DE3586410T2

DE3586410T2 - Verfahren zur herstellung von neutraler protease.

Info

Publication number: DE3586410T2
Application number: DE8585830246T
Authority: DE
Inventors: Bue Marina Del; Guido Grandi; Salvatore Toma
Original assignee: Eniricerche SpA
Current assignee: Eni Tecnologie SpA
Priority date: 1984-10-17
Filing date: 1985-09-30
Publication date: 1993-03-04
Anticipated expiration: 2005-10-01
Also published as: EP0179025A1; JPH0829083B2; IT8423190A0; DE3586410D1; JPS61181374A; CA1285233C; EP0179025B1; IT1176997B; IT8423190A1; ATE78870T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Bereich der Molekularbiologie und im speziellen die Bildung von Stämmen, die große Mengen an Proteinen erzeugen, mittels Verfahren der Gentechnologie.
Im besonderen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Exoenzyms neutrale Protease, bestehend aus der Bildung eines hybriden rekombinanten Plasmids, das das Gen enthält, welches für die neutrale Protease codiert, der Herstellung eines mutanten Stammes von Bacillus subtilis, des Einschleusens des hybriden rekombinanten Plasmids in den mutanten Stamm, der Isolierung der Klone, die das hybride rekombinante Plasmid enthalten, der Züchtung der Klone in einem flüssigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, und schließlich der Isolierung der neutralen Protease aus dem Nährmedium.
Die Verwendung neutraler Protease bakterieller Herkunft im industriellen Bereich ist bekannt, wie zum Beispiel in der Nahrungsmittelindustrie und der chemischen Industrie, im speziellen bei der Herstellung von Waschmitteln. Es ist ebenfalls bekannt, wie diese Enzyme durch Fermentationsprozesse hergestellt werden können, die das Wachstum der Mikroorganismen, die natürlicherweise das Gen, das für das Enzym codiert, enthalten, in einem geeigneten Nährmedium umfassen. Von den Mikroorganismen, die proteolytische Enzyme produzieren, sind jene der Gattung Bacillus von besonderem Interesse.
Diese bekannten Verfahren sind etwas mühsam, da eine Anzahl von Schritten erforderlich ist, und vor allem die Gesamtausbeuten nur gering sind.
Seit der Einführung der Technik der rekombinanten DNA ist es nun möglich, Mikroorganismen zu bilden, die große Mengen von Protein produzieren.
Gemäß US-PS 4237224 wird ein Gen, das für ein bestimmtes Protein codiert, aus einem Donor-Stamm isoliert und mit Hilfe spezieller DNA-Moleküle, sogenannter Vektoren, in eine geeignete Wirtszelle eingeschleust.
Die bei Versuchen in der Gentechnologie verwendeten Vektormoleküle können sich in der Wirtszelle autonom replizieren, so daß schließlich im allgemeinen 30 bis 50 Kopien vorliegen.
Wenn daher ein exogenes Gen in den Vektor eingebracht wird und der modifizierte Vektor, das sogenannte hybride rekombinante Plasmid, in die Wirtszelle eingeschleust wird, so ist die Zahl der Kopien des Gens in der Zelle gleich jener des Vektors.
Dies ergibt eine höhere Syntheserate des klonierten Produkts auf Grund des sogenannten "Gen-Dosierungs"-Effekts.
Bekanntlich wird die DNA in der Zelle durch das Enzym RNA- Polymerase in Boten-RNA transkribiert und diese wiederum durch die koordinierte Wirkung der Ribosomen und einer großen Anzahl von Enzymen und Zellprodukten in Protein übersetzt.
Auf Grund des hohen Wirkungsgrades der Transkriptions- und Übersetzungs-Systeme der Zelle wird die Produktion des entsprechenden genetischen Produkts erhöht, wenn die Zahl der Kopien eines bestimmten Gens erhöht wird.
J. Bacteriol. 160, Oktober 1984, Seiten 15-21 beschreibt die Klonierung des Gens, das für die neutrale Protease von Bacillus subtilis GSY 264 (BGSC 1A72) codiert, einem Stamm, der keine hohe Ausbeute an Protease ergibt und dessen Produktion vergleichbar ist mit der von Wildtypen wie BG16 und 168.
Obige Literaturstelle beschreibt auch die Bildung des Plasmids pNPR10, das das strukturelle Gen der neutralen Protease enthält und den Bereich von etwa 900 bp, der die Regelsignale für die Expression enthält. Dieses Plasmid wird hierauf verwendet, um den Stamm BG84 von Bacillus subtilis zu transformieren, der eine Mutation im Strukturgen von Subtilisin enthält, um neutrale Protease zu produzieren. Die in Tabelle 2 angeführten Daten zeigen, daß BG84 (pNPR10) neutrale Protease in einer Menge von 1:30 im Verhältnis zum Wildstamm BG16 produziert, der keine sehr hohe Produktion an neutraler Protease aufweist. Die Erhöhung der Expression und Produktion der neutralen Protease beruht daher auf der Anwesenheit von mehreren Kopien des Plasmids pNPR10 in dem transformierten Stamm.
Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet die Erzielung einer höheren Ausbeute bei der Produktion von neutraler Protease von Bacillus subtilis.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Produktion neutraler Protease von Bacillus subtilis, umfassend:
(a) die Isolierung des die neutrale Protease codierenden Gens mit der in Abbildung 3 angeführten Sequenz aus der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis BGSG 1A341,
(b) die Konstruktion eines hybriden rekombinanten Plasmids, das das in Schritt (a) erhaltene Gen enthält,
(c) das Einführen des hybriden rekombinanten Plasmids aus Schritt (b) in Bacillus subtilis SMS 108 (NRRL-B-1589), der eine Mutation des strukturellen Gens für die neutrale Protease und eine recE4-Mutation aufweist, und Anzüchten der erhaltenen Klone,
(d) das Isolieren der erhaltenen Klone aus Schritt (c), die das hybride rekombinante Plasmid enthalten,
(e) die Züchtung der erhaltenen Klone aus Schritt (d) in einem flüssigen Nährmedium unter Bedingungen, die die Produktion der neutralen Protease ergeben, und
(f) das Isolieren der so hergestellten neutralen Protease aus dem Nährmedium.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das hybride rekombinante Plasmid nach bekannten Verfahren mit Hilfe von DNA aus dem Donor-Mikroorganismus hergestellt, der das Gen enthält, das für die neutrale Protease codiert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt die Bildung des hybriden rekombinanten Plasmids:
1. Isolierung und Reinigung der chromosomalen DNA aus dem Donor-Mikroorganismus,
2. teilweises Schneiden der DNA mit einem Restriktionsenzym,
3. Isolierung der Fragmente der chromosomalen DNA mit einer Größe von 1,5 bis 4·10³ Basenpaaren,
4. Schneiden eines Plasmids mit einem Restriktionsenzym, das gleiche kohäsive Enden erzeugt wie jene der DNA-Fragmente,
5. Reaktion der in 3. erhaltenen Fragmente und der linearen DNA des Plasmids mit Ligase.
Unter den hierfür geeigneten Donor-Mikroorganismen wurde der Stamm Bacillus subtilis BGSC 1A341 (erhalten aus dem Bacillus Genetic Stock Center, Ohio, USA) ausgewählt, der das Gen, das für die neutrale Protease codiert, in seinem Chromosom enthält.
Die chromosomale DNA dieses Stammes wird nach einem der bekannten Verfahren isoliert und gereinigt.
Die erhaltene DNA wird hierauf mit einem spezifischen Restriktionsenzym teilweise verdaut.
Besonders geeignet ist das Restriktionsenzym MboI.
Die teilweise Verdauung der chromosomalen DNA ergibt Fragmente verschiedener Größe. Von diesen werden Fragmente mit einer Größe von 1,5 bis 4·10³ Basenpaaren, die das betreffende Gen enthalten, mit Hilfe eines Saccharose-Gradienten isoliert. Zur Herstellung des erfindungsgemäßen hybriden rekombinanten Plasmids kann jeder Vektor verwendet werden, der mit dem Wirts- Mikroorganismus kompatibel ist.
Diese Plasmide können leicht identifiziert werden, wenn der Vektor einen Marker aufweist. Besonders geeignet sind Vektoren, die einen Marker aufweisen, der Resistenz gegen ein Antibiotikum umfaßt. Von diesen Vektoren werden jene bevorzugt, die ursprünglich aus Staphilococcus aureus isolierte Plasmide sind, und davon das Plasmid pUB-110 (BGSC 1E6), das das Gen enthält, das Resistenz gegen Kanamycin verleiht.
Dieses Plasmid wird mit bekannten Verfahren durch das Restriktionsenzym BamHI geschnitten, das gleiche kohäsive Enden ergibt wie die von dem Enzym MboI erzeugten, die somit verbunden werden können. Erfindungsgemäß wird die Ligase-Reaktion aus Schritt 5) zwischen den DNA-Fragmenten vorbestimmter Größe und dem linearisierten Plasmid pUB-110 mit Hilfe bekannter Verfahren in Anwesenheit eines Ligase-Enzyms durchgeführt. Eine für diesen Zweck geeignete Ligase ist T4-DNA-Ligase, die im Handel erhältlich ist. Wenn die Reaktion unter den oben erwähnten Bedingungen durchgeführt wird, erhält man hybride rekombinante Plasmide, die hierauf zur Transformierung von Wirtszellen eines geeigneten Mikroorganismus verwendet werden.
Erfindungsgemäß zeigte sich, daß für diesen Zweck besonders geeignete Wirtszellen durch Mutation des Stamms Bacillus subtilis BGSC 1A341 erhalten werden.
Die von uns erhaltene und als SMS 108 bezeichnete Mutante hat zwei grundlegende Eigenschaften:
1) Anwesenheit einer Mutation im Strukturgen für die neutrale Protease im Zellgenom.
2) Anwesenheit einer recE4-Mutation, die die homologe Rekombination in Bacillus subtilis verhindert.
Die Anwesenheit einer Mutation in dem Strukturgen für die neutrale Protease ergibt einen neutrale Protease Minus-Genotyp (npr&supmin;), der die Identifizierung der Stämme erleichtert, wenn sie durch die rekombinanten hybriden Plasmide transformiert werden, die das Gen, das die neutrale Protease codiert, enthalten.
Beim Klonen eines chromosomalen Gens eines Mikroorganismus besteht eines der verwendeten Verfahren im sogenannten "Schrotschuß-Verfahren". Dieses Verfahren besteht darin, die chromosomale DNA mit einem Restriktionsenzym zu schneiden, und die erhaltenen Fragmente mittels dem Enzym T4-DNA-Ligase mit einem Vektor-Plasmid zu verbinden, das wiederum mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten wird. Auf diese Art ist es möglich, eine sehr große Zahl von hybriden Molekülen zu erhalten, die aus der Plasmid-DNA und einem oder mehreren Fragmenten der chromosomalen DNA bestehen.
