CN111077205A

CN111077205A - 半乳糖快速检测系统及其应用

Info

Publication number: CN111077205A
Application number: CN201811219971.XA
Authority: CN
Inventors: 胡幼圃; 陈思豪; 林昕儒; 曾柏元; 沈燕士; 刘耀南; 杨苹
Original assignee: Avalon Happo Co ltd
Current assignee: Avalon Happo Co ltd
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2020-04-28

Abstract

一种半乳糖快速定量检测系统，其包括：半乳糖组合物，包含半乳糖、缓冲剂及抗氧化剂，进入体内经代谢后，产生体液样品；试纸或滤纸，包含酵素，该酵素会与该体液样品反应产生电化学讯号；以及测量仪，包含：电源单元，提供讯号；连接器，接收该电源单元所提供的该讯号并将该讯号传送到该试纸或该滤纸上，该讯号与该电化学讯号产生相应的反应讯号后，将该相应的反应讯号传送到该测量仪；计算单元，计算该相应的反应讯号；模拟数字转换器，接收由该计算单元计算过的该相应的反应讯号，将计算过的该相应的反应讯号转换成数字化反应讯号；处理器，处理该数字化反应讯号；显示器，显示该数字化反应讯号；及数字终端机，接收该数字化反应讯号。

Description

半乳糖快速检测系统及其应用

【技术领域】

本发明提供一种快速检测人体血液中半乳糖含量的系统，特别是以此测量半乳糖浓度及评估肝功能损伤程度。

【背景技术】

肝脏与许多药品的清除(clearance)有关，其可经由不同的代谢途径或经由胆汁排泄的途径清除原药品或其代谢物，而肝功能不全所引起药品排泄或代谢速率的改变会造成药品蓄积或阻碍药品形成活性代谢物。由于血中半乳糖与肝功能异常有灵敏的相关性，且研究文献证据显示，血中半乳糖的数值与肝功能异常的程度有显著关系，因此可借助血中半乳糖的数值来评估其肝功能剩余功能。

常用的检测方法为空腹8小时后，静脉注射0.5g/kg的半乳糖，并于60分钟后，测量血浆中的半乳糖浓度(Tang H.S.et al(1992)Digestion,52:222-231；Ranek L.et al(1983)Clin.Physiol.3:173-178)。其测量方式是以不同半乳糖标准溶液浓度与其吸光值的关系，制作校正曲线；同时抽取的血液添加HClO₄震荡混合后，离心取上清液，于上清液中加入KOH震荡混合后，再离心取上清液，并于上清液中再加入半乳糖去氢酶(galactosedehydrogenase)后，为免颜色反应不准确而置于暗室60分钟以制备样品，测其吸光值，对照校正曲线找出浓度值。但是该检测过程繁复耗时，需使用多种药剂种类，因此受试者得知检测结果的时间非常冗长。

台湾专利号I292478揭示肝功能测定样品的制作方法及采样试纸。该方法也须注射半乳糖进入受试者体内，等待60分钟，测量血液中半乳糖的浓度。其测量方式是以不同半乳糖标准溶液浓度与其吸光值的关系，制作校正曲线；于样品试纸加入三氯乙酸并震荡30分钟，取出溶剂后加入含有半乳糖去氢酶的溶剂并震荡30分钟，再添加显色剂，最后测量其吸光值。但是该方法是注射半乳糖进人体，且须制作样品，检测过程繁复且耗时，因此本领域需提供一个快速且简便的半乳糖检测方法，以供需要检测半乳糖的患者使用。

台湾专利M488635揭示可检测血糖的生物试片；美国专利US971995则是揭露以电化学方式作血容性测试的检测系统，该系统包含电化学试片及测量仪，由此可知，以电化学方法监控身体状态为现有普遍的技术，然而以电化学方式检测半乳糖存在许多困难，其原因为由于酵素的蛋白质不稳定，无法在酸性溶液以外的环境中保存，且保存时间非常短，因此提供一以固态方式而且长时间保存的试纸并同时保有检测准确度为本领域欲解决的另一问题。

【发明内容】

为解决前述的问题，本发明提供一种半乳糖快速定量检测系统，其包括：一半乳糖组合物，包含半乳糖、缓冲剂及抗氧化剂，进入体内经代谢后，产生一体液样品；一试纸或一滤纸，包含一酵素，该酵素会与该体液样品反应产生一电化学讯号；以及一测量仪，包含：一电源单元，提供一讯号；一连接器，接收该电源单元所提供的该讯号并将该讯号传送到该试纸或该滤纸上，该讯号与该电化学讯号产生一相应的反应讯号后，将该相应的反应讯号传送到该测量仪；一计算单元，计算该相应的反应讯号；一模拟数字转换器，接收由该计算单元计算过的该相应的反应讯号，将计算过的该相应的反应讯号转换成一数字化反应讯号；一处理器，处理该数字化反应讯号；一显示器，显示该数字化反应讯号；其中该数字化反应讯号可被传送至一数字终端机。

为达前述目的，其中该缓冲液系选自于抗坏血酸盐缓冲剂(ascorbic acidbuffer)、柠檬酸缓冲剂(citrate buffer)、磷酸缓冲剂(phosphate buffer)、醋酸缓冲剂(acetate buffer)、碳酸缓冲剂(carbonate buffer)及三乙醇胺缓冲剂(triethanolamine buffer)所组成的群组。

