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Die vorliegende Erfindung betrifft ein
Herstellungsverfahren für Inosin und Guanosin, Substanzen, die als
Ausgangsmaterialien für die Synthese von 5'-Inosinsäure und
5'-Guanylsäure von Bedeutung sind, neue Mikroorganismen, die für ihre
Herstellung verwendet werden und eine neue DNA, die zur
Konstruktion der neuen Mikroorganismen verwendet wird.
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Zur Herstellung von Inosin und Guanosin durch
Fermentation sind Verfahren bekannt unter Verwendung von Bacillus-
Stämmen (japanische veröffentlichte geprüfte Patentanmeldungen
Nr. 2956/1980, 14160/1982 und 41915/1982 und japanische
ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 42895/1984) oder von
Brevibacterium-Stammen [japanische geprüfte Patentanmeldung Nr. 5075/1976;
Agricultural Biological Chemistry, 42, 399 (1978)], die einen
Adeninbedarf oder die nicht nur einen Adeninbedarf, sondern
auch Widerstandskraft gegen verschiedene Wirkstoffe aufweisen.
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Als Ergebnis zahlreicher Forschungsarbeiten, die auf dem
Gebiet der Nucleinsäurefermentation durchgeführt worden sind,
ist es bekannt, daß die Biosynthese von
purinnucleotidverwandten Substanzen, wie Inosin, Guanosin, Xanthosin, Adenosin,
dessen Basen (z.B. Hypoxanthin) und dessen Phosphaten (z.B.
5'-Inosinsäure) einer Feedback-Kontrolle durch adeninverwandte
Substanzen (Adenosin oder dessen Phosphat, wie 5'-Adenylsäure)
oder guaninverwandten Substanzen (Guanosin oder dessen
Phosphat, wie 5'-Guanylsäure), den Endprodukten, unterworfen ist.
Speziell die Inhibierung des Biosynthesewegs für diese
purinnucleotidverwandten Substanzen durch adeninverwandte
Substanzen ist bemerkenswert; es ist deshalb normal, eine Mutante mit
einem Adeninbedarf zu verwenden, der die
Adenylsuccinatsynthetase fehlt, wie auch die Menge an adeninverwandten Substanzen
im Medium zu begrenzen, um auf diese Weise die Menge an
adeninverwandten Substanzen in der Kulturbrühe auf einem
niedrigen Niveau zu halten (Y. Nakao, Microbial Technology,
Band 1, Seiten 311-354, herausgegeben durch H. J. Peppler und
D. Perlman, Academic Press, New York). Als Basis für den
Adeninbedarf ist in herkömmlicher weise das Verfahren
angewandt worden, in welchem ein Adenin benötigendes Auxotroph
mittels der Replika-Plattierungsmethode usw. selektiert wird,
wobei man einer mutagenen Behandlung, wie ultraviolette
Bestrahlung und Nitrosoguanidin(NTG)-Behandlung folgt.
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Die so erhaltene Adenin benötigende Mutante hat jedoch
einige Nachteile; zum Beispiel ist das Wachstum schlecht, weil
die Mutation des relevanten Enzymgens oft von Mutationen an
anderen Orten im Chromosom begleitet ist, und die Rückmutation
während der Fermentation vermindert die effiziente und stabile
Produktivität von Inosin und/oder Guanosin. Insbesondere im
Falle der fermentativen Produktion im industriellen Maßstab
nimmt die Rückmutation infolge der zunehmenden
Zellteilungshäufigkeit zu, und daher werden die Nachteile umso
schwerwiegender.
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Nachdem die Erfinder der vorliegenden Erfindung diese
Umstände bemerkt hatten, führten sie Untersuchungen durch, wie
man einen Adenosylsuccinatsynthetase-Mangelstamm erhalten
kann; als Ergebnis davon konstruierten die Erfinder
erfolgreich einen neuen Mikroorganismus, dessen chromosomale DNA
durch rekombinante DNA-Techniken wie folgt umgewandelt wurde:
ein geeignetes DNA-Fragment, jene ausgenommen, die für
Adenylsuccinatsynthetase kodieren, wurde in die
Adenylsuccinatsynthetase-Genregion im Chromosom des Mikroorganismus insertiert.
Die Erfinder fanden, daß eine sehr stabile Produktion
wiederholt durchgeführt werden kann, weil der genannte, durch die
genannte Technologie aus Bacillus-Stämmen gewonnene neue
Mikroorganismus als Rezipient große Mengen an Inosin und/oder
Guanosin akkumuliert, und keine Rückmutationen des
Adenylsuccinatsynthetase-Bedarfs
während der Fermentation gefunden
wird. Die vorliegende Erfindung hat sich auf diesem Befund
basierend entwickelt.
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Die vorliegende Erfindung stellt demgemäß folgendes
bereit:
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(1) eine DNA, umfassend eine
Adenylsuccinatsynthetase-Genregion mit einem DNA-Fragment, das insertiert wurde, um das Gen
zu inaktivieren,
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(2) wie in obigem Abschnitt (1) definierte DNA, worin die DNA
ein anderes Gen als ein Adenylsuccinatsynthetase-Gen ist,
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(3) wie in obigem Abschnitt (2) definierte DNA, worin das
andere Gen ein Selektionsmarker-Gen ist,
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(4) einen Vektor mit einer wie in obigem Abschnitt (1), (2)
oder (3) definierten DNA, die darin insertiert ist,
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(5) einen Bacillus-Stamm, der ein Transformant ist,
entstanden durch Transformation mit der wie in obigem Abschnitt (3)
definierten DNA oder mit dem wie in obigem Abschnitt (4)
beanspruchten Vektor, dem die Adenylsuccinatsynthetase fehlt und
der befähigt ist, Inosin und/oder Guanosin zu bilden, und
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(6) ein Verfahren zur Herstellung von Inosin und/oder
Guanosin, umfassend in einem Medium das Kultivieren eines Bacillus-
Stammes, welcher eine aus der Transformation mit einer DNA,
umfassend eine Adenylsuccinatsynthetase-Genregion mit einem um
das Gen zu inaktivieren, insertierten DNA-Fragment, oder einer
Vektor-DNA mit fehlender Adenylsuccinatsynthetase
resultierende Transformante ist, und die Fähigkeit zur Inosin- und/oder
Guanosin-Bildung besitzt, wobei man den Stamm Inosin und/oder
Guanosin bilden und akkumulieren läßt, und das Ernten des auf
diese Weise im Kulturmedium gebildeten Inosins und/oder
Guanosins.
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Es ist wünschenswert, daß die eine in dieser Erfindung
verwendete Adenylsuccinatsynthetase-Genregion enthaltende DNA
eine DNA ist, die sowohl das ganze DNA-Segment, welches für
das Enzym-Gen kodiert, als auch einige flankierende, direkt
stromaufwärts und stromabwärts des DNA-Segments befindliche
Regionen enthält; und in der vorliegenden Erfindung kann eine
DNA benutzt werden, die einen Teil des Enzym-Gens enthält oder
die sowohl einen Teil des Enzym-Gens als auch flankierende
Regionen davon enthält. Solche DNA läßt sich mittels
DNA-Rekombinationstechniken leicht aus mikrobieller Chromosomen-DNA
isolieren. Als Wirts-Vektor-Systeme sind für diesen Zweck die
EK-Systeme geeignet, die normalerweise verwendet werden. Das
heißt, von Escherichia coli K-12 abstammende Mutanten, wie zum
Beispiel Escherichia coli C600 [T. Maniatis et al.: Molecular
Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
University of Tokyo Press, 1982, S. 504], Escherichia coli
JA221 (IFO 14359, ATCC 33875), Escherichia coli MM 294 (ATCC
33625) [Proceedings of Natural Academy of Science, USA, 73,
4174 (1976)] und Abkömmlinge davon, werden zweckmäßig als
Wirte verwendet; pBR 322, pACYC 184, pACYC 177, pUC 18, pUC 19,
pHSG 396, pHSG 298 usw. werden zweckmäßig als Vektoren
verwendet.
