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DE29924299U1 - Charakterisierung der Genfunktion unter Verwendung doppelsträngiger RNA-Inhibition - Google Patents

Charakterisierung der Genfunktion unter Verwendung doppelsträngiger RNA-Inhibition

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DE29924299U1
DE29924299U1 DE29924299U DE29924299U DE29924299U1 DE 29924299 U1 DE29924299 U1 DE 29924299U1 DE 29924299 U DE29924299 U DE 29924299U DE 29924299 U DE29924299 U DE 29924299U DE 29924299 U1 DE29924299 U1 DE 29924299U1
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Germany
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promoter
elegans
cdna
promoters
dna
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DE29924299U
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Devgen NV
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Devgen NV
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Description

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92 607 m6/kue
In einen Mikroorganismus transferierte Bibliothek von C. elegans DNA BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit einer Bibiliothek von C. elegans cDNA, C. elegans cDNA-Fragmenten und/oder von PCR-Produkten, abgeleitet von C. elegans, die in einen Mikroorganismus transferiert wurde. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Futter für C. elegans, enthaltend die obige Bibliothek.
Es wurde kürzlich in Nature, Band 391, S. 806-811, Februar 98, beschrieben, daß die Einführung doppelsträngiger RNA in eine Zelle zu einer potenten und spezifischen Interferenz mit der Expression endogener Gene in der Zelle führt und wobei die Interferenz im wesentlich effektiver ist als die individuelle Bereitstellung eines der beiden RNA-Stränge, wie vorgeschlagen in der Antisinn-Technologie. Diese spezifische Reduktion der Aktivität des Gens trat auch bei dem Nematodenwurm Caenorhabditis elegans (C. elegans) auf, wenn die RNA in das Genom oder die Körperhöhlung des Wurms eingeführt wurde.
Die gegenwärtigen Erfinder haben dieses Verfahren verwendet und haben es weiter angewandt, um neue und erfinderische Verfahren zu entwickeln, um Genen oder DNA-Fragmenten Funktionen zuzuordnen, die in verschiedenen Projekten sequenziert wurden, wie z.B. dem humanen Genomprojekt und denen noch eine bestimmte Funktion zugeordnet werden mußte
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und zur Verwendung bei der Identifikation von DNA, die für die Vermittlung eines bestimmten Phänotyps verantwortlich ist.
Daher wird gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von DNA bereitgestellt, die für die Vermittlung eines Phänotyps in einer Zelle verantwortlich ist, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: a) Konstruktion einer cDNA oder genomischen Bibliothek der DNA der Zelle in einer Orientierung relativ zu einem Promotor (Promotoren), die in der Lage sind, die Transkription der cDNA oder DNA zu doppelsträngiger (ds-) RNA bei Bindung eines geeigneten Transkriptionsfaktors an den Promotor (die Promotoren) zu unterstützen, b) Einführung der Bibliothek in eine oder mehrere der Zellen, umfassend den Transkriptionsfaktor und c) Identifikation und Isolation eines gewünschten Phänotyps der Zelle, umfassend die Bibliothek und Identifikation der DNA oder des cDNA-Fragments aus der Bibliothek, das für die Vermittlung des Phänotyps verantwortlich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Bibliothek in hierarchische Pools organisiert werden, wie im Detail in den bereitgestellten Beispielen beschrieben, und zwar vor Schritt b) um z.B. Genfamilien zu beinhalten.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird auch ein Verfahren zur Zuordnung einer Funktion zu einer bekannten DNA-Sequenz bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: a) Identifikation eines Homologs (von Homologen) der DNA in einer Zelle, b) Isolation des relevanten DNA-Homologs (der Homologe) oder eines Fragments davon aus der Zelle, c) Klonierung des Homologs oder des Fragments in einen geeigneten Vektor in einer Orientierung relativ zur einem Promotor (Promotoren), die in der Lage sind, die Transkription von dsRNA bei Bindung eines geeigneten
Transkriptionsfaktors an die Promotoren zu unterstützen, d) Einführung des Vektors in die Zelle aus Schritt a), umfassend den Transkriptionsfaktor und e) Identifikation des Phänotyps der Zelle, im. Vergleich mit dem Wildtyp.
Bei jedem Aspekt der Erfindung kann die Nukleotid- oder DNA-Sequenz entweder in Sinn- oder Antisinn-Orientierung relativ zu einem einzelnen Promotor bereitgestellt werden, der die oben definierten Eigenschaften aufweist oder alternativ kann sie zwischen zwei identischen Promotoren bereitgestellt werden. In beiden Ausführungsformen wird die dsRNA von der Transkription bereitgestellt, die von dem Promotor initiiert wird, folgend auf die Bindung des geeigneten Transkriptionsfaktors.
Die Zelle gemäß der Erfindung kann von einem Organismus abgeleitet sein oder in einem solchen enthalten sein. Wenn die Zelle in einem Organismus enthalten ist, kann der Organismus angepaßt sein, um den geeigneten Transkriptionsfaktor zu exprimieren. Der Organismus kann jede Pflanze, jedes Tier, Pilz oder Hefe sein, ist jedoch vorzugsweise der Nematodenwurm C. elegans, der ein Wildtyp, ein nuc-1 oder pha-ts-Mutant von C. elegans oder eine Kombination dieser Mutationen sein kann. In einer alternativen Ausführungsform kann die DNA oder cDNA-Bibliothek oder das DNA-Homolog oder Fragment davon vorteilhaft in einen Mikroorganismus transfiziert oder transformiert werden, wie z.B. eine bakterielle oder Hefezelle, die dem Organismus verfüttert werden kann, der vorzugsweise der Nematodenwurm C. elegans ist. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung kann der Mikroorganismus angepaßt sein um den geeigneten Transkriptionsfaktor zu exprimieren. Vorzugsweise ist der Mikroorganismus E. coli.
Bei jedem Aspekt der Erfindung kann die DNA-Bibliothek, das DNA-Homolog oder das DNA-Fragment in einem geeigneten DNA-
Vektor konstruiert werden, der eine Sequenz von Nukleotiden umfaßt, die den Transkriptionsfaktor codieren. Alternativ wird der Transkriptionsfaktor durch einen weiteren Vektor codiert. In einer weiteren Alternative kann die Zelle oder der Organismus den Transkriptionsfaktor exprimieren oder angepaßt sein um ihn zu exprimieren. Vorzugsweise umfaßt jeder der Vektoren, die in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, einen selektierbaren Marker, der z.B. eine Nukleotidsequenz sein kann, die sup-35 oder ein Fragment davon codiert. Die Nukleotidsequenz kann relativ zu einem Promotor orientiert sein, so daß die Bindung eines Transkriptionsfaktor an den Promotor die Transkription- der DNA zu doppelsträngiger RNA initiiert. Figur 10 illustriert Vektoren und die Orientierung der DNA-Sequenz, die die doppelsträngige RNA-Produktion in C. elegans ermöglichen. So ist die DNA in einer Ausführungsform zwischen zwei Promotoren auf einem Vektor lokalisiert, der in der Lage ist, dsRNA bei Bindung eines geeigneten Transkriptionsfaktors an die Promotoren zu exprimieren. Alternativ umfaßt der Vektor zwei Kopien der DNA-Sequenz, organisiert in einer Sinn- und Antisinn-Orientierung relativ zum Promotor und wobei der Marker selektierbar ist, wenn er in einem pha-1-Mutanten C. elegans enthalten ist. Vorzugsweise sind die Promotoren T7, T3 oder SP6 Promotoren und der Transkriptionsfaktor umfaßt die geeignete Polymerase.
