phosphatase Aktivität wird angefertigt, es zeigt, in welchem Ausmaß das hinzugefügte Oestradiol-Konjugat die Bindung der primären und sekundären Antikörper hemmt. Die mit Hilfe des Diagramms festgestellte niedrigste Konzentration des Konjugats, die eine über 90%-ige Hemmung bewirkt, wird in der nun folgenden Bestimmung verwendet.
Die Mikrotiterplatten werden - wie im vorhergehenden Absatz beschrieben- zuerst mit dem monoklonalen anti-Oestradiol Antikörper dann mit Casein überzogen und anschließend gewaschen. Serielle 1 : 2 Verdünnung der Oestradiollösung, von 1 ug/ml ausgehend, werden in 50mM Tris pH7,4 bereitet. Duplikatwells werden mit je 100 ul jeder dieser Verdünnungen versetzt und für eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. 10ul einer Lösung des Oestrogen-Konjugats, mit 10-fach höherer Konzentration, als sie oben ermittelt wurde, wird dann in jedes Well hinzugefügt. Die Wells werden für eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Flüssigkeit wird verworfen und die Wells 4-mal mit TT gewaschen. 100 ul des SelAb-Conj werden in jedes Well gegeben und für eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Flüssigkeit wird dann verworfen und die Wells 4-mal mit TT gewaschen. Jedes Well erhält dann 100 ul von 10 mM para-Nitrophenolphosphat, in 50 mM Bicarbonat pH 10,3 welches 3,3mM MgCl2 enthält. Die alkalische Phosphatase Aktivität wird bei 402nm ermittelt. So erhält man eine Standardkurve von Oestradiolkonzentration gegen Phosphataseaktivität. Die Messung von Proben mit unbekannter Oestradiolkonzentration erfolgt, indem sie anstelle der oben beschriebenen seriellen Verdünnungen in den Assay eingefügt werden. Aus der Phosphataseaktivität, die zum Schluß in den Wells mit den zu bestimmenden Proben gemessen wurde, ergibt sich mittels Standardkurve die Oestradiolkonzentration der Proben.

Beispiel 2

Beispiel 1 wird wiederholt, aber das Immunisierungsregime für die Erzeugung des sekundären (SelAb) monoklonalen Antikörpers läuft via intra-splenischer Immunisierung ab mit 100 ug des anti-östradiolenmonoklonalen Antikörpers gemischt mit 200 ug von Oestradiol. Der erste Antikörper, mit dem die Mikrotiterplatte überzogen ist, ist anti-Maus 1 g Antikörper anstelle von anti-Maus IgG und auch die zweistündige Inkubation 2 ug von Maus IgM wird anstelle von IgG hinzugefügt.

Beispiel 3

Beispiel 1 wird wiederholt, aber der sekundäre Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper, erzeugt durch konventionelle Immunisierung eines Kaninchens. Der Antikörper wird auf ähnliche Weise mit Protein A gereinigt bevor Konjugation mit alkalischer Phosphatase.

Beispiel 4

Beispiel 1 wird wiederholt mit Hydrocortison anstelle von Oestradiol. Hydrocortison 3-(O-carboxy-methyl)oxim :BSA Konjugat wird verwendet um den anti-Hydrocortison Antikörper zu erzeugen und auch nachfolgend bei den Inhibitionsschritten.

Beispiel 5

Beispiel 2 wird mit Hydrocortison wiederholt.

Beispiel 6

Beispiel 3 wird mit Hydrocortison wiederholt.

Beispiel 7

Beispiel 1 wird wiederholt mit Progesteron anstelle von Oestradiol. Progesteron 3-(O-Carboxy-methyl)-oxime:BSA Konjugat wird verwendet um anti-Progesteron monoklonalen Antikörper zu erzeugen und auch nachfolgend in den Inhibitionsschritten.

Beispiel 8

Beispiel 2 wird mit Progesteron wiederholt.

