DE3587524T2

DE3587524T2 - Herstellung von chimären antikörpern.

Info

Publication number: DE3587524T2
Application number: DE85904274T
Authority: DE
Inventors: Michael Neuberger; Terence Rabbitts
Original assignee: Celltech Ltd
Current assignee: Celltech R&D Ltd
Priority date: 1984-09-03
Filing date: 1985-09-03
Publication date: 1994-01-20
Anticipated expiration: 2005-09-04
Also published as: ATE92959T1; GB8422238D0; JP2714786B2; GB8608827D0; EP0194276B2; GB2177096A; EP0194276A1; WO1986001533A1; JP2865645B2; GB2177096B; DE3587524D1; EP0194276B1; DE3587524T3; JPS62500352A; JPH10155482A

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines chimärischen Antikörpers, bei welchem Verfahren Methoden der rekombinanten DNA-Technik eingesetzt werden.
In der vorliegenden Anmeldung wird der Ausdruck "chimärischer Antikörper" zur Beschreibung eines Proteins verwendet, das zumindest den Antigen-Bindungsanteil eines Immunglobulinmoleküls (Ig) mittels einer Peptidbindung an zumindest einen Teil eines anderen Nicht-Ig-Moleküls gebunden enthält.
Sharon J. et al., Nature, 309, 364-367, 24. Mai 1984, beschreiben die Herstellung eines Gens, das für die V-Region der schweren Kette der Maus und die C-Region einer Maus-kappaleichten Kette codiert. Das Gen wurde in eine Maus-Myelom- Zellinie, die eine leichte Kette der Maus ausschied, eingesetzt. Die transformierte Zelle produzierte dimere Moleküle. Es wird angegeben, daß die Strukturuntersuchungen an diesen dimeren Molekülen Einblicke in den Aufbau von Antikörpermolekülen gestatten könnten, die aus VH und VL, die an andere interessante Moleküle, wie Enzyme und Toxine, gebunden sind, bestehen.
Die WO-A-84/00382 (US Dept. of Commerce) beschreibt eine Anzahl von Antikörper-Konjugaten, die zur Verhinderung der durch Transplantate im Wirt hervorgerufenen Störungen (graft-versus host disease) verwendet werden können. Die Konjugate werden durch kovalentes Binden des Protein-Toxins Ricin an einen monoklonalen Antikörper produziert, wobei der chemische Linker m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimidester verwendet wird.
In den letzten Jahren lieferten die Fortschritte in der Molekularbiologie, die auf der rekombinanten DNA-Technik beruhen, Verfahren zur Herstellung eines großen Spektrums heterologer Peptide durch Transformation von Wirtszellen mit heterologen DNA-Sequenzen, die für die Produktion der gewünschten Produkte codieren.
Die EP-A-0 088 994 (Schering Corporation) schlägt die Konstruktion von rekombinanten DNA-Vektoren vor, die eine ds- DNA-Sequenz enthalten, die für eine variable Region einer leichten oder einer schweren Kette eines Ig, das für einen vorherbestimmten Liganden spezifisch ist, codiert Die ds-DNA- Sequenz wird mit Initiations- und Terminationscodonen an ihren 5'- bzw. 3'-Enden zur Verfügung gestellt, jedoch fehlen ihr jegliche Nucleotide, die für solche Aminosäuren codieren, die für die variable Region überflüssig sind. Die ds-DNA-Sequenz wird zur Transformierung von Bakterienzellen verwendet. Bei diesem Einsatz wird die Produktion chimärischer Antikörper nicht in Betracht gezogen.
Die EP-A-0 102 634 (Takeda Chemical Industries Limited) beschreibt die Klonierung und Expression in bakteriellen Wirtsorganismen von Genen, die für das ganze Polypeptid der schweren Kette des humanen IgE oder für einen Teil desselben codieren, befassen sich jedoch nicht mit der Produktion chimärischer Antikörper.
Die EP-A 0 120 694 (Celltech Ltd.), die nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde, beschreibt Verfahren zur Herstellung von Ig-Molekülen durch rekombinante DNA-Technologie. Sie beschreibt auch ein Verfahren zur Produktion von modifizierten Ig-Molekülen, in welchem die Antigen-Bindungsregion von einer ersten Spezies, Klasse oder Subklasse stammt und andere Teile des Ig-Moleküls von einer zweiten, unterschiedlichen Spezies, Klasse oder Subklasse des Ig abgeleitet sind.
Die EP-A-0 125 023 (Genentech Inc. et al.), die nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde, schlägt die Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren in Bakterienzellen zur Produktion von Ig's vor, die analog zu solchen sind, die normalerweise in Wirbeltiersystemen gefunden werden, wobei man sich der Verfahren der Genmodifizierung bedient, die dort zur Konstruktion modifizierter Formen von Ig vorgeschlagen werden.
Es wird angenommen, daß die in der obigen Anmeldung von Genentech gemachten Vorschläge weder zur Expression irgendwelcher signifikanter Mengen von Ig-Polypeptidketten, noch zur Produktion von Ig-Aktivität, noch zur Ausscheidung bzw. zum Zusammenbau der Ketten zu gewünschten chimärischen Ig's führen.
Die Produktion von monoklonalen Antikörpern wurde zuerst von Kohler und Milstein (Kohler, G. und Milstein, C., Nature, 256, 495-497) beschrieben. Derartige monoklonale Antikörper haben eine vielverbreitete Anwendung, nicht nur als diagnostische Reagentien (vgl. z. B. "Immunology for the 80s, Herausg. Voller, A., Bartlett, A. und Bidwell, D., MTP Press, Lancaster, 1981), sondern auch in der Therapie (vgl. z. B. Ritz, J. und Schlossmann, S.F., Blood, 59, 1-11, 1982) gefunden.
Die in letzter Zeit bekannt gewordenen Verfahren, die eine stabile Einsetzung von Ig-Gen-DNA in Myelomzellen erlauben (vgl. z. B. Oi, V.T., Morrison, S.L., Herzenberg, L.A. und Berg, P., PNAS USA, 80, 825-829, 1983; Neuberger, M.S., EMBO J., 2, 1373-1378, 1983; und Ochi, T., Hawley, R.G., Hawley, T., Schulman, M.J., Traunecker, A., Kohler, G. und Hozumi, N., PNAS USA, 80, 6351-6355, 1983), eröffneten die Möglichkeit der Verwendung der in vitro Mutagenese und der DNA-Transfektion zur Konstruktion von rekombinanten Igs, die neue Eigenschaften aufweisen.
Es ist jedoch bekannt, daß die Funktion eines Ig-Moleküls von dessen dreidimensionaler Struktur abhängt, die ihrerseits von ihrer ersten Aminosäuresequenz abhängt. Somit kann die Veränderung der Aminosäuresequenz eines Ig dessen Aktivität nachteilig beeinflussen. Außerdem kann eine Veränderung in der für das Ig codierenden DNA-Sequenz die Fähigkeit der die DNA-Sequenz enthaltenden Zelle zur Expression, Ausscheidung oder zum Zusammenbau des Ig beeinflussen.
