DE3177298T2

DE3177298T2 - Verbesserte vektoren, verfahren zur herstellung solcher vektoren und zur expression von klonierten genen.

Info

Publication number: DE3177298T2
Application number: DE8181301413T
Authority: DE
Inventors: Walter Charles Fiers; Erik Rene Remaut
Original assignee: Biogen Inc
Current assignee: Biogen Inc
Priority date: 1980-06-06
Filing date: 1981-04-01
Publication date: 1993-07-01
Anticipated expiration: 2001-04-02
Also published as: ES500967A0; DD158918A5; IL62553A0; JPH0838177A; JP2001136966A; JP3158952B2; EP0041767B1; IE810757L; BG60443B2; IE63126B1; JPH0838176A; JP3158953B2; GR74282B; FI811009L; DK148681A; IL62553A; BR8101972A; YU87581A; JPH0787785B2; FI811009A7

Description

Technischer Bereich der Erfindung

Die Erfindung betrifft verbesserte Vektoren und Verfahren zur Herstellung solcher Vektoren und zur Expression von clonierten Genen. Die hier beschriebenen Vektoren und Verfahren sind durch eine verbesserte Expression von clonierten Genen, insbesondere bei denen von eukaryotischem Ursprung, in prokaryotischen Wirten charakterisiert. Wie der nachfolgenden Beschreibung entnommen werden kann, können diese Vektoren und Verfahren zur Verbesserung der Produktion von verschiedenen Polypeptiden, Proteinen und Aminosäuren in Wirtszellen verwendet werden.

Fachwissenschaftlicher Hintergrund

Die produzierte Menge eines Proteins in einer Wirtszelle wird von drei Hauptfaktoren beherrscht: der Kopienzahl seines Gens innerhalb der Zelle, der Effizienz der Transkription dieser Genkopien und der Wirksamkeit der Translation der erhaltenen Messenger-RNA ("mRNA"). Die Effizienz von Transkription und Translation (die zusammen die Expression darstellen) hängt andererseits von den üblicherweise vor den erwünschten codierenden Bereichen liegenden Nucleotidsequenzen ab. Diese Nucleotid- oder Expressionskontrollsequenzen legen, unter anderem, die Stelle fest, mit der die RNA-Polymerase zur Initiation der Transkription in Wechselwirkung tritt (die Promotorsequenz) und an die die Ribosomen zur Initiation der Translation binden und mit der mRNA (dem Produkt der Transkription) in Wechselwirkung treten.
Nicht jede dieser Expressionskontrollsequenzen wirkt mit gleicher Effizienz. Es ist daher oft vorteilhaft, die bestimmte codierende Sequenz eines gewünschten Proteins von seinen benachbarten Nucleotidsequenzen zu trennen und sie statt dessen zur Verbesserung der Expression mit anderen Expressionskontrollsequenzen zu verbinden. Nachdem dies erreicht worden ist, kann das so konstruierte DNA-Fragment zur Erhöhung der Zahl der Gen-Kopien innerhalb der Zelle und damit zur weiteren Verbesserung der Ausbeute an exprimiertem Protein in ein in hoher Kopienzahl vorkommendes Plasmid oder einen Abkömmling eines Bacteriophagen eingefügt werden.
Da eine Überproduktion selbst von üblicherweise nicht-toxischen Gen-Produkten für Wirtszellen schädlich sein und zu einer geringeren Stabilität von bestimmten Wirt-Vektor-Systemen führen kann, sollte eine gute Expressionskontrollsequenz in Ergänzung zur verbesserten Effizienz bei der Transkription und Translation von clonierten Genen auch steuerbar sein, um die Expression während des Bakterienwachstums regulieren zu können. Zum Beispiel können die bevorzugten Expressionskontrollsequenzen Sequenzen sein, die zur Vermeidung einer übermäßigen Anreicherung von Gen-Produkten bei der Proliferation der Wirtszellen abgeschaltet werden und anschließend wieder angeschaltet werden, um die Expression von großen Mengen der gewünschten Proteinprodukte zu fördern.
Mehrere Expressionskontrollsequenzen, die einige der vorstehend dargelegten Kriterien erfüllen, sind zur Verbesserung der Expression von Proteinen und Polypeptiden in bakteriellen Wirten verwendet worden. Zu diesen gehören zum Beispiel die Operator-, Promotor- und ribosomalen Bindungs- und Interaktionssequenzen des Lactose-Operons von E. coli (z. B. Itakura, K. et al., "Expression In Escherichia coli Of A Chemically Synthesized Gene For The Hormone Somatostatin", Science 198 (1977), 1056-63; Goeddel, D. V. et al., "Expression In Escherichia coli Of Chemically Synthesized Genes For Human Insulin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 106-10), die entsprechenden Sequenzen des Tryptophan-Synthetase-Systems von E. coli (Emtage, J. S. et al., "Influenza Antigenic Determinants Are Expressed From Haemagglutinin Genes Cloned In Escherichia coli", Nature 283 (1980), 171-74; Martial, J. A. et al., "Human Growth Hormone: Complementary DNA Cloning And Expression In Bacteria", Science 205 (1979), 602-06) und die Haupt-Operator- und Promotorregionen des Phagen λ (Bernhard, H. et al., "Construction Of Plasmid Cloning Vehicles That Promote Gene Expression From The Bacteriophage Lambda PL Promoter", Gene 5 (1979), 59-76). Diese Erfindung betrifft die letztere dieser Expressionskontrollsequenzen.
Der Bacteriophage λ enthält drei Haupt-Promotoren - PL, PR und P'R. Man weiß, daß ein Repressorprotein, das Produkt des Phagen-Gens cI, die Aktivität der Promotoren PL und PR kontrolliert. Der Repressor bindet an die jeweiligen Operatorregionen -OL und OR - dieser Promotoren und blockiert den Start der Transkription vom entsprechenden Promotor. Ferner besitzt eine Kopie des cI-Gens auf dem Chromosom eines lysogenen Stammes wegen der Autoregulation der Synthese (Ptashne, M. et al., "Autoregulation And Funktion Of A Repressor In Bacteriophage λ", Science 194 (1976), 156-61), die Fähigkeit zur vollständigen Repression der sich auf einem Multicopy-Plasmid befindenden PL- und PR-Promotoren (nachstehend beschrieben). Es ist bekannt, daß in Systemen unter Beteiligung des lac-Promotors die Repression des Promotors unter nicht-induzierenden Bedingungen nur partiell ist (Itakura, K. et al., vorstehend angegeben; Goeddel, D. V. et al., vorstehend angeführt).
Die durch den Repressor ausgeübte Kontrolle über PL- und PR-Promotoren kann durch Modifikation des Repressor- Proteins oder seines Gens verändert werden. Es ist zum Beispiel eine Mutation mit einem temperatur-empfindlichen Repressor-Protein bekannt. Bei Verwendung dieser Mutation können die Promotoren durch Veränderung der Temperatur der Kultur und damit der Stabilität des Repressors aktiviert oder inaktiviert werden.
Der Bacteriophage λ enthält auch die Gene N und cro. Das N-Gen wird von PL gesteuert. Man weiß, daß das Produkt des N-Gens als Antiterminator im Bacteriophagen λ wirkt. Antitermination hat den Vorteil, eine Termination oder Verzögerung der Transkription zu verhindern, die durch das Auftreten von Terminationssequenzen, Terminations-ähnlichen Sequenzen oder die Transkription verzögernden Sequenzen in den bestimmten DNA-Sequenzen, die transkribiert werden sollen, verursacht wird. Ferner können Polaritätseffekte, die durch vorhandene Nonsense-Codons in das Promotor-Transkript eingehen, durch das N-Gen-Produkt vermindert werden (N. Franklin & C. Yanofsky, "The N Protein Of λ: Evidence Bearing On Transcription Termination, Polarity And The Alteration Of E. coli RNA Polymerase", in "RNA Polymerase" (Cold Spring Harbor Laboratory) (1976), 693-706).
Man weiß, daß das vom PR-Promotor transkribierte Produkt des cro-Gens ein untergeordneter Repressor für die beiden Promotoren PL und PR ist (J. Pero, "Deletion Mapping Of The Site Of The tof Gene Product", in "The Bacteriophage λ", (Cold Spring Harbor Laboratory) (1971), 549-608; H. Echols, "Role Of The cro Gene In Bacteriophage λ Development", J. Mol. Biol. 80 (1973), 203-16; Johnson, A. et al., "Mechanism Of Action Of The cro Protein of Bacteriophage λ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 1783-87). Da das Produkt des cro-Gens zusammen mit den gewünschten Produkten der Wirt-Vektor-Kombination produziert wird, führt dies mit der Zeit zu einer verstärkten Wirkung des cro-Gen-Produktes auf die Expression des PL- oder PR-Promotors. Somit ist in jedem System, in dem eine kontinuierlich hohe Expression erwünscht ist, eine Deletion oder Inaktivierung des cro-Gens erforderlich.
Die Wirksamkeit des PL-Promotors für die Expression von clonierten Genen ist durch Aufnahme des Tryptophan- (trp)-Operons von E. coli in den Phagen λ gezeigt worden. (N. Franklin, "Altered Reading Of Genetic Signals Fused To The N Operon Of Bacteriophage λ: Genetic Evidence For Modification Of Polymerase By The Protein Product Of The N Gene", J. Mol. Biol 89 (1979), 33-48; Hopkins, A. et al., "Characterization Of λ trp - Transducing Bacteriophages Made In Vitro", J. Mol. Biol. 107 (1976), 549-69). Bei diesem modifizierten Phagen können die trp-Gene entweder von ihrem eigenen Promotor oder vom PL-Promotor transkribiert werden. Man stellte fest, daß die PL-vermittelte Expression im Vergleich zu der vom homologen trp-Promotor erreichten um das 3-4fache erhöht war.
Die Wirkung des Repressors auf die PL-vermittelte Expression wurde auch an diesem modifizierten Phagen gezeigt. Zum Beispiel war in Abwesenheit eines Repressors die PL-gesteuerte Expression der Anthranilat-Synthetase (des ersten Enzyms im trp-Operon) im Vergleich zur beobachteten Expression des Enzyms unter trp-Steuerung in Abwesenheit eines trp-Repressors um das 11fache erhöht (Davison, J. et al., "Quantitative Aspects Of Gene Expression In A λ trp Fusion Operon", Mol. Gen. Genet. 130 (1974), 9-20). Dennoch verringerte sich die PL-vermittelte Expression des Enzyms in Gegenwart eines aktiven cI-Gens um mindestens das 900fache. Diese Untersuchungen zeigten auch, daß eine kontinuierlich hohe Aktivität der PL-vermittelten Transkription nur möglich war, wenn das cro-Gen im Wirt nicht funktionsfähig war.
Obwohl die vorstehend beschriebenen λ-trp-Phagen die Nützlichkeit des PL-Promotors zur Expression von inserierten Genen zeigen, ist die durch Schwierigkeiten bei der Konstruktion und stabilen Vermehrung von cro&supmin;-Akzeptor-Phagen leicht eingeschränkte Verwendbarkeit solcher Phagen ein Problem. Die beobachtete hohe Expression läßt ohne solche Phagen mit dem Anwachsen der Menge des co-produzierten cro- Gen-Produkts und der Repression der Transkription vom PL-Promotor nach kurzer Zeit nach.
Während der Nachteil der λ-Phagen durch Clonierung der λ-Kontrollelemente in einem autonom replizierendem Plasmid, zum Beispiel Col EI oder seinen Abkömmlingen (Hedgpeth, J. et al., "Lambda Phage Promoter Used To Enhance Expression Of A Plasmid-Cloned Gene", Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 197-203, und Helinski, D. R. et al., "Construction and Properties of Plasmid Cloning Vehicles", in "Recombinant Molecules: Impact on Science and Society" (New York 1977), 151-65, Raven Press), oder durch die Konstruktion kleinerer, nur das λ-PL-System aufnehmender Plasmide (Bernhard, H. et al., vorstehend angegeben) teilweise überwunden werden konnte, ist bei den zuletzt genannten Vektoren der Abstand zwischen den zur Insertion von clonierten Genen verfügbaren Stellen und dem PL-Promotor ein Nachteil. Die Col EI-Vektoren, die von Helinski et al., vorstehend, beschrieben werden, enthalten zum Beispiel die trp-B-, C- und D-Gene und benötigen ein funktionelles N-Gen, das die Plazierung von Stellen für Gen- Insertionen begrenzt. In den von Bernhard et al. vorstehend beschriebenen Vektoren beträgt der Abstand zwischen den Stellen der Gen-Insertion und dem PL-Promotor auf dem Vektor zwischen etwa 300 bis etwa 8600 Basenpaaren. Die häufiger verwendeten EcoRI- und BamHI-Insertionsstellen sind in den Vektoren von Bernhard et al. nicht weniger als jeweils 600 bis 1000 Basenpaare vom PL-Promotor entfernt. Ferner liegt die HpaI-Stelle des Vektors pHUB2 von Bernhard et al., die zum PL-Promotor mit 300 Basenpaaren Abstand die geringste Entfernung hat, innerhalb der das N-Gen codierenden Sequenz dieses Vektors. Ferner kann die Wirkung des N-Gen- Produkts auf die Transkription der gewünschten DNA-Sequenzen bei den Vektoren von Bernhard et al. nicht ohne weiteres eingeschätzt werden, da das N-Gen-Produkt nicht von chromosomalem Ursprung, sondern statt dessen auf dem Plasmid selber codiert ist, das eine andere DNA-Sequenz zwischen PL und der Insertionsstelle aufweist, als die DNA-Sequenz zwischen PLOL und der Insertionsstelle des Vektors von Bernhard et al., der kein funktionelles N-Protein produziert. Neben der Führung des direkten Beweises für eine von den Vektoren von Bernhard et al. erbrachte erhöhte Proteinexpression fehlt schließlich bei Bernhard et al. auch eine Anleitung zur nutzbringenden Verwendung dieser Vektoren bei der Expression von eukaryotischen Gen-Produkten in prokaryotischen Wirten.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung löst die angesprochenen Probleme durch Lieferung eines verbesserten Vektors und eines Verfahrens zur Herstellung solcher Vektoren und zur Expression von clonierten Genen in Wirtszellen.
Es wird, genauer gesagt, erfindungsgemäß ein Vektorplasmid bereitgestellt, umfassend mindestens eine DNA-Sequenz, die den aus dem Bacteriophagen λ abgeleiteten linksgerichteten Promotor und Operator PLOL umfaßt, wobei die DNA-Sequenz dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens eine Endonuclease-Erkennungsstelle vorhanden ist, die weniger als etwa 300 Basenpaare stromabwärts von PLOL und zwischen PLOL und jeder ein N-Gen-codierenden Region in der DNA-Sequenz liegt.
Die PL-Promotoren des Phagen λ in den erfindungsgemäßen Vektoren fördern die Transkription der in diese Vektoren inserierten DNA-Sequenzen. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Vektoren sind ferner dadurch gekennzeichnet, daß zur Insertion der gewünschten DNA-Sequenzen in die Vektoren in der Nähe des PL-Promotors zahlreiche geeignete Erkennungsstellen vorhanden sind. Eine bevorzugte Entfernung zwischen dem PL-Promotor und den Erkennungsstellen beträgt weniger als etwa 300 Basenpaare, und stärker bevorzugt weniger als etwa 150 Basenpaare. Die bevorzugten erfindungsgemäßen Vektoren sind auch solche, in denen aktive N-Gene und aktive cro-Gene fehlen. Daher können durch die Wahl eines geeigneten Wirts - d. h. eines Wirts, der ein aktives chromosomales N-Gen enthält oder nicht enthält - sämtliche erfindungsgemäßen Vektoren zur Expression von DNA-Sequenzen in Gegenwart oder Abwesenheit des N-Gen-Produkts verwendet werden.
Wie aus der nachstehenden Beschreibung entnommen werden kann, erlauben die erfindungsgemäßen Vektoren und Verfahren die Konstruktion von Wirt-Vektor-Kombinationen, die eine verbesserte Expression von prokaryotischen und eukaryotischen Produkten in Wirtszellen ermöglichen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist ein schematischer Überblick einer Region des Phagen λ trp 44 cIAt&sub2; cro&supmin;. Es sind nicht sämtliche Restriktionsstellen dargestellt worden. Die Entfernungen sind, wie von E. Szybalski & W. Szybalski, "A Comprehensive Molecular Map Of Bacteriophage Lambda", Gene 7 (1979), 217-70 beschrieben, in λ-Einheiten eingetragen.
Fig. 2 ist ein schematischer Überblick der Konstruktion von erfindungsgemäßen Vektoren - pPLc2A, pPLc20 und pPLa23.
Fig. 3 ist ein schematischer Überblick der Konstruktion von erfindungsgemäßen Vektoren - pPLa2311, pPLa231 und pPLa8.
Fig. 4 ist ein schematischer Überblick der Konstruktion von erfindungsgemäßen Vektoren - pPLa83, pPLa831, pPLa832, pPLc2, pPLc23, pPLc236 und pPLc28.
Fig. 5 ist ein schematischer Überblick der Konstruktion von erfindungsgemäßen Vektoren - pPLc24.
Fig. 6 zeigt die Nucleotidsequenz der OLPL-Region von pPLa2311.
Fig. 7 zeigt die Umwandlung einer PstI-Stelle in β-Lactamase in eine BamHI-Stelle.
Fig. 8 ist ein Autoradiogramm, das die Proteinsynthese in E. coliΔK12HI (pPLa23) und E. coli M5219 (pPLa23) bei 28ºC und 42ºC aufzeichnet.
Fig. 9 ist ein Autoradiogramm, das die Proteinsynthese in E. coli K12ΔHI (pPLa23trpA&sub1;) und E. coli K12ΔHI (pPLa23trpA&sub2;) bei 28ºC und 42ºC aufzeichnet.
Fig. 10 ist ein Autoradiogramm, das die Proteinsynthese in E. coli K12ΔHI (pPLc23trpA&sub1;) bei 28ºC und 42ºC aufzeichnet.
Fig. 11 ist ein Autoradiogramm, das die Proteinsynthese in E. coli K12ΔHI (pPLa2311R&sub1;) bei 28ºC und 42ºC aufzeichnet.
Fig. 12 ist ein schematischer Überblick der Konstruktion von pPLc28SVt5 und pPLc28SVt5-37.
Fig. 13 zeigt die Konstruktion des pPLc28SVt5-37 aus pPLc28SVt5 auf der Nucleotidebene.
Fig. 14 ist ein Autoradiogramm, das die Proteinsynthese in E. coli K12ΔHI (pPLc28SVt5-37-9) bei 28ºC und 42ºC und einen Vergleich zwischen der mit Serum von einem SV40-Tumor-tragenden Hamster durchgeführten Immunpräzipitation der von diesem Wirt nach einer Induktion bei 42ºC synthetisierten Proteine und der mit demselben Serum erfolgten Immunpräzipitation des in SV-40-infizierten Nierenzellen des afrikanischen grünen Affen synthetisierten, authentischen kleinen t-Antigens auf zeigt.