Beispiel 9

Ein monoklonaler Antikörper der Maus gegen Theophyllin wird nach konventioneller Methodik gewonnen. Mäuse werden dann mit dem intakten monoklonalen Antikörper mit mehrfachen intra-peritonealen Injektionen immunisiert, ihre Milz wird herausgenommen und IgG Klasse monoklonale Antikörper werden gegen den monoklonalen Antikörper erzeugt. Diese werden für anti-idiotypische Aktivität folgendermaßen durchgemustert:
Nunc Mikrotiterplatten werden pro Well mit 1 ug anti-Maus IgG Antikörper in 100 ul von 50 mM Bicarbonat Puffer versetzt und durch Inkubation über Nacht mit dem Antikörper überzogen. Die Flüssigkeit wird entfernt und die Wells mit 200 ul pro Well von 0,2% Casein im gleichen Puffer überzogen und bei Zimmertemperatur eine Stunde inkubiert. Die Lösung wird entfernt und die Wells 4-mal mit 50mM Tris pH 7.4 gewaschen. Quadruplikate von Wells werden dann mit 1 ug des zu testenden Antikörpers in 100 ul Tris pH 7.4 versetzt.
Sie werden zwei Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Wells werden dann 4-mal mit 0.02 Tween 20 (TT) in 50 mM Tris 7.4 gewaschen. Ein Konjugat des monoklonalen anti-Theophyllin-Antikörpers mit alkalischer Phosphatase wird nach der Methode von Voller A, E.Bidwell und Ann Barlett, Bull.World Health Organ., 53, 55 (1976) hergestellt. Eine 1 : 500 Verdünnung wird davon hergestellt. Zwei 200 ul Aliquots werden entnommen und 50 ul einer 1 mg/ml Lösung von Theophyllin in 50 mM Tris pH 7,4 wird dem einen zugefügt, während dem anderen Puffer allein zugefügt wird. In Quadruplikaten der Wells wird dann jeweils ein Duplikat mit 100 ul der Theophyllin-enthaltenden Lösung versetzt, während das andere Duplikat Paar mit der Lösung ohne Theophyllin versetzt wird. Die Lösungen werden eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Wells werden dann 4-mal mit TT gewaschen und zu jedem Well wird 100 ul von 10 mM para-Nitrophenolphosphat in 50 mM Bicarbonatpuffer pH 10.3 zugegeben. Ihr Phosphataseinhalt wird dann gemessen an der Geschwindigkeit, mit der die optische Dichte sich bei 405 nm ändert. Durchgemusterte Antikörper, bei welchen die Beifügung von Theophyllin wesentlich die Menge des gebundenen Phosphatase Konjugats reduziert (wie eine Lesung von 2.0 optische Dichte Einheiten ohne Theophyllin mit 0.7 optische Dichte Einheiten mit Theophyllin) werden als anti-idiotype Antikörper für den Gebrauch in dem nachfolgenden System betrachtet.
Eine andere Gruppe von Mäusen wird intro-splenisch immunisiert mit einer Immunisation die je 100 ug des monoklonalen anti-Theophyllin Antikörpers enthält gemischt mit der gleichen Menge von Theophyllin in 100 ul 50 mM Tris pH 7,4. Während der nächsten vier Tage erhalten die Mäuse drei weitere Injektionen von 100g von Theophyllin introperitoneal.
Am vierten Tag werden ihre Milzen entfernt und Hybridome auf konventionelle Weise mit Myeloma Zellinie NSO hergestellt. Die Hybridome werden nach dem erforderlichen (SelAb) Antikörper wie folgt durchgemustert:
Mikrotiterplatten werden pro Well mit 100 ul von 50 mM Bicarbonat Puffer pH 9,6 versetzt mit 1 ug anti-Maus IgM Antikörper durch Inkubation über Nacht bei Zimmertemperatur überzogen. Danach wird die Flüssigkeit entfernt, die Wells werden mit 0,2% Casein im gleichen Puffer versetzt und eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Wells werden 4-mal mit TT gewaschen. Quadruplikate von Wells werden sodann mit jeweils 100 ul der zu testenden Hybridom-Kulturflüssigkeit versetzt. Es wird für zwei Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert, dann je 100 ul einer Lösung von 2 ug Maus IgG in jedes Well zugesetzt und die Inkubation für weitere 30 Min. fortgesetzt. Die Wells werden schließlich 4-mal mit TT gewaschen.
