DE3751631T2

DE3751631T2 - Das Streptomyces-Gal-Operon

Info

Publication number: DE3751631T2
Application number: DE3751631T
Authority: DE
Inventors: Craig W Adams; Mary Ellen Brawner; James Allan Fornwald; Francis John Schmidt
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1986-02-28
Filing date: 1987-02-26
Publication date: 1996-05-02
Anticipated expiration: 2007-02-27
Also published as: EP0235112A3; DK105287A; DE3751631D1; AU604475B2; PT84375A; PT84375B; EP0235112B1; ES2080719T3; CA1307481C; JP3037698B2; DK105287D0; JPH1066573A; JPS62265987A; EP0235112A2; GR3018626T3; ATE131535T1; AU6926787A; JP2984239B2

Description

Verweis auf verwandte Anmeldungen

Diese Anmeldung ist eine Teilfortführungsanmeldung der am 28. Februar 1986 eingereichten anhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 834,706.

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül, das das gal- Operon von Streptomyces umfaßt.
Hodgson, J. Gen. Micro. 128 (1982), 2417-2430, berichten über ein Glucose- Repressionssystem in Streptomyces coelicolor A3(2), das eine Repression auf der Ebene der Transkription des Arabinose-Aufnahmesystems, eines der Glycerin-Aufnahmesysteme und ferner eine Repression des Galactose-Aufnahmesystems in Wildtyp- Stämmen ermöglicht. Der Galactose-Metabolismus von S. coelicolor A3(2) wird von Hodgson allerdings nicht beschrieben.
Okeda et al., Mol. Gen. Genet. 196 (1984), 501-507, berichten, daß die Glucose-Kinaseaktivität, 2-Desoxyglucose-Empfindlichkeit, Glucose-Verwertung und Glucose-Repression in S. coelicolor A3(2) glk (Glucose-Kinase)-Mutanten, die mit einem 3,5 kb-DNA-Fragment transformiert waren, das das von S. coelicolor in einen Phagenvektor clonierte glk-Gen enthielt, wiederhergestellt wurden.
Seno et al., Mol. Gen. Genet. 193 (1984), 119-128, beschreiben das Glycerin-(gyl)-Operon von Streptomyces coelicolor und stellen fest, daß dieses Operon durch Substrat induziert und durch Katabolite reprimiert werden kann.
Debouck et al., Nucleic Acids Res. 13(6) (1985), 1841-1853, berichten, daß das gal-Operon von E. coli aus drei strukturell aufeinanderfolgenden Genen besteht, die die für den Galactose-Metabolismus erforderlichen Enzyme codieren, d. h., galE (Uridindiphosphogalactose-4-Epimerase), galT (Galactose-1-phosphaturidyltransferase) und galK (Galactokinase), daß diese Gene von einer polycistronischen mRNA in der Reihenfolge E, T und K exprimiert werden, daß es bekannt ist, daß die Expression des zum Promotor distalen galK Gens des Operons translational an das unmittelbar davor liegende galT-Gen gekoppelt ist, daß diese translationale Kopplung von einer strukturellen Überlappung zwischen dem Ende der galT-codierenden Sequenz und dem Ribosomenbindungsbereich von galK bewirkt wird und daß die translationale Kopplung von galT und galK die coordinierte Expression dieser Gene während des Galactose- Metabolismus gewährleistet.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine Streptomyces-gal-Operon-P2-Promotor-Expressionseinheit, einen P2-Promotor oder ein beliebiges funktionelles Derivat davon, sowie ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor, einen P1-Promotor-kontrollierten Bereich oder das vollständige gal-Operon oder ein regulierbares und funktionelles Derivat davon umfaßt.
Diese Erfindung stellt ein rekombinantes DNA-Molekül bereit, das das Streptomyces lividans-gal-Operon, das auf einem etwa 9 kb großen HindIII-SphI- Fragment auf der chromosomalen DNA von S. lividans 1326 liegt, oder ein Streptomyces-Derivat davon umfaßt, das in bezug auf die regulierbare Produktion der galT-, galE- und galK-Genprodukte im wesentlichen so wie das natürlich vorkommende Streptomyces-gal-Operon funktioniert, ein funktionelles Fremd-DNA-Molekül, das mit diesem Operon funktionell verbunden ist, einen rekombinanten DNA-Vektor, der dieses DNA-Molekül und gegebenenfalls zusätzlich ein Replicon umfaßt, ein Verfahren zur Herstellung einer mit diesem Vektor transformierten Wirtszelle, den so hergestellten transformierten Wirt, ein Verfahren zur Expression dieser funktionellen DNA-Sequenz, das die Züchtung eines so transformierten Wirts unter geeigneten Bedingungen umfaßt, so daß die funktionelle DNA-Sequenz exprimiert wird, und ein Verfahren zur Regulierung der Expression dieser funktionellen DNA-Sequenz, das die Züchtung des so transformierten Wirts unter Bedingungen, die diese Expression regulieren, umfaßt.
Diese Erfindung stellt ferner ein rekombinantes DNA-Molekül bereit, das die Streptomyces lividans-gal-Operon-P2-Promotor-Expressionseinheit, die auf einem etwa 9 kb großen HindIII-SphI-Fragment der eine NruI-Stelle aufweisenden chromosomalen DNA von S. lividans 1326 liegt, wobei die P2-Transkriptionsstartstelle etwa 1,25 kb stromabwärts der NruI-Stelle liegt, oder ein beliebiges Streptomyces-Derivat davon umfaßt, das in bezug auf die Produktion der galE- und galK-Genprodukte im wesentlichen so wie die natürlich vorkommende Einheit funktioniert, ein funktionelles Fremd-DNA- Molekül, das mit dieser Einheit funktionell verbunden ist, einen rekombinanten DNA Vektor, der dieses DNA-Molekül und gegebenenfalls zusätzlich ein Replicon umfaßt, ein Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, die mit diesem Vektor transformiert ist, den so hergestellten transformierten Wirt, und ein Verfahren zur Expression dieser funktionellen DNA-Sequenz, das die Züchtung eines so transformierten Wirts unter geeigneten Bedingungen umfaßt, so daß die funktionelle DNA-Sequenz exprimiert wird.
Diese Erfindung stellt ferner ein rekombinantes DNA-Molekül bereit, das den vom Streptomyces lividans-gal-Operon-P1-Promotor regulierten Bereich, der auf einem etwa 9 kb großen HindIII-SphI-Fragment auf der eine NruI-Stelle aufweisenden chromosomalen DNA von S. lividans 1326 liegt, wobei die P1-Transkriptionsstartstelle etwa 0,10 kb stromabwärts der NruI-Stelle liegt, oder ein Streptomyces-Derivat davon umfaßt, das im Bezug auf die regulierbare Produktion der galT, galE- und galK- Genprodukte im wesentlichen so wie der natürlich vorkommende Bereich funktioniert, ein funktionelles Fremd-DNA-Molekül, das mit diesem DNA-Molekül funktionell verbunden ist, einen rekombinanten DNA-Vektor, der dieses DNA-Molekül und gegebenenfalls zusätzlich ein Replicon umfaßt, ein Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, die mit diesem Vektor transformiert ist, den durch dieses Verfahren hergestellten transformierten Wirt, und ein Verfahren zur Expression dieser funktionellen DNA-Sequenz, das die Züchtung eines so transformierten Wirts unter geeigneten Bedingungen umfaßt, so daß die funktionelle DNA-Sequenz exprimiert wird, und ein Verfahren zur Regulierung der Expression dieser funktionellen DNA-Sequenz, das die Züchtung eines so transformierten Wirts unter Bedingungen, die diese Expression regulieren, umfaßt.
Diese Erfindung stellt ferner ein rekombinantes DNA-Molekül bereit, das den Streptomyces lividans-gal-Operon-P1-Promotor, der auf einem etwa 9 kb großen HindIII-SphI-Fragment der eine NruI-Stelle aufweisenden chromosomalen DNA von S. lividans 1326 liegt, wobei die P1-Transkriptionsstartstelle etwa 0,10 kb stromabwärts der NruI-Stelle liegt, oder ein beliebiges Streptomyces-Derivat davon umfaßt, das in bezug auf die Ermöglichung der Bindung von RNA-Polymerase daran und die Transkription einer funktionellen DNA-Sequenz, die mit diesem Promotor funktionell verbunden ist, im wesentlichen so funktioniert wie der natürlich vorkommende Promotor, ein funktionelles Fremd-DNA-Molekül, das mit diesem DNA-Molekül funktionell verbunden ist, einen rekombinanten DNA-Vektor, der dieses Molekül und gegebenenfalls zusätzlich ein Replicon umfaßt, ein Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, die mit diesem Vektor transformiert ist, den durch dieses Verfahren hergestellten transformierten Wirt, ein Verfahren zur Expression dieser funktionellen DNA- Sequenz, das die Züchtung eines so transformierten Wirts unter geeigneten Bedingungen umfaßt, so daß die funktionelle DNA-Sequenz exprimiert wird und ein Verfahren zur Regulierung der Expression dieser funktionellen DNA-Sequenz, das die Züchtung eines so transformierten Wirts unter Bedingungen, die diese Expression regulieren, umfaßt.
Diese Erfindung betrifft ferner ein rekombinantes DNA-Molekül, das den Streptomyces lividans-gal-Operon-P2-Promotor, der auf einem etwa 9 kb großen HindIII-SphI-Fragment der eine NruI-Stelle aufweisenden chromosomalen DNA von S. lividans 1326 liegt, wobei die P2-Transkriptionsstartstelle etwa 1,25 kb stromabwärts der NruI-Stelle liegt, oder ein beliebiges Streptomyces-Derivat davon umfaßt, das in bezug auf die Ermöglichung der Bindung von RNA-Polymerase daran und die Transkription einer funktionellen DNA-Sequenz, die mit diesem Promotor funktionell verbunden ist, im wesentlichen so funktioniert wie der natürlich vorkommende Promotor, ein funktionelles Fremd-DNA-Molekül, das mit diesem Bereich funktionell verbunden ist, einen rekombinanten DNA-Vektor, der dieses Molekül und gegebenenfalls zusätzlich ein Replicon umfaßt, ein Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, die mit diesem Vektor transformiert ist, den durch dieses Verfahren hergestellten transformierten Wirt und ein Verfahren zur Expression dieser funktionellen DNA-Sequenz, das die Züchtung eines so transformierten Wirts unter geeigneten Bedingungen umfaßt, so daß die funktionelle DNA-Sequenz exprimiert wird.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt eine Restriktionskarte des Streptomyces lividans 1326-Galactose (gal)-Operons und zeigt ungefähr die Lage der Strukturgene und Promotoren innerhalb des Operons.
Figur 2 zeigt eine Restriktionskarte von Plasmid pK21.
Figur 3 zeigt einen Vergleich der Restriktionskarten des S. lividans-gal- Operons und eines das S. coelicolor-galK-Gen enthaltenden Restriktionsfragments.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Es ist kürzlich festgestellt worden, daß das Genom von Streptomyces ein Operon für den Galactosemetabolismus (d. h., ein gal-Operon) enthält, das drei Strukturgene (galT, galE und galK) und zwei Promotoren (P1 und P2) umfaßt. Das galT-Genprodukt wird als Galactose-1-phosphaturidyltransferase (Transferase), das galE-Genprodukt als Uridindiphosphogalactose-4-Epimerase (Epimerase) und das galK- Genprodukt als Galactose-1-Kinase (Galactokinase) bezeichnet. Die Funktion der galT-, galE- und galK-Genprodukte im Galactosemetabolismus von Streptomyces wird im nachstehenden Diagramm erläutert:
1. Galactose + ATP-Galactokinase
Galactose-1-phosphat + ADP
2. Galactose-1-phosphat + UDP-Glucosetransferase
UDP-Galactose + Glucose-1-phosphat
3. UDP-Galactoseepimerase UDP-Glucose
Der Begriff "Promotor" bezeichnet jeden Bereich stromaufwärts eines Strukturgens, der die Bindung der RNA-Polymerase und Transkription ermöglicht.
Der Begriff "Strukturgen" bezeichnet eine Polypeptid-codierende Sequenz, die als Matrize für die mRNA-Synthese dient.
Der Begriff "Operon" bezeichnet eine Gruppe von eng gekoppelten Genen, die für die Synthese eines oder einer Gruppe von Enzymen, die als Mitglieder eines Enzymsystems funktionell verbunden sind, verantwortlich ist. Ein Operon umfaßt ein Operatorgen, eine Reihe von Strukturgenen (die zur Zahl der Enzyme im System äquivalent sind) und ein Regulatorgen. Der Begriff "Operator" oder "Operatorgen" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die die Biosynthese des Strukturgens (der aufeinanderfolgenden Strukturgene) innerhalb eines Operons kontrolliert. Der Begriff "Regulatorgen" bezeichnet ein Gen, das das Operatorgen in einem Operon durch die Produktion eines Repressors, der entweder aktiv (Enzyminduktion) oder inaktiv (Enzymrepression) sein kann, kontrolliert. Die Transkription des Strukturgens (der Strukturgene) in einem Operon wird durch das Operatorgen ein- oder ausgeschaltet, das selber durch eine oder mehrere der drei nachstehend beschriebenen Möglichkeiten kontrolliert wird: 1) In einem induzierbaren Enzymsystem wird der Operator durch einen Repressor abgeschaltet, der durch das Regulatorgen produziert wird und durch einen Metaboliten oder eine Signalsubstanz (einen Induktor), die aus der Zelle oder von außerhalb der Zelle stammt, inaktiviert werden kann, so daß die Anwesenheit des Induktors die Aktivierung des Operons bewirkt, 2) in einem reprimierten Enzymsystem wird der Operator durch einen Repressor-Corepressor-Komplex abgeschaltet, der eine Kombination eines durch das Regulatorgen produzierten, inaktiven Repressors mit einem woanders produzierten Corepressor ist, so daß die Gegenwart des Corepressors das Operon inaktiviert oder 3) in einem aktivierten Gensystem wird der Promotor durch einen von einem Regulatorgen produzierten Aktivator, der durch einen Metaboliten oder eine Signalsubstanz aktiviert werden kann, eingeschaltet.
Das Streptomyces-gal-Operon ist im Genom von Streptomyces natürlich vorhanden.
Der Begriff "Streptomyces-gal-Operon" bezeichnet den Genombereich von Streptomyces, der den P1-Promotor, P2-Promotor, die galT-, galE- und galK- Strukturgene und alle anderen zur Transkription und Translation dieser Strukturgene erforderlichen regulatorischen Bereiche umfaßt.
Der Begriff "regulatorischer Bereich" bezeichnet eine DNA-Sequenz, beispielsweise einen Promotor oder Operator, die die Transkription eines Strukturgens reguliert.