Diese Moleküle werden durch Einschleusen in Wirtszellen isoliert. Dieses Einschleusen kann mit einem der bekannten Verfahren durchgeführt werden, indem die hybriden Plasmide mit mikrobiellen Zellen, den Wirtszellen, in Kontakt gebracht werden. Die Plasmid-DNA dringt durch die Zellwand und die Membran in das Zytoplasma, wo sie wirksam werden kann. In diesem Fall wird die Zelle als transformiert bezeichnet. Die Plasmid-Transformation hat einen geringen Wirkungsgrad und durchschnittlich wird nur ein rekombinantes hybrides Plasmid in einer einzelnen Zelle wirksam.
Dadurch kann eine Population von Zellen erhalten werden, die einzelne rekombinante hybride Plasmide tragen, und die Kolonien auf einem festen Medium bilden können. Die Identifizierung der das betrachtete Gen enthaltenden Kolonie ist umso einfacher je effizienter und schneller der Auswahltest ist.
Im speziellen ist es zur leichteren Identifizierung der transformierten Kolonien, die eine hybrides rekombinantes Plasmid enthalten, das das funktionelle Gen für die neutrale Protease enthält, unserer Meinung nach vorteilhaft, einen mutanten Stamm von Bacillus subtilis 1A341 zu verwenden, der die neutrale Protease wegen einer Mutation im strukturellen Gen nicht mehr produzieren kann. Die Kolonien dieses mutanten Stammes, die auf einem festen Nährmedium, das zusätzlich zu den für das Bakterienwachstum notwendigen Substanzen Casein enthält, gezüchtet werden, ergeben nicht den typischen Hof, der andererseits um die Kolonien des Mutterstammes BGSC 1A341 zu sehen ist.
Das Fehlen der caseinolytischen Wirksamkeit bei dem mutanten Stamm hängt zusammen mit dem funktionellen Fehlen des Gens, das für die neutrale Protease codiert.
Bei Verwendung dieser mutanten Zellen in den Transformationsprozessen wird das Vorhandensein des hybriden rekombinanten Plasmids, das das die neutrale Protease codierende Gen enthält, in ihnen erfindungsgemäß auf dem festen, Casein enthaltenden Nährmedium sichtbar gemacht durch das Auftreten eines Hofs um die Kolonie.
Die Mutation des Mutterstamms Bacillus subtilis BGSC 1A341 kann durch Behandlung mit irgendeinem nach dem Stand der Technik bekannten mutagenen Mittel erzielt werden.
Insbesondere kann N-Methyl-N'nitro-N-nitrosoguanidin verwendet werden.
Die Behandlung mit dieser Verbindung wird in einer Pufferlösung (pH 6,0) bei einer Temperatur von 37ºC etwa 30 Minuten lang durchgeführt. Die für den neutrale-Protease-minus- Phänotyp verantwortliche Genmutation wird hierauf durch Transformation in Zellen von Bacillus subtilis SMS 003, die durch die Marker his, leu, met charakterisiert sind, eingebracht, wodurch ein mutanter Stamm his, leu, met, npr&supmin; erhalten wird. Der Stamm Bacillus subtilis SMS 003 wurde am 4. September 1984 bei der Federal Research Collection, North Central Region, Northern Regional Research Center (Peoria, Illinois) unter der Nummer NRRL-B-15897 hinterlegt.
Erfindungsgemäß wird der mutante Stamm npr&supmin; weiter modifiziert durch Einführen einer recE4-Mutation, die eine homologe Rekombination in Bacillus subtilis verhindert. Wenn exogene DNA in Zellen von Bacillus subtilis eingebracht wird und sie Regionen aufweist, die mit der chromosomalen DNA homolog sind, so unterliegt sie in Anwesenheit des Produkts des recE-Gens der Rekombination.
Diese Rekombination verursacht den Einbau des exogenen DNA-Fragments in das Zell-Genom.
Wenn das homologe DNA-Fragment in ein Plasmid eingebaut wird, das zur Transformation von Zellen von Bacillus subtilis recE&spplus; verwendet wird, kann dieses Plasmid das Fragment durch Rekombination verlieren.
Wenn jedoch die Funktion des rec-E-Gens in einer Wirtszelle zerstört wird, kann die homologe DNA auf dem Molekül des hybriden Plasmids erhalten werden und so von der chromosomalen DNA getrennt bleiben. Demgemäß und erfindungsgemäß erwies es sich als äußerst vorteilhaft, eine recE4-Mutation einzuführen, die homologe Rekombination in dem mutanten Stamm SMS003 npr&supmin; verhindert.
Die recE4-Mutation wird mit bekannten Verfahren aus der chromosomalen DNA des Stamms Bacillus subtilis BGSC 1A46 isoliert und hierauf durch Transformation in den mutanten Stamm SMS003 eingebracht.
Der erhaltene Stamm, charakterisiert durch die Marker his, leu, met, recE4, npr&supmin; und von uns als SMS108 bezeichnet, wurde am 4. September 1984 bei der Federal Research Collection, North Central Region, Northern Regional Research Center (Peoria, Illinois) unter der Nummer NRRL-B-15898 hinterlegt.