Vorzugsweise umfaßt der selektierbare Marker eine Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, die Expression eines Gens in der Zelle zu inhibieren oder zu verhindern, wobei das Gen für die Bereitstellung eines bekannten Phänotyps verantwortlich ist. Diese Nukleotidsequenz kann Teil des oder identisch zu dem Gen sein, das den Phänotyp bereitstellt und die Nukleotidsequenz ist selbst relativ zu einem geeigneten Promotor (Promotoren) orientiert, die in der Lage sind, die Transkription von doppelsträngiger RNA bei Bindung eines geeigneten Transkriptionsfaktors an den Promotor (die
Promotoren) zu initiieren. Alternativ kann die Nukleotidsequenz ein Teil von oder identisch zu der Gensequenz sein, die den Phänotyp vermittelt und diese Nukleotidsequenz ist derartig ausgebildet, daß sie die Integration des geeigneten oder weiteren Vektors durch homologe Rekombination in das Genom der Zelle ermöglicht und folgend auf die Integration ist die Nukleotidsequenz in der Lage, die Expression der Gensequenz zu inhibieren, die den Phänotyp vermittelt. Bei dieser Ausführungsform umfaßt die Nukleotidsequenz Stopp-Codons, die ausreichen, um eine Translation der Nukleotidsequenz, folgend auf ihre Integration in das Genom, zu verhindern. - -
Vorteilhaft können Verbindungen in dem Verfahren der Zelle oder einem Organismus zum Zwecke eines Screenings auf einen gewünschten Phänotyp zugefügt werden, wie z.B. eine Resistenz oder Empfindlichkeit gegenüber der Verbindung im Vergleich mit dem Wildtyp. Die Promotoren sind vorzugsweise induzierbar. Der Transkriptionsfaktor kann in einigen Fällen Phagen-abgeleitet sein, wie z.B. eine T7-Polymerase, getrieben von einem Phagen-Promotor. Wenn jedoch C. elegans verwendet wird, kann ein Wurm-spezifischer oder gewebespezifischer Promotor verwendet werden, wie z.B. Iet858, SERCA, UL6, myo-2 oder myo-3. Vorzugsweise ist der E. coli-Stamm ein RNAaselll und noch bevorzugter ein Rnasenegativer Stamm.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-menschlichen Organismus bereit, umfassend einen exogenen Transkriptionsfaktor und ein Transgen, umfassend einen Promotor, der mit dem DNA-Fragment operativ verbunden ist, das bei Bindung des Transkriptionsfaktors daran exprimiert wird, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: a) Bereitstellung eines ersten transgenen Organismus, umfassend ein erstes Konstrukt, das die DNA inkorporiert, die für einen exogenen
Transkriptionsfaktor codiert und einen zweiten transgenen Organismus, umfassend ein zweites Konstrukt, beinhaltend mindestens einen Promotor, der operativ mit einer gewünschten DNA-Sequenz verbunden ist, die bei Bindung des Transkriptionsfaktors des ersten transgenen Organismus daran exprimiert wird, b) Kreuzen der ersten und zweiten transgenen Organismen und Selektion der Nachkommenschaft, die die gewünschte DNA-Sequenz exprimieren. In einer Ausführungsform werden die ersten und zweiten transgenen Organismen durch Transformation der ersten und zweiten Konstrukte in jeweilige Mikroorganismen erzeugt, die darauf folgend dem jeweiligen : Organismus verfüttert werden. Vorzugsweise umfaßt das zweite Konstrukt die gewünschte DNA-Sequenz in einer Orientierung relativ zu dem Promotor, um in der Lage zu sein, die Transkription der DNA zu dsRNA bei Bindung des Transkriptionsfaktors daran zu initiieren. Bei dieser Ausführungsform umfaßt das zweite Konstrukt zwei Promotoren, die die gewünschte DNA-Sequenz flankieren, wobei die Promotoren die Transkription der DNA-Sequenz zu dsRNA bei Bindung des Transkriptionsfaktor an die Promotoren initiieren können. Alternativ wird die DNA-Sequenz in einer Sinn- und einer Antisinn-Orientierung relativ zu dem Promotor bereitgestellt, um die dsRNA bei Bindung des Transkriptionsfaktors an die Promotoren zu erzeugen. Bei jeder dieser Ausführungsformen können die ersten und/oder zweiten Konstrukte vorzugsweise mit einem Reportergen bereitgestellt werden, das operativ mit einem Promotor verbunden ist, der in der Lage ist, die Transkription des Reporters bei Bindung des Transkriptionsfaktors daran zu initiieren. Vorzugsweise codiert das Reportergen Luciferase, grün fluoreszierendes Protein, ß-Galactosidase oder ß-Lactamase.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch ein Verfahren einer Validierung von Klonen, die in Yeast two hybrid-Vektorexperimenten identifiziert wurden, wobei diese
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Experimente dem Fachmann wohlbekannt sind, und wobei diese Experimente zunächst von Chien et al. (1991) vorgeschlagen wurden, um Protein-Protein-Wechselwirkungen nachzuweisen. Das Verfahren gemäß der Erfindung umfaßt die Bereitstellung eines Konstrukts, beinhaltend die DNA, codierend für ein Protein, identifiziert in einem Zwei-Hybrid-Vektorexperiment, wobei das Konstrukt derartig ausgebildet ist, daß die DNA in einer Orientierung relativ zu einem oder mehreren Promotoren bereitgestellt wird, die in der Lage sind, die Transkription der DNA zu doppelsträngiger RNA zu unterstützen und zwar bei Bindung eines geeigneten Transkriptionsfaktors an die " Promotoren, Transformation einer Zelle, wie z.B. einer - . bakteriellen Zelle oder alternativ Transformation eine Organismus, umfassend den Transkriptionsfaktor mit den Konstrukten und Identifikation einer phänotypischen Veränderung in der Zelle oder dem Organismus, wobei es sich um C. elegans oder ähnliches handeln kann, im Vergleich mit dem Wildtyp. Vorzugsweise ist der Transkriptionsfaktor in der Zelle oder dem Organismus induzierbar. Wiederum kann die DNA-Sequenz zwischen zwei Promotoren oder sowohl in Sinn- als auch in Antisinn-Orientierung relativ zu einem einzelnen Promotor, wie oben beschrieben, lokalisiert sein. Vorzugsweise ist der Promotor ein Phagen-Polymerasepromotor und der Transkriptionsfaktor ist eine RNA-Polymerase und vorzugsweise T7-Polymerase. Ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung umfaßt sind Vektoren, die für die Transformation der Zellen oder Organismen verwendet werden und die Zellen oder Organismen selbst.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erleichterung von Schädlingsbefall von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: a) Identifikation einer DNA-Sequenz aus dem Schädling, die entweder für'das Überleben, das Wachstum, die Proliferation oder die Reproduktion kritisch ist, b) Klonierung der Sequenz aus Schritt a) oder eines Fragments
davon in einen geeigneten Vektor relativ zu einem oder mehreren Promotoren, die in der Lage sind, die Sequenz in RNA oder dsRNA bei Bindung eines geeigneten Transkriptionsfaktors an die Promotoren zu transkribieren und c) Einführung des Vektors in die Pflanze.
So stellt das Verfahren gemäß der Erfindung in vorteilhafter Weise einen besonders selektiven Mechanismus für die Erleichterung eines Schädlingsbefalls bereit und in einigen Fällen von parasitischem Befall von Pflanzen, so daß, wenn sich der Schädling von der Pflanze ernährt, er die exprimierte dsRNA in der Pflanze aufnehmen wird und so di-e Expression der DNA in dem Schädling inhibieren wird, die für sein Wachstum, Überleben, Proliferation oder Reproduktion kritisch ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann der Schädlingsorganismus Tylenchulus ssp., Radopholus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp·, Rotylenchulus ssp., Pratylenchus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirschmenniella ssp., Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Heliotylenchus ssp·, Criconemella ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichodorus ssp., Paratrichodorus ssp., Aphelenchus ssp. sein. Die DNA-Sequenz oder das Fragment davon gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann zwischen zwei gewebespezifische Promotoren kloniert werden, wie z.B. zwei wurzelspezifische Promotoren.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft den Vektor, der in jedem der Verfahren der Erfindung zur Konstruktion der Bibliothek verwendet wird, wobei der Vektor zwei identische Promotoren umfaßt, die derartig orientiert sind, daß sie in der Lage sind, die Transkription der DNA-Sequenz zu initiieren, die zwischen den Promotoren lokalisiert ist, in dsRNA bei Bindung eines geeigneten Transkriptionsfaktors an die Promotoren. Die DNA-Sequenz kann z.B. eine multiple Klonierungsstelle beinhalten. Vorzugsweise umfaßt der
Expressionsvektor eine Nukleotidsequenz, die für einen selektierbaren Marker codiert. Gemäß einer Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz, die den selektierbaren Marker codiert, zwischen zwei identischen Promotoren lokalisiert, die derartig orientiert sind, daß sie in der Lage sind, die Transkription von DNA, die zwischen den Promotoren lokalisiert ist, zu doppelsträngiger RNA bei Bindung eines geeigneten Transkriptionsfaktors an die Promotoren zu initiieren. Vorzugsweise umfaßt der selektierbare Marker eine Nukleotidsequenz, die für sup-35 codiert, für die Einführung in C. elegans mit einer pha-1-Mutation. "
Vorzugsweise umfaßt der Transkriptionsfaktor entweder eine Phagen-Polymerase, die an seinen korrespondierenden Promotor bindet oder einen C. elegans-spezifischen Promotor und noch bevorzugter eine T7-Polymerase. Vorzugsweise beinhaltet der Vektor eine multiple Klonierungsstelle zwischen den identischen Promotoren.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Expressionsvektor für die Expression eines geeigneten Transkriptionsfaktors zur Verwendung in einem Verfahren gemäß der Erfindung bereitgestellt, wobei der Vektor eine Sequenz von Nukleotiden umfaßt, die den Transkriptionsfaktor codieren, operativ verbunden mit geeigneten Expressionskontrollsequenzen. Vorzugsweise beinhalten die Expressionskontrollsequenzen Promotoren, die induzierbar, konstitutiv, allgemein oder gewebsspezifische Promotoren sind oder Kombinationen davon. Vorzugsweise umfaßt der Transkriptionsfaktor eine Phagen-Polymerase und vorzugsweise T7, T3 oder SP6 RNA-Polymerase.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Selektionssystem für die Identifikation einer Transformation einer Zelle oder eines Organismus mit einem Vektor gemäß der Erfindung bereit, wobei das System einen Vektor gemäß der Erfindung umfaßt,
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worin der selektierbare Marker eine Nukleotidsequenz umfaßt, die in der Lage ist, die Expression eines Gens in der Zelle oder einem Organismus zu inhibieren oder zu verhindern, wobei dieses Gen für die Bereitstellung eines bekannten Phänotyps verantwortlich ist. Vorzugsweise korrespondiert die Nukleotidsequenz zu einem Teil des Gens oder ist damit identisch, das den bekannten Phänotyp vermittelt und die Nukleotidsequenz ist selbst zwischen zwei identischen Promotoren lokalisiert, die in der Lage sind, die Transkription von doppelsträngiger RNA bei Bindung eines geeigneten Transkriptionsfaktors daran zu initiieren. Alternativ umfaßt die Nukleotidsequenz eine Nukleotidsequenz, die ein Teil der Gensequenz ist oder zu dieser identisch ist, die einen bekannten Phänotyp der Zelle oder des Organismus vermittelt und die derartig ausgebildet ist, daß, folgend auf die Integration des Vektors durch homologe Rekombination in das Chromosom der Zelle oder den Organismus die Sequenz die Expression der Gensequenz inhibiert, die den bekannten Phänotyp vermittelt. Vorzugsweise umfaßt gemäß dieser Ausführungsform die Nukleotidsequenz Stopp-Codons, die genügen um die Translation der Nukleotidsequenz folgend auf die Integration in das Chromosom zu verhindern. Vorzugsweise umfaßt die bekannte Gensequenz ein sup-35-Gen oder Fragment davon, das durch Identifikation eines Wachstums der Nachkommenschaft bei einer Temperatur oberhalb von 250C, folgend auf eine Einfügung in einen pha-1 etl23ts-Mutanten C. elegans-Wurm selektierbar ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die bekannte Gensequenz bereit, die ein sup-35-Gen oder ein Fragment davon umfaßt, das durch Identifikation des Wachstums der Nachkommenschaft bei einer Temperatur oberhalb von 25°C folgend auf Einführung des Vektors in einen pha-1 etl23ts-Mutanten C. elegans-Wurm selektierbar ist. Ein weiterer Aspekt umfaßt ein Verfahren der Zuordnung einer Funktion zu einer DNA-Sequenz eines vielzelligen Organismus, wobei das
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Verfahren folgendes umfaßt: a) Bereitstellung von i) einem Konstrukt, umfassen das DNA-Fragment, kloniert zwischen zwei Promotoren, die in der Lage sind, die Transkription in dem vielzelligen Organismus zu unterstützen, in einem vielzelligen Organismus, der in der Lage ist, die Transkription von dem Promotor zu initiieren; b) Identifikation des Phänotyps des vielzelligen Organismus im Vergleich zum Wildtyp.