Das nachstehende Modell wird zur Genexpression innerhalb des Streptomyces-gal-Operons vorgeschlagen. Der P1-Promotor ist ein Galactose-induzierbarer Promotor (d. h., er wird in Gegenwart von Galactose induziert und in Gegenwart von Glucose reprimiert). Gemäß den S1-Daten ist der P2-Promotor konstitutiv, d. h., er wird "eingeschaltet" ungeachtet der Gegenwart oder Abwesenheit von Galactose oder einer anderen Kohlenstoffquelle.
Eine Cosmidbank für Streptomyces lividans 1326-DNA wurde unter Verwendung von Cosmid pJW357 (das die Fähigkeit zur Replikation in Streptomyces sowie in E. coli codiert) konstruiert. Diese Bank wurde anschließend in E. coli K21 transfiziert, der ein Derivat des E. coli-Stamms MM294 ist, der eine Bacteriophagen P1- transduzierte Galactokinase (galK)-Mutation enthielt. Transfizierte Zellen wurden unter Medienbedingungen, unter denen sowohl auf die Gegenwart des Cosmids als auch die Gegenwart eines aktiven galK-Gens selektiert wird, plattiert. Schwach positive Kolonien wurden isoliert, und die von diesen Kolonien stammende Cosmid-DNA wurde in den Stamm K21 transformiert. Durch diese Transformationen wurden zwei Cosmide erhalten, die ein beständiges positives Wachstum mit Galactose als einziger Kohlenstoffquelle zeigten. Diese galK&spplus;-Cosmide wurden anschließend in Streptomyces lividans 1326-12K als Wirt transformiert, der anhand seiner Unfähigkeit auf Medium, das Galactose als einzige Kohlenstoffquelle enthielt, zu wachsen, isoliert worden war, wobei zur Selektion 2-Desoxygalactose verwendet wurde [vgl. Brawner et al., Gene 40 (1985), 191, im Druck]. Unter Bedingungen, die eine Unterscheidung zwischen Galactokinase-produzierenden und nicht produzierenden Stämmen ermöglichten, konnte nur eines der Cosmide den Wirt Streptomyces lividans 1326-12K in einen galK&spplus;-Wirt umwandeln. Weitere Untersuchungen zeigten, daß dieses Cosmid ein Gen mit Galactokinaseaktivität codiert. Weitere Untersuchungen, die eine DNA-Sequenzanalyse und Proteinuntersuchungen einschlossen, zeigten, daß dieses Streptomyces-Gen Homologie zu den E. coli- und Hefe- Galactokinasegenen aufwies. Untersuchungen der Regulation des Cosmid codierten Galactokinasegens zeigten, daß es so wie das chromosomal codierte Gen reguliert wurde.
Ein S. lividans-gal-Operon wurde ursprünglich aus einem etwa 9 Kilobasen (kb) großen Bereich von Streptomyces lividans 1326 isoliert. Der etwa 9 kb große Bereich von Streptomyces lividans 1326, der das Streptomyces-gal-Operon enthielt, ist im wesentlichen wie nachstehend in Tabelle A beschrieben kartiert worden. Der Begriff "im wesentlichen" meint, daß (1) es sich um ungefähre relative Positionen der Restriktionsstellen handelt, (2) eine oder mehrere Restriktionsstellen durch das Operon sonst nicht signifikant beeinflussende Mutationen verloren gehen oder entstehen können und (3) weitere Stellen für die angegebenen und insbesondere für nicht getestete Enzyme vorhanden sein können. Die hier verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich. Eine vollständige Beschreibung gibt Roberts in Nucleic Acids Res. 10(5) (1982), 117. Tabelle A Kartenposition Restriktionsenzym Lage (kb)
Figur 1 zeigt eine Restriktionskarte des Streptomyces lividans 1326-gal- Operons, die Lage der Strukturgene (galT, galE und galK) und die im Operon enthaltenen Promotoren (P1 und P2).
In bezug auf Tabelle A und Figur 1 entspricht die Lage der Promotoren und Strukturgene des Streptomyces lividans 1326-gal-Operons in der Restriktionskarte im wesentlichen der nachstehenden Darstellung von Tabelle B. Tabelle B Lage (kb) P1-Transkriptionsstartstelle galT-Translationsinitiationscodon P2-Transkriptionsstartstelle galE-Translationsinitiationscodon galK-Translationsinitiationscodon 3'-Ende von galK
Mikroorganismen der Gattung Streptomyces sind bisher als Quelle für Antibiotika in der pharmazeutischen Industrie verwendet worden. Daher sind die zur Erhöhung der Produktion von biologischen Produkten erforderlichen technischen Möglichkeiten, in denen Streptomyces als Vehikel zur Herstellung dieser Produkte verwendet wird, gegenwärtig verfügbar. Bevor jedoch Streptomyces als Vehikel zur Herstellung von bioaktiven Molekülen unter Verwendung der neuen DNA- Rekombinationsverfahren verwendet werden kann, müssen die E. coli-analogen regulatorischen Elemente in Streptomyces definiert werden. Diese regulatorischen Elemente schließen Ribosomenbindungsstellen und regulierte Transkriptionselemente ein.
Die Existenz eines galE-, galT- oder galK-Gens, Genprodukts oder gal- Operons in Streptomyces ist zuvor nicht beschrieben worden. Die vorliegende Erfindung, d. h., die Clonierung des Streptomyces-gal-Operons, ermöglicht die Konstruktion von regulierbaren Expressions-/Clonierungsvektoren in Streptomyces, anderen Actinomyceten und weiteren Wirtsorganismen. Die vorliegende Erfindung führte ferner zu der Erkenntnis, daß das Streptomyces-gal-Operon polycistronisch ist. Die vielleicht wichtigste Beobachtung bei der Clonierung des Streptomyces-gal-Operons ist die Auffindung von Sequenzen, die für die Regulierung des Streptomyces-galK-Gens wesentlich sind. Es kann eine direkte Analogie zur anfänglichen Verwendung des lac- Promotors von E. coli als Expressionssystem hergestellt werden. So verwendeten Brosius et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 6929-6933, die regulatorischen Elemente vom E. coli-lac-Promotor zur Regulierung der ungewöhnlich starken ribosomalen Promotoren von E. coli. Da die ribosomalen Promotoren des Streptomyces-gal- Operons wahrscheinlich ebenfalls ungewöhnlich stark sind, können mit diesen Promotoren für Streptomyces, andere Actinomyceten und weitere Wirtsorganismen geeignete regulierbare Expressionsvektoren konstruiert werden. Ferner wurde in der vorliegenden Erfindung unerwartet festgestellt, daß die zur Selektion auf E. coli-galK- Mutanten verwendete 2-Desoxygalactose-Selektion auch zur Selektion auf Streptomyces- galK-Mutanten verwendet werden kann [vgl. Brawner et al., Gene 40 (1985), 191, im Druck]. Ausgehend von diesem Befund sowie der Möglichkeit der Clonierung des Streptomyces-galK-Gens, Promotors und der regulatorischen Bereiche, die, wie hier beschrieben, zu dessen Transkription und Translation auf einem Cosmid erforderlich sind, kann somit durch homologe Rekombination ein beliebiges Strukturgen direkt in das chromosomale galK-Gen von Streptomyces inseriert werden. Durch diese Manipulation können Molekularbiologen bestimmte DNA-Fragmente stabil in das Streptomyces- Chromosom inserieren. Auf diese Weise können Forscher einen bestimmten Streptomyces-Stamm kennzeichnen oder markieren oder Expressionskassetten in den Organismus inserieren, ohne eine Antibiotika-Selektion, wie sie beispielsweise bisher für die meisten Streptomyces-Expressionsvektoren erforderlich war, durchführen zu müssen.
Diese Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül, das das Streptomyces lividans-gal-Operon oder irgendein regulierbares und funktionelles Streptomyces-Derivat davon umfaßt.
Mit "regulierbarem und funktionellem Derivat" ist jedes Derivat des Streptomyces-gal-Operons gemeint, das in bezug auf die regulierbare Produktion der galT-, galE- und galK-Genprodukte im wesentlichen in der gleichen Weise wie das natürlich vorkommende Streptomyces-gal-Operon funktioniert. Diese Derivate schließen partielle Sequenzen des gal-Operons sowie Derivate ein, die durch Modifikation der gal- Operon-codierenden Sequenz hergestellt werden. Im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Modifizierung des gal-Operons schließen beispielsweise eine Behandlung mit chemischen Mutagenen, Bestrahlung oder direkte genetische Manipulation, beispielsweise eine Insertion, Deletion oder Substitution von Nucleinsäuren unter Verwendung von Enzymen oder Rekombinationsverfahren, ein. Das natürlich vorkommende Streptomyces-gal-Operon kann aus jedem Galactose verwertenden Streptomyces- Stamm unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren isoliert werden. Zahlreiche Stämme von verschiedenen Streptomyces-Arten sind von vielen Quellen im Handel erhältlich. Die American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, kann beispielsweise etwa 400 verschiedene Streptomyces-Arten für Interessenten zur Verfügung stellen. Die Fähigkeit eines bestimmten Streptomyces-Stamms zur Galactose- Verwendung kann durch übliche Verfahren, beispielsweise durch Züchtung dieses Stamms auf einem Galactose als einzige Kohlenstoffquelle enthaltenden Medium, leicht ermittelt werden. Beispiele für bevorzugte Streptomyces-Arten, aus denen ein gal- Operon isoliert werden kann, sind S. lividans, S. coelicolor, S. azuraeus und S. albus, S. carzinostaticus, S. antifibrinolyticus und S. longisporus. S. lividans ist am meisten bevorzugt. Das Streptomyces-gal-Operon und kleinere Teile davon können als Nucleinsäuresonde verwendet werden, um homologe Sequenzen aus anderen Zellen und Organismen zu erhalten. Das Streptomyces-gal-Operon kann ferner als Selektionsmarker in einer geeigneten Wirtsmutante und zur Bereitstellung von regulatorischen Elementen verwendet werden. Mit einer "geeigneten Wirtsmutante" ist ein Wirt gemeint, der keine Galactose verwertet, da er (a) kein gal-Operon enthält, (b) ein nicht-funktionelles gal- Operon enthält oder (c) einen Defekt innerhalb eines homologen Strukturgens oder eines regulatorischen Bereichs, der im Streptomyces-gal-Operon enthalten ist, beispielsweise einen defekten P1-Promotor, P2-Promotor, ein defektes galT-Gen, galK-Gen und/oder galE-Gen, aufweist. Daher kann ein durch übliche Verfahren herstellbares rekombinantes DNA-Molekül (das das Streptomyces-gal-Operon und eine damit funktionell verbundene funktionelle Fremd-DNA-Sequenz enthält) durch übliche Verfahren, in denen der Einbau in das Wirtsgenom durch homologe Rekombination erfolgt, in eine geeignete Wirtsmutante transformiert werden, damit die funktionelle Fremd-DNA-Sequenz regulierbar exprimiert werden kann, ohne daß eine kostspielige Antibiotika-Selektion durchgeführt werden muß. Dieses Operon kann daher auch in rekombinante DNA- Expressionsvektoren zur regulierbaren Expression einer mit diesem Operon funktionell verbundenen funktionellen Fremd-DNA-Sequenz in einer geeigneten, mit diesem Vektor transformierten Wirtsmutante eingebaut werden, ohne daß eine kostspielige Antibiotika- Selektion erforderlich ist. Dieses Operon kann ferner verwendet werden, um diese Zellen, Viren und Mikroorganismen, beispielsweise Streptomyces-Stämme, andere Actinomyceten und weitere prokaryotische Organismen, beispielsweise Galactose nicht verwertende gal&supmin;-E. coli-Stämme, zu Galactose-verwertenden Stämmen zu transformieren. Diese Transformation kann pleiotrope Wirkungen auf den transformierten Wirt haben. Der Begriff "funktionelle DNA-Sequenz" meint jeden direkt oder indirekt von Streptomyces oder einer beliebigen anderen Quelle stammenden diskreten Bereich der DNA, der in einem damit transformierten Wirtsorganismus als Genexpressionseinheit, Strukturgen, Promotor oder regulatorischer Bereich funktionell aktiv ist. Bevorzugte funktionelle DNA-Sequenzen codieren beispielsweise pharmazeutisch wichtige Polypeptide, beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung darauf, Insulin, Wachstumshormon, Gewebe-Plasminogenaktivator, alpha-1-anti-Trypsin oder zur Impfstoffherstellung verwendete Antigene. Der Begriff "funktionelle Fremd-DNA- Sequenz" bezeichnet eine funktionelle DNA-Sequenz, die nicht vom Streptomyces gal- Operon-codierenden Bereich stammt.
Die Erfindung betrifft ferner ein rekombinantes DNA-Molekül, das die Streptomyces-gal-Operon-P2-Promotor-Expressionseinheit oder ein beliebiges funktionelles Derivat davon umfaßt. Mit dem Begriff "P2-Promotor-Expressionseinheit" ist der Bereich des Streptomyces-gal-Operons gemeint, der den Streptomyces-gal-Operon-P2- Promotor, die galE- und galK-Strukturgene und zur Transkription und Translation dieser Strukturgene erforderliche beliebige andere regulatorische Bereiche umfaßt. Mit "funktionellem Derivat" ist jedes beliebige Derivat der Streptomyces-gal-Operon-P2- Promotor-Expressionseinheit gemeint, das in bezug auf die Produktion der Streptomyces-gal-Operon-galE- und -galK-Genprodukte im wesentlichen in der gleichen Weise wie der natürlich vorkommende Bereich funktioniert. Diese Derivate schließen partielle Sequenzen der Streptomyces-gal-Operon-P2-Promotor-Expressionseinheit sowie Derivate ein, die durch Modifikation der die Streptomyces-gal-Operon-P2-Promotor- Expressionseinheit codierenden Sequenz hergestellt werden. Verfahren zur Durchführung dieser Modifikation sind im Stand der Technik bekannt, und einige wurden vorstehend beschrieben. Die natürlich vorkommende Streptomyces-gal-Operon-P2- Promotor-Expressionseinheit kann aus dem natürlich vorkommenden Streptomyces-gal- Operon durch übliche Verfahren isoliert werden. Die Streptomyces-gal-Operon-P2- Expressionseinheit kann als Selektionsmarker in einer geeigneten Wirtsmutante und zur Bereitstellung von regulatorischen Elementen verwendet werden. Mit "geeigneter Wirtsmutante" ist ein Wirt gemeint, der keine Galactose verwertet, da er einen Defekt in einem homologen Strukturgen oder regulatorischen Bereich enthält, der die Streptomyces-P2-Promotor-Expressionseinheit umfaßt, beispielsweise einen defekten P2- Promotor, ein defektes galE- und/oder galK-Gen. Daher kann ein durch übliche Verfahren herstellbares rekombinantes DNA-Molekül (das die Streptomyces-gal-Operon- P2-Promotor-Expressionseinheit und eine damit funktionell verbundene funktionelle Fremd-DNA-Sequenz umfaßt) durch übliche Verfahren zur Einführung in das Wirtsgenom durch homologe Rekombination in eine geeignete Wirtsmutante transformiert werden, damit die funktionelle Fremd-DNA-Sequenz konstitutiv exprimiert werden kann, ohne daß eine kostspielige Antibiotika-Selektion durchgeführt werden muß. Diese Expressionseinheit kann ferner in rekombinante DNA-Expressionsvektoren zur konstitutiven Expression von funktionellen Fremd-DNA-Sequenzen eingeschlossen werden. Die Streptomyces-gal-Operon-P2-Promotor-Expressionseinheit kann ferner zur Komplementation einer geeigneten Wirtsmutante verwendet werden, die anschließend zur konstitutiven Expression einer mit dieser Expressionseinheit funktionell verbundenen funktionellen Fremd-DNA-Sequenz in einer geeigneten, mit diesem Vektor transformierten Wirtsmutante verwendet werden kann, ohne daß eine kostspielige Antibiotika- Selektion durchgeführt werden muß.