为达前述目的，其中该抗氧化剂系选自于由维生素C或/和亚硫酸氢钠 (sodiumbisulfite)、维生素A、维生素E、类黄酮、多酚、乙二胺四乙酸((Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA))、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、N,N-双[羧甲基]甘胺酸(NTA)所组成的群组。

为达前述目的，其中该半乳糖包含D-(+)-半乳糖、L-(-)-半乳糖、稳定同位素半乳糖、环状半乳糖或半乳糖衍生物。

为达前述目的，其中该半乳糖组合物系以口服、注射、喷雾吸入及口含、直肠、栓剂或其他临床适合方式给予。

为达前述目的，其中该口服方式是通过让使用者先饮用该半乳糖组合物，接着检测血液中的半乳糖含量的方式测量体内中的半乳糖含量。

为达前述目的，其中该静脉注射方式是通过让使用者先将该半乳糖组合物注射入体内，接着检测血液中的半乳糖含量的方式测量体内中的半乳糖含量。

本发明提供另一发明目的，一种半乳糖快速定量检测系统的试纸，包括：一绝缘基板；一电极单元，配置于该绝缘基板上；一第一绝缘隔片，覆盖部分的该电极单元且包括位于该第一绝缘隔片的一第一边缘的一反应区流道，其中部分的该电极单元暴露于该反应区流道；以及一第二绝缘隔片，包含一第二绝缘隔片，该第二绝缘隔片覆盖于该第一绝缘隔片的该反应区交流道上，与该第一绝缘隔片的该第一边缘及该绝缘基板的同侧边缘呈现外凸的弧形，该绝缘基板相对该反应区交流道前段位置呈现内凹结构，其中该反应区交流道内含有一反应层，该反应层覆盖位于该反应区流道中的该电极单元且包含一酵素与一导电介质，用以与体液样品产生电化学反应；其中该试纸系利用该第二绝缘隔片的该第二边缘的外凸的弧形与该绝缘基板相对该反应区交流道前段位置的内凹结构破坏体液的内聚力，搭配毛细现象以达到快速进体液样品；其中该酵素可氧化、还原、分解或代谢半乳糖。

为达前述目的，其中该试纸的半乳糖测试范围为50-2000μg/ml。

为达前述目的，其中该绝缘基板系选自于由聚氯乙烯(PVC)、玻璃纤维 (FR-4)、聚酯(polyester suphone)、电木板、聚对苯二甲酸二乙酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚苯乙烯(PS)、玻璃板及陶瓷所组成的群组。

为达前述目的，其中该电极单元系选自于钯胶、铂胶、金胶、钛胶、碳胶、银胶、铜胶、金银混合胶及碳银混合胶所组成的群组。

为达前述目的，其中该反应层系由选自于酵素、辅酶、导电介质、缓冲剂与保护剂所组成的群组。

为达前述目的，其中该导电介质系由选自于由二茂铁(Ferrocene)、二茂铁盐(ferrocenium)、亚甲蓝(methylene blue)、三乙腈基三氯化钌 (tris(acetonitrile)ruthenium trichloride)、2,5-二羟基苯醌 (2,5-dihydroxybenzoquinone)、吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate)、四硫富瓦烯(tetrathiafulvalene)、四氰基奎诺二甲烷(tetra-cyano-quino-dimethane)、甲基紫精(methyl viologen)、甲苯胺蓝(toluidineblue)、5,6-二胺基-1，10-邻二氮杂菲 (5,6-diamino-1,10-phenanthroline)、[M(bpy)3]2+(M＝Ru or Os；BPY＝2,2’-二吡啶(2,2′-bipyridine))所组成的群组。

为达前述目的，其中该导电介质可为金属离子化合物，该金属离子化合物系选自于由MgCl₂、BeCl₂、CaCl₂、SrCl₂、BaCl₂或其组合所组成的群组。

为达前述目的，其中该缓冲剂系选自于由Tris、Tris-HCl、PBS、MES，CHES、Borate、Universal buffer mixtures(CPB)、MOPS、TES、HEPES、TAPSO、Tricine、Bicine、TAPS组成的群组。

为达前述目的，其中该安定剂系选自于由木糖醇、甘露醇、聚木糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、海藻糖、PEG、PVA、PEO、甲基纤维素(Methocel)、琼脂糖(agarose)、溶胶凝胶(sol-gel)、胶原(collagen)、壳聚糖(chitosan)、BSA、酪蛋白(casein)、再生蛋白(neoprotein)，胺基酸或其任一组合所组成的群组。

为达前述目的，其中该界面活性剂选自于由阳离子界面活性剂、阴离子界面活性剂，中性离子界面活性剂，非离子界面活性剂所组成的群组。

为达前述目的，其中该酵素可被固定化及干燥化，并保存于酸碱中性环境。

本发明提供另一发明目的，一种半乳糖快速定量检测系统的应用，其中该半乳糖快速定量检测系统可用于判断体内半乳糖浓度，以测量新生儿半乳糖血症。

为达前述目的，其中该半乳糖快速定量检测系统提供监控半乳糖值及肝能不全患者或专业人员测量。

为达前述目的，其中该半乳糖快速定量检测系统系以半乳糖浓度判断肝脏剩余功能。

【附图说明】

图1半乳糖快速检测系统外形图；

图2半乳糖快速检测系统示意图；

图3半乳糖快速检测系统准确度测试曲线图；

图4试纸构造示意图；

图5滤纸检验体积检测曲线图；

图6检验试纸存放天数测试曲线图；图6中的(a)为30℃下存放不同天数的测试曲线图，图6中的(b)为40℃下存放不同天数的测试曲线图，图6中的(c)为45℃下存放不同天数的测试曲线图；