Die vorliegende Erfindung kann durch die folgenden Beispiele deutlicher verstanden werden, die nur exemplarisch sein sollen und zwar im Hinblick auf die begleitenden Figuren,, wobei:
Figur 1 eine Nukleotidsequenz des Plasmids PGNl in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist.
Figur 2 eine Nukleotidsequenz des Plasmids PGNlOO in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist.
Figur 3 eine schematische Darstellung der verwendeten Vektoren und der in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Transformationsvorschrift ist.
Figur 4 eine Darstellung eines Expressionsvektors ist, der in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet wird.
Figur 5 eine schematische Darstellung der T7-RNA-Polymerase-Expressionsvektoren ist, die für die Transformation von C. elegans verwendet werden.
Figur 6 eine Illustration des Plasmids PGNl ist.
Figur 7 ein Diagramm eines verstärkten Vektors für die dsRNA-Inhibition ist, codierend eine sup-35 dsRNA.
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Figur 8 eine Darstellung eines Vektors für die Integration in das Genom von C. elegans ist.
Figur 9 eine Darstellung der Position einer DNA-Sequenz (Sequenzen) relativ zu einem geeigneten Promotor zur Initiation der Expression von dsRNA aus der DNA-Sequenz (den Sequenzen) ist.
Figur 10 eine Darstellung des Plasmids pGN108 ist.
Figur 11 eine Darstellung des Plasmids pGN105 ist. &Ggr;
Figur 12 eine Darstellung des Plasmids pGN400 ist.
Figur 13 eine Darstellung des Plasmids pGN401 ist.
Figur 14 eine Darstellung des Plasmids pGNllO ist.
Figur 15 eine Darstellung des Plasmids pAS2 mit vorwärts gerichteten und reversen T7/T3/SP6-Promotoren ist.
Figur 16 eine Darstellung des Plasmids pGAD424 mit vorwärts gerichteten und reversen T7/T3/SP6-Promotoren ist.
Figur 17 eine Darstellung des Plasmids pAS2-cyh2-HA+ ist, jeweils T7-final.
Figur 18 eine Darstellung des Plasmids pGAD424 ohne FULL-ICE-BOTH-T7 ist.
Figur 19 (a) eine Darstellung des Plasmids pGN205 ist und (b) eine Darstellung des Plasmids pGN207 ist.
Beispiel A: Konstruktion einer geordneten und hierarchischen gepoolten cDNA-Bibliothek und deren Anwendungen.
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Eine willkürlich geordnete und gepoolte Bibliothek:
Der Vektor ist ein E. coli-Vektor, der zwei T7-Promotoren beherbergt, mit einer multiplen Klonierungsstelle (MCS) dazwischen. Die zwei Promotoren sind zueinander orientiert und zu der MCS. In Gegenwart der T7-RNA-Polymerase, exprimiert in E. coli, C. elegans oder irgendeinem anderen Organismus, wird die RNA produziert werden, beginnend mit den zwei T7-Promotoren. Da diese in gegenüberliegendem Sinn orientiert sind, werden beide RNA-Stränge von der zwischen den beiden Promotoren in die MCS inserierten (klonierten) DNA erzeugt, was zu einer Erzeugung von doppelsträngiger RNA . (dsRNA) bei Bindung des T7 RNA-Polymerase daran führt.
Eine C. elegans cDNA-Bibliothek wird in der MCS unter Verwendung von standardisierten molekularbiologischen Verfahren konstruiert. Die Bibliothek wird in E. coli transformiert und die resultierenden E. coli werden in Kultur gezüchtet und in Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten gelagert. An diesem Punkt kann Plasmid-DNA isoliert und in Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten gelagert werden, korrespondierend zu denjenigen der E. coli Kolonien. Ungefähr 100 000 Kolonien werden erreicht. Auf diesem Weg wird die Bibliothek ungefähr 5-mal die gesamte exprimierte cDNA Variation von C. elegans beherbergen, was die Möglichkeit eröffnet, daß wenig exprimierte Sequenzen in der Bibliothek vorliegen. Dies wird zu ungefähr 1041 Platten mit 96 Kavitäten führen. Die Platten werden wie notwendig hierarchisch gepoolt. Im vorliegenden Fall wird das Pooling der Klone in einem Bereich von 10 bis 100 arrangiert. Wenn das hierarchische Pooling pro 8 oder 12 durchgeführt wird (Zahlen sind geeigneter, da die Platten mit 96 Kavitäten ein 8- bis 12-Gitter haben), wird dies zu ungefähr 87 Platten mit vielen Kavitäten führen und zu ungefähr 8352 Kavitäten. Wenn das hierarchische Pooling pro 96 Kavitäten durchgeführt wird, was eine volle Platte darstellt, führt dies zu ungefähr
11 Platten und ungefähr 1041 Kavitäten. An jedem Punkt des hierarchischen Poolings kann Plasmid DNA-isoliert werden, was weniger aufwendig sein sollte, da weniger Platten verwendet werden, was jedoch zu einem Verlust der Komplexität führen wird, obwohl dies im Fall des Poolings pro 12 nicht der Fall sein sollte. Das Pooling der DNA kann auch mit der ursprünglichen DNA durchgeführt werden.
Die unten dargestellten Experimente beschreiben, wie das hierarchische Pooling durchgeführt werden sollte, sowohl für die DNA als auch für die E. coli-Bibliothek. J
Eine geordnete Bibliothek für die RNAi-Technologie, beherbergend jedes Gen des C. elegans-Genoms und ihre Anwendungen
Wenn das Genom-Sequenzierungsprojekt zu einem Ende kommt, kann diese Information bei der Anwendung der T7-RNA-Inhibitionstechnologie verwendet werden. Jedes Gen des C. elegans-Genoms kann unter Verwendung von PCR-Technologie kloniert werden. Vorzugsweise werden Exons mit einer Minimallänge von 500 bp kloniert. Wenn die Exons zu klein sind, werden kleinere Fragmente mit PCR isoliert oder sogar Teile von Introns und benachbarten Exons werden mit der PCR-Technologie isoliert, so daß mindestens ein ausreichender Teil der translatierten Region des Gens kloniert ist. Für dieses werden mindestens 17 000 PCR-Reaktionen durchgeführt werden müssen. Die Sammlung an PCR-Produkten wird in einen T7-Vektor wie beschrieben kloniert (zwei T7-Promotoren, zueinander orientiert, mit einer multiplen Klonierungsstelle dazwischen). Jedes PCR-Produkt wird unabhängig voneinander kloniert oder kann verwendet werden, um eine willkürliche Bibliothek zu erzeugen, analog zu der beschriebenen cDNA-Bibliothek. Wenn jedes PCR-Produkt individuell kloniert wird, können die resultierenden Bakterien und die Plasmid-DNA auf verschiedene Weise gepoolt werden. Zunächst kann diese
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Sammlung von individuell klonierten PCR-Produkten in dem T7 RNAi-Vektor willkürlich gepoolt werden, wie beschrieben in der willkürlichen Bibliothek. Dieses Pooling kann auch auf rationalerem Wege durchgeführt werden. Z.B. können die Gene des C. elegans-Genoms unter Verwendung von bioinformatischen Werkzeugen analysiert werden (in Silico-Biologie). Verschiedene Gene des Genoms werden zu einer Gen-Familie gehören oder werden Homologe im Genom aufweisen. Diese Mitglieder der Gen-Familie werden gepoolt oder die Mitglieder, die Homologe sind, werden gepoolt. Auf diesem Wege wird die Anzahl von ungefähr 17 000 Klonen auf eine einfacher verwendbare Quantität reduziert. Diese Bibliothek kann verwendet werden, um auf Phänotypen bei den Verfahren gemäß der Erfindung zu screenen. Der resultierende Phänotyp ergibt eine funktioneile Beschreibung des Gens oder der Gen-Familie oder der Gen-Homologe des C. elegans-Genoms. Da die Bibliothek aus einem Teil von jedem Gen im Genom besteht, ermöglicht dieses Verfahren die Beschreibung des Gesamtgenoms in funktionell phänotypischen Bezeichnungen. Hierfür muß die doppelsträngige RNA (dsRNA) in den Wurm eingeführt werden. Diese Einführung von Klonen allein oder von gepoolten Klonen, sei es willkürliches Pooling oder rationales Pooling, kann wie beschrieben auf verschiedene Weisen erreicht werden.
Beispiel eines Vektors für die Expression von doppelsträngiger RNAi
Jeder Vektor, der einen T7-Promotor enthält, kann verwendet werden und der eine multiple Klonierungsstelle enthält (es sind viele kommerzielle erhältlich). Primer, die den T7-Promotor enthalten und ein Primer mit dem reversen komplementären Strang, beide mit den geeigneten Enden, werden entwickelt. Diese Primer können hybridisiert werden und wenn sie gut entwickelt wurden, können sie in den gewählten Vektor kloniert werden. Die minimale Sequenz für einen T7-Promotor ist TAATACGACTCACTATAGGGCGA. Obwohl jeder Vektor für die
Konstruktion eines T7-Expressionsvektors verwendet werden kann, folgt ein Beispiel, wie dies mit dem Vektor pGEM-3zf(-) erreicht werden kann.
- Vektor pGEM-3zf(+) (PROMEGA) wurde mit Hindlll und Sail verdaut.
- Die Primer oGNl und oGN2 wurden miteinander bei einer endgültigen Konzentration von 1 &mgr;g/30 &mgr;&idiagr; vermischt, gekocht und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt.