Zwei 200ul Aliquots einer 1 : 500 Verdünnung des anti-Theophyllin monoklonalen Antikörpers - alkalischer Phosphatase Konjugat in 50mM Tris pH 7,4 Puffer versetzt mit 0,1% Rinder Serum Album in (TBSA) werden entnommen. Zu einem wird 50 ul des Puffers versetzt mit 100 ug Theophyllin und zum anderen Puffer allein hinzugefügt. Die Lösungen werden gemischt und für 10 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Zu jeder Lösung wird 50 ul von TBSA versetzt mit 10 ug eines selektierten anti-idiotypen Antikörpers hinzugefügt. Die Lösungen werden dann weitere 10 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. 100 ul jeder Lösung wird dann im Duplikat den Mikrotiterwellen hinzugefügt welche zu dem zu testenden Antikörper exponiert wurden. Eine weitere Inkubation für eine halbe Stunde bei Zimmertemperatur folgt. Die Flüssigkeit wird dann verworfen und die Wells 4-mal mit TT gewaschen. Zu jedem Well wird dann 100 ul des 10mM para-Nitrophenylphosphat in 50 mM Bicarbonat Puffer pH 10,3 und versetzt mit 3,3 mM MgCl2 zugegeben. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wird dann durch den optische Dichtewechsel bei 405 nm bestimmt. Wo der optische Dichtewechsel in den Duplikaten, denen Theophyllin zugefügt wurde, deutlich größer ist als in jenen ohne Theophyllin (d. h. so wie 2,0 OD zu 1,0 OD Einheiten), wird der getestete Antikörper als selektiver Antikörper angesehen, und das Hybridom, von dem es gewonnen wurde, wird von allen kontaminierenden Klonen gereinigt und benutzt um Ascites mit konventionellen Techniken aufzuziehen. Der so erhaltene monoklonale Antikörper wird mittels Protein A-Fraktionierung gereinigt. Es wird dann wie oben beschrieben mit alkalischer
Phosphatase konjugiert ("SelAb-Conj" wird auf diese Weise erhalten). Das auf diese Weise hergestellte Konjugat wird für die Theophyllin-Bestimmung folgendermaßen verwendet:
Die Mikrotiterplatten werden durch Versetzen der Wells mit 10ul des 50 mM Bicarbonatpuffer pH 9.6, welcher 1 ug des monoklonalen anti-Theophyllin Antikörpers enthält, überzogen. Es folgt eine Inkubation über Nacht bei Zimmertemperatur. Die Wells werden dann mit 100 ul 0,2% Casein im gleichen Puffer versetzt und eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Sie werden dann 4-mal mit TT gewaschen. Eine serielle 1 : 2 Verdünnung des anti-idiotypen Antikörpers in PBS, beginnend mit der Konzentration 1 ug/ml, wird durchgeführt. Die Wells werden in Duplikaten mit je 100 ul dieser Verdünnung versetzt und für eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert; zu einem Well-Duplikat wird die Pufferlösung ohne Konjugat zugegeben. Die Flüssigkeit wird verworfen und die Wells 4-mal mit TT gewaschen. 100 ul einer 1 : 400 Verdünnung der Präperation von SelAb-Conj wird in jedes Well hinzugefügt und die Wells bei Zimmertemperatur für eine weitere Stunde inkubiert. Danach wird die Flüssigkeit verworfen und die Wells 4-mal mit TT gewaschen. 100 ul von 10mM para-Nitrophenylphosphat, in 50mM Bicarbonat pH10.3, versetzt mit 3,3 mM MgCl2, wird dann in jedes Well befördert und die Aktivität der alkalischen Phosphatase bei 402 nm bestimmt. Ein Diagramm der Theophyllin Konzentration gegen die Phosphatase Aktivität wird angefertigt, es zeigt, in welchem Ausmaß der hinzugefügte anti-idiotype Antikörper die Bindung der primären und sekundären Antikörper hemmt. Die mit Hilfe des Diagramms festgestellte niedrigste Konzentration des Konjugats, die eine über 90-%ige Hemmung bewirkt, wird in der nun folgenden Bestimmung verwendet.
Die Mikrotiterplatten werden - wie im vorhergehenden Absatz beschrieben - mit dem monoklonalen anti-Theophyllin Antikörper überzogen und gewaschen. Serielle 1 : 2 Verdünnungen der Theophyllinlösung, von 1 ug/ml ausgehend,werden in 50 mM Tris pH7,4 bereitet. Duplikatwells werden mit je 100 ul jeder dieser Verdünnungen versetzt und für eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. 10 ul einer Lösung des anti-idiotypen Antikörpers, mit 10-fach höherer Konzentration, als sie oben für die über 90%-ige Hemmung ermittelt wurde, wird dann in jedes Well hinzugefügt. Die Wells werden für eine weiter Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. 100 ul des SelAb-Conj werden in jedes Well gegeben und für eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Flüssigkeit wird dann verworfen und die Wells 4-mal mit TT gewaschen. Jeder Well erhält dann 100 ul von 10 mM para-Nitrophenolphosphat, in 50 mM Bicarbonat pH 10,3, versetzt mit 3,3 mM MgCl2. Die alkalische Phosphatase Aktivität wird bei 405 nm ermittelt. So erhält man eine Standardkurve von Theophyllinkonzentration gegen Phosphatase Aktivität.
Die Messung von Proben mit unbekannter Theophyllinkonzentration erfolgt, indem sie anstelle der oben beschriebenen seriellen Verdünnungen in den Assay eingefügt werden. Aus der Phosphatase Aktivität, die zum Schluß in den Wells mit den zu bestimmenden Proben gemessen wurde, ergibt sich mittels Standardkurve die Theophyllinkonzentration der Proben.

