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DE3005225A1 - Plasmid puc3 und verfahren zu seiner isolierung - Google Patents

Plasmid puc3 und verfahren zu seiner isolierung

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Publication number
DE3005225A1
DE3005225A1 DE19803005225 DE3005225A DE3005225A1 DE 3005225 A1 DE3005225 A1 DE 3005225A1 DE 19803005225 DE19803005225 DE 19803005225 DE 3005225 A DE3005225 A DE 3005225A DE 3005225 A1 DE3005225 A1 DE 3005225A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
plasmid
puc3
streptomyces
dna
volume
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19803005225
Other languages
English (en)
Inventor
Vedpal Singh Malik
Fritz Reusser
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pharmacia and Upjohn Co
Original Assignee
Upjohn Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Upjohn Co filed Critical Upjohn Co
Publication of DE3005225A1 publication Critical patent/DE3005225A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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Description

Henkel, Kern, Feiler & Hänzel Patentanwälte
'2,' Registered Representatives
'V hafnra iha
before the
European Patent Office
MöhlstraBe 37 D-8000 München 80
Tel.: 089/982085-87 Telex: 0529802 hnkl d Telegramme: ellipsoid
TUC 3502 - Dr.F/rm
THE UPJOHN COMPANY
Kalamazoo, Mich., V.St.A.
Plasmid pUC3 und Verfahren zu seiner Isolierung
030047/0691
Beschreibung
Die Entwicklung von Plasmidvektoren für rekombinante DNS-Gentechnologie bei Mikroorganismen ist bekannt. Eine ausführliche Zusammenfassung über die DNS-Forschung findet sich in "Science", Band 196, April 1977.
Ähnliche DNS-Arbeiten sind derzeit bei industriell wichtigen Mikroorganismen der Gattung Streptomyces im Gange (vgl. M.J. Bibb, J.M. Ward und D.A. Hopwood in "Nature", Band 274, Seiten 398 bis 400 (1978) "Transformation of plasmid DNA into Streptomyces at high frequency"). Obwohl in verschiedenen Streptomyceten Plasmid-DNS'en nachgewiesen wurden (vgl. M.L.B. Huber und 0. Godfrey in "Can. J. Microbiol.", Band 24, Seiten 631 und 632 (1978) "A general method for lysis of Streptomyces species"; H. Schrempf, H. Bujard, D.A. Hopwood und W. Goebel in "J. Bacteriol.", Band 121, Seiten 416 bis 421 (1975)"Isolation of covalently closed circular deoxy-ribonucleic acid from Streptomyces coelicolor A3(2)"; H. Umezawa in "Biomedicine", Band 26, Seiten 236 bis 249 (1977) "Microbial secondary metabolities with potential use in cancer treatment (Plasmid involement in biosynthesis and compounds)" und V.S. Malik in "J. Antibiotics", Band 30, Seiten 897 bis 899 (1977) "Preparative Method for the isolation of super-coiled DNA from a chloramphenicol producing Streptomycete"), wurden lediglich drei Streptomyceten-Plasmide physikalisch isoliert und ausführlich in der Literatur beschrieben (vgl. Schrempf aaO). Das Vorliegen anderer Plasmide in der Gattung Streptomyces wurde aus den in den folgenden Veröffentlichungen veröffentlichten genetischen Daten geschlossen:
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(1) H. Akagawa, M. Okanishi und H. Umezawa in "J. Gen. Microbiol.", Band 90, Seiten 336 bis 346 (1975) "A plasmid involved in chloramphenicol production in Streptomyces venezuelae: Evidence from genetic mapping";
(2) R0F. Freeman und D.A. Hopwood in "J. Gen. Microbiol.", Band 106, Seiten 377 bis 381 (1978) "Unstable naturally occurring resistance to antibiotics in Streptomyces";
(3) E.J. Friend, M. Warren und D.A. Hopwood in "J. Gen. Microbiol.", Band 106, Seiten 201 bis 206 (1978) "Genetic evidence for a plasmid controlling fertility in an industrial strain of Streptomyces rimosus";
(4) D.A. Hopwood und H.M. Wright in "J. Gen. Microbiol.", Band 79, Seiten 331 bis 341 (1973) "A plasmid of Streptomyces coelicolor carrying a chromosomal locus and its inter-specific transfer";