Es war daher keineswegs klar, daß es möglich sein würde, funktionelle, veränderte Antikörper durch rekombinante DNA-Verfahren herzustellen.
Ähnliche Betrachtungen sind auch auf andere Proteine anzuwenden. Es konnte daher nicht erwartet werden, daß die Fusion eines Gens, das für zumindest einen Teil eines Ig's codiert, mit einem Gen, das für zumindest einen Teil eines Nicht-Ig-Proteins codiert, überhaupt zur Expression irgend eines Proteins führen wird, und schon gar nicht zur Expression eines Proteins, das ausgeschieden und zur Erzielung eines funktionellen chimärischen Antikörpers zusammengebaut werden kann.
Die vorliegenden Erfinder haben jedoch in überraschender Weise entdeckt, daß es möglich ist, durch rekombinante DNA-Verfahren ausgeschiedene, zusammengesetzte chimärische Antikörper zu produzieren, die zumindest einen Teil eines Ig-Moleküls und zumindest einen Teil eines Nicht-Ig-Proteins enthalten und in denen beide Teile zu funktioneller Aktivität befähigt sind.
Dieses überraschende Ergebnis wird durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erzielt, welches folgende Schritte umfaßt:
a) Herstellung eines Expressionsvektors, der einen geeigneten, mit einer DNA-Sequenz betrieblich verbundenen Promotor enthält, wobei die DNA-Sequenz einen ersten, für zumindest die variable Region der schweren oder leichten Kette eines Ig-Moleküls codierenden Teil und einen zweiten, für zumindest einen Teil eines zweiten Proteins codierenden Teil enthält;
b) Transformierung einer immortalisierten Säugetierzellinie mit dem so hergestellten Vektor, wobei die Säugetierzellinie eine isolierte leichte bzw. schwere Kette ausscheidet, die zu dem Teil des Ig-Moleküls, der von dem ersten Teil des in Stufe (a) hergestellten Vektors codiert wird, komplementär ist; und
c) Züchtung dieser transformierten Zellinie zur Herstellung eines chimärischen Antikörpers.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein anderes Verfahren zur Herstellung eines chimärischen Antikörpers zur Verfügung, der zumindest einen Teil eines Ig-Moleküls und zumindest einen Teil eines Nicht-Ig-Proteins enthält und in dem beide Teile zu funktioneller Aktivität befähigt sind, welches Verfahren folgende Schritte umfaßt:
a) Herstellung eines ersten Expressionsvektors, der einen geeigneten, mit einer DNA-Sequenz betrieblich verbundenen Promotor enthält, wobei die DNA-Sequenz einen ersten, für zumindest die variable Region der schweren oder leichten Kette eines Ig-Moleküls codierenden Teil und einen zweiten, für zumindest einen Teil eines Nicht-Ig-Proteins codierenden Teil enthält;
b) Herstellung eines zweiten Expressionsvektors, der einen geeigneten, mit einer DNA-Sequenz betrieblich verbundenen Promotor enthält, wobei die DNA-Sequenz für zumindest die variable Region einer komplementären leichten bzw. schweren Kette eines Ig-Moleküls codiert;
c) Transformierung einer immortalisierten Säugetierzellinie mit den ersten und zweiten, in Stufen a) und b) hergestellten Vektoren; und
d) Züchtung dieser transformierten Zellinie zur Herstellung eines chimärischen Antikörpers.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung noch ein weiteres alternatives Verfahren zur Herstellung eines chimärischen Antikörpers zur Verfügung, der zumindest einen Teil eines Ig-Moleküls und zumindest einen Teil eines Nicht-Ig- Proteins enthält und in dem beide Teile zu funktioneller Aktivität befähigt sind, welches Verfahren folgende Schritte umfaßt:
a) Herstellung eines Expressionsvektors, der enthält: eine erste DNA-Sequenz, die einen ersten, für zumindest die variable Region der schweren oder leichten Kette eines Ig-Moleküls codierenden Teil und einen zweiten, für zumindest einen Teil eines Nicht-Ig-Proteins codierenden Teil in betrieblicher Verbindung mit einem geeigneten Promotor umfaßt; und eine zweite DNA-Sequenz, die für zumindest die variable Region einer komplementären leichten bzw. schweren Kette eines Ig-Moleküls codiert und in betrieblicher Verbindung mit einem geeigneten Promotor steht;
b) Transformierung einer immortalisierten Säugetierzellinie mit dem in Stufe a) hergestellten Vektor; und
c) Züchtung dieser transformierten Zellinie zur Herstellung eines chimärischen Antikörpers.
Die immortalisierte Zellinie stammt bevorzugt aus lymphoidem Ursprung, wie eine Myelom-, Hybridom-, Triom- oder Quadrom-Zellinie. Die Zellinie kann auch eine normale Lymphoidzelle, wie eine 3-Zelle, umfassen, die durch Transformation mit einem Virus, wie etwa dem Epstein-Barr-Virus, immortalisiert wurde. In besonders bevorzugter Weise ist die immortalisierte Zellinie eine Myelomzellinie oder ein Derivat einer solchen.
Es ist bekannt, daß manche immortalisierte Lymphoid- Zellinien, wie Myelom-Zellinien, in ihrem normalen Zustand isolierte leichte oder schwere Ketten vin Ig ausscheiden. Derartige Zellinien können in dem ersten erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sofern die normalerweise ausgeschiedene Kette komplementär zu dem Teil des Ig-Moleküls ist, für den der erste Teil des in Stufe a) hergestellten Vektors codiert.
Wenn jedoch die immortalisierte Zellinie die Kette nicht ausscheidet oder keine komplementäre Kette ausscheidet, wird es notwendig, das zweite oder dritte Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden.
Die Verfahren, gemäß welchen derartige Vektoren produziert und zur Transformation der immortalisierten Zellinien verwendet werden können, sind in der Fachwelt allgemein bekannt und stellen keinen Teil der Erfindung dar. Sie werden jedoch in den folgenden Beispielen ausführlich erläutert.
In dem Fall, wo die immortalisierte Zellinie eine komplementäre leichte oder schwere Kette ausscheidet, kann die transformierte Zellinie durch Transformation einer geeigneten Bakterienzelle mit dem Vektor und anschließende Fusion der Bakterienzelle mit der immortalisierten Zellinie, z. B. durch Sphäroplast-Fusion, hergestellt werden.