- Der Primer wurde in den Vektor unter Verwendung von . . Standardligationsverfahren ligiert. Der resultierende Vektor ist pGNl (dargestellt in Figur 1) und enthält zwei T7-Promotoren, die zueinander orientiert sind und beherbergt eine multiple Klonierungsstelle dazwischen.
Die Sequenzen von oGNl und oGN2 sind:
- OGNl: AGC TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG AGA AGC TT
- 0GN2: TCG AAA GCT TCT CGC ATA ATA GTG AGT CGT ATT AC
Beispiel für die Konstruktion einer Bibliothek
RNA kann aus jedem Organismus isoliert werden, der gegenüber RNAi empfindlich ist. Im allgemeinen wird die isolierte RNA dann in doppelsträngige cDNA kopiert und darauffolgend in geeignete Vektoren für das Klonieren hergestellt. Verschiedene Verfahren existieren sowie auch molekularbiologische Kits, die von verschiedenen Firmen gekauft werden können, einschließlich Promega, Clontech, Boehringer Mannheim, BRL, usw. die folgendes ermöglichen:
- Isolierung von RNA,
- schließlich kann polyA RNA isoliert werden (verschiedene Techniken und Kits sind erhältlich)
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- Erststrangsynthese mit AMV reverser Transkriptase, willkürlichen hexameren Primern und/oder Oligo(dT)-Primer
- ZweitStrangsynthese mit Rnase H, DNA-Polymerase I,
- übereinstimmende Enden mit T4 DNA-Polymerase
- Zugabe eines Adapters mit T4 DNA-Ligase
- schließlich Behandlung mit T4-Polynukleotidkinase
- Klonierung der cDNA in den Vektor.
Die resultierende Ligationsmischung kann als cDNA-Bibliothek betrachtet werden. Die Ligation enthält alle cDNA aus dem Verfahren, ligiert in den interessanten Vektor. Um die Bibliothek zu ordnen, muß die Ligation in E. coli-Stämme. transformiert werden.
Anwendung dieser E. colis oder DNA-Bibliothek T7-RNA erzeugender Stamm:
- Ein Standardstamm ist BL21 (DE3): F-ompT[lon]hsds(r-m-; und E. coli B-Stamm) &lgr; (DE3). Schließlich können Varianten von BL21 (DE3) verwendet werden, obwohl BL21 (DE3)pLysS verwendet wird.
- Jeder andere E. coli-Stamm, der die T7 RNA-Polymerase produziert, der erhältlich sein kann, muß konstruiert werden. Dies kann einfach unter Verwendung eines Phagens erzeugt werden, der kommerziell erhältlich ist, in diesem Fall wird der XCE6-Vektor (bereitgestellt von Promega) verwendet. Fast jeder E. coli-Stamm kann mit diesem Phagen transfiziert werden und T7 RNA-Polymerase produzieren.
- Ein RNAselll mutanter E. coli:
Verschiedene Stämme sind im Prinzip erhältlich; wir wählen in einem ersten Experiment die Verwendung des Stamms AB301-105: rna-19, suc-11, bio-3, gdhA2, his95, rnc-105, relAl, spoTl,
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metBl (Kinder et al. 1973 Mol. Gen. Genet 126:53), aber andere Stämme können besser geeignet sein. Dieser Stamm wird mit &lgr;&Ogr;&Egr;6 infiziert und so wird eine T7-produzierende Variante erzeugt werden.
Der Wildtyp C. elegans-Wurm kann auf den Bakterien-Pools gezüchtet werden. Die Bakterien exprimieren die T7 RNA-Polymerase. Dies führt dazu, daß große Mengen dsRNA in dem Verdauungssystem von C. elegans auftauchen, die in den Organismus diffundieren und zu einer Inhibition der Expression führen. Diese Bibliothek kann nun für das Screening auf verschiedene Phänotypen verwendet werden.. . Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß es sehr viel schneller im Nachweis von relevanten Genen in bestimmten Abläufen ist als die bekannte C. elegans-Technologie. Außerdem kann, wenn ein interessanter Phänotyp gefunden wird, das verantwortliche Gen einfach kloniert werden.
Unter Verwendung des hierarchischen Poolings kann man einfach in einem zweiten Screening den relevanten Klon des Pools finden. Die inserierte DNA dieses Klons kann dann sequenziert werden. Dieses Experiment führt zu genetischen und biochemischen Daten in einem Schritt.
Wildtyp C. elegans-Stämme können mit Verbindungen kombiniert werden, um auf den Phänotyp, eine Arzneimittelresistenz und/oder eine Arzneimittelempfindlichkeit zu screenen. Der C. elegans-Stamm kann ein mutierter Stamm sein, das Screening für einen verstärkten Phänotyp, einen reduzierten Phänotyp oder einen neuen Phänotyp. Der C. elegans-Stamm kann ein mutierter Stamm sein und der Bibliothek-Screen kann mit Verbindungen kombiniert werden. Auf diese Weise kann man auf eine Arzneimittelresistenz, eine Arzneimittelempfindlichkeit, einen verstärkten Phänotyp, einen reduzierten Phänotyp oder einen neuen Phänotyp screenen. Der E. coli-Stamm kann ein T7 RNA-Polymerase-exprimierender Stamm, wie beispielsweise BL21
(DE3) sein, jedoch wird die Bildung von doppelsträngiger RNA unter Verwendung eines speziellen E. coli-Stamms, der RNAselll-negativ ist, verstärkt. Die RNAselll erkennt spezifische Schlaufen in der dsRNA. Schließlich kann ein E. coli-Staitim verwendet werden, der in RNAse deletiert ist, die nicht RNAselll sind oder ein E. coli kann verwendet werden, der in einer oder mehreren RNAasen deletiert ist. Die Expression der T7 RNA-Polymerase in den meisten bekannten E. coli-Stämmen und Konstrukten, die zur Erzeugung von T7 RNA-Polymerase-erzeugenden E. coli-Stämmen erhältlich sind, umfaßt in der Regel einen induzierbaren Promotor. Auf diesem" Weg wird die Produktion der T7 RNA-Polymerase reguliert, und auf die Weise die Produktion der dsRNA. Vorteilhaft kann dieses Merkmal verwendet werden um den C. elegans-Wurm in spezifischen Abschnitten des Wachstums zu "Puls" füttern. Die Würmer werden auf den nicht-induzierten E. coli-Stämmen gezüchtet. Wenn der Wurm das interessante Stadium erreicht hat, wird die T7 RNA-Produktion in den Bakterien induziert. Dies ermöglicht das Studium der Funktion jedes Gens zu jedem Zeitpunkt des Lebenszyklusses des Tieres.
Screening der Bibliothek auf Homologe von möglicherweise interessanten menschlichen Genen und Zuordnung einer Funktion zu diesen Genen.
Hunderte von Genen wurden in verschiedenen Projekten isoliert, wobei es sich um Genomprojekte handelte, differentiell exprimierte Arrays, Hybridisierungsstudien usw. Die beschriebene cDNA-Bibliothek kann einen Weg bereitstellen, um diesen Genen eine Funktion zuzuordnen oder sicherzustellen, und zwar in schneller und effizienter Weise. Zunächst müssen das Wurmhomolog oder die Wurmhomologe oder die Gene durch bioinformatische Werkzeuge (in Silico-Biologie) identifiziert werden. Es werden PCR-Primer entwickelt und das cDNA-Fragment wird unter Verwendung von PCR-Technologie isoliert. Die PCR kann an den hierarchischen
Pools durchgeführt werden. Der positive Pool oder individuelle Vertiefungen, die die Bakterien beherbergen, die die geeignete cDNA aufweisen, werden an C. elegans verfüttert und der Phänotyp wird festgehalten.
Die PCR kann an einer cDNA durchgeführt werden, die aus C. elegans isoliert wurde. Die resultierende DNA kann in den T7 Vektor kloniert und in die dsRNA erzeugenden E. colis transformiert werden, von denen der C. elegans-Wurm dann ernährt wird. Abhängig davon, welcher Weg schneller und zuverlässiger ist, muß eine Wahl getroffen werden. r
Wenn das Gen zu einer Genfamilie gehört, kann es sein, daß der Wurm auf einer Mischung aus Bakterien ernährt werden muß. Jedes von diesen beherbergt einen Teil der Mitglieder der Genfamilie. E. coli-Stämme, Wachstumsbedingungen, Kombinationen mit Verbindungen, können wie oben beschrieben durchgeführt werden.
Wenn die rationale Bibliothek verwendet wird, in der alle Gene von C. elegans in einer organisierten und strukturierten Weise kloniert sind, können das C. elegans-Homolog und schließlich die anderen Homologe, Orthologe und Mitglieder der Genfamilie einfach in der Bibliothek unter Verwendung einer Silico-Biologie zurückverfolgt werden. Auf dieser Stufe wird keine PCR benötigt und die Bakterien oder die DNA können isoliert werden, auf denen der Wurm angezüchtet wird.
Beispiele
Die Idee einer Reihe von Experimenten war die Überprüfung sowohl des RNAi-Vektors als auch verschiedener E. coli-Stämme, die konstruiert wurden.
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1) Konstruktion eines Test-Plasmids
Jede cDNA, die einen klaren Phänotyp in dem Wurm ergibt, wenn sie ausgeschaltet wurde oder in einem RNAi-Experiment verwendet wurde, kann verwendet werden. Es ist bekannt, daß unc-22 ein guter Kandidat ist, aber es kann möglich sein, daß andere Gene möglich sind. Wir haben uns für eine sensibles System entschieden, das in einem späteren Stadium verwendet werden kann. Das System wurde mit sup-35 in einem pha-1-Hintergrund getestet. Exon 5 des sup-35 wurde durch PCR isoliert und in den T7 Promotorvektor pGNl kloniert. Der ? resultierende Vektor wurde als pGN2 bezeichnet, pha-1 (ß2.123) mutierte Würmer können keinen Nachwuchs bei Temperaturen von mehr als 250C erzeugen. Dies liegt an einem Entwicklungsproblem in der Embryogenese. Wenn sup-35 ausgeschaltet oder in diesem Stamm inhibiert ist, kann die Nachkommenschaft bei dieser Temperatur wachsen. Die Kombination von pha-1-mutanten Würmern und sup-35 RNAi ist ein gutes System um verschiedene Optionen zu überprüfen.