图7静脉注射半乳糖的GSP结果与口服半乳糖的OGSP相关性结果；

图8静脉注射半乳糖的GSP结果与口服半乳糖的OGSP相关性结果；

图9半自动化机械手臂完成的试纸检验结果曲线图；

图10对半乳糖测量仪进行密码卡校正，测量仪自动开机时显示的图案；

图11用半乳糖测量仪检测半乳糖，测量仪自动开机时屏幕显示的图案。

其中，100试纸，110绝缘基板，120电极单元，122第一端，124第二端，130第一绝缘隔片，132第一边缘，134反应区交流道，140第二绝缘隔片，142第二边缘，144通气孔，150反应层，200测量仪，210连接器， 211计算单元，212模拟数字转换器，213处理器，214显示器，215电源单元，300数字终端机。

【具体实施方式】

本发明通过下面的实施例进行示例性说明，但本发明不受下述实施例所限制。本发明所使用的材料，除非特别指明，均为市售易于获得的材料。

本发明的半乳糖快速定量检测系统利用酶电化学传感技术 (ElectrochemicalSensing Technology)，其外观示意图如图1所示，该系统主要采用可抛弃干式酵素电极仪技术，利用经人体肝脏代谢的半乳糖或其代谢物与酵素发生电化学反应而产生微电流，再藉由微电流的量测，测得半乳糖数值，并藉由该数值评估该肝功能剩余情形，惟本案的半乳糖快速定量检测系统不限于评估肝功能，还可测量有关于半乳糖的相关疾病，例如新生儿的半乳糖血症 (galactosemia)，且本发明所述的半乳糖进一步包括半乳糖及其衍生物。

实施例1半乳糖快速定量检测系统使用方法

1-1半乳糖检测试纸的使用

半乳糖检测试纸分别封装于铝箔包中，并储存在4℃～10℃(39.2°F～ 51.2°F)温度下冷藏。使用前需回温20分钟，开封后的半乳糖检测试纸需要在 30分钟内使用完毕，超过这个时间的试纸不能再使用，需丢弃。

1-2样本采集及准备

用户须先注射或使用半乳糖组合物，其中该半乳糖组合物内容为半乳糖含量为总量的1％至80％，较佳含量状态为总量的4％或40％，不添加或添加缓冲剂量的0或是0.001％～5％，不添加或添加抗氧化剂含量为总量的0或是 0.001～5％，以上含量系指重量百分比。选用缓冲剂与抗氧化剂，添加以下含量可调配成适当的配方；0.01M～1M抗氧化剂选自于由维生素C、亚硫酸氢钠 (sodium bisulfite)、维生素A、维生素E、类黄酮、多酚、乙二胺四乙酸 ((Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA))、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、N,N-双[羧甲基]甘胺酸(NTA)所组成的群组，或选用0.01M～1M抗坏血酸盐缓冲剂(ascorbic acid buffer)、柠檬酸缓冲剂(citrate buffer)、磷酸缓冲剂(phosphatebuffer)、醋酸缓冲剂(acetate buffer)、碳酸缓冲剂(carbonate buffer)及三乙醇胺缓冲剂(triethanolamine buffer)所组成的群组，调整酸碱度值为4.0至9.0。而添加 0.01％柠檬酸缓冲剂(citrate buffer)，0.5％亚硫酸氢钠(sodiumbisulfite)酸碱度值为4.5，获得稳定的配方。在使用上述半乳糖组合物60分钟后，先以肥皂和温水清洗手指并擦干，采体液前用酒精棉片擦试指尖，需等指尖完全干燥后，使用体液采集装置取得体液样品，且应避免过度挤压体液采集部分。

1-3使用程序

(1)密码卡校正

为了测得正确的半乳糖值，在每一次使用新的一盒半乳糖试纸时，应重新校正半乳糖测量仪。校正时，只许使用附于该盒的密码卡。并确认密码卡密码及所用的半乳糖检测试纸盒上的密码相同，之后将密码卡的接触电极插入半乳糖测量仪密码卡插槽。将半乳糖试纸插入测试仪的试纸插槽后，测量仪会自动开机，且在屏幕显示出如图10所示的图案。用户须确认此密码与密码卡相同，随后取出密码卡，如此校正即完成，便可进行半乳糖测试。

(2)检测半乳糖

取将试纸插入测量仪的试纸插入孔处后，测量仪即自动开机，并于屏幕显示如图11所示的图案，用户确认屏幕密码与试纸盒的密码相同，待屏幕闪烁滴血符号

即可采血。

采集体液前需用酒精棉片擦拭指尖，待完全干燥后，以体液采集装置，取得体液样品。将体液轻触试纸的吸体液口，试纸即自动吸入体液至反应区，待看见试纸反应区透明试窗完全呈现体液颜色并听见“哔”声，即可移开指尖体液样品。量测完毕时(约1分钟)，即会在屏幕显示出半乳糖值。测试完毕后，取出试纸，并妥善丢弃；若不连续测试，三分钟后测量仪会自动关机。