Die Erfindung betrifft ferner ein rekombinantes DNA-Molekül, das den Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor-regulierten Bereich oder ein beliebiges regulierbares und funktionelles Derivat davon umfaßt. Mit dem Begriff "P1-Promotor-regulierter Bereich" ist der Bereich des Streptomyces-gal-Operons gemeint, der den Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor, die galT-, galE- und galK-Strukturgene und beliebige andere regulatorische Bereiche, die zur Transkription und Translation dieser Strukturgene erforderlich ist, umfaßt. Mit "regulierbarem und funktionellem Derivat" ist jedes beliebige Derivat des Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor-regulierten Bereichs gemeint, der in bezug auf die regulierbare Produktion der Streptomyces-gal-Operon- galT-, -galE- und -galK-Genprodukte im wesentlichen in der gleichen Weise wie der natürlich vorkommende Bereich funktioniert. Diese Derivate schließen partielle Sequenzen des Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor-regulierten Bereichs sowie Derivate ein, die durch Modifikation der den Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor-regulierten Bereich codierenden Sequenz hergestellt werden. Verfahren zur Durchführung dieser Modifikation sind im Stand der Technik bekannt, und einige wurden vorstehend beschrieben. Der natürlich vorkommende Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor-regulierte Bereich kann aus dem natürlich vorkommenden Streptomyces-gal-Operon durch übliche Verfahren, beispielsweise durch Ausschneiden des P2-Promotors aus dem natürlich vorkommenden Streptomyces-gal-Operon oder durch Inaktivierung des P2- Promotors durch eine Punktmutation oder durch Insertion einer Fremd-DNA-Sequenz in den Promotor, isoliert werden. Der Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor-regulierte Bereich ist für die vorstehend beschriebenen Verwendungsmöglichkeiten für das Streptomyces-gal-Operon von Nutzen.
Die Erfindung betrifft ferner ein rekombinantes DNA-Molekül, das den Streptomyces-gal-Operon-P2-Promotor oder ein beliebiges funktionelles Derivat davon umfaßt. Mit "funktionellem Derivat" ist ein beliebiges Derivat des Streptomyces-gal- Operon-P2-Promotors gemeint, das in bezug auf die Ermöglichung der Bindung der RNA-Polymerase daran und der Transkription einer mit diesem Promotor funktionell verbundenen funktionellen DNA-Sequenz im wesentlichen in der gleichen Weise wie der natürlich vorkommende P2-Promotor funktioniert. Diese Derivate schließen partielle Sequenzen des Streptomyces-gal-Operon-P2-Promotors sowie Derivate ein, die durch Modifikation der den gal-Operon-P2-Promotor-codierenden Sequenz hergestellt werden. Verfahren zur Durchführung dieser Modifikation sind im Stand der Technik bekannt, und einige wurden vorstehend beschrieben. Der natürlich vorkommende Streptomyces- gal-Operon-P2-Promotor kann durch übliche Verfahren aus dem natürlich vorkommenden Streptomyces-gal-Operon isoliert werden. Ein durch übliche Verfahren herstellbares rekombinantes DNA-Molekül (das den Streptomyces-gal-Operon-P2-Promotor und eine damit funktionell verbundene funktionelle Fremd-DNA-Sequenz umfaßt) kann durch übliche Verfahren zur Einführung in das Wirtsgenom durch homologe Rekombination in eine geeignete Wirtsmutante transformiert werden, damit die funktionelle Fremd-DNA- Sequenz konstitutiv exprimiert werden kann. Der Streptomyces-gal-Operon-P2- Promotor kann ferner in rekombinante DNA-Expressionsvektoren eingeführt werden, um eine damit funktionell verbundene funktionelle Fremd-DNA-Sequenz in Viren und eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen oder Organismen, besonders in mit diesem Vektor transformierten Streptomyces oder anderen Actinomyceten, konstitutiv exprimieren zu können.
Die Erfindung betrifft ferner ein rekombinantes DNA-Molekül, das den Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor oder ein beliebiges regulierbares und funktionelles Derivat davon umfaßt. Mit "regulierbarem und funktionellem Derivat" ist ein beliebiges Derivat des Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotors gemeint, das in bezug auf die Ermöglichung der Bindung der RNA-Polymerase daran und die Regulierung der Transkription einer mit diesem Promotor funktionell verbundenen funktionellen DNA- Sequenz im wesentlichen in der gleichen Weise wie der natürlich vorkommende P1- Promotor funktioniert. Diese Derivate schließen partielle Sequenzen des Streptomyces- gal-Operon-P1-Promotors sowie Derivate ein, die durch Modifikation der den gal- Operon-P1-Promotor-codierenden Sequenz hergestellt werden. Verfahren zur Durchführung dieser Modifikation sind im Stand der Technik bekannt, und einige wurden vorstehend beschrieben. Der natürlich vorkommende Streptomyces-gal-Operon-P1- Promotor kann aus dem natürlich vorkommenden Streptomyces-gal-Operon durch übliche Verfahren isoliert werden. Ein durch übliche Verfahren herstellbares rekombinantes DNA-Molekül (das den Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor und eine damit funktionell verbundene funktionelle Fremd-DNA-Sequenz umfaßt) kann durch übliche Verfahren zur Einführung in das Wirtsgenom durch homologe Rekombination in eine geeignete Wirtsmutante transformiert werden, um die funktionelle Fremd-DNA-Sequenz konstitutiv exprimieren zu können. Der Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor kann ferner in rekombinante DNA-Expressionsvektoren eingeführt werden, um eine damit funktionell verbundene funktionelle Fremd-DNA-Sequenz in Viren und eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen oder Organismen, besonders in Streptomyces oder anderen Actinomyceten, die mit diesem Vektor transformiert sind, regulierbar exprimieren zu können.
Die Erfindung betrifft ferner ein rekombinantes DNA-Molekül, das das Streptomyces-gal-Operon-galE-, -galT- oder -galK-Gen oder ein beliebiges funktionelles Derivat davon umfaßt. Mit "funktionellem Derivat" sind alle Derivate des Streptomyces- gal-Operon-galE, -galT- oder -galK-Gens gemeint, die in bezug auf die Produktion eines aktiven galE-, galT- oder galK-artigen Genprodukts im wesentlichen in der gleichen Weise wie das natürlich vorkommende Gen funktionieren. Diese Derivate schließen partielle Sequenzen des Streptomyces-gal-Operon-galE-, -galT- oder -galK-Gens sowie Derivate ein, die durch Modifikation der gal-Operon-Sequenz hergestellt werden. Verfahren zur Durchführung dieser Modifikation sind im Stand der Technik bekannt, und einige wurden vorstehend beschrieben. Das natürlich vorkommende Streptomyces- gal-Operon-galE-, -galT- und/oder -galK-Gen kann aus dem natürlich vorkommenden Streptomyces-gal-Operon durch übliche Verfahren isoliert werden. Das Streptomyces- gal-Operon-galE-, -galT- und/oder -galK-Gen kann als Selektionsmarker in einer geeigneten Wirtsmutante verwendet werden. Mit "geeigneter Wirtsmutante" ist ein Wirt gemeint, der keine Galactose verwertet, da er einen Defekt in einem homologen galE-, galT- und/oder galK-Gen enthält. Daher kann ein durch übliche Verfahren herstellbares rekombinantes DNA-Molekül (das das Streptomyces-gal-Operon-galE-, -galT- und/oder -galK-Gen und eine funktionelle Fremd-DNA-Sequenz, die beide mit einem geeigneten regulatorischen Bereich funktionell verbunden sind, umfaßt) durch übliche Verfahren zum Einbau in das Wirtsgenom durch homologe Rekombination in eine geeignete Wirtsmutante transformiert werden, damit die Transformanten ohne eine kostspielige Antibiotika-Selektion nachgewiesen werden können. Entsprechend kann ein rekombinanter DNA-Vektor, der das Streptomyces-gal-Operon-galE-, -galT- und/oder -galK- Gen und eine funktionelle Fremd-DNA-Sequenz, die beide mit geeigneten regulatorischen Bereichen funktionell verbunden sind, sowie ein Replicon umfaßt, durch übliche Verfahren in eine geeignete Wirtsmutante transformiert werden, um Transformanten ohne eine kostspielige Antibiotika-Selektion nachweisen zu können. Das Streptomyces- gal-Operon-galE-, -galK- und/oder -galT-Gen kann ferner zur Komplementation einer geeigneten Wirtsmutante verwendet werden.
Das Streptomyces-gal-Operon-galE-Gen kann ferner zur Bereitstellung einer Ribosomenbindungsstelle und eines Initiationscodons verwendet werden, die an eine funktionelle Fremd-DNA-Sequenz fusioniert werden können, damit diese codierende Sequenz nach ihrem Einbau in einen geeigneten Expressionsvektor und einer Transformation in einen geeigneten Wirt exprimiert werden kann. Nach der Fusion dieser funktionellen Fremd-DNA-Sequenz mit der galE-Gen-Ribosomenbindungsstelle und dem Initiationscodon in einem rekombinanten DNA-Expressionsvektor, der die Streptomyces-gal-Operon-P2-Promotor-Expressionseinheit oder das gesamte gal-Operon umfaßt, wird die DNA-Sequenz nach der Transformation dieses Vektors in einen geeigneten Wirtsorganismus konstitutiv exprimiert. Nach der Fusion dieser DNA-Sequenz mit der galE-Gen-Ribosomenbindungsstelle und dem Initiationscodon in einem rekombinanten DNA-Expressionsvektor, der den Streptomyces-gal-Operon-P2-Promotor-regulierten Bereich enthält, kann die Expression dieser DNA-Sequenz nach der Transformation dieses Vektors in einen geeigneten Wirtsorganismus durch Regulation der Menge an Galactose oder Glucose reguliert werden.
Das Streptomyces-gal-Operon-galT-Gen kann ferner zur Bereitstellung einer Ribosomenbindungsstelle und eines Initiationscodons verwendet werden, die mit einer funktionellen Fremd-DNA-Sequenz fusioniert werden können, damit diese codierende Sequenz nach ihrem Einbau in einen geeigneten Expressionsvektor und einer Transformation in einen geeigneten Wirt exprimiert werden kann. Nach der Fusion dieser funktionellen Fremd-DNA-Sequenz mit der galT-Gen-Ribosomenbindungsstelle und dem Initiationscodon in einem rekombinanten DNA-Expressionsvektor, der den Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor-regulierten Bereich oder das gesamte gal-Operon umfaßt, kann die Expression dieser codierenden Sequenz in einem mit diesem Vektor transformierten Wirt, wie vorstehend beschrieben, reguliert werden.
Die Erfindung betrifft ferner einen rekombinanten DNA-Vektor, der ein Replicon, Streptomyces-gal-Operon oder ein funktionelles und regulierbares Derivat davon und eine mit diesem Operon funktionell verbundene funktionelle Fremd-DNA- Sequenz umfaßt. Dieser Vektor kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Das verwendete Replicon sollte die Eigenschaft aufweisen, einen Vektor im mit dem Vektor transformierten Wirtsorganismus stabil und extrachromosomal zu erhalten.
Die Erfindung betrifft ferner einen transformierten Wirtsmikroorganismus, der einen rekombinanten DNA-Vektor enthält, wobei dieser Vektor ein Replicon, das Streptomyces-gal-Operon oder ein funktionelles und regulierbares Derivat davon und eine mit diesem Operon funktionell verbundene funktionelle Fremd-DNA-Sequenz enthält, und ein Verfahren zur Herstellung dieses Wirts, das eine Transformation eines geeigneten Wirtsmikroorganismus mit diesem Vektor umfaßt. Geeignete, im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbare Wirtsmikroorganismen sind beispielsweise Viren und eukaryotische und prokaryotische Zellen oder Organismen, besonders Actinomyceten, beispielsweise die der Gattung Streptomyces. Die am meisten bevorzugten Wirtsmikroorganismen gehören zur Gattung Streptomyces. Bevorzugte Streptomyces- Arten sind beispielsweise Streptomyces lividans, S. coelicolor, S. azuraeus und S. albus. Eine Transformation eines derartigen Wirtsmikroorganismus mit diesem Vektor kann unter Verwendung von üblichen Verfahren, beispielsweise dem Verfahren von Chater et al., Curr. Top. Micro. Imm. 96 (1982), 69-95, durchgeführt werden. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Expression der funktionellen DNA-Sequenz, die im erfindungsgemäßen transformierten Wirt enthalten ist, wobei das Verfahren die Züchtung dieses transformierten Wirts unter geeigneten Bedingungen umfaßt, so daß die funktionelle DNA-Sequenz exprimiert wird. Mit "geeigneten Bedingungen" sind Bedingungen gemeint, die dem Wirt ein Wachstum ermöglichen und die Expression der funktionellen DNA-Sequenz ermöglichen. Derartige geeignete Bedingungen können durch den Fachmann unter Verwendung von üblichen Verfahren ermittelt werden und hängen von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise dem verwendeten Wirtsorganismus und der zu exprimierenden funktionellen DNA-Sequenz. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Regulierung der Expression der im so transformierten Wirt enthaltenen funktionellen DNA-Sequenz, das die Züchtung eines diese funktionelle DNA-Sequenz enthaltenden transformierten Wirts unter geeigneten Bedingungen, bei denen ihre Expression regulierbar ist, umfaßt. Mit "geeigneten Bedingungen" sind Bedingungen gemeint, die eine Regulierung des Streptomyces-gal-Operons (und damit der funktionellen Fremd-DNA-Sequenz) ermöglichen. Mit "regulierbar" ist gemeint, daß es auf die Gegenwart von Galactose oder seiner Metaboliten und die Gegenwart von Glucose oder seiner Metaboliten in den Nährmedien der transformierten Wirtszelle antwortet. Eine derartige Regulierung kann durch Zugabe oder Entfernung von Galactose oder Glucose in das bzw. aus dem Kulturmedium des transformierten Wirts erfolgen. Die optimalen Mengen an Galactose und/oder Glucose zur Erhöhung oder Verringerung der Expression der funktionelle Fremd-DNA-codierenden Sequenz durch den erfindungsgemäßen transformierten Wirt können durch den Fachmann unter Verwendung von üblichen Verfahren leicht ermittelt werden.