(5) K. Hotta, Y. Okami und H. Umezawa in "J. Antibiotics", Band 30, Seiten 1146 bis 1149 (1977) »Elimination of the ability of a kanamycin-producing strain to biosynthesize deoxystreptamine moiety by acriflavine";
(6) R. Kirby, L.F. Wright und D.A. Hopwood in "Nature", Band 254, Seiten 265 bis 267 (1975) "Plasmiddetermined antibiotic synthesis and resistance in Streptomyces coelicolor";
(7) R. Kirby und D.A. Hopwood in "J. Gen. Microbiol.",
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-s-
Band 98, Seiten 239 bis 252 (1977) "Genetic determination of methylenomycin synthesis by the SCPI plasmid of Streptomyces coelicolor A3(2)";
(8) M. Okanishi, T. Ohta und H0 Umezawa in "J. Antibiotics", Band 33, Seiten 45 bis 47 (1969) "Possible control of formation of aerial mycelium and antibiotic production in Streptomyces by episomic factors";
(9) M. Okanishi in "Amino Acid-Nucleic Acid", Band 35, Seiten 15 bis 30 (1977) "Involvement of plasmids in the production of secondary metabolites";
(10) H. Schrempf und ¥. Goebel in "J. Bacteriol.", Band 131, Seiten 251 bis 258 (1977) "Characterization of a plasmid from Streptomyces coelicolor A,";
(11) P.D. Shaw und J„ Piwowarski in "J. Antibiotics", Band 30, Seiten 404 bis 408 (1977) "Effect of ethidium bromide and acriflavine on streptomycin production by Streptomyces bikiniensis" und
(12) M. Yagisawa, T.S. Huang Rossana und J.E. Davies in "J. Antibiotics", Band 31, Seiten 809 bis 813 (1978) "Possible involvement of plasmids in biosynthesis of neomycin".
In "J. Antibiotics", Band XKX, Nr9 1O9 Seiten 897 bis 899, wird ein Verfahren zum Isolieren von Plasmid-DNS beschrieben. Aus dieser Veröffentlichung vermag der Fachmann keine Erkenntnisse bezüglich der vorliegenden Erfindung zu schöpfen. Dies deshalb, weil der Ausgangs-Mikro-
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Organismus für die Plasmid-DNS nicht in so weitgehendem Maße identifiziert ist, daß damit das Verfahren gemäß der Erfindung durchführbar wäre. Darüber hinaus ist der betreffende Ausgangs-Mikroorganismus auch nirgends hinterlegt und somit nicht Verfügbar.
Das Plasmid pUC3 erhält man aus dem Mikroorganismus Streptomyces sp. 3022a (DSM ). Im einzelnen erhält man das Plasmid aus dem genannten Mikroorganismus durch Züchten der Kultur auf einem geeigneten Medium, Ernten der Kultur nach einer geeigneten Zeit, Lysieren des geernteten Mycels und Gewinnen von praktisch reinem pUC3 aus dem erhaltenen Lysat. Die Empfindlichkeitseigenschaften des Plasmids pUC3 gegenüber verschiedenen Restriktionsendonukleasen befähigen es zu einer leichten Modifizierung und zur Anpassung an zahlreiche Wirtvektorsysteme.
Das Plasmid pUC3 ist durch Standardcharakterisierungstests einschließlich seines Molekulargewichts von etwa 20 χ 10 Dalton und ein Restriktionsbild entsprechend der Zeichnung gekennzeichnet.
Das Plasmid pUC3 eignet sich als Klonungsvektor bei der DNS-Gentechnologie, wobei die gewünschten Gene in das Plasmid eingeschleust oder -gebaut werden und anschließend eine Transformation des Plasmids in einen geeigneten Wirt erfolgt.
In der Zeichnung ist das Restriktionsendonuklease-Spaltungsbild für das Plasmid pUC3 dargestellt. Das Bild beruht auf der Grundlage, daß das Plasmid pUC3 ein Molekulargewicht von 20 χ 10 Dalton oder eine Molekularlänge von 30 Kiobasenpaaren aufweist. Die Bildpositionen der
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-G-
verschiedenen Restriktionsstellen sind in Prozenten angegeben, wobei die Gesamtplasmidlänge mit 100% angesetzt ist. Einer der EcoRI-Stellen ist die Position 0 (%) auf dem Kreisbild zugeordnet.
Für die verschiedenen Restriktionsendonukleasen werden folgende Abkürzungen gewählt:
(1) EcoRI ist ein Enzym aus Escherichia coli;
(2) Hind III ist ein Enzym aus Hemophilus influenzae;
(3) Xho I ist ein Enzym aus Xanthomonas holcicola;
(4) Pst I ist ein Enzym aus Providencia stuartii und
(5) BgI II ist ein Enzym aus Bacillus globigii.
