DE3787851T3

DE3787851T3 - Verfahren zur Bestimmung von Glukose im Vollblut.

Info

Publication number: DE3787851T3
Application number: DE3787851T
Authority: DE
Inventors: Frank San Mateo Ca 94402 Jurik; Geoffrey Scotts Valley Ca 95066 Mcgarraugh; Roger Palo Alto Ca 94303 Phillips; Ray Red Bluff Ca 96080 Underwood
Original assignee: LifeScan Inc
Current assignee: LifeScan Inc
Priority date: 1986-08-13
Filing date: 1987-08-07
Publication date: 1998-08-20
Anticipated expiration: 2007-08-08
Also published as: GR3035974T3; DE3752386T2; DE3752241D1; DK419187A; NO932316L; DK91594A; EP0256806B1; EP0256806A2; ES2126562T3; FI110547B; JP2589053B2; FI95749C; FI873356A0; SG83640A1; DE3752229T2; EP0960946A3; FI93149C; FI93149B; KR970003312B1; CN1116307A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung von Glukose in Vollblut.
Die quantitative Bestimmung chemischer und biochemischer Komponenten in farbigen wäßrigen Flüssigkeiten, insbesondere in farbigen biologischen Flüssigkeiten, wie Vollblut und Urin und Derivaten biologischer Flüssigkeiten, wie Blutserum und Blutplasma, ist von ständig wachsender Bedeutung. Wichtige Anwendungsbereiche liegen in der medizinischen Diagnostik und Behandlung und in der quantitativen Bestimmung der Exposition gegenüber therapeutischen Arzneistoffen, Rauschmitteln, gefährlichen Chemikalien und dergleichen. In manchen Fällen sind entweder die zu bestimmenden Materialmengen so gering - im Bereich von einem Mikrogramm oder weniger pro Deziliter - oder es ist so schwierig, sie genau zu bestimmen, daß die verwendete Vorrichtung sehr kompliziert und nur für geschultes Laborpersonal nützlich ist. In diesem Fall sind die Ergebnisse im allgemeinen nicht vor einigen Stunden oder Tagen nach Probeentnahme erhältlich. In anderen Fällen wird oftmals Wert darauf gelegt, daß Laien in der Lage sind, den Test routinemäßig, schnell und reproduzierbar ohne eine Laboreinrichtung mit rascher oder sofortiger Informationsanzeige durchführen konnen.
Ein allgemein bekannter medizinischer Test ist die Messung des Blutzuckerspiegels durch Diabetiker. Die derzeitige Lehre rät Diabetespatienten, ihren Blutzuckerspiegel zwei- bis siebenmal am Tag zu messen, je nach der Natur und der Schwere des Einzelfalles. Aufgrund des beobachteten Bildes der gemessenen Glukosespiegel passen Patient und Arzt gemeinsam die Diät, ihre Durchführung und die Insulineinnahme an, um die Krankheit besser zu bewältigen. Diese Information sollte dem Patienten natürlich sofort zur Verfügung stehen.
Ein derzeit in den Vereinigten Staaten verbreitet verwendetes Verfahren wendet einen Testartikel des Typs an, der in dem US-Patent 3 298 789 beschrieben ist, das am 17. Januar 1967 für Mast erteilt wurde. In diesem Verfahren wird eine Probe von frischem Vollblut (normalerweise 20-40 ul) auf ein mit Ethylcellulose beschichtetes Reagenskissen gegeben, das ein Enzymsystem enthält, das Glukoseoxidase- und Peroxidaseaktivität aufweist. Das Enzymsystem reagiert mit Glukose und setzt Hydrogenperoxid frei. Das Kissen enthält auch einen Indikator, der mit dem Hydrogenperoxid in Gegenwart von Peroxidase reagiert, was eine Farbe ergibt, deren Intensität proportional zu dem Glukosespiegel der Probe ist.
Ein anderes, weitverbreitetes Testverfahren zur Bestimmung von Blutzucker wendet eine ähnliche Chemie an, verwendet jedoch anstelle des mit Ethylcellulose überzogenen Kissens einen wasserbeständigen Film, in dem die Enzyme und der Indikator verteilt sind. Diese Art von System ist in dem US- Patent Nr. 3,630,957, beschrieben, das am 28. Dezember 1971 für Rey et al. erteilt wurde.
In beiden Fällen läßt man die Probe für eine bestimmte Zeit (normalerweise eine Minute) mit dem Reagenskissen in Kontakt bleiben. In dem ersten Fall wird dann die Blutprobe mit einem Wasserstrahl abgewaschen, während sie in dem zweiten Fall von dem Film abgewischt wird. Das Reagenskissen oder der Film wird dann trockengetupft und ausgewertet. Die Bewertung wird durchgeführt, indem man entweder die gebildete Farbe mit einer Farbkarte vergleicht oder indem man das Kissen oder den Film in eine Vorrichtung zur Bestimmung der diffusen Reflexion gibt, um den Farbintensitätswert abzulesen.
Obwohl die zuvor genannten Verfahren jahrelang zur Glukoseüberwachung verwendet worden sind, weisen sie bestimmte Einschränkungen auf. Die erforderliche Probengröße ist für einen Test durch Einstich in die Fingerbeere ziemlich groß und für manche Menschen, deren kapilläres Blut nicht ohne weiters austritt, schwierig zu erreichen.
Darüber hinaus sind diese Verfahren gemeinsam mit anderen einfachen, von Laien durchgeführten kolorimetrischen Bestimmungen, dahingehend beschränkt, daß ihr Ergebnis auf einem Ablesen der absoluten Farbe beruht, das sich wiederum auf das absolute Ausmaß der Reaktion zwischen der Probe und den Testreagenzien bezieht. Die Tatsache, daß die Probe von dem Reagenskissen nach dem zeitlich festgelegten Reaktionsintervall abgewaschen oder abgewischt werden muß, macht es erforderlich, daß der Anwender am Ende des festgelegten Zeitintervalles bereitsteht und zur richtigen Zeit abwischt oder abwäscht. Die Tatsache, daß die Reaktion beendet wird, indem die Probe entfernt wird, führt zu einiger Unsicherheit im Ergebnis, insbesondere bei der Anwendung Zuhause. Zu langes Waschen kann niedrige Ergebnisse und zu kurzes Waschen kann hohe Ergebnisse liefern.
Ein anderes Problem, das in einfachen kolorimetrischen Bestimmungen für Laien oft vorliegt, ist die Notwendigkeit, eine zeitliche Abfolge einzuleiten, wenn Blut auf ein Reagenskissen aufgebracht wird. Ein Anwender führt normalerweise einen Einstich in einen Finger durch, um eine Blutprobe zu erhalten und muß dann gleichzeitig das Blut von dem Finger auf ein Reagenskissen auftragen, während er mit seiner anderen Hand einen Zeitlauf einstellt, was die gleichzeitige Verwendung beider Hände erfordert. Dies ist besonders schwierig, da es oft notwendig ist, sicherzustellen, daß der Zeitablauf nur gestartet wird, wenn Blut auf das Reagenskissen aufgetragen wird. Sämtliche Verfahren des Standes der Technik erfordern zusätzliche Manipulationen oder zusätzliche Schaltungen, um dieses Ergebnis zu erreichen. Demgemäß ist eine Vereinfachung dieses Aspektes von Reflexionsanzeige- Vorrichtungen erwünscht.
Das Vorliegen von roten Blutkörperchen oder anderen farbigen Komponenten stört oft die Bestimmung dieser absoluten Werte, weshalb rote Blutkörperchen in diesen beiden Verfahren des Standes der Technik ausgeschlossen werden müssen, da sie am meisten verbreitet angewendet werden. In der Vorrichtung des Patents Nr. 3,298,789 verhindert eine Ethylcellulosemembran, daß rote Blutkörperchen in das Reagenskissen eindringen. In ähnlicher Weise hindert der wasserbeständige Film des Patents 3,630,957 rote Blutkörperchen am Eindringen. In beiden Fällen bewirkt das Spülen oder das Abwischen auch das Entfernen dieser potentiell störenden roten Blutkörperchen vor der Bestimmung.
Demgemäß bleibt ein Bedarf für ein System zum Nachweis von Analyten in farbigen Flüssigkeiten, wie Blut, das keine Entfernung überschüssiger Flüsgkeit von einem Reflexionsstreifen, von dem die Reflexionanzeige erhalten wird, erfordert.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Glukose im Blut, wie in Anspruch 1 definiert.
Die Bestimmung von Glukose in Vollblut wird ohne Störung durch das Blut und ohne ein kompliziertes Protokoll durchgeführt, bei dem Anwendungsfehler auftreten.
Die vorliegende Erfindung ist durch die folgende ausführliche Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen leichter verständlich, worin:
Fig. 1 eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform einer Test vorrichtung ist, die das Reaktionskissen enthält, auf das die zu analysierende Flüssigkeit aufgebracht wird.
Fig. 2 ein schematisches Blockdiagramm einer Vorrichtung ist, die bei der praktischen Anwendung der Erfindung verwendet werden kann.
Fig. 3 ein schematisches Blockdiagramm einer alternativen Vorrichtung ist, die bei der praktischen Anwendung der Erfindung verwendet werden kann.