Besonders bevorzugtes Verfahren zur Durchführung der Erfindung

Um ein besseres Verständnis der hier beschriebenen Erfindung zu ermöglichen, erfolgt die nachstehende genaue Beschreibung.
In der Beschreibung werden die folgenden Begriffe verwendet:
Nucleotid - Eine monomere, aus einem Zuckermolekül (Pentose), einem Phosphat und einer Stickstoff-enthaltenden, heterocyclischen Base bestehende DNA- oder RNA-Einheit. Die Base ist mit dem Zuckermolekül über ein glycosidisches Kohlenstoffatom (1'-Kohlenstoffatom der Pentose) verbunden und diese Kombination einer Base und eines Zuckers wird ein Nucleosid genannt. Jedes Nucleotid wird durch seine Base charakterisiert. Die vier DNA-Basen sind Adenin ("A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil ("U").
DNA-Sequenz - Eine lineare Anordnung von Nucleotiden, die miteinander über Phosphodiesterbindungen zwischen dem 3'- und 5'-Kohlenstoff von benachbarten Pentosen verbunden sind.
Codon - Eine DNA-Sequenz von drei Nucleotiden (ein Triplett), die über ihre Matritze oder Messenger-RNA ("mRNA") eine Aminosäure, ein Translationsstartsignal oder ein Translationsterminationssignal codiert. Zum Beispiel codieren die Nucleotidtripletts TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG die Aminosäure Leucin ("Leu"), TAG, TAA und TGA sind Translationsstopsignale und ATG ist ein Translationsstartsignal.
Polypentide - Eine lineare Anordnung von Aminosäuren, die untereinander über Peptidbindungen zwischen der α-Amino- und Carboxyl-Gruppe benachbarter Aminosäuren verbunden sind.
Strukturgen - Eine DNA Sequenz, die über ihre mRNA eine für ein bestimmtes Polypeptid charakteristische Sequenz von Aminosäuren codiert.
Transkription - Der Vorgang zur Erzeugung von mRNA von einem Strukturgen.
Translation - Der Vorgang zur Produktion eines Polypeptids von einer mRNA.
Expression - Der Vorgang, den ein Strukturgen zur Produktion eines Polypeptids durchlaufen muß. Es ist eine Kombination von Transkription und Translation.
Plasmid - Eine nicht-chromosomale, doppelsträngige DNA Sequenz, die ein intaktes Replicon in der Weise umfaßt, daß das Plasmid in einer Wirtszelle repliziert wird. Wenn das Plasmid in einen einzelligen Organismus eingeführt wird, können als Folge der Plasmid-DNA die Eigenschaften dieses Organismus verändert oder transformiert werden. Zum Beispiel transformiert ein Plasmid, das das Gen für die Tetracyclin- Resistenz (Tet®) trägt, eine zuvor Tetracyclin-empfindliche in eine dagegen resistente Zelle. Eine durch ein Plasmid transformierte Wirtszelle wird als "Transformante" bezeichnet.
Phage oder Bacteriophage - Bakterien-Viren, von denen viele aus DNA-Sequenzen bestehen, die in eine Proteinhülle oder einen Mantel ("Capsid") eingekapselt sind.
Clonierungsvehikel oder Vektor - Ein Plasmid, eine Phagen-DNA oder eine andere DNA-Sequenz, die zur Replikation in einer Wirtszelle befähigt ist und die durch eine oder eine kleine Zahl von Endonuclease-Erkennungs- oder Restriktionsstellen charakterisiert ist, an denen solche DNA-Sequenzen in einer vorherbestimmbaren Weise gespalten werden können, ohne daß dies mit dem Verlust von einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA verbunden ist, z. B. der Replikation, Produktion von Hüllproteinen oder dem Verlust von Promotor- oder Bindungsstellen, und die einen Marker trägt, geeignet für die Verwendung bei der Identifizierung von transformierten Zellen, z. B. Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz.
Clonieren - Das Verfahren zum Erhalt einer Population von Organismen oder DNA-Sequenzen, die sich von einem solchen Organismus oder von einer solchen Sequenz durch asexuelle Reproduktion ableiten.
Rekombinante DNA-Moleküle oder Hybrid-DNA - Ein Molekül, bestehend aus DNA-Segmenten von verschiedenen Genomen (der gesamten DNA einer Zelle oder eines Virus), die außerhalb von lebenden Zellen über ihre Enden miteinander verbunden worden sind und die Fähigkeit aufweisen, einige Wirtszellen zu infizieren und darin erhalten zu bleiben.
Expressions-Kontrollsequenz - Eine Sequenz von Nucleotiden, die die Expression von Genen kontrolliert und steuert, wenn sie mit solchen Genen funktionell verbunden ist.

Die Wirtszellen dieser Erfindung

Jede der zahlreichen erhältlichen Wirtszellen kann in den erfindungsgemäßen Wirt-Vektor-Kombinationen verwendet werden. Die Auswahl eines bestimmten Wirts hängt von einer Reihe von auf dem Fachgebiet bekannten Faktoren ab. Diese schließen zum Beispiel die Verträglichkeit mit dem gewählten Vektor, die Toxizität der vom Hybrid-Plasmid codierten Proteine, die Einfachheit der Gewinnung des erwünschten Proteins, die Expressionseigenschaften, die biologische Sicherheit und die Kosten ein. Es versteht sich, daß diese Faktoren untereinander abgewogen werden müssen, da nicht jeder Wirt ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül gleich wirksam exprimiert. Im Rahmen dieser allgemeinen Kriterien können verwendbare wirte Stämme von E. coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus Stearothermophilus und weitere Bacilli, Hefen und weitere Pilze, tierische oder Pflanzliche Wirte, wie tierische einschließlich menschlicher) Zellen oder Pflanzenzellen in Kultur, oder weitere Wirte einschließen.
Die bevorzugten Wirtszellen dieser Erfindung sind die E. Coli-Stämme K12 cItsΔHI (K12 M72 lacam Δ trpEA2 Sm® (ΛcI857 Nam7Nam53ΔHI bio&spplus;)) ("K12ΔHI") (Bernhard, H. et al., vorstehend angegeben) und M5219 (K12 M72 lacam Δ trpam Sm® (λcI857 ΔHI bio252)) ("M5219") (H. Greer, "The kil Gene Of Bacteriophage λ", Virology 66 (1975), 589-604).
Beide Stämme enthalten einen defekten, nicht-entferne baren λ-Prophagen, der ein mutiertes cI-Gen trägt. Das mutierte Gen codiert einen Temperatur-empfindlichen Repressor und ermöglicht so durch Einstellung der Temperatur eine Transkription vom zu aktivierenden PL-Promotor - bei 28ºC ist der Repressor aktiv und die Transkription vom PL-Promotor wird unterdrückt, bei 42ºC hingegen ist der Repressor inaktiv ist und die Transkription vom PL-Promotor wird angeschaltet.
Die ΔHI-Deletion des Prophagen entfernt einen Teil des cro-Gens und alle anderen Gene im Prophagen weiter rechts vom cro-Gen (Castellazzi, M. et al., "Isolation And Characterization Of Deletions In Bacteriophage λ Residing As Prophage In E. coli K12", Mol. Gen. Genet. 117 (1972), 211-18).
Der Stamm M5219 enthält ferner eine bio252-Deletion, die sämtliche Gene links von cIII entfernt, einschließlich des kil-Gens im Prophagen. Der Stamm M5219 exprimiert nach einer Temperaturinduktion darüberhinaus ein funktionelles N-Gen-Produkt von einem chromosomalen N-Gen. Der Stamm K12ΔHI weist andererseits zwei amber-Mutationen im N-Gen auf, die es funktionell N-negativ werden lassen.
Daher ermöglichen beide Stämme ein experimentelles An- oder Abschalten der Expression vom PL-Promotor. Ferner ermöglicht eine Wahl von K12ΔHI oder M5219 den Ablauf einer PL-vermittelten Transkription in Abwesenheit oder Gegenwart des N-Gen-Produkts. Und, da weder E. coli K12ΔHI noch E. coli M5219 ein funktionelles cro-Gen-Produkt exprimieren, wird in ihnen eine sekundäre Repression der PL-vermittelten Expression vermieden.