Erfindungsgemäß werden in Schritt c) die wie oben beschrieben erhaltenen hybriden rekombinanten Plasmide in Zellen von Bacillus subtilis SMS108 eingeschleust, die mit dem Verfahren beschrieben von S. Contente und D. Dubnau in Mol. Gen. Genet. 167, (1979) 251-258 kompetent gemacht wurden.
Die Klone, die das Gen für die neutrale Protease tragen, werden auf Platten getrennt, die ein geeignetes Nährmedium enthalten, dem Kanamycin und Casein zugesetzt wurden.
Mit diesem Verfahren können nur die Zellen erhalten werden, die das hybride rekombinante Plasmid mit der Determinante für die Resistenz gegen Kanamycin enthalten, und aus diesen können leicht jene isoliert werden, die das Gen für die neutrale Protease enthalten, identifizierbar durch die Anwesenheit eines Hofes (Abbildung 1). Die hybriden rekombinanten Plasmide, die das Gen für die neutrale Protease enthalten, werden hierauf aus zwei Klonen, die von Höfen umgeben sind, isoliert. Diese Plasmide, als pSM 126 und pSM 127 bezeichnet, ergeben die Restriktions-Muster dargestellt in Abbildung 2.
Die Zellen, aus denen diese Plasmide, bezeichnet als Bacillus subtilis SMS 108 (pSM 126) und Bacillus subtilis SMS 108 (pSM 127), isoliert wurden, wurden am 4. September 1984 bei der Federal Research Collection, North Central Region, Northern Regional Research Center (Peoria, Illinois) unter der Nummer NRRL-B-15899 bzw. NRRL-B-15900 hinterlegt.
Zellen von Bacillus subtilis SMS 108 (pSM 126) und Bacillus subtilis SMS 108 (pSM 127) werden hierauf unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Nährmedium in Anwesenheit von Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Mineralsalzen bei einer Temperatur von 37ºC gezüchtet, bis die neutrale Protease in hohen Ausbeuten in dem Nährmedium erhalten wird. Geeignete Kohlenstoffquellen, die in dem Nährmedium verwendet werden können, können irgendeine Art eines assmilierbaren Moleküls sein.
Die Stickstoffverbindungen werden üblicherweise aus organischen und anorganischen Ammoniumsalzen ausgewählt, wie zum Beispiel: Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumsuccinat und Harnstoff. Für diesen Zweck geeignete anorganische Salze sind unter anderem: Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat, Zinksulfat.
Diese Salze werden in Mengen eingesetzt, wie sie im allgemeinen in den üblichen Fermentationsverfahren verwendet werden. Das erfindungsgemäß verwendete Nährmedium ist vorzugsweise Vy (veal infusion broth, Kalbfleischbrühe) (DIFCO), dem Hefeextrakt (DIFCO) zugesetzt wurde.
Nach Ende der Fermentierungsreaktion werden die Zellen durch Filtrieren oder Zentrifugieren aus dem Reaktionsmilieu entfernt und die produzierte neutrale Protease wird in der überstehenden Flüssigkeit durch Messen der Enzymaktivität gemäß dem Verfahren von H. Uheara et al (J. Bacteriol. 119, 82-91, 1971) bestimmt.
Die für den Stamm Bacillus subtilis SMS 108 (pSM126) und Bacillus subtilis SMS108 (pSM127) erhaltenen Werte sind, ausgedrückt in Einheiten/ml, 1895 bzw. 2097.
Die Analyse eines aliquoten Anteils der überstehenden Flüssigkeit auf einem Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid- Gel nach dem Verfahren von Laemnli U.K. (Nature 277, 680 (1970)) zeigt für beide Stämme die Anwesenheit eines Proteins mit einem Molekulargewicht von MW 39 000, identisch mit jenem der neutralen Protease, die von Bacillus subtilis BGSC 1A341 erzeugt wird.
Erfindungsgemäß wurde die Nucleotidsequenz des Gens, das für die neutrale Protease codiert, bestimmt.
Die Analyse wurde durchgeführt durch Einfügen der Restriktionsfragmente A, B und C (Abbildung 2) des Gens für die neutrale Protease, das im Plasmid pSM127 vorliegt, in die Vektoren H13mp8 und M13mp9 (erhalten von New England Nuclear) und sequenziert nach der Methode von F. Sanger et al (PNAS 74, 5463- 5467, 1977) und nach dem Vorgehen von M. Poncz et al (PNAS 79, 4298-4302, 1982).
P. Mantsala und H. Zalkin in J. Bacteriol. L4, 493-501 (1980) veröffentlichten die endständige Aminosequenz der ersten 16 Aminosäuren der extrazellulären neutralen Protease von Bacillus subtilis: Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Thr-Leu- Lys-Gly-Ala-Thr-Val-Pro. Durch einen Vergleich dieser Daten aus der Literatur mit der Nucleotidsequenz, die von uns bestimmt wurde und die in Abbildung 3 angegeben wird, zeigt sich, daß die Sequenz von 16 Aminosäuren in der neutralen Protease in dem von der DNA abgeleiteten Protein vorliegt, wenn man beim Aminosäurerest 222 beginnt. Dies bedeutet, daß das Gen, daß von uns geklont wurde und das mit hoher Ausbeute in Bacillus subtilis SMS108 exprimiert wird, jenes für die neutrale Protease ist. Dieses Enzym wird durch Bacillus subtilis SMS108 in Form eines Vorläufers synthetisiert und hierauf an der Stelle 221-222 geschnitten, um die reife Protease zu ergeben.