Genaue Beschreibung

Das Reagenselement

Die vorliegende Erfindung stellt eine verbesserte, rasche und einfache Methodenlehre bereit, die eine zuverlässige und leicht zu bedienende Vorrichtung zur Bestimmung von Glukose anwendet, und die insbesondere ein Enzymsubstrat umfaßt, das in der Erzeugung von Wasserstoffperoxid als einem Enzymprodukt resultiert. Das Verfahren umfaßt das Auftragen eines kleinen Volumens von Vollblut auf eine poröse Matrix, das ausreicht, die Matrix zu sättigen. An die Matrix sind ein oder mehrere Reagenzien eines signalerzeugenden Systems gebunden, was die Erzeugung eines Produkts zur Folge hat, das wiederum eine Ausgangsänderung des Reflexionswerts der Matrix zur Folge hat. Die Matrix liegt normalerweise in einer Vorrichtung zur Bestimmung der Reflexion vor. Die flüssige Probe durchdringt die Matrix, was an der Meßfläche zu einer Anfangsänderung der Reflexion führt. Dann wird ein oder mehrere Male nach der Anfangsänderung die Reflexion abgelesen, um die weitere Veränderung der Reflexion an der Meßfläche oder in der Matrix, die ja auf der Bildung des Reaktionsprodukts beruht, mit der Menge des Analyten in der Probe in Beziehung zu setzen.
Für Glukosebestimmungen wird als Probemedium (Assay Medium) Vollblut verwendet. Die Matrix enthält ein Oxidaseenzym, das Wasserstoffperoxid erzeugt. In der Matrix ist auch eine Peroxidase, und ein Farbstoffsystem enthalten, das in Verbindung mit der Peroxidase ein lichtabsorbierendes Produkt erzeugt. Das lichtabsorbierende Produkt ändert das Reflexions-signal. Bei Vollblut wird bei zwei verschiedenen Wellenlängen abgelesen, wobei der Ablesewert bei einer Wellenlänge dazu verwendet wird, die Hintergrundinterferenz bzw. -störung zu subtrahieren, die durch Hämatokrit, Oxidation des Blutes und andere Variablen, die das Ergebnis nachteilig beeinflußen können, verursacht werden.
Es wird ein Reagenselement angewendet, das die Matrix und die Elemente des signalerzeugenden Systems, die in der Matrix enthalten sind, umfaßt. Das Reagenselement kann andere Komponenten für besondere Anwendungen umfassen. Das Verfahren erfordert, daß man ein geringes Volumen Blut, das normaler weise keiner vorherigen Behandlung (außer ggfs. mit einem Antikoagulans) unterzogen wurde, auf die Matrix aufträgt. Die Zeitmessung der Bestimmung wird durch die Vorrichtung aktiviert, die automatisch eine Veränderung der Reflexion der Matrix feststellt, wenn Flüssigkeit durch die Matrix dringt. Die Änderung in der Reflexion über eine vorbestimmte Zeit-spanne als Ergebnis der Bildung von Reaktionsprodukt wird dann mit dem Gehalt an Analyt in einer Probe verknüpft.
Die erste zu berücksichtigende Komponente der vorliegenden Erfindung ist ein Reagenselement, zweckmäßigerweise in Form eines Kissens, das eine inerte poröse Matrix und die Komponente oder die Komponenten eines signalerzeugenden Systems umfaßt, wobei das System in der Lage ist, mit einem Analyten zu reagieren, und dabei lichtabsorbierendes Reaktionsprodukt zu bilden, mit dem die Poren der porösen Matrix getränkt werden. Das signal erzeugende System behindert den Flüssigkeitsstrom durch die Matrix nicht signifikant.
Um das Ablesen der Reflexion zu erleichtern, ist es bevorzugt, daß die Matrix mindestens eine Fläche aufweist, die im wesentlichen glatt und eben ist. Normalerweise ist die Matrix zu einem dünnen Blatt mit mindestens einer glatten, ebenen Fläche geformt. Beim Gebrauch wird die zu analysierende flüssige Probe auf eine Seite des Blattes aufgetragen, wodurch jede vorliegende Probenverbindung mittels Kapillar-, Saug- und Schwerkraftströmung und/oder Diffusionswirkungen durch das Reagenselement fließt. Die Komponenten des in der Matrix vorliegenden signalerzeugenden Systems reagieren miteinander, wobei ein lichtabsorbierendes Reaktionsprodukt entsteht. Einfallendes Licht trifft auf einer anderen Stelle auf das Reagenselement als an derjenigen, an der die Probe aufgetragen ist. Licht wird von dem Element als diffus reflektiertes Licht reflektiert. Dieses diffuse Licht wird gesammelt und gemessen, beispielsweise mit einem Detektor oder einem Reflexionsspektrophotometer. Die reflektierte Lichtmenge wird mit dem Analytengehalt in der Probe in Beziehung gesetzt, was normalerweise eine inverse Funktion des Analytengehalts in der Probe ist.

Die Matrix

Es wird wiederum jede der Komponenten, die zur Herstellung des Reagenselementes notwendig sind, beschrieben. Die erste Komponente ist die Matrix selbst.
Die Matrix ist eine hydrophile, poröse Matrix, an die Reagenzien kovalent oder nichtkovalent gebunden sein können. Die Matrix ermöglicht das Fließen eines wäßrigen Mediums durch die Matrix. Sie ermöglicht auch die Bindung von Proteinzusammensetzungen an die Matrix ohne die biologische Aktivität des Proteins, z.B. die enzymatische Aktivität eines Enzyms, signifikant nachteilig zu beeinflußen. In dem Ausmaß, in dem Proteine kovalent gebunden werden sollen, weist die Matrix aktive Stellen für kovalente Bindungen auf oder sie kann auf an sich bekannte Weise aktiviert werden. Die Zusammensetzung der Matrix ist reflektierend und weist eine ausreichende Dicke auf, um die Bildung eines lichtabsorbierenden Farbstoffes in dem Hohlraumvolumen oder auf der Fläche zu erlauben, um die Reflexion von der Matrix wesentlich zu beeinflußen. Die Matrix kann aus einer einheitlichen Zusammensetzung oder aus einer Beschichtung auf einem Substrat sein, die die notwendige Struktur und die physikalischen Eigenschaften bereitstellt.
Die Matrix verformt sich üblicherweise nicht, wenn sie naß wird, und behält somit ihre ursprüngliche Konformation und Größe. Die Matrix weist ein bestimmtes Absorptionsvermögen auf, so daß das Volumen, das absorbiert wird, innerhalb angemessener Grenzen kalibriert werden kann, wobei die Abweichungen üblicherweise bei unterhalb von etwa 50 %, vorzugsweise bei nicht mehr als 10 %, gehalten werden. Die Matrix weist eine ausreichende Naßfestigkeit auf, um eine routinemäßige Herstellung zu ermöglichen. Die Matrix ermöglicht es, daß nichtkovalent gebundene Reagenzien relativ gleichmäßig auf der Oberfläche der Matrix verteilt werden.
Die Matrixoberflächen werden aus Polyamid hergestellt. Die Polyamide sind zweckmäßigerweise Kondensationspolymere von Monomeren von 4 bis 8 Kohlenstoffatomen, wobei die Monomeren Lactame oder Kombinationen von Diaminen und Dicarbonsäuren sind. Die Polyamidzusammensetzungen können modifiziert werden, um andere funktionelle Gruppen einzuführen, die geladene Strukturen bereitstellen, so daß die Oberflächen der Matrix neutral, positiv oder negativ, sowie neutral, basisch oder sauer sein können. Bevorzugte Oberflächen sind positiv geladen.
Die poröse Matrix weist vorzugsweise Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von etwa 0,1 bis 2,0 um, vorzugsweise etwa 0,2 bis 1,0 und noch mehr bevorzugt von etwa 0,6 bis 1,0 um auf.
Eine bevorzugte Herstellungsweise des porösen Materials besteht darin, das hydrophile Polymer auf einen Kern aus nichtgewebten Fasern zu gießen. Die Kernfasern können jedes faserartige Material sein, das die beschriebene Integrität und Festigkeit erzeugt, wie Polyester und Polyamide. Das Reagens, das das lichtabsorbierende Reaktionsprodukt bildet, das im folgenden im einzelnen erläutert wird, liegt in den Poren der Matrix vor, blockiert die Matrix jedoch nicht, so daß der flüssige Anteil des zu analysierenden Blutes, durch die Poren der Matrix fließen kann, während Erythrocyten, an der Oberfläche gehalten werden.
Die Matrix ist im wesentlichen reflektierend, so daß sie auch ohne die Verwendung einer reflektierenden Rückwand eine diffuse Reflexion erzeugt. Vorzugsweise werden mindestens 25 %, bevorzugter mindestens 50 % des einfallenden Lichtes, das auf die Matrix auftrifft, reflektiert und als diffuse Reflexion emittiert. Es wird üblicherweise eine Matrix von weniger als etwa 0,5 mm Dicke verwendet, wobei eine Dicke von etwa 0,01 bis 0,3 mm bevorzugt ist. Eine Dicke von 0,1 bis 0,2 mm ist am meisten bevorzugt, insbesondere bei einer Nylonmatrix.
Normalerweise ist die Matrix auf einen Träger aufgebracht, um ihr eine körperliche Form und Steifigkeit zu verleihen, obwohl dies nicht notwendig sein muß. Fig. 1 zeigt eine Ausführungsform eines Reagenselementes zur Verwendung bei dem Verfahren gemäß der Erfindung, bei der ein dünnes Kissen 11 aus einer reagenshaltigen hydrophilen Matrix mittels eines Klebstoffs 13 an ein Ende eines Kunststoffträgers 12 positioniert wird, der das Kissen unmittelbar und fest mit einem Griff des Trägers verbindet. Eine Öffnung 14 liegt in dem Träger 12 in dem Bereich vor, mit dem das Kissen 11 verbunden ist, so daß eine Probe an eine Fläche des Kissens aufgetragen werden kann und das Licht von der anderen Fläche reflektiert wird.
Eine flüssige zu testende Probe wird auf das Kissen 11 aufgetragen. Im allgemeinen weist das Kissen eine Oberfläche in der Größenordnung von etwa 10 mm² bis 100 mm², insbesondere eine Fläche von 10 mm² bis 50 mm², das normalerweise von einem Probenvolumen von 5 bis 10 Mikroliter mehr als ausreichend gesättigt wird.
Bestimmungen der diffusen Reflexion im Stand der Technik - vgl. EP-A- 0110173 - sind normalerweise unter Verwendung einer reflektierenden Verstärkung durchgeführt worden, die mit der Matrix verbunden oder hinter dieser angebracht war. Eine solche Verstärkung ist während der Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht nötig und liegt auch nicht vor, weder als Teil des Reagenselementes noch der Reflexionsvorrichtung. Die Reflexion wird in der vorliegenden Erfindung von einer anderen Oberfläche als derjenigen bestimmt, auf die die Probe aufgetragen wird.
Wie aus der Fig. 1 ersichtlich ist, hält der Träger das Kissen 11, so daß eine Probe auf eine Seite des Reagenskissens aufgetragen werden kann, während die Lichtreflexion von der Fläche des Kissens gemessen wird, das gegenüber der Stelle liegt, auf die die Probe aufgetragen ist.
Fig. 2 zeigt ein System, in dem das Reagens auf die Seite mit der Öffnung in dem Trägergriff aufgetragen ist, während das Licht reflektiert und auf der anderen Seite des Kissens gemessen wird. Es können auch andere Strukturen als die dargestellte verwendet werden. Das Kissen kann verschiedene Gestalten und Formen annehmen, und zwar je nach den hierbei angeführten Einschränkungen. Das Kissen ist an mindestens einer Fläche und üblicherweise an zwei Flächen zugänglich.
Die Matrix des Reagenselementes kann mit dem Träger durch jedes geeignete Mittel verbunden sein, z.B. durch einen Halter, eine Klemme oder Klebstoffe, in dem bevorzugten Verfahren ist sie jedoch an den Träger gebunden. Die Bindung kann mit jedem nichtreaktiven Klebstoff erfolgen, durch ein thermales Verfahren, in dem die Trägeroberfläche genügend geschmolzen wird, um etwas von dem für die Matrix verwendeten Material einzuschließen, oder sie kann durch Mikrowellen- oder Ultraschall-Bindeverfahren erfolgen, die die Matrix ebenso mit dem Träger verschmelzen. Es ist wichtig, daß die Verbindung derart ist, daß sie nicht selbst die Bestimmungen der diffusen Reflexion oder die zu bestimmende Reaktion wesentlich stört, obwohl es unwahrscheinlich ist, daß dies eintritt, da an der Stelle, an der die Ablesung vorgenommen wird, kein Klebestoff vorzuliegen braucht. Beispielsweise kann ein Klebstoff 13 auf den Träger 12 angebracht werden, worauf zunächst die Öffnung 14 in kombinierten Streifen und Klebstoff gestanzt und dann das Kissen 11 auf den Klebstoff in der Nähe der Öffnung 14 angebracht wird, so daß der periphäre Teil des Reagenskissens mit dem Träger verbunden ist.