Konstruktion von mehreren Ausführungsformen von erfindungsgemäßen Vektoren

Obgleich es mehrere gut bekannte Quellen für die Promotoren des λ-Phagen gibt, wurde zum Zweck der nachfolgenden, erläuternden Beispiele der Konstruktion von erfindungsgemäßen Vektoren der Phage λ trp 44 cIAt&sub2; cro&supmin; als die Quelle für Promotoren des Phagen λ ausgewählt.
Die Herstellung des Phagen λ trp 44 cIAt&sub2; cro&supmin; wird von N. Franklin, "The N Operon of Lambda: Extent And Regulation As Observed In Fusions To The Tryptophan Operon Of Escherichia Coli", in "The Bacteriophage λ" (Cold Spring Harbor Laboratories) (1971), 621-38) beschrieben. Die At&sub2;-Mutation im cI-Gen macht den Repressor thermolabil (M. Lieb, "Studies Of Heat-Inducible Lambda Bacteriophages. I. Order Of Genetic Sites And Properties Of Mutant Prophages", J. Mol. Biol. 16 (1966), 149-63). Die cro&supmin;-Mutation verhindert eine sekundäre Repression der PL-Funktion. Obgleich die cro&spplus;-Phagen für eine längerwährende Expression weniger bevorzugt werden, versteht es sich natürlich, daß sie in den Vektoren dieser Erfindung verwendet werden können. Der Phage trägt auch ein funktionelles N-Gen und einen aktiven PL-Promotor. Der Phage liefert eine 3- bis 4fach erhöhte Expression des trp-Enzyms im Vergleich zur Ausbeute durch ihren eigenen homologen trp-Promotor (N. Franklin, vorstehend angegeben).
λ trp 44 cIAt&sub2; cro&supmin;-DNA wurde aus diesem Phagen durch Phenolextraktion der über CsCl gereinigten Phagenpartikel hergestellt. Die Struktur der PLOL-Region dieses Phagen ist in Fig. 1 dargestellt.
Der PL-Promotor und die benachbarten Operatoren (OL), sind zusammen mit dem Beginn der N-Gen-Sequenz, innerhalb eines Bereichs der DNA begrenzt, der etwa 100 Basenpaare lang und bei etwa 73,4% auf der λ-Karte (Fig. 1) lokalisiert ist (Maniatis, T. et al., "Recognition Sequences Of Repressor And Polymerase In Operators Of Bacteriophage λ", Cell 5 (1975), 109-13; J. Dahlberg & F. Blattner, "Sequence Of Promotor-Operator Proximal Region Of The Major Leftward RNA Of Bacteriophage λ", Nucleic Acids Res. 2 (1975), 1441-58). Der PR-Promotor und der benachbarte Operator (OR), sind zusammen mit dem Beginn der cro-Gen-Sequenz, ebenso innerhalb eines Bereichs der DNA begrenzt, der bei etwa 76,6% auf der λ-Karte (Fig. 1) lokalisiert ist (Maniatis, T. et al., vorstehend angegeben).
Sämtliche Verfahren zur Isolierung dieser Regionen aus der DNA des Phagen λ können zur Herstellung von Clonen, die die gewünschten Promotor-Sequenzen enthalten, verwendet werden. Mehrere Kombinationen von Restriktionsenzymen können zum Beispiel zur Entnahme der gewünschten Regionen aus der DNA des Phagen λ verwendet werden (Fig. 1). Diese Fragmente können anschließend direkt zur Herstellung von Clonen verwendet werden, oder die Fragmente können vor der Clonierung durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren zur Verkürzung oder Verlängerung weiter behandelt werden.
Nach der Herstellung kann das geeignete DNA-Fragment in sämtliche Clonierungsvehikel oder Vektoren inseriert werden. Verwendbare Clonierungsvehikel können zum Beispiel aus Abschnitten von chromosomalen, nicht-chromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen bestehen, zum Beispiel aus verschiedenen bekannten Abkömmlingen von SV40 und bekannten bakteriellen Plasmiden, zum Beispiel Plasmiden von E. coli, einschließlich Col E1, pCR1, pBR322, pMB9 und deren Derivaten, aus Plasmiden mit einem breiteren Wirtsspektrum, wie RP4, aus Phagen-DNAs, zum Beispiel den zahlreichen Abkömmlingen des Phagen λ, weiteren DNA-Phagen und filamentösen, einzelsträngigen DNA-Phagen, wie M13, und aus Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmid- und Phagen-DNAs oder von Hefe-Plasmiden, wie dem 2 u-Plasmid oder deren Abkömmlinge, stammen.
Ferner können innerhalb jedes bestimmten Clonierungsvehikels mehrere Stellen zur Insertion des DNA-Fragmentes des Phagen λ verwendet werden. Diese Stellen werden üblicherweise durch die Restriktions-Endonuklease, die sie spaltet, benannt. In pBR322 sind zum Beispiel verschiedene Restriktionsstellen zur Insertion eines DNA-Fragmentes verfügbar (Bolivar, F. et al., "Construction And Characterization Of New Cloning Vehicles II. A Multi-Purpose Cloning System", Gene 2 (1977), 95-113; J. G. Sutcliffe, "pBR322 Restriction Map Derived From the DNA Sequence: Accurate DNA Size Markers Up To 4361 Nucleotide Pairs Long", Nucleic Acids Res. 5 (1978), 2721-28). Vergleiche auch die Fig. 2 und 4. Es versteht sich von selbst, daß ein für diese Erfindung nützliches Clonierungsvehikel keine Restriktionsstelle zur Insertion des DNA-Fragmentes des Phagen λ aufweisen muß. Zur Herstellung des gewünschten erfindungsgemäßen Vektors kann das Vehikel statt dessen durch andere Verfahren an das Fragment angefügt werden.

A. Erfindungsgemäße Vektoren, die den PL-Promotor in einer im Bezug auf den Replikationsursprung im entgegengesetzten Uhrzeigersinn liegenden Orientierung enthalten

1. pPLa23

Die Fig. 2, auf die nun Bezug genommen wird, zeigt, wie ein erfindungsgemäßer verbesserter Vektor, pPLa23, in einer Reihe von Schritten hergestellt wurde. Diese werden in Fig. 2 dargestellt und nachstehend ausführlicher beschrieben.

(a) Als Zwischenprodukt dienendes Plasmid pPLc2A

Die vorstehend isolierte λ trp 44 cIAt&sub2; cro&supmin;-DNA wurde zur Entfernung eines sich von etwa 71,3% bis 81,02% auf der λ-Karte (Fig. 1 und 2) erstreckenden Fragmentes mit BamHI und EcoRI gespalten. In ähnlicher Weise wurde pBR322 mit BamHI und EcoRI gespalten und das DNA-Fragment des Phagen λ in die Stelle inseriert aus der das pBR322- EcoRI-BamHI-Fragment entfernt worden war (Fig. 2).
Der erhaltene Vektor erhielt die Bezeichnung pPLc2A, das "c" verweist auf die im Hinblick auf den Replikationsursprung im Uhrzeigersinn liegende Orientierung des PL-Promotors. Die λ-betreffende Information auf diesem Molekül erstreckt sich von der BamHI-Stelle des Phagen (71,3% λ) bis zur EcoRI-Stelle (81,02% λ) und schließt das Gen N, die OLPL-Region, die Gene rex und cI (mutiert), die ORPR-Region, die Gene cro (mutiert) und cII und Teile des Gens O ein (Fig. 1 und 2).
E. coli C600 (kompetent gemacht durch CaCl&sub2;-Behandlung) wurde mit dem vorstehend hergestellten pPLc2A unter geeigneten (Sicherheits-)Bedingungen transformiert. Die Transformanten wurden bei 34ºC auf LB-Platten selektiert, die mit 10&sup9; Plaque-bildenden Einheiten (pfu) der Mutante des Phagen-λklar (M. Lieb, vorstehend angegeben) angeimpft waren und ferner 100 ug/ml Carbenicillin enthielten. Das ausgewählte λ-DNA-Fragment schließt das cIAt&sub2;-Gen ein, und daher werden die dieses Fragment enthaltenden Transformanten bei 34ºC gegen die Phagen-Mutante λklar resistent sein. Ferner schließt das gewählte pBR322-Fragment das Gen für Ampicillin-Resistenz ein, so daß Wirte, die durch Plasmide transformiert wurden, bei denen dieses Gen intakt war, im Gegensatz zu nicht derart transformierten Wirten in Nährmedien wachsen werden, die dieses Antibiotikum enthalten.
Zwanzig Transformanten wurden ausgewählt und die Kulturen bei 34ºC im LB-Medium, das 100 ug/ml Carbenicillin und 10&supmin;² M MgCl&sub2; enthielt, gezüchtet. Um sicherzustellen, daß die Transformanten wirkliche, ein cI-Gen enthaltende Transformanten und keine der seltenen zur Adsorption des λ-Phagen unfähige Bakterien waren, wurden Aliquots der Kulturen entweder mit λklar oder λvir infiziert (F. Jacob & E. Wollman, "Etude Genetique d'un Bacteriophage Tempere d'Escherichia Coli. I. Le Systeme Genetique du Bacteriophage λ", Ann. Inst. Pasteur 87 (1954), 653-90). Alle zwanzig Transformanten zeigten sich gegenüber λklar resistent und gegenüber λvir empfindlich.
Form-I-DNA von einer dieser zwanzig Transformanten wurde unter Verwendung von Standardverfahren isoliert, mit EcoRI und BamHI gespalten, und ihre Länge wurde mittels Standardmarkern bestimmt. Die DNA zeigte zwei Banden, die den erwarteten Längen des pBR322-Fragmentes und des Fragmentes des Phagen λ entsprachen.

(b) Als Zwischenprodukt dienendes Plasmid pPLc20 - Entfernung des BglII-Fragmentes von pPLc2A

Die λ-Region von pPLc2A schließt vier BglII-Stellen ein, die bei 73,77, 78,80, 80,16 und 80,28 00 λ liegen (Fig. 1 und 2) (V. Pirotta, "Two Restriction Endonucleases From Bacillus Globigi", Nucleic Acids Res. 3 (1976), 1747-60; H. Szybalski & W. Szybalski, "A Comprehensive Molecular Map of Bacteriophage λ", Gene 7 (1979), 217-70).
Die pPLc2A-DNA wurde zur Entfernung des BglII-Fragmentes zwischen 73,77% λ und 80,28% λ mit BglII gespalten, bei einer DNA-Konzentration von weniger als 1 ug/ml wieder legiert, und E. coli W6 (λrex) (durch CaCl&sub2; kompetent gemacht), das einen chromosomalen λ-Repressor cI aufweist, wodurch die PL-abhängige Transkription beendet wird, wurde damit transformiert (Fig. 2). Carbenicillin-resistente Clone wurden durch Züchtung in 100 ug/ml Carbenicillin-enthaltender L-Brühe selektiert und unter Verwendung einer T&sub4; rII 638-Mutante auf Verlust der λrex-Funktion abgesucht. Die λrex-Funktion verhindert das Wachstum der T&sub4; rII 638-Mutante (B. Howard, "Phage λ Mutants Deficient In rII Exclusion", Science 158 (1967), 1588-89). Das durch diese BglII-restringierten Transformanten nicht verhinderte Wachstums der T&sub4; rII 638-Mutante, verglichen mit dem ausbleibenden Wachstum der Mutante in durch pPLc2A transformierten Wirten zeigte daher, daß die rex-Funktion durch die BglII-Deletion aus dem rekombinanten DNA-Molekül pPLc2A eliminiert worden war.
Die Restriktionsanalyse der rekombinanten DNA-Moleküle dieser mit BglII restringierten Transformanten zeigte eine einzige vorhandene BglII-Stelle. Ferner ergab die Spaltung durch EcoRI und BamHI zwei Fragmente - ein dem erwarteten pBR322-Fragment entsprechendes und das andere mit der nach der Entfernung des Bereichs zwischen den BglII-Stellen 73,77% λ und 80,28% λ erwarteten Größe (1900 Basenpaare) des DNA-Fragmentes des Phagen λ. Dieses modifizierte Plasmid erhielt die Bezeichnung pPLc20. Seine λ-DNA- Insertion erstreckt sich von der BamHI-Stelle (71,3%) bis zur BglII-Stelle (73,77%) und von der BglII-Stelle (80,28%) bis zur EcoRI-Stelle (81,02%). Es schließt das N-Gen, die OLPL-Region und einen Teil des O-Gens ein (Fig. 1).
Während sich der letzte Teil dieses Beispiels der Konstruktion von Ausführungsformen von erfindungsgemäßen Vektoren auf den PL-Promotor konzentriert - der PR-Promotor wurde mit dem BglII-BglII-Fragment aus pPLc2A entfernt - versteht es sich von selbst, daß die gleichen Manipulationen zur Entfernung des PL-Promotors aus pPLc2A und zur Konstruktion eines den PR-Promotor behaltenden Vektors hätten verwendet werden können. Ferner könnten im Schutzbereich der Erfindung liegende Vektoren, die sowohl die PL- als auch die PR-Promotoren so enthalten, daß die beiden Promotoren mit- oder gegeneinander auf die Expression von inserierten DNA-Sequenzen wirken, mit gleichen Verfahren konstruiert werden.

(c) pPLa23 - Einführung einer EcoRI-Stelle in kurzer Entfernung stromabwärts von PL