2) Testen von RNAi unter Verwendung eines E. coli-Stamms, der dsRNA erzeugt
- pGN2 wurde in einen E. coli-Stamm BL21(DE3) eingeführt und die T7 RNA-Polymerase wurde mit IPTG induziert. C. elegans-Würmer (pha-1 (e2123)) wurden auf diesen Bakterien inokuliert und bei der eingeschränkten Temperatur von 250C gezüchtet. Wenn dieser Mutant ein embryonischer Mutant bei dieser Temperatur ist, wird keine Nachkommenschaft beobachtet werden. Wenn das sup-35-Gen durch die in dem E. coli vorliegende dsRNA effizient inhibiert ist, wird Nachkommenschaft beobachtet.
- pGN2 wurde in den E. coli-Stamm AB301-105(DE3) eingeführt und die T7 RNA-Polymerase wurde mit IPTG induziert. C. elegans-Würmer (pha-1 (e2123)) wurden auf diesen Bakterien
inokuliert und bei der beschränkten Temperatur von 250C gezüchtet. Wenn dieser Mutant ein embryonischer Mutant ist, wird bei dieser Temperatur keine Nachkommenschaft beobachtet werden. Wenn das sup-35-Gen durch die dsRNA, die in dem E. coli vorliegt, effizient inhibiert wird, wird Nachkommenschaft beobachtet werden.
3) Verbesserung des Wurmstamms für eine bessere Aufnahme von dsRNA
Bevor der pha-1 C. elegans auf dem E. coli-Stamm plattiert ]. wird, der die doppelsträngige sup-35 RNA produziert, wurde der Wurm mit EMS (Methansulfonsaureethyl) mutagenisiert. Die Nachkommenschaft dieses mutagenisierten Wurms wird dann auf die Bakterien plattiert. Die Würmer, die sich von diesen Bakterien ernähren, ergeben eine größere Nachkommenschaft, die eine Mutation aufweist, die zu einer Verbesserung der dsRNA-Aufnähme führt und können für weitere Experimente verwendet werden.
Stabile Integration des dsRNA-erzeugenden Vektors in das Genom des T7 RNA-Polymerase erzeugenden Wurms
Ein E. coli-Vektor kann konstruiert werden, der die folgenden Merkmale beherbergt: Zwei T7-Promotoren, die zueinander gerichtet sind, mit einer Restriktionsstelle oder einer multiplen Klonierungsstelle dazwischen. Weiterhin kann der Vektor die C. elegans-sup35 genomische DNA enthalten, die in einer solchen Weise bearbeitet wurde, daß sie mehrere Stopp-Codons in unterschiedlichen Intervallen enthält, so daß kein Gesamtlängen-Protein aus dem sup35-genomischen DNA-Fragment exprimiert werden kann, wie illustriert in Figur 8. Jede cDNA oder jedes cDNA-Fragment kann in die multiple Klonierungsstelle zwischen den beiden T7-Promotoren kloniert werden. Wenn dieser Vektor in einen C. elegans-Stamm eingeführt wird, der die T7 RNA-Polymerase exprimiert, wird
die cDNA oder das DNA-Fragment, die zwischen den beiden T7-Promotoren kloniert ist/ transkribiert, und erzeugt dsRNA aus dem klonierten Fragment.
Der Vektor wird so konstruiert, daß er in pha-1 (e2123)-mutanten Würmern verwendet werden kann, die T7 RNA-Polymerase exprimieren. Die Expression der T7 RNA-Polymerase kann konstitutiv oder reguliert, allgemein oder gewebsspezifisch sein. Diese pha-1 (e2123)-Würmer können bei Temperaturen oberhalb von 250C keine Nachkommenschaft erzeugen, was an einem Entwicklungsproblem in der Embryogenese liegt. Wenn sup-35 in diesem Stamm inhibiert oder ausgeschaltet isty Jcann die Nachkommenschaft bei dieser Temperatur wachsen.
Wenn der Vektor in den Wurm eingeführt wird, kann der Vektor sich durch homologe Rekombination integrieren (Campbeilähnliche Integration). Es wurde auch gezeigt, daß die homologe Rekombination in C. elegans auftritt, obwohl mit niedrigen Frequenzen (Plasterk und Groenen, EMBO J. 11:287-290, 1992). Die homologe Rekombination an dem sup35-Gen wird zu einem Ausschalten des Gens führen, da die zwei resultierenden sup-35-Gene die Stopp-Codons beherbergen werden. Der resultierende Wurm und seine Nachkommenschaft, wenn die Rekombination in Eiern stattfinden sollte, wird eine Kopie des in das Genom integrierten Vektors aufweisen. Dies kann so gewählt werden, da nur die Würmer, bei denen das sup-35 ausgeschaltet wurde, bei Temperaturen von oberhalb von 250C eine Nachkommenschaft erzeugen werden. Weiterhin wird der resultierende Wurm stabil doppelsträngige RNA aus dem zwischen die beiden T7-Promotoren klonierten DNA-Fragment erzeugen. Dieser Wurm kann nun als stabiler transgener Wurmstamm angesehen werden, mit einer Reduktion der Funktion des Gens, von dem ein Fragment zwischen die beiden T7-Promotoren kloniert wurde.
Die DNA kann dem Wurm durch verschiedene Verfahren zugeführt werden, einschließlich Injektion, ballistischer Transformation, Eintauchen in die DNA-Lösung, Füttern mit Bakterien. Neue und andere Verfahren, die die Transformationseffizienz erhöhen, können in die Betrachtung mit einbezogen werden.
Der gewählte C. elegans-Stamm kann außerdem andere Mutationen aufweisen als die pha-1 (e2123)-Mutation und kann andere Gene exprimieren als die T7 RNA-Polymerase.
Beispiel B: Ein Yeast two hybrid-RNAi-Vektor - -
Ein Yeast two hybrid-Vektor kann konstruiert werden, der die beiden T7-Promotoren beherbergt. Die Vektoren können derartig konstruiert werden, daß sie sich sowohl in Hefe als auch in E. coli replizieren. Im allgemeinen werden cDNA-Bibliotheken für dieses Yeast two hybrid-System in den Gal4- oder LexA-Vektoren hergestellt. Die Bibliothek wird in Vektoren konstruiert, die die Aktivierungsdomäne von einem dieser Gene aufweisen. Ein Vektor kann konstruiert werden, der immer noch in dem Yeast two hybrid-Screen wirksam ist, der aber außerdem zwei T7 Promotoren enthält, die zueinander orientiert sind, mit einer Klonierungsstelle dazwischen. Die Reihenfolge der Sequenzen in dem Plasmid wird dann die folgende sein: "Plasmid-Rückgrad, (GAL4-T7), MCS, T7, Rückgrat". Eine in diesem Vektor konstruierte C. elegans-cDNA-Bibliothek kann als eine Standard-Yeast two hybrid-Bibliothek in einem Experiment zur Isolation von interagierenden Proteinen mit einem gegebenen Protein verwendet werden. Sobald ein Klon isoliert wurde, kann das Plasmid in einen E. coli-Stamm eingeführt werden, der die T7 RNA-Polymerase exprimiert und wird so dsRNA des klonierten Fragments erzeugen. Die Bakterien, die diese dsRNA erzeugen, können dem Wurm verfüttert werden und Phänotypen können gesammelt werden. Wie in dem vorherigen Beispiel ist dieses Überprüfungsverfahren
für einen neu isolierten Yeast two hybrid-Klon deutlich kürzer als das Standardverfahren, das PCR und/oder Klonierungsschritte benötigt, RNA-Experimente und/oder Abschaltexperimente. In den meisten Fällen werden die isolierten Klone zunächst sequenziert und auf der Basis der Sequenz wird eine Entscheidung getroffen, mit weiteren Experimenten fortzufahren. Bei der vorliegenden Erfindung kann jeder isolierte Klon einfach das geeignete E. coli eingeführt und dem Wurm verfüttert werden. Die Überprüfung wird dann durch Phänotyp-Analyse durchgeführt.
Um dieses Verfahren anzuwenden wurde ein Yeast two hybrid unter Verwendung eines bekannten Gens als Köder und der neukonstruierten Bibliothek als Ziel durchgeführt. Proteine, die durch die Klone in dem Ziel codiert werden, die mit dem Köder-Protein interagieren, werden zu positiven Hefe-Klonen führen, die das Reportermolekül exprimieren, so wie durch LacZ-Färbung mit X-gal beobachtet werden kann. Das Plasmid, das für das Zielprotein codiert, wird direkt aus dem Hefestamm isoliert und in E. coli eingeführt. Der E. coli ist ein T7 RNA-Polymerase produzierender E. coli. In diesem Fall wird die doppelsträngige RNA aus der DNA erzeugt, die in die multiple Klonierungsstelle des Vektors kloniert wurde. Wenn diese dsRNA dem Wurm unter Verwendung der vorher beschriebenen Verfahren verfüttert wird, wird das Gen in dem Wurm inhibiert, was zu einem bestimmten Phänotyp führt.
- Dieser Yeast two hybrid-Vektor kann vorteilhaft verwendet werden um eine geordnete und hierarchisch gepoolte Bibliothek zu konstruieren, wie beschrieben im vorherigen Beispiel.
- Ein Hefestamm kann auch konstruiert werden, der gegebenenfalls die T7 RNA-Polymerase erzeugt. Nach den Yeast two hybrid-Experimenten könnte die Expression der T7 Polymerase induziert werden, was zu der Produktion von dsRNA in der Hefezelle führt. Dementsprechend könnte die Hefe dem
Wurm verfüttert werden. Es sind Beweise erhältlich, die zeigen, daß sich die C. elegans-Würmer von Hefe ernähren.