Die Erfindung betrifft ferner einen rekombinanten DNA-Vektor, der ein Replicon, eine Streptomyces-gal-Operon-P2-Promotor-Expressionseinheit oder ein funktionelles Derivat davon und eine mit dieser Einheit funktionell verbundene funktionelle Fremd-DNA-Sequenz umfaßt. Dieser Vektor kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Für das verwendete Replicon muß sichergestellt sein, daß es die Fähigkeit zur stabilen und extrachromosomalen Erhaltung eines Vektors im mit dem Vektor transformierten Wirtsorganismus besitzt.
Diese Erfindung betrifft ferner einen transformierten Wirtsmikroorganismus, der einen rekombinanten DNA-Vektor umfaßt, wobei dieser Vektor ein Replicon, die Streptomyces-gal-Operon-P2-Promotor-Expressionseinheit oder ein funktionelles Derivat davon und eine mit einer derartigen Einheit funktionell verbundene funktionelle Fremd- DNA-Sequenz enthält, und ein Verfahren zur Herstellung dieses Wirts, das die Transformation eines geeigneten Wirtsmikroorganismus mit diesem Vektor umfaßt. Mit dem Begriff "funktionell verbunden" ist gemeint, daß eine funktionelle DNA-Sequenz so transkriptional oder translational mit einer Expressionkontrollsequenz (d. h., dem Streptomyces-gal-Operon, der P2-Promotorexpressionseinheit, dem P1-Promotor-regulierten Bereich, P1-Promotor oder P2-Promotor) verbunden ist, daß die Expression der funktionellen DNA-Sequenz von der Expressionskontrollsequenz reguliert wird. So kann beispielsweise eine funktionelle Fremd-DNA-Sequenz durch Insertion dieses Operons in das Streptomyces-gal-Operon-P1- oder -P2-Promotor-Transkript transkriptional oder translational mit dem Streptomyces-gal-Operon verbunden sein. Der Begriff "Replicon" bezeichnet den Bereich der DNA auf einem Plasmid, der die stabile und extrachromosomale Erhaltung eines derartigen Plasmids in einem damit transformierten Wirtsmikroorganismus oder einer Zelle bewirkt. Es wurde ferner festgestellt, daß das Streptomyces-gal-Operon und kleinere Teile davon als Nucleinsäuresonde verwendet werden können, um homologe Sequenzen aus andere Zellen und Organismen zu erhalten. Geeignete Wirtsmikroorganismen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind beispielsweise Viren oder eukaryotische oder prokaryotische Zellen oder Organismen, besonders Actinomyceten, beispielsweise die der Gattung Streptomyces. Die am meisten bevorzugten Wirtsmikroorganismen gehören zur Gattung Streptomyces. Bevorzugte Streptomyces-Arten sind beispielsweise Streptomyces lividans, S. coelicolor, S. azuraeus und S. albus. Eine Transformation dieses Wirtsmikroorganismus mit diesem Vektor kann unter Verwendung von üblichen Verfahren, beispielsweise dem Verfahren von Chater et al., Curr. Top. Micro. Imm. 96 (1982), 69-95, durchgeführt werden. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Expression der funktionellen DNA-Sequenz, die im erfmdungsgemäßen transformierten Wirt enthalten ist, wobei das Verfahren die Züchtung dieses transformierten Wirts unter geeigneten Bedingungen umfaßt, so daß die funktionelle DNA-Sequenz exprimiert wird. Mit "geeigneten Bedingungen" sind Bedingungen gemeint, die dem Wirt das Wachstum und der funktionellen DNA-Sequenz die Expression ermöglichen. Diese geeigneten Bedingungen können durch den Fachmann unter Verwendung von üblichen Verfahren ermittelt werden und hängen von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise dem verwendeten Wirtsorganismus und der zu exprimierenden funktionellen DNA-Sequenz.
Die Erfindung betrifft ferner einen rekombinanten DNA-Vektor, der ein Replicon, einen Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor-regulierten Bereich oder ein funktionelles und regulierbares Derivat davon und eine mit diesem Bereich funktionell verbundene funktionelle Fremd-DNA-Sequenz umfaßt. Dieser Vektor kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Das verwendete Replicon muß die Fähigkeit aufweisen, einen Vektor im mit dem Vektor transformierten Wirtsorganismus stabil und extrachromosomal zu erhalten.
Diese Erfindung betrifft ferner einen transformierten Wirtsmikroorganismus, der einen rekombinanten DNA-Vektor umfaßt, wobei dieser Vektor ein Replicon, einen Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor-regulierten Bereich oder ein funktionelles und regulierbares Derivat davon und eine mit diesem Bereich funktionell verbundene funktionelle Fremd-DNA-Sequenz enthält, und ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Wirts, das die Transformation eines geeigneten Wirtsmikroorganismus mit diesem Vektor umfaßt. Geeignete verwendbare Wirtsmikroorganismen sind beispielsweise Viren oder eine eukaryotische oder prokaryotische Zelle oder ein Organismus, besonders Actinomyceten, beispielsweise die der Gattung Streptomyces. Die am meisten bevorzugten Wirtsmikroorganismen gehören zur Gattung Streptomyces. Bevorzugte Streptomyces-Arten sind beispielsweise Streptomyces lividans, S. coelicolor, S. azuraeus und S. albus. Die Transformation dieser Wirtsmikroorganismen mit diesem Vektor kann unter Verwendung von üblichen Verfahren, beispielsweise dem Verfahren von Chater et al., Curr. Top. Micro. Imm. 96 (1982), 69-95, durchgeführt werden. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Expression der im transformierten erfindungsgemäßen Wirt enthaltenen funktionellen Fremd-DNA-Sequenz, wobei das Verfahren die Züchtung dieses transformierten Wirts unter geeigneten Bedingungen umfaßt, so daß die funktionelle DNA-Sequenz exprimiert wird. Mit "geeigneten Bedingungen" sind Bedingungen gemeint, die dem Wirt ein Wachstum ermöglichen und die Expression der funktionellen DNA-Sequenz ermöglichen. Derartige geeignete Bedingungen können durch den Fachmann unter Verwendung von üblichen Verfahren ermittelt werden und hängen von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise dem verwendeten Wirtsorganismus und der zu exprimierenden funktionellen DNA-Sequenz. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Regulierung der Expression der im so transformierten Wirt enthaltenen funktionellen DNA-Sequenz, das die Züchtung eines diese funktionelle DNA-Sequenz enthaltenden transformierten Wirts unter geeigneten Bedingungen, bei denen ihre Expression regulierbar ist, umfaßt. Mit "geeigneten Bedingungen" sind Bedingungen gemeint, die eine Regulierung des Streptomyces-gal- Operon-P1-Promotors(und damit der funktionellen Fremd-DNA-Sequenz) ermöglichen. Mit "regulierbar" ist gemeint, daß er auf die Gegenwart von Galactose oder seiner Metaboliten und die Gegenwart von Glucose oder seiner Metaboliten in den Nährmedien der transformierten Wirtszelle antwortet. Eine derartige Regulierung kann durch Zugabe oder Entfernung von Galactose oder Glucose in das bzw. aus dem Kulturmedium des transformierten Wirts erfolgen.
Die Erfindung betrifft ferner einen rekombinanten DNA-Vektor, der ein Replicon, einen Streptomyces-gal-Operon-P2-Promotor oder ein funktionelles Derivat davon und eine mit diesem Promotor funktionell verbundene funktionelle Fremd-DNA- Sequenz umfaßt. Ein derartiger Vektor kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Das verwendete Replicon muß die Fähigkeit zur stabilen und extrachromosomalen Erhaltung eines Vektors im mit dem Vektor transformierten Wirtsorganismus besitzen.
Die Erfindung betrifft ferner einen transformierten Wirtsmikroorganismus, der einen rekombinanten DNA-Vektor umfaßt, wobei dieser Vektor ein Replicon, einen Streptomyces-gal-Operon-P2-Promotor oder ein funktionelles Derivat davon und eine mit diesem Bereich funktionell verbundene funktionelle Fremd-DNA-Sequenz enthält, und ein Verfahren zur Herstellung dieses Wirts, das die Transformation eines geeigneten Wirtsmikroorganismus mit diesem Vektor umfaßt. Geeignete verwendbare Wirtsmikroorganismen sind beispielsweise Actinomyceten, beispielsweise der Gattung Streptomyces. Die am meisten bevorzugten Wirtsmikroorganismen gehören zur Gattung Streptomyces. Bevorzugte Streptomyces-Arten sind beispielsweise Streptomyces lividans, S. coelicolor, S. azuraeus und S. albus. Die Transformation dieses Wirtsmikroorganismus mit diesem Vektor kann unter Verwendung von üblichen Verfahren, beispielsweise dem Verfahren von Chater et al., Curr. Top. Micro. Imm. 96 (1982), 69-95, durchgeführt werden. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Expression der funktionellen Fremd-DNA-Sequenz, die im transformierten erfindungsgemäßen Wirt enthalten ist, wobei das Verfahren die Züchtung dieses transformierten Wirts unter geeigneten Bedingungen umfaßt, bei denen die funktionelle DNA-Sequenz exprimiert wird. Mit "geeigneten Bedingungen" sind Bedingungen gemeint, die dem Wirt das Wachstum und der funktionellen DNA-Sequenz die Expression ermöglichen. Derartige geeignete Bedingungen können durch den Fachmann unter Verwendung von üblichen Verfahren ermittelt werden und hängen von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise dem verwendeten Wirtsorganismus und der zu exprimierenden funktionellen DNA-Sequenz.
Die Erfindung betrifft ferner einen rekombinanten DNA-Vektor, der ein Replicon, einen Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor oder ein beliebiges regulierbares und funktionelles Derivat davon und eine mit einem derartigen Bereich funktionell verbundene funktionelle Fremd-DNA-Sequenz umfaßt. Dieser Vektor kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Das verwendete Replicon muß die Fähigkeit besitzen, einen Vektor im mit dem Vektor transformierten Wirtsorganismus stabil und extrachromosomal zu erhalten.
Die Erfindung betrifft ferner einen transformierten Wirtsmikroorganismus, der einen rekombinanten DNA-Vektor umfaßt, wobei dieser Vektor ein Replicon, einen Streptomyces-gal-Operon-P1-Promotor oder ein beliebiges regulierbares und funktionelles Derivat davon und eine mit diesem Bereich funktionell verbundene funktionelle Fremd-DNA-Sequenz enthält, und ein Verfahren zur Herstellung dieses Wirts, das eine Transformation eines geeigneten Wirtsmikroorganismus mit diesem Vektor umfaßt. Verwendbare, geeignete Wirtsmikroorganismen sind beispielsweise Viren oder prokaryotische oder eukaryotische Zellen oder Organismen, besonders Actinomyceten, beispielsweise die der Gattung Streptomyces. Die am meisten bevorzugten Wirtsmikroorganismen gehören zur Gattung Streptomyces. Bevorzugte Streptomyces- Arten sind beispielsweise Streptomyces lividans, S. coelicolor, S. azuraeus und S. albus. Die Transformation dieser Wirtsmikroorganismen mit diesem Vektor kann unter Verwendung von üblichen Verfahren, beispielsweise dem Verfahren von Chater et al., Curr. Top. Micro. Imm. 96 (1982), 69-95, durchgeführt werden. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Expression der funktionellen Fremd-DNA-Sequenz, die im transformierten erfindungsgemäßen Wirt enthalten ist, wobei das Verfahren die Züchtung dieses transformierten Wirts unter geeigneten Bedingungen umfaßt, bei denen die funktionelle DNA-Sequenz exprimiert wird. Mit "geeigneten Bedingungen" sind Bedingungen gemeint, die dem Wirt ein Wachstum und der funktionellen DNA-Sequenz die Expression ermöglichen. Diese hinreichenden Bedingungen können durch den Fachmann unter Verwendung von üblichen Verfahren ermittelt werden und hängen von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise dem verwendeten Wirtsorganismus und der zu exprimierenden funktionellen Fremd-DNA-Sequenz. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Regulierung der Expression der im so transformierten Wirt enthaltenen funktionellen DNA-Sequenz, das die Züchtung eines diese funktionelle Fremd-DNA- Sequenz enthaltenden transformierten Wirts unter geeigneten Bedingungen, bei denen ihre Expression regulierbar ist, umfaßt. Mit "geeigneten Bedingungen" sind Bedingungen gemeint, die eine Regulierung des gal-Operon-P1-Promotors (und somit der funktionellen DNA-Sequenz) ermöglichen. Mit "regulierbar" ist gemeint, daß er auf die Gegenwart oder Abwesenheit von Galactose oder seiner Metaboliten und die Gegenwart von Glucose oder seiner Metaboliten in den Nährmedien der transformierten Wirtszelle antwortet. Diese Regulierung kann durch Zugabe oder Entfernung von Galactose oder Glucose zum bzw. aus dem Kulturmedium des transformierten Wirts durchgeführt werden.