Das in pPLc20 vorhandene BglII-BamHI-Fragment enthält eine einzelne HaeIII-Stelle [73,1% λ, Fig. 1], die etwa 150 Nucleotide stromabwärts von PL liegt (B. Allet und R. Solem "Separation And Analysis Of Promotor Sites In Bacteriophage λ DNA By Specific Endonucleases", J. Mol. Biol. 85 (1975), 475-84). Diese Stelle kann durch Legierung von glatten Enden eines freiliegenden HaeIII-Endes an ein freiliegendes EcoRI-Ende, das vorher durch Verlängerung des zurückstehenden 3'-Endes mit DNA-Polymerase I in Gegenwart von Desoxyribonucleosidtriphosphaten in ein glattes Ende überführt worden war, in eine EcoRI-Stelle umgewandelt werden (Backman, K. et al., "Construction Of Plasmids Carrying The cI Gene Of Bacteriophage λ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73 (1976), 4174-78). Einzelheiten des Verfahrens werden nachstehend beschrieben und in Fig. 2 erläutert.
Sechs pmol pBR322 wurden durch EcoRI gespalten. Nach der Inaktivierung des Enzyms durch Wärmebehandlung wurde die DNA ausgefällt und in 250 ul eines Puffers, der 50 mM Tris- HCl (pH-Wert 7,8), 5 mM MgCl&sub2;, 1 mM β-Mercaptoethanol, 2 uM von jedem der vier Desoxyribonucleosidtriphosphate (mit α-³²P-dATP (345 Ci ³²P/mmol)) und 50 ug BSA/ml enthielt, gelöst. Sechs Einheiten der DNA-Polymerase I von E. coli (Worthington) wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde 90 Min. bei 16ºC inkubiert. Dieses Verfahren führte im linearisierten pBR322 zu einer Umwandlung der freiliegenden 3'-Enden der EcoRI-Stelle in glatte Enden.
Nach der Inaktivierung des Enzyms durch Wärmebehandlung wurde das Gemisch auf 50 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethenol eingestellt, und die DNA mit BamHI gespalten. Die Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem 1,4% Agarose-Gel getrennt und durch Autoradiographie überwacht. Ein das größere der beiden Fragmente - pBR322, das eine freiliegende BamHI-Stelle und eine EcoRI-Stelle mit glatten Enden besaß - enthaltendes Gel-Scheibchen wurde herausgeschnitten und bei -90ºC eingefroren. Dieses Stückchen Agarose wurde anschließend 20 Min. bei 20000 UpM zentrifugiert (SS34 -Rotor (Sorvall)). Der abgetrennte Überstand wurde entfernt, und die Schritte des Einfrierens und Zentrifugierens wurden zweimal wiederholt. Etwa 30% der im Agarose-Scheibchen enthaltenen DNA wird unter diesen Bedingungen in den Übersband übertragen. Die so übertragene DNA wurde aus den vereinigten Überständen ausgefällt und in 10 ul 10 mM Tris- HCl (pH-Wert 7,4), 50 mM NaCl und 7 mM β-Mercaptoethanol gelöst
Zwei pmol pPLc20 wurden mit BglII und BamHI gespalten und die Fragmente auf einem Agarose-Gel getrennt. Das kleinere Fragment (BglII-BamHI) wurde, wie vorstehend beschrieben, aus dem Gel eluiert und zur Herstellung eines Gemisches von BamHI-BspRI- und BspRI-BglII-Fragmenten, wobei das letztere den PL-Promotor trägt, mit BspRI, einem Isoschizomer von HaeIII, gespalten (Kiss, A. et al., "A New Sequence- Specific Endonuclease (Bsp) From Bacillus Sphaericus", Gene 1 (1977), 323-29). Die Enzyme BglII und BamHI stellen identische freiliegende Enden her, so daß ein freiliegendes BglII-Ende mit einem freiliegenden BamHI-Ende und umgekehrt legiert werden kann. Ferner ist das Ergebnis jeder der beiden Legierungen kein Substrat mehr für BglII oder BamHI, sondern wird vom Enzym Sau3Al (MboI) erkannt (V. Pirotta, vorstehend angegeben).
Zwei pmol des vorstehend erwähnten, größeren pBR322- EcoRI-BamHI-Fragmentes wurden mit 0,8 pmol des BamHI-BspRI- und BspRI-BglII-Fragmentgemisches legiert. Im Anschluß an die Legierung (die freiliegende BamHI-Stelle auf dem pBR322- Fragment ist zur Legierung mit entweder den freiliegenden BglII- oder BamHI-Stellen des pPLc20-Fragmentes verfügbar, und die mit glatten Enden versehene EcoRI-Stelle des pBR322- Fragmentes ist zur Legierung mit den BspRI-(HaeIII)-Stellen des pPLc20-Fragmentes verfügbar) wurde das Gemisch zur Entfernung der rekombinanten Moleküle, die das in den pBR322-Vektor inserierte, nicht erwünschte BamHI-BspRI-Fragment enthielten, mit BamHI gespalten. Mit dem erhaltenen Gemisch wurde E. coli M5219 transformiert und die Transformanten auf Carbenicillin-Resistenz selektiert. Insgesamt wurden 23 Transformanten erhalten. Sämtliche dieser Transformanten waren Tetracyclin-empfindlich (das Tetracyclin-Resistenzgen ist auch in pBR322 enthalten), da die BamHI-Spaltung von pBR322 zur Folge hatte, daß es kein intaktes Tet® codierendes Gen im modifizierten Plasmid (Figur 2) mehr gab.
Die fortbestehende Existenz des Ph-tragenden BspRI- BglII-Fragmentes in diesen Clonen wurde durch Spaltung der DNA mit HincII überprüft. Da pBR322 zwei HincII-Stellen (j. Sutcliffe, vorstehend angegeben) und das erwartete λ PL-Fragment eine einzige HincII-Stelle (73,4% λ, Fig. 1) (B. Allet und R. Solem, vorstehend angegeben) enthält, sollten richtig konstruierte rekombinante DNA-Moleküle drei HincII- Stellen enthalten. Von den 23 erhaltenen Transformanten enthielten fünf die drei vorhergesagten HincII-Stellen. Drei von ihnen besaßen eine einzige EcoRI-Stelle, was ein Anzeichen für die richtige Verbindung zwischen der BspRI- (HaeIII-)Stelle des pPLc20-Fragmentes und der mit glatten Enden versehenen EcoRI-Stelle des pBR322-Fragmentes in diesen Clonen war. Diesen drei Clonen fehlte auch eine BamHI- Stelle, wie dies wegen der erwarteten Legierung des BglII- Endes des pPLc20-Fragmentes an das BamHI-Ende des pBR322- Fragmentes vorhergesagt werden konnte. Einer dieser Clone wurde für die weitere Arbeit ausgewählt und erhielt die Bezeichnung pPLa23 (Fig. 2).
pPLa23 besteht aus einem pBR322-Fragment, das sich von der BamHI-Stelle (Basenpaar 377 von pBR322) zur EcoRI- Stelle (Basenpaar 4362 von pBR322) erstreckt (J. Sutcliffe, vorstehend angegeben) (Fig. 2). Der verbleibende Teil von pBR322 ist in pPLa23 durch das Fragment der λ trp 44 cIAt&sub2; cro&supmin;-DNA ersetzt worden, das zwischen der HaeIII-Stelle bei 73,1% λ (jetzt eine wiederhergestellte EcoRI-Stelle) und der BglII-Stelle bei 73,77% λ (jetzt eine Sau3A-Stelle) (Fig. 2) liegt. Die Größe dieses Fragmentes wurde durch Agarose-Gelelektrophorese auf etwa 300 Basenpaare geschätzt. Innerhalb dieses Fragmentes befinden sich die OLPL-Region und die ersten 115 Nucleotide des N-Gen-Transkripts (J. Dahlberg & F. Blattner, vorstehend angegeben). Die Richtung der Transkription vom Pi-Promotor aus verläuft von der BglII-Stelle zur HaeIII-Stelle und in derselben Richtung wie die Transkription vom β-Lactamase-Promotor von pBR322 (J. Dahlberg & F. Blattner, vorstehend angegeben; J.Sutcliffe, vorstehend angegeben).
Zwei Merkmale des Plasmids sind von besonderem Interesse: 1) Die den PL-Promotor und das β-Lactamase-Gen codierenden Regionen sind auf einem einzigen HaeII-Fragment vorhanden, das durch die HaeII-Stellen bei den Basenpaaren 2720 und 436 von pBR322 markiert wird (Fig. 3) (J. Sutcliffe, vorstehend angegeben; B. Allet und R. Solem, vorstehend angegeben; V. Pirotta, vorstehend angegeben). 2) Der Replikationsursprung liegt auf einem HaeII-Fragment von 370 Basenpaaren, das dem das β-Lactamase-Gen tragenden HaeII-Fragment benachbahrt ist (Fig. 3). Ein funktioneller Replikationsursprung erfordert, daß die Verbindung um die HaeII-Stelle in Position 2720 beibehalten wird (Oka, A. et al., "Nucleotide Sequence Of Small Col El Derivatives. Structure Of The Regions Essential For Autonomous Replication And Colicin El Immunity", Mol. gen. Genet. 172 (1979), 151-59). Diese Merkmale von pPLa23 wurden zur Einführung eines zweiten Antibiotika-Resistenz-Markers in den Vektor verwendet.

2. pPLa231 und pPLa2311 - Einführung eines Kanamycin-Resistenz-Markers in pPLa23

Die Fig. 3, auf die nun Bezug genommen wird, zeigt die Schritte, die zur Herstellung weiterer erfindungsgemäßer Vektoren aus pPLa23 verwendet wurden. Diese Schritte werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
Ein die Resistenz gegen Kanamycin codierendes HaeII- Fragment wurde aus dem Plasmid pMK20 erhalten (Kahn, M. et al., "Plasmid Cloning Vehicles Derived From Plasmids ColEl, F, R6K und RK2", Methods in Enzymology 68 (1979), 268-80). Der Replikationsursprung auf dem Plasmid pMK20 ist weitgehend innerhalb eines HaeII-Fragmentes von 359 Basenpaaren enthalten. Der Ursprung erstreckt sich jedoch auch über die Verbindung zwischen diesem Fragment und einem benachbarten HaeII-Fragment hinweg (Kahn, M. et al., vorstehend angegeben). Die Nucleotidsequenz im Bereich der HaeII-Stelle ist mit der in pBR322 im Bereich der HaeII-Stelle in Position 2720 gefundenen Sequenz identisch (Oka, A. et al., vorstehend angegeben; J. Sutcliffe, vorstehend angegeben).
Ein Gemisch von pPLa23 und pMK20 wurde mit HaeII vollständig gespalten und wieder legiert, und E. coli M5219 (durch CaCl&sub2;-Behandlung kompetent gemacht) damit transformiert (Fig. 3). Erfolgreich transformierte Kolonien wurden aufgrund ihrer Resistenz gegen Carbencillin und Kanamycin selektiert, da nur Clone, die das β-Lactamase-Gen von pBR322 und das Kanamycin-Gen von pMK20 enthalten, die doppelte Antibiotika-Resistenz zeigen werden. Zwölf Transformanten mit der doppelten Resistenz wurden ausgewählt. Plasmid-DNA wurde, wie vorstehend beschrieben, aus diesen Transformanten isoliert und durch HaeII-Spaltung und Größenbestimmung der Fragmente auf einem 6% Acrylamid-Gel analysiert. Fünf dieser Clone wiesen nur drei HaeII-Fragmente auf - ein dem HaeII-Fragment von pPLa23 entsprechendes HaeII-Fragment, das den PL-Promotor und das β-Lactamase-Gen trägt, ein dem HaeII-Fragment von pMK20 entsprechendes HaeII-Fragment, das das Kanamycin-Resistenz-Gen trägt, und ein kleines HaeII-Fragment, das auch von pMK20 abstammt und zur Plasmid-Replikation erforderlich ist (Fig. 3).
Die fünf ausgewählten Clone wurden weiter untersucht, um die Orientierung des das Kanamycin-Gen enthaltende HaeII- Fragment von pMK20 im Hinblick auf die wiederhergestellte EcoRI-Stelle im HaeII-Fragment von pPLa23 festzustellen. Man weiß, daß das HaeII-Fragment von pMK20, das das Kanamycin- Gen enthält, eine einzige asymmetrische HindIII-Stelle enthält (Kahn, M. et al., vorstehend angegeben) (Fig. 3). Daher bietet diese Stelle eine Möglichkeit, die Orientierung des Fragmentes festzustellen.
Die fünf Clone wurden mit HindIII und EcoRI gespalten und die Größe der erhaltenen Fragmente, wie vorstehend beschrieben, bestimmt. Vier der fünf Clone besaßen den größeren Teil des mit HindIII gespaltenen, das Kanamycin-Gen enthaltenden HaeII-Fragmentes von pMK20, das dem den Ursprung enthaltenden, kleinen HaeII-Fragment und der rekonstruierten EcoRI-Stelle benachbart ist. Ein Clon wies die entgegengesetzte Orientierung auf. Diese zwei Gruppen von Clonen erhielten willkürlich die Bezeichnungen pPLa231 bzw. pPLa2311 (Fig. 3).
pPLa2311 wurde willkürlich aus den vorstehend konstruierten Plasmiden ausgewählt und die Nucleotidsequenz der PL-Region bestimmt.
Vor der Sequenzierung wurden zwei Gruppen von Restriktionsfragmenten aus pPLa2311 hergestellt - EcoRI- HincII-Fragmente und HincII-EcoRI-XhoI-Fragmente (in Fig. 3 nicht dargestellt). In beiden Fällen wurde pPLa2311 durch das erste Restriktionsenzym gespalten und die erhaltenen Fragmente mit ³²P unter Verwendung der T&sub4;-Polynucleotidkinase (P-L-Biochemicals) markiert. Anschließend wurden die Fragmente durch das zweite Restriktionsenzym oder, im Fall von EcoRI-XhoI, Paar von Enzymen, gespalten, und die Fragmente auf einem 6% Agarose-Gel getrennt. Die Sequenzierung erfolgte in üblicher Weise unter Verwendung der Verfahren von A. Maxam & W. Gilbert, "A New Method For Sequencing DNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 560-64.
Die Nucleotidsequenz dieser Region ist in Fig. 6 dargestellt. Sie reicht von der HaeII-Stelle im pBR322 bis zur wiederhergestellten EcoRI-Stelle an der Verbindung zwischen dem Fragment des λ-Phagen und pBR322. Die ermittelte Sequenz weist im Vergleich zu bekannten Sequenzen die nachfolgenden Eigenschaften auf: (1) Die Nucleotidsequenz der OLPL-Operator-Promotor-Region ist identisch mit der Sequenz dieser Region im Phagen λ (Maniatis, T. et al., vorstehend angegeben); (2) die Sequenz zwischen der HaeII-Stelle und der Sau3A-Stelle an der Verbindung zwischen dem λ-Phagen- Fragment und pBR322 ist identisch mit der des ursprünglichen pBR322 (J. Sutcliffe, vorstehend angegeben); (3) Die Sequenz des N-Gen-Transkripts stimmt mit der Ausnahme einer Deletion eines Adenosinrestes in Position 41 des Transkripts mit der Sequenz überein, die auf der mRNA-Ebene von Dahlberg & Greenblatt (vorstehend angegeben) ermittelt wurde, und (4) die Sequenz schließt nicht das Translations-Startsignal des N-Gens ein (N. Franklin & G. Bennett, "The N Protein Of Bacteriophage λ, Defined By Its DNA Sequence, Is Highly Basic", Gene 8 (1979), 107-19)

3. pPLa4 und pPLa8 - Umwandlung der PstI-Stelle im β-Lactamase-Gen von pPLa2311 in eine BamHI-Stelle

