DE69232801T2

DE69232801T2 - Abtrennungsverfahren

Info

Publication number: DE69232801T2
Application number: DE69232801T
Authority: DE
Inventors: Ramadan Arbi Abuknesha; Mark Philip Byfield
Original assignee: Marconi Optical Components Ltd
Current assignee: Marconi Optical Components Ltd
Priority date: 1991-03-20
Filing date: 1992-03-20
Publication date: 2003-08-14
Anticipated expiration: 2012-03-21
Also published as: GB9206082D0; GB2255637A; EP0640216A1; EP0640216B1; DE69232801D1; CA2106339A1; GB2255637B; ATE225512T1; WO1992016838A1; JPH06506058A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Trennverfahren, das Anwendung findet bei der Detektion einer Spezies (z. B. in Immunoassays und in Immunsensoren) und ein Verfahren, das zur Verwendung bei der Detektion geeignet ist, die Verwendung eines Sensors bei einem Detektionsverfahren der vorliegenden Erfindung und die Verwendung eines Test-Kit in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.
Gemäß eines ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung wird ein Trennverfahren bereitgestellt, das zur Verwendung in einem Immunoassayvorgang zur Detektion einer zu analysierenden Spezies geeignet ist, wobei das Trennverfahren die Bereitstellung einer Hilfsspezies und einer Bindespezies für die Hilfsspezies beinhaltet, um eine spezifische Bindung einzugehen, wobei die Hilfspezies keine Primärspezies ist und die Hilfsspezies ein Ligand ist und die Hilfsspezies auf einem Trägermaterial bereitgestellt wird, wobei das Trägermaterial im Wesentlichen nicht durchlässig ist, es sich bei der Bindespezies um einen Antikörper handelt, der fähig ist, eine spezifische Bindung mit der Hilfsspezies einzugehen, und die Bindespezies geeignet ist, mit Hilfe einer Verknüpfung, die eine Bindung eines nichtspezifischen. Bindungstyps an die Bindespezies beinhaltet, an eine Primärspezies gebunden zu werden, wobei die Bindespezies so angeordnet ist, dass sie mit Hilfe der Verknüpfung an die Primärspezies gebunden wird.
Ein Beispiel für eine Verknüpfung eines nichtspezifischen Bindungstyps ist eine kovalente Bindung. So kann die Bindung zum Beispiel eine kovalente Verknüpfung mit der Bindespezies beinhalten.
Ein weiteres Beispiel für eine Verknüpfung eines nichtspezifischen Bindungstyps ist eine Bindung, die eine Adsorption beinhaltet. So können zum Beispiel eine Bindespezies und eine Primärspezies verknüpft sein, indem beide an ein geeignetes Material (z. B. ein Trägermaterial, wie Latexteilchen) adsorbiert werden.
Die Bindespezies kann mit der Primärspezies direkt oder indirekt (z. B. über eine andere Spezies) verknüpft sein.
So kann zum Beispiel in den Fällen, in denen die Bindespezies so eingestellt ist, dass sie direkt an die Primärspezies gebunden ist, die Verknüpfung eine Bindung des nichtspezifischen Bindungstyps (z. B. eine kovalente Bindung) zwischen der Bindespezies und der Primärspezies sein.
In den Fällen, in denen zum Beispiel die Bindespezies so eingestellt ist, dass sie indirekt mit der Primärspezies verknüpft wird, eine oder mehrere andere Spezien nach Bedarf eine oder mehrere Verknüpfungen beinhalten, wobei zumindest eine dieser Verknüpfungen eine Verknüpfung eines nichtspezifischen Bindungstyps mit der Bindespezies ist.
Es versteht sich, dass in den Fällen, in denen eine oder mehrere Bindungen an der Verknüpfung beteiligt sind, eine der Bindungen eine Bindung des nichtspezifischen Bindungstyps ist, und es sich bei jeder weiteren Bindung oder Bindungen in der Verknüpfung um jeden beliebigen Typ handeln kann (z. B. einen nichtspezifischen Bindungstyp oder einen spezifischen Bindungstyp). So kann die Verknüpfung zum Beispiel eine weitere Bindung oder weitere Bindungen eines nichtspezifischen Bindungstyps enthalten oder kann eine weitere Bindung oder Bindungen eines spezifischen Bindungstyps beinhalten (z. B. eines Ligand-Bindertyps) oder einer Mischung von Bindungstypen (z. B. nichtspezifischen Bindungstypen und spezifischen Bindungstypen).
In den Fällen, in denen die Bindespezies über ändere Spezien mit der Primärspezies verknüpft ist, kann es sich bei den anderen Spezien zum Beispiel um einen sekundären Antikörper oder einen Liganden oder einen Binder handeln, und die Bindespezies kann zum Beispiel kovalent mit den anderen Spezien verknüpft sein.
Es versteht sich, dass die Trennung gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgen kann, indem die Hilfsspezies und die Bindespezies so eingestellt werden, dass sie miteinander eine Bindung eingehen.
Gemäß eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, das zur Verwendung bei der Detektion einer zu analysierenden Spezies oder Analytspezies mittels Immunoassay geeignet ist, wobei das Verfahren beinhaltet, eine Hilfsspezies und eine Bindespezies für die Hilfsspezies so einzustellen, dass sie eine spezifische Bindung eingehen, wobei die Hilfsspezies keine Primärspezies ist und es sich bei der Hilfsspezies um einen Liganden handelt und die Hilfsspezies auf einem Trägermaterial bereitgestellt wird, wobei das Trägermaterial im Wesentlichen undurchlässig ist, es sich bei der Bindespezies um einen Antikörper handelt, der geeignet ist, eine spezifischen Bindung mit der Hilfsspezies einzugehen, und die Bindespezies ferner geeignet ist, über eine Verknüpfung mit der Primärspezies verknüpft zu werden, wobei die Verknüpfung eine Bindung eines nichtspezifischen Bindungstyps an die Bindespezies beinhaltet und die Bindespezies so eingestellt ist, dass sie mit Hilfe der Bindung an die Primärspezies gebunden wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise eine Analytspezies als solche detektiert werden oder eine Analytspezies kann als Teil einer zu detektierenden Substanz detektiert werden (z. B. kann die Analytspezies Teil einer Substanz sein, bei der es sich um eine die Analytspezies enthaltende Substanz handelt). Beispielsweise kann die vorliegende Erfindung einen Antikörper für die Analytspezies oder einen Antikörper für die zu detektierende Substanz verwenden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls ein Trennverfahren bereitgestellt, das für die Verwendung in einem Immunoassay-Vorgang zur Detektion einer Analytspezies geeignet ist, wobei das Trennverfahren die Verwendung einer Hilfsspezies beinhaltet, bei der es sich um einen Liganden handelt, der auf einem Trägermaterial bereitgestellt wird, die Verwendung einer Bindespezies für die Hilfsspezies, wobei es sich bei der Bindespezies um einen Antikörper handelt, der geeignet ist, eine spezifische Bindung mit der Hilfsspezies einzugehen, und wobei die Bindespezies geeignet ist, mit Hilfe einer Verknüpfung an die Primärspezies gebunden zu werden, wobei die Verknüpfung eine Bindung eines nichtspezifischen Bindungstyps an die Bindespezies beinhaltet und die Verwendung eines Antikörpers für die Analytspezies oder die Verwendung eines Antikörpers für die zu detektierende Substanz beinhaltet.
Ein Antikörper für die Analytspezies oder ein Antikörper für die zu detektierende Substanz können durch jedes geeignete Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel durch jene, die zur Züchtung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper bekannt ist. So können die Antikörper zum Beispiel durch die Immunisierung von Tieren gezüchtet werden.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Trennverfahren bereitgestellt, das geeignet ist, in einem Immunoassay-Verfahren zur Detektion einer Analytspezies eingesetzt zu werden, wobei das Trennverfahren die Verwendung einer Hilfsspezies, bei der es sich um einen Liganden handelt, der auf ein Trägermaterial aufgebracht ist, die Verwendung einer Bindespezies für die Hilfsspezies, wobei die Bindespezies ein Antikörper ist, der geeignet ist, eine spezifische Bindung mit der Hilfsspezies einzugehen, und die Bindespezies eine zu detektierende Substanz trägt und die Verwendung eines Antikörpers für die zu detektierende Substanz beinhaltet.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren bereit, das zur Verwendung bei der Detektion einer Analytspezies durch Immunoassay geeignet ist, wobei das Verfahren die Verwendung einer Hilfsspezies, bei der es sich um einen Liganden handelt, der auf ein Trägermaterial aufgebracht ist, die Verwendung einer Bindespezies für die Hilfsspezies, wobei es sich bei der Bindespezies um einen Antikörper handelt, der geeignet ist, eine spezifische Bindung mit der Hilfsspezies einzugehen und die Bindespezies geeignet ist, über eine Verknüpfung mit der Primärspezies verknüpft zu werden, wobei die Verknüpfung eine Bindung eines nichtspezifischen Bindungstyps an die Bindespezies beinhaltet, und die Verwendung eines Antikörpers für eine Analytspezies oder die Verwendung eines Antikörpers für eine zu detektierende Substanz beinhaltet.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, das zur Verwendung bei der Detektion einer Analytspezies durch Immunoassay geeignet ist, wobei das Verfahren die Verwendung einer Hilfsspezies, bei der es sich um einen Liganden handelt, der auf ein Trägermaterial aufgebracht ist, die Verwendung einer Bindespezies für die Hilfsspezies, wobei die Bindespezies ein Antikörper ist, der geeignet ist, eine spezifische Bindung mit der Hilfsspezies einzugehen und die Bindespezies eine zu detektierende Substanz trägt und die Verwendung eines Antikörpers für die zu detektierende Substanz beinhaltet.
Gemäß eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Sensors in einem Verfahren der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, wobei der Sensor ein Trägermaterial und eine Hilfsspezies, die auf dem Trägermaterial bereitgestellt wird, beinhaltet.
Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßer Sensor eine Oberfläche aufweisen, die geeignet ist, als Trägermaterial für die Hilfsspezies zu dienen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein erfindungsgemäß verwendeter Sensor ein Trägermaterial beinhalten, das eine Oberfläche aufweist, mit deren Hilfe die Hilfsspezies immobilisiert wird.
Bei der Oberfläche kann es sich zum Beispiel um Glas, Quarz oder ein Elektrodenmaterial handeln.
Gemäß eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Trägermaterials in einem Trennverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, wobei eine Hilfsspezies auf diesem Trägermaterial bereitgestellt wird.
Gemäß eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Trägermaterials in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, wobei eine Hilfsspezies auf diesem Trägermaterial bereitgestellt wird.
Die Bindespezies kann so eingestellt werden, dass sie die zu detektierende Substanz auf jede beliebige Weise und zu jeder beliebigen Zeit trägt. So kann die Bindespezies zum Beispiel so eingestellt sein, dass sie die Substanz trägt, bevor die Bindung zwischen der Hilfsspezies und der Bindespezies stattgefunden hat oder im Anschluss daran.
Bei einer Primärspezies gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Spezies, die geeignet ist, an einer primären Immun-Bindungsreaktion teilzuhaben. Beispielsweise handelt es sich bei einer primären Immun-Bindungsreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung um eine, in der eine Analytspezies oder eine zu detektierende Substanz (die eine Analytspezies enthält) eine spezifische Bindungsreaktion eingeht, oder eine zertifizierte Analytspezies (wie sie später definiert werden wird) oder eine zertifizierte zu detektierende Substanz (wie sie hier später definiert werden wird) eine spezifische Bindungsreaktion eingeht oder eine Analytspezies und eine zertifizierte Analytspezies spezifische Bindungsreaktionen eingehen oder eine zu detektierende Substanz und eine zertifizierte zu detektierende Substanz spezifische Bindungsreaktionen eingehen. (Es versteht sich, dass die Analytspezies und die zertifizierte Analytspezies mit anderen Spezien und nicht untereinander spezifische Bindungsreaktionen eingehen und dass die zu detektierende Substanz und die zertifizierte zu detektierende Substanz mit anderen Spezien und nicht untereinander Bindungsreaktionen eingehen.)
Beispielsweise kann es sich bei einer Primärspezies um einen primären Antikörper oder einen Liganden (z. B. ein Antigen) handeln. Es versteht sich, dass es sich bei der Primärspezies zum Beispiel um einen Antikörper für eine Analytspezies, einen Antikörper für eine zertifizierte Analytspezies, einen Antikörper für eine zu detektierende Substanz oder einen Antikörper für eine zertifizierte zu detektierende Substanz handeln kann. Es versteht sich ferner, dass es sich in einem vorgegebenen Immunoassay bei dem Antikörper für die Analytspezies und dem Antikörper für die zertifizierte Analytspezies um denselben Antikörper handelt. Gleichermaßen versteht es sich, dass in einem vorgegebenen Immunoassay es sich bei dem Antikörper für die zu detektierende Substanz und dem Antikörper für die zertifizierte zu detektierende Substanz um denselben Antikörper handelt. Es versteht sich ferner, dass es sich bei einer Primärspezies zum Beispiel um eine Analytspezies, eine zertifizierte Analytspezies, eine zu detektierende Substanz oder eine zertifizierte zu detektierende Substanz handeln kann.