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Außerdem können auch Wirts-Vektor-Systeme verwendet
werden, die Kombinationen sind aus einem Phagenvektor, wie Charon
4A ("Molecular Cloning", S. 31), EMBL 3 oder EMBL 4 (Journal
of Molecular Biology, 170, 827) und einem Wirt, wie
Escherichia coli DP 50supF ("Molecular Cloning", S. 504), Escherichia
coli NM 538 oder NM 539 (Journal of Molecular Biology, 170,
827), Escherichia coli LE 392 (Journal of Biological
Chemistry, 218, 97), oder dergleichen. Es ist auch möglich,
Wirts-Vektor-Systeme eines Bacillus-Stamms zu verwenden, wie
zum Beispiel Bacillus subtilis MI 114 (Gene, 24 255) oder
eine davon abstammende Mutante als Wirt und ein Plasmid, das
die Fähigkeit der autonomen Replikation in einem Bacillus-
Stamm aufweist, wie zum Beispiel pUB 110, pC 194, pE 194, pS
194, pSA 2100 oder pHY 300 PLK als Vektor.
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Im allgemeinen gibt es keine besondere Beschränkung für
den Ursprung des Adenylsuccinatsynthetase-Gens, es kann daher
ein beliebiger Mikroorganismus als Donor verwendet werden,
vorausgesetzt, die Basensequenz seines
Adenylsuccinatsynthetase-Gens weist eine hohe Homologie mit der Basensequenz des
Adenylsuccinatsynthetase-Gens im Chromosom des wie unten
beschrieben als Rezipient verwendeten Bacillus-Stamms auf.
Besonders bevorzugt wird die Verwendung eines Bacillus-Stamms,
und dies auch vom Gesichtspunkt der leichten Handhabung, weil
sogenanntes Selbstklonieren erzielt wird, und es auch zu
erwarten ist, daß die erhaltene Transformante stabil sein wird.
Der genannte Donor muß weiterhin nicht immer die Fähigkeit
haben, Inosin, Guanosin, Xanthosin oder Purinbasen zu
produzieren, aber es wird bevorzugt, daß der Donor keine
Adenylsuccinatsynthetase-Defizienz aufweist. Als Beispiele solcher DNA-
Donoren seien Bacillus-Stämme wie Bacillus subtilis, Bacillus
pumilus und Bacillus licheniformis erwähnt. Die folgenden
Stämme seien insbesondere als Beispiele davon genannt.
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Bacillus subtilis Nr. 168 (BGSC lAl)
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Bacillus subtilis Nr. 115 (IFO 14187, FERM BP-1327)
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Bacillus subtilis MI 114 (Gene, 24, 255)
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Bacillus pumilus ATCC 7061
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Bacillus licheniformis ATCC 14580
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BGSC : Bacillus Genetic Stock Center
(Bacillusgenetisches Vorratszentrum)
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IFO : Institute for Fermentation, Osaka (Institut für
Fermentation, Osaka)
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FERM BP : auf dem Budapester Vertrag basierende
Zugangsnummer beim Fermentation Research Institute
(FRI) (Fermentationsforschungsinstitut), Amt für
Industrielle Wissenschaft und Technologie,
Ministerium für Internationale(n) Handel und
Industrie, 1-3, Higashi 1-chome, Yatabemachi,
Tsukuba-gun, Ibaragi-ken, Japan
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ATCC : American Type Culture Collection
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Ein bekanntes Verfahren, um aus einem Donor die
chromosomale DNA herzustellen, ist zum Beispiel das Verfahren, welches
Phenol zur Extraktion der chromosomalen DNA verwendet (H.
Saito und K. Miura: Biochem. Biophys. Acta 72, 619). Die so
erhaltene chromosomale DNA wird mit passend ausgewählten
Restriktionsenzymen verdaut und unter Verwendung von DNA-Ligase
mit einem Vektor ligiert. Man verwendet diese
Ligationsmischung zur Transformation eines Wirtsbacteriums, welches
defizient ist in der Adenylsuccinatsynthetase, und selektiert
die Transformante, in welcher die Adenylsuccinatsynthetase-
Defizienz komplementiert worden ist. Die Transformation des
adenylsuccinatsynthetase-defizienten Wirts kann, wenn der Wirt
Escherichia coli ist, gemäß einem bekannten Verfahren, zum
Beispiel dem Verfahren von N. Cohen et al. (Proceedings of
National Academy of Science, USA, 69, 2110), oder, wenn der
Wirt ein Bacillus-Stamm ist, gemäß einem bekannten Verfahren,
zum Beispiel dem Verfahren von S. Chang and S. N. Cohen
(Molec. Gen. Genet., 168, 115) durchgeführt werden.
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Ob in der so erhaltenen Transformanten die
Adenylsuccinatsynthetase-Defizienz komplementiert worden ist, kann leicht
auf Basis der Kultivierbarkeit der Transformanten in einem
adeninfreien Medium (einem mit anderen Nährstoffen als dem
benötigten Adenin versetztem Medium) beurteilt werden.
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Um die das Gen enthaltende DNA in großer Menge aus der
Transformanten zu erhalten, die in der
Adenylsuccinatsynthetase-Defizient komplementiert worden ist, kann gemäß der In
obengenannten "Molecular Cloning", Seiten 86-93 beschriebenen
Methode verfahren werden.
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Diese DNA-Rekombinationstechnik kann gemäß dem in der
japanischen veröffentlichten ungeprüften Patentanmeldung Nr.
156388/1985 oder der europäischen Patentveröffentlichung Nr.
0151341 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
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Das Gen enthaltende DNA kann auch aus einer Genbank des
Donors erhalten werden durch Selektion einer Rekombinanten,
die den Adeninbedarf der enzymdefizienten Mutanten eines
Bacillus-Stamms komplementiert, der ein Chromosom hat, welches
hochgradig homolog ist mit der Basensequenz des
Adenylsuccinatsynthetase-Gens eines Bacillus-Stamms, der als der unten
beschriebene Rezipient verwendet wird.
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Eine Genbank kann man zum Beispiel gemäß dem Verfahren
von G. Rapaport et al., (Molec. Gen. Genet. 176, 239) oder dem
Verfahren von E. Ferrari et al. (J. Bacteriol. 146, 430)
herstellen in der Weise, wie sie unten kurz zusammengefaßt wird.
Die aus dem Donor extrahierte chromosomale DNA wird mit
passend ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und unter
Verwendung von DNA-Ligase mit einem Vektor ligiert. Man verwendet
die Ligationsmischung um eine Transformante zu erhalten. Aus
der Transformanten extrahiert man zum Beispiel gemäß dem in
"Molecular Cloning": S. 368 beschriebenen Verfahren das
rekombinante Plasmid, welches als Genbank verwendet wird. Das
obengenannte rekombinante Plasmid wird dann zu einen aus einem
adenylsuccinatsynthetase-defizienten Stamm der Gattung
Bacillus hergestellten kompetenten Zelle einem rekombinanten
Plasmid mit der Fähigkeit, die
Adenylsuccinatsynthetase-Defizienz des Stammes zu komplementieren, gegeben, wobei eine das
Adenylsuccinatsynthetase-Gen für die vorliegende Erfindung
enthaltende DNA erhalten werden kann.
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Zur Konstruktion und Isolierung der neuen
erfindungsgemäßen DNA aus jener DNA, die das so erhaltene
Adenylsuccinatsynthetase-Gen enthält, verwendet man in einfacher und
konventioneller Weise die DNA-Rekombinationstechnologie; zum
Beispiel wird ein Wirts-Vektor-System von Escherichia coli in
geeigneter Weise verwendet.