Die Fig. 3 und 7 zeigen einen schematischen Überblick der Umwandlung der PstI-Stelle im β-Lactamase-Gen vom pPLa2311 in eine BamHI-Stelle. Das Plasmid pPLa2311 wurde mit PstI linearisiert. Im Anschluß an die Phenol- und Chloroformextraktion wurde die DNA ausgefällt, erneut mit/in einer Konzentration von 50 pmol/ml in 25 mM NaCOOCH&sub3; (pH-Wert 4,5), 1 mM ZnCOOCH&sub3; und 125 mM NaCl gelöst und zur Entfernung der überstehenden 3'-Enden 90 Min. bei 25ºC mit 1,5 Einheiten S1-Nuclease (Sigma) pro pmol DNA behandelt (Fig. 7). Die Umsetzung wurde durch Zusatz von EDTA zu einer Konzentration von 5 mM beendet. Die S1-Nuclease wurde durch 10-minütige Inkubation des Gemisches bei 70ºC in Gegenwart von 0,2% SDS und anschließender Phenol- und Chloroformextraktion entfernt. Die DNA wurde durch Zusatz von 4 Vol. 2 M NH&sub4;COOCH&sub3; und 14 Vol. Ethanol ausgefällt.
Die gewonnene DNA mit glatten Enden wurde an im 10fachen molaren Überschuß vorliegende BamHI-Linker-Moleküle (Collaborative Research Inc.) legiert (Bahl, C. et al., "A General Method For Inserting Specific DNA Sequences Into Cloning Vehicles", Gene 1 (1977), 81-92) (Fig. 7). Im Anschluß an die Spaltung mit BamHI und die erneute Legierung bei einer niedrigen DNA-Konzentration (Fig. 7) wurde das Gemisch mit PstI gespalten, um gegen die Moleküle zu selektionieren, die der S1-Nucleasebehandlung entgangen waren und eine intakte PstI-Stelle behalten hatten. Mit zwei ug behandelter DNA wurde anschließend E. coli M5219 transformiert und die Transformanten durch ihre Kanamycin-Resistenz selektiert. Eine Gesamtzahl von 10 Transformanten wurde erhalten, bei denen zwei keine PstI-Stelle aufwiesen, aber eine BamHI- Stelle erhalten hatten. Die rekombinanten DNA-Moleküle dieser letzten beiden Transformanten erhielten die Bezeichnung pPLa8 und pPLa4 (Fig. 3, pPLa4 ist in Fig. 3 nicht dargestellt). Die Fragmente, die nach einer kombinierten EcoRI- BamHI-Spaltung der rekombinanten DNA-Moleküle dieser Transformanten erhalten wurden, liefen zusammen mit den nach einer EcoRI-PstI-Spaltung vom pPLa2311 erhaltenen Fragmenten auf einem 1,4% Agarose-Gel. Somit war die PstI-Stelle in pPLa2311 durch eine BamHI-Stelle ersetzt worden.
Es wird wieder auf Fig. 7 Bezug genommen, die die Wirkung der vorstehend beschriebenen Schrittfolge auf das β-Lactamase-Gen darstellt. Wie in Fig. 7 gezeigt, ist das Endergebnis der Konstruktion der Ersatz des Ala-Aminosäurerestes an Position 182 im β-Lactamase-Protein durch die Sequenz Arg-Ile-Arg. Da dieser Austausch das Leseraster des β-Lactamase-Gens intakt läßt, wurde erwartet, daß die Transformanten der rekonstruierten Clone eine Resistenz gegen Carbenicillin zeigen würden. Unerwarteterweise waren die durch pPLa4 und pPLa8 transformierten Wirtszellen nicht gegen Carbenicillin resistent.

4. pPLa83 - Einführung einer BamHI-Stelle in die unmittelbare Nähe der EcoRI-Stelle von pPLa8

Das Plasmid pAD3 (ein Geschenk von H. Schaller) enthält eine Sequenz von 47 Basenpaaren, die in die BamHI- Stelle von pBR322 inseriert worden war. Diese Sequenz besteht aus den nachfolgenden Einheiten - BamHI-Stelle - EcoRI-Stelle - Lactose-Operator - EcoRI-Stelle - BamHI- Stelle. Zur Insertion dieser Sequenz in die wiederhergestellte BamHI-Stelle von pPLa8, wurden pPLa8 und ein 10facher Überschuß vom pAD3 mit BamHI gespalten, erneut ligiert, und E. coli W6 (λrex) wurde damit transformiert (Fig. 4). Die Transformanten wurden auf Platten, die ein Minimalmedium, 50 ug/ml Kanamycin, 0,1% Glucose, 40 ug/ml X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) enthielten, selektiert (J. Miller, "Experiments In Molecular Genetics" (Cold Spring Harbor Laboratory) (1972), 48), da die Gegenwart von X-Gal-Farbe den Nachweis von Transformanten, die ein Lactose-Operator-Fragment enthalten, ermöglicht. Die den Lactose-Operator enthaltenden Transformanten sind in dem Medium tatsächlich blau und deshalb von den übrigen Transformanten leicht unterscheidbar.
Die rekombinanten DNA-Moleküle wurden von einer der blauen Kolonien, wie vorstehend beschrieben, isoliert und mit EcoRI gespalten. Die erhaltenen zwei Fragmente laufen auf einem Agarose-Gel im wesentlichen zusammen mit den zwei Fragmenten, die mit EcoRI-BamHI-Spaltung von pPLa8 erhalten wurden, wodurch bestätigt wurde, daß das gewünschte Fragment von 47 Basenpaaren aus pAD3 an der rekonstruierten BamHI- Stelle in pPLa8 korrekt eingefügt worden war. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pPLa83 (Fig. 4).

5. pPla831 - Eine BamHI-Stelle näher an den PL-Promotor im pPLa83 heranführen

Um eine BamHI-Stelle näher an den PL-Promotor in pPLa83 heranzuführen, wurde das EcoRI-EcoRI-Fragment durch Spaltung von pPLa83 mit EcoRI deletiert und bei einer verdünnten DNA-Konzentration erneut legiert (Fig. 4). Die Transformation von E. coli W6 (λrex) mit den erhaltenen rekombinanten DNA-Molekülen und das Wachstum auf Platten, die ein Minimalmedium enthielten, das, wie vorstehend beschrieben, mit X-Gal und Kanamycin versetzt war, ermöglichten eine Selektion der keine Lactose-Operator-Region enthaltenden Clone. Die Spaltung der DNA aus einer ausgewählten Transformante mit BamHI-XhoI und ein Vergleich des Laufverhaltens der erhaltenen Fragmente mit den beiden Fragmenten aus der EcoRI-XhoI-Spaltung von pPLa8 bestätigte, daß, wie erwartet, die BamHI-Stelle im modifizierten Plasmid etwa 150 Basenpaare vom PL-Promotor entfernt war. Das modifizierte Plasmid erhielt die Bezeichnung pPLa831.
Es versteht sich natürlich, daß Veränderungen, die solchen der vorstehend in Abschnitten 3, 4 und 5 beschriebenen ähnlich sind, zur Bereitstellung weiterer, weniger als 300 Basenpaare von dem gewählten Promotor und den gewählten Operatoren in den erfindungsgemäßen Vektoren entfernte Endonuclease-Erkennungsstellen vorgenommen werden können. Beispiele solcher Manipulationen schließen die nachstehend beschriebenen ein.

6. pPLa832 - Insertion einer HindIII-Stelle in der unmittelbaren Nähe der BamHI-Stelle von pPLa831

Plasmid pAD16 (ein Geschenk von H. Schaller) enthält ein in die BamHI-Stelle von pBR322 inseriertes 36 Basenpaare großes Fragment, bestehend aus: BamHI-Stelle-HindIII-Stelle- HindIII-Stelle-BamHI-Stelle. Zur Insertion dieser Sequenz in die BamHI-Stelle von pPLa831 wurden pPLa831 und ein 10facher Überschuß von pAD16 mit BamHI gespalten und erneut legiert, E. coli M5219 wurde damit transformiert und auf Kanamycin- Resistenz selektiert (Fig. 4). Da es kein einfaches Absuchverfahren zur Feststellung der richtigen Insertion des gewünschten BamHI-Fragmentes in pPLa831 gibt, hing die Analyse der Transformanten, die in Gegenwart von Kanamycin wuchsen, von der Restriktionsspaltung einzelner, nach dem Zufallsprinzip ausgewählter Clone ab. Unter den 32 analysierten Clonen wurde einer gefunden, der nach einer Spaltung mit HindIII zwei Fragmente produzierte (Fig. 4). Die Größe dieser Fragmente war auf einem 1,4% Agarose-Gel von den nach einer BamHI-HindIII-Spaltung oder EcoRI-HindIII-Spaltung von pPLa831 erhaltenen Fragmenten nicht zu unterscheiden. Dieses modifizierte Plasmid erhielt die Bezeichnung pPLa832.

B. Vektoren, die den PL-Promotor im Hinblick auf den Replikationsursprung in der dem Uhrzeigersinn entsprechenden Orientierung enthalten

1. pPLc2 - Clonierung des PL-tragenden Fragmentes von pPLa832

Ein äquimolares Gemisch von pBR322 und pPLa832 wurde mit BamHI und anschließend mit HindIII gespalten (Fig. 4). Das Gemisch wurde erneut legiert, M5219 wurde damit transformiert und auf Carbenicillin-Resistenz selektiert. Da die mit der richtigen Konstruktion hergestellten rekombinanten DNA-Moleküle das intakte Gen für Tetracyclin nicht mehr enthielten, wurden die Transformanten auch auf den Verlust der Tetracyclin-Resistenz abgesucht. Die rekombinanten DNA- Moleküle wurden, wie vorstehend beschrieben, aus ausgewählten Transformanten isoliert und durch Spaltung analysiert. Das ausgewählte Plasmid enthielt eine einzige HindIII- Stelle. Eine kombinierte HindIII-BamHI-Spaltung ergab zwei Fragmente, die auf einem Agarose-Gel im wesentlichen zusammen mit den beiden, durch eine einzige EcoRI-Spaltung entstandenen Fragmenten wanderten. Die Gegenwart des PL-tragenden Fragmentes wurde durch HincII-Spaltung bestätigt. Dieses Enzym spaltete den Vektor in drei Fragmente, deren Größen mit der Struktur der in Fig. 4 dargestellten Fragmente übereinstimmte. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pPLc2, wobei das "c" als Hinweis dafür dient, daß der PL-Promotor im Hinblick auf den Replikationsursprung im Uhrzeigersinn orientiert ist.

2. pPLc23 - Entfernung einer EcoRI-Stelle aus pPLc2

Das Plasmid pPLc2 enthält zwei EcoRI-Stellen - eine, die vom Ursprungsvektor pBR322 abstammt, und eine, die in der Nähe der BamHI-Stelle liegt, die durch Insertion der HindIII-BamHI-Fragmente von pPLa832 eingeführt worden war (Fig. 4). Die von pBR322 abstammende EcoRI-Stelle wurde durch Spaltung von pPLc2 mit HindIII und XhoI und anschließende, 30-minütigen Spaltung mit Bal31 bei 25ºC in 0,6 M NaCl, jeweils 12,5 mM CaCl&sub2; und MgSO&sub4;, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,1) entfernt. Die Exonuclease Bal31 verkürzt schrittweise 3'- und 5'-Enden (Gray, H. et al., "Extracellular Nucleases of Pseudomonas Bal31. I. Characterization Of Single Strand-Specific Deoxyriboendonuclease And Double-Strand Deoxyriboexonuclease Activities", Nucleic Acids Res. 2 (1975), 1459-92)
Das Gemisch wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert, bis zu einer DNA-Konzentration von 1 ug/ml verdünnt und legiert. Im Anschluß an die Legierung wurde die DNA zur Entfernung der ursprünglichen Plasmidmoleküle nochmals mit XhoI und HindIII gespalten, M5219 wurde damit transformiert und auf Carbenicillin-Resistenz selektioniert. Eine Transformante mit einer fehlenden HindIII- und XhoI-Stelle wurde gefunden. Dieses Plasmid enthielt eine einzige EcoRI-Stelle und besaß drei HincII-Stellen (Fig. 4). Diese letzte Eigenschaft bestätigte, daß die PL-Region noch vorhanden war. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pPLc23.
Um das Ausmaß des exonucleolytischen Abbaus durch das Enzym Bal31 einzuschätzen, wurde die pPLc23-DNA gleichzeitig mit BamHI und PstI gespalten und die Größe der Fragmente auf einem 1,4% Agarose-Gel bestimmt. Verglichen mit dem PstI- BamHI-Fragment vom ursprünglichen pPLc2 zeigte das PstI-BamHI-Fragment von pPLc23 eine Deletion von über 800 Basenpaaren. Verglichen mit der EcoRI-PstI-Spaltung bestätigte die kombinierte Spaltung mit EcoRI-Pstl-HaeII, daß die HaeII-Stelle an der Verbindungsstelle zwischen dem PL-tragenden Fragment und dem Kanamycin-Fragment erhalten worden war.

3. pPLc236 - Einführung einer HindIII-Stelle in pPLc23

Das Plasmid pPLc23 enthält je eine einzige EcoRI- und BamHI-Stelle, die etwa 150 Nucleotide stromabwärts vom PL-Promotor liegen (Fig. 4). Eine HindIII-Stelle zur Insertion wurde durch Legierung des aus pPLa832 erhaltenen BamHI- HindIII-HindIII-BamHI-Fragmentes in die BamHI-Stelle von pPLc23 in pPLc23 eingeführt. Die Transformanten wurden in M5219 erhalten und durch eine Restriktionsanalyse auf die Gegenwart einer HindIII-Stelle abgesucht. Die Struktur eines repräsentativen Clons wurde durch Agarose-Gelelectrophorese der nach PstI-EcoRI, PstI-BamHI oder PstI-HindIII-Spaltung erhaltenen Fragmente bestätigt. Die Fragmente, die nach jeder dieser kombinierten Spaltungen erhalten wurden, wanderten auf einem 1,4% Agarose-Gel im wesentlichen zusammen, was zeigte, daß die EcoRI-, BamHI- und HindIII-Stellen sich in unmittelbarer Nachbarschaft voneinander befinden. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pPLc236 (Fig. 4).
Der größere Teil des Plasmids pPLc236 stammt von der BamHI-Stelle an Position 377 (J. Sutcliffe, vorstehend angegeben) bis mindestens zum Beginn des β-Lactamase-Gens etwa an der Position 4160 (J. Sutcliffe, vorstehend angegeben) von pBR322. Der verbleibende Teil besteht aus 1) Sequenzen, die von einem Teil des Kanamycin-Gens abstammen, das zwischen der Xhol-Stelle und einem HaelI-Ende dieses Fragmentes liegt; 2) ein Haell-BamHI-Fragment, das den PL-Promotor enthält, etwa 300 Nucleotide umfaßt und aus pPLa832 stammt; 3) eine Sequenz, die BamHI-HindIII-HindIII-BamHI-Stellen codiert.