Konstruktion eines T7 RNA-Polymerase erzeugenden Stamms und deren Anwendungen
Ein C. elegans-Stamm kann konstruiert werden, der die T7 RNA-Polymerase exprimiert. Die Expression kann allgemein und konstitutiv sein, könnte aber auch unter einem gewebsspezifischen Promotor, einem induzierbaren Promotor oder einem zeitlich beschränkten Promotor oder einem Promotor; durchgeführt werden, der eine dieser Eigenschaften oder, eine Kombination dieser Eigenschaften beinhaltet. Die DNA kann in diesen C. elegans-Stamm eingeführt werden. Dies wird entweder durch Injektion, durch Beschüß mit Teilchen, durch Elektroporation oder wie vorher erwähnt durch Verfüttern durchgeführt. Wenn die DNA ein Plasmid wie in den vorherigen Beispielen beschrieben ist, d.h. ein Plasmid, das ein kloniertes cDNA-Fragment oder ein PCR-Fragment zwischen zwei flankierenden T7-Promotoren beherbergt, dann wird die dsRNA dieses cDNA oder PCR-Fragments in der Zelle oder dem gesamten Organismus gebildet, was zu einer Herabregulation des korrespondierenden Gens führt. Die eingeführte DNA kann eine effiziente vorübergehende Herabregulation aufweisen. Die eingeführte DNA kann eine extrachromosomale Anordnung bilden, wobei diese Anordnung zu einer eher katalytischen Ausschaltung oder Reduktion des funktionalen Phänotyps führen kann. Das Plasmid könnte auch in das Genom des Organismus integriert werden, was zu demselben katalytischen Abschalten oder der Reduktion des funktioneilen Phänotyps führt, was jedoch nicht stabil transmittierbar wäre.
- Plasmid-DNA, die eine cDNA oder einen Teil einer cDNA oder ein EST oder ein PCR-Fragment von C. elegans beherbergt, kloniert zwischen zwei T7-Promotoren wie beschrieben in den Beispielen A) und B), kann in den T7 RNA-Polymerase-Wurm
durch Standardverfahren eingeführt werden. Phänotypen können analysiert werden. -DNA aus einer geordneten und gepoolten Bibliothek wie in Beispiel A) kann in den T7 RNA-Polymerase-Wurm eingeführt werden und zwar durch Standardverfahren (Injektion, Beschüß). Phänotypen können analysiert werden. Bei dem hierarchischen Pool kann der Originalklon einfach aufgefunden werden.
- Dasselbe Verfahren kann mit einem mutanten Wurm durchgeführt werden, der die T7 RNA-Polymerase exprimiert. Ein Screening für verstärkte, reduzierte oder neue Phänotypen.
- Das Verfahren kann verwendet werden, um ein Screening von Verbindungen zu ermöglichen. Das Screening mit entweder einem Wildtypstamm oder einem mutanten Stamm für verstärkte oder neue Phänotypen.
- Die DNA könnte in den Wurm durch neue Verfahren eingeführt werden. Eines von diesen Verfahren ist die Zufuhr von DNA durch E. coli. In diesem Fall wird die hierarchische gepoolte Bibliothek dem Tier verfüttert. Um einen Verdau der E. coli-DNA in dem Verdauungssystem des Nematoden zu verhindern, wird vorzugsweise ein DNAase-defizienter C. elegans verwendet, wie z.B. nuc-1 (el392). Dieses Verfahren würde eins der besonders interessanten sein, da es unabhängig von der Transformationseffizienz anderer Techniken wäre und im allgemeinen schneller und weniger arbeitsaufwendig.
2) Mögliche Verstärkungen des Verfahrens
- Ein Vektor wird konstruiert, so daß er die sup-35-cDNA oder einen Teil dieser DNA beherbergt, kloniert zwischen zwei T7-Promotoren. Der Rest des Vektors ist derselbe wie beschrieben in den Beispielen A) und B). Dieser Vektor kann in einen pha-lts-Mutanten C. elegans eingeführt werden. Ein
Temperaturauswahlsystem existiert in diesem Fall und nur diejenigen Würmer, die die DNA aufgenommen haben und die doppelsträngige sup-35-RNA exprimieren, werden bei beschränkten Temperaturen überleben. Die hierarchisch gepoolte Bibliothek kann durch jedes oben beschriebene Verfahren zugeführt werden.
- Der Vektor kann verwendet werden um eine Bibliothek zu konstruieren, die in einen T7 RNA-Polymerase exprimierenden E. coli eingeführt wird. In diesem Fall haben wir ein analoges Screening wie in Teil A mit einem zusätzlichen ; Screening auf Würmer, bei denen die dsRNA sup-35 aktiv.ist.
- Die DNA oder die dsRNA von sup-35 könnte auf einem anderen Plasmid zugeführt werden. Für die Fütterung, sowohl die DNA-Verfütterung (Beispiel C) oder die dsRNA-Verfütterung, Beispiel A) und B), bedeutet dies, daß die beiden Plasmide in einem Bakterium vorliegen könnten oder daß der Wurm auf einer Mischung von Bakterien gefüttert wird, wobei eines von diesen das sup-35-Konstrukt beherbergt.
Beispiel für die Konstruktion eines T7 RNA-erzeugenden C. elegans
Um eine T7 RNA-Polymerase in dem Wurm zu erzeugen, sind verschiedene Möglichkeiten möglich. Die T7-Polymerase kann unter verschiedenen Promotoren exprimiert werden, wobei es sich um induzierbare Promotoren, konstitutive Promotoren, allgemeine Promotoren und Gewebe-(zell)-spezifische Promotoren oder Kombinationen davon handeln kann. Beispiele für diese Promotoren sind der Hitzeschock-Promotor hsp-16, der Verdauungssystem-Promotor ges 1, der Promotor von cet858, jedoch auch der Promotor von dpy 7 und das Promotorelement GATAl. In diesem Beispiel wird die T7 RNA-Polymerase unter der Kontrolle des hsp-16-Promotors exprimiert, der in dem pPD49.7 8-Vektor erhältlich ist. Die T7 RNA-Polymerase wird
als PCR-Produkt unter Verwendung der Primer von GN3 und GN4 isoliert.
Das resultierende PCR-Produkt wird mit Nhel und Ncol verdaut, wie auch der Vektor, in den wir klonieren wollen, wobei es sich um den Fire Vektor pPD49.78 handelt. Der resultierende Vektor ist pGNIOO, dargestellt in Figur 2 oGN3: CAT GGC AGG ATG AAC ACG ATT AAC ATC GC oGN4: ATG GCC CCA TGG TTA CGG GAA CGC GAA GTC CG pGNIOO ist enthalten.
Der Vektor wird in den Wurm unter Verwendung von Standardverfahren eingeführt, wie z.B. einer Mikroinjektion
Die folgenden Stämme wurden dann konstruiert:
- Wildtyp (pGNIOO)
- nuc-1- (el392) (pGNIOO)
- pha-1 (e2123) (pGNIOO)
- pha-1; nuc-1 (pGNIOO)
Alle diese Stämme waren in der Lage, T7 RNA-Polymerase zu produzieren, wenn sie durch die Temperatur induziert wurden oder alternativ durch Metalle, z.B. die Anwendung von schwerem Cadmium oder Quecksilber. Das Verfahren für die Temperaturinduktion ist die Verlagerung des Tiers auf eine Temperatur bei 30 bis 33°C für mindestens eine Stunde, woraufhin das Tier zu den Standardtemperaturen (15 bis 250C) zurückgebracht werden kann.
Der Wildtypstamm, der die T7 RNA-Polymerase erzeugt, kann für die Herstellung von jeder RNA in dem Wurm verwendet werden. Insbesondere können die Plasmide von den beschriebenen Bibliotheken in diese Würmer eingeführt werden und die Phänotypen können festgehalten werden.
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Der nuc-1-Mutanten-Wurm wird verwendet werden um DNA über Bakterien einzuführen, auf denen sich die Würmer ernähren. Da der nuc-1-Wurm die DNA nicht verdaut, kann die Plasmid-DNA die Verdauungswand überschreiten. Wenn sie von den Zellen aufgenommen wird, die die T7 RNÄ-Polymerase erzeugen, wird dsRNA erzeugt, wodurch das Gen inhibiert wird, aus dem die RNA transkribiert wurde.
Der pha-1-Mutantenstamm, der die T7 RNA-Polymerase erzeugte, kann verwendet werden um die Verfahren wie oben beschrieben zu verstärken. Die DNA kann durch Beschüß, Mikroinjektion oder Verfütterung eingeführt werden. Insbesondere kann di.eser Stamm für die Vektoren verwendet werden, die dsRNA von sup-35 und vom betrachteten Gen erzeugen, wobei es sich bei dem letzteren um ein PCR-Produkt, eine cDNA oder eine Bibliothek wie beschrieben handeln kann.
Der pha-1, nuc-1-Mutant, der die T7 RNA-Polymerase erzeugt, kann für die bakterielle Zufuhr der DNA verwendet werden. Die DNA wird vorzugsweise das Plasmid sein, das dsRNA sowohl von sup-35 als auch dem betrachteten Gen erzeugt. Der Wurmstamm wird vorzugsweise die T7 RNA-Polymerase im Verdauungssystem erzeugen. Die Zufuhr wird vorzugsweise durch Fütterung des Wurms auf Bakterien, die das Plasmid beherbergen, durchgeführt.
Anwendung der RNAi-Technologie bei Pflanzen
Nematoden sind für einen großen Teil der Schäden verantwortlich, denen Pflanzen ausgesetzt sind und insbesondere Pflanzen, die in der Landwirtschaft verwendet werden. Die RNAi-Verfahren gemäß der Erfindung können für Pflanzen verwendet werden, um diese parasitischen Nematoden daran zu hindern, sich länger zu ernähren. In einem ersten Schritt wird ein DNA-Fragment aus der parasitischen Pflanzennematode isoliert, das für das Überleben oder das
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Wachstum oder die Nahrungsaufnahme oder Vervielfältigung der Tiere kritisch ist. Jedes Gen, dessen Expression essentiell ist, ist für diesen Zweck geeignet.