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Die neue DNA dieser Erfindung kann aus einem das
Adenylsuccinatsynthetase-Gen enthaltenden Plasmid mittels folgender
Verfahrensweise konstruiert und isoliert werden.
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Das Plasmid, welches das Adenylsuccinatsynthetase-Gen
enthält, wird in herkömmlicher Verfahrensweise durch ein
Restriktionsenzym verdaut. Das zu insertierende DNA-Fragment
wird separat davon in herkömmlicher Verfahrensweise durch ein
Restriktionsenzym verdaut, und das abgespaltene Fragment wird,
nachdem es beispielsweise durch Agarosegel-Elektrophorese
abgetrennt worden ist, extrahiert und erforderlichenfalls
isoliert. Die beiden Fragmente werden miteinander vermischt, und,
falls ihre kohäsiven Enden identisch sind, werden beide
Fragmente durch T4-DNA-Ligase direkt zusammen ligiert, oder, falls
ihre kohäsiven Enden nicht identisch sind, werden beide
Fragmente, nachdem ihre kohäsiven Enden durch
T4-DNA-Polymerase in stumpfe Enden umgewandelt worden sind, durch T4-DNA-
Ligase zusammen ligiert, wodurch die gewünschte DNA erhalten
wird.
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Zur Verdauung des das Adenylsuccinatsynthetase-Gen
enthaltenden Plasmids kann irgendein Restriktionsenzym verwendet
werden, solange dieses die Spaltstellen in der Gen-DNA
erkennt, und es sind insbesondere jene bevorzugt, die weniger
Spaltstellen im Gen erkennen und nicht irgendwelche andere
Teile des Plasmids spalten. Geeignete Beispiele, die verwendet
werden können, sind Afl II, Apa I, Axy I, Bam HI, Bcl I, Bgl
II, Bst EII, Cla I, Eco RI, Eco 81I, Hpa I, Hin dIII, Kpn I,
Mlu I, Nco I, Pst I, Sac I, Sac II, Sal I, Sma I, Sph I, Spl
I, Ssp I, Stu I, Xba I und Xho I.
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Als das in die Adenylsuccinatsynthetase-Genreglon zu
insertierende DNA-Fragment kann in dieser Erfindung irgendein
DNA-Fragment ungeachtet dessen Herkunft, einschließlich der
DNA-Fragmente aus Prokaryoten und Eukaryoten, verwendet
werden, solange es das genannte Gen inaktiviert. Vom
Gesichtspunkt der praktischen Anwendung ist es normalerweise
vorteilhaft, ein DNA-Fragment, das ein Selektionsmarkergen
enthält, zu verwenden, so daß nicht nur die Selektion der
Transformanten erleichtert wird sondern auch die
Adenylsuccinatsynthetase defizient ist.
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Als Selektionsmarker-Gen kann irgendein Gen verwendet
werden, solange es selbst in einem Bacillus-Stamm exprimiert,
es ist aber bevorzugt, daß sich das Marker-Gen in einem
Escherichia coli-Wirt exprimiert. In diesem Fall können die
Expression in einem Bacillus-Stamm und die Expression in einem
Escherichia coli-Wirt etwas sein, was als sogenanntes
Durchlesen bezeichnet wird; das zu insertierende DNA-Fragment muß
daher nicht immer einen Promotor aufweisen, der sich selbst in
dem Wirt exprimiert.
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Als Beispiele solcher Marker-Gene seien erwähnt:
Wirkstoffresistenz-Gene, Aminosäurebiosynthese-Gene,
Nucleinsäurebiosynthese-Gene und Vitaminbiosynthese-Gene. Zu den
Wirkstoffresistenz-Genen zählen zum Beispiel das Bacillus pumilus
Chloramphenicolacetyltransferase-Gen [D.M. Williams et al.: J.
Bacteriol., 146, 1162 (1981)], das Plasmid pC 194
Chloramphenicolacetyltransferase-Gen [S. Horinouchi and B.
Weisblum: J. Bacteriol., 150, 815 (1982)] und das Plasmid pUB
110 Kanamycinnucleotidyltransferase-Gen [M. Natsumura et al.:
J. Bacteriol., 160, 413 (1984)]. Zu den
Aminosäurebiosynthese-Genen zählen das Bacillus subtilis-Leucinbiosynthese-Gen (T.
Tanaka and K. Sakaguchi: Molec. Gen. Genet., 165, 269 (1978))
und das Tryptophanbiosynthese-Gen [K. Yoshimura et al.: J.
Bacteriol., 159, 905 (1984)]; zu den Nucleinsäurebiosynthese-
Genen zählen das Escherichia coli-Thymidinsynthetase-Gen
[Rubin et al.: Gene, 10, 227 (1980)]; und zu den
Vitaminbiosynthese-Genen zählen das Mausdihydrofoliatreductase-Gen
[D. M. Williams et al.: Gene, 16, 199 (1981)].
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Die Selektion des ein insertiertes inaktiviertes
Adenylsuccinatsynthetase-Gen tragenden Transformanten kann leicht
mit einem Verfahren, wie jenem, in welchem das relevante
Antibiotikum zum Selektionsmedium zugegeben wird, wenn eine ein
Wirkstoffresistenz-Gen enthaltende DNA verwendet wird, oder
durch Komplementierung der Auxotrophie, wenn ein Biosynthese-
Gen als Marker verwendet wird, durchgeführt werden.
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Ein DNA-Fragment eines Selektionsmarker-Gens kann wie
folgt konstruiert werden:
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Zur Isolierung der DNA eines Selektionsmarker-Gens wird
eine das Gen tragende rekombinante DNA mit einem passend
ausgewählten Restriktionsenzym verdaut, durch
Agarosegel-Elektrophorese fraktioniert, und aus dem Agarosegel-Fragment, welches
das Gen enthält, wird dann die gewünschte DNA durch bekannte
Verfahren isoliert, wie zum Beispiel das in "Molecular
Cloning", Seiten 164-166 beschriebene Verfahren. Als für diesen
Zweck verwendete Restriktionsenzyme werden jene, die keine
Restriktionsstellen im Gen erkennen und die ein das Fragment
enthaltendes Gen liefern, das so klein wie möglich ist,
besonders bevorzugt. Es ist auch möglich, in geeigneter Weise zwei
Restriktionsenzyme in Kombination zu benutzen, wenn dies
erforderlich ist. Wenn die beiden Enden des so erhaltenen DNA-
Fragments des Selektionsmarker-Gens nicht mit den kohäsiven
Enden der Restriktionsstellen des zu insertierenden
Adenylsuccinatsynthetase-Gens identisch sind, wird es möglich, eine
Ligation unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase zur Umwandlung
der genannten kohäsiven Enden in stumpfe Enden durchzuführen.
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Um die neue DNA der vorliegenden Erfindung in großer
Menge zu erhalten, wird das Wirtsbacterium unter Verwendung der
obengenannten Ligationsmischung transformiert; es wird eine in
dem Selektionsmedium, das zu dem insertierten Selektionsmarker
korrespondiert, kultivierte Transformante erhalten; und diese
Transformante wird einer einem bekannten Verfahren, wie dem
obengenannten "Molecular Cloning", Seiten 86-93,
entsprechenden Prozedur unterworfen.
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Um die Adenylsuccinatsynthetase-Genregion mit dem darin
insertierten Marker aus dem so erhaltenen Plasmid zu
isolieren, wird das Plasmid mittels herkömmlicher Verfahren durch
Restriktionsenzyme verdaut und durch Agarosegel-Elektrophorese
abgetrennt, worauf es leicht extrahiert und isoliert werden
kann, beispielsweise mittels eines Elektroeluters.
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Als nächstes folgt eine Erklärung des Verfahrens zur
Konstruktion eines neuen Mikroorganismus durch Transformation
eines Bacillus-Stamms mittels der neuen, so ernaltenen DNA.