Das Plasmid pUC3 erhält man, wie bereits erwähnt, aus dem Mikroorganismus Streptomyces sp. 3022a (DSM ). Die biologisch reine Kultur dieses Mikroorganismus ist bei der Dauersammlung von "Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA" unter der Hinterlegungsnummer NRRL 11441 hinterlegt und von dieser DauerSammlung erhältlich. Die Kultur ist in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben, beispielsweise (1) CG. Smith in "J. Bacteriol.", Band 75, Seiten 577 bis 583 (1958), (2) L.C. Vining und D.W.S. Westlake in "Can. J. Microbiol.», Band 10, Seiten 705 bis 716 (1964) "Biosynthesis of the phenylpropanoid moiety of chloramphenicol" und (3) V.S. Malik und L.C. Vining in "Can. J. Microbiol.", Band 16, Seiten 173 bis 179 (1970) »Metabolism of Chloramphenicol by the producing organism".
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-ι
Eigenschaften des Plasmids pUC3:
Molekulargewicht: etwa 20 χ 10 Dalton Empfindlichkeitseigenschaften gegenüber Restriktionsendonukleasen:
Das Plasmid pUC3 besitzt folgende Empfindlichkeitseigenschaften gegenüber Restriktionsendonukleasen (vgl. das in der Zeichnung dargestellte Restriktionsendonuklease-Spaltungsbild für das Plasmid pUC3):
Plasmidempfindlichkeitseigenschaften gegenüber Restriktionsendonukleasen:
Spaltstellen
Enzym Plasmid pUC3
Jpaltstellen Enzym Plasmid pUC3
Bg II zahlreiche*
Bamin 4
EcoRI 3
Pst I VJl
Mbo II zahlreiche
Xba I 0
Sal I zahlreiche
Hae II >7
Sma I
zahlreiche
Bg III 4
Hpa I 0
Hind III 1
Κρη Ι >5
Pvu II 9
Ava I zahlreiche
Xho I 2
Hph I zahlreiche
Hinf I zahlreiche
Hinc II zahlreiche
* steht für mehr als 10 Stellen
Die Ergebnisse wurden, durch Verdauung von DNS in Gegenwart eines Überschusses an Restriktionsendonuklease erhalten. Die Anzahl der Restriktionsstellen ergibt sich
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aus der Anzahl der in 0,7- bzw. 1,Obigen Agarosegelen auflösbaren Fragmente.
pUC3 kann zur Schaffung rekombinanter Plasmide, die durch Transformation in Wirtbakterien eingefügt werden können, herangezogen werden. Es ist bekannt, wie rekombinante Plasmide geschaffen werden können. Bei einem solchen Verfahren erfolgt eine Spaltung des isolierten Vektorplasmids» beispielsweise pUC3, an einer spezifischen Stelle mit Hilfe einer Restrxktionsendonuklease, beispielsweise Hind III. Das Plasmid, bei dem es sich um ein ringförmiges DNS-Molekül handelt, wird dabei durch das Enzym, das die beiden DNS-Stränge an einer speziellen Stelle zerschneidet, in ein lineares DNS-Molekül überführt. Eine andere NichtVektor-DNS wird mit demselben Enzym in ähnlicher Weise gespalten. Beim Vermischen des linearen Vektors oder von Teilen desselben mit Nicht-Vektor-DNS'en, können sich ihre einsträngigen oder stumpfen Enden miteinander paaren und in Gegenwart eines als Polynukleotidligase bekannten zweiten Enzyms unter Bildung eines einzigen DNS-Rings kovalent vereinigen.
Die geschilderten Maßnahmen können auch zum Einbau einer bestimmten DNS-Länge aus einem höheren Tier in pUC3 herangezogen werden. So kann beispielsweise die DNS, die bei Fröschen für eine Ribosomen-RNS-Codierung verantwortlich ist, mit der gespaltenen pUC3-DNS gemischt werden« Die erhaltenen ringförmigen DNS-Moleküle bestehen aus PlasmidpUC3 mit einer eingefügten Länge Frosch-rDNS.
Die unter Verwendung von pUC3 erhaltenen, ein gewünschtes genetisches Element enthaltenden rekombinierten Plasmide
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können zu Abdruckzwecken in einen Wirtsorganismus eingeschleust werden. Beispiele für wertvolle Gene, die in der geschilderten Weise in Wirtsorganismen eingeschleust werden können, sind Gene mit Somatostatin-, Rattenproinsulin- und Proteasencodierung.