Der Ausdruck "Antikörper" wie er in der Beschreibung verwendet wird (z. B. in Bezug auf einen primären Antikörper oder einen sekundären Antikörper) umfasst sowohl den gesamten Antikörper als auch Antikörperfragmente, wie Fab und (Fab)&sub2; und infolgedessen umfasst der Ausdruck "Antikörper", wie er hier verwendet wird, sowohl ganze Antikörper als auch Antikörperfragmente.
Ebenfalls ist unter einer "zertifizierten Analytspezies" eine Spezies zu verstehen, die geeignet ist, auf eine im Wesentlichen gleiche Weise wie eine zu detektierende Analytspezies unter den im Wesentlichen gleichen Bedingungen zu reagieren. Gleichermaßen ist unter einer "zertifizierten zu detektierenden Substanz" eine Substanz zu verstehen, die geeignet ist, auf im Wesentlichen die gleiche Weise wie eine zu detektierende Substanz unter den im Wesentlichen gleichen Bedingungen zu reagieren.
Es versteht sich, dass eine zertifizierte Analytspezies inter alia als Eichsubstanz oder Standard verwendet werden kann. Gleichermaßen versteht sich, dass eine zertifizierte zu detektierende Substanz inter alia als Eichsubstanz oder Standard verwendet werden kann.
Bei der Hilfsspezies handelt es sich um eine Spezies, die nicht selbst an einer primären Immunreaktion unter Ausbildung einer spezifischen Bindung mit einer Analytspezies (oder einer zertifizierten Analytspezies) oder einer zu detektierenden Substanz (oder einer zertifizierten zu detektierenden Substanz) teilnimmt.
Die Hilfsspezies kann zum Beispiel auf jede beliebige Weise auf einem Trägermaterial vorgesehen sein, und es versteht sich, dass in dieser Beschreibung "bereitstellen auf einem Trägermaterial" und "bereitgestellt auf einem Trägermaterial" zum Beispiel Situationen umfassen, in denen das Trägermatrial selbst oder ein Teil des Trägermaterials selbst die Hilfsspezies bereitstellt und Situationen, in denen das Trägermaterial eine Hilfsspezies trägt.
So kann die Hilfsspezies zum Beispiel durch chemische Gruppen oder Substanzen des Trägermaterials bereitgestellt werden, oder die Hilfsspezies kann zum Beispiel an das Trägermaterial (z. B. durch eine kovalente Verknüpfung oder Adsorbtion) gebunden sein. In den Fällen, in denen das Trägermaterial zum Beispiel ein Polymer ist, können Polymereinheiten als Hilfsspezies fungieren. Beispielsweise können ebenfalls Oberflächengruppen, die auf einem Trägermaterial vorliegen, wie Polystyrol oder modifiziertes Siliziumdioxid als Hilfsspezies fungieren.
Beispielsweise kann, anstatt dass das Trägermaterial so eingestellt wird, dass es eine einzige Hilfsspezies bereitstellt, das Trägermaterial Oligomere oder Polymere der Hilfsspezien bereitstellen.
In den Fällen, in denen eine Hilfsspezies an das Trägermaterial geknüpft ist, kann die Hilfsspezies direkt mit dem Trägermaterial oder über andere Spezien (z. B. ein Trägerprotein) verknüpft werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, das ebenfalls die Schritte beinhaltet, eine Hilfsspezies entweder direkt oder indirekt an das Trägermaterial zu knüpfen.
Beispielsweise kann die Oberfläche eines Trägermaterials aktiviert sein, um so die Verknüpfung von Liganden zu Erlauben. Die Oberfläche eines geeigneten Trägermaterials kann mit Hilfe einer chemischen Behandlung aktiviert werden, sodass freie Aminogruppen bereitgestellt werden, an die die Liganden gebunden werden können.
Anstatt dass ferner einzelne Hilfsspezien an freie Aminogruppen geknüpft werden, können (wie zuvor offenbart hergestellte) Oligomere der Hilfsspezies oder Polymere der Hilfsspezies an die freien Aminogruppen geknüpft werden.
Beispielsweise kann eine Hilfsspezies an eine weitere Spezies (z. B. ein Trägerprotein oder Polymer) gebunden werden (z. B. kovalent oder anders), und die andere Spezies kann mit dem Trägermaterial verknüpft sein, derart, dass die Hilfsspezies indirekt auf dem Trägermaterial bereitgestellt wird.
Anstatt dass die einzelne Hilfsspezies indirekt an das Trägermaterial geknüpft wird, ist es ebenfalls möglich, Oligomere oder Polymere der Hilfsspezies an eine weitere Spezies (z. B. ein Trägerprotein oder ein Polymer) zu binden (z. B. kovalent oder anders), und die weitere Spezies kann an das Trägermaterial geknüpft sein, derart, dass Oligomere der Hilfsspezies oder Polymere der Hilfsspezies indirekt auf dem Trägermaterial bereitgestellt werden.
In den Fällen, in denen eine Hilfsspezies mit dem Trägermaterial verknüpft ist, kann die Verknüpfung mit der Hilfsspezies zu jedem gewünschten Zeitpunkt bewirkt werden. D. h., dass die Hilfsspezies zum Beispiel dazu gebracht werden kann, eine Bindung mit der Bindespezies einzugehen, bevor die Hilfsspezies mit dem Trägermaterial verknüpft wird oder im Anschluss daran. Im Allgemeinen ist es jedoch zweckmäßiger, die Hilfsspezies mit dem Trägermaterial zu verknüpfen, bevor die Hilfsspezies und die Bindespezies zusammengebracht werden.
Es versteht sich, dass unter bestimmten Umständen die Verwendung von Oligomeren oder Polymeren der Hilfsspezies von Vorteil sein kann. So können zum Beispiel durch die Verwendung von Oligomeren oder Polymeren einer Hilfsspezies mehr Hilfsspezien bereitgestellt werden, als es möglich ist, bereitzustellen, wenn lediglich eine Hilfsspezies verwendet wird. Folglich bietet die Bereitstellung von mehr Hilfsspezien zur Verfügung stehen, die eine Reaktion mit den zur Verfügung stehenden Bindespezien eingehen.
Die Bindespezien können so eingestellt sein, dass sie auf jede beliebige Weise und zu jedem beliebigen Zeitpunkt eine Bindung mit der Hilfsspezies eingehen können. So kann die Bindespezies zum Beispiel so eingestellt werden, dass sie (entweder direkt oder indirekt) eine Bindung mit einer Primärspezies eingehen, entweder bevor oder nachdem sie eine Bindung mit der Hilfsspezies eingegangen sind.
Bei den Hilfsspezien kann es sich um einen geeigneten Liganden handeln, Beispiele dafür sind Antigenliganden (wie Haptene).
Beispiele für Antigenliganden sind 2,4-Dinitrophenol, Fluoreszein, Digitoxin, Cumarin und Cibacron-Blau.
Weitere Beispiele für Hilfsspezien, die mit dem Trägermaterial verknüpft werden können (z. B. durch eine kovalente Bindung oder eine nichtkovalente Verknüpfung (Adsorption)) sind lösliche Materialien, wie zum Beispiel lösliche Moleküle (z. B. Polymere), wie Polypeptide, Proteine, Polysaccharide und leitfähige Polymere. Hapten-Funktionen können kovalent an lösliche Materialien (z. B. Polymere) gekoppelt werden. Beispielsweise kann eine Hilfsspezies als Beschichtung eines Polymers auf einem Trägermaterial bereitgestellt werden.
Bei der Bindespezies kann es sich um jeden beliebigen Antikörper handeln, der geeignet ist, eine Bindung mit der Hilfsspezies einzugehen. Die Bindespezies kann daher als "Hilfs" -Bindespezies betrachtet werden, dahingehend, dass sie geeignet ist, eine Bindung mit der Hilfsspezies einzugehen.
Der Antikörper kann als Bindeprotein betrachtet werden.
In den Fällen, in denen die Hilfsspezies ein Antigenligand ist, kann die Bindespezies ein Antikörper für den Antigenliganden sein. Ein Antikörper für die Hilfsspezies kann als Anti-Hilfsspezies-Antikörper betrachtet werden.
Folglich kann in den Fällen, in denen es sich bei der Hilfsspezies um Fluoreszein, Cumarin, 2,4-Dinitrophenol oder Cibacron-Blau handelt, die Bindespezies ein Anti- Fluoreszein-Antikörper, ein Anti-Cumarin-Antikörper, ein Anti-2,4-Dinitrophenol-Antikörper oder ein Anti-Cibacron- Blau-Antikörper sein.
Es versteht sich, dass Antikörper, die zuvor offenbart wurden, auf jede geeignete Weise hergestellt werden können, zum Beispiel auf jene, die zur Züchtung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper bekannt sind. So können Antikörper zum Beispiel gezüchtet werden, indem Tiere mit Konjugaten immunisiert werden, die aus geeigneten Derivaten eines Liganden und eines immunogenen Trägerproteins bestehen, wie Bovin-Serum-Albumin oder Key-hole-Limpet-Haemocyanin. Das Produkt, das erhalten wird, indem Tiere immunisiert werden, kann wie gewünscht gereinigt werden (z. B. unter Verwendung der Affinitäts-Chromatographie), um die erforderlichen Antikörper zu erhalten.
Das Trennverfahren der vorliegenden Erfindung kann infolgedessen zum Beispiel Trennsysteme verwenden, die Fluoreszein/Anti-Fluoreszein-Antikörper, Cumarin/Anti-Cumarin- Antikörper, 2,4-Dinitrophenol/Anti-2,4-Dinitrophenol- Antikörper oder Cibacron-Blau/Anti-Cibacron-Blau-Antikörper enthalten.
Die vorliegende Erfindung kann zum Beispiel Anwendung bei der Detektion einer Analytspezies oder bei der Detektion einer zu detektierenden Substanz in einer beliebigen Probe finden. So können zum Beispiel Wasserproben, Erdproben, Proben lebender Spezien (wie Pflanzen (z. B. Gemüse) oder Tiere) oder Luftproben eine Analytspezies oder eine zu detektierende Substanz für die Detektion gemäß der vorliegenden Erfindung bereitstellen. Beispiele für biologische Proben, in denen eine Analytspezies oder eine zu detektierende Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert werden können, sind Blut, Plasma, Serum, Urin, Speichel und Milch. Eine Analytspezies oder eine zu detektierende Substanz kann zum Beispiel in Wasser, einer wässrigen Zubereitung oder einem Fluidextrakt vorliegen. Bei einer Analytspezies kann es sich zum Beispiel um ein Hapten handeln.
Beispiele für Analytspezies, die gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert werden können, sind:
(a) Steroidhormone, wie Progesteron, 17α- Hydroxyprogesteron oder Estradiol (z. B. in einer Blut-, Serum-, Speichel-, Urin- oder Milchprobe),
(b) Hormone, wie Thyroidhormon (z. B. Thyroxin oder Triiodothyronin),
(c) Arzneimittel/Drogen, wie Drogen bei Drogenmissbrauch (z. B. Phenobarbital) und Arzneimittel (z. B. Digoxin) (z. B. in Blut-, Serum-, Speichel- oder Urinproben),
(d) Polypeptidhormone (z. B. in einer Blut- oder Urinprobe),
(e) Tumormarker, wie Markerproteine (z. B. in einer Blut- oder Serumprobe),
(f) menschliches Serumalbumin,
(g) menschliches Chlorion-Gonadotrophin (hCG),
(h) menschliches IgG,
(i) Proteinantigene,
(j) Blutproteine (z. B. Immunoglobuline, Enzymmarker oder Re-zeptoren),
(k) Markerproteine, die aus Urinuntersuchungen bestimmter Krankheiten resultieren,
(1) Insektizide, Pestizide oder Herbizide (z. B. in Wasser oder Erde)
(m) Toxine (z. B. soche, die aus Futtermitteln oder Nahrungsmitteln extrahiert wurden), und
(n) Mikroorganismen (z. B. Viren und Bakterien).
Weitere Beispiele für Analytspezien, die gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert werden können, sind Metallkomplexe.
Die vorliegende Erfindung kann somit Anwendung bei der Detektion von Metallkomplexen finden, wie zum Beispiel Schwermetallkomplexen, die als toxisch betrachtet werden können (z. B. vom biologischen Standpunkt aus, wenn sie in der Umgebung vorliegen).
Ein Beispiel für Metallkomplexe, die gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert werden können, ist Methylquecksilber.
Beispielsweise können Metallionen unter Verwendung eines Komplexbildners (z. B. eines Chelatbildners) in einen Metallkomplex umgewandelt werden, und der so gebildete Komplex kann als erfindungsgemäße Analytspezies dienen.
Gemäß der vorliegende Erfindung können beispielsweise Metalle, wie im Folgenden beschrieben, detektiert werden.
Beispiele für Trägermaterialien, die gemäß der vorliegenden Erfindung Anwendung finden, sind Festphasenmaterialien, wie die Wand eines Reaktionsgefäßes, unlösliche Polysaccharide, Mikroteilchen (z. B. teilchenförmige Microcellulose), Polystyrol (z. B. in Form von Vertiefungen, Kugeln, Microtiterplatten, Platten, Stäben oder Rohren), vernetztes Dextran (z. B. Sephadex), unlösliche Polymerstrukturen, Glasflächen, Oberflächen aus Siliziumdioxidderivaten (z. B. Silylgruppen mit chemischen Funktionen), lösliche Polymere, die an eine geeignete Fläche (z. B. eine Glasfläche) geknüpft sind, Materialien in Form von. Mikroteilchen mit eingeschlossenen Eisenoxiden (magnetisierbare Teilchen), Nylon und Polyamide.
Es versteht sich, dass es Typen von Trägermaterial gibt, die zur Verwendung mit einigen Analytspezien und einigen zu detektierenden Substanzen ungeeignet sind. So kann zum Beispiel die Verwendung von einigen Trägermaterialtypen ungeeignet sein, in den Fällen, in denen es sich bei der Analytspezies um einen Metallion handelt oder die zu detektierende Substanz Metall enthält (z. B. können Trägermaterialien, die eingeschlossene Eisenoxide enthalten, unerwünschte Wechselwirkungen erzeugen).
Die vorliegende Erfindung kann zum Beispiel Anwendung in unmarkierten Assay-Verfahren oder Assay-Verfahren, die von detektierbaren Spezien abhängig sind (z. B. von Markierungsstoffen abhängig) finden, wie Enzym-Immunoassay, Fluor- Immunoassay und Radio-Immunoassay. Beispielsweise kann die vorliegende Erfindung Anwendung finden bei Antikörper- markierten oder Antigen-markierten Assays.
Beispielsweise kann jede geeignete detektierbare Spezies gemäß der vorliegenden Erfindung für die Detektion einer Analytspezies oder einer zu detektierenden Substanz verwendet werden. Es versteht sich, dass es sich bei der detektierbaren Spezies zum Beispiel um eine detektierbare Struktur handeln kann.
Beispiele für detektierbare Spezien sind Enzyme, Fluorophore (oder polymere Fluorophore), Radioisotope, Liganden (oder Polymere von Liganden) und Binder.