Der erste Teil der DNA-Sequenz, der für zumindest die variable Region der schweren oder leichten Kette des Ig-Moleküls codiert, kann direkt an den Nicht-Ig-Proteinteil desselben angehängt werden. Andererseits kann die variable Region an den Nicht-Ig-Proteinteil über eine dazwischenliegende Sequenz gebunden werden, die ihrerseits für eine spezifische Spaltungssequenz codiert, wie z. B. eine Faktor Xa-Spaltungs- Sequenz, die in der EP-A-0 161 937 beschrieben ist. Es kann auf diese Anmeldung bezüglich einer weiteren Diskussion der Verwendung spezifischer Spaltungssequenzen Bezug genommen werden.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein chimärischer Antikörper zur Verfügung gestellt, der zumindest einen Teil eines Ig-Moleküls und zumindest einen Teil eines Nicht-Ig-Proteins enthält und in dem beide Teile zu funktioneller Aktivität befähigt sind, welcher Antikörper umfaßt:
a) eine erste Polypeptidkette, die enthält: (i) zumindest die variable Region der schweren oder leichten Kette eines Ig-Moleküls; und (ii) zumindest einen Teil eines Nicht- Ig-Proteins, wobei die Teile (i) und (ii) entweder durch eine direkte Peptidbindung oder durch eine dazwischenliegende Peptidsequenz aneinander gebunden sind; und
b) eine zweite Polypeptidkette, die zumindest die variable Region einer komplementären leichten bzw. schweren Kette eines Ig-Moleküls umfaßt, wobei die erste und die zweite Kette so aneinander gebunden sind, daß sie eine Antigen-Bindungsstelle bilden.
In der ersten Polypeptidkette kann das Nicht-Ig-Protein sein:
i) zumindest der aktive Teil eines Enzyms oder das gesamte Enzym;
ii) ein Protein mit einer bekannten Bindungsspezifität; oder
iii) ein Protein-Toxin, wie Ricin.
Der chimärische Antikörper im obigen Fall i) kann insbesondere in einem Enzym-gebundenen Immunoassay-(ELISA)-System anstelle der derzeit getrennt in Verwendung stehenden Antikörper und Enzyme zum Einsatz kommen.
Der chimärische Antikörper des obigen Falles ii) kann auch in Immunoassays verwendet werden. Beispielsweise kann das Protein eine Bindungsspezifität für ein leicht erkennbares Label, wie ein Schwermetall oder ein radioaktives Metall oder ein gefärbtes oder färbbares Molekül, besitzen.
Der chimärische Antikörper des obigen Falles iii) ist eindeutig in der Therapie von Nutzen, beispielsweise als cytotoxisches Zielprodukt in der Krebstherapie. In dieser Hinsicht kann auf einen Artikel von Thorpe et al. Bezug genommen werden (Thorpe, P.E., Edwards, D.C., Davies, A.J.S. und Ross, W.C.J., in "Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine", 167-201, Herausg. McMichael, A.J. und Fabre, J.W., Academic Press, 1982).
Die chimärischen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können eine spezifische Spaltungsstelle zwischen dem Teil der variablen Region (i) und dem Nicht-Ig-Proteinteil (ii) enthalten. Derartige chimärische Antikörper können zur Reinigung des Nicht-Ig-Proteins verwendet werden. Zum Beispiel kann die variable Region für ein Hapten spezifisch gemacht werden, das auf einem chromatographischen Medium immobilisiert werden kann. Der chimärische Antikörper kann dann durch Affinitätschromatographie immobilisiert und das kontaminierende Material kann weggewaschen werden. Das Nicht-Ig-Protein kann dann, vor oder nach Eluierung der variablen Region aus dem chromatographischen Medium, von derselben abgespalten werden. Die vorliegende Erfindung wird eingehender, ohne einschränkende Wirkung, unter Bezugnahme auf die angeschlossenen Zeichnungen beispielhaft erläutert, in welchen:
Fig. 1A die Struktur eines Plasmids pSV-Vu1 zeigt;
Fig. 1B die vorhergesagte Struktur des IgM Moleküls zeigt, das von der mit dem Plasmid pSV-Vu1 transformierten Zellinie J558L produziert wird;
Fig. 2 zeigt Polyacrylamidgele des gereinigten IgM Moleküls, das von der mit dem Plasmid pSV-Vu1 transformierten Zellinie J558L produziert wird;
Fig. 3A zeigt die Struktur des Plasmids pSV-uNPτδ;
Fig. 3B zeigt die vorhergesagte Struktur des chimärischen Antikörpers F(ab)'&sub2;, der von der mit dem Plasmid pSV- VNPτδ transformierten Zellinie J558L produziert wurde;
Fig. 4 zeigt Polyacralamidgele von gereinigten Produkten, die von der mit verschiedenen Plasmiden transformierten Zellinie J558L produziert wurden;
Fig. 5 zeigt Polyacralamidgele von gereinigten Produkten, die von der mit verschiedenen Plasmiden in Gegenwart oder Abwesenheit von Tunicamycin transformierten Zellinie J558L produziert wurden;
Fig. 6A zeigt die Struktur des Plasmids pSV- VNPτSNase;
Fig. 6B zeigt die vorhergesagte Struktur des chimärischen Antikörpers, der von der mit dem Plasmid pSV-VNPτSNase transformierten Zellinie J558L produziert wurde;
Fig. 7 zeigt Polyacrylamidgele, die zur Überwachung der SNase-aktivität verwendet werden;
Fig. 8 zeigt einen Assay vom Typ ELISA;
Fig. 9 zeigt die Struktur des Plasmids pSV-VNPτmyc;
Fig. 10 zeigt einen Assay für die c-myc-antigene Determinante in Fab-myc;
Fig. 11A zeigt die Struktur des Plasmids pSV- VNPτKlenow;
Fig. 113 zeigt die vorhergesagte Struktur des chimärischen Antikörpers Fab-τKlenow, der von der mit dem Plasmid pSV-VNPτKlenow transformierten Zellinie J558L produziert wird;
Fig. 12 zeigt Polyacrylamidgele des gereinigten chimärischen Antikörpers Fab-τKlenow; und
Fig. 13 zeigt einen Assay für Aktivität der Klenow- Fragmentes.
In den Zeichnungen, die die Plasmide darstellen, geben dünne horizontale Linien den pSV2 gpt-Vektor an, dicke Linien stellen Maus- oder Human-Ig-Gen-DNA dar, Exons werden durch Boxen dargestellt und schraffierte Bereiche zeigen Nicht-Ig-Protein-DNA.
Die Orte des gpt-Gens und des Verstärkerelementes (E) für die Locus-Transkription der schweren Ketten sind angegeben. Die Restriktionsendonuclease-Spaltungsstellen werden wie folgt abgekürzt:
R = Eco RI; Xh = Xho I; S = Sac I; und Sl/Xh = eine Sequenz, die durch Verbindung einer Sal I-Stelle mit einer Xho I-Stelle gebildet wird. Die Sequenz wird rund um die Xho I-Stelle des Plasmids pSV-VNPτSNase dargestellt, das eine Verbindung des Exons τ2b CH2 und des SNase-Gens bildet.
In den schematischen Darstellungen der vorhergesagten Strukturen der Ig-Moleküle und chimärischen Antikörper sind die Disulfid-Brücken zwischen den schweren (H) Ketten und den leichten (lambda) Ketten durch (-S-) angegeben. Es ist nur eine Untereinheit des zehnwertigen pSV-Vu1-codierten IgM erläutert.