Der Nutzen des Plasmids pUC3 beruht auf seiner Fähigkeit zur Wirkung als Plasmidvektor bei industriell bedeutenden Mikroorganismen, z.B. Streptomyces. So erhält man durch Klonung einer genetischen Information aus Streptomyces in pUC3 eine Möglichkeit zur Steigerung industriell wertvoller Produkte aus diesen Organismen, z.B. von Antibiotika.
Dieser Versuch ist dem Konzept einer Klonung von Genen für eine Antibiotikumproduktion in das gut charakterisierte Escherichia-coli-K-12-Wirt/Vektor-System vergleichbar. Das E.-coli-System hat den Nachteil, daß Gene aus einigen gram-positiven Organismen, z.B. Bacillus, in dem gram-negativen E,-coli-Wirt nicht gut abklatschbar sind (do not express well). In gleicher Weise verbleiben Plasmide aus gram-negativen Organismen nicht in gram-positiven Wirten, so daß in grampositiven Wirten gram-negative genetische Information entweder schlecht oder überhaupt nicht abgeklatscht (expressed) wird. Dies veranschaulicht klar und deutlich den Vorteil eines gram-positiven Wirt/Vektor-Systems und den Nutzen von Plasmid pUC3 in einem solchen System.
In der Regel erfordert die Verwendung eines Wirt/Vektor-Systems zur Herstellung eines für den Wirt fremden Produkts die Einschleusung von Genen für den gesamten biosynthetischen Weg des Produkts in den neuen Wirt. Wie bereits ausgeführt, kann dies zu Problemen beim genetischen Abklatsch
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(genetic expression) führen. Ferner können auch neue und/ oder verstärkte Probleme bei der Züchtung der Mikroorganismen und bei der Extraktion und Reinigung des Produkts auftreten. Ein vielleicht brauchbarerer Versuch besteht darin, einen Plasmidvektor, z.B. pUC3, in einen normalerweise das Produkt liefernden Wirt einzuschleusen und auf das Plasmid die Gene für die Biosynthese des Produkts zu klonen. Zumindest sollten sich dadurch die Probleme bei der Züchtung und Produktextraktion und -reinigung auf ein Mindestmaß senken lassen. Darüber hinaus dürfte es bei diesem KIonungssystem nicht erforderlich sein, sämtliche Gene des Biosyntheseweges zu klonen und zu verstärken, vielmehr dürfte es lediglich erforderlich sein, Steuergene (regulatory genes) oder Gene mit Codierung für die Geschwindigkeit der Produktbiosynthese begrenzenden Enzymen zu klonen. Da das Plasmid pUC3 ein Streptomycetenplasmid darstellt, ist es in dieser Hinsicht für die Gattung Streptomyces ideal geeignet. Da ferner das Plasmid pUC3 ein Plasmid aus einem gram-positiven Organismus darstellt, kann es in einer Reihe anderer Mikroorganismen, z.B. Bacillus, Arthrobacter und dergleichen, als Vektor dienen.
Streptomyces sp. 3022a (NRRL 11441) (DSM ) läßt sich in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen züchten. Der Organismus kann in einem Nährmedium mit als Kohlenstofflieferanten beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat und als Stickstofflieferanten beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweißartigen oder -haltigen Material wachsen gelassen werden. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glucose, brauner Zucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und dergleichen.
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Bevorzugte Stickstofflieferanten sind beispielsweise Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Casein, Fischmehl, Feststoffe aus den Destillationsanlagen, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle und dergleichen. Zweckmäßigerweise werden Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gebracht. Spurenmetalle, z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, brauchen nicht zugesetzt zu werden, da als Bestandteile des Mediums vor dessen Sterilisation Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile zum Einsatz gelangen.
Das beimpfte Medium kann bei jeder beliebigen Temperatur, bei der ein akzeptables Mikroorganismenwachstum gewährleistet ist, beispielsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 18° und 30°, vorzugsweise zwischen etwa 20° und 28°C, wachsen gelassen werden. Üblicherweise erreicht man ein optimales Mikroorganismenwachstum in etwa 2 bis 5 Tagen. Zu diesem Zeitpunkt wird der pH-Wert des Mediums alkalisch und der Organismus produziert Chloramphenicol.