Die chemischen Reagenzien

Es wird ein spezifisches signalerzeugendes System angewendet, das in der Lage ist, mit dem Analyten (Glukose) in der Probe zu reagieren, um (entweder direkt oder indirekt) eine Verbindung zu erzeugen, die eine charakteristische Absorption bei einer Wellenlänge aufweist, die verschieden ist von einer Wellenlänge, bei der das Probemedium im wesentlichen absorbiert.
Polyamid-Matrizen werden beim Ausführen von Reaktionen verwendet, in denen Glukose mit einem sauerstoffaufbrauchenden Oxidaseenzym auf solche Weise reagiert, daß ein Produkt erzeugt wird, das weiter mit einem Farbstoffzwischenprodukt reagiert, um entweder direkt oder indirekt einen Farbstoff zu bilden, der in einem vorbestimmten Wellenlängenbereich absorbiert. Das Glukose-Oxidaseenzym oxidiert Glukose und erzeugt Wasserstoffperoxid als ein Reaktionsprodukt. Das Wasserstoffperoxid kann dann direkt mit einem Farbstoffzwischenprodukt oder einem Vorläufer in einer katalysierten oder unkatalysierten Reaktion reagieren, um eine oxidierte Form des Zwischenproduktes oder des Vorläufers zu erzeugen. Dieses oxidierte Material kann das gefärbte Produkt erzeugen oder mit einem zweiten Vorläufer reagieren, um den endgültigen Farbstoff zu bilden. Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung besteht der verwendete Farbstoffvorläufer aus 3-Methyl-2- benzothiazolinon-hydrazon-hydrachlorid und 3-Dimethylamino-benzoesäure (MBTH - DMAB) (Anal. Biochem., 79, 597-601, 1977).

Das Analyseverfahren

Das Analyseverfahren dieser Erfindung beruht auf einer Änderung der Absorption, die durch diffuse Reflexion gemessen wird, und die vom Glukosegehalt abhängt, der in einer zu prüfenden Vollblutprobe vorliegt. Diese Änderung kann durch Messen der Änderung der Absorption der Testprobe zwischen zwei oder mehreren Zeitpunkten bestimmt werden.
Der erste Schritt, der beim Test zu berücksichtigen ist, ist das Auftragen der Probe auf die Matrix. In der Praxis kann eine Analyse wie folgt durchgeführt werden: zunächst wird eine Probe Vollblut gewonnen. Blut kann beispielsweise durch einen Einstich in den Finger gewonnen werden. Ein Überschuß dieser Flüssigkeit nach Sättigung der Matrix in dem Bereich, in dem das Reflexionsvermögen gemessen wird (d.h. etwa 5 bis 10 Mikroliter) wird auf das Reagenselement oder die Elemente der Testvorrichtung aufgebracht. Das gleichzeitige Inbetriebnehmen eines Timers ist nicht erforderlich (was beim Stand der Technik üblicherweise erforderlich ist), wie im folgenden ersichtlich wird. Überschüssige Flüssigkeit kann durch leichtes Abtupfen entfernt werden, dies ist jedoch ebenfalls nicht notwendig. Die Testvorrichtung ist normalerweise in einem Instrument angebracht, das die Lichtabsorption bestimmt, z.B. die Farbintensität durch Reflexion, bevor die Probe aufgetragen wird. Die Absorption wird zu bestimmten Zeitpunkten, nachdem die Probe aufgetragen wurde, bestimmt. In dieser Anmeldung bezieht sich der Ausdruck Absorption nicht nur auf Licht innerhalb des sichtbaren Wellenlängenbereiches, sondern auch auf Licht außerhalb des sichtbaren Wellenlängenbereiches, wie Infrarot- und Ultraviolett-Strahlung. Von diesen Bestimmungen der Absorption kann eine Geschwindigkeit der Farbentwicklung als Funktion des Glukosespiegels kalibriert bzw. geeicht werden.

Das Meßinstrument

Ein geeignetes Instrument, wie ein Reflexionsspektrophotometer mit geeigneter Software, kann so hergestellt werden, daß es die Reflexion automatisch zu bestimmten Zeitpunkten bestimmt, die Geschwindigkeit der Reflexionsänderung berechnet und unter Verwendung von Eichfaktoren den Glukosespiegel in Vollblut angibt. Eine solche Vorrichtung ist schematisch in Fig. 2 dargestellt, wobei eine Testvorrichtung zur Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung, das einen Träger 12 umfaßt, an dem ein Kissen 11 befestigt ist, gezeigt wird. Eine Lichtquelle 5, z.B. eine Licht mit hoher Intensität emittierende Diode (LED) projiziert einen Lichtstrahl auf das Kissen. Ein wesentlicher Teil (mindestens 25 %, vorzugsweise mindestens 35 % und bevorzugter mindestens 50 %, in Abwesenheit des Reaktionsproduktes) dieses Lichts wird von dem Kissen diffus reflektiert und wird mit dem Lichtdetektor 6 nachgewiesen, beispielsweise einem Phototransistor, der einen Ausgangsstrom erzeugt, der proportional zu dem Licht ist, das er erhält. Die Lichtquelle 5 und/oder der Detektor 6 können, falls gewünscht, so adaptiert werden, daß sie Licht einer bestimmten Wellenlänge erzeugen oder darauf reagieren. Die Ausgangsleistung des Detektors 6 wird zu einem Verstärker 7 geleitet,beispielsweise einem linearen integrierten Schaltkreis, der den Phototransistorstrom in eine Spannung umwandelt. Die Ausgangsleistung des Verstärkers 7 kann zum Nachsteuern und Halten der Schaltung 8 verwendet werden. Dies ist ein kombinierter linear/digital integrierter Schaltkreis, der die Analogspannung des Verstärkers 7 nachsteuert oder verfolgt und auf einen Befehl des Mikroprozessors 20 die Spannung auf der Höhe, die sie zu jenem Zeitpunkt hatte, festhält oder hält. Der Analog--zu-Digital-Konverter 19 entnimmt die Analogspannung aus dem Nachführ- und Halteschaltkreis 8 und wandelt sie beispielsweise auf einen Befehl des Mikroprozessors 20 in binäre 12-bit Digitalziffern um. Der Mikroprozessor 20 kann eine integrierte Digitalschaltung sein. Er dient den folgenden Kontrollfunktionen:
1) Zeitmessung für das gesamte System; 2) Ablesen der Ausgangsleistung des Analog/Digital-Konverters 19; 3) Datenspeicherung entsprechend der in bestimmten Zeitintervallen gemessenen Reflexion zusammen mit einem Programm- und Datenspeicher 21; 4) Berechnen des Glukosespiegels aus den gespeicherten Reflexionen; und 5) Ausgabe der Werte der Glukosekonzentration an die Anzeige 22. Der Speicher 21 kann eine integrierte Digitalschaltung sein, die Daten und das Mikroprozessor-Betriebsprogramm speichert. Die Meldevorrichtung 22 kann in verschiedenen Hardcopy- und Softcopy-Formen vorliegen. Üblicherweise ist sie eine visuelle Anzeige, wie eine Flüssigkristall- oder LED-Anzeige, sie kann aber auch ein Streifendrucker, ein akustisches Signal oder dergleichen sein. Das Instrument kann auch einen Start-Stop-Schalter enthalten und kann eine akustische oder sichtbare Zeitangabe bereitstellen, um, falls gewünscht, auf den Zeitpunkt für das Auftragen der Proben, das Ablesen der Werte, usw. hinzuweisen.

Reflexionsschaltung

In der vorliegenden Erfindung kann der Reflexionsschaltkreis selbst zum Einleiten der Zeitmessung benutzt werden, indem man ein Abfallen der Reflexion mißt, die eintritt, wenn der wäßrige Teil des auf das Kissen aufgetragenen Vollbluts zu der Oberfläche wandert, an der die Reflexion gemessen wird. Normalerweise wird die Meßvorrichtung in einem "Bereit"-Modus eingeschaltet, in dem die Reflexion automatisch in kurzen Intervallen (normalerweise etwa 0,2 Sekunden) von dem normalerweise gebrochen weißen, im wesentlichen trockenen, nichtumgesetzten Reagenselement bestimmt wird. Die Anfangsmeßung wird normalerweise durchgeführt, bevor die Matrix von dem zu analysierenden Vollblut durchdrungen ist, sie kann jedoch auch durchgeführt werden, nachdem das Vollblut auf eine Stelle auf dem Reagenselement aufgebracht worden ist, die verschieden ist von derjenigen, an der die Reflexion gemessen wird. Der Reflexionswert wird von dem Mikroprozessor ausgewertet, normalerweise durch das Speichern von aufeinanderfolgenden Werten im Speicher und anschließendes Vergleichen eines jeden Wertes mit dem nichtumgesetzten Anfangswert. Wenn der wäßrige Teil des Vollbluts die Reagensmatrix durchdringt, signalisiert das Abfallen der Reflexion den Beginn der Zeitintervallmessung. Ein Abfallen der Reflexion von 5 bis 50 %, normalerweise ein Abfallen von etwa 10 %, kann dazu verwendet werden, die Zeitmeßung einzuleiten. Auf diese einfache Weise liegt eine exakte Synchronisation des Probenmediums, das die Oberfläche erreicht, von der aus die Messungen vorgenommen werden, und der Einleitung der Bestimmungsreihe vor, ohne daß ein Tätigwerden des Anwenders erforderlich ist.