Ein Teil dieses Gens, ein Exon oder cDNA, wird kloniert. Dieses DNA-Fragment kann unter dem Einfluß eines gewebespezifischen Promotors, vorzugsweise eines wurzelspezifischen Promotors kloniert werden, noch bevorzugt zwischen zwei wurzelspezifischen Promotoren. Die DNA des klonierten Gens unter Kontrolle des wurzelspezifischen Promotors kann in die betroffene Pflanze eingeführt werden ; und zwar unter Verwendung von transgener Technologie für. Pflanzen. Für jede parasitische Nematode kann ein unterschiedliches DNA-Stück benötigt werden und dementsprechend wird für jede Pflanzenrasse ein unterschiedlicher Promotor benötigt werden.
Die Wurzel wird RNA oder dsRNA von dem eingeführten Stück DNA erzeugen, wenn ein wurzelspezifischer Promotor verwendet wird. Wenn sich die Nematode von der Pflanze ernährt, wird die RNA und/oder dsRNA konsumiert oder von der Nematode verdaut. Die RNA und/oder dsRNA kann in die Zellen der Nematode eindringen und ihre inhibitorische Wirkung auf die Ziel-DNA ausüben. Abhängig von der Natur des klonierten DNA-Stücks des Wurms wird die Nematode nicht mehr in der Lage sein zu überleben, zu essen, sich fortzupflanzen usw., was in jedem Fall verhindert, daß sich das Tier weiter von der Pflanze ernährt und so die Pflanze geschützt wird.
Konstruktion eines T7 RNA-Polymerase-produzierenden C. elegans
Um T7 RNA-Polymerase oder andere RNA-Polymerasen in Tieren zu erzeugen und insbesondere in Nematoden und ganz besonders in C. elegans können verschiedene Möglichkeiten in betracht gezogen werden. Die T7 RNA-Polymerase kann unter
verschiedenen Promotoren exprimiert werden. Diese Promotoren können induzierbare Promotoren, konstitutive Promotoren, allgemeine Promotoren, gewebsspezifische Promotoren oder Kombinationen derselben sein.
Beispiel 1
Konstruktion eines Basisvektors für die Expression der T7-Polymerase in C. elegans
Die für die T7-Polymerase codierende Sequenz wurde durch PCR aus &lgr; CE6 (Novagen, Madison, USA) unter Verwendung der.Primer OGN26 (ATGGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG) und OGN46 (CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC) unter Verwendung von Standardverfahren (PCR, A practical approach, 1993, Ed. J. McPherson, et al., IRL Press) vervielfältigt. Das resultierende DNA-Fragment, das für die T7 RNA-Polymerase codierte, wurde mit Agel und EcoRI verdaut und in den Fire Vektor pPD97.82 inseriert, verdaut mit Agel und EcoRI. Das resultierende Konstrukt codiert für einen offenen Leserahmen der T7 RNA-Polymerase in Fusion mit dem SV4 0 großen T-Antigen-Kern-Lokalisationssignal (NLS) mit der Aminosäuresequenz MTAPKKKRKVPV. Diese Kern-Lokalisierungssignalsequenz wird benötigt, um die T7 RNA-Polymerase aus dem Cytoplasma in den Kern zu verlagern, wo sie in der Lage ist, an ihre spezifischen Promotoren zu binden, bezeichnet als T7-Promotoren. Stromaufwärts von der codierenden Sequenz für das T7-Polymerase-Fusionsprotein liegt ein Minimalpromotor (myo-2), dem eine multiple Klonierungsstelle (MCS) vorgeschaltet ist, in die verschiedene C. elegans-Promotoren inseriert werden können. Dieses Plasmid (pGNlO5, dargestellt in Figur 11) ist ein Basis-T7-RNA-Polymerase-Plasmid, das die Expression der T7-Polymerase in C. elegans ermöglicht. Derivate dieses Plasmids, bei denen Promotoren in die multiple Klonierungsstelle kloniert sind, ermöglichen eine
induzierbare, konstitutive, generelle und gewebsspezifische Expression der T7 RNA-Polymerase in C. elegans, da die Expression durch den Promotor reguliert werden wird, der in die multiple Klonierungsstelle kloniert ist.
Obwohl nicht auf diese Beispiele begrenzt, ist es für die folgenden Promotoren bekannt, daß sie die Expression in den folgenden Geweben induzieren: let-858 (ubiquitäre Expression), myo-2 (Expression im Pharynx), myo-3 (Muskeln der Körperwand), egl-15 (Muskeln der Vulva), unc-119 (Pan-Neuron). ;
Beispiel 2
Konstruktion eines Vektors für die Expression einer T7 RNA-Polymerase in C. elegans-Muskelgewebe
Die für die T7 RNA-Polymerase codierende Sequenz war durch PCR aus &lgr; CE6 unter Verwendung der Primer OGN43 (GCCACCGGTGCGAGCTCATGAACACGATTAACATCGC) und OGN44 (CACTAGTGGGCCCTTACGCGAACGCGAAGTCCG), verdaut mit Agel/Spel und inseriert in den pGK13-Vektor, verdaut mit Agel/Spel amplifiziert. (Dieser Vektor enthält den starken SERCA-Promotor, der die Expression im Pharynx antreibt, in der Muskel der Vulva, dem Schwanz und der Körperwand). Ein Kernlokalisierungssignal (NLS) von einem SV40 großen T-Antigen wurde vor die für die T7-Polymerase codierende Sequenz durch die Insertion von zwei überlappenden Oligos OGN45 (CCGGATGACTGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAGCT) und OGN46 (CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC) inseriert, und zwar an den Sacl/Agel-Restriktionsstellen. Das resultierende Konstrukt wurden pGNlO8 genannt, wie dargestellt in Figur Die Einführung dieses Plasmids in C. elegans führt zur Expression der T7 RNA-Polymerase im Pharynx, dem Muskel der Vulva, des Schwanzes und der Körperwände.
Um die Expression und Funktionalität der T7 RNA-Polymerase in C. elegans unter Regulationen des SERCA-Promotors zu überprüfen, wurde pGNlO8, der für die T7 RNA-Polymerase unter Kontrolle des SERCA-Promotors codiert, in C. elegans injiziert. Ein Testvektor wurde co-injiziert. Dieser Testvektor codiert für GFP unter Kontrolle eines T7-Promotors (pGN401 in Figur 13). Das Plasmid pGN401 wurde konstruiert durch Insertion von zwei überlappenden Oligos OGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) und OGN42 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT) in den Sacl/Agel geöffneten Feuervektor pPD87.82, wodurch ein T7-Promotor : erzeugt wurde. Weiterhin wurde ein Selektionsmarker co-. . injiziert, um auf Transformanten (rol6, pRF4) zu selektieren. Der letztere Selektionsvektor pRF4 ist dem Fachmann wohlbekannt. Transgenes Fl konnte einfach isoliert werden, da sie den rol 6 Phänotyp zeigen. Diese transgenen C. elegans exprimierten alle GFP im Pharynx, dem Muskel der Vulva, des Schwanzes und der Körperwand. Diese Daten zeigen deutlich, daß die T7 RNA-Polymerase unter Regulation des SERCA-Promotors funktionell exprimiert wird, und daß die exprimierte T7 RNA-Polymerase an den T7-Promotor bindet, der in pGN401 vorliegt und die Transkription des GFP-Gens initiiert, das dann funktionell exprimiert wird, was zu einer Fluoreszenz im Muskelgewebe führt, wo SERCA die Expression der T7 RNA-Polymerase induziert.
Beispiel 3
Konstruktion eines Vektors für die ubiguitäre Expression der T7 Polymerase in C. elegans
Das NLS-T7 RNA-Polymerase-Fusionsgen wurde aus pGNlO8 mit XmaI/Bspl201 isoliert und in den Feuervektor pPD103.05 kloniert, verdaut mit XmaI/Bspl20l. Dies führt zu einem Vektor, bei dem die T7 RNA-Polymerase unter Regulation des Iet858-Promotors kloniert ist. Dieser spezifische Promotor
ermöglicht die Expression der T7 RNA-Polymerase in allen Geweben. Das resultierende Plasmid wurde pGNllO genannt (Figur 14).
Beispiel 4
Konstruktion eines Vektors für die T7 RNA-Polymerase vermittelte Expression von DNA-Fragmenten, Genen und cDNAs unter der Kontrolle eine T7-Promotors
Der Feuervektor pPD97.82 wurde mit Sacl/Agel verdaut und eine T7-Promotorsequenz wurde durch Insertion von zwei . . überlappenden Oligos oGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) und OGN42 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT) in die Sacl/Age/Restriktionsendonukleasenstellen erzeugt. Diese Konstrukt (pGN400 Figur 12) enthält einen GFP offenen Leserahmen, kloniert zwischen die Sacl und EcoRI-Restriktionsendonukleasestellen unter der Regulation des T7-Promotors. Jedes Gen, cDNA- oder DNA-Fragment können in diesen Vektor durch Deletion des GPF-Gen als Agel/Sacl-Fragment und durch Klonierung des DNA-Fragments von Interesse in den Vektor kloniert werden. Vorzugsweise kann das DNA-Fragment von Interesse durch PCR-Amplifikation erhalten werden, und Insertion der Sacl/Agel-Stellen in die Primer. Das resultierende DNA-Fragment nach PCR-Amplifikation wird dann verdaut und das GFP-Gen in pGN400 wird durch das amplifizierte DNA-Fragment ersetzt.
Jeder Vektor, der einen T7-Promotor enthält, könnte zum Zwecke einer T7 RNA-Polymerase induzierten Expression in C. elegans verwendet werden, wie die kommerziell erhältlichen pGEM-Vektoren und pBluescript-Vektoren. Dies wird deutlich durch den pGN401-Vektor gezeigt, der GFP unter der Regulierung des T7-Promotors in einem transgenen C. elegans exprimiert, der die T7 RNA-Polymerase exprimiert.
Die Verwendung von pGN400 hat den Vorteil, daß der Vektor ein 3'UTR-Fragment von unc-54 beinhaltet, das die Transkription oder Stabilität der RNA verstärkt.