Beispielsweise kann ein Enzym mit Hilfe des entsprechenden Substrates detektiert werden, Fluorophore und Radioisotope können direkt mit den geeigneten Detektoren detektiert werden, Liganden können unter Verwendung von Bindern für diese detektiert werden, wobei diese Binder mit Markierungssubstanzen verknüpft sind, und Binder können unter Verwendung von Liganden für diese detektiert werden, wobei die Liganden mit Markierungssubstanzen verknüpft sind.
Bei der Markierungssubstanz kann es sich zum Beispiel um jede beliebige Markierungssubstanz handeln, wie jene, die nach dem Stand der Technik in Bezug auf Protein- Bindungsassays (z. B. Immunoassays) bekannt sind. (Es versteht sich, dass eine Markierungssubstanz ebenfalls als Signalspezies oder als markierende Spezies betrachtet werden kann.)
Beispiele für Markierungssubstanzen sind Enzyme (z. B. Alkalinphosphatase, β-Galactosidase und Meerrettich- Peroxidase), Fluorophore (z. B. Fluoreszeine, Cumarine oder Rhodamin), chemilumineszierende Verbindungen, biolumineszierende Verbindungnen, Radioisotope und Farbstoffe.
Die Detektion oder die Messung eines Signals von einer detektierbaren Spezies kann auf jede geeignete Weise erfolgen, wie zum Beispiel solche, die auf dem immunchemischen Gebiet bekannt sind.
In den Fällen, in denen zum Beispiel ein Ligand oder ein Binder als detektierbare Spezies verwendet wird (wie es zuvor offenbart wurde), kann jeder geeignete Ligand oder Binder verwendet werden.
Beispiele für Liganden, die als detektierbare Spezien verwendet werden können, sind Antigene (z. B. 2,4- Dinitrophenol, Fluoreszein, Digitoxin, Cumarin und Cibacron-Blau), die als Haptene betrachtet werden können, und nicht-antigene Liganden, wie zum Beispiel der Ligand eines spezifischen Ligand-Binder-Paares (z. B. Biotin).
Beispiele für Binder, die als detektierbare Spezien verwendet werden können, sind Antikörper (z. B. Anti-2,4- Dinitrophenol-Antikörper, ein Anti-Fluoreszein-Antikörper, ein Anti-Digitoxin-Antikörper, ein Anti-Cumarin-Antikörper und ein Anti-Cibacron-Blau-Antikörper) und Binder spezifischer Ligand-Binder-Paare (z. B. Avidin). Es versteht sich, dass Antikörper, wie jene, die zuvor offenbart wurden, auf jede geeignete Weise hergestellt werden können, wie den bekannten zur Züchtung polyklonaler und monoklonaler Antikkörper. So können Antikörper zum Beispiel durch Immunisierung von Tieren gezüchtet werden.
Die vorliegende Erfindung kann für jede geeignete Form immunologischer Detektion oder von Immunoassays Anwendung finden, Beispiele hierfür sind Verfahren konkurrierender Immunoassays, Verfahren nichtkonkurrierender Immunoassays und Sandwich-Immunoassay-Verfahren.
In den Fällen, in denen eine detektierbare Spezies gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann die detektierbare Spezies zum Beispiel so eingestellt werden, dass sie auf jede geeignete Weise und zu jedem geeigneten Zeitpunkt mit einer ausgewählten Spezies oder Substanz verknüpft werden kann. So kann eine detektierbare Spezies zum Beispiel (in geeigneter Form, um in einem Immunoassay verwendet zu werden) mit einer Bindespezies verknüpft werden oder mit einer zertifizierten Analytspezies oder mit einer zertifizierten Substanz (wobei es sich um die zu detektierende zertifizierte Substanz handelt) oder mit einem primären Antikörper oder mit einem sekundären Antikörper.
Die vorliegende Erfindung wird nun beispielhaft in Bezug auf ein Verfahren des konkurrierenden Immunoassays und in Bezug auf ein Verfahren des nichtkonkurrierenden Immunoassays beschrieben.
In den beiden Immunoassay-Verfahren, die im Folgenden beschrieben werden, wird ein Anti-Hilfsspezies-Antikörper verwendet. (In den Fällen, in denen es sich zum Beispiel bei der Hilfsspezies um ein Hapten handelt, das ein Antigen ist, kann der Anti-Hilfsspezies-Antikörper als Anti- Hilfshapten-Antikörper betrachtet werden.) Wie hier zuvor offenbart wurde, können Anti-Hilfsspezies-Antikörper durch jedes geeignete Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel durch solche, die zur Züchtung polyklonaler und monoklonaler Antikörper bekannt sind.
Beispielsweise können in einem Verfahren des konkurrierenden Immunoassays, das ein Trennverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet, die folgenden Vorgänge stattfinden:
(a) Eine Hilfsspezies wird in hoher Konzentration in ein Trägermaterial eingeführt (z. B. über eine kovalente Bindung) oder das Trägermaterial selbst wird so eingestellt, dass es die Hilfsspezies bereitstellt,
(b) ein zuvor hergestellter Antikörper für die Hilfsspezies wird über eine kovalente Bindung an eine zertifizierte Analytspezies gebunden,
(c) ein Anti-Analyt-Antikörper (welcher zum Beispiel als primärer Antikörper bezeichnet werden kann) wird mit einer Markierungssubstanz (die geeignet ist, ein Signal abzugeben)(z. B. eine fluoreszierende Substanz oder ein Enzym) markiert,
(d) in der Reaktion, die als primäre Immunreaktion benannt wird, werden die Analytspezies (wenn sie vorhanden ist), geeignete Mengen des markierten primären Antikörpers und die zertifizierte Analytspezies, die mit dem Antikörper für die Hilfsspezies verknüpft ist, in Lösung gemischt.
Es ist zu erwarten, dass die primäre Immunreaktion innerhalb eines kurzen Zeitraums (z. B. bei einer Temperatur von 37ºC-42ºC) das Gleichgewicht erreicht oder sich diesem nähert, sodass eine primäre Immunreaktionsmischung bereitgestellt wird. Es versteht sich, dass die primäre Reaktionsmischung inter alia gebundene und ungebundene Fraktionen enthalten kann.
Anschließend wird ein mäßiger "Überschuss" der Hilfsspezies, die auf dem Trägermaterial bereitgestellt wird (z. B. entweder durch das Trägermaterial gehalten oder durch das Trägermaterial selbst bereitgestellt oder als ein Teil des Trägermaterials) der primären Immunreaktionsmischung zugefügt, oder die primäre Immunreaktionsmischung wird in Kontakt mit einem "Überschuss" der Hilfsspezies, die auf dem Trägermaterial vorgesehen ist (z. B. durch das Trägermaterial bereitgestellt, oder als Teil davon oder mit diesem verknüpft) in Kontakt gebracht.
(Es versteht sich, dass "Überschuss", wie er in dem vorhergehenden Abschnitt verwendet wird, "Überschuss" der Anknüpfungspunkte der Hilfsspezies in Bezug auf die entsprechende Bindespezies für die Hilfsspezies bedeutet.)
Da die Hilfsspezies in einem sehr großen Überschuss in Bezug auf den Antikörper für die Hilfsspezies vorliegt, ist davon auszugehen, dass die Bindungsreaktion schnell und wirkungsvoll mit einem hohen Anteil des Antikörpers für die Hilfsspezies erfolgt, welche an das Trägermaterial gebunden wird. Beispielsweise kann unter einigen Umständen, jedoch nicht unter allen, bis zu 99% des Antikörpers an das Trägermaterial gebunden werden.
So können zum Beispiel durch die Bindung zwischen der Bindespezies und der Hilfsspezies einige der Antikörper, die die Markierungssubstanz tragen, auf dem Trägermaterial zurückgehalten werden, da sie mit der zertifizierten Analytspezies verknüpft sind, die wiederum mit der Bindespezies verknüpft ist. Der Anteil der zurückgehaltenen Antikörper, die die Markierungssubstanz tragen, hängt von der Konzentration der "konkurrierenden" Analytspezies ab, die, wenn überhaupt, in einer gegebenen Probe vorliegt. Bei der konkurrierenden Analytspezies kann es sich um einen Standard handeln oder sie kann in einer unbekannten Menge vorliegen.
Das Trägermaterial kann mit geeigneten Puffern gewaschen werden, um ungebundene Materialien zu entfernen, und aktive Gruppen der Markierungssubstanzen, die mit dem Trägermaterial verknüpft sind, können mit jedem geeigneten Verfahren, wie zum Beispiel jenen, die nach dem. Stand der Technik bekannt sind, gemessen werden.
Beispielsweise können die aktiven Gruppen der Markierungssubstanzen in Lösung ausgewaschen werden, wobei geeignete Puffer verwendet werden, um die Messung der Markierungssubstanz zu erleichtern.
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung (z. B. Ausführungsformen, die optische Immunsensoren verwenden, welche auf dem Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Prinzip oder auf Fluoreszenz mit herabgesetzter kritischer Frequenz basieren) kann es sein, dass ein Waschschritt nicht erforderlich ist. So können die aktiven Gruppen der Markierungssubstanz, die mit dem Trägermaterial verknüpft sind. (bei dem es sich zum Beispiel um eine Sensoroberfläche handeln kann) in Gegenwart ungebundenen Materials gemessen werden.
Es versteht sich, dass unter Verwendung von Standardmengen einer geeeichten Analytspezies die Kalibrierung so erfolgen kann, dass anschließend unbekannte Mengen der Analytspezies bestimmt werden können. Es versteht sich ebenfalls, dass in einem konkurrierenden Immunoassay die Menge an Markierungssubstanz, die auf dem Trägermaterial zurückgehalten wird, abnimmt, wenn die Menge an Analytspezies zunimmt, und umgekehrt, dass die Menge an Markierungssubstanz, die auf dem Trägermaterial zurückgehalten wird, ansteigt, wenn die Menge der Analytspezies abnimmt, wobei sie ein Maximum erreicht, wenn keine Analytspezies vorliegt.
Beispielsweise kann in einem nichtkonkurrierenden Immunoassay-Verfahren, das ein Trennverfahen gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet, folgendes verwendet werden:
(a) Ein Antikörper für die Analytspezies (ein "Signal" - Antikörper), der zu der Markierungssubstanz konjugiert ist, welche geeignet ist, ein Signal abzugeben (z. B. eine fluoreszierende Substanz oder ein Enzym),
(b) ein Hybrid-Komplex, der einen "immobilisierenden" Antikörper enthält, der zu einem Antikörper für die Hilfsspezies konjugiert ist,
(c) eine Analytspezies (die zum Beispiel eine antigene Substanz mit hohem Molekulargewicht ist),
(d) ein Trägermaterial, das selbst eine Hilfsspezies bereitstellt oder mit einer Hilfsspezies verknüpft ist.
Beispielsweise kann in einem nichtkonkurrierenden Immunoassay-Verfahren, das ein Trennverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, folgendes stattfinden:
(i) Eine Analytspezies von Interesse und der "Signal" - Antikörper, der zu der Markierungssubstanz konjugiert ist, werden in Lösung vermischt, womit die Analytspezies durch den Signal-Antikörper gebunden wird,
(ii) der Reaktionsmischung, die in (i) gebildet wird, wird in Lösung ein mäßiger "Überschuss" des immobilisierenden Antikörper-Hybrid-Komplexes (z. B. der imobilisierende Antikörper, der zu einem Antikörper für die Hilfsspezies konjugiert ist) zugefügt, woraufhin ein Immunkomplex, der eine "Sandwich-Struktur" mit der Analytspezies bildet, ausgebildet wird,
(iii) überschüssiges Trägermaterial (z. B. das selbst eine Hilfsspezies bereitstellt oder mit einer Hilfsspezies verknüpft ist) wird der Reaktionsmischung, die unter (ii) gebildet wurde, zugefügt oder die Reaktionsmischung, die in (ii) gebildet wurde, wird mit einem Überschuss an Trägermaterial (z. B. das selbst eine Hilfsspezies bereitstellt oder mit einer Hilfsspezies verknüpft ist) in Kontakt gebracht, derart, dass eine Bindung des Antikörpers für die Hilfssspezies (wobei der Antikörper zu dem immobilisierenden Antikörper konjugiert ist) an die Hilfsspezies (die durch oder auf dem Trägermaterial bereitgestellt wird) erfolgt. Mit Hilfe dieser Bindung wird lediglich der "Signal-" Antikörper, der an die Analytspezies gebunden ist, mit dem Trägermaterial verknüpft.
Das Trägermaterial kann mit einem geeigneten Puffer gewaschen werden, um nichtverknüpfte "Signal" -Antikörper zu entfernen.
Die Markierungssubstanz, die auf dem Trägermaterial zurückbleibt und deren Menge direkt proportional zur Konzentration der Analytspezies ist, kann mit jedem geeigneten Verfahren, wie zum Beispiel den nach dem Stand der Technik bekannten, gemessen werden.
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung (z. B. Ausführungsformen, die die Verwendung eines optischen Immunsensors beinhalten, welche auf dem Oberflächen- Plasmon-Resonanz-Prinzip beruhen oder auf der Fluoreszenz mit herabgesetzter kritischer Frequenz) kann es sein, dass ein Waschschritt nicht erforderlich ist. Infolgedessen können die aktiven Gruppen der Markierungssubstanz, welche mit dem Trägermaterial verknüpft sind (bei dem es sich zum Beispiel um eine Sensoroberfläche handeln kann) in Gegenwart umgebundenen Materials gemessen werden.
Es versteht sich, dass durch Verwendung von Standardmengen einer zertifizierten Analytspezies die Kalibrierung so erfolgen kann, dass anschließend unbekannte Mengen einer Analytspezies bestimmt werden können.
Es versteht sich ferner, dass es in heterogenen immunchemischen Analysen (Immunoassays) notwendig ist, gebundene und ungebundene Fraktionen der detektierbaren Spezies (z. B. einer Markierungssubstanz) zu trennen, um die Bewertung der Verteilung der detektierbaren Spezies (z. B. Markierungssubstanz) im gebundenen und ungebundenen Zustand zu bewerten. Es ist zu berücksichtigen, dass dieser Trennschritt in einem Immunoassay-Verfahren eines der wichtigsten Merkmale einer solchen Methode ist.
Die praktische Bedeutung eines Trennschritts beruht auf der Tatsache, dass die Wirksamkeit des Schrittes, die Einfachheit oder Komplexität und die Geschwindigkeit, die die allgemeinen Eigenschaften eines Assay-Verfahrens beeinflussen und die Leistung eines Assay-Verfahrens beeinflussen können.