Wenn das Wachstum in großen Gefäßen und Tanks durchgeführt wird, bedient man sich vorzugsweise der vegetativen Form, und nicht der Sporenform, des Mikroorganismus zum Beimpfen, um eine deutliche Verzögerung des Mikroorganismenwachstums und eine dadurch bedingte ineffiziente Ausnutzung der Anlage zu vermeiden. Folglich ist es zweckmäßig, in einer Nährbrühe ein vegetatives Inokulat zu erzeugen, indem man diese Nährbrühe mit einem aliquoten Teil von einem Boden, flüssigen N2-Agarpfropfen oder einer geneig-
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- 4Ü- -
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ten Kultur beimpft. Wenn ein junges, aktives, vegetatives Inokulat gebildet ist, wird dieses aseptisch in große Gefäße oder Tanks übertragen. Das Medium, in dem das vegetative Inokulat erzeugt wird, kann dasselbe oder ein anderes (als das, in dem das Mikroorganismenwachstum erfolgt) sein, solange nur ein gutes Mikroorganismenwachstum gewährleistet ist.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen. Sämtliche Prozentangaben sind "Gew.-%". Mengenangaben für Lösungsmittelgemische sind "Volumenangaben» .
Beispiel 1
Isolierung des Plasmids pUC3 aus einer biologisch reinen Kultur von Streptomyces sp. 3022a (DSM ):
Streptomyces-sp.-3022a-(DSM )-Sporen werden in 100 ml des folgenden Mediums:
Bactotrypton 0s05%
Brauereimelasse (Brer rabbit molasses) 1,0?6
Glycerin 1,0%
Hefeextrakt (Difco) 0,25%
inokuliert. Nun wird der pH-Wert mit In-IIaOH auf 7,2 ein= gestellt und mit Leitungswasser auf 1000 ml aufgefüllte
Das Medium war vorher in einem 500 ml fassenden Erlenmeyer·= Kolben sterilisiert worden. Nach dem Beimpfen wird der Kolben etwa 36 bis 48 h bei einer Temperatur von 25°C auf einem mit 250 Upm umlaufenden Drehrüttler inkubiert„
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Mit der erhaltenen Zellensuspension werden 40 Kolben mit einem Glycerin/Serin/Lactat-Medium in einer Menge von 1% beimpft. Das Glycerin/Serin/Lactat-Medium besitzt folgende Zusammensetzung:
Glycerin 2%
60%iges Natriumlactat 2,8%
Dl-Serin 0,3%
Natriumchlorid 0,6%
Hefeextrakt (Difco) 0,025%
KII2PO4 0,14%
K2HPO4 0,2%
MgSO4.7H2O 0,05%
MnSO4. H2O 0,0008%
CuSO4.5H2O 0,0006%
ZnSO4 0,0012%
Der pH-Wert ist mit In-NaOH auf 7,0 eingestellt.
Nach 3-tägiger Inkubation bei einer Temperatur von 28°C werden die Zellen von der Brühe durch Zentrifugieren mit niedriger Geschwindigkeit (beispielsweise 10000 χ g während min bei einer Temperatur von 40C) abgetrennt, worauf die überstehende Flüssigkeit von dem Mycelpellet dekantiert wird. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen, während das Pellet in 200 ml eines 25% Saccharose enthaltenden Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffers eines pH-Werts von 8,0 resuspendiert wird. Danach werden 40 ml einer 2 mg/ml-Lösung von Lysozym in TES_Puffer (0,03m-Tris-(hydroxymethyl )-aminomethan, 0,05 m-Äthylendiamintetraessigsäure und 0,05m-NaCl eines pH-Werts von 8,0) zugesetzt, worauf das Gemisch unter gelegentlichem Durchmischen 30
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-AS-
min lang bei einer Temperatur von 250C inkubiert wird. Nach Zugabe von 100 ml O,25m-Äthylendiamintetraessigsäure (pll- ¥ert: 8,0) wird das Gemisch nochmals 30 min bei 250C inkubiert. Danach wird die Zellensuspension durch Zusatz eines Wasch- oder Reinigungsmittels, z.B. 320 ml 1,0% Brij-58, 0,4% Desoxychisäure, 0,05% Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer eines pH-Werts von 8,0 und 0,06m-Äthylendiamintetraessigsäure, lysiert und 30 min lang bei einer Temperatur von 250C inkubiert. Das Lysat wird noch 30 bis 60 min bei einer Temperatur von 500C inkubiert. Danach wird das viskose Lysat 60 min bei 10000 Upm in einem Rotor mit Sorvall-Zentrifuge zentrifugiert. Hierauf wird die viskose überstehende Flüssigkeit mit einem Salz, beispielsweise Cäsiumchlorid (bevorzugt) oder Cäsiumsulfat, und dem einschließenden (intercalating) Farbstoff Äthidiumbromid zur Bereitstellung einer Lösung einer Dichte von -1,550 gemischt. Die erhaltene Lösung wird bei 145000 χ g (isopyknisches Dichtegradientenzentrifugieren) bis zum Gleichgewicht zentrifugiert. Die kovalent geschlossene ringförmige Plasmid-DNS wird dann im Zentrifugenrohr bei Bestrahlung mit UV-Licht (320 mn) als schwacher fluoreszierender Streifen unter dem intensiv fluoreszierenden Streifen linearer Chromosomen- und Plasmid-DNS·en sichtbar.