Beschreibung der Abbildungen

Abbildung 1 zeigt eine Platte, die Casein (DIFCO) enthält, auf der die Kolonien, die neutrale Protease produzieren, von Höfen umgeben sind, und jene, die das Enzym nicht produzieren, keine Höfe aufweisen.
Abbildung 2 zeige die Restriktions-Diagramme der hybriden rekombinanten Plasmide pSM126 und pSM127.
Abbildung 3 ist die Nucleotidsequenz des Gens, das für die neutrale Protease codiert. Die gestrichelte Linie zeigt die Sequenz der 16 aminoendständigen Aminosäuren der extrazellulären neutralen Protease.
Die untenstehenden Beispiele dienen zur näheren Beschreibung und schränken die Erfindung nicht ein.

Beispiel 1

Herstellung des mutanten Stammes Bacillus subtilis SMS108

Zellen von Bacillus subtilis BGSC 1A341, die neutrale Protease produzieren, werden über Nacht bei 37ºC unter starkem Rühren in 100 ml VY Nährmedium gezüchtet, das zuvor bei 120ºC 15 Minuten lang sterilisiert worden war und folgende Zusammensetzung aufweist:
DIFCO Kalbfleischbrühe 25 g/l
DIFCO Hefeextrakt 5 g/l
H&sub2;O 1 l
Die erhaltene Kultur wird 1:100 mit VY Nährmedium verdünnt und unter starkem Rühren bei 37ºC gezüchtet.
Nach dem Wachstum wird die optische Dichte (O.D.) mit einem Spektrophotometer (Perkin-Elmer Modell 551 S) bei 650 nm in einer 1 ml Zelle mit einer optischen Weglänge von 1 cm gemessen. Bei einem Wert der O.D.650 von 0,7 oder etwa 0,7 werden 10 ml der Kultur 20 Minuten lang bei 5000 UpM in einer Beckmann Modell 4226 Zentrifuge zentrifugiert. Die Zellen werden hierauf mit 5 ml Trismaleat (TM) Puffer gewaschen, der folgende Zusammensetzung aufweist:
Tris 0,05 M
Maleinsäure 0,05 M
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 1 g
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,1 g
Ca(NO&sub3;)&sub2; 0,25 mg
FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,25 mg
pH 6,0
und danach in 10 ml TM-Puffer, der 300 ug/ml N-Methyl-Nmi nitro-N-nitrosoguanidin enthält, resuspendiert.
Die Suspension wird 30 Minuten lang bei 37koC gerührt.
Nach Ende der Reaktion wird die Suspension zentrifugiert und die Zellen mit 5 ml TM-Puffer gewaschen und in 50 ml VY Nährmedium resuspendiert.
Die Suspension wird hierauf in 50 aliquote Teile von je 1 ml aufgeteilt und jeder aliquote Teil wird über Nacht bei 37ºC unter Rühren kultiviert. Danach werden zu jedem aliquoten Teil 200 ul steriles Glycerin zugefügt und die Teile nach Einfrieren in einem Trockeneis-Äthanol-Bad bei -80ºC aufbewahrt.
Zur Isolierung der Mutanten werden die verschiedenen aliquoten Teile auf eine Temperatur von 37ºC gebracht und danach mit Spizizen Mineralmedium geeignet verdünnt, und 0,1 ml jeder Verdünnung auf Platten von Nährmedium ausgebreitet, das folgende Zusammensetzung aufweist:
DIFCO Nährlösung 8 g
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,25 g
KCl 1 g
DIFCO Agar 15 g
FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,28 g
MnCl&sub2; 1,25 mg
Ca(NO&sub3;)&sub2; 164 mg
Casein 10 g
H&sub2;O 1 l
Die Platten werden über Nacht bei 48ºC inkubiert, und hierauf jene Kolonien, die nicht von einem Hof umgeben sind, ausgewählt. Von den ausgewählten 13 000 Kolonien erwiesen sich nur 10 als negative neutrale Protease-Mutanten.
Einer dieser Mutanten wurde als SMS104 bezeichnet.
Die für den neutrale Protease-Phänotyp verantwortliche Genmutation wird hierauf durch Transformation in kompetente Zellen des Stammes Bacillus subtilis SMS003, in unserem Laboratorium isoliert, eingebracht.
Die chromosomale DNA des Stammes SMS104, nach bekannten Verfahren isoliert und wie in Beispiel 2 beschrieben, wird zu den kompetent gemachten Zellen des Stammes SMS003 in einer Konzentration von 1 ug/ml zugefügt. Geeignete Verdünnungen der Transformationsmischung werden sodann auf Casein-Platten ausgebreitet. Nach einer Inkubationsperiode über Nacht bei 37ºC ist eine der 500 erhaltenen Kolonien nicht von einem Hof caseinolytischer Aktivität umgeben. Die Mutation RecE4 wird in diesen Klon, bezeichnet als SMS107, eingeführt. Die chromosomale DNA von Bacillus subtilis 1A46 (TrpC2, recE4, Thr-5) wird nach bekannten Verfahren extrahiert und gereinigt und in einer Konzentration von 1 ug/ml zur Transformierung kompetenter Zellen von SMS107 verwendet.
Die Transformationsmischung wird hierauf auf Minimum- Medium (Spizizen minimal medium) plattiert, das mit 50 ug/ml Histidin und Leucin ergänzt worden war. Auf diese Weise wurden die Zellen von SMS107, die auf einem Medium ohne Methionin wachsen können, ausgewählt.
Die Met&spplus; Kolonien werden sodann auf Platten mit Spizizen- Medium übertragen, das 100 ug/ml Methylmethansulfonat enthielt. Die auf diese Substanz empfindlichen Kolonien sind jene mit der Mutation recE4. Eine dieser Kolonien wird isoliert und als SMS108 bezeichnet.