4. pPLc28 - Deletion aus pPLc236

Eine BalI-Stelle überlappt die beiden benachbarten HindIII-Stellen in pPLc236 (in Fig. 4 nicht dargestellt). Das Plasmid enthält auch eine einzige PvuII-Stelle am Basenpaar 2067 des pBR322-Anteils (J. Sutcliffe, vorstehend angegeben) (Fig. 4). Sowohl das Enzym Ball als auch PvuII erzeugen glatte Enden. pPLc236-DNA wurde mit Ball und PvuII gespalten und bei niedriger DNA-Konzentration erneut ligiert. Durch Selektion auf Carbenicillin-Resistenz wurden Transformanten in M5219 erhalten. Die DNA eines repräsentativen Clons wurde durch Spaltung analysiert. Eine BamHI-Spaltung erzeugte ein einziges Fragment, das auf einem 1,4% Agarose-Gel mit dem größeren Teil von pPLc236 nach BamHI- PvuII-Spaltung zusammen lief. Die kombinierte Spaltung entweder mit PstI-EcoRI, PstI-BamHI oder PstI-HindIII erzeugte in jedem Fall zwei Fragmente, von denen das kleinere auf einem 1,4% Agarose-Gel im wesentlichen zusammen mit einem PstI-EcoRI-Fragment lief, das aus pPLc236 erhalten wurde. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pPLc28 (Fig. 4).
pPLc28, wie die übrigen beschriebenen erfindungsgemäßen Plasmide, kann natürlich zur Insertion anderer Restriktionsstellen noch weiter manipuliert werden. Zum Beispiel ist ein Fragment mit folgendem Inhalt: Xba-Restriktionsstelle - Sal-Restriktionsstelle - Xba-Restriktionsstelle - Pst-Restriktionsstelle - Xba-Restriktionsstelle, in die HindIII-Restriktionsstelle von pPLc28 inseriert worden. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pPLc2819. Eine weitere ähnliche Manipulation lieferte ein Plasmid, das ein in die BamHI-Stelle von pPLc28 inseriertes Fragment mit der Pst-Restriktionsstelle - Sal-Restriktionsstelle - Xba-Restriktionsstelle - Sal-Restriktionsstelle - Xba-Restriktionsstelle enthielt. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pPLc2833.

5. pPLc24 - Insertion der Ribosomenbindestelle und des aminoterminalen Teils des Replicase-Proteins des Bacteriophagen MS2 in pPLc28

Ein EcoRI-BamHI-Fragment von 431 Basenpaaren, das die Ribosomenbindestelle und die ersten 98 Aminosäurereste des Bacteriophagen MS2-Replicasegens codiert, wurde aus dem Plasmid pMS2-7 (Devos, R. et al., "Construction And Characterization Of A Plasmid Containing A Nearly Full-Size DNA Copy Of Bacteriophage MS2 RNA", J. Mol. Biol. 128 (1979), 595-619) erhalten. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pPLc28 inseriert, wodurch das ursprüngliche darin enthaltene EcoRl-BamHI-Fragment ersetzt wurde (Fig. 5). Die Struktur des erhaltenen Plasmids mit der Bezeichnung pPLc24 wurde durch Restriktionsanalyse mit EcoRI-BamHI und Größenvergleich zwischen den so erhaltenen und den durch eine EcoRI- BamHI-Spaltung von pMS2-7 und pPLc28 erhaltenen Fragmenten bestätigt. In pPLc24 verläuft die Translation des Protein- Fragmentes der MS2-Replicase colinear zu der Transkription vom PL-Promotor und ist daher unter PL-Kontrolle.

Biologische Eigenschaften von durch erfindungsgemäße Vektoren transformierten Wirtszellen

1. Stabilität bei 28ºC

Die Stämme K12ΔHI oder M5219, die mit jedem der vorstehend beschriebenen Vektoren transformiert waren, wurden in LB-Medium ohne Selektion auf Antibiotika-Resistenz-Marker bei 28ºC über 20 Generationen gezüchtet. Geeignete Verdünnungen der Kulturen wurden anschließend bei 28ºC entweder in Gegenwart oder Abwesenheit des gewünschten Antibiotikums ausplattiert. In allen Fällen blieb ungeachtet der Selektion auf Antibiotika-Resistenz die Zahl der erhaltenen Kolonien gleich, was ein Nachweis für die bei 28ºC vollständige Stabilität der Vektoren in diesen Wirten war (vgl. Tabelle 1, nachstehend aufgeführt).
Sämtliche Vektoren konnten auch zur Transformation eines für den Bacteriophagen λ lysogenen Wirtsstammes verwendet werden. Solche Stämme, bei denen der integrierte Phage ein cI-Produkt des Wildtyps synthetisiert, waren bei erhöhter Temperatur (37ºC) lebensfähig. Im Gegensatz dazu konnten nicht-lysogene Wirte durch diese Vektoren nicht transformiert werden. Statt dessen enthielten die wenigen, in diesen Versuchen erhaltenen Transformanten stets Vektoren mit Deletionen, die die PL-Region vollständig oder größtenteils entfernten.

2. Verhalten von PL-Vektoren enthaltenden Zellen nach einer verlängerten Induktion bei 42ºC

Die Effizienz der bei 42ºC durchgeführten Ausplattierung der Stämme K12ΔHI und M5219, die mit den erfindungsgemäßen Vektoren transformiert worden waren, wurde entweder mit oder ohne Antibiotikaselektion bestimmt.
Vektoren mit einer im Bezug auf den Replikationsursprung im Uhrzeigersinn orientierten PL-Insertion (pPLc-Typ) verhielten sich ähnlich. Die für pPLc236 erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle I dargestellt. Der durch pPLc236 transformierte Stamm K12ΔHI ließ sich, unabhängig von einer vorgenommenen oder nicht vorgenommenen Selektion mit Antibiotika, bei 42ºC und bei 28ºC gleich gut ausplattieren. Der mit pPLc236 transformierte Stamm M5219 ließ sich auf nicht-selektiven Platten mit einer Effizienz von 1 plattieren. Wenn jedoch eine Selektion mit Antibiotika vorgenommen wurde, verringerte sich die Effizienz der Plattierung um mindestens das 1000fache. Die bei 42ºC auf nichtselektiven Platten erhaltenen Kolonien trugen keine Resistenz mehr gegen antibiotische Marker.
Vektoren mit einer im Bezug auf den Replikationsursprung im entgegengesetzten Uhrzeigersinn orientierten PL- Insertion (pPLa-Typ) zeigten bei 42ºC ein komplexeres Muster der Koloniebildung. Transformanten vom Stamm M5219 formten bei 42ºC selbst bei einer fehlenden Selektion durch Antibiotika keine Kolonien (die Effizienz der Plattierung war geringer als 10&supmin;³; Tabelle I). Das Verhalten von Transformanten des Stammes K12ΔHI bei 42ºC hing von der Natur des vorliegenden Vektors ab. Zum Beispiel zeigten Transformanten, die pPLa23 oder pPLa2311 enthielten, Plattierungseffizienzen im Bereich von 1 bis 10&supmin;³, häufig mit einer starken Uneinheitlichkeit in der Koloniegröße, während Transformanten, die pPLa832 enthielten, sowohl mit als auch ohne Selektion mit Antibiotika stets mindestens eine 1000fache Verringerung der Plattierungseffizienz zeigten.
Daher führt die Expression von Vektoren vom pPLa-Typ bei 42ºC zu einer Beeinträchtigung des Wirtsstoffwechsels, die den Zellen das Überleben, selbst bei einer fehlenden Selektion für das Plasmid, bei dieser hohen Temperatur unmöglich macht. Diese Auswirkung ist bei Verwendung von M5219-Wirten am deutlichsten. Umgekehrt beeinträchtigen Vektoren vom pPLc-Typ nicht direkt den Stoffwechsel der Wirtszelle, da bei einem fehlenden selektiven Druck ein 100%iges Überleben von induzierten Zellen beobachtet wird. Eine fortgesetzte Transkription vom PL-Promotor mit der gleichzeitigen Expression des N-Gens in M5219 führt jedoch gegebenenfalls zu einer Hemmung der Vektor-Replikation in M5219-Stämmen. Dies wird daran deutlich, daß solche Zellen auf selektiven Platten bei 42ºC nicht wachsen können. Tabelle I Plattierungseffizienz* 28ºC 42ºC Ohne Mit Stamm Vektor Selektion
* Die bakteriellen Kulturen wurden in LB-Medium bei 28ºC in Gegenwart von Antibiotika bis zur Sättigung gezüchtet. Geeignete Verdünnungen wurden entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von Antibiotika plattiert und bei 28ºC oder 42ºC inkubiert. Die Zahl der erhaltenen Kolonien wurde bestimmt.

Expression von Genen in den erfindungsgemäßen Vektoren

1. Allgemeine Vorgehensweise

Die erfindungsgemäßen Vektoren können in nützlicher Weise zur Herstellung einer Vielzahl von Polypeptiden und Proteinen verwendet werden, indem DNA-Sequenzen, die die gewünschten Polypeptide oder Proteine codierenden Gene umfassen, in eine der dem Promotor und Operator benachbarten Endonuclease-Erkennungsstellen der Vektoren inseriert, geeignete Wirte mit Vektoren, die diese inserierten DNA-Sequenzen enthalten, transformiert, die Wirte gezüchtet und die Polypeptide oder Proteinprodukte gewonnen werden. Beispiele solcher Polypeptide und Proteine schließen Leukocyten-Interferon, Insulin, Hepatitis-Antigene, Antigene der Maul- und Klauenseuche, Fibroblasten-Interferon, menschliches Wachstumshormon, Immun-Interferon und eine Vielzahl von weiteren prokaryotischen, eukaryotischen und viralen Enzymen, Hormonen, Polypeptiden, Antigenen und Proteinen ein.
Zur Veranschaulichung dieser Verfahren wurde die Synthese von bestimmten Genprodukten in den erfindungsgemäßen Vektoren durch Puls-Markierung von induzierten Zellen und Analyse der markierten Proteine durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese überwacht.
Zellen, die durch die erfindungsgemäßen Vektoren transformiert worden waren, wurden bei 28ºC in Antibiotikafreiem LB-Medium bis zu einer Dichte von 2·10&sup8;/ml gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und im ursprünglichen Volumen eines Mediums zur Markierung der Zellen mit einem ¹&sup4;C-Aminosäuregemisch resuspendiert, das aus 19 mM NH&sub4;Cl, 86 mM NaCl, 42 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 1 mM MgSO&sub4;, 0,2% Glucose, 0,05% Casaminosäuren (Difco), 0,01% Hefeextrakt und 50 ug/ml L-Tryptophan bestand, oder des vorstehend beschriebenen Mediums mit den Ausnahmen, daß die Casaminosäuren und der Hefeextrakt durch ein 5% Methionin- Testmedium (Difco) zur Markierung der Zellen mit ³&sup5;S- Methionin ersetzt worden waren. Die Inkubation wurde bei 28ºC 60 Min. fortgesetzt. Eine Hälfte der Kultur wurde anschließend bei 42ºC gehalten. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Induktion, wie durch die über den Bahnen in den Fig. 8-11 angegebene Zahl der Minuten angezeigt wird, wurden Aliquots der Kulturen bei 28ºC und 42ºC mit einem ¹&sup4;C-Aminosäuregemisch oder mit ³&sup5;S-Methionin (Amersham) markiert.
Der Markereinschluß wurde durch Phenolextraktion beendet. Die synthetisierten Proteine wurden durch Zusatz von 5 Vol. Ethanol aus der Phenolphase ausgefällt und in 1% SDS, 1% β-Mercaptoethanol, 10% Glycerol und 62,5 mM Tris- HCl (pH-Wert 6,8) erneut gelöst. Proben wurden 5 Min. gekocht und bei 12000·g zentrifugiert, und mit ihnen wurde nach dem Verfahren von U. Lämmli, "Cleavage Of Structural Proteins During the Assembly Of The Head Of Bacteriophage T4", Nature 227 (1970), 680-82, auf SDS-enthaltenden Polyacrylamid-Gelen (10% bis 15% Acrylamid) eine Elektrophorese durchgeführt. Im Anschluß an die Elektrophorese wurden die Gele für die Fluorographie nach dem Verfahren von W. Bonner & R. Laskey, "A Film Detection Method For Tritium- Labelled Proteins And Nucleic Acids In Polyacrylamide Gels", Eur. J. Biochem. 46 (1974), 83-88, präpariert mit der Ausnahme, daß EN³HANCE (NEN) anstelle von PPO-DMSO verwendet wurde.