Beispiele

In den nachstehend beschriebenen Beispielen werden spezifische erfindungsgemäße Ausführungsformen genauer beschrieben. Diese Beispiele sollen den Gegenstand der Erfindung erläutern, ihren Schutzbereich jedoch nicht einschränken. In allen Beispielen wird die Temperatur in Grad Celsius (ºC) angegeben.
Unter Verwendung von üblichen Verfahren, beispielsweise den in den nachstehend beschriebenen Beispielen beschriebenen, kann der Fachmann das gal-Operon aus jedem Galactose verwertenden Streptomyces-Stamm isolieren. Unter Verwendung von Verfahren, die den hier zur Isolierung des Streptomyces-gal-Operons verwendeten gleichen, kann ein Fachmann das Streptomyces-gal-Operon zur Isolierung eines gal-Operons von anderen Galactose-verwertenden Streptomyces-Stämmen, insbesondere S. coelicolor, S. azuraeus, S. albus und anderen S. lividans-Stämmen verwenden.
Molekulargenetische Manipulationen und weitere Verfahren, die in den nachstehend beschriebenen Beispielen verwendet werden, werden von Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, England (1985), beschrieben.

Abkürzungen

In den nachstehend beschriebenen Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
LB: 10 Gramm (g) Trypton, 5 g Hefeextrakt und 5 g NaCl.
MBSM (modifiziertes MBSM): Vgl. Brawner et al., Gene 40 (1985), 191 (im Druck).
MOPS: (3)-N-Morpholin-(propansulfonsäure).
YEME + MgCl&sub2; + Glycin: [pro Liter (1)] 3 g Hefeextrakt, 5 g Pepton, 3 g Malzextrakt, 10 g Glucose, 10 g MgCl&sub2; x 6H&sub2;O und 340 g Saccharose.
SL: Es werden (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; (1 g/l), L-Asparagin (2 g/l), K&sub2;HPO&sub4; (9 g/l), NaH&sub2;PO&sub4; (1 g/l) mit 0,2 % Agar vermischt und autoklaviert. Anschließend werden Hefeextrakt (20 g/l), MgCl&sub2; (5 g/l), CuCl&sub2; (0,1 g/l) und Spurenelemente [20 ml/l enthaltend ZnCl&sub2; (40 mg/l), FeCl&sub3; x 6H&sub2;O (200 mg/l), CuCl&sub2; x 2H&sub2;O (10 mg/l), NaB&sub4;O&sub7; x 10H&sub2;O (10 mg/l) und (NH&sub4;)&sub6;MO&sub7;O&sub2;&sub4; x 4H&sub2;O (10 mg/l)] zugesetzt, anschließend wird filtriert und sterilisiert.
YEME (Ym-Base): (pro Liter) Hefeextrakt (3 g), Pepton (5 g), Malzextrakt (3 g) und MgCl&sub2; x 6H&sub2;O (2 g).
Ymglu: YEME + Glucose (10 g).
Ymgal: YEME + Galactose (10 g).

Bakterienstämme

In den nachstehend beschriebenen Beispielen werden die folgenden E. coli- Stämme verwendet: CGSC Stamm#(a) Bezeichnung des Stamms Geschlecht Chromosomale Marker
(a)CGSC-Stamm # ist die Stamm-Nummer, die der Stamm vom E. coli Genetic Stock Center of the Department of Human Genetics, Yale University School of Medicine, 333 Cedar Street, P. O. Box 3333, New Haven, Connecticut, 06510, USA, erhielt.
(b)galE9 ist der alte Lederberg-Marker gal9 und galT22 ist der alte Lederberg-Marker gal&sub1;.

S1-Analyse

Die S1-Analyse wird zur Identifizierung des 5'-Endes der RNAs und der Länge einer interessierenden RNA verwendet. In den nachstehend beschriebenen Beispielen wurde die S1-Analyse gemäß dem Verfahren von Weaver et al., Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1175, und Berk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 1214, durchgeführt.

Beispiel I

A. Clonierung eines Streptomyces lividans-Galactokinasegens

Der Stamm Streptomyces lividans 1326 ist von Bibb et al., Mol. Gen. Genetics 184 (1981), 230-240, beschrieben und wurde von D. A. Hopwood, John Innes Foundation, Norwich, England, erhalten. Der Stamm Streptomyces lividans 1326 und der das pIJ6-Plasmid enthaltende Stamm S. lividans 1326 wurden am 1. Juni 1982 unter den Hinterlegungsnummern NRRL 15091 bzw. 15092 bei der Agricultural Research Culture Collection, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt.
Chromosomale DNA mit hohem Molekulargewicht wurde aus dem Stamm Streptomyces lividans 1326 gemäß dem Verfahren von Maniatis et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1982), isoliert und auf einem 10 bis 40 % Saccharosegradienten nach Größe fraktioniert (vgl. Maniatis et al., siehe oben, S. 284-285). Fraktionen von 18 bis 24 Kilobasen (kb)-Paaren wurden vereinigt und gegen 10 mM Tris-HCl/l mM EDTA (pH-Wert 8) ausgiebig dialysiert. Cosmid-"Shuttle-Vektor" pJW357 wurde verwendet, um die derart fraktionierte chromosomale DNA vollständig clonieren zu können. pJW357 wurde durch Fusion von PstI- gespaltenem pDPT6 mit PstI-gespaltenem pIJ350 konstruiert. pIJ350 wird von Kieser et al., Mol. Gen. Genet. 185 (1982), 223-238, beschrieben. pDPT6 ist ein Tetracyclin- und Chloramphenicol-resistenter, auf pBR322 beruhender E. coli-Cosmid- Clonierungsvektor, der von Taylor et al., US-Patent Nr. 4,476,227, beschrieben wird. pJW357 weist eine einzige EcoRI-Stelle im Chloramphenicol-Resistenzgen und eine einzige BamHI-Stelle im Tc (Tetracyclin)-Resistenzgen auf. pJW357 wurde mit BamHI gespalten, mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und mit der vorstehend beschriebenen fraktionierten chromosomalen DNA ligiert.
Das Ligierungsprodukt wurde in Köpfe von Bakteriophagen verpackt (unter Verwendung des von Maniatis et al., siehe oben, S. 264-265, beschriebenen in vitro- Verpackungssystems) und in den Stamm E. coli K21, der ein galK&supmin;-Derivat von E. coli MM294 ist, transfiziert. Die transformierten Zellen wurden zwei Stunden in LB- Medium und weitere zwei Stunden in 25 ug/ml Chloramphenicol enthaltendem LB- Medium gezüchtet, dreimal mit gleichen Volumina an keine Kohlenstoffquelle enthaltendem M9-Medium [vgl. Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory (1972)] gewaschen und auf 30 mg/ml Chloramphenicol enthaltendem M9-Agar [dem Prohn, Histidin, Arginin, Isoleucin, Leucin, Kochsalzlösung und 0,5 % Galactose zugesetzt wurden; vgl. Adams et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 89(2) (1979), 650-58] ausplattiert. Auf zwanzig Platten wurden etwa 200 Transformanten pro Platte verteilt. Nach einer Inkubation von drei Tagen bei 37ºC wurden keine Transformanten nachgewiesen. Die Minimalplatten wurden anschließend mit Nicotinsäure bis zu einer Konzentration von 5 ug/ml besprüht, um den Nicotinsäure- Bedarf des Stamms E. coli K21 zu decken, und die Inkubation wurde 3 weitere Tage bei 37ºC und 2 weitere Tage bei Raumtemperatur fortgesetzt. Nach der Inkubation wurden die überlebenden Kolonien sowohl in 30 ug/ml Chloramphenicol enthaltendem MacConkey Galactose Agar (MAC-GAL) [vgl. Miller et al., siehe oben] als auch in M63-Minimalagar [vgl. Miller et al., siehe oben], dem 0,5 % Galactose, 5 ug/ml Nicotinsäure, 5 ug/ml Thiamin und 30 ug/ml Chloramphenicol zugesetzt wurden, gegeben. Nur zwei Kolonien enthielten Cosmid-DNA, die E. coli K21 in einen galK&spplus;- Phänotyp transformierten. Diese Cosmide erhielten die Bezeichnungen pSLIVGAL-1 und pSLIVGAL-2. Beide Kolonien waren hellrot auf MAC-GAL (d. h., sie waren galK&spplus;) und wuchsen auch auf M63-Medium.
Die Plasmide pSLIVGAL-1 und pSLIVGAL-2 wurden aus den beiden vorstehend beschriebenen galK&spplus;-Kolonien isoliert und gemäß dem Verfahren von Chater et al., Curr. Top. Micro. Imm. 96 (1982), 69-95, in den Stamm Streptomyces lividans 1326-12K (ein galK-defizienter Stamm, der nach der UV-Mutagenese des Stamms S. lividans 1326 isoliert wurde; vgl. Brawner et al., Gene 40 (1985), 191, (im Druck)) transformiert. Die Plasmid-codierte Komplementation des S. lividans 1326-12K (galK&supmin;)- Wirts wurde durch Beobachtung des Sporenwachstums getestet nach Plattierung auf MBSM-gal-Thiostrepton gemäß dem Verfahren von Brawner et al., Gene, 40 (1985), 191, (im Druck). pSLIVGAL-2 zeigte keine nachweisbare Komplementation des Wirts Streptomyces 1326-12K.
Zellextrakte wurden aus Kulturen hergestellt, die in 1 % Glucose oder Galactose und 10 g/ml Thiostrepton enthaltendem SL-Medium gezüchtet wurden. Die Extrakte wurden auf eine Galactokinaseproduktion durch Immunoblot-Analyse (vgl. Brawner et al., Gene 40 (1985), 191, im Druck) unter Verwendung von gegen E. coli- Galactokinase hergestellten Kaninchen-Antiseren analysiert. Das durch Immunoblot- Analyse nachgewiesene Protein wies die ungefäre Größe von E. coli-galK auf. Dieses Protein erschien in Galactose enthaltenden Streptomyces-Kulturen in um ein Mehrfaches erhöhten Mengen im Vergleich zu Glucose-Kulturen.
B. Kartierung des S. lividans galK-Bereichs in einem Cosmid
Der galK-Bereich der wie vorstehend beschrieben hergestellten Cosmide pSLIVGAL1 und pSLIVGAL2 wurde durch Zufallsclonierung von Fragmenten aus den Cosmiden in ein pUC18-Derivat [vgl. Norrander et al., Gene 26 (1983), 101-106] und Überprüfung der Komplementation des Stamms E. coli MM294 (galK&supmin;) auf MAC-GAL- Medium identifiziert. Der Cosmid-Clon wurde mit Sau3AI (unter Verwendung von Bedingungen, die die Ausbeute an 2 bis 4 kb langen Fragmenten maximierte) partiell gespalten, und die Reaktionsprodukte wurden in die BglII Stelle von pUC18-TT6 ligiert, das ein pUC18 Derivat ist, das durch Insertion der nachstehend beschriebenen synthetischen DNA-Sequenz in die BamHI-Stelle von pUC18 konstruiert wurde:
5'GATCAGATCTTGATCACTAGCTAGCTAG 3'
3' TCTAGAACTAGTGATCGATCGATCCTAG 5'
Zwölf galK&spplus;-Clone (rot auf MAC-GAL) wurden nach Größe selektiert. Ein Clon mit der späteren Bezeichnung Plasmid pSAU10 war am kleinsten und wies eine Insertionsgröße von etwa 1,4 kb auf.
Im Gegensatz zu Kolonien, die pSLIVGAL1 enthielten, waren die pUC-Clone auf MAC-GAL-Medium stark rot, wodurch eine erhöhte Produktion an Galactokinase angezeigt wurde. Die wahrscheinlichste Erklärung für die erhöhte Enzymmenge war die Transkription des S. lividans-galK-Gens durch einen E. coli-Promotor, der stärker als der stromaufwärts liegende Promotor auf dem Cosmid war.
Die pSAU10-Insertion wurde als EcoRI-HindIII-Fragment (diese Stellen flankieren den Insertionsbereich von pUC18-TT6) isoliert, um es als Sonde für das S. lividans-galK-Gen zu verwenden. Die zur Clonierung verwendete chromosomale DNA wurde mit EcoRI und MluI und mit BamHI und BglII gespalten, und anschließend gemäß dem Verfahren von Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975), 503, ein Blot durchgeführt. Das pSAU10-Fragment wurde nicktranslatiert und an den Blot hybridisiert. Mit der Sonde konnte ein 1,3 kb-EcoRI-MluI-Fragment und ein 5 kb-BamHI-BglII-Fragment in den chromosomalen Spaltprodukten identifiziert werden. Bei einem Vergleich dieser Daten mit der Restriktionskarte der Cosmid-Insertion wurde die Lage des galK-Gens (zwischen den Positionen 5 und 7 in der Restriktionskarte; vgl. Tabelle A) bestätigt.