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Für diese Transformation kann als Rezipient irgendein
Bacterium verwendet werden, solange wie es das Merkmal
besitzt, daß das Bacterium außerhalb der Zelle zugegebene
lineare DNA aufnimmt und seinen Charakter ändert als Ergebnis der
Rekombination in einem Teil, der in hohem Maße homolog ist mit
der Basensequenz der DNA im Chromosom, was bekanntlich als die
Fähigkeit zur Transformation bezeichnet wird; der Rezipient
braucht nicht identisch sein mit dem
Adenylsuccinatsynthetase-Gendonor, solange die Basensequenz seiner chromosomalen DNA
in hohem Maße homolog zur Basensequenz des in der linearen DNA
enthaltenen Adenylsuccinatsynthetase-Gens ist. Um
Transformanten zu erhalten, die in hohem Maße die Fähigkeit zur
Produktion von Inosin und/oder Guanosin haben, werden
Bacillus-Stämme, insbesondere Bacillus subtilis, Bacillus pumilus,
Bacillus licheniformis und dergleichen in Anbetracht der
Tatsache bevorzugt, daß die genannten Bakterien bekanntermaßen
wenigstens einen der purinnucleotidverwandten Substanzen, wie
zum Beispiel Inosin, Guanosin und Xanthosin akkumulieren, daß
sie der Transformation befähigt und pathogenfrei sind und sie
lange sicher in industriellem Maßstab verwendet worden sind.
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Hinzu kommt, wenn diese Bakterien beispielsweise, nachdem
sie mit einem oder mehreren der bekannten Charakteristika, die
für die Akkumulierung von purinnucleotidverwandten Substanzen
als vorteilhaft angesehen werden, zum Beispiel Resistenzen
gegen Purinanaloge, wie die 8-Azaguanidin-Resistenz, die
Nucleosidphosphorylase-Defizienz, die
5'-Gyanylatreduktase-Defizienz und die Foliatanatagonisten-Resistenz, versehen worden
sind, als Rezipienten verwendet werden, für die Verbesserung
der Inosin- und/oder Guanosin-Produktivität oft vorteilhaftere
Ergebnisse erhalten werden.
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Um Inosin gemäß dieser Erfindung auf vorteilhafte Weise
herzustellen, ist es wünschenswert, als Rezipienten einen
Bacillus-Stamm zu verwenden, der eine Transformante ist,
resultierend aus der Transformation mit einer DNA, welche eine 5'-
Inosinsäuredehydrogenase(IMP-Dehydrogenase)-Genregion umfaßt,
die ein das darin insertierte Gen inaktiviernde DNA-Fragment
aufgewiesen hatte, oder mit enem die genannte DNA darin
insertiert tragenden Vektor, dem IMP-Dehydrogenase fehlt und der
befähigt ist, Inosin herzustellen (offenbart in der
japanischen Patentanmeldung Nr. 311588/1986 und der
US-Patentanmeldung Serial No. 136367). Bacillus subtilis BM 1041 (IFO 14560,
FERM BP-1243 sei als Beispiel des Rezipienten erwähnt.
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Wenn man nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verfährt,
ist es außerdem möglich, einen Stamm als Rezipienten zu
verwenden, der keine Adenylsuccinatsynthetase-Defizienz besitzt,
um den neuen Mikroorganismus dieser Erfindung zu konstruieren,
und es ist auch möglich, einen
adenylsuccinatsynthetase-defizienten Stamm als Rezipienten zu verwenden, der resultierend
aus der Züchtung nach einem herkömmlichen Verfahren die
Fähigkeit der Produktion von purinnucleotidverwandten Substanzen
erworben hat, um einen neuen stabilen Mikroorganismus mit
einer verbesserten Befähigung zur Produktion von
purinnucleotidverwandten Substanzen zu erhalten. Als Beispiele von
Rezipienten, die zur Gattung Bacillus gehören, seien die folgenden
erwähnt:
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Bacillus subtilis Nr. 115 (IFO 14187, FERN BP-1327)
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Bacillus subtilis No. 168 (BGSC No. lAl)
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Bacillus subtilis MI 114 (Gene 24, 255)
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Bacillus subtilis BM 1022 (IFO 14580, FERN BP-1324)
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Eacillus subtilis BM 1032 (IFO 14559, FERN BP-1242)
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Bacillus subtilis lA3 (BGSC No. 1A3)
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Bacillus subtilis NA-6011 (IFO 14189, FERN BP-291)
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Bacillus subtilis NA-6012 (IFO 14190, FERN BP-292)
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Bacillus subtilis NA-6128 (IFO 14373, FERN EP-617)
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Bacillus subtilis NA-7821 (IFO 14368, FERN BP-618)
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Bacillus subtilis ATCC 19221
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Bacillus subtilis ATCC 14662
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Bacillus pumilus ATCC 7061
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Bacillus pumilus (FERM P-2116)
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Bacillus pumilus (FERM P-4832)
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Bacillus pumilus (FERM P-4829)
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Bacillus licheniformis ATCC 14580
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Bacillus licheniformis IFO 12485
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Wenn die neue DNA dieser Erfindung dazu verwendet wird,
einen Bacillus-Stamm zu transformieren, kann die DNA in Form
eines Inserts in das Plasmid verwendet werden; im allgemeinen
wird jedoch die Verwendung einer DNA in linearer Form oder die
erfindungsmäße DNA außerhalb des Plasmids bevorzugt.
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Die Transformation eines Bacillus-Stamms unter Verwendung
eines linearen DNA-Fragments kann mit einem bekannten
Verfahren durchgeführt werden [C. Anagnostopouls und J. Spizizen: J.
Bacteriol., 81, 741 (1961)], und die Transformante kann von
der auf dem Selektionsmedium gewachsenen Kolonie mit Hilfe
eines Selektionsmarkers aufgesammelt werden. Wenn
beispielsweise
ein Wirkstoffresistenz-Gen als Selektionsmarker
insertiert worden ist, kann die Transformante aus dem den
relevanten Wirkstoff enthaltenden Selektionsmedium aufgenommen
werden. Um zu beurteilen, ob die so erhaltene Transformante ein
Stamm mit der erfindungsgemäß erwünschten
Adenylsuccinatsynthetase-Defizienz geworden ist oder nicht, wird sein Wachstum
sowohl auf einem die für das Wachstum des Rezipienten
essentiellen Substanzen enthaltenden Minimalmedium als auch auf
einem durch Adeninzusatz zum Minimalmedium hergestellten,
komplettierten Medium geprüft.
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Wenn dem für die Transformation verwendeten Rezipienten
Adenylsuccinatsynthetase fehlt, kann eine Veränderung im
Adenylsuccinatsynthetase-Gen nicht durch das genannte Verfahren
beurteilt werden, weil der Rezipient ohne Adenin selbst nicht
in dem obengenannten Medium wächst, aber es ist auf einfache
Weise möglich, wie unten im nächsten Absatz beschrieben, die
Southern-Hybridisierung zu verwenden, um auf diese Weise zu
beurteilen, ob die erhaltene Transformante die gewünschte ist.
Selbst wenn dem für die Transformation verwendete Rezipienten
Adenylsuccinatsynthetase fehlt, erhält man einen
Mikroorganismus dieser Erfindung auf einfache Weise. Um die
Adenylsuccinatsynthetase-Defizienz zu reparieren, wird der Rezipient mit
einer das normale Adenylsuccinatsynthetase-Gen enthaltenden
DNA, die aus einem Donor-Mikroorganismus mit
Adenylsuccinatsynthetase-Aktivität kloniert wurde, transformiert. Dann wurde
die Transformante mit der erfindungsgemäßen DNA
retransformiert.