2. Prokaryotische Gene

(a) Das β-Lactamase-Gen

pPLa23 (Fig. 3) schließt das β-Lactamase-Gen in Sinn-Orientierung stromabwärts vom PL-Promotor ein. Daher kann die Produktion des vom β-Lactamase-Gen codierten Proteins als Anzeige für die Wirksamkeit des Vektors bei der Expression prokaryotischer Gene überwacht werden.
Transformanten von K12ΔHI und M5219 durch pPLa23 - E. coli K12ΔHI (pPLa23) und E. coli M5219 (pPLa23) - wurden, wie vorstehend beschrieben, hergestellt und ihre Proteinsynthese überwacht. Die Ergebnisse werden in Fig. 8 dargestellt. Dieser kann entnommen werden, daß eine erhebliche Erhöhung der Syntheserate der zwei Proteine mit relativem Molekulargewicht von 27,5 K bzw. 30 K kurz nach der Induktion der Transformanten bei 42ºC eintrat. Die Größen dieser exprimierten Proteine entsprachen den erwarteten Längen der reifen β-Lactamase und ihrem Vorläufer (J. Sutcliffe, vorstehend angegeben). Ferner wurde die induzierte Synthese dieser Proteine von einer parallel dazu erhöhten enzymatischen Aktivität der β-Lactamase begleitet, wie nach dem Verfahren von O'Callaghan et al., "Novel Method For Detection Of β-Lactamases By Using A Chromogenic Cephalosporin Substrate", Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1 (1972), 283-88, festgestellt wurde, und beide Proteine wurden durch anti-β-Lactamase-Serum spezifisch ausgefällt. Zur Kontrolle wurde die Proteinsynthese in Wirten überwacht, die nicht mit dem Vektor pPLa23 transformiert worden waren. Es wurde bei den nicht-transformierten Wirten die Synthese keines der beiden vorstehend beschriebenen Proteine beobachtet.
Wie in Fig. 8 dargestellt, ist das allgemeine Muster der Proteinsynthese in diesen Transformanten bei 28ºC und 42ºC sehr ähnlich. Die Syntheserate einiger Proteine hingegen wird anscheinend durch Umstellung der Zellen auf 42ºC bedeutsam verändert. Ein ähnliches Verhalten wurde in nicht mit pPLa23 transformierten Zellen beobachtet. Wie in Fig. 8 dargestellt, nimmt außerdem die relative Menge des größeren der beiden β-Lactamase verwandten Proteine - des nicht prozessierten Vorläufers der β-Lactamase - mit der Zeit nach der Induktion zu. Diese Neigung zu einer Anreicherung von Vorläuferprotein kann eine Sättigung der β-Lactamase-Prozessierungsmaschinerie der Zelle anzeigen.
Zur Feststellung der prozentualen Synthese der β-Lactamase bezüglich der gesamten de novo-Proteinsynthese der Transformanten wurden die Proteinbanden der β-Lactamase (27,5 K) und ihres Vorläufers (30 K) aus dem getrockneten Gel herausgeschnitten und ihre Radioaktivität mit der gesamten auf das Gel aufgetragenen Radioaktivität verglichen. Diese Ergebnisse sind in Tabelle II dargestellt. Tabelle II Prozentualer Anteil der Synthese der β-Lactamase bezüglich der gesamten de novo-Proteinsynthese Minuten nach der Induktion bei 42ºC Stamm Kontrolle bei 28ºC
Wie in Tabelle II dargestellt, erreicht die Synthese der β-Lactamase und ihres Vorläufers ein höchstes Niveau von etwa 30% der gesamten de novo-Proteinsynthese in beiden Wirtszellstämmen. Die Kinetiken zur Erreichung dieses Niveaus sind jedoch für die zwei Stämme verschieden - Stamm K12ΔHI bleibt bei der Erreichung des 30% Niveaus 20 Min. hinter Stamm M5219 zurück. Es ist möglich, daß das N-Genprodukt, das nach der Induktion des Stammes M5219 mitproduziert wird, jedoch in Stamm K12ΔHI fehlt, bestimmte Signale zur Verzögerung der Transkription in den DNA- Sequenzen stromabwärts vom PL-Promotor überwinden kann und dadurch die Synthese der β-Lactamase im Stamm M5219 beschleunigt.
Zur Feststellung der Rate der gesamten Proteinsynthese in diesen Transformanten wurde die gesamte eingebaute Radioaktivität während eines bestimmten Zeitraums bestimmt und mit der verglichen, die während des 0-10 Min. Intervalls eingebaut wurde (d. h., das anfänglichen Zeitraums, der willkürlich als Bezugsgröße von 100% gewählt wurde). Die Ergebnisse sind in Tabelle III dargestellt. Tabelle III Rate der gesamten Proteinsynthese Minuten nach der Induktion bei 42ºC Stamm
Wie in Tabelle III dargestellt, wird die gesamte Proteinsynthese in E. coli M5219 (pPLa23) nach der Induktion schnell beendet. Dies entspricht dem vorher beobachteten Unvermögen der M5219-Transformanten, bei 42ºC zu überleben. Eine ähnliche Hemmung der Proteinsynthese wird bei E. coli M5219 (pBR322) nicht beobachtet. Eine wesentliche Verminderung der gesamten Proteinsynthese wird auch nach einer verlängerten Inkubation bei 42ºC in E. coli K12ΔHI (pPLa23) beobachtet. Diese Zellen sind jedoch in der Lage, Temperaturen von 42ºC zu überleben.

(b) Das Tryptophan-Synthetase-A-Gen

(i) pPLa23

Ein EcoRI-Fragment (5300 Basenpaare), das das trp A-Cistron von Salmonella typhimurium enthielt, wurde aus pES9 erhalten (Selker, E. et al., "Mitomycin C Induced Expression Of trp A Of Salmonella tryphimurium Inserted Into The Plasmid ColEl", J. Bacteriology 129 (1977), 388-94) und in die EcoRI-Stelle von pPLa23 inseriert. Zwei repräsentative Plasmide, die dieses Fragment in jeder der zwei möglichen Orientierungen bezüglich der Richtung des PL-Promotors als Insertion enthielten, erhielten die Bezeichnungen pPLa23trpA&sub1; und pPLa23trpA&sub2;.
Induktionsprofile des Stammes K12ΔHI, der entweder pPLa23trpA&sub1; oder pPLa23trpA&sub2; enthielt, sind in Fig. 9 dargestellt. Ein bedeutendes Protein von etwa 25000 Dalton wurde durch pPLa23trpA&sub1; induziert, fehlte jedoch bei induzierten Zellen, die pPLa23trpA&sub2; enthielten. Das beobachtete Molekulargewicht dieses Proteins entspricht dem theoretischen Wert (28500), der aus der Nucleotidsequenz des S. typhimurium trp A-Gens (B. Nichols & c. Yanofsky, "Nucleotide Sequences Of trp A Of Salmonella typhimurium And Escherichia coli: An Evolutionary Comparison", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 5244-48) vorhergesagt wurde. Ferner erhöhte sich parallel zur Anhäufung dieses induzierten Proteins die Enzymaktivität, die der Gegenwart eines trp A-Genprodukts entsprach, wie nach den Verfahren von O. Smith & c. Yanofsky, "Enzymes Involved In The Biosynthesis Of Tryptophan", Methods in Enzymology 5 (1962), 794-806 festgestellt wurde.
Nach einer verlängerten Induktion sowohl von pPLa23trpA&sub1; als auch pPLa23trpA&sub2; wird ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 18 K synthetisiert (Fig. 9). Der prozentuale Anteil der Synthese dieses Proteins im Vergleich zur gesamten de novo-Proteinsynthese der Transformante ist unabhängig von der Orientierung des EcoRI trp A-Fragmentes im Hinblick auf die Richtung der Transkription vom PL-Promotor. Vermutlich wird daher die Synthese dieses Proteins durch einen möglicherweise leicht Temperatur-abhängigen, bakteriellen Promotor kontrolliert, der auf dem 5300 Basenpaare langen EcoRI trp A-Fragment, dessen Codierungskapazität tatsächlich viel größer ist als für das trp A benötigt wird, vorhanden ist (E. Selker, vorstehend angegeben).
Der prozentuale Anteil der Synthese von trp A im Vergleich zur gesamten de novo-Proteinsynthese in der Transformante wurde im wesentlichen wie vorstehend für die β-Lactamase beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV dargestellt. Die trp A-Synthese erreichte wieder ein höchstes Niveau von etwa 30% der gesamten de novo-Synthese. Tabelle IV Prozentualer Anteil der Synthese von trp A im Vergleich zur gesamten de novo-Proteinsynthese Minuten nach der Induktion Kontrolle bei 28ºC

(ii) pPLa2311

Ein rekombinantes DNA-Molekül, das mit pPLa23trpA&sub1; identisch ist, jedoch von pPLa2311 abstammt, wurde ebenfalls, im wesentlichen wie vorstehend beschrieben, hergestellt. Mit pPLa2311trpA&sub1; transformierte K12ΔHI verhielten sich ähnlich wie pPLa23trpA&sub1;-Transformanten (mit der Ausnahme, daß in diesem Versuch das höchste Niveau der gesamten de novo-Synthese nach 150 Min. bei nur 20% lag). Die verlängerte Induktion führte wiederum zu einer Nettoabnahme der gesamten Proteinsynthese.

(iii) pPLc23

Das EcoRI-Fragment von pES9 besitzt ein Ende, das innerhalb des trp B-Gens liegt, und enthält etwa 2500 Basenpaare von der EcoRI-Stelle entfernt eine einzige SalI-Stelle (Selker, E. et al., vorstehend angegeben). Da das trp A-Gen keine SalI-Stelle enthält (B. Nichols & C. Yanofsky, vorstehend angegeben), muß das trp A-Gen vollständig in dem Teil des EcoRI-Fragmentes von pES9 liegen, das sich von der ersten EcoRI-Stelle zur SalI-Stelle erstreckt. Das zuvor hergestellte EcoRI-Fragment von pES9 wurde daher mit SalI gespalten und das erhaltene Fragment als Ersatz für das EcoRI-SalI-Fragment in pPLc23 inseriert (Fig. 4). Auf der Grundlage der beobachteten Richtung der Translation des trp A-Gens in pPLa23trpA&sub1; und pPLa23trpA&sub2; erhielt das auf pPLc23 basierende rekombinante DNA-Molekül, das das trp A-Gen colinear zur Transkription vom PL-Promotor trug, die Bezeichnung pPLc23trpA&sub1;.
Nach der Induktion (42ºC) von E. coli K12ΔHI (pPLc23trpA&sub1;) wurde trp A 3 Stunden nach der Induktion auf einem maximalen Niveau von etwa 40% der gesamten de novo- Proteinsynthese synthetisiert. Ferner wurde dieses hohe Niveau der de novo-Synthese 2 Std. beibehalten (Fig. 10). Diese Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle V dargestellt. Im Gegensatz zum Verhalten der Vektoren vom pPLa-Typ nimmt daher die Proteinsynthese der Transformanten vom pPLc-Typ bis zu 5 Std. nach der Induktion nicht ab. Tabelle V Minuten nach der Induktion bei 42ºC Prozentualer Anteil der Synthese von trp A-* Rate der gesamten Proteinsynthese Kontrolle bei 28ºC * verglichen mit der gesamten de novo-Proteinsynthese
Die tatsächliche Menge an induziertem Protein, das sich in den vorstehenden Transformanten ansammelte, wurde auch durch kontinuierliche Markierung der induzierten Zellen gemessen. E. coli K12ΔHI (pPLc23trpA&sub1;) wurde in LB-Medium bei 28ºC bis zu einer Dichte von 1·10&sup7; Zellen/ml gezüchtet. Die Zellen wurden anschließend mit einem 10 uCi ¹&sup4;C-Aminosäuregemisch markiert. Bei einer Kulturdichte von 4·10&sup7; Zellen/ml wurden die Zellen auf 42ºC übertragen und die Inkubation fortgesetzt. Als die Kultur die Sättigung erreicht hatte (6 Std. nach der Induktion), wurden die Proteine aus den Zellen extrahiert und auf SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Der Prozentsatz der in der trp A-Bande eingebaute Radioaktivität wurde bestimmt. Bei den verwendeten Bedingungen kann eine einheitliche Markierung der Zellen angenommen werden, so daß die in ein Protein eingeschlossene Radioaktivität die tatsächliche Menge des in der Zelle vorhandenen Proteins wiedergibt. Man stellte fest, daß das trp A-Protein 10% der gesamten Proteine der Zelle ausmachte.
Diese trp A-Konzentration von 10% der gesamten Zellproteine von E. coli K12ΔHI (pPLc23trpA&sub1;) dient auch dazu, die wichtigen Unterschiede zwischen den λ PL-enthaltenden Vektoren von Bernhard, H. et al., vorstehend angegeben, und denen der vorliegenden Erfindung aufzuzeigen. Im Gegensatz zu den von den erfindungsgemäßen Vektoren gelieferten 10% an tatsächlicher trp A-Konzentration, berichten Bernhard, H. et al., nur von einer 6,6%igen trp A-Konzentration - geschätzt auf der Grundlage der trp A-Enzymaktivität und einer angenommenen spezifische Aktivität des Proteins. Es sollte auch deutlich gemacht werden, daß die von Bernhard, H. et al., genannte Konzentration von 6,6% trp A bei Vektoren beobachtet wurde, die auch ein aktives N-Gen enthielten, und die Transkription daher vermutlich in Gegenwart des anti-terminierenden N-Genprodukts erfolgte. Es wurde von Bernhard, H. et al., bei einem Vektor, der kein aktives N-Gen enthielt, nur über eine Konzentration von 2% trp A berichtet. Im Gegensatz dazu wurde die mit den verbesserten erfindungsgemäßen Vektoren beobachtete Konzentration von 10% trp A in Abwesenheit der N-Genprodukte erreicht. Die vorliegenden Vektoren und Verfahren stellen daher eine deutliche Verbesserung gegenüber jenen auf dem Fachgebiet beschriebenen Vektoren und Verfahren dar.

(c) Das Gen des Replicaseproteins des Bacteriophagen MS2

Das Plasmid pMS2-7 enthält eine beinahe vollständige Kopie des Genoms des RNA-Bacteriophagen MS2 (Devos, R. et al., vorstehend angegeben). Das Replicase-Gen (R) des Phagen ist innerhalb eines EcoRI-PstI-Fragmentes enthalten. Dieses Fragment wurde in pPLa2311 durch einen einfachen Ersatz des EcoRI-PstI-Fragmentes dieses Vektors inseriert. Transformanten von E. coli K12ΔHI (pPLa2311R&sub1;) wurden nach Empfindlichkeit gegenüber Carbenicillin abgesucht, da das Ampicillin-Resistenzgen in pPLa2311R&sub1; nicht mehr intakt ist. Die Identität des inserierten Fragmentes wurde durch gleichzeitige Elektrophorese mit den bekannten Fragmenten von pMS2-7-DNA auf einem Agarose-Gel festgestellt. In pPLa2311R&sub1; verläuft die Transkription des MS2-Replicaseproteins colinear mit der Transkription vom PL-Promotor.
Die induzierten E. coli K12ΔHI (pPLa2311R&sub1;) Zellen synthetisieren ein Protein mit einem relativen Molekulargewicht von 59 K (Fig. 11). Die Größe dieses Proteins entspricht dem Molekulargewicht von 60692 Dalton, das aus den Informationen über die Sequenz der viralen RNA für die MS2-Replicase berechnet wurde (Fiers, W. et al., "Complete Nucleotide Sequence Of Bacteriophage MS2 RNA: Primary And Secondary Structure Of The Replicase Gene", Nature 260 (1976), 500-507)
Die Gegenwart des funktionellen MS2-Replicaseproteins in den Proteinprodukten von Zellen, die mit pPLa2311R&sub1; transformiert worden waren, wurde auch durch Komplementationsanalyse mit MS2-Amber-Mutanten überprüft. Diese Analyse bestätigte, daß durch pPLa2311R&sub1; transformierte Zellen ein Produkt erzeugten, das spezifisch das Produkt einer ein verändertes Replicasegen tragenden MS2-Mutante komplementierte und daß Zellen, die nicht durch pPLa2311R&sub1; transformiert worden waren, das Produkt einer solchen Mutante nicht komplementierten.
Im Hinblick auf die Proteinsynthese der MS2-Replicase verhielten sich sowohl E. coli K12ΔHI (pPLa2311R&sub1;) als auch E. coli M5219 (pPLa2311R&sub1;) gleich - nach 30 Min. Induktion betrug der prozentuale Anteil der Synthese der MS2-Replicase 29% der gesamten de novo-Proteinsynthese, bei sich schnell verringerndem Niveau der Proteinsynthese bei weiterer Induktion (Fig. 11). Da eine solche Abnahme im Syntheseniveau bei der Synthese der β-Lactamase oder von trp A nicht beobachtet wurde, kann die Reduktion durch eine besondere Eigenschaft der MS2-Replicase verursacht sein. Die beobachtete Neigung der Phagen-Replicase zur Bindung an ihre eigene mRNA an einer Stelle in der Nähe der Mitte des Cistrons (Meyer et al., "The Binding Sites Of Qβ RNA", Experienta 31 (1975), 143 ff) kann zum Beispiel die weitere Translation des mRNA-Komplexes behindern.