Vorversuche

In den folgenden Beispielen wird eine etablierte Maus- Plasmacytom-Zellinie J558L verwendet, die leichte lambda&sub1;-Ketten ausscheidet, jedoch keinerlei schwere Ketten des Ig produziert. Diese Plasmacytom-Zellinie wird von Oi et al. (Oi, V.T., Morrison, S.L., Herzenberg, L.A. und Berg, P., PNAS USA, 80, 825-829, 1983) beschrieben.
In den Beispielen wurden die reduzierte Proben auf 12%-igen Polyacrylamidgelen analysiert, während die nicht reduzierten Proben auf 7%-igen Polyacrylamidgelen analysiert wurden.
Die Beispiele verwenden auch das von Neuberger, M.S., EMBO J., 2, 1373-1378, 1983, beschriebene Plasmid pSV-Vu1. Dieses Plasmid umfaßt ein komplettes Maus-Immunoglobulin-u- Gen, das in den Expressionsvektor pSV2 gpt geklont und in Fig. 1A dargestellt ist. Das von diesem Plasmid codierte Ig u Polypeptid hat eine variable Region der schweren Kette, VH, die charakteristisch ist für Maus-Antikörper, die die lambda&sub1;-leichte Kette tragen, und die für das Hapten 4-Hydroxy-3-nitrophenacetyl (NP) spezifisch sind: die NP-Bindungsaktivität sollte daher im Anschluß an die Kombination der pSV- Vu1-codierten schweren Kette mit den lambda&sub1;-leichten Maus- Ketten gebildet werden.
Um dies zu bestätigen, wurde pSV-Vu1-DNA durch Sphäroplast-Fusion in die Zellinie J558L eingeführt und diese in einem selektiven Medium gezüchtet, wobei im wesentlichen nach der Beschreibung in dem oben genannten Neuberger-Artikel mit der Ausnahme vorgegangen wurde, daß HAT aus dem selektiven Medium weggelassen und Mycophenolsäure in einer Menge von 5 ug/ml verwendet wurde, wie in dem oben genannten Artikel von Oi et al. angegeben ist. Die Zellen wurden durch Grenzverdünnung. geklont. Die Antikörperproben wurden aus den Überständen der geklonten J558L Transfektanten, die in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium, das 5% fetales Kalbsserum enthielt, gezüchtet worden waren, isoliert. Die Überstände (2 Liter) wurden über 2 ml-Säulen von 4-Hydroxy-5-jod-3-nitrophenacetylaminocapronsäure-Sepharose (NIPcap-Sepharose) laufen gelassen und der Antikörper wurde mit 1 mM NIPcapOH in Phosphat-gepufferter Salzlösung aus dem gewaschenen Sorbens eluiert.
Der biosynthetisch gekennzeichnete Antikörper wurde aus den Überständen der bei 37ºC 4 Stunden in L-[³&sup5;S]-Methionin-haltigem Medium inkubierten Zellen mit Hilfe von 40 ul NIPcap-Sepharose-Säulen isoliert und gereinigt. Erforderlichenfalls war Tunicamycin während der Kennzeichnung und während einer 2-stündigen Vorinkubation mit 8 ug/ml anwesend (parallele Inkubationen mit einer IgE-ausscheidenden Zellinie bestätigten die Wirksamkeit dieser Behandlung).
Stabil transfizierte Zellen wurden ausgewählt und durch Grenzverdünnung geklont. Es wurden zwanzig Klone durch Radioimmunoassay analysiert und jeder schied hohe Mengen an NP-spezifischem IgM-Antikörper aus. Wie in Fig. 2 erläutert, kann der homogene Anti-NP-IgM-Antikörper aus den Überständen von pSV-Vu1-transfizierten Klonen mit einer Ausbeute von etwa 3 mg/ml isoliert werden.
In Fig. 2 zeigt die Spur (a) gereinigten Antikörper (30 ug), der vor der Elektrophorese mit 2-Mercaptoethanol gekocht und mit Coomassie-Blau gefärbt worden war; die Spur (b) zeigt Marker, die dazu dienen, das Molekulargewicht der Ketten abschätzen zu können. Die vorhergesagte Struktur des Ig-Moleküls, das aus den pV-Vu1-transfizierten Klonen isoliert wurde, ist in Fig. 1B gezeigt.

F(ab)'&sub2;-ähnlicher modifizierter Antikörper.

Es wurde ein Derivat des pSV-Vu1 konstruiert, in welchem die Cu-Exons durch das CH1 und Hinge-Exons des Maus-τ2b- Gens ersetzt waren. Zur Schaffung der Translationstermination und der Polyadenylierungssequenzen wurde ein Exon, Cδs, das von dem Gen, das für ausgeschiedene Maus-δ-Ketten codiert, stammte, an das 3'-Ende des Gens gesetzt. Das konstruierte Plasmid pSV-VNPτδ ist in Fig. 3A dargestellt.
Um das Plasmid pSV-VNPτδ zu konstruieren, werden die VNP-Exons von pSV-Vu1, die auf einem gemeinsamen Eco RI-Fragment enthalten sind, in einen Vektor eingebracht, der aus dem Bam HI-Eco RI-Fragment von pSV2gpt (vgl. Mulligan, R.C. und Berg, P., PNAS USA, 78, 2072-2076, 1981) mit einem Xho I-Adapter in der Bam HI-Stelle besteht. Das Plasmid enthält ein Eco RI-Sac I-Maus-Cτ2b-Fragment, das von dem Phagen lambdaMYG9 stammt (vgl. Neuberger, M.S. und Calabi, F., Nature, 305, 240- 243, 1983). Das Maus-Cδs-Exon als das PSV-VNPτδ-Plasmid ist in einem Bam HI-Fragment des Phagen Ch 257 3 enthalten (vgl. Cheng, R.-L., Blattner, F.R., Fitzmaurice, L., Mushinski, J.F., und Tucker, P.W., Nature, 296, 410-415, 1982), gewonnen als ein Sac I-Sal I-Fragment nach der Klonierung in M13mp 11.
Von dem gekürzten Schwere-Ketten-Gen des Plasmids pSV-VNPτδ würde man erwarten, daß es die Synthese eines F(ab)'&sub2;-ähnlichen chimärischen Antikörpers lenkt, wie schematisch in Fig. 3B gezeigt, der aus zwei IgG2b-Fab-Molekülen besteht, die durch Disulfidbrücken über das τ2b-Hinge aneinander gebunden sind und ein 21 Aminosäure-Schwanzstück an dem Carboxy-Ende aufweisen, das durch das Cδs-Exon codiert wird.
Das Plasmid pSV-VNPτδ wurde in J558L-Zellen transfiziert und der Radioimmunoassay zeigte, daß stabil transfizierte Zellen große Mengen von lambda&sub1;-tragendem Anti-NP-Antikörper ausschied. Dieser NP-spezifische Antikörper wurde aus Kulturüberständen verschiedener transfizierter Klone mit einer Ausbeute von 5 bis 10 mg/l isoliert. Polyacrylamid-Gelelektrophorese des gereinigten Materials (Fig. 4) zeigt, daß die hauptsächliche Proteinspezies ein unreduziertes Molekulargewicht von etwa 110 000 Dalton hatte. Nach der Reduktion wurden eine Bande, die mit der lambda-leichten Kette gemeinsam wanderte, ebenso wie mehrere Polypeptide mit höherem Molkulargewicht beobachtet. Das am reichlichsten auftretende dieser größeren Polypeptide hat ein Molekulargewicht von 31 000 und könnte die schwere Kette des F(ab)'&sub2;-ähnlichen Antikörpers darstellen. Jedoch besteht eine deutliche Verunreinigung des pSV-VNPτδ F(ab)'&sub2;-Antikörpers mit anderem NP-bindenden Material, das ein unreduziertes Molekulargewicht von etwa 50 000 Dalton hat und aus lambda&sub1;-leichten Ketten und einer von verschiedenen schweren Ketten im Molekulargewichtsbereich von 36 000 bis 40 000 zusammengesetzt ist. Die Anwesenheit dieser geringeren Antikörperkomponente spiegelt keine Glykosylierungs-Reterogenität wieder, da die elektrophoretische Mobilität des pSV-VNPτδ-codierten Anti-NP-Antikörpers durch die Aufnahme von Tunicamycin in das Inkubationsmedium während der biosynthetischen Kennzeichnungsversuche nicht beeinflußt wird (Fig. 5) Es kann angenommen werden, daß die geringeren Banden sich von dem F(ab)'&sub2;-Antikörper in dem Carboxy-endständigen Teil der schweren Kette unterscheiden, was wahrscheinlich ein Resultat der anderen Bearbeitungsweise der pSV-VNPτδ- Immunglobulin-Gen-RNA-Transkripte ist. Nichtsdestoweniger ist es trotz der verunreinigenden Banden klar, das der F(ab)'&sub2;ähnliche Anti-NP-Antikörper synthetisiert und in guten Ausbeuten durch pSV-VNPτδ-transfizierte J558L-Zellen ausgeschieden werden kann.