Glukosetest

Im folgenden wird ein Beispiel hinsichtlich des Nachweises von Glukose in Gegenwart von roten Blutkörperchen beschrieben, um nähere Einzelheiten und besondere Vorteile darzulegen.
Die Verwendung von Polyamidoberflächen zur Bildung des Reagenselementes bietet in der vorliegenden Erfindung eine Reihe von erwünschten Eigenschaften, nämlich, daß das Reagenselement hydrophil ist (d.h., daß es das Reagens und die Probe ohne weiteres aufnimmt), daß es sich nicht verformt, wenn es naß wird (um so eine flache Oberfläche für das Bestimmen der Reflexion bereitzustellen), daß es mit Enzymen kompatibel ist (um eine gute Lagerbeständigkeit zu verleihen), daß es ein begrenztes Probenvolumen pro Volumeneinheit der Membran aufnimmt (das ist notwendig, um einen erweiterten dynamischen Meßbereich zu demonstrieren) und daß es eine ausreichende Naßfestigkeit aufweist, um eine routinemäßige Herstellung zu ermöglichen.
In einer typischen Anordnung wird das Verfahren unter Verwendung einer Vorrichtung durchgeführt, die aus einem Kunststoffhalter und dem Reagenselement (die Matrix, die das damit durchtränkte signalerzeugende System aufweist) besteht. Die bevorzugt verwendete Matrix zur Herstellung des Reagenselementes ist eine Mikrofiltrationsmembran aus Nylon, insbesondere Membranen, die aus auf einen Kern aus nichtgewebten Polyesterfasern formgegossenen Nylon-66 hergestellt sind. Zahlreiche Nylon-Mikrofiltrationsmembranen dieser Klasse werden kommerziell von der Pall Ultrafine Filtration Corporation hergestellt und weisen eine durchschnittliche Porengröße von 0,1 bis 0,3 Mikron auf. Diese Materialien zeigen mechanische Festigkeit und Flexibilität, Formbeständigkeit, wenn sie Wasser ausgesetzt werden, und rasches Benetzen. Es sind viele Variationen in der speziellen chemischen Struktur des Nylons möglich. Diese umfassen nichtfunktionalisiertes Nylon-66 mit geladenen Endgruppen (unter dem Warenzeichen Ultipore von Pall Ultrafine Filtration Corporation vertrieben; "Pall"). Unterhalb pH 6 herrschen positive Ladungen vor, während oberhalb pH 6 negative Ladungen vorherrschen. In anderen Membranen wird das Nylon vor dem Formen der Membran funktionalisiert, um Membranen mit unterschiedlichen Eigenschaften zu erhalten. Mit Carboxy-Gruppen funktionalisierte Nylons sind über einen breiten pH-Bereich negativ geladen (von Pall als Carboxydyne vertrieben). Nylon bzw. Polyamide können auch mit positiv geladenen Gruppen einer hohen Dichte auf ihrer Oberfläche funktionalisiert werden, normalerweise mit quaternären Amin- Gruppen, so daß sie über einen breiten pH-Bereich nur geringe Ladungsänderungen aufzeigen (als Posidyne von Pall vertrieben). Solche Materialien sind für die Durchführung der vorliegenden Erfindung besonders gut geeignet. Es ist auch möglich, Membranen zu verwenden, die reaktive funktionelle Gruppen aufweisen, die für eine kovalente Immobilisierung von Proteinen bestimmt sind (als Biodyne Immuno Affinity-Membranen von Pall vertrieben). Solche Materialien können verwendet werden, um Proteine, z.B. Enzyme, die als Reagenzien verwendet werden, kovalent zu binden. Obwohl sämtliche dieser Materialien verwendbar sind, stellt Nylon, das auf seiner Oberfläche positiv geladene Gruppen einer hohen Dichte aufweist, die beste Stabilität der Reagenzien bereit, wenn es zu einem trockenen Reagenskissen formuliert ist. Nichtfunktionalisiertes Nylon ergibt die nächstbeste Stabilität, wobei carboxyliertes Nylon die danach nächstbeste ergibt.
Die gewünschten Ergebnisse werden mit Porengrößen im Bereich von etwa 0,2 bis 2,0 um, vorzugsweise etwa 0,5 bis 1,2 um und am meisten bevorzugt etwa 0,8 um erhalten.
Die Form des Trägers, auf dem das Reagenselement angeordnet ist, ist relativ unwichtig, solange sie den Zugang zu einer Seite des Reagenselementes für die Probe und zu der anderen Seite des Reagenselementes für auffallendes Licht, dessen Reflexion gemessen wird, ermöglicht. Der Griff des Trägers hilft ebenfalls dabei, das Reagenselement derart in die Absorptionsmeßvorrichtung einzuführen, daß es in das optische System eingreift. Ein Beispiel für einen geeigneten Griff ist ein Mylar oder ein anderer Kunststoffstreifen, auf den ein Transferklebstoff, wie 3M 465 oder Y9460 Transferklebstoff, aufgetragen wurde. In den Kunststoff wird durch den Transferklebstoff hindurch eine Öffnung gestanzt. Ein Reagenselement, normalerweise in Form eines dünnen Kissens, das entweder Reagenzien enthält oder dem später Reagenzien zugefügt werden, wird dann mittels des Transferklebstoffs auf den Griff aufgetragen, so daß es mit dem Griff in dem Bereich, der die Öffnung umgibt, die durch den Griff und den Transferklebstoff gestanzt wurde, fest verbunden ist. Eine solche Vorrichtung ist in Fig. 1 veranschaulicht, die ein Kissen 11 zeigt, das an einen Mylar -Griff 12 mittels eines Klebstoffs 13 verbunden ist. Die Öffnung 14 macht eine Seitenfläche 15 des Kissens 11 für die Probe oder das auffallende Licht zugänglich, während die andere Seite 16 des Kissens uneingeschränkt zugänglich ist. Sämtliche Dimensionen des Kissens und des Griffs können so ausgewählt werden, daß das Kissen sicher in eine Reflexionsbestimmungsvorrichtung nahe einer Lichtquelle und eines Detektors für reflektiertes Licht paßt.
Wenn eine Nylonmatrix das Kissen bildet, und wenn die angegebenen Dicken verwendet werden, ist es bevorzugt, das Kissen durch den Träger auf solche Weise abzustützen, daß gemessen in jeder Richtung, nicht mehr als 6 mm von der Stelle, an der die Probe aufgetragen und die Lichtreflexion gemessen wird, nicht abgestützt bzw. unterstützt sind. Größere nicht abgestützte Bereiche tragen zu einer ungenügenden Formstabilität der Membran bei, so daß die Messung der Reflexion ungünstig beeinflußt wird. Eine Öffnung 14 mit einem Durchmesser von 5 mm in dem in Fig. 1 dargestellten Kissen funktioniert recht zufriedenstellend.
Für den Mindestdurchmesser einer solchen Öffnung gibt es keine besondere Grenze, obwohl Durchmesser von mindestens 2 mm wegen der Einfachheit der Herstellung, dem Auftrag der Probe und der Bestimmung der Lichtreflexion bevorzugt sind.
Es ist notwendig, einen Farbstoff auszuwählen, der eine Absorption bei einer Wellenlänge aufweist, die von der Wellenlänge, bei der rote Blutkörperchen Licht absorbieren, verschieden ist, wenn Vollblut das Probemedium ist. Das Farbstoffpaar MBTH-DMAB (3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon- hydrochlorid und 3-Dimethylaminobenzoesäure) wurde, obwohl es in letzter Zeit als für die Farbentwicklung für Peroxidase-marker in Enzym-Immunoassays geeignet beschrieben wurde, noch nie in einem handelsüblichen Bestimmungsreagens für Glukose verwendet. Dieses Farbstoffpaar verleiht einen größeren dynamischen Bereich und zeigt eine verbesserte enzymatische Stabilität im Vergleich zu traditionellen Farbstoffen, die zur Glukosebestimmung verwendet werden, wie Benzidinderivate. Darüber hinaus ist das Farbstoffpaar MBTH-DMAB nicht karzinogen, ein Merkmal der meisten Benzidinderivate.
Die Verwendung des Paares MBTH-DMAB ermöglicht die wegen der Bildung von Hämatocrit und des Oxidationsgrades des Bluts nötige Korrektur mit einem einzigen Korrekturfaktor. Die üblicherweise mehr verwendeten Benzidin-Farbstoffe erlauben eine solche Korrektur nicht. Der Farbstoff bildet ein Chromophor, das bei annähernd 635 nm absorbiert, jedoch nicht in signifikantem Ausmaß bei 700 nm. Leichte Abweichungen beim Bestimmen der Wellenlängen (± etwa 10 nm) sind erlaubt. Bei 700 nm können sowohl Hämatocrit als auch der Grad der Oxidation durch Messen der Farbe des Blutes bestimmt werden. Darüber hinaus sind im Handel sowohl für Bestimmungen bei 635 nm als auch bei 700 nm lichtemittierende Dioden (LED) erhältlich, wodurch die Massenproduktion einer Vorrichtung vereinfacht wird. Durch Verwenden der zuvor beschriebenen bevorzugten Porengröße der Membran und der erfindungsgemäßen Reagensformulierung kann sowohl das Hämatocrit als auch das Oxidationsverhalten korrigiert werden, indem man nur bei 700 nm wellenlänge mißt.
Es wurden noch zwei zusätzliche Bedingungen gefunden, um eine besondere Stabilität und eine lange Lagerbeständigkeit für eine Glukoseoxidase/Peroxidase-Formulierung auf einer Polyamidmatrix bereitzustellen. Dabei wird ein pH im Bereich von 3,8 bis 5,0, vorzugsweise etwa 3,8 bis 4,3, am meisten bevorzugt etwa 4,0, und ein konzentriertes Puffersystem verwendet, um die Reagenzien auf die Matrix aufzutragen. Es wurde gefunden, daß der wirksamste Puffer ein 10 Gew.-% Citratpuffer mit wirksamen Konzentrationen von 5 bis 15 % ist. Das sind Gewicht/Volumen-Prozentangaben der Lösung, in der die Reagenzien auf das Kissen aufgebracht werden. Andere Puffer können auf derselben molaren Basis verwendet werden. Die größte Stabilität wurde erreicht, wenn ein niedriger pH, vorzugsweise etwa pH 4, ein MBTH-DMAB-Farbstoffsystem und eine hohe Enzym-konzentration von annähernd 500 bis 1000 U/ml der aufgetragenen Lösung verwendet wurde.
Bei der Herstellung des MBTH-DMAB-Reagens und des Enzymsystems, das den Rest des signalerzeugenden Systems bildet, ist es nicht notwendig, exakte Volumen und Verhältnisse aufrechtzuerhalten, obwohl die im folgenden vorgeschlagenen Werte gute Ergebnisse ergeben. Die Reagenzien werden von dem Kissen ohne weiteres absorbiert, wenn Glukoseoxidase in einer Lösung von etwa 27 - 54 Vol.-%, die Peroxidase in einer Konzentration von etwa 2,7 - 5,4 mg/ml, MBTH in einer Konzentration von etwa 4 - 8 mg/ml und DMAB in einer Konzentration von etwa 8 - 16 mg/ml vorliegt. Das Gewichtsverhältnis von DMAB-MBTH wird vorzugsweise im Bereich von (1-4) :1, vorzugsweise von etwa (1,5 - 2,5):1 und am meisten bevorzugt von etwa 2:1 aufrechterhalten.
Die Grundlagentechniken für die Herstellung des Reagenselementes sind, wenn sie einmal festgestellt sind, einfach. Eine Membran ist stark und stabil, insbesondere, wenn eine Nylonmembran der bevorzugten Ausführungsform ausgewählt wird. Es sind lediglich zwei Lösungen notwendig, um das Reagens aufzutragen, und diese Lösungen sind beide bereits formuliert und stabil. Die erste enthält im allgemeinen die Farbstoffkomponenten und die zweite enthält im allgemeinen die Enzyme. Wenn das MBTH-DMAB-Farbstoffpaar verwendet wird, werden die einzelnen Farbstoffe beispielsweise in einem wäßrigen organischen Solvens, normalerweise einem 1:1-Gemisch aus Acetonitril und Wasser, gelöst. Die Matrix wird in die Lösung getaucht, die überschüssige Flüssigkeit durch Abtupfen entfernt und die Matrix wird dann getrocknet, normalerweise bei 50 - 60 ºC 10 - 20 Minuten lang. Die Matrix, die die Farbstoffe enthält, wird dann in eine wäßrige Lösung getaucht, die die Enzyme enthält. Eine typische Formulierung enthält die Peroxidase und die Glukoseoxidaseenzyme sowie einen gewünschten Puffer, Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel oder dergleichen. Die Matrix wird dann abgetupft, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und wie zuvor getrocknet. Eine typische Formulierung für das Glukosereagens ist wie folgt:

Farbstofflösung zum Eintauchen

Man vereinigt:
40 mg MBTH,
80 mg DMAB,
5 ml Acetonitril und
5 ml Wasser.
Man rührt, bis sämtliche Feststoffe aufgelöst sind und gießt auf eine Glasplatte oder eine andere flache Oberfläche. Man taucht ein Stück der Posidyne-Membran (Pall Co.) ein, tupft die überschüssige Flüssigkeit ab und trocknet bei 56 ºC 15 Minuten lang.

Enzymlösung zum Eintauchen

Man vereinigt:
6 ml Wasser,
10 mg EDTA-Dinatriumsalz,
200 mg Poly Pep (ein Enzymreaktor) niedriger Viskosität Poly Pep ist ein Warenzeichen von Sigma),
0,668 g Natriumcitrat,
0,523 g Zitronensäure,
2,0 ml 6 Gew.-%-iges Gantrez AN-139 (ein Enzymreaktor), gelöst in Wasser, (Gantrez ist ein Warenzeichen von GAF),
30 mg Meerrettichperoxidase, 100 Einheiten/mg, und
3,0 ml Glukoseoxidase, 2000 Einheiten/ml.
Man rührt, bis sämtliche Feststoffe aufgelöst sind und gießt auf eine Glasplatte oder eine andere flache Oberfläche. Man taucht ein Stück der zuvor mit den Farbstoffen imprägnierten Membran ein, löscht die überschüssige Flüssigkeit ab und trocknet bei 56 ºC 15 Minuten lang.
Die elektronische Vorrichtung, die verwendet wird, um die Reflexion zu bestimmen, enthält mindestens eine Lichtquelle, einen Detektor für reflektiertes Licht, einen Verstärker, einen Analog-Digital-Konverter, einen Mikroprozessor mit Speicher und Programm und eine Anzeigevorrichtung.
Die Lichtquelle besteht normalerweise aus einer lichtemittierenden Diode (LED). Obwohl es möglich ist, eine polychrome Lichtquelle und einen Lichtdetektor zu verwenden, der in der Lage ist, bei zwei verschiedenen Wellenlängen zu messen, enthält eine bevorzugte Vorrichtung zwei LED-Quellen oder eine einzige Diode, die in der Lage ist, Licht zweier verschiedener Wellenlängen zu emittieren. Im Handel erhältliche LEDs, die Licht mit Wellenlängen erzeugen, die zuvor als erfindungsgemäß bevorzugt beschrieben wurden, umfassen einen Hewlett-Packard HLMP-1340 mit einem Emissionsmaximum bei 635 nm und eine Hewlett-Packard QEMT-1045 mit einem Schmalband-Emissionsmaximum bei 700 nm. Geeignete im Handel erhältliche Lichtdetektoren umfassen einen Hamamatsu 5874-18K und einen Litronix BPX-65.
Obwohl andere Meßverfahren durchführbar sind, werden mit dem folgenden Verfahren die gewünschten Ergebnisse erhalten. Die Bestimmungen werden durch einen Photodetektor in bestimmten Intervallen vorgenommen, nachdem die Zeitmessung eingeleitet wurde. Die 635 nm LED wird nur während einer kurzen Meßzeitspanne gespeist, die annähernd 20 Sekunden nach der Startzeit, die durch die Reflexionsschaltung angezeigt wird, beginnt. Wenn diese Bestimmung anzeigt, daß in der Probe ein hoher Glukosespiegel vorliegt, wird eine 30- Sekunden-Bestimmung vorgenommen und für die endgültige Berechnung verwendet, um die Genauigkeit zu verbessern. Normalerweise werden Spiegel ab etwa 250 mg/dl als hohe Spiegel angesehen. Der Hintergrund wird mit einer 700 nm- Bestimmung korrigiert, die etwa 15 Sekunden nach Beginn der Meßperiode vorgenommen wird. Die Messung des Photodetektors wird über das Intervall integriert, während die geeignete LED aktiviert wird, was normalerweise weniger als 1 Sekunde dauert. Die ungefähren Reflexionsbestimmungen werden dann für Berechnungen verwendet, die von dem Mikroprozessor durchgeführt werden, nachdem das Signal verstärkt und in ein digitales Signal umgewandelt wurde. Es können zahlreiche Mikroprozessoren zum Durchführen dieser Berechnung verwendet werden. Ein von der Rockwell International hergestellter AIM65-SB-Mikrocomputer hat sich als zufriedenstellend erwiesen.
Die vorliegenden Verfahren ermöglichen eine sehr einfache Vorgehensweise mit minimalen Arbeitschritten seitens des Anwenders. Bei der Anwendung wird das Reagenselement in den Detektor gegeben, so daß die Öffnung genau in dem Element mit den optischen Vorrichtungen des Nachweissystems zu liegen kommt bzw. eingreift. Eine entfernbare Kappe oder eine andere Abdeckung ist über den optischen Vorrichtungen und den Streifen angebracht, um die Anordnung vor Umlicht bzw. der Raumhelligkeit zu schützen. Die Meßsequenz wird dann durch Drücken eines Knopfes auf der Meßvorrichtung eingeleitet, die den Mikrocomputer aktiviert, um reflektiertes Licht aus nicht-umgesetzten Reagenskissen zu messen, was als eine Rtrocken-Bestimmung bezeichnet wird. Die Kappe wird dann entfernt und ein Tropfen Vollblut auf das Reagenskissen aufgetragen, und zwar normalerweise während das Reagenskissen von den optischen Vorrichtungen und der Meßvorrichtung erfaßt wird. Es ist bevorzugt, daß der Reagensstreifen von den optischen Instrumenten erfaßt bleibt, um die Handhabung bzw. die Handgriffe zu minimieren. Das Instrument ist in der Lage, das Auftragen von Vollblut durch eine Abnahme der Reflexion wahrzunehmen, wenn die Probe die Matrix passiert und reflektiertes Licht auf der gegenüberliegenden Seite gemessen wird. Die Abnahme der Reflexion leitet eine zeitliche Abfolge ein, die an anderen Stellen dieser Beschreibung ausführlicher beschrieben wird. Die Abdeckung sollte innerhalb 15 Sekunden nach Aufbringen der Probe wieder angebracht werden, obwohl diese Zeit je nach der Art der zu bestimmenden Probe variieren kann. Die Ergebnisse werden normalerweise annähernd 30 Sekunden nach Aufbringen des Bluts angezeigt, wenn Glukose aus einer Vollblutprobe bestimmt wird, obwohl eine 20-Sekunden- Reaktion für Glukoseproben, die eine Glukosekonzentration von weniger als 250 mg/dl aufweisen, zulässig ist.
Eine besonders zuverlässige Schätzung des Glukosespiegels (oder jedes anderen zu bestimmenden Analyten) kann unter Verwendung des Hintergrundstroms durchgeführt werden, d.h., des Stroms bei eingeschaltetern Photodetektor, jedoch ohne von dem Reagenskissen reflektiertem Licht, um eine Hintergrundkorrektur durchzuführen. Es wurde über eine Zeitspanne von 2 bis 3 Monaten gezeigt, daß sich dieser Wert für ein einzelnes Instrument, das nach den bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung hergestellt wurde, nicht ändert, und es ist möglich, diese Hintergrundbestimmung in den Computerspeicher als eine Konstante einzuprogrammieren. Mit einer leichten Modifizierung des Verfahrens kann dieser Wert jedoch für genauere Ergebnisse bei jeder Analyse bestimmt werden. In dem modifizierten Verfahren wird das Meßgerät mit geschlossenem Deckel angeschaltet, bevor das Reagens eingetragen ist, und der Hintergrundstrom wird gemessen. Das Reagenselement wird dann bei geschlossener Abdeckung in die Meßvorrichtung eingeführt, eine Rtrocken-Bestimmung durchgeführt, und das Verfahren wird, wie zuvor beschrieben, fortgesetzt. Bei diesem modifizierten Verfahren braucht der Hintergrundstrom während der Lebensdauer des Meßgeräts nicht stabil zu bleiben, wodurch zuverlässigere Ergebnisse erhalten werden.
Die unaufbereiteten Daten, die zur Berechnung eines Ergebnisses in einem Glukosetest notwendig sind, sind ein Hintergrundstrom, der als Hintergrundreflexion, Rb, bezeichnet wird, wie zuvor beschrieben wurde; eine Bestimmung des nicht-umgesetzten Reagenselementes, Rtrocken, die ebenfalls zuvor beschrieben wurde; und eine Endpunktbestimmung. Verwendet man die hier beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen, ist der Endpunkt nicht besonders stabil und muß von der anfänglichen Auftragung des Bluts an zeitlich präzise festgelegt werden. Die beschriebene und in Teilanmeldungen beanspruchte Meßvorrichtung führt diese Zeiteinstellung jedoch automatisch durch. Für Glukosekonzentrationen unter 250 mg/dl wird ein ausreichend stabiler Endpunkt in 20 Sekunden erreicht, und eine Endreflexion, R&sub2;&sub0;, wird gemessen. Für Glukosekonzentrationen bis zu 450 mg/dl ist eine Bestimmung der Reflexion nach 30 Sekunden, R&sub3;&sub0;, angemessen. Obwohl das hier beschriebene System bis zu 800 mg/dl Glukose eine gute Differenzierung zeigt, ist die Bestimmung oberhalb 450 mg/dl etwas geräuschvoll und ungenau, jedoch nicht so sehr, daß dies ein signifikantes Problem verursacht. Längere Reaktionszeiten sollten geeignetere Bestimmungen für höhere Spiegel der Glukosekonzentration bereitstellen.
Die Bestimmung der Reflexion bei 700 nm für die duale Wellenlängenmessung wird normalerweise bei 15 Sekunden (R&sub1;&sub5;) vorgenommen. Zu dieser Zeit ist das Reagenskissen mit dem Blut vollständig gesättigt. Nach mehr als 15 Sekunden findet die Farbstoffreaktion immer noch statt und wird zu einem kleinen Teil durch eine Bestimmung bei 700 nm wahrgenommen. Da die Farbstoffabsorption bei dem 700 nm-Signal ein Nachteil ist, werden Bestimmungen nach mehr als 15 Sekunden demgemäß in den Berechnungen nicht berücksichtigt.