实施例2检测系统原理与测试

本发明主要提供一种藉由半乳糖快速定量检测系统量测体液半乳糖含量，系让受试者使用前述的半乳糖组合物，该半乳糖组合物经由人体肝脏代谢后，于血液中产生半乳糖或其代谢物，受试者以指尖采血得到一样品，将该样品滴入本发明的试纸，由于该试纸中含有酵素，可与血液中半乳糖或其代谢物产生电化学反应而产生电流，将试纸插入本发明的测量仪，测量仪透过检测试纸的电流讯号测量受试者体内的半乳糖含量，藉此监控受试者的健康状况，因为该方法检测过程简单，可大幅降低以往检测半乳糖所耗的时间，亦不失其准确度。

图2是显示根据本发明的实施例而绘示的半乳糖检测系统方块示意图，此系统包含本发明的一试纸100以及一测量仪200。测量仪200包含用以对外连接的连接器210、用于换算浓度的计算单元211、一模拟数字转换器212、一处理器213及一显示器214。当电源单元215通过连接器210施加一讯号(较佳讯号为方波讯号，其频率为1KHz～22KHz；电压为50mV～5V，较佳的该电压为 300mV～800mV)到试纸100后，样品中半乳糖或其代谢物与试纸中的酵素发生电化学反应产生一电化学讯息，该讯号会与该电化学讯号作用产生一相应的反应讯号，通过连接器210传送该相应的反应讯号到测量仪200的计算单元211。然后，计算单元211会计算该相应的反应讯号，并将该相应的反应讯号输出到模拟数字转换器(analog todigital converter，简称ADC)212，模拟数字转换器212 会将该相应的反应讯号转换为一数字化的反应讯号，此数字化的反应讯号经由处理器213进行进一步处理及/或经由显示器214将显示测量结果。此外，该数字化反应讯号可传送至一数字终端机300，像是透过蓝芽、无线讯号等方式将半乳糖浓度讯号传送至手机或是计算机。

2-1准确度测试

首先准备5种不同浓度的半乳糖样品(分别为200μg/mL、500μg/mL、 900μg/mL、1200μg/mL及1500μg/mL)，各自取24组，并将静脉血液作为体液样品的具体实施例分别加入其中，再以本发明所请的测量仪测试其浓度数值，并计算其平均(μg/mL)、标准偏差(standard deviation,S.D)及变异系数(coefficient of variation,％C.V.)，制成回归分析图(见图3)。其中检测环境为室温(25±5℃)，相对湿度为20％至60％。如图3所示，本发明的测试仪读取数值与实际半乳糖浓度有高达0.98的高度相关系数，代表本发明的测试仪有高度准确性。

2-2精密度测试

首先在检测环境为室温(25±5℃)，相对湿度为20％至60％准备5种不同浓度的半乳糖样品(分别为200μg/mL、500μg/mL、900μg/mL、1200μg/mL及1500μg/mL)，各自取3组，并将静脉血液作为体液样品的具体实施例分别加入其中，再以本发明所请的测量仪测试其浓度数值，然后重复做8天，并且计算浓度数值的平均及变异系数(coefficient ofvariation,％C.V.)的平均(如表1所示)，由表1数据可知，5种浓度8天的变异系数平均值介于6.5-7.5之间，代表该测量仪有高度精密度。

表1半乳糖快速检测系统精密度测试结果

综上所述，本发明的半乳糖检测系统使用过程简便且快速，是因为透过本发明的半乳糖组合物配方，使半乳糖快速经由人体肝脏代谢，使血液或体液中含有半乳糖或其代谢物，再以指尖采血，又当采集的样品与试纸中的酵素发生电化学反应，并以本发明的测量仪检测，仅需花费1分钟的读取时间，不需要再行制作检体，大幅的减少使用者的测量半乳糖的步骤，进而缩短测量时间，因此本发明提供本领域一个快速、简便又有高准确性的半乳糖测量方法，以供需要检测半乳糖的患者使用。

实施例3检验试纸

图4系依照本发明的一实施例的一种试纸示意图。本实施例的试纸100包括一绝缘基板110、一电极单元120、一第一绝缘隔片130及一第二绝缘隔片140，试纸中内含酵素可与样品中的半乳糖或其代谢物产生电化学反应。

绝缘基板110为具有平整的表面、具有电绝缘性以及可耐40℃～120℃的耐热能力的基材，其材料可包含聚氯乙烯(PVC)、玻璃纤维(FR-4)、聚酯(polyester suphone)、电木板、聚对苯二甲酸二乙酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚苯乙烯(PS)、玻璃板、陶瓷或上述材料的任意组合。

电极单元120配置于绝缘基板110上，并包括相对的一第一端122与一第二端124。电极单元120可由多个彼此之间相互绝缘的电极所组成，其材料可为任何导电物质，例如钯胶、铂胶、金胶、钛胶、碳胶、银胶、铜胶、金银混合胶、碳银混合胶、或上述导电材料的任意组合。在一实施例中，电极单元120系由一导电碳粉层或是金属层所构成。又一实施例中，电极单元120系由一导电银胶层及位于其上的一导电碳粉层所组成，其中该导电碳粉层的阻抗一般远大于导电银胶层或其他金属胶层。