Versuche gemäß der Erfindung

Beispiel 1 - chimärischer Fab-Nuclease Antikörper

Ein DNA-Restriktionsfragment, das das S. aureus- Nuclease- (SNase)-Gen enthält, wurde in die Xho 1-Stelle eingesetzt, die in dem CH2-Exon des Maus-τ2b-Gens lokalisiert ist. Es wurde Plasmid-pSV-VNPτSNase zusammengesetzt, indem die VNP-Exons, die auf dem gemeinsamen Eco RI-Fragment enthalten sind, in den Vektor eingesetzt werden, der das Bam HI-Eco RI- Fragment des pSV2gpt mit einem Xho I-Adapter in der Bam HI- Stelle aufweist, wie oben beschrieben wurde. Ein von dem Phagen lambda-MYG9 abgeleitetes Eco RI-Xho I-Maus-Cτ2b-Fragment wurde ebenfalls in den Vektor eingesetzt, so daß die pSV- VNPτSNase das τ2b CHI, das Hinge und das 5'-Ende des CH2-Exons enthält. Die SNase Codierungsregion stammt von einem M13mp8- Klon, der ein S. aureus Sau 3A Fragment in der Bam HI-Stelle enthält. Entfernung des SNase-Gens aus M13mp8 als ein Bam-Sal I-Fragment und neuerliche Klonierung in M13mp12W (vgl. Karn, J., Mathes, H.W.D., Gait, M.J., und Brenner, S., Gene, 32, 217-224, 1984) erlaubte dessen Isolation als ein Xho I-Sal I- Fragment für den endgültigen Zusammenbau der pSV-VNPτSNase, deren Struktur in Fig. 6A gezeigt ist.
Das Schwere-Kette-Gen der pSV-VNPτSNase ist ähnlich dem von pSV-VNPτδ, mit der Ausnahme, daß das Cδs-Exon entfernt und durch ein Exon ersetzt worden war, das die ersten vier Codone des τ2b CH2-Exons, in Phase an die Nuclease-Codierungsregion fusioniert, enthielt. Die von SV40 stammenden Sequenzen des von pSV2gpt abgeleiteten Vektors stellen die Polyadenylierungssignale zur Verfügung.
Die J558L-Zellen wurden mit pSV-VNPτSNase transfiziert und die in selektivem Medium überlebenden Zellen wurden durch Grenzverdünnung geklont. Der Radioimmunoassay der Überstände der geklonten Transfektanten ergab, daß etwa ein Drittel positiv für die Produktion von lambda-tragendem Anti-NP- Antikörper war. Die positiven Klone ergaben zwischen 1 mg/l und 10 mg/l NP-bindenden Antikörper, der die vorhergesagte, in Fig. 6B gezeigte Struktur hatte.
Die Analyse des biosynthetisch gekennzeichneten Antikörpers durch Gelelektrophorese zeigte, daß eine Bande mit der leichten lambda&sub1;-Kette mitwanderte, ebenso wie zwei fanden von der schweren Kette mit den Molekulargewichten 45 000 und 46 000 (Fig. 5). Der Unterschied zwischen diesen beiden schweren Ketten wurde nicht identifiziert, jedoch stimmen ihre Mobilitäten gut mit der vorhergesagten Mobilität der schweren Kette von VNPτSNase überein. Obwohl die Sequenz Asn-Asn-Thr in der SNase vorliegt, sind die beiden Banden der schweren Ketten von VNPτSNase immer noch in jenen Proben anwesend, die aus den Überständen von Zellen isoliert wurden, die biosynthetisch in Gegenwart von Tunicamycin gekennzeichnet wurden (Fig. 5). Das deutet darauf hin, daß der Unterschied zwischen den beiden schweren Ketten von VNPτSNase nicht auf die N-gebundene Glykosylierung zurückzuführen ist. Der VNPτSNase-Antikörper erscheint auf einem nicht reduzierten Gel etwas heterogener, wobei er Banden mit den erwarteten Mobilitäten sowohl von F(ab)'&sub2;-SNase als auch Fab-SNase ergab (Fig. 4). Die Anwesenheit von SNase auf dem Carboxy-Ende der schweren Kette könnte die Disulfidbrückenbindung der τ2b-Hinge-Regionen inhibieren.
Zur Untersuchung der Nuclease-Aktivität in dem VNPτSNase-Präparat wurden Proben, die auf Hapten-Sepharose- Säulen gereinigt worden waren, mit einem Substrat aus einzelstrangiger DNA inkubiert. Der Abbau der DNA wurde überwacht, indem die Agarosegel-Elektrophorese, wie folgt, beobachtet wurde. Die einzelstrangige M13DNA (2 ug) wurde bei 37ºC 30 min in einem Medium mit pH 8,5 (20 ul) inkubiert, das 25 mM Natriumborat, 250 mM NaCl, 10 mM CaCl&sub2; und variierende Gehalte an chimärischem VNPτSNase-Antikörper oder an gereinigter S. aureus-Nuclease enthielt. Die verwendeten Mengen Antikörper/Enzym sind in Nanogramm angegeben. Die DNA in den Proben wurde dann nach der Elektrophorese über ein 1,2%-iges Agarosegel durch Ethidiumbromid-Fluoreszenz analysiert. Ein Hind III-Abbau von Phagen-lambda-DNA liefert Größenmarker. Die Ca&spplus;&spplus;-Abhängigkeit der Nucleaseaktivität wurde bestätigt, indem Inkubationen in Gegenwart von 40 mm MgCl&sub2; und 25 mM EGTA durchgeführt wurden.
Wie in Fig. 7 dargestellt, zeigt VNPτSNase, nicht jedoch die VNPτδ-Antikörper, Nucleaseaktivität und diese Aktivität - wie jene der authentischen s. aureus-Nuclease - ist von den Ca&spplus;&spplus;-Ionen, nicht jedoch von den Mg&spplus;&spplus;-Ionen abhängig. Auf molarer Basis beurteilt, beträgt die katalytische Aktivität der VNPτSNase-Probe etwa 10% der der authentischen S. aureus- Nuclease.
Der chimärische VNPτSNase-Antikörper kann als ein genetisch konjugierter, Enzym-gebundener Antikörper in Assays von Typ ELISA verwendet werden, wie in Fig. 8 gezeigt ist. Die Antigen-beschichteten Kunststoffplatten wurden mit verschiedenen Mengen von VNPτSNase-Protein inkubiert und der gebundene Antikörper wurde dann auf Grund seiner Nucleaseaktivität festgestellt. Dies wurde mit Hilfe einer DNA und Ethidiumbromid enthaltenden Lösung erreicht, die zu den Platten zugesetzt wurde. Im Anschluß an den Abbau des DNA-Substrates durch den immobilisierten VNPτSNase-Antikörper, nahm die Fluoreszenz, die durch den DNA/Ethidiumbromid-Komplex hervorgerufen wird, deutlich ab.
Insbesondere wurden Polyvinyl-Mikrotiterplatten mit (NIP)&sub2;&sub0;-Rinderserumalbumin-(BSA) (40 ug/ml) beschichtet. Nach der Blockierung der unreagierten Stellen mit BSA wurden Verdünnungen von VNPτSNase oder chimärischem VNPτδ-Antikörper in den Vertiefungen inkubiert, wobei die Antikörpermengen in Fig. 8 in Nanogramm angegeben sind. Nach dem Abwaschen des ungebundenen Materials wurde eine Lösung (40 ul) mit einem Gehalt an 1 ug M13 einzelstrangiger DNA und 1 ug/ml Ethidiumbromid in einem pH 8,5-Puffer zugesetzt. Die Platte wurde nach einstündiger Inkubation bei 37ºC photographiert.
Wie in Fig. 8 gezeigt, wurden Mengen im Bereich von 10 ng VNPτSNase-Antikörper leicht festgestellt und es wurde keine Abnahme der Fluoreszenz bei dem VNPτδ-Antikörper-Vergleich erhalten. Wir haben gefunden, daß der Assay zumindest um das Zehnfache empfindlicher gemacht werden kann, wenn die Inkubationszeit mit dem DNA-Substrat verlängert wird.