Die zuvor beschriebenen unbearbeiteten Daten werden verwendet, um Parameter proportional zur Glukosekonzentration zu berechnen und die leichter sichtbar gemacht werden können als Reflexionsmessungen. Eine logarithmische Transformation der Reflexion analog der Beziehung zwischen dem Absorptionsvermögen und der Analytenkonzentration, die bei der Transmissionsspektroskopie (Beersches Gesetz) beobachtet wird, kann, falls gewünscht, verwendet werden. Eine Vereinfachung der Kubelka-Monk-Gleichungen, speziell für die Reflexionsspektroskopie abgeleitet, hat sich als besonders hilfreich erwiesen. In dieser Ableitung ist K/S auf die Analytenkonzentration bezogen, wobei K/S durch die Gleichung 1 definiert ist.
K/S-t = (1 - R*t)2/(2 x R*t) (1)
R*t ist die zu einem bestimmten Endzeitpunkt t gemessene Reflexion und der absorbierte Teil des einfallenden Lichtstrahls, der durch die Gleichung 2 beschrieben wird, wobei Rt der Endpunkt der Reflexion, R&sub2;&sub0; oder R&sub3;&sub0;, ist.
R*t = (Rt - Rb)/(Rtrocken - Rb) (2)
R*t variiert von 0, wenn kein Licht reflektiert wird (Rb) bis 1, wenn das gesamte Licht reflektiert wird (Rtrocken). Die Verwendung der Reflexion in den Berechnungen vereinfacht die Gestaltung der Meßvorrichtung als eine hochstabile Quelle in hohem Maß und eine Nachweisschaltung wird unnötig, da diese Komponenten mit jeder Bestimmung von Rtrocken und Rb überwacht werden.
Für eine Bestimmung bei einer einzelnen Wellenlänge kann K/S bei 20 Sekunden (K/S-20) oder bei 30 Sekunden (K/S-30) berechnet werden. Die Eichkurven dieser Parameter für Glukosebestimmungen mit YSI (Yellow Springs Instruments) können durch die in Gleichung 3 umrissene Polynomgleichung dritter Ordnung präzise beschrieben werden.
YSI = a&sub0; + a&sub1;(K/S) + a&sub2;(K/S)2 + a&sub3;(K/S)³ (3)
Die Koeffizienten für diese Polynome sind in Tabelle 1 aufgelistet. TABELLE 1 Koeffizienten für Polynome dritter Ordnung, die für Einzelwellenlängen- Eichkurven geeignet sind
Die einzige chemische Spezies, die wird, ist der MBTH-DMAB-Indamin- Farbstoff und die komplexe Matrix, die analysiert wird, ist auf einer 0,8 u Posidyne-Membran verteiltes Vollblut. Ein Artikel mit dem Titel "Application of Near Infra Red Spectrophotometry to the Nondestructive Analysis of Foods: A Review of Experimental Results", CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 18(3) 203-30 (1983), beschreibt die Verwendung von Instrumenten aufgrund der Bestimmung einer Differenz der optischen Dichte OD (λa - λb), wobei OD λa die optische Dichte der Wellenlänge ist, die dem Absorptionsmaximum einer zu bestimmenden Komponente entspricht und OD λb die optische Dichte bei einer Wellenlänge, bei der dieselbe Komponente nicht signifikant absorbiert.
Der Algorithmus für eine duale Wellenlängenmessung ist notwendigerweise komplexer als für die Bestimmung einer einzelnen Wellenlänge, ist jedoch wirkungsvoller. Die durch die Bestimmung bei 700 nm angewendete Korrektur erster Ordnung ist eine einfache Subtraktion der Hintergrundfarbe aufgrund des Blutes. Um diese Korrektur durchzuführen, kann eine Beziehung zwischen der Absorption bei 635 nm und 700 nm aufgrund der Blutfarbe durch Bestimmen der Blutproben mit 0 mg/dl Glukose über einen weiten Bereich der Blutfarbe bestimmt werden und wurde auch bestimmt. Der Farbbereich wurde durch Variieren des Hämatokrits gebildet, und es wurden recht lineare Beziehungen beobachtet. Aus diesen Kurven wurde der K/S-15-Wert bei 700 nm normiert, um dem K/S-30-Wert bei 635 nm zu entsprechen. Diese Beziehung ist in Gleichung 4 beschrieben, in der K/S-15n der normierte K/S-15-Wert bei 700 nm ist.
K/S-15n = (K/S-15 x 1,54) - 0,133 (4)
Es wird darauf hingewiesen, daß die Äquivalenz des normierten 700 nm-Signals und des 635 nm-Signals lediglich bei einem Glukosewert von 0 zutrifft. Die Termini, von denen die Eichkurven abgeleitet wurden, sind durch die Gleichungen 5 und 6 definiert.
K/S-20/15 = (K/S-20) - (K/S-15n) (5)
K/S-30/15 = (K/S-30) - (K/S-15n) (6)
Diesen Kurven genügen am besten Polynomgleichungen vierter Ordnung ähnlich der Gleichung 3, denen in K/S ein Term vierter Ordnung zugefügt ist. Die computertauglichen Koeffizienten für diese Gleichungen sind in Tabelle 2 angegeben. TABELLE 2 Koeffizienten für einen Fit von Polynomen vierter Ordnung, von Eichkurven für duale Wellenlängen
Eine Korrektur zweiter Ordnung zum Eliminieren von Fehlern aufgrund chromatographischer Effekte wurde ebenfalls entwickelt. Proben mit wenig Hämatokrit ergeben bei 700 nm charakteristischerweise eine niedrige Anzeige im Vergleich zu Proben mit höherem Hämatokrit mit derselben Anzeige bei 635 nm. Wenn das Verhältnis von (K/S-30)/(K/S-15) gegenüber K/S-30 über einen breiten Bereich von Hämatokrit- und Glukosekonzentrationen aufgetragen wird, gibt die so erhaltene Linie auf dem Diagramm die Grenze an zwischen Proben, die chromatographische Effekte (oberhalb der Kurve) und denjenigen, die keine (unterhalb der Kurve) zeigen. Die K/S-30-Werte für die Proben oberhalb der Kurve werden durch Anheben des Anzeigewertes korrigiert, damit sie einem Punkt auf der Kurve mit demselben (K/S-30)/(K/S-15) entsprechen.
Die zuvor genannten Korrekturfaktoren waren genau auf ein einzelnes Instrument und auf eine begrenzte Anzahl von Reagenszubereitungen abgestimmt. Der Algorithmus kann für ein einzelnes Instrument und Reagens in derselben Weise, die zuvor beschrieben ist, optimiert werden.
Zusammengefaßt setzt das System die Bedienerfunktionen auf ein Mindestmaß herab und bietet zahlreiche Vorteile gegenüber den Reflexionsbestimmungsverfahren des Standes der Technik. Im Vergleich zu den bisherigen Verfahren zur Bestimmung von Glukose in Blut hat es mehrere offenkundige Vorteile. Erstens ist die Probenmenge, die zur Sättigung des dünnen Kissens wie 11 notwendig ist, gering (normalerweise 5 - 10 Mikroliter). Zweitens ist die erforderliche Bedienungszeit lediglich die, die notwendig ist, um die Probe auf das Kissen aufzutragen und die Abdeckung zu schließen (normalerweise 4 -7 Sekunden). Drittens ist kein gleichzeitiger Beginn des Zeitlaufs erforderlich. Viertens wird Vollblut verwendet. Das Verfahren erfordert keinerlei Trennung oder Verwendung von Proben, die frei von roten Zellen sind, und kann ebenso mit anderen tiefgefärbten Proben verwendet werden.
Mehrere nicht offensichtliche Vorteile ergeben sich aus der Praxis der vorliegenden Erfindung. Normalerweise durchdringt Blut eine hydrophile Membran, wodurch eine flüssige Schicht auf der entgegengesetzten Seite der Membran entsteht, eine Oberfläche, die dann nicht für eine Reflexions-bestimmung geeignet ist. Es wurde jedoch gefunden, daß Blut, offensicht-lich aufgrund von Wechselwirkungen von roten Blutkörperchen und Proteinen im Blut mit der Matrix, die Polyamidmatrix benetzt, ohne daß überschüssige Flüssigkeit die poröse Matrix durchdringt, die die Reflexionsbestimmung auf der gegenüberliegenden Seite der Matrix stört.
Darüber hinaus erwartet man von den in der vorliegenden Erfindung verwendeten dünnen Membranen, daß, wenn sie naß sind, Licht durchlassen und nur ein schwaches Signal an die Reflexions-Meßvorrichtung zurücksenden. Die bisherigen Lehren wiesen allgemein darauf hin, daß eine reflektierende Schicht hinter der Matrix notwendig ist, um ausreichend Licht zu reflektieren. In anderen Fällen wurde vor der Farbbestimmung ein weißes Kissen hinter dem Reagenskissen angebracht. Im vorliegenden Fall ist weder eine reflektierende Schicht noch ein weißes Kissen erforderlich. Tatsächlich wird die Erfindung normalerweise mit einer lichtabsorbierenden Oberfläche hinter dem Reagenselement durchgeführt, wenn auffallendes Licht auf die Matrix auftritt. Das Verwenden einer lichtabsorbierenden Oberfläche hinter dem Reagenselement, gepaart mit dem Messen der Reflexion bei zwei verschiedenen Wellenlängen, ermöglicht es, daß ohne Entfernen von überschüssiger Flüssigkeit aus der Matrix akzeptable Reflexionsbestimmungen erhalten werden, wodurch eine Stufe eliminiert wird, die bei den bisher gelehrten Verfahren normalerweise erforderlich war.
Die Erfindung wird im folgenden allgemein beschrieben, wobei sie anhand der folgenden speziellen Beispiele besser verstandlich werden soll, wobei die Beispiele lediglich zur Veranschaulichung angeführt werden und die Erfindung, falls nicht anders angegeben ist, nicht einschränken sollen.