Die Trennung gebundener und ungebundener Fraktionen einer detektierbaren Spezies (z. B. einer Markierungssubstanz) kann erfolgen, indem ein Verfahren, das einen Antikörper, der an einer festen Phase immobilisiert ist, ausnutzt, indem ein Antikörper an der Oberfläche eines Reaktionsgefäßes (z. B. Polystyrolrohre) adsorbiert wird oder kovalent an ein aus Mikroteilchen bestehendes Material, wie Microcellulose, Sephadex oder ein aus Mikroteilchen bestehendes Material mit eingeschlossenem Eisenoxid (magnetisierbare Teilchen) gebunden wird.
Die Verwendung immobilisierter Antikörper bei der Trennung in einem Immunoassay kann mehrere Nachteile haben. Zum Beispiel kann die Wechselwirkung zwischen Antikörper und Analytspezies (oder zertifizierter Analytspezies) beträchtlich langsamer sein (z. B. aufgrund von Diffusion) als jene, die zwischen dem gleichen Antikörper und der Analytspezies (oder der zertifizierten Analytspezies) in Lösung erfolgt (es kann zum Beispiel ein längerer Zeitraum erforderlich sein, um ein Gleichgewicht zu erreichen).
Die Immobilisierung eines Antikörpers auf einer festen Phase ist kein problemfreier Vorgang. So kann er zum Beispiel schwierig zu steuern oder zu reproduzieren sein, und es kann ebenfalls ein bedeutender Proteinverlust auftreten. Die vorliegende Erfindung kann die Vorteile von Reaktionen in Lösung zusammen mit einem schnellen Festphasen- Trennverfahren bieten.
Es wurde zuvor Bezug auf eine zu detektierende Substanz genommen. Eine solche zu detektierende Substanz kann zum. Beispiel eine eine Analytspezies enthaltene Spezies sein (z. B. eine Spezies, die eine Analytspezies enthält oder trägt), die durch Wechselwirkung einer Analytspezies mit einem geeigneten Mittel gebildet worden ist.
Demzufolge wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, das die Verwendung eines Agens umfasst, wobei das Agens geeignet ist, mit einer Analytspezies in Wechselwirkung zu treten oder mit einer zertifizierten Analytspezies, um so eine zu detektierende Substanz zu bilden, ferner die Verwendung einer Bindespezies zur Verknüpfung mit dem Agens, die Verwendung einer Hilfsspezies, wobei die Bindespezies und die Hilfsspezies miteinander eine Bindung eingehen können, die Verwendung eines Trägermaterials und die Verwendung eines Antikörpers für die zu detektierende Substanz.
Es versteht sich, dass die Analytspezies oder die zertifizierte Analytspezies, das Agens, die Bindespezies, die Hilfsspezies, das Trägermaterial und der Antikörper auf jede geeignete Weise und zu jedem geeigneten Zeitpunkt in Kontakt miteinander gebracht werden können.
Beispielsweise stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, das die Schritte umfasst, eine Analytspezies und eine Bindespezies zusammenzubringen, die ein Agens trägt, das geeignet ist, eine Wechselwirkung mit der Analytspezies einzugehen, wobei eine Wechselwirkung der Analytspezies mit dem Agens bewirkt wird, um so eine zu detektierende Substanz zu bilden, die Bindespezies, die die zu detektierende Substanz trägt, die auf diese Weise gebildet wird, und eine Hilfsspezies, die auf dem Trägermaterial bereitgestellt wird, zusammenzubringen, um so eine Bindung zwischen der Bindespezies und der Hilfsspezies zu bewirken, und einen Antikörper aufzubringen, wobei der Antikörper ein Antikörper für die zu detektierende Substanz ist, derart, dass der Antikörper an die zu detektierende Substanz gebunden ist.
Als Alternative für das zuvor offenbarte Beispiel können die Hilfsspezies und die Bindespezies, die ein Agens trägt, welches geeignet ist, eine Wechselwirkung mit der Analytspezies einzugehen, derart eingestellt sein, dass sie miteinander eine Bindung eingehen, bevor eine Analytspezies mit dem Agens in Wechselwirkung tritt, um die zu detektierende Substanz zu bilden.
Es versteht sich, dass der Antikörper für die zu detektierende Substanz ein Antikörper sein kann, bei dem es sich um einen spezifischen Antikörper für die zu detektierende Substanz handelt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Antikörper für die zu detektierende Substanz wahlweise eine detektierbare Spezies (wie sie zuvor offenbart wurde) tragen. So kann die detektierbare Spezies zum Beispiel eine Markierungsubstanz sein (zum Beispiel eine Enzym-Markierungssubstanz, eine Fluoreszenz-Markierungssubstanz oder eine radioaktive Markierungssubstanz).
Folglich wird gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, das die Schritte beinhaltet, eine Bindespezies und eine Hilfsspezies, welche auf einem Trägermaterial vorgesehen ist, so bereitzustellen, dass eine Bindung zwischen der Bindespezies und der Hilfsspezies ausgebildet wird, wobei die Bindespezies so eingestellt ist, dass sie die zu detektierende Substanz trägt, ein Antikörper zugesetzt wird, wobei es sich bei diesem Antikörper um einen Antikörper für die zu detektierende Substanz handelt und dieser Antikörper eine Markierungssubstanz trägt, derart, dass der Antikörper eine Bindung mit der zu detektierenden Substanz eingeht, und mit Hilfe der Markierungssubstanz die Bindung des Antikörpers und der Substanz zu detektieren.
Die Bindespezies kann so eingestellt werden, dass sie eine zu detektierende Substanz auf eine beliebige Weise und zu einer beliebigen Zeit trägt (z. B. vor oder nach der Ausbildung der Bindung zwischen Bindespezies und Hilfsspezies).
Jedes geeignete Agens, das geeignet ist, eine zu detektierende Substanz zu bilden, kann von der Bindespezies gemäß der vorliegenden Erfindung getragen werden. Ein Agens, das geeignet ist, einen Komplex mit der Analytspezies zu bilden, ist zum Beispiel ein Agens, welches Anwendung bei der Bildung einer zu detektierenden Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung findet.
Wenn es sich bei der Analytspezies um ein Metall handelt (z. B. in Form eines Metallions), kann das Agens, das durch die Bindespezies getragen wird zum Beispiel ein Agens sein, das geeignet ist, eine metallhaltige Spezies zu bilden (z. B. einen Metallkomplex).
Beispiele für Agentien, die einen Komplex mit einem Metall bilden, sind Chelatbildner.
So wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, das beinhaltet, eine Bindespezies, die ein oder mehrere Moleküle eines Chelatbildners trägt, und eine Analytspezies, die Metallionen enthält, zusammenzubringen, um eine Bindespezies zu bilden, die als zu detektierende Substanz einen Chelatkomplex trägt, die Bindespezies, die den Metallchelatkomplex trägt, und eine Hilfsspezies, die auf einem Trägermaterial bereitgestellt wird, zusammenzubringen, um so eine Bindung zwischen der Bindespezies und der Hilfsspezies zu bewirken, einen Antikörper zuzufügen, wobei es sich bei diesem Antikörper um einen Antikörper für die zu detektierende Substanz handelt und dieser Antikörper eine detektierbare Spezies trägt, sodass der Antikörper eine Bindung mit dem Metallchelatkomplex eingeht und die Bindung des Antikörpers und des Metallchelatkomplexes zu detektieren.
Beispielsweise kann der Antikörper eine detektierbare Spezies tragen, welche eine Enzym-Markierungssubstanz enthält, und die Detektion der Bindung des Antikörpers und des Metallchelatkomplexes kann mit Hilfe eines enzyminduzierten Übergangs erfolgen.
Der enzyminduzierte Übergang kann zum Beispiel ein Farbübergang oder ein Fluoreszenzübergang oder ein Lumineszenzübergang oder ein elektrochemischer Übergang sein.
Es versteht sich, dass es sich bei dem Antikörper um einen Antikörper handeln kann, der den Metallchelatkomplex, jedoch nicht die Chelatbildnermoleküle, die keinen Komplex mit dem Metallion gebildet haben, erkennt.
Demzufolge kann der Antikörper in Bezug auf den Metalichelatkomplex spezifisch sein. Auch kann der Antikörper so sein, dass er spezifisch in Bezug auf einen Komplex eines bestimmten Metallions mit einem Chelatbildner ist, derart, dass er keine signifikante Bindung mit Komplexen eingeht, die andere Metallionen enthalten, welche mit demselben Chelatbildner einen Komplex bilden.
Beispiele für Chelatbildner zur Bildung eines Metallchelats sind:
Ethylendiamintetraacetat (EDTA),
Diethylentriaminpentaacetat (DTPA),
Cyclohexylendinitriltetraessigsäure (CDTA),
1-Benzyl-EDTA, Derivate von 1-Benzyl-EDTA,
8-Hydroxychinolin, Derivate von 8-Hydroxychinolin
und Deferoxamin.
Das Agens kann auf beliebige Weise von der Bindespezies getragen werden, (d. h. durch eine kovalente Bindung zwischen dem Agens und der Bindespezies). Beispielsweise kann eine Substanz des Agens mit der Bindespezies verknüpft sein oder es kann mehr als eine Substanz des Agens mit der Bindespezies verknüpft sein. Demzufolge kann zum Beispiel ein Molekül eines Agens mit der Bindespezies verknüpft sein oder, es können zum Beispiel mehr als ein Molekül des Agens mit der Bindespezies verknüpft sein.
Aus der vorangegangenen Offenbarung ist zu entnehmen, dass gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren den Schritt enthalten kann, einen Komplex einer Analytspezies zu bilden, wobei der so gebildete Komplex eine zu detektierende Substanz bereitstellt.
Aus der vorangegangenen Offenbarung geht ebenfalls hervor, dass gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren den Schritt enthalten kann, ein Agens entweder direkt oder indirekt an die Bindespezies zu knüpfen.
Die vorliegende Erfindung kann zum Beispiel Anwendung bei der Detektion von Metallen (z. B. in Form freier hydrierter Metallionen) in der Umwelt entnommenen Proben oder klinischen Proben oder industriellen Proben finden.
Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung zum Beispiel Anwendung bei der Detektion und Bestimmung von Metallen finden kann, die als in der Umwelt vorhandene Gifte betrachtet werden können. Folglich kann die vorliegende Erfindung Anwendung bei der Umweltüberwachung finden.
So können zum Beispiel Konzentrationsmengen eines Metallions (z. B. die Konzentration eines Schwermetallions), die typisch im ppb-Bereich liegt, in einer beliebigen geeigneten Probe detektiert und bestimmt werden. So können zum Beispiel Wasserproben, Erdproben, Proben von lebenden Produkten (z. B. Pflanzen (beispielsweise Gemüse) oder Tieren) oder Luftproben eine Analytspezies oder eine zu detektierenden Substanz für die Detektion gemäß der vorliegenden Erfindung bereitstellen.
Bevorzugt sollten die Verfahren zur Entnahme der Proben und Konzentrierung so sein, dass die Verunreinigung durch externe Quellen minimiert wird.
Beispielsweise sind geeignete Proben, die der Detektion gemäß der vorliegenden Erfindung unterzogen werden sollen, wässrige Proben.
Es folgen Beispiele für Metalle, die detektiert werden können:
Calcium (CaII), Eisen (FeII, FeIII), Kobalt (CoII, CoIII), Aluminium (AlIII), Zink (ZnII), Blei (PbII), Kupfer (CuII, CuI), Cadmium (CdII), Vanadium (VII, VIII), Silber (AgI, AgII) Quecksilber (HgI, HgII), Indium (InIII), Mangan (MnII) und Nickel (NiII).
Es versteht sich, dass die zu detektierende Substanz und ein Antikörper für diese Substanz auf eine beliebige Weise in Kontakt gebracht werden können. So kann zum Beispiel das Zusammenbringen der zu detektierenden Substanz und des Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung in einem wässrigen Medium erfolgen.
Wie zuvor offenbart, kann der Antikörper für die zu detektierende Substanz auf jede beliebige Weise hergestellt werden, zum Beispiel jene, die für die Züchtung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern bekannt sind. So können zum Beispiel Antikörper mit Hilfe der Immunisierung von Tieren gezüchtet werden.
So kann zum Beispiel eine Analytspezies mit einem Agens zur Reaktion gebracht werden, um so eine Substanz zu bilden (z. B. einen Komplex der Analytspezies), und die Substanz kann vor der Verwendung mit einem Trägerprotein konjugiert werden, um einen Antikörper für die Substanz herzustellen.
Es versteht sich, dass die Substanz, wenn sie zur Herstellung eines Antikörpers verwendet wird, als Hapten betrachtet werden kann.
Ferner kann ein Agens beispielsweise mit einem Trägerprotein konjugiert werden und anschließend eine Analytspezies eingeführt werden, sodass diese mit dem Agens reagiert, um eine Substanz (z. B. einen Komplex der Analytspezies) zu bilden, derart, dass das Trägerprotein, das die Substanz trägt, verwendet werden kann, um einen Antikörper für die Substanz herzustellen.
So kann zum Beispiel ein Chelatbildner, wie p-Aminobenzyl- EDTA mit Bovinserumalbumin (BSA) oder "Keyhole Limpet Haemocymin" (KLH) über ein Thiocyanat-Derivat oder Diazo- Derivat der p-Aminofunktion konjugiert werden, und das Produkt, das aus dieser Konjugation resultiert mit einem Überschuss an einem Metallsalz (z. B. Bleinitrat oder Kobaltnitrat) zur Reaktion gebracht werden, sodass sich eine Metallion-EDTA-BSA-Spezies oder eine Metallion-EDTA-KLH-Spezies bildet.
Nachdem das überschüssige Metallsalz (z. B. durch Gelfiltration oder Dialyse) entfernt worden ist, kann eine derartige Spezies verwendet werden, um einen Antikörper für den Metallion-EDTA-Komplex zu züchten, zum Beispiel durch die Immunisierung von Tieren über einen Zeitraum von 4-6 Monaten.
Es versteht sich, dass, nachdem eine Bindespezies mit einer Hilfsspezies, die auf dem Trägermaterial bereitgestellt wird, eine Bindung eingegangen ist, die Bindespezies ebenfalls an das Trägermaterial geknüpft ist. In den Fällen, in denen zum Beispiel eine Bindespezies an eine Analytspezies oder eine zu detektierende Substanz geknüpft ist und ein Antikörper für die Analytspezies oder die zu detektierende Substanz zugefügt wird, kann infolgedessen der gebundene Antikörper ebenfalls an das Trägermaterial geknüpft sein (über die Analytspezies oder die zu detektierende Substanz, die Bindespezies und die Hilfsspezies).