而第一绝缘隔片130材料可包含但不限于聚氯乙烯绝缘胶带、乙烯对苯二甲酸酯绝缘胶带、热干燥型绝缘漆或紫外光固化型绝缘漆，其覆盖部分的电极单元120(也就是部分的第一端122)且包括位于第一绝缘隔片130的一第一边缘132的一反应区流道134。其中第一端122露出于反应区流道134，体液样品(例如是血液)能够透过毛细作用填入反应区流道134，以进行后续的电化学反应。反应区流道134的两长边呈阶梯状，并且在靠近第一边缘132处的宽度大于远离第一边缘132处的宽度。

配置于第一绝缘隔片130的反应区流道134内至少具有一反应层150，其至少覆盖位于反应区流道134中的电极单元120且包含至少含有半乳糖酶与导电介质的成分，用以与体液样品(例如是血液)产生化学反应。其中反应层150 更含有半乳糖酶及导电介质测量区。

反应层150的组成可以但不限于酶、辅酶、导电介质、缓冲剂、安定剂或界面活性剂。其中导电介质系用以接收活化物质与体液样品反应后所产生的电子，并将该电子经由电极单元120传导到测量仪200，其包含但不限于二茂铁 (Ferrocene)、二茂铁盐(ferrocenium)、亚甲蓝(methylene blue)、三乙腈基三氯化钌(tris(acetonitrile)ruthenium trichloride)、2,5-二羟基苯醌 (2,5-dihydroxybenzoquinone)、吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate)、四硫富瓦烯(tetrathiafulvalene)、四氰基奎诺二甲烷(tetra-cyano-quino-dimethane)、甲基紫精(methyl viologen)、甲苯胺蓝(toluidineblue)、5,6-二胺基-1，10-邻二氮杂菲 (5,6-diamino-1,10-phenanthroline)、[M(bpy)3]2+(M＝Ru or Os；BPY＝2,2’-二吡啶(2,2′-bipyridine))。又导电介质可为金属离子化合物该金属离子化合物包含以金属离子藉由电子及电荷吸引关系而成为的金属盐类并可以于水溶液中解离，可为但不限于MgCl₂、BeCl₂、CaCl₂、SrCl₂、BaCl₂或其组合；该缓冲剂包含但不限于Tris、Tris-HCl、PBS、MES，CHES、Borate、Universal buffer mixtures (CPB)、MOPS、TES、HEPES、TAPSO、Tricine、Bicine、TAPS的中性及碱性缓冲剂；该安定剂系包含但不限于木糖醇、甘露醇、聚木糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、海藻糖、PEG、PVA、PEO、甲基纤维素(Methocel)、琼脂糖(agarose)、溶胶凝胶(sol-gel)、胶原(collagen)、壳聚糖(chitosan)、BSA、酪蛋白(casein)、再生蛋白(neo protein)，胺基酸或其任一组合；该界面活性剂，包含但不限于阳离子界面活性剂、阴离子界面活性剂、中性离子界面活性剂或非离子界面活性剂。

另外，本发明的试纸的第二绝缘隔片140是覆盖于第一绝缘隔片130、部分的电极单元120及部分的绝缘基板110。由于第二绝缘隔片140完全覆盖在第一绝缘隔片130的反应区流道134上，使得反应区流道134的上、下、左、右分别被第二绝缘隔片140、绝缘基板110、第一绝缘隔片130在反应区流道134旁的三壁面包围而形成五面封闭的管形。当体液样品透过试纸100的采体液样品口进入反应区流道134时，体液样品在反应区流道134内的附着力会大于体液样品的内聚力，而使得体液样品持续前进。

更进一步地来说，第一绝缘隔片130的第一边缘132、第二绝缘隔片140的一第二边缘142及绝缘基板110的同侧边缘呈现一个外凸的弧形，绝缘基板110 的此边缘相对反应区流道134前段位置呈内凹结构，试纸100利用第二边缘142 的外凸结构及绝缘基板110相对反应区流道134前段位置的内凹结构破坏体液的内聚力，并搭配毛细现象以达到快速进体液样品的功能。还有，第二绝缘隔片140更包含一通气孔144，其位于较远离第二边缘142的位置，也就是位于第一绝缘隔片130的反应区流道134的末端。通气孔144用以排出反应区流道134内的气体，以避免体液样品被气泡堵住而无法在反应区流道134内顺利前进。

其中，由于试纸内半乳糖酵素的蛋白质不稳定，无法在碱性环境及干燥的状态下保存，据此，半乳糖酵素皆以酸性的状态并以溶液保存，但在酸性的硫酸胺溶液下保存时间非常短，一旦干燥即失去活性，故无法成为固态方式存在，然而透过本发明的试纸的上述配方与其结构，使试纸中的酵素不只可于酸性环境下保存，亦可在中性及碱性环境方式固化及保存，同时可使酵素于干燥状态下仍然保持活性，长期保存其中，是故，本发明的试纸藉由上述的配方突破以往限制，使酵素可被固定化及干燥化，有效将酵素干燥于试片上并仍保有活性。