Beispiel 10

Ein monoklonaler Antikörper gegen Theophyllin wird erzeugt und ein Teil mit Phosphatase markiert. Ein monoklonaler anti-idiotyper Antikörper wird gegen den anti-Theophyllin monoklonalen Antikörper erzeugt. Ein selektiver monoklonaler Antikörper wird gegen den monoklonalen anti-Theophyllin Antikörper Theophyllin Komplex erzeugt. Ein Assay für Theophyllin wird dann durchgeführt mittels der Bindung von selektivem monoklonalen Antikörper auf feste Oberflächen und indem man diese markierten anti-Theophyllin Antikörpern aussetzt, die einem Bereich von Theophyllin Standard Präperationen und Proben, die zu bestimmen sind, ausgesetzt waren, und dem anti-idiotypen Antikörper. Die Menge der alkalischen Phosphatase, die spezifisch an die Oberflächen gebunden ist, wird gemessen und die Theophyllin Konzentration in der Probe berechnet.

Beispiel 11

Die Methode von Beispiel 10 wurde mit Gentamycin anstelle von Theophyllin benutzt.

Beispiel 12

Die Methode von Beispiel 10 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß der monoklonale Antikörper gegen Theophyllin fragmentiert wurde und Fab Fragment mit alkalischer Phosphatase markiert und in der Bestimmung benutzt wurde.

Beispiel 13

Vorbereitung und Gebrauch eines selektiven Antikörpers gegen Tetrahydrocannibal.
Mit Methoden analog zu denen beschrieben in Europäische Patentapplikation Nr. 0264219: (1) ein monoklonaler Antikörper wird gegen Tetrahydrocannibal erzeugt (THC); (2) es wird Affinität markiert mit THC Derivat wie beschrieben um ein delta-8-THC-Konjugat zu bilden; (3) ein monoklonaler Antikörper wird gegen dieses Konjugat vorbereitet. Obwohl dieser Antikörper einen Komplex des anti-THC monoklonalen Antikörpers und THC bindet, wird es auch den anti-THC Antikörper allein binden in nicht unbedeutendem Ausmaß, so daß hohe Untergründe resultieren, wenn er in den Assays benutzt wird, die in der Europäischen Patentapplikation Nr.0264219 beschrieben werden.; er könnte jedoch effektiv für die Bestimmung von THC durch die Methode der gegenwärtigen Erfindung als selektiver Antikörper benutzt werden. Es wird benutzt wie in Beispiel 1 der gegenwärtigen Spezifikation mit den folgenden Änderungen: das zu bestimmende Hapten ist THC; der primäre Bindungspartner ist der monoklonale anti-THC Antikörper; der selektive Antikörper wird erzeugt wie oben beschrieben; der sekundäre Bindungspartner ist ein Konjugat von 11-(carboxy-methyl)-oxim Derivat von delta-9-THC und Rinderserum Album in, das auf konventionelle Weise hergestellt wurde.