Folglich kann jeder erforderliche Waschschritt (z. B. mit geeigneten Puffern) verwendet werden, um ungebundene Materialien zu entfernen.
Markierungssubstanzen, die auf dem Trägermaterial zurückbleiben und deren Menge direkt proportional zur Konzentration der Analytspezies oder der zu detektierenden Substanz ist, können mit jedem geeigneten Verfahren, wie den nach dem Stand der Technik bekannten, gemessen werden.
Es versteht sich, dass bei der Verwendung eines Antikörpers für die zu detektierende Substanz (z. B. einen Metallkomplex) die Bindung des Antikörpers und der Substanz spezifisch sein kann, derart, dass die so erhaltene Detektion in Bezug auf die Substanz und damit in Bezug auf jede beliebige Analytspezies, die Teil der Substanz ist, spezifisch und empfindlich ist.
Beispielsweise können die Konzentrationen der Analytspezies im nanomolaren bis picomolaren Bereich (d. h. 10&supmin;&sup9;-10&supmin;¹² M) nach der vorliegenden Erfindung detektiert werden (z. B. indem ein Immunoassay-Verfahren, wie ein enzymmarkiertes Immunoassay-Verfahren verwendet wird).
Die Empfindlichkeit der Detektion gemäß der vorliegenden Erfindung kann als "Detektionsgrenze" ausgedrückt werden (nach dem Stand der Technik auch als "Grenze der quantitativen Bestimmung" bekannt). Diese Grenze bezieht sich auf die Beziehung einer Änderung der Anzeige und einer Konzentration der Analytspezies, die den Wechsel der Anzeige bewirkt.
Die "Detektionsgrenze" ist die niedrigste Konzentration oder Menge einer Analytspezies (gewöhnlich in Konzentrationseinheiten angegeben), die mit Hilfe eines analytischen Verfahrens detektiert werden kann.
Die "Detektionsgrenze" sollte im Allgemeinen eine Sicherheit von zumindest 95% haben, um aussagekräftig zu sein.
In einem Beispiel für ein Verfahren zur Detektion gemäß der vorliegenden Erfindung, das die Verwendung eines markierten Immunoassay-Verfahrens beinhaltet, umfassen die Faktoren, die die Empfindlich der Detektion beeinträchtigen:
(a) Die Affinität eines Antikörpers in Bezug auf eine Analytspezies oder eine zu detektierende Substanz,
(b) die spezifische Aktivität einer für das Assay verwendeten Markierungssubstanz,
(c) die Natur der Signalspezies (z. B. den Typ der verwendeten Signalspezies (z. B. eine radioaktive Markierungssubstanz, eine enzymatische Markierungssubstanz oder eine Floreszenzmarkierungssubstanz)),
(d) den Hintergrund des Assay (d. h. Hintergrund- " Geräusch") und
(e) die Instrumente, die verwendet werden, um das Assay- Signal zu messen.
In den Fällen, in denen eine zu detektierende Substanz zum Beispiel gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert werden soll, wird bevorzugt, dass die zu detektierende Substanz ausreichend stabil ist, um eine befriedigende Detektion zu erlauben. Es wird ebenfalls bevorzugt, dass die Substanz in Bezug auf den Antikörper der Substanz als ein "Hapten" wirkt.
In den Fällen, in denen gemäß der vorliegenden Erfindung eine zu detektierende Substanz und ein Antikörper für die Substanz verwendet werden, kann die Spezifität in Bezug auf die Detektion der Analytspezies, die einen Teil der zu detektierenden Substanz bildet, gemäß der vorliegenden Erfindung als der Grad bestimmt werden, mit dem die Detektion zwischen der Analytspezies (z. B. dem Metallion) und anderen Spezien (z. B. anderen Metallionen) unterscheidet, wenn eine Probe, die der Detektion unterzogen wird, eine Mischung aus Spezien enthält.
Die Spezifität der Detektion kann daher von der Spezifität des Antikörpers für die zu detektierende Substanz in Gegenwart anderer Spezien abhängen (z. B. eines Komplexes oder von Komplexen, die Wechselwirkungsreaktionen bewirken können).
Eine Substanz, die geeignet ist, einen Komplex mit einer Analytspezies zu bilden, kann zum Beispiel ebenfalls geeignet sein, einen Komplex mit anderen Spezien als der Analytspezies zu bilden.
In solchen Fällen kann es eine "Kreuzreaktion" des Antikörpers (d. h. eines Antikörpers für den Komplex der Analytspezies) mit Komplexen einer Substanz mit anderen Spezien als der Analytspezies geben.
Beispielsweise kann ein Verfahren zur Bestimmung einer Kreuzreaktion eines Antikörpers (z. B. eines Antikörpers für den Komplex der Analytspezies) mit Komplexen einer anderen Spezies als der Analytspezies geben.
Beispielsweise nutzt ein Verfahren zur Bestimmung der Kreuzreaktionen eines Antikörpers einen immobilisierten primären Antikörper und einen markierten Komplex der Analytspezies in einem vergleichenden Immunoassay-Verfahren. So kann eine Eichkurve (d. h. eine Standardkurve) aufgestellt werden, indem ein Bereich von Konzentrationen der Analytspezies und eine "begrenzte" Menge des immobilisierten Antikörpers verwendet werden. Die Bindung einer begrenzten Menge eines markierten Komplexes der Analytspezies wird in Abwesensenheit eines vergleichenden Standardkomplexes der Analytspezies aufgezeichnet und in Gegenwart von ansteigenden Anteilen eines solchen Standards.
Eine Eichkurve (eine "Dosis-Antwortsignal-Kurve") wird aufgestellt, indem der Anteil der gebundenen Markierungssubstanz (in gebundenen %) gegen die Standardkonzentration aufgetragen wird. Es versteht sich, dass die Bindung der Markierungssubstanz als 100% angesetzt wird, (wenn 0% des Standards gebunden ist) oder die gesamte Menge der Markierungssubstanz als 100% festgelegt wird.
Die obigen Schritte werden wiederholt, wobei der Standard durch Bereiche bekannter Konzentrationen von Komplexen ersetzt wird, die dasselbe Mittel (wie es bei der Komplexbildung der Analytspezies verwendet wird) enthalten, das mit anderen Spezien als der Analytspezies komplexiert wird. Alle anderen Parameter werden im Wesentlichen unverändert gelassen.
So kann eine Reihe von Dosis-Antwortsignal-Kurven von Standards und möglichen "Kreuzreaktions" -Komplexen zusammen in einem Diagramm aufgetragen werden.
Kreuzreaktionswerte (CR) werden als das hundertfache des Verhältnisses der molaren Konzentrationen des Standards und möglichen kreuzreagierenden Komplexen berechnet, die eine Abnahme der Bindung der Markierungssubstanz um 50% bewirken (wobei der Bindungswert in Abwesenheit der konkurierenden Substanzen zu 100% angesetzt wird).
Folglich:
Aus der vorangegangenen Offenbarung geht hervor, dass die Detektion einer Analytspezies gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden kann, indem beispielsweise ein immunchemisches Detektionsverfahren, z. B. ein Immunoassay- Verfahren verwendet wird.
In den Fällen, in denen zum Beispiel ein Mittel, das geeignet ist, eine Wechselwirkung mit einer Analytspezies einzugehen, verwendet wird, um eine zu detektierende Substanz zu bilden, kann eine Analytspezies (z. B. ein Metallion) durch Wechselwirkung mit dem Mittel, welches mit einer Bindespezies verknüpft sein kann und so eine zu detektierende Substanz bildet, aus der Probe extrahiert werden.
Folglich kann die Bindespezies an eine Hilfsspezies gebunden sein, wobei die Hilfsspezies auf einem Trägermaterial bereitgestellt wird und anschließend ein markierter Antikörper zugegeben wird. Die Menge der vorliegenden Substanz (und damit die Menge der Analytspezies, die in der Probe vorliegt) kann mit Hilfe von Verfahren, die für Immunoassays bekannt sind, bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung kann ebenfalls für Sensoren, welche gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, z. B. Immunsensoren, wie optische Immunsensoren und elektrochemische Immunsensoren, die Möglichkeit bieten, dass eine Sensorfläche, die eine Hilfsspezies trägt, für viele unterschiedliche oder alle Analytspezien gleich ist, wobei ein allgemein verwendbarer Sensoraufbau bereitgestellt wird.
Eine Kombination, die eine Sensoroberfläche enthält, die eine Hilfsspezies trägt, kann also zum Beispiel so ausgestaltet sein, dass sie eine Regeneration für eine mehrfache Anwendungen erlaubt. Zum Beispiel kann eine Kombination einer Sensoroberfläche, die eine Hilfsspezies trägt, durch Entfernen der gebundenen Substanzen regeneriert werden, wobei mit einer geeigneten Pufferzubereitung gewaschen wird (z. B. 0,1 M Glycin-HCl bei pH 2,5).
Gemäß eines weiteren Beispiels kann die Hilfsspezies so ausgewählt sein, dass sie gegenüber einer Behandlung mit organischen Lösungsmitteln und/oder chaiotropen Reagenzien stabil ist, um so die Regeneration für die mehrfache Wiederverwendung zu erlauben.
Die vorliegende Erfindung bietet somit die Möglichkeit, einen nichtspezifischen Sensor, wie einen Immunsensor oder eine Immunelektrode aufzubauen.
So kann zum Beispiel ein elektrochemischer Immunsensor bereitgestellt werden, indem eine Elektrodenoberfläche mit einem leitfähigen Polymer (z. B. einem Polypyrrol-Polymer) beschichtet ist, welches so eingestellt ist, dass es als Hilfsspezies fungiert. Antikörper für dieses leitfähige Polymer (z. B. Polypyrrol-Polymer) oder dessen Segmente können mit Hilfe geeigneter Verfahren, wie sie nach dem Stand der Technik bekannt sind, erzeugt werden, um sie in solchen Sensoren zu verwenden. Zum Beispiel kann eine Kombination, welche eine Elektrodenoberfläche und eine leitfähige Polymerbeschichtung enthält, so eingestellt sein, dass sie eine Regeneration zur mehrfachen Wiederverwendung erlaubt.
Die Verfahren konkurrierender und nichtkonkurrierender Immunoassays, die hier anhand von Beispielen beschrieben wurden, können in einem elektrochemischen Immunsensor, wie er direkt vorher beschrieben wurde, verwendet werden. Eine Spezies als Markierungssubstanz zur Verwendung in derartigen elektrochemischen Immunsensoren kann so eingestellt sein, dass sie eine elektroaktive Spezies bereitstellt.
Bei herkömmlichen elektrochemischen Immunsensoren, wie sie nach dem Stand der Technik bekannt sind, können spezifische Antikörper auf einer Elektrodenoberfläche immobilisiert werden, um so einen spezifischen Immunsensor bereitzustellen. Derartige Immunsensoren können interne Beschränkungen aufweisen, wenn Mehrfachelektroden mit denselben Eigenschaften erforderlich sind. Diese Nachteile werden offensichtlich, da die Regeneration des Sensors schwierig werden kann oder die Regeneration dazu führt, dass sich die Aktivität des Antikörpers verschlechtert.
Die vorliegende Erfindung kann die Möglichkeit bereitstellen, derartige Nachteile zu vermeiden, dahingehend, dass der erfindungsgemäß verwendete Sensor kein spezifischer Sensor sein muß.
Aus dem Vorangegangenen wird klar, dass zum Beispiel für die Detektion einer Analytspezies gemäß der vorliegenden Erfindung ein Immunsensor-Verfahren eingesetzt werden kann.
Zum Beispiel kann die Hilfsspezies auf der Oberfläche einer Sensorvorrichtung (z. B. einer Glasoberfläche, einer Quarzoberfläche oder auf einer Elektrodenoberfläche) immobilisiert sein.
So wird zum Beispiel bei der Verwendung von direkten optischen Immunsensoren keine Markierung verwendet, und die Bindung einer Analytspezies oder einer zu detektierenden Substanz und eines Antikörpers kann eine Signalerzeugung bewirken, um die Detektion zu erlauben (z. B. durch Oberflächen-Plasmon-Resonanz).
Beispielsweise kann bei der Verwendung eines Immunsensors mit markierten Antikörpern die Signalerzeugung durch ein geeignetes Verfahren detektiert werden, das den Eigenschaften des Signals, welches durch die Markierung erzeugt wird, entspricht (z. B. kann eine Einrichtung zur Messung der Fluoreszenzemission verwendet werden, wenn die Markierung eine fluoreszenzerzeugende Substanz ist).
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Test-Kit bereitgestellt, wobei das Test-Kit ein Trägermaterial und eine Hilfsspezies, die auf das Trägermaterial aufgebracht ist, enthält und in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
In einer Ausführungsform kann die Bindespezies mit einem Mittel verknüpft sein, das geeignet ist, eine zu detektierende Substanz zu bilden, wenn sie mit einer Analytspezies in Kontakt gebracht wird. Es kann ferner ein Antikörper für die Substanz verwendet werden. Ebenfalls kann eine Vorrichtung verwendet werden, um mit Hilfe eines immunologischen Verfahrens die Menge der gebildeten Substanz und damit die Menge der Analytspezies, die in einer vorgegebenen Probe vorliegt (z. B. einer wässrigen Probe) zu bestimmen.
Daraus geht hervor, dass die erfindungsgemäße Detektion zum Beispiel qualitativ oder quahtitativ erfolgen kann. Es ist ebenfalls klar, dass die quantitative Detektion verwendet werden kann, um die Konzentrationsanteile zu bestimmen.
Ferner kann die vorliegende Erfindung für Proben verwendet werden, die die Analytspezies oder zu detektierende Substanzen enthalten, und für Proben, die im Wesentlichen keine Analytspezies oder keine zu detektierenden Substanzen enthalten (z. B. eine "Leer" -Standardprobe oder eine "unbekannte" Probe, bei der, wenn sie der erfindungsgemäßen Detektion unterzogen wird, herausgefunden wird, dass sie im Wesentlichen keine Analytspezies oder zu detektierende Substanz enthält).
Beispielsweise kann bei der Verwendung von Standardmengen einer zertifizierten Analytspezies oder einer zertifizierten zu detektierenden Substanz die Kalibrierung so erfolgen, dass anschließend unbekannte Mengen einer Analytspezies oder unbekannte Mengen einer zu detektierenden Substanz bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen beschrieben, wie folgt:

Beispiel 1

Herstellung eines Anti-17β-Estradiol-Antiserums

17β-Estradiol wird als Analytspezies ausgewählt, um beispielsweise die Verwendung eines aus einer Hilfsspezies und einer Bindespezies bestehenden Paarsystems bei der erfindungsgemäßen Trennung von gebundenen und ungebundenen Fraktionen in ELISA (enzyme labelled immunosorbent assay) zu veranschaulichen. Folglich ist es notwendig, einen Antikörper für 17β-Estradiol herzustellen.
17β-Estradiol-3-(O-carboxymethyläther), (z. B. E&sub2;3CME) wird hergestellt und an Keyhole-Limpet-Haemocyanin (KLH) gekoppelt, um ein Immunogen herzustellen. So wird das Derivat, N-Hydroxysuccinimidester, von 17β-Estradiol-3-(O- carboxymethyläther) hergestellt. Der Ester (10 mg/ml in Dioxan) wird 50 mg von KLH (in 10 ml 0,1 M NaHCO&sub3;, pH 8,6) zugegeben. Das resultierende konjugierende Immunogen wird mit Hilfe von Dialyse gegen 3% NaHCO&sub3; gereinigt. Kaninchen- Antiserum zu 17β-Estradiol wird über einen Zeitraum von 9 Monaten bei monatlichen Intervallen durch Injektion von 0,5 mg-Substanzen des konjugierten Immunogens erzeugt.
Estradiol-Derivate, wie sie zuvor beschrieben wurden, werden ebenfalls an Ei-Albumin (Ovalbumin) gekoppelt, um ein zertifiziertes Analytspezies-Proteinkonjugat zu erzeugen, welches geeignet ist, an Polystyrol-Microtiter-Platten adsorbiert zu werden.
30 mg kristallines Ei-Albumin 30 mg in 6 ml 0,1 M NaHCO&sub3; (pH 8.6) wird mit 0,3 mg des aktiven Esters E&sub2;3CME (in 1 ml Dimethylformamid) zur Reaktion gebracht. Das so gebildete Konjugat wird gereinigt, indem es einer extensiven Dialyse mit 3% NaHCO&sub3; unterzogen wird und dann mit Aktivkohle (1%) behandelt wird, um nichtgebundenes Estradiol zu entfernen.

Titration der Bindungsaktivität des Anti-17β-Estradiol- Antikörpers

Polystyrol-Mikrotiter-ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen werden mit dem zertifizierten Analytproteinkonjugat (z. B. E&sub2;3CME-Ovalbumin) beschichtet, welches wie zuvor beschrieben hergestellt wird. Anschließend wird das Konjugat (0,1 ug in 100 ul in 0,1 M NaHCO&sub3;) über einen Zeitraum von 24 Stunden zur Adsorbtion gebracht. Überschüssige aktive Stellen werden mit einer 0,5 gl&supmin;¹-Lösung aus Pferde- Hämoglobin (150 ul in 0,1 M NaHCO&sub3;) blockiert. Die Antikörper-Bindungsaktivität in dem Anti-17β-Estradiol-Antiserum wird mit Hilfe von Diagrammen bewertet, in denen die Antwortsignale der Antikörperverdünnung aufgetragen sind. Es wird eine Verdünnungsreihe des Antiserums mit Assay-Puffern erstellt (50 mN Tris-HCl, pH 7,4, welches 0,1 M NaCl, 0,1% Gelatine, 0,05% Tween (eingetragene Marke) 20 und 0,001% Thimerosal enthält). 100 ul-Volumeneinheiten jeder so erhaltenen Verdünnung werden (zwei Mal) in die beschichteten Vertiefungen der wie zuvor beschrieben hergestellten beschichteten Platten gegeben und über einen Zeitraum von 2 Stunden bei 37ºC zur Reaktion gebracht. Nachdem die Platten gewaschen worden sind, werden 100 ul eines zweiten Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugats zugegeben und diese eine weitere Stunde bei 37ºC zur Reaktion gebracht. (Das zweite Antikörper-Meerrettichperoxidase-Konjugat ist ein im Handel erhältliches Konjugat aus einem Anti-Kaninchen- Immunoglobin-Antikörper eines Esels und Meerrettichperoxidase enthält). Das Assay-Signal wird durch das Meerrettichperoxidase-(HRP)-Substrat, 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) bei einer Reaktionszeit von 20 Minuten erzeugt. Die optische Dichte (O.D.) bei 415 nm wird in einem Standard-ELISA-Plattenauslesegerät ausgelesen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle I

Beispiel 2

Herstellung eines Antikörpers für die Hilfsspezies

In diesem Beispiel wird ein Antikörper (eine Bindespezies) für eine Hilfsspezies, bei der es sich um einen Liganden handelt, erzeugt. So wird 7-Amino-4-methylcumarin-3- propionsäure (7AMCPA) synthetisiert und unter Verwendung eines aktiven Esterderivates an Bovinserum gekoppelt, um ein Immunogenkonjugat zu bilden. Schafantikörper für 7- Amino-4-methylcumarin wird durch Injektion von 1,5 mg- Substanzen des Immunogenkonjugats über einen Zeitraum von 12 Monaten in monatlichen Intervallen erzeugt. Das zuvor beschriebene 7-Amino-4-methoylcumarinesterderivat wird an Ei-Albumin (Ovalbumin) gekoppelt, um ein Ligand-Protein- Konjugat bereitzustellen, um es für Polystyrol- Mikrotiterplatten zu verwenden. Die Antikörperbindungsaktivität in dem erzeugten Antiserum wird bewertet, indem ein Verfahren verwendet wird, bei dem mit Hilfe von ELISA eine Antwortsignalkurve einer Verdünnungsreihe aufgestellt wird, wie es in Beispiel 1 offenbart ist, mit dem Unterschied, dass 2 ug des Ligand-Protein-Konjugats verwendet werden, um die Platten zu beschichten und ein Anti-Schaf-Antikörper- HRP-Konjugat als zweiter Antikörper verwendet wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Es wird darauf hingewiesen, dass der Antikörper für die Hilfsspezies die Bindespezies für die Hilfsspezies ist. Tabelle II