3-1试纸检验体积检测

图5为一般滤纸血液体积分析，并以血液作为体液样品的具体实施例，由结果可知使用滤纸至少需取30μL的指尖血体积才能确保误差小于15％。而本申请的试纸则可以较小体积做检测，实验方法为先准备3种浓度的半乳糖(分别为 200μg/mL、900μg/mL及1500μg/mL)，每个浓度各自会以1、2、5、7及10μL容量检测其数据值(见表2)，各自重复3次，并计算其平均(μg/mL)、标准偏差 (standard deviation,S.D)及变异系数(coefficient ofvariation,％C.V.)。其中浓度在 250μg/mL以下的半乳糖，可接受的平均C.V为小于20％；而浓度在251至 1500μg/mL，可接受的平均C.V.为小于15％。由表2结果可知，浓度200μg/mL的半乳糖各体积的平均C.V为3.03～8.15％，小于15％；而900μg/mL及1500μg/mL 的半乳糖各体积的平均C.V为3.14～6.54％，都小于20％，故本检测试纸可检测体积≧1μL的半乳糖。

表2半乳糖快速检测系统检验体积检测结果

3-2试纸长期稳定度测试

为评估试纸，于严酷环境下，推测其于4℃环境下的保存天数。

准备5种浓度的半乳糖样品(分别为200μg/mL、500μg/mL、1200μg/mL、 900μg/mL及1500μg/mL)，分别分成3组，分别是30℃、40℃与45℃的存放环境，并逐一测量其半乳糖读数。其中浓度在250μg/mL以下的半乳糖，可接受的平均 C.V为小于20％；而浓度在251至1500μg/mL，可接受的平均C.V.为小于15％；而相关系数(R)需大于0.9。由图6的结果可知，于4℃可存放最久(545.32天)，30℃则是30天，40℃为11天，45℃则是7天，本发明的试纸较佳的存放环境可存放于4℃～10℃。由此可知，本试纸现已可储存于4℃下稳定180天，室温稳定60天；加速性试验预估4℃下稳定545天。

3-3红细胞压积评估测试(Hematocrit Evaluation Test)

为检测试纸能否在正常范围内检测不同红细胞压积(Hematocrit,HCT)的样品。先准备5种不同浓度的半乳糖血液样品(分别为200μg/mL、450μg/mL、 800μg/mL、1150μg/mL及1500μg/mL)，并各自准备20％、30％、40％、50％及60％范围的HCT样品，并逐一测量其半乳糖读数。其中浓度在250μg/mL以下的半乳糖，可接受的平均C.V为小于20％；而浓度在251至1500μg/mL，可接受的平均 C.V.为小于15％；而相关系数(R)需大于0.9。结果如表3和表4所示， 450～1500μg/mL的平均C.V.皆小于15％；200μg/mL的平均C.V小于20％，因此本试验试纸至少可测试20％～60％血容性范围的血液样品。

表3红细胞压积测试结果

表4红细胞压积测试结果(续)

3-4重复性测试(Repeatability test)

为评估半乳糖检测系统的结果是否具有重复性，进行重复性测试。该测试会准备5种不同浓度的半乳糖(分别为200μg/mL、500μg/mL、900μg/mL、1200μg/mL及1500μg/mL)加入血液样品中，每种浓度将会被3台测量仪测试，而每一种测量仪会重复测量6次。浓度250μg/mL以下的半乳糖平均C.V.需在20％以下，251-1500μg/mL的半乳糖平均C.V.需在15％以下。表5显示500～1500μg/mL 的平均CV在7.12～9.83％之间，小于15％；200μg/mL的平均CV为14.58％，小于 20％，故本发明的半乳糖快速定量检测系统的结果具有重复性。

表5重复性测试结果

综上所述，本发明的试纸可检测最小体积为1μL的体液样品，且由于前述的酶与其配方，使本发明的试纸可于室温下存放60天，于4℃下存放180天，克服习知半乳糖试纸保存不易的技术障碍，且因本发明试纸可检验体积最小为 1μL，可让受试者免于每次检测造成大伤口的不适，又同时保有检测结果的高度准确性，提供半乳糖受试者一较佳的使用工具。