Kovalent geschlossene ringförmige Plasmid-DNS wird zu ihrer Kennzeichnung dargestellt, indem sie aus den isopyknischen Gradienten entfernt, das Äthidiumbromid durch zweimalige Behandlung mit einem Drittel Volumen Isopropanol extrahiert und die wäßrige Phase gegen 10 ml Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 10 ml Äthylendiamintetraessigsäure (pH-Wert: 8,0) dialysiert wird. Hierbei erhält man praktisch reines Plasmid pUC3.
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Maßnahmen zur Kennzeichnung und Isolierung des Plasmids pUC3:
Die Größe des Plasmids pUC3 wird durch Elektronenmikroskopie ermittelt.
Restriktionsendonuklease-Verdauung und Agarosegelelektrophorese:
Sämtliche verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich.
Die Verdauung der Plasmid-DNS erfolgt in einem Restriktionspuffer mit lOmM-Tris-ChydroxymethylJ-aminomethanhydrochlorid (pH-Wert: 7,4); 5 mM-MgCl2; 1 mM-DTT für Ava I, Hph I, Mbo II, Pvu II, Hae II, Kpn I, Hinc II, Hpa I und BgI II. Derselbe Puffer mit 50 mM-NaCl wird bei Bam H-I, Hinf I, Sal I, Xba I, BgI I, EcoRI, Xho I, Hind III und Pst I verwendet. Sma-I-Verdauungspräparate enthalten 15 mM-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid (pH-Wert: 9,0); 15 mM-KCl; 6 mM-MgCl2 (vgl. L.E. Post, A.E. Arfsten, F. Reusser und M. Nomura in "Cell", Band 15, Seiten 215 bis 229 (1978) "DNA sequences of promoter regions for the str and spc ribosomal protein operons in E. coli").
Die Verdauungspräparate werden in nach Shinnick und Mitarbeitern (vgl. T.M. Shinnick, E. Lund, 0. Smithies und F.R. Blattner in "Nucl. Acids Res.", Band 2, Seiten 1911 bis 1229 (1975) "Hybridization of labeled RNA to DNA in agarose gels") zubereiteten 1%igen Agarosegelen analysiert.
Hind III-verdaute λ-DNS dient als Molekulargewichtsreferenz (vgl. K, Murray und N.E. Murray in "J. Mol. Biol.",
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- -ι 6 -
■4t-
Band 98, Seiten 551 Ms 564 (1975) "Ehage Lambda Receptor Chromosomes for DNA Fragments made with Restriction Endonuclease III of Haemophilus influenzae and Restriction Endonuclease I of Escherichia coli").
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Claims (3)

Patentansprüche
1. Im wesentlichen reines Plasmid pUC3, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa 20 χ 10 Dalton und ein Restriktionsendonuklease-SpaltungsMld entsprechend der Zeichnung.
2. Verfahren zum Isolieren von im wesentlichen reinem pUC3 aus Streptomyces sp. 3022a (DSM ), dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) Streptomyces sp. 3022a (DSM ) auf einem geeigneten Medium züchtet;
(b) die Kultur nach einer geeigneten Zeit erntet;
(c) das geerntete Mycel lysiert und
(d) aus dem Lysat im wesentlichen reines pUC3 isoliert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. 3022a (DSM ) etwa 36 bis 48 h lang bei einer Temperatur von etwa 280C auf einem Nährmedium züchtet.
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DE19803005225 1979-03-19 1980-02-12 Plasmid puc3 und verfahren zu seiner isolierung Withdrawn DE3005225A1 (de)

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