Beispiel 3

Kopplung des Analytderivates an die Bindespezies

Die IgG-Fraktion des Schaf-Anti-7AMCPA-Antikörpers wird mit Hilfe von Ionenaustausch-Chromatographie auf DEAE-Sephadex A50 hergestellt. (Sephadex ist eine eingetragene Marke.) 17β-Estradiol-3-(O-carboxymethyläther) wird mit Hilfe von standardisierten Konjugationsverfahren an die IgG-Fraktion gekoppelt. Daraufhin werden 2,0 mg des aktiven E&sub2;3CME Esters (in 200 ul Dioxan) zu 100 mg der IgG-Fraktion in 15 ml von 0,1 M NaHCO&sub3; (pH 8,6) gegeben, um ein Konjugat aus Bindespezies und zertifizierter Analytspezies zu bilden. Nach der Dialyse und der Behandlung mit 1% künstlicher Kohle wird die Aktivität der Antikörperbindung in diesem Konjugat mit Hilfe eines ELISA-Verfahrens, vergleichbar dem in Beispiel 2 offenbarten, bewertet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle III

Beispiel 4

Reinigung des Konjugats aus Bindespezies und zertifizierter Analytspezies

Das Konjugat aus Bindespezies und zertifizierter Analytspezies, das hergestellt wurde, indem der aktive E&sub2;3CME-Ester an die IgG-Fraktion des Schaf-Anti-7AMCPA-Antikörpers gekoppelt wurde, wie es in Beispiel 3 offenbart ist, enthält als Verunreinigungen Konjugate von IgG mit anderen Substanzen als dem Antikörper. Diese Verunreinigungen werden durch Reinigung mittels Affinitätschromatographie entfernt, wobei die Hilfsspezies, wie sie in Beispiel 2 offenbart ist und die an Sepharose-6B als Affinitätsmatrix gekoppelt ist, verwendet wird. Die Affinitätsmatrix wird erzeugt, indem ein 7AMCPA-Ei-Albumin (Ovalbumin)-Konjugat (20 mg) an Cyanogenbromid aktiviertes Sepharose-6B (5 ml) gekoppelt wird. (Sepharose ist eine eingetragene Marke.)
Alle Schritte der Behandlung der Affinitätsmatrix, das Waschen und das Verfahren der Affinitätschromatographie werden in der Kälte (5ºC) ausgeführt, und es wird eine kühle Chromatographie-Gehäuse verwendet.
Die Affinitätsmatrix wird zunächst extensiv gemäß eines Standardverfahrens der Affinitätschromatographie gewaschen. Um nur lose gebundene Liganden aus der Matrix zu entfernen, wird die Matrix mit 5 ml des Anti-7AMCPA-Antiserums gemischt (mit dem Assay-Puffer auf 20 ml verdünnt), und anschließend wird die Matrix mit 100 ml des Elutionsreagens (20% Acetonitril und 1% Propionsäure in destilliertem Wasser) gewaschen. Die Affinitätsmatrix wird sorgfältig mit dem Assay-Puffer gewaschen, um Spuren des Elutionsreagenses zu entfernen. Der Assay-Puffer hat die in Beispiel 1 offenbarte Zusammensetzung.
Die so erzeugte Affinitätsmatrix kann als 7AMCPA-Ovalbumin- Sepharose-6B-Gel bezeichnet werden. (Sepharose ist eine eingetragene Marke.)
Das Anti-7AMCPA-Antikörper-E&sub2;3CME-Konjugat (80 mg in 20 ml des Puffers, 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,1, welches 0,1 M NaCl, 0,1% Natriumazid und 0,05% Tween (eingetragene Marke) 20 enthält) wird in einer Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 0,1 ml pro Minute durch 2 ml der Affinitätsmatrix geführt. Nachdem das gesamte Konjugat in der Säule der Matrix ausgesetzt worden ist, indem sie in Lösung in die Säule eingeführt wurde, wird die Säule mit 50 ml eines Waschpuffers (0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, der 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20 und 0,1% Natriumazid enthält) gewaschen, um ungebundene Materialien zu entfernen. Wenn die optische Dichte (bei 280 nm) des Eluats aus der Säule auf 0,05 fällt, wird die Säule mit 20 ml eiskaltem destillierten Wasser gewaschen, wobei die Fließgeschwindigkeit sich während des Waschvorgangs auf 0,5 ml pro Minute erhöht. Nach dem Waschen mit Wasser wird ein Gradient eines eluierenden Reagenzes auf die Säule gegeben. (Das eluierende Reagenz ist eine Mischung aus 20% Acetonitril und 1% Propionsäure in destilliertem Wasser.) Das eluierende Reagenz wird in Eis gehalten, um eine niedrige Temperatur beizubehalten. Die eluierten Fraktionen (2 ml pro Fraktion) werden in 0,5 ml eines 0,2 M Phosphatpuffers (pH 8,0) aufgenommen, um die Säure zu neutralisieren. Der Elution folgt eine Messung der O.D. bei 280 nm (Proteinadsorbtion). Die Ergebnisse sind in Tabelle IV aufgeführt. Tabelle IV
(Die Auftragungen der O.D. für die Fraktionen 1 und 15 geben im Wesentlichen jene von destilliertem Wasser wieder, da das eluierende Reagenz erst etwa zu dem Zeitpunkt auf die Säule gegeben wurde, zu dem die Fraktion 11 aus der Säule gesammelt wurde. Es wird darauf hingewiesen, dass eine ansteigende Menge des eluierenden Reagenzes einen Anstieg der Elution des Proteins bewirkt.)
Die Fraktionen, die Protein enthalten (Fraktionen 17-24), werden gesammelt und extensiv gegen 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) + 0,1 M NaCl in der Kälte (5ºC) dialysiert, um die Konzentration des eluierenden Reagenzes zu reduzieren und eine Renaturierung des Antikörpers zu ermöglichen.

Beispiel 5

Die Bindungsaktivität des Antikörpers in dem Konjugat, das nach der Dialyse einer Affinitätsreinigung unterzogen worden ist (die Herstellung erfolgte gemäß Beispiel 4) wird mit Hilfe des Verfahrens, bei dem eine Antwortsignalkurve einer Verdünnungsreihe vergleichbar mit jenem in Beispiel 2 offenbarten Verfahren aufgestellt wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle V aufgeführt. Tabelle V

Beispiel 6

Der Estradiol-Gehalt des Konjugates, der gemäß Beispiel 4 hergestellt wurde, wird titriert, wobei zunächst das Konjugat an den Liganden, der an die Mikrotiterplatten adsorbiert ist, gebunden wird, mit einem Puffer gewaschen wird, der Kaninchen-Anti-Estradiol-Antikörper (auf 1/10000 verdünnt) zugegeben wird und die Komponenten über einen Zeitraum von 1 Stunde bei 37ºC zur Reaktion gebracht werden. Nach dem Waschen erzeugt das Anti-Kaninchen-Antikörper-HRP- Konjugat ein Signal, wobei ein Verfahren verwendet wird, das dem in Beispiel 1 offenbarten entspricht. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI aufgeführt. Tabelle VI

Beispiel 7

Ein Eichdiagramm für die Analytspezies Estradiol wird durch ELISA erzeugt, indem eine erfindungsgemäße Trennung erfolgt. Überschüssiger Hilfsligand (7AMCPA-Ei-Albumin) wird an ELISA-Mikrotiterplatten adsorbiert, wie es in Beispiel 2 offenbart ist.
Estradiol-Standards werden in einem Assay-Puffer hergestellt. Der Assay-Puffer besteht aus der in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung. 50 ul-Volumeneinheiten dieses Standards werden zweifach in Reagenzgläser gegeben, wobei folgende Substanzen zugefügt werden: 50 ul eines durch Affinitätschromatographie gereinigten Anti-7AMCPA-Antikörper- E&sub2;3CME-Konjugats, das wie in Beispiel 4 offenbart hergestellt wurde (verdünnt auf 1/7000) und 50 ul eines Kaninchen-Anti-E&sub2;3CME-Antikörpers (verdünnt auf 1/10000). Nach einer Inkubation bei 37ºC über einen Zeitraum von 30 Minuten werden 100 ul/Volumeneinheiten aus dem Inhalt jedes Assay-Röhrchens in einzelne Vertiefungen einer Mikrotiterplatte übertragen, welche eine Hilfsspezies enthalten, die in diesem Beispiel der Ligand 7-Amino-4-methylcumarin-3- propionsäure ist. In diesem Beispiel wird der Ligand mit Ovalbumin konjugiert und so indirekt mit dem Trägermaterial (Mikrotiterplatten) über Ovalbumin verknüpft.
Nach Inkubation bei 37ºC über einen Zeitraum von 30 Minuten wird die Mikrotiterplatte gewaschen und ein Anti-Kaninchen- Antikörper-HRP-Konjugat zugegeben. Der Assay wird wie in Beispiel 1 beendet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 aufgeführt. Tabelle VII

Beispiel 8

Es wird ein Kreuzreaktionsdiagramm für Östron (ein Hauptkreuzreagenz für Estradiol) mit Hilfe des in Beispiel 7 offenbarten Verfahrens aufgestellt, wobei anstelle von Estradiol Östron verwendet wird.
Die Ergebnisse sind Tabelle 8 aufgeführt. Tabelle VIII

Beispiel 9

Ein Kreuzreaktionsdiagramm für Estriol (ein Hauptkreuzreaktiospartner in Bezug auf Estradiol) wird mit dem in Beispiel 7 offenbarten Verfahren aufgestellt, wobei Estriol anstelle von Estradiol verwendet wird. Tabelle IX
Vergleicht man die Ergebnisse, die in den Beispielen 7, 8 und 9 erhalten wurden, wird deutlich, dass das Antwortsignal der Anlytspezies (Estradiol) sich von den beiden Hauptkreuzreaktionspartner Östron und Estriol signifikant unterscheiden.

Claims

1. Trennverfahren, geeignet zur Verwendung in einem Immunoassay-Verfahren zur Detektion einer zu analysierenden Spezies, wobei das Trennverfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß das Trennverfahren die Bereitstellung einer Hilfsspezies und einer Bindespezies für die Hilfsspezies beinhaltet, um eine spezifische Bindung einzugehen, wobei die Hilfsspezies keine Primärspezies ist und die Hilfsspezies ein Ligand ist und die Hilfsspezies auf einem Trägermaterial bereitgestellt wird, wobei das Trägermaterial im wesentlichen nicht durchlässig ist, es sich bei der Bindespezies um einen Antikörper handelt, der fähig ist, eine spezifische Bindung mit der Hilfsspezies einzugehen, und die Bindespezies geeignet ist, mit Hilfe einer Verknüpfung, die eine Bindung eines nicht spezifischen Bindungstyps an die Bindespezies beinhaltet, an eine Primärspezies gebunden zu werden, wobei die Bindespezies so angeordnet ist, daß sie mit Hilfe der Verknüpfung an die Primärspezies gebunden wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die Verknüpfung des nicht spezifischen Bindungstyps eine kovalente Bindung oder eine Adsorption beinhaltende Verknüpfung ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die Verknüpfung auch eine weitere Bindung eines nicht spezifischen Bindungstyps oder eine weitere Bindung eines spezifischen Bindungstyps beinhaltet.

4. Verfahren, geeignet zur Verwendung bei der Detektion einer zu analysierenden Spezies mittels Immunoassay, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß das Verfahren beinhaltet, eine Hilfsspezies und eine Bindespezies für die Hilfsspezies bereitzustellen, so daß diese eine spezifische Bindung eingehen, wobei es sich bei der Hilfsspezies nicht um eine Primärspezies handelt und die Hilfsspezies ein Ligand ist und die Hilfsspezies auf einem Trägermaterial aufgebracht ist, wobei das Trägermaterial im wesentlichen nicht durchlässig ist, die Bindespezies ein Antikörper ist, der geeignet ist, eine spezifische Bindung mir der Hilfsspezies einzugehen und die Bindespezies geeignet ist, mit Hilfe einer Verknüpfung an die Primärspezies gebunden zu werden, welche eine Bindung eines nicht spezifischen Bindetyps an die Bindespezies beinhaltet, wobei die Bindespezies so angeordnet ist, daß sie mit Hilfe der Verknüpfung an die Primärspezies gebunden wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 3, ferner dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die Verwendung einer Hilfsspezies, welche ein Ligand ist, der auf ein Trägermaterial aufgebracht ist, die Verwendung einer Bindespezies für die Hilfsspezies, wobei die Bindespezies ein Antikörper ist, welcher geeignet ist, eine spezifische Bindung mit der Hilfsspezies einzugehen, und wobei die Bindespezies geeignet ist, mit Hilfe einer Verknüpfung an die Primärspezies gebunden zu werden, welche eine Bindung eines nicht spezifischen Bindungstyps an die Bindespezies beinhaltet, und die Verwendung eines Antikörpers für die zu analysierende Spezies oder die Verwendung eines Antikörpers für eine zu detektierende Substanz beinhaltet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, ferner dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die Verwendung einer Hilfsspezies, welche ein Ligand ist, der auf ein Trägermaterial aufgebracht ist, die Verwendung einer Bindespezies für die Hilfsspezies, wobei die Bindespezies ein Antikörper ist, der geeignet ist, eine spezifische Bindung mit der Hilfsspezies einzugehen, und wobei die Bindespezies eine zu detektierende Substanz trägt, und die Verwendung eines Antikörpers für die zu detektierende Substanz beinhaltet.