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Ob die so erhaltene Transformante der gewünschte neue
Mikroorganismus ist, kann bestätigt werden, indem man die
chromosomale DNA der Transformanten durch geeignete
Restriktionsenzyme verdaut, einer Agarosegel-Elektrophorese
unterwirft, mit Alkali denaturiert, auf ein Nitrocellulosefilter
transferiert, getrennt davon ein wie für die Insertion
verwendetes DNA-Fragment, zum Beispiel ein DNA-Fragment, das ein
Wirkstoffresistenz-Gen enthält, radioaktiv markiert und eine
Southern-Hybridisierung unter Verwendung des radioaktiv
markierten DNA-Fragments als Sonde durchführt. Das heißt, auf
der Tatsache basierend, daß zur Sonde in der chromosomalen DNA
des Rezipienten keine Hybridisierung vorhanden ist, während in
der chromosomalen DNA der Transformanten Hybridisierung zur
Sonde vorhanden ist, kann leicht beurteilt werden, ob die
genannte Transformante der erfindungsgemäß erwünschte
Mikroorganismus ist.
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Es kann bestätigt werden, daß das genannte DNA-Fragment
in das Adenylsuccinatsynthetase-Gen insertiert worden ist, und
dies basiert auf der Tatsache, daß, wenn unter Verwendung von
aus dem Donor isolierter Adenylsuccinatsynthetase als Sonde
eine Southern-Hybridisierung durchgeführt wird, das zur Sonde
hybridisierende Fragment der chromosomalen DNA der
Transformanten um die Länge des insertierten DNA-Fragments größer
wird.
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Die obengenannte Transformante, die das Marker-Gen darin
im Adenylsuccinatsynthetase-Gen in der chromosomalen DNA
insertiert gehabt hatte, Ist als Ergebnis der Expression des
Marker-Gens, wenn dieses ein Wirkstoffresistenz-Gen ist, bei
spielsweise wirkstoffresistent geworden, und sie ist, als
Ergebnis der Insertion des Marker-Gens,
adenylsuccinatsynthetase-defizient geworden und weist einen Adeninbedarf auf;
verglichen mit dem Rezipienten vor der Transformation bleibt aber
die Transformante in den anderen bakteriologischen
Charakteristika unverändert.
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Zu den Merkmalen der Transformante zählt, daß die
Rückmutationsrate auf Adeninbedarf so niedrig ist, daß keine
Revertante entdeckt werden kann.
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Die Rückmutationsrate kann durch den Zahlenwert des
Verhältnisses der Anzahl der auf adeninfreiem Agarplattenmedium
gewachsenen Kolonien zur Anzahl der über das genannte
Agarplattenmedium mit Adenin verteilten Zellen ausgedrückt werden.
Doch ist in der genannten Transformanten die Rückmutationsrate
extrem niedrig; es erscheint keine Revertante, selbst wenn die
Transformante subkultiviert oder mit einem mutagenen Agens
behandelt wird.
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Als Beispiele solcher erfindungsgemäßer Transformanten
seien Bacillus subtilis BM 1051 (IFO 14581, FERM BP-1325) und
Bacillus subtilis NA-6201 (IFO 14582, FERM BP-1326), die auch
unten in den Beispielen vorkommen, erwähnt. Es ist natürlich
leicht möglich, gemäß dem in der vorliegenden Beschreibung
beschriebenen Verfahren durch Auswahl geeigneter Marker-Gene
und Rezipienten in der gleichen Weise verschiedene
Transformanten zu konstruieren.
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Zur Herstellung von Inosin und/oder Guanosin unter
Verwendung der durch diese Erfindung erhaltenen Transformanten
wird das gleiche Verfahren angewandt wie das herkömmliche
Verfahren zur Kultivierung von Bakterien, die Inosin und/oder
Guanosin produzieren.
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Das heißt, als Medium wird ein Medium verwendet, welches
nicht nur Nährstoffe wie Aminosäuren, Nucleinsäuren und
Vitamine wie erforderlich, sondern auch eine Kohlenstoffquelle,
eine Stickstoffquelle und Metallionen enthält. Als
Kohlenstoffquelle wird Glucose, Saccharose, Maltose, Stärke,
verzuckerter Stärkesirup, Melasse usw. verwendet. Als
Stickstoffquelle werden nicht nur anorganische Stickstoffquellen wie
Ammoniumsalze der Schwefelsäure, Salpetersäure,
Chlorwasserstoffsäure, Kohlensäure usw., Ammoniakgas und wäßriges
Ammoniak, sondern auch organische Stickstoffquellen wie Pepton,
Maisquellwasser, Sojamehl, Trockenhefe und Harnstoff allein
oder in Kombination verwendet. Als weitere Nährstoffe werden
verschiedene geeignete Mineralstoffe, Aminosäuren, Vitamine
usw., die für das Wachstum der Bakterien essentiell sind,
ausgewählt und allein oder in Kombination verwendet. Als
Adeninquelle werden nicht nur Adenin, Adenosin, Adenylsäure und
Nucleinsäuren, sondern auch Mikrobenzellen, die diese Substanzen
enthalten, Extrakte davon usw. verwendet.
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Das Medium kann weiterhin, falls erforderlich,
Antischaummittel, wie Siliconöl und Polyalkylenglykol, und dazu
zugesetzte oberflächenaktive Substanzen aufweisen.
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Man führt die Kultivierung normalerweise unter aeroben
Bedingungen, d.h. Schüttelkultur, aerobe Submerskultivierung
usw. durch. Der pH des Mediums ist vorzugsweise im Bereich von
4 bis 9. Wenn man während der Kultivierung eine pH-Schwankung
beobachtet, kann man Schwefelsäure, Calciumcarbonat,
Natriumhydroxid, Ammoniakgas, wäßriges Ammoniak usw. in geeigneter
Weise zugeben, um den pH auf den bevorzugten Bereich
wiedereinzustellen. Die Kultivierungstemperatur wird normalerweise
innerhalb des Bereiches 20 ºC bis 45 ºC in einer für das
Wachstum der verwendeten Mikrorganismen und für die
Akkumulierung von Inosin und/oder Guanosin geeigneten Weise ausgewählt.
Die Kultivierung wird fortgesetzt, bis die Menge an Inosin
und/oder Guanosin im wesentlichen das Maximum erreicht hat,
normalerweise ist aber dieses Ziel schon innerhalb von 24 bis
144 Stunden Kultivierung erreicht.
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Um Inosin und/oder Guanosin aus der Kultur abzutrennen
und zu ernten, können gewöhnliche Reinigungsmethoden, über die
schon publiziert worden ist, verwendet werden, zum Beispiel
die Präzipitation und die Chromatographie unter Verwendung von
Ionenaustauschharz oder Aktivkohle.
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Die vorliegende Erfindung ermöglicht die effiziente,
industriell vorteilhafte Herstellung von Inosin und/oder
Guanosin, die Rohmaterialien der wichtigen Würzsubstanzen
5'-Inosinsaure und 5'-Guanylsäure sind.
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Das heißt, durch Transformation eines Bakterienstamms als
Rezipienten unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA kann
ein neuer Bakterienstamm erhalten werden, dem
Adenylsuccinatsynthetase fehlt und der im hohem Maße befähigt ist, Inosin
und/oder Guanosin zu produzieren.
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Durch diese Erfindung ist es weiterhin möglich, unter
Verwendung eines bereits gezüchteten
adenylsuccinatsynthetasedefizienten Bacillus-Stamms mit der Fähigkeit, eines oder
mehrere aus Inosin, Xanthosin und Guanosin zu produzieren, als
Rezipienten, einen neuen Bakterienstamm mit weiter
verbesserter Produktivität zu erhalten. Das genannte
Produktionsbacterium weist nicht nur eine hohe Akkumulation von Inosin und
Guanosin auf, es ist aber auch unwahrscheinlich, daß es
Rückmutation zeigt, so daß es sehr stabil ist; deshalb ist das
Bacterium vom Standpunkt des Produktionsmanagements sehr
vorteilhaft.