C. DNA-Sequenzierung des S. lividans-gal-Operons

Das Streptomyces lividans-gal-Operon wurde durch das Kettenabbruchverfahren [(vgl. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463] und chemische Spaltung [vgl. Maxam und Gilbert, Methods in Enzymology 65 (1980), 499] sequenziert. Die ursprünglichen galK-Sequenzen stammten von Sau3AI- und SalI- Fragmenten der Insertion in pSAU6 (ein mit pSAU10 verwandtes Plasmid mit einer Insertionslänge von 2,3 kb ("2.3 kb sibling"), die in die BamHI- bzw. SalI-Stellen von M13mp10 "shotgun"-cloniert war [vgl. Messing, Methods in Enzymology 101 (1983), 20]. Die Aminosäuresequenzen der S. lividans-galT-, -galE- und -galK-Gene wurden mit dem Computer erstellt und durch einen Vergleich mit Aminosäuresequenzen der E. coli- und/oder S. cerevisiae-Galactokinase, -gal-1-Phosphat-Uridyltransferase und -UDP-4-Epimerase weiter analysiert. Die Sequenzen dieser Proteine wurden durch Computeranalyse unter Verwendung der die gal-Enzyme codierenden vollständigen oder partiellen DNA-Sequenz der Gene abgeleitet [vgl. Debouck et al., Nucleic Acids Res. 13(6) (1985), 1841-1853, und Citron und Donelson, J. Bacteriology 158 (1984), 269]. Eine gewisse Homologie wurde zwischen der abgeleiteten Proteinsequenz der S. lividans-galK-, -galT- und -galE-Genprodukte und den entsprechenden E. coli- und/oder S. cerevisiae-Genprodukten festgestellt.
Die vollständige DNA-Sequenz des S. lividans-gal-Operons ist in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 enthält ferner die Transkriptionsstartstellen für die Operonpromotoren und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der galT-, galE- und galK-Genprodukte. Tabelle 1 Translatierte Sequenz des Streptomyces lividans-Galactose-Operons Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung)

Beispiel 2

Promotoren des S. lividans-gal-Operons

a) P1-Promotor

(1) Zusammenfassung

Dieser Promotor ist Galactose-induzierbar und Glucose-reprimierbar und ist der regulierbare Promotor für das gesamte Streptomyces-gal-Operon. S1-Daten zeigen, daß das Streptomyces-gal-Operon ein polycistronisches Transkript von etwa 3,4 kb codiert. Das Transkript besteht aus etwa 1 kb für galT und darauffolgend aus jeweils etwa 1 kb für galE und galK. (Vgl. Figur 1).
Die Galactose-Induktion von P1 wird mindestens teilweise durch eine Operatorsequenz, deren 5'-Ende 31 bp stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle liegt, und ein Operator-erkennendes Repressorprotein vermittelt.

(2) Experimentelle Durchführung: Isolierung, Lokalisierung und Charakterisierung des P1-Promotors

Die stromaufwärts des Streptomyces lividans-galK-ATG liegenden Sequenzen wurden unter Verwendung des E. coli-galK-Promotor-Sondensystems von Brawner et al., Gene 40 (1985), 191, im Druck, auf Promotoren abgesucht. Das HindIII-MluI- Fragment (vgl. Tabelle A, Position 1 bis 5 der Restriktionskarte) wurde mit Sau3AI gespalten, in die einzige BamHI-Stelle von pK21 (Figur 2) ligiert und gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 in E. coli K21 (galK&supmin;) transformiert. pK21 ist ein Derivat von pSKO3 und ist ein das E. coli-galK-Gen enthaltender E. coli-Streptomyces-"shuttle- Vektor" (vgl. Figur 2). Die Konstruktion von pSKO3 wird von Rosenberg et al., Genetic Engineering 8 (1986), im Druck, beschrieben. Die Clone, die galK exprimierten, d. h., die, die eine Promotoraktivität aufwiesen, wurden auf MacConkey-Galactose- Platten identifiziert. Zwei galK&spplus;-Clone (mit der Bezeichnung pK21 MH1 und 2) wurden in Streptomyces 1326-12K (galK&supmin;) transformiert. Extrakte von Transformanten wurden in Ymglu und Ymgal gezüchtet und durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von anti-E. coli-Galactokinase-Antiserum analysiert. Die Blots zeigten signifikant höhere Mengen an Galactokinase in den Extrakten von Galactose-induzierten Kulturen.
Eine Restriktionsanalyse zeigte, daß pK21 MH1 und 2 eine 410 bp-Sau3AI- Insertion enthielten, die zwischen den HindIII- und BglII-Stellen (vgl. Tabelle A, Positionen 1 bis 2 der Restriktionskarte) enthalten war, wobei eine Southern-Blot- Analyse gemäß dem Verfahren von Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975), 503, durchgeführt wurde. Das clonierte Fragment wurde durch S1-Analyse unter Verwendung von aus Streptomyces lividans 1326-12K- und E. coli K21-Kulturen isolierter RNA analysiert. Das Fragment ergab nach einer S1-Spaltung ein aus 290 Nucleotiden bestehendes geschütztes Fragment (das zeigte, daß das 5'-Ende einer mRNA 290 bp stromaufwärts der Sau3AI-Stelle lag). Hybridisierungsexperimente (unter Verwendung von einzelsträngigen M13-Clonen dieses Bereichs) zeigten, daß die Richtung der Transkription, wie in Figur 2 dargestellt, von links nach rechts verlief (d. h., die Transkription verläuft in Richtung galK).
Eine übliche DNA-Sequenzanalyse und außerdem eine S1-Restriktionskartierung wurden zur Bestimmung des 5'-Endes der mRNA verwendet.
Die für die Regulierung der Galactose-Induktion von P1 verantwortlichen Sequenzen wurden durch Entfernung der stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle liegenden Sequenzen durch Verdau mit Nuclease Bal31 lokalisiert. Jede Veränderung der Promotorfunktion oder der Galactose-Induktion durch Entfernung dieser Sequenzen wurde unter Verwendung des zur Identifizierung von P1 verwendeten E. coli-galK- Promotor-Sonden-Plasmids untersucht.

(3) Konstruktion von gal-Promotor-Deletionen

Plasmid pHL5 wurde durch Clonierung eines DNA-Fragments, das Sequenzen von 100 bp stromabwärts der Startstelle der P1-Transkription und 216 bp stromaufwärts der Startstelle der P1-Transkription enthielt, in das Plasmid pUC19TT1 konstruiert. Plasmid pUC19TT1 wird von Norrander et al., Gene 26 (1983), 101-106, beschrieben und weist den Linker wie pUC18-TT6 auf. Vgl. Beispiel IB. Deletionen, die sich in die stromaufwärts liegende Sequenz vor P1 erstreckten, wurden durch Linearisierung von pHL5 mit HindIII und Behandlung der Enden mit der Nuclease Bal31 erzeugt. Die überstehenden Enden wurden anschließend mit dem Klenow- Fragment der DNA-Polymerase I repariert. Bal 31-behandeltes pHL5 wurde anschließend mit BamHI gespalten und auf einem 5 % Acrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen. DNA-Fragmente im Molekulargewichtsbereich von 100 bis 300 bp wurden aus dem Gel eluiert und in M13mp10 subcloniert, der mit HindII und BamHI gespalten worden war. [Vgl. Messing, Methods in Enzymology 101 (1983), 20]. Die einzelnen Deletionen wurden anschließend von der einzelsträngigen Phagen-DNA durch das Didesoxykettenabbruchverfahren von Sanger et al., siehe oben, sequenziert.

(4) Verknüpfung der P1-Promotor-Deletionen mit dem E. coli-galK-Gen

Die unterschiedlichen mp10-Clone wurden mit BamHI und HindIII gespalten. Die einzelnen Deletionen enthaltende DNA-Fragmente wurden aus Agarosegelen mit niedrigem Schmelzpunkt isoliert und anschließend mit pK21, das mit BamHI und HindIII gespalten wurde, ligiert (vgl. Figur 2). Nach der Transformation in E. coli MM294 wurde die Plasmid-DNA für jede der Deletionsderivate isoliert und in Streptomyces lividans 12K transformiert.