3. Eukaryotische Gene

(a) Das kleine t-Antigen des Simian Virus 40-Gens

Ein HindIII-DNA-Fragment, das die gesamte das kleine t-Antigen von SV40 codierende Sequenz enthält (Volckaert, G. et al., "Nucleotide Sequence Of The Simian Virus 40 Small-t Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 2160-64), wurde in die HindIII-Stelle von pBR322 inseriert (Fig. 12). Die Orientierung der Insertion wurde durch Restriktionsanalyse, die auf der Gegenwart einer asymmetrisch angeordneten TaqI-Stelle beruhte, bestimmt. Aus diesem hybriden DNA-Molekül wurde ein EcoRI-BamHI-Fragment, das das vorstehend beschriebene HindIII-Fragment und Teile von pBR322 umfaßte, entfernt und derart als Ersatz für dessen EcoRI-BamHI-Fragment in pPLc28 inseriert, daß die Richtung der Translation des kleinen t-Antigens colinear mit der Transkription vom PL-Promotor verläuft (Fig. 12). Das erhaltene rekombinante DNA-Molekül erhielt die Bezeichnung pPLc28SVt5.
Zur Verkürzung des Abstandes zwischen dem PL-Promotor und dem Initiationscodon (ATG) des das kleine t-Antigen codierenden Gens wurde pPLc28SVt5 modifiziert, wobei das EcoRI-HindIII-Fragments zwischen dem Gen und dem PL-Promotor entfernt wurde. Diese Manipulationen sind in den Fig. 12 und 13 dargestellt. Sie bestanden aus einer Spaltung von pPLc28SVt5 mit ClaI, einer Verkürzung des 3'-Endes der DNA in zwei getrennten Schritten unter Verwendung der 3'-Exonuclease-Aktivität der T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von GTP bzw. TTP, einer Weiterbehandlung mit S1-Nuclease, einem Anfügen von EcoRI-Linkern an die glatten Enden, einer Spaltung des Fragmentes mit EcoRI und einer erneuten Legierung der komplementären Enden.
Die Transformation von E. coli K12ΔHI durch diese modifizierten hybriden DNA-Moleküle und die Induktion ergaben eine Expression von ziemlich großen Mengen eines Proteins mit einem relativen Molekulargewicht von 14 K (Fig. 14).
Dieses Protein wurde ohne Induktion nicht produziert und durch Wirtszellen nicht erzeugt, die nicht mit SV40-DNA enthaltenden Vektoren transformiert worden waren.
Obgleich das authentische kleine t-Antigen ein Molekulargewicht von 19 K aufweist und das in diesen transformierten Zellen produzierte Protein nur in sehr geringem Maß durch Antikörper ausgefällt wurde, die gegen das große T-Antigen von SV40 entwickelt worden waren, bestätigten zweidimensionale Fingerabdrücke (Elektrophorese beim pH-Wert von 3,5, mit einer anschließenden Chromatographie in Butanol/Essigsäure/Pyridin/Wasser (15:3:10:12)) von tryptischen Peptiden, die von diesem Protein und vom authentischen kleinen t-Antigen abstammten, daß die beiden verwandt waren. Obgleich es nicht wünschenswert ist, durch eine Theorie festgelegt zu werden, ist es denkbar, daß die Sekundärstruktur der am PL-Promotor beginnenden mRNA dergestalt ist, daß die Initiation an einem internen Initiationscodon des kleinen t-Antigens der Initiation am wirklichen Startsignal vorgezogen wird. Diese Hypothese stimmt auch mit der Sekundärstruktur überein, die unter Verwendung der Verfahren von D. Iserentant & W. Fiers, "Secondary Structure Of mRNA And Efficiency Of Translation Initiation", Gene 9 (1980), 1-12, aus den Nucleotidsequenzen einiger dieser SVt-enthaltender Vektoren abgeleitet werden konnte.
Eines der wie vorstehend beschrieben hergestellten modifizierten rekombinanten pPLc28SVt5-DNA-Moleküle exprimierte zusätzlich zur 14 K Protein-Hauptkomponente geringere Mengen einer 17 K Komponente. Dieses Molekül erhielt die Bezeichnung pPLcSVt5-37. Während die Gegenwart des 17 K Proteins anfänglich nur durch spezifische Immunopräzipitation mit großem T-Antiserum nachgewiesen werden konnte, ermöglichte die weitere Modifikation des Moleküls eine verbesserte Synthese der 17 K Komponente. Diese Modifikation, die aus einer Spaltung von pPLc28SVt5-37 mit EcoRI, einer Verlängerung der zurückstehenden 3'-Enden mit DNA-Polymerase I (Backman, K. et al., vorstehend angegeben) und einer erneuten Legierung der glatten Enden bestand, kann die Sekundärstruktur der mRNA verändert haben. Durch pPLc28SVt5-37-9 transformierte Wirte lieferten nach der Induktion etwa 4% ihrer gesamten de novo-Proteinsynthese als einer 17 K Proteinkomponente. Diese Ergebnisse sind in Fig. 14 dargestellt. Wie in Spur c der Fig. 14 gezeigt, wurde die 17 K Komponente im im wesentlichen gleichen Ausmaß wie authentisches kleines t-Antigen, das in SV40-infizierten Nierenzellen vom afrikanischem, grünen Affen gezüchtet worden war, durch Serum eines SV40-Tumor-tragenden Hamsters immunpräzipitiert.

(b) Das menschliche Fibroblast-Interferon-(HFIF)-Gen

Wie in der am 6. Juni 1980 eingereichten britischen Patentanmeldung 80,18701 beschrieben, wurde das das menschliche Fibroblasten-Interferon codierende Gen in die Vektoren pPLa8 und pPLc24 zur Produktion von rekombinanten DNA-Molekülen inseriert, die in transformierten Wirten nach einer geeigneten Induktion zur Expression von Proteinen befähigt sind, die eine antivirale, physikalisch-chemische, immunologische und biologische Aktivität aufweisen, die dem ursprünglichen menschlichen Fibroblasten-Interferon sehr nahe kommt.

(c) Ein FMDV-Antigen-Gen

Wie in der am 15. August 1980 eingereichten britischen Patentanmeldung 80,26661 beschrieben, wurde eine DNA- Sequenz, die ein die Spezifität von viralen FMD-Antigenen zeigendes Polypeptid codierte, zur Produktion von rekombinanten DNA-Molekülen, die in transformierten Wirten nach einer geeigneten Induktion zur Expression von Polypeptiden befähigt waren, die die Spezifität von viralen FMD-Antigenen zeigten, in den Vektor pPlc24 inseriert.
Die nach den hier beschriebenen Verfahren hergestellten Mikroorganismen und Vektoren werden durch Kulturen beispielhaft vertreten, die am 8. September 1980 bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, United States, hinterlegt und als PL-A bis PL-D identifiziert wurden:
A. E. coli M5219 (pPLa2311)
B. E. coli K12ΔHI (pPLa8)
C. E. coli K12ΔHI (pPLc28)
D. E. coli M5219 (pPLc24)
Diese Kulturen erhielten die Hinterlegungsnummern ATCC 31694 bis 31697.
Ferner werden nach den hier beschriebenen Verfahren hergestellte Mikroorganismen und Vektoren, die auch zur derartigen Expression inserierte DNA-Sequenzen enthalten, beispielhaft an Kulturen dargestellt, die in der Kultursammlung "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen" in Göttingen, Westdeutschland, hinterlegt und, wie nachstehend beschrieben, identifiziert wurden:
HFIF-D: E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12) [DSM 1851]
HFIF-E: E. coli K12ΔHI (G-pPLa-HFIF-67-12) [DSM 1852]
HFIF-F: E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12 Δ 19) [DSM 1853]
HFZF-G: E. coli M5219 (G-pPLc-HFZF-67-8) [DSM 1854]
FMDV-A: E. coli W6 (λrex-pPL-VP1-1) [DSM 1879]
FMDV-B: E. coli NF1 (λN&supmin;cro&supmin;cIts-pPL-VP1-1) [DSM 1880]
FMDV-C: E. coli NF1 (λN&supmin;cro&supmin;cIts-pPL-VP1-5) [DSM 1881]
Die Kulturen HFIF-D - HFIF-G wurden am 5. Juni 1980 hinterlegt. Die Kulturen FMDV-A-FMDV-C wurden am 30. Juli 1980 hinterlegt.
Während hier vorstehend eine Anzahl von erfindungsgemäßen Ausführungsformen dargestellt wurde, liegt es auf der Hand, daß die Grundkonstruktion zur Bereitstellung weiterer Ausführungsformen verändert werden kann, die die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen verwenden. Es muß daher berücksichtigt werden, daß der Schutzbereich dieser Erfindung durch die beigefügten Ansprüche definiert wird, und nicht durch die spezifischen Ausführungsformen, die vorstehend zur beispielhaften Erläuterung dargestellt worden sind.

Claims

1. Plasmidvektor, umfassend wenigstens eine DNA-Sequenz, die den aus dem Bacteriophagen λ abgeleiteten linksgerichteten Promotor und Operator PLOL umfaßt, wobei die DNA-Sequenz dadurch gekennzeichnet ist, daß ein aktives cro-Gen und ein aktives N-Gen fehlt und wenigstens eine Endonuclease-Erkennungsstelle vorhanden ist, die in der DNA-Sequenz weniger als 300 Basenpaare stromabwärts von PLOL liegt.

2. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungsstelle EcoRI, BamHI, HindIII, PstI, XbaI oder SalI umfaßt.

3. Vektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungsstelle in der DNA-Sequenz weniger als etwa 150 Basenpaare stromabwärts von PLOL liegt.

4. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß dieser eine Ribosomenbindungsstelle einschließt, die zwischen PLOL und der Endonuclease-Erkennungsstelle liegt.

5. Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Ribosomenbindungsstelle aus der MS2-Bacteriophagen- Replicase abgeleitet ist.

6. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in eine der Endonuclease-Erkennungsstellen eine DNA-Sequenz inseriert ist, die ein eukaryotisches, prokaryotisches oder virales Protein, Polypeptid, Enzym, Hormon, Antigen oder Fragment davon codiert.

7. Verfahren zur Herstellung eines verbesserten Vektorplasmids, wobei in ein Clonierungsvehikel wenigstens eine DNA-Sequenz inseriert wird, die den aus dem Bacteriophagen λ abgeleiteten linksgerichteten Promotor und Operator PLOL umfaßt, wobei die DNA-Sequenz gekennzeichnet ist durch das Fehlen eines aktiven cro-Gens und eines aktiven H-Gens und daß das Clonierungsvehikel wenigstens eine Endonuclease-Erkennungsstelle bereitstellt, die in der DNA-Sequenz weniger als 300 Basenpaare stromabwärts von PLOL liegt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungsstelle EcoRI, BamHI, HindIII, PstI, XbaI oder SalI umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungsstelle in der DNA-Sequenz weniger als etwa 150 Basenpaare stromabwärts von PLOL liegt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Ribosomenbindungsstelle in den Vektor zwischen PLOL und der Endonuclease-Erkennungsstelle inseriert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Ribosomenbindungsstelle aus der MS2-Bacteriophagen- Replicase abgeleitet ist.

12. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, wobei eine DNA-Sequenz, die ein eukaryotisches, prokaryotisches oder virales Protein, Polypeptid, Enzym, Hormon, Antigen oder Fragment davon codiert, in wenigstens eine Endonuclease-Erkennungsstelle eines Vektorplasmids inseriert wird, das gekennzeichnet ist durch (1) wenigstens eine DNA-Sequenz, die den aus dem Bacteriophagen λ abgeleiteten linksgerichteten Promotor und Operator PLOL umfaßt, (2) wenigstens eine Endonuclease- Erkennungsstelle, die in der DNA-Sequenz weniger als 300 Basenpaare stromabwärts von PLOL liegt und (3) das Fehlen eines aktiven cro-Gens und eines aktiven N-Gens.

13. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, daß ein mit einem Vektor nach Anspruch 6 transformierter Wirtsorganismus kultiviert wird und das Polypeptid gesammelt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid Leukocyten-Interferon, Fibroblasten- Interferon, Immuninterferon, Insulin, menschliches Wachstumshormon, tierisches Wachstumshormon, Antigene von Hepatitis, Maul- und Klauenseuche und anderen Viren, und andere prokaryotische, eukaryotische und virale Enzyme, Hormone, Antigene, Polypeptide, Proteine oder Aminosäuren umfaßt.

15. Plasmidvektoren, die in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen hinterlegt sind und als DSM 1851, DSM 1852, DSM 1853, DSM 1854, DSM 1879, DSM 1880 und DSM 1881 bezeichnet sind, und die in der American Type Culture Collection hinterlegt sind und als ATCC 31694, ATCC 31695, ATCC 31696 und ATCC 31697 bezeichnet sind.