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Mit Hilfe der folgenden Ausführungsbeispiele wird jetzt
die vorliegende Erfindung detaillierter beschrieben werden,
aber sie ist natürlich niemals darauf beschränkt. Die
Reaktionen unter Verwendung der Restriktionsenzyme (alle hergestellt
durch Nippon Gene, Japan) oder die Modifikation von Enzymen
wurden, wenn nicht anders angegeben, unter Einhaltung der von
den Enzymherstellern spezifizierten Arbeitsbedingungen
durchgeführt.
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Die Hinterlegungen und das Datum der Hinterlegung der 8
Mikroorganismen, auf die in den folgenden Beispielen Bezug
genommen wird, werden unten in der Tabelle gezeigt:
Hinterlegung Mikroorganismus
IFO (Datum der Hinterlegung)
FRI (Datum der Hinterlegung)
Bacillus subtilis BM 1051
Bacillus subtilis NA-6201
Bacillus subtilis Nr. 115
Bacillus subtilis BM 1032
Escherichia coli MM 294 (pPA350-1)
Escherichia coli C 600 (pPA350)
Bacillus subtilis NA-6128
Bacillus subtilis BM 1022
Beispiel 1
i) Herstellung der chromosomalen DNA
-
Bacillus subtilis Nr. 115 (IFO 14187, FERM BP-1327) wurde
in ein C-Medium (5 g/l Glucose, 0,5 g/l Natriumcitrat, 5 g/l
Polypepton, 5 g/l Hefeextrakt, 1 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 7 g/l K&sub2;HPO&sub4;,
3 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,2 g/l MgSO&sub4; 7 H&sub2;O, pH 7,0) eingeimpft und bei
37 ºC über Nacht kultiviert, und aus 1 l der Kulturbrühe
wurden durch das Chromosomen-DNA-Extraktionsverfahren unter
Verwendung von Phenol 7,1 mg chromosomale DNA erhalten.
ii) Fraktionierung der chromosomalen DNA
-
Die nach Abschnitt i) erhaltene chromosomale DNA wurde bei
37 ºC 60 Minuten lang mit dem Restriktionsenzym Bgl II bis zur
vollständigen Verdauung umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde
dann mit der Saccharosegradientenmethode
(Saccharosekonzentration 10 bis 40 %; Beckmann Ultrazentrifuge Roter SW41Ti, 26000
UpM, 24 Stunden, 20 ºC) in zwanzig etwa 500 ul große Portionen
fraktioniert. Die Saccharosegradientenmethode wurde gemäß dem
in "Molecular Cloning", Seiten 270-280 beschriebenen Verfahren
durchgeführt.
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Unter Verwendung eines Aliquots jeder Fraktion wurden
dann kompetente Zellen von Bacillus subtilis BM 1032, dem
durch die herkömmliche, später beschriebene Methode
hergestellten adenylsuccinatsynthetase-defizienten Stamm,
transformiert, und man verteilte sie über ein M-9 CAT
Agarplattenmedium (6 g/l Na&sub2;HPO&sub4;, 3 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g/l NaCl, l g/l NH&sub4;Cl,
1mM MgSO&sub4;, 1 mM CaCl&sub2;, 2 g/l Glucose, 2 g/l Caseinaminosäure,
50 mg/l Tryptophan, 15 g/l Agar, pH 7,2); als Ergebnis davon
traten aus den Fraktionen Nr. 4, 5 und 6 Kolonien ohne
Adeninbedarf auf. Die Fraktionen Nr. 4, 5 und 6 wurden
vereinigt und es wurde damit eine Ethanolpräzipitation
durchgeführt, und die DNA wurde zurückgewonnen.
-
Die DNA-Präzipitate wurden dann in TE-Puffer aufgelöst,
und man ließ darauf das Restriktionsenzym Bam HI bei 37 ºC 1
Stunde lang bis zur vollständigen Verdauung der DNA einwirken,
und man unterzog dann die Reaktionsmischung einer Agarosegel-
Elektrophorese. Man schnitt das Agarosegel in Übereinstimmung
mit der Mobilität in 8 Gelfragmente, und aus jedem Fragment
wurde die DNA mit einem unidirektionalen Elektroeluter
(International Biotechnologies, Inc.) zurückgewonnen. Unter
Verwendung eines Aliquots der DNA wurden kompetente Zellen von
Bacillus subtilis BM 1032 in der gleichen Weise wie oben
transformiert, wobei ein zu Komplementierung des Adeninbedarfs des
genannten Stamms befähigtes DNA-Fragment aus der Fraktion
erhalten wird, die der elektrophoretischen Mobilität von
ungefähr 6,7 bis 8,5 kB DNA entspricht.
iii) Insertion des chromosomalen DNA-Fragments in pBR322
-
3 ug pBR322 wurden nach Verdauung mit dem
Restriktionsenzym Bam HI mit alkalischer Phosphatase behandelt und einer
Phenolextraktion unterzogen, der eine Ethanolpräzipitation
folgte. Das resultierende Präzipitat wurde in TE-Puffer
aufgelöst und mit dem DNA-Fragment von Abschnitt ii) gemischt, und
man führte mit Hilfe von T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo, Japan)
die Ligierungsreaktion durch. Unter Verwendung von 5 ul dieser
Reaktionsmischung wurden kompetente Zellen des Stamms
Escherichia coli C600 transformiert, wobei man ungefähr 800
Transformanten mit Ampicillinresistenz und Empfindlichkeit gegen
Tetracyclin erhielt. Diese Transformation wurde gemäß dem
Verfahren von Cohen et al. durchgeführt. Dann wurde aus jedem der
obengenannten Escherichia coli-Transformanten die DNA gemäß
dem in Molecular Cloning, Seiten 368-369 beschriebenen
Verfahren extrahiert, und man transformierte die in Abschnitt ii)
hergestellten kompetenten Zellen von Bacillus subtilis BM
1032, wobei eine Transformante erhalten wurde, welche das den
Adeninbedarf des genannten Stamms, nämlich Escherichia coli
C600 (pPA350), komplementierende rekombinante Plasmid trägt.
iv) Herstellung von rekombinantem Plasmid aus der
Transformante Escherichia coli C600 (pPA350) (IFO 14578, FERM BP-
1322) in großem Maßstab
-
Die Plasmidextraktion aus Escherichia coli C600 (pPA350)
wurde gemäß dem in "Molecular Cloning", Seiten 86-93,
beschriebenen Verfahren durchgeführt. Das heißt, Escherichia
coli C600 (pPA350) wurden in LB-Medium (10 g/l Baktotrypton, 5
g/l Hefeextrakt, 5 g/l Natriumchlorid) eingeimpft, und zur
Amplifikation des Plasmids wurden 140 ug/ml Chloramphenicol
zugegeben. Nach Kultivierung über Nacht wurden die Zellen
gesammelt und gewaschen. Zu den gewaschenen Zellen gab man
Lysozym und dann eine 1 % Natriumlaurylsulfat enthaltende 0,2 N
Natriumhydroxidlösung. Nach der Zugabe von 5 M Kaliumacetat
wurden die Zellen zentrifugiert, um auf diese Weise einen das
Plasmid enthaltenden Überstand zu geben. Man gab das 0,6-fache
Volumen an Isopropanol zum Überstand, um auf diese Weise die
plasmidische DNA auszufällen. Nach Waschen mit Ethanol wurde
das Präzipitat in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl-Puffer, 1 mM EDTA,
pH 8,0) aufgelöst. Zur resultierenden Lösung gab man
Cäsiumchlorid bis zu einer relativen Dichte von 1,60 und dann
Ethidiumbromid bis zu einer Endkonzentration von 600 ug/ml.
Die Mischung wurde 12 Stunden lang bei 20 ºC und 50000 UpM
unter Verwendung einer Ultrazentrifuge (Roter, V&sub6;&sub5;Ti)
zentrifugiert und man nahm die im Ultravioletten nachweisbare
Plasmidbande. Nach Extraktion und Entfernen des Ethidiumbromids mit
n-Butanol wurde die DNA an TE-Puffer dialysiert, wobei man aus
1 l Kulturbrühe das rekombinante Plasmid pPA350 in einer Menge
von ungefähr 100 ug erhielt.