7. Verfahren nach Anspruch 4, ferner dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die Verwendung einer Hilfsspezies, bei der es sich um einen Liganden handelt, der auf ein Trägermaterial aufgebracht ist, die Verwendung einer Bindespezies für die Hilfsspezies, wobei die Bindespezies ein Antikörper ist, der geeignet ist, eine spezifische Bindung mit der Hilfsspezies einzugehen, und wobei die Bindespezies geeignet ist, mit Hilfe einer Verknüpfung an die Primärspezies gebunden zu werden, welche eine Bindung eines nicht spezifischen Bindungstyps an die Bindespezies beinhaltet, und die Verwendung eines Antikörpers für eine zu analysierende Spezies oder die Verwendung eines Antikörpers für eine zu detektierende Substanz beinhaltet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, ferner dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die Verwendung einer Hilfsspezies, bei der es sich um einen Liganden handelt, der auf ein Trägermaterial aufgebracht ist, die Verwendung einer Bindespezies für die Hilfsspezies, wobei die Bindespezies ein Antikörper ist, der geeignet ist, eine spezifische Bindung mit der Hilfsspezies einzugehen, und wobei die Bindespezies eine Substanz trägt, die detektiert werden soll, und die Verwendung eines Antikörpers für die zu detektierende Substanz beinhaltet.

9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial oder Teile desselben die Hilfsspezies bereitstellt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die Hilfsspezies direkt oder indirekt an das Hilfsmaterial angebracht ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, ferner dadurch gekennzeichnet, daß ein Oligomer einer Hilfsspezies oder ein Polymer einer Hilfsspezies auf dem Trägermaterial bereitgestellt wird.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Hilfsspezies um 2,4-Dinitrophenol, Fluorescein, Digitoxin, Cumarin oder Cibacron-Blau handelt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Hilfsspezies um ein Polypeptid, ein Protein, ein Polysaccharid oder ein leitendes Polymer handelt.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die Hilfsspezies als Polymerbeschichtung auf einem Trägermaterial bereitgestellt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder Anspruch 14, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die Bindespezies ein Anti-Fluorescein-Antikörper, Anti-Cumarin-Antikörper, Anti-2,4-Dinitrophenol- Antikörper oder ein Anti-Cibacron-Blau-Antikörper ist.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die Primärspezies ein Primärantikörper oder ein Ligand ist.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die zu analysierende Spezies als solche detektierbar ist oder die analysierende Spezies Teil einer zu detektierenden Substanz ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die zu analysierende Spezies ein Hormon, eine Droge, ein Steroid, einen Tumor-Marker, menschliches Serumalbumin, menschliches chloriertes Gonadotrophin, menschliches IgG, ein Proteinantigen, ein Blutprotein, ein Markerprotein, ein Giftstoff, ein Mikroorganismus, ein Metallkomplex oder ein Metallion ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Metallkomplex um Methylquecksilber handelt.

20. Verfahren nach Anspruch 18, ferner dadurch gekennzeichnet, daß das Metallion ein Calciumion, ein Eisenion, ein Kobaltion, ein Aluminiumion, ein Zinkion, ein Bleiion, ein Kupferion, ein Cadmiumion, ein Vanadiumion, ein Silberion, ein Quecksilberion, ein Indiumion, ein Manganion oder ein Nickelion ist.

21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner dadurch gekennzeichnet, daß eine zu detektierende Substanz durch Wechselwirkung einer zu analysierenden Spezies mit einem Agens gebildet wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, ferner dadurch gekennzeichnet, daß das Agens ein Agens ist, das geeignet ist, einen Komplex zu bilden.

23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es den Schritt beinhaltet, einen Komplex einer zu analysierenden Spezies zu bilden, wobei der Komplex die zu detektierenden Substanz bereitstellt.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es die Verwendung eines Agens, wobei das Agens geeignet ist, mit der zu analysierenden Spezies oder mit einer authentischen zu analysierenden Spezies in Wechselwirkung zu treten, um eine zu detektierende Substanz zu bilden, die Verwendung einer Bindespezies, zur Assoziierung mit dem Agens, die Verwendung einer Hilfsspezies, wobei die Bindespezies eine Bindespezies für die Hilfsspezies ist und die Bindespezies und die Hilfsspezies geeignet sind, eine Bindung miteinander einzugehen, die Verwendung eines Trägermaterials und die Verwendung eines Antikörpers für die detektierende Substanz beinhaltet.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei das Verfahren ferner dadurch gekennzeichnet, ist, daß es die Schritte beinhaltet, eine zu analysierende Spezies und eine Bindespezies zusammenzubringen, welche ein Agens trägt, das geeignet ist, eine Wechselwirkung mit der zu analysierenden Spezies einzugehen und damit eine Wechselwirkung der zu analysierenden Spezies mit dem Agens zu bewirken, um so eine zu detektierende Substanz zu bilden, wobei die Bindespezies, die die gerade gebildete, zu detektierende Substanz trägt, und eine Hilfsspezies, die auf ein Trägermaterial aufgebracht ist, zusammenzubringen, um so eine Bindung zwischen der Bindespezies und der Hilfsspezies zu bewirken, und einen Antikörper zuzugeben, wobei der Antikörper ein Antikörper für die zu detektierende Substanz ist, derart, daß der Antikörper an die zu detektierende Substanz bindet.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die Hilfsspezies und eine Bindespezies, die ein Agens trägt, das geeignet ist, eine Wechselwirkung mit der zu analysierenden Spezies einzugehen, so angeordnet sind, daß sie aneinander binden, bevor eine zu analysierende Spezies mit dem Agens in Wechselwirkung tritt, so daß eine zu detektierende Substanz gebildet wird.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 26, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es die Schritte enthält, eine Bindespezies und eine Hilfsspezies, welche auf ein Trägermaterial aufgebracht ist, zusammenzubringen, um so eine Bindung zwischen der Bindespezies und der Hilfsspezies zu bewirken, die Bindespezies so bereitzustellen, daß sie eine zu detektierende Substanz trägt, einen Antikörper einzubringen, wobei es sich bei dem Antikörper um einen Antikörper für die zu detektierende Substanz handelt und der Antikörper eine Indikatorspezies trägt, derart, daß der Antikörper an die zu detektierende Substanz gebunden wird und die Bindung des Antikörpers und der Substanz mit Hilfe der Indikatorspezies zu detektieren.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 27, ferner dadurch gekennzeichnet, daß ein Chelatbildner verwendet wird, um einen Komplex als zu detektierende Substanz zu bilden.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 28, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es ferner beinhaltet, eine Bindespezies, welche ein oder mehrere Moleküle eines Chelatbildners trägt, und eine zu analysierende Spezies, die Metallionen enthält, zusammenzubringen, um eine Bindespezies zu bilden, die einen Metall-Chelatkomplex als zu detektierende Substanz trägt, die Bindespezies, die den Metall- Chelatkomplex trägt, und eine Hilfsspezies, die auf einem Trägermaterial aufgebracht ist, zusammenzubringen, um so eine Bindung zwischen der Bindespezies und der Hilfsspezies zu bewirken, einen Antikörper einzubringen, wobei der Antikörper ein Antikörper für die zu detektierende Substanz ist und der Antikörper eine detektierbare Spezies trägt, derart, daß der Antikörper an den Metall-Chelatkomplex bindet und die Bindung des Antikörpers und des Metall-Chelatkomplexes zu detektieren.

30. Verfahren nach Anspruch 29, ferner dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper eine detektierbare Spezies trägt, die einen Enzymindikator aufweist und die Bindung des Antikörpers und des Metall-Chelatkomplexes durch einen Enzyminduzierten Übergang detektiert wird.

31. Verfahren nach Anspruch 30, ferner dadurch gekennzeichnet, daß der Enzyminduzierte Übergang ein Farbübergang, ein Fluoreszenzübergang, ein Lumineszenzübergang oder ein elektrochemischer Übergang ist.

32. Verfahren nach Anspruch 28 oder Anspruch 29, ferner dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatbildner Ethylendiamintetraacetat, Diethylentriaminpentaacetat, Cyclohexylendinitriltetraessigsäure, 1-Benzyl-ETDA, ein Derivat von 1-Benzyl-EDTA, 8- Hydroxychinolin, ein Derivat von 8-Hydroxychinolin oder Deferoxamin ist.

33. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial ein Material fester Phase und das Material fester Phase eine Wand eines Reaktionsgefäßes ist, ein unlösliches Polysaccharid, ein Microteilchen, Polystyrol, vernetztes Dextran, eine unlösliche Polymerstruktur, eine Glasfläche, eine derivatisierte Siliciumdioxidfläche, ein Polymer, das auf die Fläche aufgebracht ist, ein Material aus Micropartikeln mit eingeschlossenem Eisenoxid, Nylon oder ein Polyamid ist.

34. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28 oder 32 oder 33, ferner dadurch gekennzeichnet, daß eine detektierbare Spezies verwendet wird.

35. Verfahren nach Anspruch 34, ferner dadurch gekennzeichnet, daß eine detektierbare Spezies verwendet wird und die detektierbare Spezies ein Enzym, ein Fluorophor, ein polymeres Fluorophor, ein Radioisotop, ein Ligand, ein Polymer eines Liganden oder ein Bindemittel aufweist.

36. Verfahren nach Anspruch 35, ferner dadurch gekennzeichnet, daß eine detektierbare Spezies ein Ligand ist und der Ligand über die Verwendung eines Bindemittels für diesen detektiert wird oder die detektierbare Spezies ein Bindemittel ist und das Bindemittel unter Verwendung eines Liganden für dieses detektiert wird.

37. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner dadurch gekennzeichnet, daß eine Indikatorspezies verwendet wird.

38. Verfahren nach Anspruch 37, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Indikatorspezies um ein Enzym, ein Fluorophor, eine chemilumineszierende Verbindung, eine biolumineszierende Verbindung, ein Radioisotop oder einen Farbstoff handelt.

39. Verfahren nach Anspruch 38, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die Indikatorspezies alkalische Phosphatase, β- Galactosidase, Meerrettich-Peroxidase, Fluorescein, Cumann oder Rhodamin ist.

40. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 10 bis 39, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es beinhaltet, eine Hilfsspezies auf einem Trägermaterial aufzubringen.

41. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 10 bis 40, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es den Schritt beinhaltet, ein Agens an eine Bindespezies entweder direkt oder indirekt zu binden.

42. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner dadurch gekennzeichnet, daß eine Probe Wasser, Erde, einer lebendigen Spezies oder Luft eine zu analysierende Spezies oder eine zu detektierende Substanz zur Detektion bereitstellt.

43. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner dadurch gekennzeichnet, daß eine biologische Probe einer Detektion unterworfen wird.

44. Verfahren nach Anspruch 43, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe Blut, Plasma, Serum, Urin, Speichel oder Milch ist.

45. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner dadurch gekennzeichnet, daß eine zu analysierende Spezies oder eine zu detektierende Substanz in Wasser, einer wäßrigen Zubereitung oder einem Fluidextrakt vorliegt.

46. Kompetitives Immunoassay-Verfahren, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Verwendung eines Trennverfahrens nach Anspruch 1 umfaßt.

47. Nicht kompetitives Immunoassay-Verfahren, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Verwendung eines Trennverfahrens nach Anspruch 1 beinhaltet.

48. Verwendung eines Sensors, dadurch gekennzeichnet, daß gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 47 der Sensor ein Trägermaterial beinhaltet und eine Hilfsspezies auf dem Trägermaterial vorgesehen ist.

49. Verwendung eines Trägermaterials, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Trennverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder der Ansprüche 5 bis 47 eine Hilfsspezies auf dem Trägermaterial vorgesehen ist.

50. Verwendung eines Trägermaterials, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 47 eine Hilfsspezies auf dem Trägermaterial vorgesehen ist.

51. Verwendung eines Test-Kits, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 47 das Test-Kit ein Trägermaterial und eine Hilfsspezies beinhaltet, welche auf dem Trägermaterial vorgesehen ist.