(5) Funktionsanalyse von Bal31-erzeugten Deletionen in S. lividans

Für jede einzelne Promotordeletion wurde in YM-Base (YEME) + 10 ug/ml Thiostrepton eine einzelne Thiostrepton-resistente Transformante bis zur späten log- Phase gezüchtet. Die Zellen wurden anschließend pelletiert, einmal in M56-Medium gewaschen und in M56-Medium resuspendiert (vgl. Miller et al., siehe oben). Die gewaschenen Zellen wurden anschließend zur Inokulierung von YM + 0,1 M MOPS (pH- Wert 7,2) + 10 ug/ml Thiostrepton, dem 1 % Galactose oder 1 % Glucose zugesetzt wurden, verwendet. Die Zellen wurden 16 Stunden gezüchtet und anschließend auf eine Galactokinase-Aktivität getestet.
Zehn individuelle pK21-Derivate, die 120, 67, 55, 34, 31, 24, 20, 18, 10 bzw. 8 bp der stromaufwärts der P1-Transkriptionsstartstelle liegenden Sequenz enthielten, wurden auf eine Expression der Galactokinase untersucht. Die Ergebnisse zeigten, daß die gesamte, für die Galactose-Induktion (d. h., Produktion von 10 bis 20fach höhere Mengen an Galactokinase in mit Galactose-gezüchteten Zellen im Vergleich zu mit Glucose gezüchteten Zellen) von P1 erforderliche Information in den 31 bp einer stromaufwärts von P1 liegenden Sequenz enthalten war. Eine Deletion, die 34 bp der Sequenz stromaufwärts von P1 beläßt, ist durch Galactose partiell induzierbar, da Galactose 6fach höhere Mengen an Galactokinase induzierte. Daher muß ein Ende des Operators in der Sequenz zwischen der Position -24 und -31 liegen. Die übrigen Deletionen, die 20, 18, 10 bzw. 8 bp der stromaufwärts liegenden Sequenz belassen, ergeben einen konstitutiven P1-Promotor, das heißt, die produzierten Mengen an Galactokinase waren bei einer Züchtung der Zellen in Gegenwart von Galactose oder Glucose äquivalent. Obwohl die Promotordeletionen, die 8 und 10 bp von P1 beließen, konstitutiv waren, war die produzierte Menge an Galactokinase im Vergleich zu Promotordeletionen, die 18 bis 120 bp der stromaufwärts liegenden Sequenz beließen, 10fach reduziert. Dieses Ergebnis zeigt, daß Sequenzen zwischen den Positionen -10 und -18 von P1 für die Promotorfunktion wesentlich sind.
Diese Daten stützen ein Modell, in dem die Galactose-Induktion von P1 mindestens partiell durch eine Operatorsequenz vermittelt wird. Ein Ende dieser Sequenz ist 24 bis 31 bp stromaufwärts der P1-Transkriptionsstartstelle. Durch eine Entfernung eines Teils oder des gesamten Operators wird ein partiell oder vollständig dereprimierter Promotor erhalten. Das andere Ende dieser Sequenz wurde durch diese Experimente nicht definiert, es ist jedoch höchst wahrscheinlich in der 24 bis 31 bp der stromaufwärts der P1-Transkriptionsstartstelle liegenden Sequenz enthalten. Ferner kann die Möglichkeit nicht ausgeschlossen werden, daß das 3'-Ende des Operators ebenfalls innerhalb der 100 bp stromabwärts der Transkriptionsstartstelle liegt, da diese Sequenzen im kleinsten, zur Galactose-Induktion erforderlichen Bereich enthalten sind. Diese Daten legen ferner den Schluß nahe, daß der mit der Operatorsequenz interagierende Faktor ein Repressorprotein ist. Schließlich gibt es keinen Beweis, der die Möglichkeit ausschließt, daß P1 durch andere Faktoren als einen Repressor (d. h., positiven Aktivator, beispielsweise das Lambda-Phagen-cII-Protein) reguliert wird, um das Transkript des Galactose-induzierbaren Promotors zu modulieren.

b) P2-Promotor

(1) Zusammenfassung

Der P2-Promotor des Streptomyces-gal-Operons liegt stromaufwärts des galE- Gens und transkribiert sowohl das galE- als auch das galK-Gen.
Die Expression des P2-Promotors ist konstitutiv (d. h., nicht mit Glucose reprimierbar/nicht mit Galactose induzierbar), wie durch S1-Analyse gezeigt wurde.

(2) Experimentelles Vorgehen: Isolierung, Lokalisierung und Charakterisierung des P2-Promotors

Die Existenz des Streptomyces-gal-Operon-P2-Promotors zeigte sich, als das BglII-MluI-Fragment (vgl. Tabelle A, Positionen 2 bis 5 der Restriktionskarte) der S. lividans 1326-DNA in das Plasmid pK21 inseriert wurde (vgl. Figur 2) und eine Galactokinase-Expression im damit transformierten Streptomyces lividans 1326-12K beobachtet wurde.
Eine DNA-Sequenzanalyse und S1-Analyse wurden zur Identifizierung des 5'- Endes des S. lividans-gal-Operon-P2 verwendet. Das 5'-Ende des P2-Promotor- Transkripts liegt innerhalb eines Bereichs von 100 bp stromaufwärts des abgeleiteten galE-ATG.

Beispiel 3

Nachweis einer polycistronischen mRNA im Streptomyces-gal-Operon

Eine S1-Analyse wurde zur Kartierung der stromaufwärts und stromabwärts des Streptomyces lividans-gal-Operon-galK-Gens liegenden Transkripte verwendet. Überlappende DNA-Fragmente von 1 bis 2 kb wurden aus Subclonen isoliert, weiter gespalten und endmarkiert. Die mRNA wurde vom 3'-Ende von galK zum stromaufwärts liegenden Ende bei P1 analysiert.
Das 3'-Ende des Streptomyces lividans-gal-Operon-Transkripts liegt wahrscheinlich in den ersten hundert Basen stromabwärts von galK. Die Fragmente, die an 3'-Enden markiert waren, die an Stellen in der galK-Sequenz lagen, wurden nicht auf ihrer gesamten Länge geschützt (S1-Analyse), wenn sie sich bis in diesen stromabwärts liegenden Bereich erstreckten. Ein Experiment zeigte einen möglicherweise geschützten Bereich, der 50 bis 100 bp stromabwärts des galK-Translationsstops endete. Die Existenz eines Transkriptionsterminators kann durch übliche Verfahren unter Verwendung eines Terminatorsondensystems nachgewiesen werden. Das gal-Operon- Transkript erstreckt sich eindeutig nicht zur PvuII-Stelle (vgl. Tabelle A, Position 8 der Restriktionskarte), da von dieser Stelle kein Schutz der 5'-markierten PvuII-Fragmente auf der gesamten Länge erfolgt.
5'-endmarkierte Fragmente von zwei PvuII-Fragmenten, Fragment I (Positionen 4 bis 6 der Restriktionskarte; vgl. Tabelle A) und Fragment II (Positionen 6 bis 8 der Restriktionskarte; vgl. Tabelle A), und die Insertion von pSau10 wurden als Quellen für Sonden für ein "S1-walking" vom 3'- zum 5'-Ende der mRNA verwendet. Alle Fragmente dieses Bereichs sind geschützt, ausgenommen das den P2-Promotor enthaltende Fragment, das einen partiellen und vollständigen Schutz zeigt. Der vollständige Schutz vor einer Spaltung durch S1 zeigt eine polycistronische mRNA, die stromaufwärts bei P1 initiiert und sich bis etwa 100 bp stromabwärts von galK erstreckt.
Die vorstehend beschriebenen Daten sind ein indirekter Nachweis einer polycistronischen mRNA des Streptomyces-gal-Operons. Die S1-Analyse unter Verwendung eines langen kontinuierlichen DNA-Fragments (z. B. des 4,5 kb-HindIII-SacI- Fragments; vgl. Kartenposition 7 in Tabelle A) wurde zum Nachweis der Transkriptgröße verwendet.

Beispiel 4

Lokalisierung der S. lividans-gal-Operon-galE- und -galT-Gene

(1) Zusammenfassung

Das S. lividans-gal-Operon-galE-Gen wurde auf einem 1,5 kb-PvuII- Fragment (Kartenposition 4 bis 6 in Tabelle A) von pLIVGAL1 lokalisiert (Figur 1).
Die S. lividans-gal-Operon-galE-codierenden Sequenzen erstrecken sich über die MluI-Stelle (Kartenposition 5 in Tabelle A).
Das S. lividans-gal-Operon-galT-Gen wurde im 1,15 kb-Nru-PvuII-Bereich (vgl. Tabelle A, Positionen 1a bis 4 der Restriktionskarte) von pSLIVGAL1 lokalisiert.
Die Richtung der S. lividans-gal-Operon-galE- und -galT-Transkription entspricht der des galK-Gens.

(2) Experimentelles Vorgehen

Die anderen auf pLIVGAL1 enthaltenden Funktionen mußten identifiziert werden. Insbesondere codiert dieses Plasmid das Enzym Galactoseepimerase (galE) oder das Enzym Galactosetransferase (galT). Das Streptomyces-gal-Operon-galK-Gen wurde durch seine Fähigkeit zur Komplementation eines E. coli-galK&supmin;-Wirts identifiziert. Daher wurde auch zur Identifizierung der Streptomyces-galT- und -galE-Gene untersucht, ob sie E. coli-galE&supmin;- bzw. -galT&supmin;-Wirte komplementieren. Ein E. coli-galT&supmin;- Stamm (CGSC-Stamm #4467, W3101) und zwei galE&supmin;-Stämme (CGSC-Stamm #4473, W3109 und CGSC-Stamm #4498, PL-2) wurden für einen Komplementationstest mit dem pSLIVGAL1-Clon verwendet.
Das HindIII-SphI-Fragment von etwa 9 kb (vgl. Tabelle A, Positionen 1 bis 16 der Restriktionskarte), das das Streptomyces lividans-gal-Operon-galK-Gen enthielt, wurde in pUC19 inseriert. Dieses Fragment lag im pUC19 so, daß die Transkription vom Plac-Promotor von pUC19 in der gleichen Richtung wie normalerweise für das Streptomyces-galK-Gen erfolgt. pUC19 wird von Yanisch-Perrou et al., Gene 33 (1983), 103, beschrieben. Die Komplementation wurde durch Züchtung auf MacConkey-Galactose-Platten getestet. Galactose-verwertende Zellen [galE&spplus;, galT&spplus; und galK&spplus;] sind auf diesem Medium rot bis rosa. Der pUC19 mit der HindIII-SphI- Insertion enthaltende E. coli-Stamm PL-2 (vgl. Beispiel 2) war auf der Indikatorplatte rosa, womit angezeigt wurde, daß das HindIII-SphI-Fragment das Streptomyces lividans-galE-Gen enthielt. Es wurde nachstehend durch Restriktionsanalyse nachgewiesen, daß das galE-Gen im 4,5 kb-HindIII-SacI (die SacI Stelle ist in der Nähe des Bereichs bei der Kartenposition 7 bis 8 in Tabelle A)-Fragment lag. Nach einer Entfernung der Sequenzen von der MluI-Stelle (Kartenposition 5 in Tabelle A) bis zur SacI-Stelle wurde keine galE-Komplementation in E. coli PL-2 nachgewiesen. Das 5'- Ende des galK-Gens liegt 70 bp von der MluI-Stelle entfernt. Daher schien es wahrscheinlich, daß die MluI-Stelle im 5'- oder 3'-Ende des galE-Gens enthalten war. Zur Ermittlung der Richtung der galE-Transkription wurde das HindIII-SacI-Fragment in pUC18 inseriert. In dieser Konfiguration wies das Streptomyces lividans-galK-Gen im Bezug auf Plac eine gegensätzliche Orientierung auf. Der pUC18-HindIII-SphI-Clon komplementierte E. coli PL-2 nicht, womit angezeigt wurde, daß galE in der gleichen Richtung wie galK transkribiert wird. Ferner konnte gefolgert werden, daß die MluI- Stelle im 3'-Ende des galE-Gens lag. Durch eine DNA-Sequenzanalyse des PvuII-MluI- Fragments (vgl. Tabelle A, Position 4 bis 5 der Restriktionskarte) wurde ein offener Leserahmen identifiziert, der ein Polypeptid mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von 33 000 D codiert. Das 5'-Ende dieses Leserahmens liegt etwa 176 bp von der PvuII-Stelle entfernt (vgl. Tabelle A, Position 4 der Restriktionskarte). Somit stützen die Sequenzierungsergebnisse die Schlußfolgerung, daß sich das 3'-Ende von galE über die MluI-Stelle erstreckt (vgl. Tabelle A, Position 5 der Restriktionskarte).
Entsprechende Experimente zur Lokalisierung des galT-Gens auf pSLIVGAL1 wurden mit galT&supmin;-Wirten versucht.
Der Bereich zwischen P1 und dem 5'-Ende von galE wurde zur Identifizierung des galT-Gens sequenziert. Durch Ableitung der Aminosäuresequenz von der DNA-Sequenz wurde ein Leserahmen identifiziert, der ein einen zur Hefetransferase homologen Bereich zeigendes Protein codiert.

Beispiel 5

Galactose-Induktion des S. lividans-gal-Operon-galK-Gens

(1) Zusammenfassung

Die Expression der Galactokinase wird innerhalb einer Stunde nach der Zugabe von Galactose zum Kulturmedium induziert.
Die Galactokinase-Expression ist innerhalb von 6 Stunden nach der Zuckerzugabe 10fach höher in Gegenwart von Galactose als in Gegenwart von Glucose oder in Gegenwart keiner Kohlenstoffquelle.