Beispiel 2 - Chimärischer Fab-myc-Antikörper

Der Carboxy-endständige Teil des Maus-c-myc-Gens wurde an den Antikörper Fab fusioniert. Das Produkt des c-myc- Gens ist ein Protein, das viele Thiolgruppen enthält und sich normalerweise innerhalb der Zelle befindet. Es besteht kein Grund zu der Annahme, daß das dritte Exon des c-myc für sich allein einen funktionellen Proteinbereich codiert. Wenn daher das Fab-myc-Fusionsprotein von der Zelle ausgeschieden wird, würde das eine Proteinquelle zur Herstellung von Anti-myc-Antiseren darstellen.
Das Plasmid pSV-VNPτmyc wurde im wesentlichen so zusammengebaut, wie es für den Zusammenbau von pSV-VNPτδ beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß das pSV-VNPτδ-Sac I-Xho I-Fragment, das das Cδs-Exon enthält, durch ein Sac I-Bgl II- Fragment ersetzt wurde, das das 3'-Exon von Maus-c-myc enthielt. Die Restriktionsstelle in Fig. 9, die mit Bg/B bezeichnet ist, ist eine Stelle, die durch Verbindung der Bgl II-Stelle an dem 3'-Ende von c-myc mit der Bam HI-Stelle des pSV2gpt gebildet wird. Das c-myc-Fragment stammt von dem Phagen lambdaMYG2, der das translozierte c-myc-Gen des Maus- Plasmacytoms X63Ag8 enthält (vgl. Neuberger und Calabi, loc. cit.).
Das Plasmid ist in der Struktur ähnlich dem pSV- VNPτδ, mit der Ausnahme, daß das cδs-Exon durch das 3'-endständige Exon des Maus-c-myc-Gens ersetzt ist. Dieses c-myc- Exon codiert für 187 Aminosäuren (vgl. Bernhard, O. Cory, S. Gerondatis, S., Webb, E. und Adams, J. M., EMBO J., 2375-2383, 1983) und sollte für das Transkriptions-Polyadenylierungssignal sorgen.
Das Plasmid wurde in J558L transfiziert und Zellen aus Vertiefungen, die positiv für die Produktion von Anti-NP- Antikörper sind, wurden durch Grenzverdünnung geklont. Das Hapten-bindende Protein wurde aus den Kulturüberständen isoliert und in einem indirekten Radioimmunoassay auf die Anwesenheit von c-myc-antigenen Determinanten analysiert.
Proben sowohl des mutmaßlichen Fab-myc als auch des Anti-NP F(ab)'&sub2; (als Vergleich) wurden in den Vertiefungen einer Polyvinyl-Mikrotiterplatte inkubiert, die vorher mit einem monoklonalen Anti-c-myc-Antikörper beschichtet worden war; der gebundene Anti-NP-Antikörper wurde dann unter Verwendung eines radiojodierten monoklonalen Anti-Idiotyp-Antikörpers festgestellt, der den Fab-Anteil der Anti-NP-Antikörper erkennt.
Wie in Fig. 10 gezeigt, bindet das Fab-myc klar an den monoklonalen Anti-c-myc-Antikörper, während das Anti-NP- F(ab)'&sub2; und andere Vergleichssubstanzen dies nicht tun. Das Fab-myc wurde auch von zwei anderen monoklonalen Antikörpern erkannt, die spezifisch für das Carboxy-Ende von c-myc sind. SDS/Polyacrylamidgel-Elektrophorese des Fab-myc zeigt, daß dieses einigermaßen heterogen ist; eine mit lamdba&sub1;-leichten Ketten mitwandernde Bande und mehrere Banden mit höherem Molekulargewicht im Bereich von 38 000 bis 55 000 Dalton werden beobachtet, wobei keine einzige dominante Bande einer schweren Kette festzustellen ist. Die erwartete Größe des Fab-myc beträgt 50 000 Dalton. Es wurde beobachtet, daß nach längerer Lagerung in der Fab-myc-Probe Niederschläge auftreten, und die SDS/Polyacrylamidgel -Elektrophorese zeigt eine ausgedehntere Heterogenität der Banden der schweren Ketten. Wir nehmen daher an, daß die Heterogenität des Fab-myc-Proteins, auf die durch die SDS/Polyacrylamidgel-Analyse hingewiesen worden war, sehr wahrscheinlich auf einen proteolytischen Abbau zurückzuführen ist.