Beispiel I

Reproduzierbarkeit:

Eine männliche Blutprobe (JG, Hämatokrit = 45) wurde für die Sammlung der in den Tabellen 3 - 5 dargelegten Reproduzierbarkeitsdaten verwendet. Tabelle 3 Reproduzierbarkeit eines MPX-Systems bei einer einzigen Wellenlänge Tabelle 4 Reproduzierbarkeit eines MPX-Systems mit zwei Wellenlängen Tabelle 5 Reproduzierbarkeit einer Öffnung von 3,0 mm Durchmesser
Das Blut wurde in Aliquots aufgeteilt und mit Glukose über einen Bereich von 25 - 800 mg/dl beaufschlagt. Bei jedem Glukosetestspiegel wurden 20 Bestimmungen von Streifen gemacht, die willkürlich aus einer 500-Streifen-Probe (Lot FJ4-49B) entnommen wurden. Die Ergebnisse dieser Untersuchung führen zu den folgenden Schlußfolgerungen:
1. Eine gegen zwei Wellenlängen: Der durchschnittliche C.V. für das duale Ergebnis bei 30 Sekunden betrug 3,7 % gegenüber 4,8 % für das Einzelwellenlängenergebnis bei 30 Sekunden, eine Verbesserung von 23 % über einen Glukosebereich von 25 - 810 mg/dl. Die Verbesserung an C.V. betrug 33 % in dem Glukosebereich von 25 - 326 mg/dl. Hier sank der C.V. von 5,4 % auf 3,6 %, eine signifikante Verbesserung in dem am meisten verwendeten Bereich. Die duale Wellenlängenbestim-mung für 20 Sekunden ergab ähnliche Verbesserungen in C.V. im Vergleich zu den Einzelwellenlängenbestimmungen in dem Bereich 25 - 325 mg/dl (Tabellen 3 und 4).
2. Zwei Wellenlängen, Ergebnis bei 20 gegenüber 30 Sekunden: Der C.V.- Durchschnitt für ein Ergebnis bei 20 Sekunden in dem Bereich von 25 - 100 mg/dl ist nahezu identisch mit der Bestimmung bei 30 Sekunden, 4,2 % gegenüber 4,1 %. Bei 326 mg/dl weist jedoch die Bestimmung bei 30 Sekunden einen C.V. von 2,1 % und das Ergebnis bei 20 Sekunden einen C.V. von 4,5 % auf. Wie aus der K/S-20-Reaktionskurve ersichtlich war, beginnt die Steigung bzw. die Kurve oberhalb 250 mg/dl scharf abzufallen. Dies führte zu schlechter Reproduzierbarkeit bei Glukosespiegeln von größer als 300 bei der Bestimmung bei 20 Sekunden. Aus diesen Reproduzierbarkeitsdaten liegt der Cutoff für das Ergebnis bei 20 Sekunden irgendwo zwischen 100 und 326 mg/dl. Ein Cutoff von 250 mg/dl wurde später aus den Ergebnissen der in Beispiel II dargelegten Recovery-Studie bestimmt.
3. Größe der Öffnung: Es wurde eine kleinere Größe der Öffnung der Optik, 3,0 mm us. 5-0 Minuten, untersucht. Anfängliches Experimentieren unter Verwendung einer zehnfach unterteilten, mit der Hand eingetauchten Probenscheibe zeigte verbesserte C.V.-Werte mit der 3,0 mm-Öffnung, offensichtlich wegen leichterer Registrierung mit der System-Optik. Wenn jedoch eine maschinell hergestellte Rollmembran verwendet wurde, betrug der durchschnittliche C.V.-Wert (Tabelle 5) der größeren Öffnung, 4,7 mm, 3,9 % vs. einem durchschnittlichen C.V.-Wert für die 3,0 mm-Öffnung von 5,1 %. Dieser Anstieg von 30 % des C.V.-Werts lag wahrscheinlich an der ungleichen Oberfläche der Rollmembranpartie, die im folgenden erläutert wird.

Beispiel II

Recovery-Studie:

Zum Vergleich des vorliegenden Verfahrens (MPX) gegen ein typisches Verfahren des Stands der Technik unter Verwendung eines Yellow Springs Instrument Model 23A Glukoseanalysators, hergestellt von Yellow Springs Instrument Co., Yellow Springs, Ohio (YSI), wurde Blut von 36 Spendern getestet. Die Spender wurden gleichermaßen aufgeteilt zwischen männlichen und weiblichen und in Hämatokritbereiche von 35-55 % eingeteilt. Die Blutproben wurden innerhalb von 30 Stunden nach der Sammlung verwendet, wobei Lithiumheparin als Antikoagulans verwendet wurde. Jede Blutprobe wurde in Aliquots aufgeteilt und mit Glukose beaufschlagt, wobei 152 Proben im Bereich von 0 - 700 mg/dl Glukose erhalten wurden. Jede Probe wurde zweimal getestet, was insgesamt 304 Datenpunkte ergab.
Aus diesen Daten wurden Reaktionskurven konstruiert und die Glukose werte dann aus der geeigneten Gleichung (Tabellen 1 und 2) berechnet. Diese MPX-Glukosewerte wurden dann gegen die YSI-Werte aufgetragen, wobei Streuungsdiagramme erhalten wurden.
Vergleich der MPX-Systeme: Sowohl für die Meßzeiten bei 20 Sekunden und bei 30 Sekunden ist die Streuung in den Streuungsdiagrammen einer Wellenlänge sichtbar größer als in den Streuungsdiagrammen mit zwei Wellenlängen. Die 20-Sekunden-Bestimmung weist oberhalb 250 mg/dl große Streuung auf, die 30-Sekunden-Bestimmung weist jedoch keine breite Streuung auf, bis der Glukosespiegel ≥ 500 mg/dl ist.
Diese Streuungsdiagramme wurden quantitativ ausgewertet, indem die Abweichungen von YSI bei verschiedenen Glukosebe-reichen bestimmt wurden. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten. Tabelle 6 Genauigkeit von MPX aus den Recovery-Werten

Anmerkungen: Dies sind Zwischenverfahren-C.V.-Werte.

a. Das Dualwellenlängensystem ergab C.V.-Werte, die in einem 30 % niedrigeren Bereich lagen als die des Einzelwellenlängensystems.
b. Das Einzelwellenlängensystem zeigte von 0-50 mg/dl einen S.D.-Wert von ±6-7 mg/dl, wogegen der S.D.-Wert für eine Dualwellenlängen-Bestimmung nur ±2,2 mg/dl betrug.
c. Der Cutoff für eine 30-Sekunden-MPX-Bestimmung beträgt 250 mg/dl. Für den Bereich von 50-250 mg/dl ergaben sowohl die 20- und 30-Sekunden-Bestimmungen ähnliche Zwischenverfahren- C.V.-Werte (annähernd 7 % für Einzelwellenlänge, 5,5% für Dualwellenlänge). Im 250 - 450 mg/dl-Bereich Zwischenverfahren-C.V.Werte jedoch mehr als das Doppelte für die 20-Sekunden-Bestimmung bis 14,5 % für die Einzelwellenlänge und 12,8% für die Dualwellenlänge.
d. Die 30-Sekunden-Bestimmung war oberhalb 450 mg/dl sowohl für die Einzel- als auch für die Dualwellenlängen-Bestimmung unverwendbar (C.V.-Werte von 10,2 und 8,4 %).
Folglich gaben zwei MPX-Systeme eine optimale quantita-tive Bestimmung im Bereich von 0 - 450 mg/dl.
1. MPX 30 Dual: Dieses Dualwellenlängensystem gab eine 30-Sekunden- Bestimmungzeit mit einer Zuverlässigkeitsgrenze von 95 % (definiert als die Wahrscheinlichkeit einer Messung, die innerhalb von 2 S.D. des YSI liegt) von 11,3 % (C.V.) für den Bereich von 50 - 450 mg/dl (Tabelle 7) und ±4,4 mg/dl (S.D.) für 0 - 50 mg/dl.
2. MPX 30/20 Dual: Dieses Dualwellenlängensystem ergab eine 20-Sekunden- Bestimmungszeit in dem Bereich von 0 - 250 mg/dl und eine Zeit von 30 Sekunden für den Bereich 250 - 450. Die Zuverlässigkeitsgrenzen von 95 % sind nahezu identisch mit denen des MPX 30 Dual-Systems (Tabelle 7), 11,1 % (C.V.) für 50 - 450 mg/dl und ±4,6 mg/dl (S.D. für 0 - 50 mg/dl). Tabelle 7 Vergleich der 95 % Zuverlässigkeitsgrenzen für MPX, GlucoScan Plus und Accu-Chek bG* Reagenskissen
* Die Zuverlässigkeitsgrenzen für MPX stammten von YSI. Die Zuverlässigkeitsgrenzen für GlucoScan Plus und Accu-Chek bG stammten von der Beziehungsgleichung gegenüber YSI, die systematische Fehler aufgrund geringer Differenzen in der Kalibrierung eliminiert.