Beispiel 2

Isolierung und Reinigung der chromosomalen DNA des Stammes Bacillus subtilis BGSC 1A341

Ein Liter flüssiges VY Nährmedium in einem 3 l Erlenmeyerkolben wird mit 10 ml einer 16 Stunden Kultur von Bacillus subtilis BGSC 1A341 beimpft.
Die Suspension wird unter starkem Rühren bei einer Temperatur von 37ºC gehalten.
Nach dem Wachstum wird die optische Dichte (O.D.) mit einem Spektrophotometer (Perkin-Elmer Modell 551 S) bei 650 nm in einer 1 ml Zelle mit einer optischen Weglänge von 1 cm gemessen. Bei einem Wert der O.D. 650 von 1 wird die Kultur 20 Minuten lang bei 5000 UpM in einer Sorvall Zentrifuge mit einem Rotor Modell GS3 zentrifugiert. Hierauf werden die Zellen in 10 ml einer Lösung von 0,1 M Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0,05 M NaCl, pH 6,9, resuspendiert. 1 ml einer Lösung mit 0,1 M EDTA, 0,05 M NaCl, pH 6,9 und 10 mg/ml Lysozym (von Boehringer Mannheim) werden danach der Suspension zugefügt.
Die Suspension wird 30 Minuten bei 37ºC gerührt. Danach wird 1 ml einer 10%igen Lösung von Natriumdodecylsulfat zugegeben und die Suspension 10 Minuten lang auf einer Temperatur von 65ºC gehalten. Zu der erhaltenen Lösung wird hierauf Pronase (von Boehringer Mannheim), die zuvor 30 Minuten lang bei 37ºC in einer Lösung (SSC) von 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat inkubiert worden war, bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugefügt.
Die Lösung wird bis zur vollständigen Klärung bei 37ºC gehalten und danach NaCl bis zu einer Endkonzentration von 1 M zugefügt.
Die ausgefällte DNA wird mit einem Glasstab aufgenommen und in einem 100 ml Becherglas, das 3 Volumina kaltes Äthanol enthält, suspendiert. Hierauf wird die DNA in 10 ml SSC 0,1 X resuspendiert und die Suspension über Nacht bei Raumtemperatur (20 bis 25ºC) sanft gerührt.
Nach Ende dieses Zeitraums werden pankreatische RNAse (10 ug/ml) und RNAse T1 (5 uEinheiten/ml) zugefügt und die Mischung 30 Minuten bei 37ºC inkubiert.
Die in der Mischung anwesenden Proteine werden durch zwei aufeinanderfolgende Extraktionen mit gleichen Volumina von mit SSC gesättigtem Phenol entfernt, und die DNA enthaltende Lösung gegen SSC Puffer dialysiert.
Die DNA mit hohem Molekulargewicht (chromosomale DNA) wird sodann durch Zugabe eines 1/10 Volums von 3 M CH&sub3;COONH&sub4;, 1 mM EDTA (pH 7,59 und 0,54 Volumina Isopropanol gereinigt. Die so erhaltene DNA wird aufgenommen und in SSC Puffer bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml resuspendiert und bei 4ºC aufbewahrt.

Beispiel 3

Teilweise Verdauung der chromosomalen DNA mit MboI und ihre Fraktionierung

100 ug der wie in Beispiel 2 beschrieben erhaltenen DNA werden in 1 ml einer 6 mM Lösung von Tris-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl und 6 mM MgCl&sub2; in Anwesenheit von 100 Einheiten des Enzyms MboI (BRL) suspendiert.
Die Reaktion wird bei einer Temperatur von 37ºC 30 Minuten lang durchgeführt und hierauf durch Erwärmen auf 65ºC über 10 Minuten abgeblockt.
Die erhaltene Lösung, die die teilweise verdaute DNA enthält, wird in drei aliquote Teile geteilt und hierauf schichtförmig auf vorgefertigte 10-40% Saccharose-Gradienten in Anwesenheit von 30 mN Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Hydrochlorid (Tris-HCl), (pH 8,1), 10 mM EDTA, 1 M NaCl aufgetragen, und 20 Stunden lang bei 25 000 UpM in einer Beckmann Modell SW27 Zentrifuge zentrifugiert.
Fraktionen von 2 ml, die Fragmente chromosomaler DNA verschiedener Dimensionen enthalten, werden gesammelt. Ein aliquoter Teil jeder Fraktion wird auf Agarose-Gel unter Zuhilfenahme von geeigneten Molekulargewichts-Standards analysiert, um die Dimensionen der in den einzelnen Fraktionen vorliegenden DNA-Fragmente zu bestimmen.
Die Fraktionen mit DNA-Fragmenten mit Dimensionen zwischen 1,5 und 4·10³ Basenpaaren (bp) werden vereinigt und mit einem gleichen Volumen Wasser verdünnt. Zu dieser Lösung werden zwei Volumina Äthanol zugegeben. Die Lösung wird in einem Trockeneis-Äthanol-Bad (T = -80ºC) 15 Minuten lang gehalten. Die ausgefällt DNA wird hierauf durch Zentrifugieren bei 10 000 UpM von der Mischung abgetrennt.
Die erhaltene DNA wird mit 70%igem Äthanol gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Beispiel 4

Konstruktion von hybriden Plasmiden, die das Gen für die neutrale Protease enthalten.

5 ug des Plasmids pUB110 (BGSC 1E6), das die Determinante für die Resistenz gegen Kanamycin enthält, werden in 50 ul einer Lösung, die 6 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl und 6 mM MgCl&sub2; enthält, mit 5 Einheiten (U) des Restriktionsenzyms Bam HI (erhältlich von BRL) bei einer Temperatur von 37ºC 1 Stunde lang linearisiert.
5 ug von chromosomalen DNA-Fragmenten mit Dimensionen zwischen 1,5 und 4·10³ bp, wie in Beispiel 3 beschrieben erhalten, und 5 ug pUB110, wie oben beschrieben linearisiert, werden in 100 ul einer Lösung, die 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol und 0,6 mM Adenosintriphosphat (ATP) enthält, gemischt und mit Hilfe von 10 U der DNA-Ligase T4 verbunden. Die Ligations-Mischung wird 3 Stunden lang bei Raumtemperatur (20 bis 25ºC) gehalten.