-
Man verdaute das Plasmid pPA350 mit verschiedenen
Restriktionsenzymen, und, basierend auf dem Molekulargewicht
der Hin dIII-Verdauung der Lamdaphagen-DNA, wurde aus dem
Agarosegel-Elektrophorese-Migrationsmuster die in Fig. 1 gezeigte
Restriktionsstellen-Karte abgeleitet.
v) Isolierung des pC194-Chloramphenicolacetyltransferase-
Gens (cat)
-
pC194 (3 ug) wurde mit den Restriktionsenzymen Hpa II und
Sau 3AI verdaut, und mit Hilfe von T4-DNA-Polymerase (Takara
Shuzo, Japan) wurden die kohäsiven Enden in stumpfe Enden
umgewandelt. Getrennt davon wurde pUC19 (1 ug) mit dem
Restriktionsenzym Hinc II verdaut. Man vermischte die beiden
gespalten Fragmente und ligierte sie mit Hilfe von T4-DNA-Ligase
miteinander. Unter Verwendung dieser Reaktionsmischung wurde
Escherichia coli MM294 (ATCC 33625) transformiert, um auf
diese Weise ein ampicillinresistente und
chloramphenicolresistente Transformante, nämlich Escherichia coli MM294 (pCAT15), zu
erhalten. Man extrahierte aus dieser Transformanten gemäß dem
Verfahren des vorangehenden Abschnitts das rekombinante
Plasmid, wodurch man aus 1 l Kulturbrühe ungefähr 2000 ug DNA
erhielt, und die DNA wurde als pCAT15 bezeichnet. 30 ug pCAT15
wurden mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Hin dIII doppelt
verdaut, und die kohäsiven Enden wurden mittels
T4-DNA-Polymerase in stumpfe Enden umgewandelt. Danach wurde eine
Agarosegel-Elektrophorese durchgeführt, und das einer
Mobilität von 1,1 kB DNA entsprechende Agarosegel-Fragment wurde
herausgeschnitten. Dann wurde die DNA unter Verwendung eines
unidirektionalen Elektroeluters aus dem genannten
Agarosegel-Fragment extrahiert, und man führte mit der DNA
einer Ethanolpräzipitation durch. Das Präzipitat wurde in
TE-Puffer gelöst.
Beispiel 2
-
Konstruktion der plasmidischen DNA, die das
Adenylsuccinatsynthetase-Gen mit darin insertiertem
Chloramphenicolacetyltransferase-Gen umfaßt
-
Nach vollständiger Verdauung durch das Restriktionsenzym
Hpa I wurden 3 ug pPA350 15 Minuten lang auf 65 ºC erhitzt und
es wurde damit eine Ethanolpräzipitation durchgeführt, und das
Präzipitat wurde in TE-Puffer gelöst.
-
Die resultierende Lösung und die im vorangehenden
Abschnitt erhaltene, DNA-fragmenthaltige Lösung wurden
miteinander vermischt, und man führte mit Hilfe von T4-DNA-Ligase
eine Ligierungsreaktion durch. Unter Verwendung einer 5 ul-
Portion der Reaktionsmischung wurden kompetente Zellen von
Escherichia coli transformiert, um auf diese Weise eine
ampicillinresistente und chloramphenicolresistente Transformante,
nämlich Escherichia coli MM294 (pPA350-1) (IFO 14579, FERM BP-
1323) zu erhalten. Man extrahierte dann gemäß dem oben im
Beispiel 1-iv beschriebenen Verfahren aus der Transformanten
Escherichia coli MM294 (pPA350-1) das Plasmid, und bezeichnete
es als pPA350-1. Man spaltete das Plasmid pPA350-1 mit
verschiedenen Restriktionsenzymen, und, basierend auf dem
Molekulargewicht des Hin dIII-Spaltprodukts des Lamdaphagen-DNA,
wurde aus dem Muster der Agarosegel-Elektrophorese eine
Restriktionskarte abgeleitet (Fig. 2). Aus dem
Restriktionsmuster ist es klar ersichtlich, daß es sich bei der genannten
DNA um eine pBR322 und das insertierte Fragment umfassende
10,5 kb DNA handelt, und sie eine Struktur hat, in welcher das
Chloramphenicolacetyltransferase-Gen pCAT 15 enthaltende DNA-
Fragment in die Hpa-Stelle im Adenylsuccinatsynthetase-Gen des
Bacillus subtilis insertiert ist. Das Verfahren zur
Konstruktion von pPA350-1 und die Restriktionsenzymkarte werden in
Fig. 2 gezeigt.
Beispiel 3
-
i) Konstruktion eines neuen Bacillus-Stamms, der eine
inaktivierte Adenylsuccinatsynthetase-Gen-DNA trägt, in welchem
ein Chloramphenicolacetyltransferase-Gen in die chromosomale
DNA insertiert ist.
-
Aus Bacillus subtilis MI 114 wurde mit Hilfe
herkömmlicher Methoden der Gewinnung eine Transformante mit
Purinnucleosidphoshorylase-Defizienz und
5'-Guanylatreduktase-Defizienz, nämlich Bacillus subtilis BM 1022 (IFO 14580, FERM BP-
1324), gewonnen. Dann wurden gemäß dem Verfahren von C.
Aganostpoulos und J. Spizizen kompetente Zellen des genannten
Stamms hergestellt. Zu 1 ml einer Suspension der genannten
kompetenten Zeilen wurde ein 10,5 kB DNA-Fragment gegeben, das
durch Spaltung des in Beispiel 2 erhaltenen Plasmids mit Pvu
II erhalten wurde, und nach 1 Stunde Schütteln bei 37 ºC wurde
die Suspension über die 10 ug/ml Chloramphenicol enthaltende
LB-Agarplatte verteilt und einen Tag lang bei 37 ºC inkubiert.
Man erhielt aus der gebildeten Kolonie eine
chloramphenicolresistente Transformante, nämlich Bacillus subtilis BM 1051 (IFO
14581, FERM BP-1325).
-
Die genannte Transformante wurde auf eine M-9
CAT-Agarplatte
sowie in eine weitere Platte mit obigem Medium, die
zusätzlich Adenin enthielt, eingeimpft, und ihr Wachstum wurde
untersucht; das Ergebnis war die Bestätigung dafür, daß die
genannte chloramphenicolresistente Transformante gleichzeitig
einen Adeninbedarf aufweist.
ii) Rückmutationstest von Bacillus subtilis BM 1051 auf
Adeninbedarf
-
Bacillus subtilis BM 1051 wurde in 20 ml des in Tabelle 1
beschriebenen Impfmediums eingeimpft und bei 37 ºC 18 Stunden
lang in einer Schüttelkultur gehalten. Danach wurden 1 ml des
Kulturmediums zum in Tabelle 1 beschriebenen
Hauptfermentationsmedium (20 ml) transferiert und bei 37 ºC 2 Tage lang in
Schüttelkultur gehalten. Nachdem die Subinokulation 5 Mal wie
oben wiederholt wurde, wurden in der Kulturbrühe die
lebensfähigen Zellen gezählt; es wurde gefunden, daß die Anzahl an
lebensfähigen Zellen in der Kulturbrühe, die alle einen
Adeninbedarf aufwiesen und wovon keine eine Revertante war, 1 x
10&sup9; pro ml Kulturbrühe betrug.
-
Davon getrennt wurde Bacillus subtilis BM 1022 einem her
kömmlichen Verfahren zur Gewinnung einer Auxotrophen
unterzogen. Das heißt, nach Behandlung mit Nitrosoguanidin wurde der
genannte Stamm auf einem 50 mg/l Adenin enthaltenden M-9 CAT-
Agarplattenmedium verteilt und bei 37 ºC 1 Tag lang inkubiert.