Beispiel III

Stabilität:

Die meiste Arbeit im Laboratoriumsmaßstab, die zur Optimierung der Stabilität durchgeführt wurde, wurde unter Verwendung von mit der Hand eingetauchten Kissen, die Scheibchen aus 0,8 u Posidyne-Membran waren, fertiggestellt. Die spezifische Farbstoff/Enzymformulierung wurde vorher beschrieben.
1. Stabilität bei Raumtemperatur: Diese Untersuchung versuchte, jede Veränderung in Reaktion auf das 0,8 um Posidyne-Membran-Reagens, das bei 18 - 20 ºC über Silikagel als Trockenmittel gelagert wurde, auf einer Karte aufzuzeichnen. Nach 2,5 Monaten war keine merkliche Veränderung eingetreten, wie durch die Reaktion einer Probe bei Raumtemperatur gegenüber der Reaktion einer bei 5 ºC gelagerten Probe bestimmt wurde. Jedes Streuungsdiagramm repräsentierte einen Glukosebereich von 0 - 450 mg/dl.
2. Stabilität bei 37 ºC: Es wurde eine Stabilitätsuntersuchung bei 37 ºC unter Verwendung desselben Reagenses wie bei der RT-Untersuchung durchgeführt. Die Unterschiede in den Glukosewerten von bei 37 ºC belastetem Reagens gegenüber RT-Reagens, für Kissen mit und ohne Adhäsiv, wurde gegenüber der Zeit aufgetragen. Obwohl die Daten aufgrund der schlechten Reproduzierbarkeit von handgemachten Kissen verrauscht waren, war die Stabilität für Kissen hervorragend, ob sie nun mit oder ohne Adhäsiv belastet wurden.
3. Stabilität bei 56 ºC: Es wurden acht 5 - 6 Tage dauernde Stabilitäts Untersuchungen unter Verwendung verschiedener Zubereitungen einer ähnlichen Formulierung auf Membrankissen durchgeführt (Tabelle 8). Für den Test bei niedrigem Glukosespiegel (80 - 100 mg/dl) fiel der durchschnittliche Glukosewert nach Belastung um 3,4 %, wobei der höchste Abfall 9,55 % betrug. Bei dem Test mit hohem Spiegel (280 - 320 mg/dl) wich die Glukose-Bestimmung durchschnittlich um 3,4 % ab, wobei die größte Abweichung 10,0 % betrug. Tabelle 8 Stabilität einer 0,8 um Posidyne-Kissen-Reagens-Formulierung, pH = 4,0, die 5 - 6 Tage lang bei 56 ºC belastet wurde
* Diese beiden Proben enthielten das zweifache der normalen Konzentration an Enzym und Farbstoff.
Eine Untersuchung der Belastung dieser Membran bei 56 ºC über eine Zeitspanne von 19 Tagen zeigte keinen bedeutenden Unterschied für Streifen, die mit oder ohne Adhäsiv belastet wurden. In beiden Fällen betrug die Abweichung des Glukosewerts in 19 Tagen < 15% bei niedrigen Testspiegeln (80 - 100) und 300 mg/dl. Eine andere Untersuchung bei 56 ºC unter Verwendung handgetauchter 0,8 um Posidyne-Membran-Kissen mit dem zweifachen der normalen Konzentration an Enzym und Farbstoff wurde fertiggestellt. Zwei separate Zubereitungen derselben Formulierung wurden hergestellt und die Stabilität über eine Zeitspanne von 14 Tagen gemessen. Die Durchschnittsergebnisse der beiden Untersuchungen wurden aufgetragen. Über die Zeitspanne von 14 Tagen lagen die Änderungen innerhalb ±10 % sowohl für den Test mit hohem als auch mit niedrigem Glukosespiegel. Diese Daten zeigen, daß diese Formulierung besonders stabil ist.

Beispiel IV

Probengröße:

Die Erfordernisse für die Probengröße für MPX sind in Tabelle 9 angegeben. Tabelle 9 Wirkung der Probengröße auf MPX-Bestimmungen
Die in der Tabelle angegebenen Volumina wurden unter Verwendung einer Mikropipette auf das in Fig. 1 gezeigte Reagenskissen übertragen. Wenn Blut aus einem Einstich in den Finger auf ein Kissen aufgetragen wird, kann nicht die gesamte Probe übertragen werden, daher stellen die hier angegebenen Volumina nicht die gesamte Probengröße dar, die für die Analyse aus dem Finger gedrückt werden muß. Es ist mindestens eine 3 ul-Probe notwendig, um den Reagenskissenkreis vollständig zu bedecken. Dies stellt nicht genügend Probematerial bereit, um das Reagenskissen vollständig zu sättigen und MPX ergibt niedrige Ergebnisse. Eine 4 ul-Probe sättigt das Reagenskissen knapp während eine 5 ul-Probe eindeutig adäquat ist. Eine 10 ul-Probe ist ein großer, leuchtender Tropfen, und eine 20 ul-Probe ist ein sehr großer Tropfen und wird wahrscheinlich nur verwendet, wenn Blut aus einer Pipette für das Entnehmen der Probe verwendet wird.
Bei einer niedrigen Glukosekonzentration hängt das Einzelwellenlängen- Ergebnis etwas von der Probengröße ab, was bei Verwendung der Dualwellenlängen-Bestimmung vollständig eliminiert wird. Obwohl diese Abhängigkeit bei der Einzelwellenlänge als annehmbar betrachtet werden kann, ist sie eindeutig unerwünscht.

Beispiel V

Reproduzierbarkeit:

Die zuvor beschriebenen experimentellen Bestimmungen wurden immer wiederholt durchgeführt, normalerweise zwei, drei oder vier Bestimmungen pro Datenpunkt. Diese Wertegruppen zeigten immer enge Übereinstimmung, sogar für Proben mit extremen Hämatokrit- oder extremen Sauerstoffspiegeln. Die C.V.- Werte lagen gut unter 5 %. Es ergibt sich daher, daß die Reproduzierbarkeit sehr gut bis hervorragend ist.
Die vorliegende Erfindung weist viele Vorteile gegenüber Systemen auf, die bislang im Handel erhältlich sind oder in der Literatur beschrieben wurden. Die Protokolle sind einfach und erfordern geringe technische Begabung und sind relativ frei von Bedienerfehlern. Die Proben können rasch durchgeführt werden und verwenden kostengünstige und relativ unschädliche Reagenzien, was für Materialien, die zuhause verwendet werden, ein wichtiger Gesichtspunkt ist. Der Benutzer erhält Ergebnisse, die verstanden werden können und in Verbindung mit einer Dauertherapie verwendet werden können. Zusätzlich weisen die Reagenzien eine lange Haltbarkeit auf, so daß die erhaltenen Ergebnisse für eine lange Zeitdauer zuverlässig sind. Die Ausstattung ist einfach und zuverlässig und im wesentlichen automatisch.
Alle Patente und anderen Veröffentlichungen, die in dieser Anmeldung spezifisch genannt sind, weisen auf das Niveau desjenigen Durchschnittsfachmannes hin, an den sich diese Erfindung richtet.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von Glukose in einer Blutprobe, umfassend

die Bereitstellung eines Reagenzelements (11), umfassend eine poröse, hydrophile, reflektierende Polyamidmatrix welche ein signalerzeugendes System enthält, umfassend Glukoseoxidase, Peroxidase und eine MBTH-DMAB-Farbstoffvorstufe die mit Glukose reagiert um ein lichtabsorbierendes Farbstoffprodukt zu erzeugen, um die Glukosekonzentration im Blut in Anwesenheit von optisch sichtbarem Hämoglobin anzuzeigen, wobei die Matrix eine erste Oberfläche (15) und eine der ersten Oberfläche (15) gegenüberliegende zweite Oberfläche (16) besitzt, wobei die Matrix so beschaffen ist, daß überschüssige Flüssigkeit von der ersten Oberfläche (15) nicht zur zweiten Oberfläche (1 6) durchdringt;

das Auftragen einer nicht bestimmten Vollblutprobe auf die erste Oberfläche (15);

ohne die überschüssige Probe oder roten Blutzellen von der ersten Oberfläche (15) zu entfernen, die Bestimmung, mittels einer von der zweiten Oberfläche (16) der Matrix ausgeführten Messung der Reflexion bei zwei verschiedenen Wellenlängen, eine zur Korrektur der Hintergrundabsorption durch die Farbe des Blutes und eine bei einer Absorptionswellenlänge des Farbstoffprodukts, der durch die Umsetzung der Glukose in der nicht bestimmten Vollblutprobe mit dem signalerzeugenden System erzeugten Menge an Farbstoffprodukt; und

die Bestimmung der Glukosekonzentration in der nicht bestimmten Vollblutprobe mittels der Reflexionsmessung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die beiden Wellenlängen in einem Bereich von 625 bis 645 nm und von 690 bis 710 nm liegen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die beiden Wellenlängen etwa 635 und 700 nm betragen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Matrix MBTH und DMAB in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 1 bis 1 : 4 enthält.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei eine Enzymlösung zu der Matrix gegeben wurde, wobei die Lösung einen den pH- Wert auf 3,8 bis 5 einstellenden Puffer enthielt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Puffer einen pH-Wert von 3,8 bis 4,3 ergibt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Puffer einen pH-Wert von etwa 4 ergibt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Puffer 5 bis 15 Gew.-% Citrat enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Puffer etwa 10 Gew.-% Citrat enthält.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Matrix eine einzelne Schicht ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Matrix eine positiv geladene Membran ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, das das Auslösen einer Zeitmessung einer vorbestimmten Serie von zeitlich gesteuerten Reflexionsbestimmungen umfaßt, mittels Nachweis des Durchdringens wenigstens eines Teils der Probe durch die Matrix von der ersten Oberfläche zur zweiten Oberfläche durch Abnahme der von der zweiten Oberfläche gemessenen Reflexion.