Beispiel 3- Chimärischer Fab-τ-Klenow-Antikörper

Es wurde ein Plasmid, pSV-VNPτKlenow, zusammengebaut, das für die schwere Kette eines rekombinanten Antikörpers codiert, in welchem das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I an den Fab-Teil eines Maus-IgG2b-Moleküls fusioniert ist.
Die Konstruktion des pSV-VNPτKlenow erfolgt analog zu jener, die vorher für die pSV-VPNτSNase angegeben wurde. Die Codierungsregion für das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I wurde als ein Bam HI-Fragment durch Kombination zweier Plasmide erhalten, nämlich pcJ14 (C.M. Joyce und N.G.D. Grindley, PNAS USA, 80, 1830-1834, 1983) und pCJ89 (C.M. Joyce und N.G.D. Grindley, J. Bacteriol., 158, 636-643, 1984), worin die Bam HI-Linker an jeder Seite der Klenow-Codierungsregion eingesetzt worden war. Dieses Bam HI-Fragment wurde durch den Einsatz von Linkern in ein Sal I-Fragment umgewandelt und in die einzige Xho I-Stelle des pSV-VNPτ2b eingesetzt (CH2, CH3).
Dieses Antikörper/Enzym-Fusionsgen enthält eine variable Region VNP, so daß die Assoziation der schweren Kette von pSV-VNPτKlenow mit der lambda-leichten Kette des Maus- Immunoglobulins aus der J558L-Zellinie eine Bindungsstelle für das Hapten 4-Hydroxy-3-nitrophenacetyl (NP) bildet. Das VNP- Gen ist verbunden mit Exons, die für das CH1, das Hinge und den Amino-endständigen Teil des CH2-Bereichs einer τ2b-schweren Kette des Maus-Immunglobulins codiert. Die DNA, die für den Rest des CH2 und alle CH3's codiert, wurde durch ein Fragment des E. coli DNA-Polymerase 1-Gens ersetzt, das die 5'-3'- Polymerase- und die 3'-5'-Exonuclease-Aktivitäten (das Klenow- Fragment) spezifiziert. Dieses Fab-Klenow-Fusionsgen wurde in den Plasmidvektor pSV2gpt geklont, der ein Polyadenylierungssignal für die Fab-Klenow-Transkriptionseinheit zur Verfügung stellt und auch für einen Marker, gpt, sorgt, der Resistenz gegen die Droge Mycophenolsäure verleiht und daher die Selektion von stabil transfizierten Säugetierzellen erlaubt.
Sphäroplast-Fusion wurde als Mittel zur Einführung von pSV-VNPτKlenow-DNA in J558L-Zellen verwendet. (Das zur Protoplastfusion und zur Selektion der transfizierten Klone verwendete Verfahren ist detailliert von M.S. Neuberger und G.T. Williams in Protein engineering: applications in science, medicine and industry (Herausg. M. Inouye und R. Sarma, Academic Press) beschrieben. Die stabilen Transfektanten wurden in einem Medium selektiert, das Mycophenolsäure enthielt, und die Anwesenheit von NP-spezifischem Antikörper in dem Kulturmedium solcher Transfektanten wurde durch einen Radioimmunoassay identifiziert. Die Transfektanten wurden durch Grenzverdünnung geklont und ein spezieller Klon, JW64/7, der einen hohen Antikörper-Titer ergab, wurde für die weiteren Untersuchungen ausgewählt.
Das von JW64/7 ausgeschiedene Protein wurde durch SDS/Polyacrylamidgel-Elektrophorese von biosynthetisch gekennzeichneten Proben, die auf einem Hapten-Sepharose-Sorbens gereinigt worden waren, untersucht (Fig. 12B). Wie aus der vorhergesagten Struktur des Fab-Klenow-Proteins erwartet (Fig. 11B), zeigte das Gel die Anwesenheit von zwei Polypeptidketten: eine der lambda&sub1;-leichten Kette entsprechende Bande und eine schwere Kette mit dem Molekulargewicht von etwa 96 000 (Fig. 12B). Innerhalb des Klenow-Teils der schweren Kette von Fab-Klenow wurden vier Sequenzen der Form Asn-X-Thr/Ser angetroffen; diese könnten Stellen für die N-gebundene Glycosylierung darstellen. Um herauszufinden, ob die schwere Kette von Fab-Klenow tatsächlich glycosyliert ist, wurden biosynthetische Kennzeichnungsuntersuchungen in Gegenwart des Glycosylierungs-Inhibitors Tunicamycin durchgeführt. Die Ergebnisse (Fig. 12B) zeigen, daß Tunicamycin tatsächlich zur Synthese einer schweren Kette von reduziertem Molekulargewicht führt.
Fab-Klenow-Protein wurde durch Affinitätschromatographie auf NP-Sepharose aus Kulturüberständen von JW64/7 isoliert, die in DMEM mit 10% fötalem Kalbsserum gezüchtet worden waren, wobei ein homogenes Präparat erhalten wurde (Fig. 12A). Die Ausbeute variiierte im Bereich von 1 bis 15 mg Protein pro Liter Kulturüberstand. Die 5'-3'-Polymerase-Aktivität des gereinigten Proteins wurde durch Verwendung des klassischen Assays gemessen (der Assay wurde nach der Beschreibung von P. Setlow, Methods Enzymol. 29, 3-12, 1974, durchgeführt), wobei das Enzym mit "aktivierter" DNA und den vier dNTPs inkubiert wird, von denen eines radiomarkiert ist; der Einbau der Radioaktivität in säurefällbares Material wird verfolgt. In diesem Versuch, bei dem aktivierte Kalbsthymus-DNA als Substrat verwendet wird, ergab das Fab-Klenow eine Aktivität von etwa 1.1·10³ Einheiten/mg im Vergleich zu einem Wert von 7·10³ Einheiten/mg, der unter denselben Assay-Bedingungen unter Verwendung einer handelsüblichen Probe von homogenem Klenow-Fragment erhalten wurde, das durch proteolytische Fragmentierung von aus E. coli isolierter DNA-Polymerase I hergestellt worden war. Es ist eine Abnahme der spezifischen Aktivität (ausgedrückt als Einheiten pro mg Protein) des Fab- Klenow im Vergleich zu dem normalen Enzym im Hinblick auf ihre verschiedenen Molekulargewichte zu erwarten. Jedoch kann dies auch nur zu einem Teil für den Unterschied in der Aktivität verantwortlich sein. Die Prüfung des nicht reduzierten Fab- Klenow in SDS/Polyacrylamidgelen (nicht dargestellt) deutet auf die Anwesenheit von zweiwertigem F(ab')&sub2;-Klenow ebenso wie von monovalentem Protein. Es ist möglich, daß das F(ab')&sub2;-Klenow nur halbseitige Reaktivität zeigen könnte; andererseits könnte es sein, daß die Glycosylierung die spezifische Aktivität des Fab-Klenow reduziert.
Ein hauptsächliches Verwendungsfeld des DNA-Polymerase I Klenow-Fragmentes liegt in dem Kettenabbruch bei der DNA-Sequenzierung. Wie in Fig. 13 gezeigt, kann Fab-Klenow tatsächlich mit Erfolg für diesen Zweck eingesetzt werden. Fig. 13 zeigt die Verwendung von Fab-Klenow bei der kettenabbrechenden DNA-Sequenzierung. DNA aus einem M13-Klon wurde sequenziert, indem Fab-Klenow nach der Beschreibung von Sanger et al. (F. Sanger, S. Nicklen und A.R. Coulson, PNAS USA, 74, 5463-5476, 1077) unter Einsatz von 1 Einheit Fab-Klenow pro Klon verwendet wurde.
Somit konnte gezeigt werden, daß die rekombinante Antikörper-Technologie mit Erfolg zum Markieren spezifischer Enzyme verwendet werden kann, so daß diese von der Zelle ausgeschieden und leicht bis zur Homogenität in einer einzigen Reinigungsstufe gereinigt werden können.