实施例4以半乳糖快速定量检测系统判断肝功能

4-1口服半乳糖OGSP结果与静脉注射半乳糖的GSP结果比较

图7、图8为127位受试者(56位肝功能正常与71位肝功能受损)以静脉注射半乳糖的GSP结果与口服半乳糖的OGSP相关性，依据Digest 1992；52:222-231建议，由受试者以静脉注射半乳糖的GSP数值(GSP)将受试者分为3组，以GSP< 280μg/ml定义受试者为肝功能正常，GSP介于280～480μg/ml定义受试者为肝功能中度受损，GSP>480μg/ml定义受试者为肝功能严重受损。根据图7、图8结果，口服半乳糖的OGSP数值比静脉注射半乳糖的GSP数值更高，且口服半乳糖的OGSP数值随着肝功能受损的严重度而增加，且，OGSP与GSP呈正相关性。肝功能正常组的受试者口服半乳糖OGSP数值为318±27μg/ml(平均值±标准误SE)，最低值为18μg/ml，最高值为887μg/ml；肝功能轻度或中度受损的受试者口服半乳糖OGSP数值为590±40μg/ml(平均值±标准误SE)，最低值为 294μg/ml，最高值为1282μg/ml；肝功能严重受损的受试者口服半乳糖OGSP 数值约为777±48μg/ml(平均值±标准误SE)，最低值为293μg/ml，最高值为1499 μg/ml。表6结果显示3组受试者以静脉注射半乳糖的GSP结果与口服半乳糖的 OGSP结果，结果显示口服半乳糖的OGSP数值随着肝功能受损的严重度而增加，特别的是，口服半乳糖的OGSP数值比静脉注射半乳糖的GSP数值更高。根据图7、图8与表6结果可以判断，肝功能正常组的受试者口服半乳糖OGSP数值主要范围(平均值±2倍标准误SE)约为264～372μg/ml，肝功能轻度或中度受损的受试者口服半乳糖OGSP主要范围(平均值±2倍标准误SE)约为510～670 μg/ml，肝功能严重受损的受试者口服半乳糖OGSP主要范围(平均值±2倍标准误 SE)约为介于681μg/ml与873μg/ml之间。即使受试者结果因个体差异有所不同，肝功能正常组的受试者口服半乳糖OGSP数值通常不超过670μg/ml，肝功能受损受试者的OGSP数值会大于370μg/ml，因此受试者的OGSP数值大于370 μg/ml应接受进一步的肝脏功能检测。除了上述静脉注射方式，以其他注射方式或是投药方式也可获得相似结果。

表6、受试者静脉注射GSP结果与口服半乳糖的OGSP结果(平均值±标准误SE)

***P<0.005(ANOVA&LSD分析)

实施例5新生儿的半乳糖血症(Galactosemia)筛查

半乳糖血症为遗传性疾病，归因于病患没有足够的半乳糖分解酶，因此半乳糖堆积于体内，导致病患产生嗜睡、呕吐、腹泻、不能正常生长以及黄疸等症状。经由新生儿筛查可以在婴儿食用母乳前确定，不会有不良影响。本发明的半乳糖测量仪也可用于新生儿的半乳糖血症筛查。由于新生儿筛查的检验不依赖蛋白质或是乳糖的消化，而是采用婴儿的第一个血液样品，因此做此筛检不须先服用本发明的半乳糖组合物，且系采脚尖采血，当血液样品结果侦测出半乳糖数值大于100μg/ml即代表该新生儿有半乳糖血症的风险，需做进一步检查。

实施例6半自动化手臂操作分析

图9为半乳糖单点法使用半自动化机器手臂分析传统酵素滤纸方法与半乳糖快速定量检测系统进行比较，并分别以静脉注射半乳糖组合物与口服半乳糖组合物两种方式进行，其中静脉注射半乳糖组合物以传统酵素滤纸方法与本案半乳糖快速定量检测系统的相关系数为0.963，而口服半乳糖组合物的相关系数为0.927。总体来说，不论是以口服或是静脉注射都具有高度相关性，其相关系数皆达0.9以上，故本发明的半乳糖快速定量检测系统可供业者量产。

综上所述，本发明所提供的一种半乳糖快速定量检测系统，经过准确度及精密度测试，且可用于判断肝功能以及半乳糖相关疾病，例如，例如新生儿的半乳糖血症筛查，以供医疗人员或是病患判断其身体状态，并依此判断是否需做进一步检查。

Claims

1.一种半乳糖快速定量检测系统，其包括：

一半乳糖组合物，包含半乳糖、缓冲剂及0～99％的抗氧化剂，进入体内经肝脏代谢后，产生一体液样品；

一试纸或一滤纸，包含一酵素，该酵素会与该体液样品反应产生一电化学讯息；以及

一测量仪，包含：

一电源单元，提供一讯号；

一连接器，接收该电源单元所提供的该讯号并将该讯号传送到该试纸或该滤纸上，该讯号与该电化学讯号作用产生一相应的反应讯号后，将该相应的反应讯号传送到该测量仪；

一计算单元，计算该相应的反应讯号；

一模拟数字转换器，接收由该计算单元计算过的该相应的反应讯号，将计算过的该相应的反应讯号转换成一数字化反应讯号；

一处理器，处理该数字化反应讯号；及一显示器，显示该数字化反应讯号；

其中该数字化反应讯号可被传送至一数字终端机。

2.如权利要求1所述的半乳糖快速定量检测系统，其中该缓冲剂系选自于抗坏血酸盐缓冲剂(ascorbic acid buffer)、柠檬酸缓冲剂(citrate buffer)、磷酸缓冲剂(phosphate buffer)、醋酸缓冲剂(acetate buffer)、碳酸缓冲剂(carbonate buffer)及三乙醇胺缓冲剂(triethanolamine buffer)所组成的群组。

3.如权利要求1所述的半乳糖快速定量检测系统，其中该抗氧化剂系选自于由维生素C或/和亚硫酸氢钠(sodium bisulfite)、维生素A、维生素E、类黄酮、多酚、乙二胺四乙酸((Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA))、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、N,N-双[羧甲基]甘胺酸(NTA)所组成的群组。