Die gebildete Kolonie wurde mit der
Replika-Plattierungsmethode auf ein M-9 CAT-Agarplattenmedium (die gleiche
Zusammensetzung wie oben mit der Ausnahme, daß kein Adenin enthalten war)
sowie auf ein Adenin enthaltendes M-9 CAT-Agarplattenmedium
transferiert und bei 37 ºC über Nacht inkubiert, wobei aus der
Kolonie ein adenylsuccinatsynthetase-defizienter Stamm,
nämlich Bacillus subtilis BM 1032 (IFO 14459, FERM BP-1242)
erhalten wurde, der die Fähigkeit hat, in Gegenwart von Adenin
nicht aber in dessen Abwesenheit zu wachsen.
-
Dieser Stamm Bacillus subtilis BM 1032 mit Adeninbedarf
wurde der gleichen Prozedur wie oben unterworfen, uni die
Häufigkeit der Rückmutation zu untersuchen; als Ergebnis davon
wurde gefunden, daß die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml
Kulturbrühe 1 x 10&sup9; betrug, von welchen 15 %, nämlich 1,5 x
10&sup8; Zellen Revertanten waren, die keinen Adeninbedarf hatten.
iii) Inosin- und Guanosinproduktivität von Bacillus
subtilis BM 1051
-
Bacillus subtilis BM 1051 wurde in eine konische Flasche
mit 1 l Fassungsvermögen, die 125 ml des in Tabelle 1
gezeigten Impfmediums enthielt, eingeimpft und wurde bei 37 ºC 12
Stunden lang in Schüttelkultur gehalten. Die Gesamtmenge der
Kulturbrühe wurde dann in ein Gefäß mit 5 l Fassungsvermögen,
das 2,5 l des in Tabelle 1 beschriebenen
Hauptfermentationsmediums enthielt, transferiert und 72 Stunden lang bei 37 ºC
kultiviert, währenddessen 100 ml einer 12,5 % Ammoniumsulfat
und 6,25 % Harnstoff enthaltenden Mischlösung 24 Stunden nach
Beginn der Hauptfermentation zugegeben wurden. Am Ende der
Kultivierung wurden die Mengen an Inosin und Guanosin, die
sich akkumuliert hatten, durch
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie bestimmt; es wurde bestätigt, daß sich 9,4 mg/ml
Inosin und 5,0 mg/ml Guanosin akkumuliert hatten. Die
Transformante Bacillus subtilis BM 1032 wurde unter den gleichen
Bedingungen wie oben kultiviert, was nur zu einer Akkumulation
von 6,3 mg/ml Inosin und 4,9 mg/ml Guanosin führte.
Tabelle 1
Zusammensetzung des Mediums
Konzentration (g/l)
Impfmedium
Hauptfermentationsmedium
Glucose
Natriumglutamat
Ammoniumsulfat
Harnstoff
Maisquellwasser
Magnesiumsulfat
Adenin
Dinatriummonohydrogenphosphat
Kaliumchlorid
Calciumchlorid
Mangansulfat
Calciumcarbonat
Beispiel 4
-
Gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 wurden kompetente
Zellen des Stamms Bacillus subtilis NA-6128 (IFO 14373, FERM BP-
617) hergestellt und das durch Spaltung von pPA350 mit Pvu II
erhaltene 8,4 kB DNA-Fragment wurde hinzugefügt; dann wurden
die Zellen 1 Stunde lang bei 37 ºC geschüttelt, um auf diese
Weise die Transformation durchzuführen. Die geschüttelte
Mischung wurde dann auf ein M-9 CAT Agarplattenmedium verteilt,
und aus der gebildeten Kolonie wurde eine Transformante, deren
Adeninbedarf repariert ist, nämlich NA-6128R, erhalten. Dann
wurden kompetente Zellen der genannten Transformanten
hergestellt, und das 10,5 kB DNA-Fragment, das durch Spaltung und
Linearisierung des in Beispiel 2 erhaltenen pPA350-1 mit Pvu
II erhalten wurde, wurde hinzugefügt, und diesem folgte 1
Stunde Schütteln bei 37 ºC, um auf diese Weise die
Transformation
durchzuführen; aus der Kolonie, die auf dem 10 ug/ml
Chloramphenicol enthaltenden LB-Medium wuchs, wurde eine
chloramphenicolresistente Transformante, nämlich Bacillus
subtilis NA-6201 (IFO 14582, FERM BP-1326) gewonnen. Basierend
auf der Fähigkeit, auf M-9 CAT-Medium und auf Adenin
enthaltendem M-9 CAT-Medium zu wachsen, wurde bestätigt, daß die
genannte Transformante einen Adeninbedarf aufweist.
Beispiel 5
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Der Stamm Bacillus subtilis NA-6201 wurde in eine
konische Flasche mit 1 l Fassungsvermögen, die 125 ml des in
Tabelle 1 gezeigten Impfmediums enthielt , eingeimpft und
wurde bei 37 ºC 12 Stunden lang in einer Schüttelkultur gehalten.
Die gesamte Menge der Kulturbrühe wurde in ein 2,5 l des
Hauptfermentationsmediums von Tabelle 1 enthaltendes Gefäß mit
5 l Fassungsvermögen transferiert, und wurde bei 37 ºC 96
Stunden lang kultiviert, währenddessen sowohl 24 als auch 48
Stunden nach Beginn der Hauptfermentation 100 ml einer 12,5 %
Ammoniumsulfat und 6,25 % Harnstoff enthaltenden Mischlösung
zugegeben werden. Am Ende der Kultivierung wurden die Mengen
an Inosin und Guanosin, die sich akkumuliert hatten, durch
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie bestimmt; es wurde
dabei bestätigt, daß sich 24,3 mg/ml Inosin und 18,2 mg/ml
Guanosin akkumuliert hatten. Der Stamm Bacillus subtilis NA-
6128 wurde unter den gleichen Bedingungen wie oben kultiviert,
und dies führte nur zur Akkumulation von 20,5 mg/ml Inosin und
16,1 mg/ml Guanosin.
-
Die Kulturbrühe des obengenannten NA-6201-Stamms wurde
auf die Anzahl der lebensfähigen Zellen und die Anzahl der
revertanten Zellen mit Adeninbedarf untersucht; es wurde
gefunden, daß die Anzahl der lebensfähigen Zellen 8 x 10&sup8; pro ml
beträgt, wovon keine eine Revertante mit Adeninbedarf ist.
-
Die Kulturbrühe des obengenannten NA-6128-Stamms wurde
auch auf die Gegenwart von Revertanten mit Adeninbedarf
untersucht; es wurde bestätigt, daß 3 x 10&sup5; Revertanten pro ml
Kulturbrühe vorhanden waren. Das heißt, der Vergleich der
Rückmutationrate beweist auch den Effekt dieser Erfindung.
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Fig. 1 zeigt die Restriktionsenzymkarte des rekombinanten
Plasmids, das die wie in Beispiel 1 erhaltene
Adenylsuccinatsynthetase-Genregion enthält.
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Fig. 2 zeigt das Verfahren zur Herstellung des in
Beispiel 2 erhaltenen Plasmids pPA350-1. In der Abbildung stellen
S, H, C, P bzw. II die Restriktionsenzyme Sac I, Hpa I, Cla I,
Pst I und Pvu II dar. Die schattierten Bereiche zeigen die
Adenylsuccinatsynthetase-Genregion; die geschwärzten Bereiche
zeigen die Chloramphenicolacetyltransferase-Genregion; die
weißen Bereiche zeigen pBR322. Die dünnen Linien an beiden
Enden des mit Eco RI und Hin dIII aus pCAT15 geschnittenen
Fragments zeigen die aus der Mehrfachklonierungsstelle von
pUCI9 stammende DNA.