Beispiel 5

Transformierung von Zellen von Bacillus subtilis SMS108

Zellen von Bacillus subtilis SMS108 werden nach der Methode von D. Dubnau et al. (J. Mol. Biol. L6, 209-221, 1971) transformiert.
20 ul der Ligations-Mischung, wie in Beispiel 4 beschrieben erhalten, werden verwendet, um 1 ml von Bacillus subtilis SMS108 Zellen, die kompetent gemacht worden waren, zu transformieren.
Die Transformierungs-Mischung wird 30 Minuten lang bei 37ºC gehalten und hierauf auf Platten ausgebreitet, die ein Casein-Medium mit der Zusammensetzung aus Beispiel 1 enthalten.
Die Platten werden 16 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Nach diesem Zeitraum zeigen sich Kolonien, von denen einige von einem Hof umgeben sind. Dies sind die Kolonien von Bacillus subtilis SMS108, die das hybride Plasmid mit der Determinante für die Resistenz gegen Kanamycin und das Gen für die extrazelluläre neutrale Protease, die die enzymatische Hydrolyse des vorhandenen Caseins verursacht, enthalten. Von 130 000 Transformanten zeigen sich 12 umgeben von einem Hof caseinolytischer Aktivität.

Beispiel 6

Isolierung und Charakterisierung des hybriden Plasmids, das das Gen, das für die neutrale Protease codiert, enthält.
Aus zwei Transformanten mit caseinolytischer Aktivität, wie in Beispiel 5 erhalten, werden die hybriden Plasmide pSM126 und pSM127, deren Restriktionsdiagramme in Abbildung 2 angegeben sind, isoliert mit Verfahren, die von Gryczan et al (J. Bacteriology 134, 318-329, 1978) beschrieben sind.
Diese Plasmide besitzen einen gemeinsamen DNA-Bereich von etwa 2400 Basenpaaren (bp). Die derart isolierten Plasmide werden einzeln in kompetente Zellen des Stammes Bacillus subtilis SMS108 wieder eingebracht.
Nach Wachstum über 30 Minuten bei 37ºC werden die Transformierungs-Mischungen auf Platten ausgebreitet, die ein Caseinmedium mit der weiter oben beschriebenen Zusammensetzung aufweisen. Nach 16 Stunden bei einer Temperatur von 37ºC zeigen sich alle gegen Kanamycin resistente Transformanten von einem Hof proteolytischer Aktivität umgeben.
Dies zeigt die Anwesenheit der beiden hybriden Plasmide pSM126 und pSM127 des Gens, das für eine extrazelluläre Protease codiert.
In dem gleichen Versuch werden Zellen von Bacillus subtilis SMS108 durch das Plasmid pUB110, das die Determinante für die Resistenz gegen Kanamycin enthält, transformiert.
Die transformierten Zellen ergeben, auf Platten ausgebreitet, die Casein in dem Medium enthalten, nach 16 Stunden bei 37ºC keine Hofbildung. Dies zeigt, daß diese Transformanten keine Gene enthalten, die für caseinolytische Aktivität codieren.

Beispiel 7

Produktion und Charakterisierung der proteolytischen Aktivität des Stammes Bacillus subtilis SMS108 (pSM126) und Bacillus subtilis SMS108 (pSM127)

Vier 100 ml Erlenmeyerkolben, die 10 ml VY-Medium enthalten und zu deren ersten dreien 5 ug/ml Kanamycin zugesetzt wurde, werden mit jeweils den folgenden Stämmen geimpft: Bacillus subtilis SMS108 (pSM126), Bacillus subtilis SMS108 (pSM127), Bacillus subtilis SMS108 (pUB110) und Bacillus subtilis BGSC 1A341. Die Kolben werden unter kräftigem Rühren 24 Stunden bei 37ºC gehalten.
Danach werden die Zellen von dem Nährmedium durch Zentrifugieren abgetrennt und die überstehenden Flüssigkeiten bei 4ºC 24 Stunden lang gegen 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) Puffer, der 2 mM Calciumacetat enthält, dialysiert.
Hierauf werden 100 ul jeder überstehenden Flüssigkeit mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) Puffer, der 2 mM Calciumacetat enthält, geeignet verdünnt und mit 0,5 ml einer 0,6%igen Caseinlösung (Merck) in 50 mM Tris-HCl Puffer vermischt, um die Aktivität des von jedem Stamm in der Nährlösung produzierten Enzyms zu bestimmen.
Die Mischungen werden bei einer Temperatur von 37ºC 30 Minuten lang inkubiert. Das nicht hydrolysierte Casein wird sodann durch Zugabe von 0,5 ml einer Lösung, die 0,11 M Trichloressigsäure, 0,33 M Essigsäure und 0,22 M Natriumacetat enthält, bei Raumtemperatur (20º bis 25ºC) 30 Minuten lang ausgefällt.
Nach Ende dieses Zeitraums wird der Niederschlag durch Zentrifugieren bei 10 000 UpM über 10 Minuten abgetrennt und die Extinktion der überstehenden Flüssigkeit bei einer Wellenlänge von 275 nm mit einem Perkin Elmer Modell 551S Spektrophotometer gemessen.
Eine Protease-Einheit wird definiert als die Menge an Enzym, die in einer Minute bei 37ºC unter den oben beschriebenen Bedingungen einen Anstieg der Extinktion bei 275 nm verursacht, der 1 ug Tyrosin äquivalent ist.
Die Charakterisierung der von den einzelnen Stämmen produzierten Protease wurde durch gesonderte Bestimmung der Aktivität der neutralen Protease und der in der gleichen Lösung vorhandenen Serinprotease durchgeführt.
Erstere wird durch Präinkubation der überstehenden Flüssigkeit eine Stunde lang bei 0ºC in Anwesenheit von 5 mM EDTA gehemmt; zweitere wird durch Einwirken auf die überstehende Flüssigkeit von 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PSMF) eine Stunde lang bei 0ºC gehemmt.
Die bei der Analyse der überstehenden Flüssigkeiten erhaltenen Ergebnisse für die verschiedenen Stämme werden in Tabelle 1 angeführt. Tabelle 1 Proteolytische Aktivität in dem Nährmedium (Einheiten/ml) Stamm Abwesenheit von Hemmstoffen In Anwesenheit von von EDTA In Anwesenheit von von PMFS 1. B. subtilis SMS108 (pSM126) n.b. nicht bestimmbar
In Anwesenheit großer Mengen neutraler Protease ist es nicht möglich, die Aktivität auf Grund der Serinprotease zu bestimmen.
Aus den Angaben der Tabelle 1 zeigt sich, daß die erfindungsgemäßen Stämme eine neutrale Protease mit einer 5 bis 6 Mal größeren Ausbeute als die ursprünglichen Stämme produzieren.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung neutraler Bacillus subtilis Protease, umfassend:

(a) die Isolierung des die neutrale Protease codierenden Gens mit der in Abbildung 3 angeführten Sequenz aus der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis BGSG 1A341,

(b) der Konstruktion eines hybriden rekombinanten Plasmids, das das in Schritt (a) erhaltene Gen enthält,

(c) das Einführen des hybriden rekombinanten Plasmids aus Schritt (b) in Bacillus subtilis SMS 108 (NRRL-B-1589), der eine Mutation des strukturellen Gens für die neutrale Protease und eine recE4-Mutation aufweist, und Anzüchten der erhaltenen Klone,

(d) das Isolieren der erhaltenen Klone aus Schritt (c), die das hybride rekombinante Plasmid enthalten,

(e) die Züchtung der erhaltenen Klone aus Schritt (d) in einem flüssigen Nährmedium unter Bedingungen, die die Produktion der neutralen Protease ergeben, und

(f) das Isolieren der so hergestellten neutralen Protease aus dem Nährmedium.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mutationen erzielt werden durch:

(a') Behandlung des Bacillus Stamms BGSG 1A341, der die neutrale Protease produzieren kann, mit einem mutagenen Mittel,

(b') Übertragen der erzielten Genmutation auf einen Stamm von Bacillus subtilis, und

(c') Einbringen einer recE4-Mutation in den in Schritt (b') erhaltenen transformierten Bacillus subtilis Stamm.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das mutagene Mittel in Schritt (a') N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Bacillus subtilis Stamm in Schritt (b') Bacillus subtilis SMS 003 (NRRL-B-15897) ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Einbringen der recE4-Mutation in Schritt (c') durch Transformierung mit einem Gen erreicht wird, das eine recE4-Mutation enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das die recE4-Mutation enthaltende Gen aus der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis BGSC 1A46 isoliert wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Einführung des hybriden rekombinanten Plasmids in Schritt (c) mittels Transformierung durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Isolierung der Klone, die das rekombinante hybride Plasmid enthalten, in Schritt (d) durch Plattieren der Klone aus Schritt (c) auf ein Nährmedium, dem Kanamycin und Casein zugesetzt wurden, durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Wachstum in Schritt (c) durchgeführt wird in einem flüssigen Medium unter aeroben Bedingungen in Anwesenheit von Stickstoffquellen, Kohlenstoffquellen, Mineralsalzen und bei einer Temperatur von 20º bis 40ºC.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der in Schritt (d) isolierte Klon Bacillus subtilis SMS 108 (pSM 126) (NRRL-B-15899) oder Bacillus subtilis SMS 108 (pSM 127) (NRRL-B-15900) ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das rekombinante hybride Plasmid von Schritt (b) hergestellt wird durch:

(a'') Isolierung und Reinigung chromosomaler DNA von Bacillus subtilis BGSC 1A341,

(b'') teilweisem Schneiden der chromosomalen DNA mit dem Restriktionsenzym MboI,

(c'') Isolierung von Fragmenten der chromosomalen DNA mit einer Länge von 1,5 bis 4·10³ Basenpaaren,

(d'') Schneiden eines Plasmids mit dem Restriktionsenzym, und

(e'') Binden, in Anwesenheit von T4 DNA Ligase, der in Schritt (c'') erhaltenen DNA-Fragmente mit dem in Schritt (d'') erhaltenen geschnittenen Plasmid, um das erwähnte rekombinante hybride Plasmid zu erhalten.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Isolierung der Fragmente in Schritt (c'') auf einem Saccharose-Gradienten durchgeführt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Plasmid aus Schritt (d'') pUB110 (BGSG 1E6) ist und das Restriktionsenzym BamHI ist.

114. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das hybride Plasmid aus Schritt (b) pSM 126 oder pSM 127, wie in Anspruch 15 bzw. 16 definiert, ist.

15. Plasmid pSM 126, wie erhältlich aus Bacillus subtilis Stamm SMS 108 (pSM 126) hinterlegt bei NRRL unter der Eingangszahl NRRL-B-15899.

16. Plasmid pSM 127, wie erhältlich aus Bacillus subtilis Stamm SMS 108 (pSM 127) hinterlegt bei NRRL unter der Eingangszahl NRRL-B-15900.

17. Verfahren zur Herstellung von neutraler Bacillus subtilis Protease, umfassend den Schritt der Züchtung eines Bacillus subtilis Stammes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bacillus subtilis SMS 108 (pSM 126) (NRRL-B-15899) oder Bacillus subtilis SMS 108 (pSM 127) (NRRL-B-15900) in einem flüssigen Nährmedium unter Bedingungen, die die Produktion neutraler Protease ergeben.