4.如权利要求1所述的半乳糖快速定量检测系统，其中该半乳糖至少包含D-(+)-半乳糖、L-(-)-半乳糖、稳定同位素半乳糖、环状半乳糖或半乳糖衍生物。

5.如权利要求1所述的半乳糖快速定量检测系统，其中该半乳糖组合物系以口服或是注射、喷雾吸入及口含、直肠、栓剂或是其他临床适合方式给予。

6.如权利要求5所述的半乳糖快速定量检测系统，其中该口服方式系透过让使用者先使用该半乳糖组合物，接着检测体液中的半乳糖含量的方式测量体内中的半乳糖含量。

7.如权利要求5所述的半乳糖快速定量检测系统，其中该注射方式系透过让使用者先注射该半乳糖组合物进体内，接着检测体液中的半乳糖含量的方式测量体内中的半乳糖含量。

8.一种如权利要求1所述的半乳糖快速定量检测系统的试纸，包括：

一绝缘基板；

一电极单元，配置于该绝缘基板上；

一第一绝缘隔片，覆盖部分的该电极单元且包括位于该第一绝缘隔片的一第一边缘的一反应区流道，其中部分的该电极单元露出于该反应区流道；以及

一第二绝缘隔片，包含一第二边缘，该第二绝缘隔片覆盖于该第一绝缘隔片的该反应区交流道上，该第二绝缘隔片的该第二边缘与该第一绝缘隔片的该第一边缘及该绝缘基板的同侧边缘呈现外凸的弧形，该绝缘基板相对该反应区交流道前段位置呈现内凹结构，其中该反应区交流道内含有一反应层，该反应层覆盖位于该反应区流道中的该电极单元且包含一酵素与一导电介质，用以与体液样品产生电化学反应；

其中该试纸系利用该第二绝缘隔片的该第二边缘的外凸的弧形与该绝缘基板相对该反应区交流道前段位置的内凹结构破坏体液的内聚力，搭配毛细现象以达到快速进体液样品；

其中该酵素可氧化、还原、分解或代谢半乳糖。

9.如权利要求8所述的的试纸，其中该绝缘基板系由选自于由聚氯乙烯(PVC)、玻璃纤维(FR-4)、聚酯(polyester suphone)、电木板、聚对苯二甲酸二乙酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚苯乙烯(PS)、玻璃板及陶瓷所组成的群组。

10.如权利要求8所述的试纸，其中该电极单元系由选自于钯胶、铂胶、金胶、钛胶、碳胶、银胶、铜胶、金银混合胶及碳银混合胶所组成的群组。

11.如权利要求8所述的试纸，其中该反应层系选自于酵素、辅酶、导电介质、缓冲剂、安定剂与界面活性剂所组成的群组。

12.如权利要求8所述的试纸，其中该导电介质系选自于由二茂铁(Ferrocene)、二茂铁盐(ferrocenium)、亚甲蓝(methylene blue)、三乙腈基三氯化钌(tris(acetonitrile)ruthenium trichloride)、2,5-二羟基苯醌(2,5-dihydroxybenzoquinone)、吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate)、四硫富瓦烯(tetrathiafulvalene)、四氰基奎诺二甲烷(tetra-cyano-quino-dimethane)、甲基紫精(methyl viologen)、甲苯胺蓝(toluidineblue)、5,6-二胺基-1，10-邻二氮杂菲(5,6-diamino-1,10-phenanthroline)、[M(bpy)3]2+(M＝Ru or Os；BPY＝2,2’-二吡啶(2,2′-bipyridine))所组成的群组。

13.如权利要求8所述的试纸，其中该导电介质可为金属离子化合物，该金属离子化合物系选自于由MgCl₂、BeCl₂、CaCl₂、SrCl₂、BaCl₂及其组合所组成的群组。

14.如权利要求11所述的试纸，其中该缓冲剂系选自于由Tris、Tris-HCl、PBS、MES，CHES、Borate、Universal buffer mixtures(CPB)、MOPS、TES、HEPES、TAPSO、Tricine、Bicine和TAPS组成的群组。

15.如权利要求11所述的试纸，其中该安定剂系选自于由木糖醇、甘露醇、聚木糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、海藻糖、PEG、PVA、PEO、甲基纤维素(Methocel)、琼脂糖(agarose)、溶胶凝胶(sol-gel)、胶原(collagen)、壳聚糖(chitosan)、BSA、酪蛋白(casein)、再生蛋白(neo protein)，胺基酸或其任一组合所组成的群组。

16.如权利要求11所述的试纸，其中该界面活性剂系选自于由阳离子界面活性剂、阴离子界面活性剂，中性离子界面活性剂和非离子界面活性剂所组成的群组。

17.如权利要求8所述的试纸，其中该试纸的半乳糖测试范围为50-2000μg/ml。

18.如权利要求8所述的试纸，其中该酵素可被固定化及干燥化，并保存于酸碱中性环境。

19.一种如权利要求1所述的半乳糖快速定量检测系统的应用，其中该半乳糖快速定量检测系统可用于测量血中半乳糖浓度以检测新生儿半乳糖血症。

20.如权利要求19所述的应用，其中该半乳糖快速定量检测系统提供监控半乳糖值及肝能不全患者或专业人员测量。

21.如权利要求19所述的应用，其中该半乳糖快速定量检测系统系以半乳糖浓度判断肝脏剩余功能。