Claims

1. Eine Methode für die Bestimmung eines Haptens, wobei die Methode folgendes beinhaltet: (i) Kontaktieren des Haptens mit einem Bindungspartner des Haptens, wodurch das Hapten an einen Anteil des Bindungspartners gebunden wird, (ii) Kontakt des ungebundenen Bindungspartners mit einem sekundären Bindungspartner dazu, (iii) Kontakt des Bindungspartners mit einem Antikörper, welcher den ans Hapten gebundenen Bindungspartner bindet, welcher jedoch den an den sekundären Bindungspartner gebundenen Bindungspartner nicht bindet; und (iv) Bestimmung der Menge des an den Bindungspartner gebundenen Antikörpers.

2. Eine Methode wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei ein Überschuß an Bindungspartner benutzt wird.

3. Eine Methode wie entweder in Anspruch 1 oder 2 beansprucht, wobei das Hapten ein Molekulargewicht von weniger als 1000 besitzt.

4. Eine Methode wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

5. Eine Methode wie in Anspruch 4 beansprucht, wobei der sekundäre Bindungspartner ein makromolekulares Derivat des Haptens ist.

6. Eine Methode wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, wobei der Bindungspartner ein Antikörper ist.

7. Eine Methode wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei der Bindungspartner ein monoklonaler Antikörper ist.

8. Eine Methode wie entweder in Anspruch 6 oder Anspruch 7

beansprucht, wobei das Derivat des Haptens für die Gewinnung des Bindungspartners verwendet wurde.

9. Eine Methode wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, wobei der sekundäre Bindungspartner ein Antikörper gegen den Bindungspartner ist.

10. Eine Methode wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, wobei entweder der Bindungspartner oder der Antikörper immobilisiert ist.

11. Eine Methode wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, wobei entweder der Bindungspartner oder der Antikörper markiert ist.

12. Eine Methode wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei derjenige Bindungspartner oder Antikörper, der nicht immobilisiert ist, markiert ist.

13 Eine Methode wie entweder in Anspruch 2 oder 3 beansprucht, welche beinhaltet: (i) Kontaktieren des Haptens mit einem markierten monoklonalen Antikörper, wobei das Hapten zu einem Anteil des markierten monoklonalen Antikörpers gebunden wird, (ii) Kontaktieren des ungebundenen markierten monoklonalen Antikörpers mit einem großen Bindungspartner hierfür, (iii) Kontaktieren des markierten monoklonalen Antikörpers mit einem immobilisierten Antikörper, welcher den markierten monoklonalen Antikörper bindet, welcher dort an das Hapten gebunden ist, aber welcher den markierten monklonalen Antikörper nicht bindet, zu welchem dort sein großer Bindungspartner gebunden ist; und (iv) die Bestimmung der Menge des an den markierten monoklonalen Antikörpers gebundenen Antikörpers.

14. Eine Methode wie entweder in Anspruch 2 oder 3 beansprucht, welche beinhaltet: (i) Kontaktieren des Haptens mit einem immobilisierten monoklonalen Antikörper hierfür, wobei das Hapten zu einem Anteil des monoklonalen Antikörpers gebunden wird, (ii) Kontaktieren des ungebundenen immobilisierten monklonalen Antikörpers mit einem großen Bindungspartner hierfür, (iii) Kontaktieren des immobilisierten monoklonalen Antikörpers mit einem markierten Antikörper, welcher den immobilisierten monoklonalen Antikörper bindet, zu welchem dort das Hapten gebunden ist, welcher jedoch den immobilisierten monoklonalen Antikörper, welcher seinen großen Bindungspartner dort gebunden hat, nicht bindet; und (iv) Bestimmung der Menge des markierten Antikörpers, die zum immobilisierten monoklonalen Antikörper gebunden wurde.

15. Eine Methode wie entweder in Anspruch 13 oder 14 beansprucht, in welcher ein Überschuß des Bindungspartners benutzt wird.

16. Ein Kit für die Bestimmung des Haptens durch eine Methode wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15 beansprucht, welche beinhaltet einen Bindungspartner für das Hapten, einen sekundären Bindungspartner für das Hapten und einen Antikörper, welcher den Bindungspartner binden kann, welcher das Hapten daran gebunden hat, aber welcher denjenigen Bindungspartner nicht bindet, der seinen sekundären Bindungspartner daran gebunden hat.