(2) Experimentelles Vorgehen

Die Galactose-Induktion des Streptomyces lividans-galK-Gens wurde durch Bestimmung der Galactokinase-Aktivität 1, 3, 6 und 24 Stunden nach der Zugabe von Galactose untersucht. Zwei Liter YM + 0,1 M MOPS (pH-Wert 7,2) wurden mit 2 x 10&sup7; Sporen von Streptomyces lividans 1326 inokuliert. Nach einer Züchtung für 21 Stunden wurde Galactose oder Glucose zu einer Endkonzentration von 1 % zugesetzt. Eine, drei, sechs und vierundzwanzig Stunden nach der Zugabe von Zucker wurden die Zellen isoliert und auf eine Galactokinase-Aktivität getestet. Die Gesamt-RNA wurde durch von Hopwood et al., siehe oben, beschriebene Verfahren hergestellt.
Eine Erhöhung der Galactokinase-Synthese wurde eine Stunde nach der Zugabe von Galactose beobachtet. Die Erhöhung nahm mit der Zeit zu (1 bis 24 Stunden). Eine S1-Analyse der aus den induzierten Kulturen isolierten RNA bestätigte, daß die Erhöhung der galK-Aktivität durch erhöhte Mengen des P1-Promotor- Transkripts bewirkt wurde.
Die S1-Daten und die Induktionsuntersuchungen stützen das nachstehend beschriebene Modell der Genexpression im Streptomyces-gal-Operon. Der P1-Promotor ist der Galactose-induzierbare Promotor. Das P1-Transkript schließt galT, galE und galK ein. Der P2-Promotor ist konstitutiv und sein Transkript schließt galE und galK ein.
Interessanterweise weist das E. coli-gal-Operon ebenfalls zwei Promotoren, P1 und P2, auf. [Vgl. Nusso et al., Cell 12 (1977), 847]. P1 wird durch eine cAMP- CRP-Bindung aktiviert, während P2 durch cAMP-CRP inhibiert wird. Die Translation der E. coli-gal-Operon-galE-codierenden Sequenz ist effizienter, wenn die Transkription bei P2 initiiert, der dazu dient, eine konstante Menge an Epimerase selbst in Abwesenheit von Galactose oder der Gegenwart von Glucose zu liefern [vgl. Queen et al., Cell 25 (1981), 241]. Die Epimerase bewirkt eine Umwandlung von Galactose in Glucose-1-phosphat während der Galactose-Verwertung und eine Umwandlung von UDP-Glucose in UDP-Galactose, die für die Zellwandbiosynthese von E. coli erforderlich ist. Es ist möglich, daß der P2-Promotor des Streptomyces-galK-Operons auch die Funktion hat, die Epimerase und Galactokinase in Abwesenheit von Galactose oder während des sekundären Metabolismus zu liefern.

Beispiel 6

Das S. coelicolor-gal-Operon

(1) Zusammenfassung

Die Restriktionskarte eines das S. coelicolor-galK-Gen enthaltenden Fragments ist mit der Restriktionskarte des S. lividans-gal-Operons identisch. (Vgl. Figur 3).
S. coelicolor kann auf Minimalmedien, die Galactose als einzige Kohlenstoffquelle enthalten, wachsen.
Die Galactokinase-Expression in S. coelicolor wird durch Zugabe von Galactose zu den Nährmedien induziert.
Ein Promotor, der zu P1 analog bzw. wahrscheinlich damit identisch ist, ist für die Galactose-Induktion des S. coelicolor-gal-Operons verantwortlich.

(2) Experimentelles Vorgehen

Ein partielles Sau3A-Fragment von etwa 14 kb, das das S. coelicolor-galK- Gen enthielt, wurde von K. Kendall und J. Cullum an der University of Manchester, Institute of Science and Technology, Manchester, UK, isoliert (unveröffentlichte Ergebnisse, persönliche Mitteilung). Sie konnten das S. coelicolor-galK-Gen durch Komplementation einer S. coelicolor-galK-Mutante in einem 3 kb-EcoRI-Fragment lokalisieren. Die Lage mehrerer Restriktionsstellen im S. lividans-gal-Operon stimmte mit der Lage überein, die innerhalb, stromaufwärts und stromabwärts des das S. coelicolor- galK-Gen enthaltenden EcoRI-Fragments gefunden wurde (Figur 3). Daher scheint es wahrscheinlich, daß die Genorganisation des S. coelicolor-gal-Operons mit der des S. lividans-gal-Operons identisch war.
Die Galactose-Induktion des S. coelicolor-galK-Gens wurde durch Immunblots untersucht. S. coelicolor wurde in YM + 1 % Galactose oder 1 % Glucose (Ymglu oder Ymgal) 20 Stunden bei 28ºC gezüchtet. Die Galactokinase-Expression wurde unter Verwendung von gegen gereinigte E. coli-Galactokinase hergestellten Kaninchen-Antiseren nachgewiesen. Das nachgewiesene Protein hatte ungefähr die Größe des E. coli- und S. lividans-galK-Genprodukts. Die Galactokinase-Expression ist Galactose-induziert, da sie nur nachgewiesen wurde, wenn S. coelicolor in Ym + Galactose (Ymgal) gezüchtet wurde.
S1-Nucleaseschutz-Untersuchungen wurden durchgeführt, um festzustellen, ob die Galactose-Induktion des S. coelicolor-gal-Operons von einem Promotor kontrolliert wurde, der zu dem S. lividans-P1-Promotor analog war. RNA wurde aus S. coelicolor, der in Ym + 1 % Galactose oder 1 % Glucose (Ymgal oder Ymglu) gezüchtet wurde, isoliert. Die zur S1-Analyse dieser RNA verwendete Hybridisierungssonde war ein den S. lividans-P1-Promotor, seine Transkriptionsstartstelle und das 5'-Ende des galT-Gens enthaltendes 410 bp-Sau3A-Fragment. Das durch diese Analyse nachgewiesene S1-geschützte Fragment wanderte zusammen mit dem geschützten Fragment, das bei Hybridisierung der Sonde an RNA nachgewiesen wurde, die aus in Galactose enthaltenden Medien gezüchteten S. lividans isoliert wurde. Dieses Ergebnis zeigte somit, daß die Galactose-Induktion des S. coelicolor-gal-Operons durch eine vom S. lividans- P1-Promotor nicht unterscheidbare Sequenz kontrolliert wurde.
Es soll angemerkt werden, daß die nachstehend beschriebenen Streptomyces- Stämme auf Medium mit Galactose als einziger Kohlenstoffquelle wachsen konnten:
S. albus J1074 (von Dr. Chater, John Innes Foundation, Norwich, England, erhalten)
S. carzinostaticus - ATCC-Hinterlegungsnummer 15944
S. carzinostaticus - ATCC-Hinterlegungsnummer 15945
S. antifibrinolyticus - ATCC-Hinterlegungsnummer 21869
S. antifibrinolyticus - ATCC-Hinterlegungsnummer 21870
S. antifibrinolyticus - ATCC-Hinterlegungsnummer 21871
S. longisporus - ATCC-Hinterlegungsnummer 23931
Die Abkürzung "ATCC" steht für American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA.
Zwar beschreiben die vorstehende Beschreibung und die Beispiele die Erfindung und deren bevorzugte Ausführungsformen vollständig, es ist jedoch selbstverständlich, daß die Erfindung nicht auf die jeweils beschriebenen Ausführungsformen beschränkt ist. Die Erfindung schließt daher alle Ausführungsformen ein, die im Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche liegen.

Claims

1. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend ein Streptomyces lividans-gal-Operon, das sich auf einem etwa 9 kb großen HindIII-SphI-Fragment der chromosomalen DNA von S. lividans 1326 befindet, oder ein beliebiges Streptomyces-Derivat davon, das in bezug auf die regulierbare Produktion der galT-, galE- und galK-Genprodukte im wesentlichen in der gleichen Weise funktioniert wie das natürlich vorkommende Streptomyces-gal-Operon.

2. Molekül nach Anspruch 1, wobei das Operon ein S. coelicolor-gal-Operon ist.

3. Molekül nach Anspruch 1 mit der folgenden codierenden Sequenz:

4. Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das außerdem eine fremde funktionelle DNA-Sequenz umfaßt, die funktionell mit einem solchen Operon verknüpft ist.

5. Rekombinates DNA-Molekül, umfassend eine Streptomyces lividans-gal-Operon-P2-Promotor-Expressionseinheit, die sich auf einem etwa 9 kb großen HindIII-SphI-Fragment der chromosomalen DNA von S. lividans 1326 mit einer NruI-Stelle befindet, wobei die P2-Transkriptionsstartstelle etwa 1,25 kb stromabwärts der NruI-Stelle liegt, oder ein beliebiges Streptomyces-Derivat davon, das in bezug auf die Produktion der galE- und galK-Genprodukte im wesentlichen in der gleichen Weise wie die natürlich vorkommende Einheit funktioniert.

6. Molekül nach Anspruch 5, wobei die Expressionseinheit eine S. coelicolor-gal-Operon-P2-Promotor-Expressionseinheit ist.

7. Molekül nach Anspruch 5 oder 6, das außerdem eine fremde funktionelle DNA-Sequenz umfaßt, die funktionell mit einer solchen Expressionseinheit verknüpft ist.

8. Rekombinates DNA-Molekül, umfassend einen durch einen Streptomyces lividans-gal-Operon-P1-Promotor regulierten Bereich, der sich auf einem etwa 9 kb großen HindIII- SphI-Fragment der chromosomalen DNA von S. lividans 1326 mit einer NruI-Stelle befindet, wobei die P1-Transkriptionsstartstelle etwa 0,10 kb stromabwärts der NruI- Stelle liegt, oder ein beliebiges Streptomyces-Derivat davon, das in bezug auf die regulierbare Produktion der galT-, galE- und galK-Genprodukte im wesentlichen in der gleichen Weise wie der natürlich vorkommende Bereich funktioniert.

9. Molekül nach Anspruch 8, wobei der Bereich ein vom S. coelicolor-gal-Operon-P1-Promotor regulierter Bereich ist.

10. Molekül nach Anspruch 8 oder 9, das außerdem eine fremde funktionelle DNA-Sequenz umfaßt, die funktionell mit dem regulierten Bereich verknüpft ist.

11. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend einen Streptomyces lividans-gal-Operon-P2-Promotor, der sich auf einem etwa 9 kb großen HindIII-SphI-Fragment der chromosomalen DNA von S. lividans 1326, mit einer NruI-Stelle befindet, wobei die P2-Transkriptionsstartstelle etwa 1,25 kb stromabwärts der NruI-Stelle liegt, oder ein beliebiges Streptomyces-Derivat davon, das in bezug auf die Ermöglichung der Bindung von RNA-Polymerase daran und die Transkription einer funktionellen DNA-Sequenz, die mit dem Promotor funktionell verknüpft ist, im wesentlichen in der gleichen Weise wie der natürlich vorkommende Promotor funktioniert.

12. Molekül nach Anspruch 11, wobei der Promotor ein S. coelicolor gal-Operon-P2-Promotor ist.

13. Molekül nach Anspruch 11 oder 12, das außerdem eine fremde funktionelle DNA-Sequenz umfaßt, die funktionell mit dem P2-Promotor verknüpft ist.

14. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend einen Streptomyces lividans-gal-Operon-P1-Promotor, der sich auf einem etwa 9 kb großen HindIII-SphI-Fragment der chromosomalen DNA von S. lividans 1326 mit einer NruI-Stelle befindet, wobei die P1-Transkriptionsstartstelle etwa 0,10 kb stromabwärts der NruI-Stelle liegt, oder ein beliebiges Streptomyces-Derivat davon, das in bezug auf die Ermöglichung der Bindung von RNA-Polymerase daran und der Transkription einer funktionellen DNA-Sequenz, die funktionell mit dem Promotor verknüpft ist, im wesentlichen in der gleichen Weise wie der natürlich vorkommende Promotor funktioniert.

15. Molekül nach Anspruch 14, wobei der Promotor ein S. coelicolor-gal-Operon-P1-Promotor ist.

16. Molekül nach Anspruch 14 oder 15, das außerdem eine fremde funktionelle DNA-Sequenz umfaßt, die funktionell mit dem P1-Promotor verknüpft ist.

17. Transformierte(r) Wirtsorganismus oder -zelle, umfassend das Molekül nach einem der Ansprüche 4, 7, 10, 13 oder 16.

18. Verfahren zur Herstellung eines (einer) transformierten Wirtsorganismus oder -zelle, der (die) das Molekül nach einem der Ansprüche 4, 7, 10, 13 oder 16 enthält, umfassend die Transformation eines (einer) geeigneten Wirtsorganismus oder -zelle mit einem solchen Molekül.

19. Rekombinanter DNA-Vektor, umfassend das Molekül nach einem der Ansprüche 4, 7, 10, 13 oder 16 und gegebenenfalls zusätzlich ein Replikon.

20. Transformierte(r) Wirtsorganismus oder -zelle, umfassend den rekombinanten DNA-Vektor nach Anspruch 19.

21. Verfahren zur Herstellung eines (einer) transformierten Wirtsorganismus oder -zelle, der (die) den rekombinanten DNA-Vektor nach Anspruch 19 enthält, umfassend die Transformation eines (einer) geeigneten Wirtsorganismus oder -zelle mit einem solchen Vektor.

22. Verfahren zur Expression einer fremden funktionellen DNA-Sequenz, umfassend die Züchtung eines (einer) transformierten Wirtsorganismus oder -zelle, der (die) den rekombinanten DNA-Vektor nach Anspruch 19 enthält, unter geeigneten Bedingungen, so daß die funktionelle DNA-Sequenz exprimiert wird.

23. Verfahren zur Regulation der Expression einer fremden funktionellen DA-Sequenz, umfassend die Züchtung eines (einer) transformierten Wirtsorganismus oder -zelle, der (die) den rekombinanten DNA-Vektor nach Anspruch 19 enthält, umfassend das Molekül nach Anspruch 4, 10 oder 16, unter geeigneten Bedingungen, so daß die Expression der Sequenz regulierbar ist.