Schlußfolgerung

Die obigen Beispiele zeigen, daß es durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich ist, ausgeschiedene funktionelle chimärische Antikörper zu produzieren, was früher nicht möglich war. Das Verfahren gestattet die Produktion einer Reihe von chimärischen Antikörpern, die bisher noch unbekannt waren.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines chimärischen Antikörpers, der zumindest einen Teil eines Ig-Moleküls und zumindest einen Teil eines Nicht-Ig-Proteins enthält und in dem beide Teile zu funktioneller Aktivität befähigt sind, welches Verfahren folgende Schritte umfaßt

a) Herstellung eines Expressionsvektors, der einen geeigneten, mit einer DNA-Sequenz betrieblich verbundenen Promotor enthält, wobei die DNA-Sequenz einen ersten, für zumindest die variable Region der schweren oder leichten Kette eines Ig-Moleküls codierenden Teil und einen zweiten, für zumindest einen Teil eines Nicht-Ig-Proteins codierenden Teil enthält;

b) Transformierung einer immortalisierten Säugetierzellinie mit dem so hergestellten Vektor, wobei die Säugetierzellinie eine isolierte Ig-leichte bzw. schwere Kette ausscheidet, die zu dem Teil des Ig-Moleküls, der von dem ersten Teil des in Stufe (a) hergestellten Vektors codiert wird, komplementär ist; und

c) Züchtung dieser transformierten Zellinie zur Herstellung eines chimärischen Antikörpers.

2. Verfahren zur Herstellung eines chimärischen Antikörpers, der zumindest einen Teil eines Ig-Moleküls und zumindest einen Teil eines Nicht-Ig-Proteins enthält und in dem beide Teile zu funktioneller Aktivität befähigt sind, welches Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a) Herstellung eines ersten Expressionsvektors, der einen geeigneten, mit einer DNA-Sequenz betrieblich verbundenen Promotor enthält, wobei die DNA-Sequenz einen ersten, für zumindest die variable Region der schweren oder leichten Kette eines Ig-Moleküls codierenden Teil und einen zweiten, für zumindest einen Teil eines Nicht-Ig-Proteins codierenden Teil enthält;

b) Herstellung eines zweiten Expressionsvektors, der einen geeigneten, mit einer DNA-Sequenz betrieblich verbundenen Promotor enthält, wobei die DNA-Sequenz für zumindest die variable Region einer komplementären leichten bzw. schweren Kette eines Ig-Moleküls codiert;

c) Transformierung einer immortalisierten Säugetierzellinie mit den ersten und zweiten, in Stufen a) und b) hergestellten Vektoren; und

d) Züchtung dieser transformierten Zellinie zur Herstellung eines chimärischen Antikörpers.

3. Verfahren zur Herstellung eines chimärischen Antikörpers, der zumindest einen Teil eines Ig-Moleküls und zumindest einen Teil eines Nicht-Ig-Proteins enthält und in dem beide Teile zu funktioneller Aktivität befähigt sind, welches Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a) Herstellung eines Expressionsvektors, der enthält: eine erste DNA-Sequenz, die einen ersten, für zumindest die variable Region der schweren oder leichten Kette eines Ig-Moleküls codierenden Teil und einen zweiten, für zumindest einen Teil eines Nicht-Ig-Proteins codierenden Teil in betrieblicher Verbindung mit einen geeigneten Promotor umfaßt; und eine zweite DNA-Sequenz, die für zumindest die variable Region einer komplementären leichten bzw. schweren Kette eines Ig-Moleküls codiert und in betrieblicher Verbindung mit einem geeigneten Promotor steht;

b) Transformierung einer immortalisierten Säugetierzellinie mit dem in Stufe a) hergestellten Vektor; und

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem die immortalisierte Zellinie myeloiden Ursprungs ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem die immortalisierte Zellinie eine Myelomzellinie oder ein Derivat derselben ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem davon abhängigen Anspruch, bei welchem die Transformierung dadurch erfolgt, daß eine geeignete Bakterienzelle mit dem in Stufe a) hergestellten Vektor transformiert und dann die Bakterienzelle mit der immortalisierten Zellinie fusioniert wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei welchem der erste Teil der DNA-Sequenz, die für zumindest die variable Region der schweren oder leichten Kette des Ig-Moleküls codiert, direkt an den zweiten Teil, der zumindest für einen Teil eines Nicht-Ig-Proteins codiert, gebunden ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei welchem der erste Teil der DNA-Sequenz, der für zumindest die variable Region der schweren oder leichten Kette des Ig-Moleküls codiert, an den zweiten Teil, der für zumindest einen Teil eines Nicht-Ig-Proteins codiert, mit Hilfe einer dazwischenliegenden Sequenz, die für eine spezifische Spaltungssequenz codiert, gebunden ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei welchem die Spaltungssequenz spezifisch für Faktor Xa ist.

10. Chimärischer Antikörper, der zumindest einen Teil eines Ig-Moleküls und zumindest einen Teil eines Nicht-Ig-Proteins enthält und in dem beide Teile zu funktioneller Aktivität befähigt sind, welcher Antikörper umfaßt:

a) eine erste Polypeptidkette, die enthält: (i) zumindest die variable Region der schweren oder leichten Kette eines Ig-Moleküls; und (ii) zumindest einen Teil eines Nicht- Ig-Proteins, wobei die Teile (i) und (ii) entweder durch eine direkte Peptidbindung oder durch eine dazwischenliegende Peptidsequenz aneinander gebunden sind; und

b) eine zweite Polypeptidkette, die zumindest die variable Region einer komplementären leichten bzw. schweren Kette eines Ig-Moleküls umfaßt, wobei die erste und die zweite Kette so aneinander gebunden sind, daß sie eine antigene Bindungsstelle bilden.

11. Chimärischer Antikörper nach Anspruch 10, bei welchem das Nicht-Ig-Protein ein Enzym ist.

12. Chimärischer Antikörper nach Anspruch 10, bei welchem das Nicht-Ig-Protein ein Nicht-Ig-Protein mit bekannter Bindungsspezifität ist.

13. Chimärischer Antikörper nach Anspruch 10, bei welchem das Nicht-Ig-Protein ein Protein-Toxin ist.

14. Chimärischer Antikörper nach einem der Ansprüche 10 bis 13, bei welchem die erste Peptidkette eine spezifisch spaltbare Bindungssequenz zwischen dem Teil (i) der variablen Region und dem Teil (ii) des Nicht-Ig-Proteins umfaßt.

15. Verwendung des chimärischen Antikörpers nach Anspruch 11 in einem Assay des ELISA-Typs.

16. Verwendung eines chimärischen Antikörpers nach Anspruch 12 in einem Immunoassay.

17. Chimärischer Antikörper nach Anspruch 13 zur Verwendung in der Therapie.

18. Verwendung des chimärischen Antikörpers nach Anspruch 14 zur Reinigung des Nicht-Ig-Proteinteils durch Affinitätschromatographie.