Erzeugung von permanenten gewebsspezifischen "pseudo knockout "-RNAi-C . elegans-Linien
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt werden Genabschaltungen in C. elegans nach willkürlich in großem Umfang angelegter Mutagenese und auf PCR basierender sib-Selektion erhalten. Dieses Verfahren ist grob, sehr zeitaufwendig und schwierig. Es wurde beschrieben, daß die Einführung von doppelsträng-iger RNA in eine Zelle, zu einer starken und spezifischen Interferenz der Expression der endogenen Gene führt. In C. elegans kann die Gen-Expression durch Injektion von RNA in die Körperhöhlung des Wurms, Eintauchen des Wurms in eine Lösung, die dsRNA enthält oder Verfütterung von E. coli, die dsRNA korrespondierend zum betrachteten Gen, herabreguliert werden. C. elegans-Zellen haben die Fähigkeit die dsRNA aus ihrer extrazellulären Umgebung aufzunehmen. Es wurde auch berichtet, daß mRNA ein Ziel dieser dsRNA vermittelten genetischen Interferenz ist (Montgomery and Fire 1998). Es wurde auch vorgeschlagen, daß die Ziel-DNA in dem Kern abgebaut wird, bevor eine Translation auftreten kann. Obwohl die durch RNAi vermittelte Reduktion der Gen-Expression auf die nächsten Generationen übertragen werden kann, ist die Vererblichkeit gering und die Wirkung wird während weiteren Nachkommen schnell verloren. Dies liegt vermutlich an einer kontinuierlichen Abnahme des dsRNA-Pools. Wir schlagen hier ein Verfahren zur Konstruktion von C. elegans-Linien mit einem permanenten, vererblichen RNAi-Phänotyp vor. Das Verfahren umfaßt die Erzeugung von transgenen C. elegans-Linien durch Einführung von Plasmiden, die cDNA-Fragmente des Zielgens in Sinn- und Antisinn-Richtung unter Kontrolle eines Wurm-Promotors oder durch Transkription eines invertierten Repeats der cDNA aus einem Einzelkonstrukt einführen.
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Alternativ kann die dsRNA aus einem Vektor transkribiert werden, der eine cDNA beherbergt, flankiert von zwei T7-Promotoren in einem C. elegans-Stamm, der die T7-Polymerase exprimiert. Das Ergebnis ist ein transgener Wurm mit einem vererblichen, stabilen "Pseudo-knock-out"-Phänotyp. Die Expression der cDNA oder der T7-Polymerase kann generell und konstitutiv sein, könnte aber auch unter einem gewebespezifischen Promotor reguliert werden. Im Gegensatz zur durch externer dsRNAi induzierter RNAi (injiziert, eingetaucht oder verfüttert), würde dieses Verfahren ermöglichen, eine konditioneile, gewebsspezifische Inhibition der Gen-Expression zu erhalten. - -
Inhibition der unc-22-Expression durch RNA-Interferenzergebnisse bei einem "Twitching"-Phänotyp
unc 22-cDNA (Exon 22) wurde in Sinn- und Antisinn-Richtung in PPD103.05 kloniert (A. Fire Nr. L2865), der den let 858-Promotor enthielt, der in der Lage ist, RNA-Sequenzen in allen Geweben zu exprimieren. Die resultierenden Plasmide wurden pGN205 (Figur 19a) und pGN207 (Figur 19b) genannt. Diese Konstrukte wurden im C. elegans zusammen mit einem selektierbaren Marker eingeführt (rol-6, GFP). Transgene Fl-Individuen (die rol-6 oder GRP exprimieren) zeigten einen "Twitching"-Phänotyp, der indizierte, daß RNAi durch endogene Transkription von RNA aus transgener DNA vermittelt werden konnte. Der RNAi-Phänotyp co-segregierte mit dem selektierbaren Marker zu weiteren Nachkommen. Dies führte zur Erzeugung von C. elegans-Linien mit permanentem RNAi-Phänotyp.
Erzeugung von stabilen T7 RNA-Polymerase-Linien und Erzeugung von dualen transgenen Würmern
Ein Expressionssystem in C. elegans, basierend auf einer exogenen RNA-Polymerase, macht zwei Plasmide nötig. Eins
h-I
codiert für die RNA-Polymerase unter Kontrolle eines spezifischen Promotors, während das andere Plasmid für das DNA-Fragment, das exprimiert werden soll, unter Regulation des T7-Promotors codiert. Im Falle von semistabiler RNAi, auch bezeichnet als pseudostabiler Knockout, wird die DNA von Interesse zwischen zwei T7-Promotoren kloniert, so daß dsRNA erzeugt werden kann.
Das es bekannt ist, daß das T7 RNA-Polymerase-Expressionssystem ein Hochexpressionssystem ist, wird dies zu Problemen bei der Erzeugung dualer transgener Tiere führen. Wenn das in der C. elegans-Nematode zur exprimierende Gen toxisch ist, wird dies zu lethalen Effekten führen und daher zu der Konstruktion von C. elegans ohne hochregulierte stabile Expression des Gens von Interesse. Wenn das Gen von Interesse für das Überleben des Organismus essentiell ist, wird die RNAi mit einem DNA-Fragment von diesem Gen ebenso zu lethalen Effekten führen, so daß pseudostabile Knockouts nicht möglich sind.
Um dieses Problem zu überwinden haben die vorliegenden Erfinder ein System, bestehend aus zwei transgenen Tieren, entwickelt. Das erste Tier ist transgen für die T7 RNA-Polymerase. Die T7 RNA-Polymerase kann in allen Zellen oder spezifischen Zellen oder Geweben exprimiert werden, wie in den vorherigen Beispielen gezeigt wurde. Das zweite transgene Tier ist transgen für das DNA-Fragment von Interesse.
Dies kann ein Gen oder eine cDNA, verbunden mit einem T7-Promotor sein oder, wenn man eine RNAi durchführen will, ein DNA-Fragment von einem solchen Gen, kloniert zwischen zwei T7-Promotoren.
Beide transgenen Tiere sind lebensfähig und zeigen keine abweichenden Phänotypen. Dies liegt daran, daß die T7 RNA-Polymerase, die in dem ersten transgenen Organismus
exprimiert wird, für den Organismus nicht toxisch ist, selbst wenn sie in relativ hohen Mengen exprimiert wird. In dem zweiten transgenen Organismus wird das Gen von Interesse nicht exprimiert oder die dsRNA wird nicht produziert, da diese transgenen Tiere nicht die T7 RNA-Polymerase enthalten.
Die Expression des Gens oder der cDNA von Interesse oder die RNAi mit einem DNA-Fragment kann nun durch Paarung der beiden transgenen Tiere erhalten werden. Die Nachkommenschaft von diesen sind dual transgen und exprimieren das Gen von Interesse oder exprimieren die dsRNA des DNA-Fragments von Interesse. Um ausreichende männliche Nachkommenschaft bei einer solchen Paarung zu erzeugen, kann eins der männlichen transgenen Tiere eine C. elegans-Mutante mit einem Phänotyp sein, der die Erzeugung von männlichen Tieren bevorzugt. Ein Beispiel für einen solchen Mutanten ist him-5· Vorzugsweise wird ein solcher Mutant verwendet, um ein C. eleganstransgenes Tier für T7 RNA-Polymerase zu erzeugen, während der Hermaphrodit das DNA-Fragment unter Regulation des TV-Promotors beherbergt.
Um eine effektiv auf die duale transgene Nachkommenschaft zu selektieren, kann ein zweites Transgen in das zweite transgene Tier eingeführt werden. Dieses Transgen enthält ein Reportergen unter Regulation des T7-Promotors. Das Reportergen kann GFP, Luciferase, beta-Galactosidase oder beta-Lactamase sein. Ein Beispiel eines solchen Transgens sind die Vektoren pGN400 und pGN401.
Um eine induzierbare, gewebsspezifische Expression eines Transgens in C. elegans zu erhalten, können wir männliche Ausgangstiere erzeugen (d.h. him-5), die das T7-Polymerasekonstrukt unter Kontrolle von unterschiedlichen C. elegans-Promotoren enthalten, die eine gewebsspezifische Expression ermöglichen. Diese männlichen Tiere können mit
Hermaphroditen gekreuzt werden, die das Gen von Interesse unter Kontrolle eines T7-Promotors tragen.
Weiterhin können die Transgene in das Genom des Tiers integriert werden. Verfahren zur Erzeugung einer stabilen Integration eines Plasmids in das Genom des Tieres wurden beschrieben (Methods in cell bioloav. Bd. 48. 1995. herausgegeben von Epstein und Shakes, Academic Press) und involvieren die Bestrahlung des Tiers. Dies kann für beide Tiere durchgeführt werden, jedoch vorzugsweise werden die Tiere, die die T7 RNA-Polymerase exprlinieren, einer solchen ' Behandlung unterzogen. Dies führt zu einer Sammlung von· G. elegans-Nematoden, die die T7 RNA-Polymerase unter der Kontrolle verschiedener Promotoren stabil exprimieren. Beispiele für die Promotoren sind die folgenden: myo-2 (Pharynx-Expression), myo-3 (Körperwandmuskeln), egl-15 (Vulvamuskeln), unc-119 (pan-neuron), SERCA (Muskeln), Iet858 (alle Zellen), ges-1 (Verdauungssystem).
Konstruktion von RNAi T7-Promotor-Yeast two hybrid-Vektoren
pGAD42 4 mit vorwärts gerichteten und reversen T7/T3 und/oder Sp6
In den meisten two hybrid-Experimenten wurde eine cDNA-Bibliothek in das Plasmid pGDA424 (Figur 16) kloniert, das mit zusätzlichen Restriktionsstellen in dem Polylinker erzeugt wurde, wie z.B. einer Ncol-Stelle (Clontech). Diese Bibliothek ermöglicht das Screening auf Bindungsproteine in einem Yeast two hybrid-Experiment. Wir konstruierten einen neuen Yeast two hybrid-Vektor mit denselben Möglichkeiten um ein Yeast two hybrid zu erzeugen, das jedoch zwei zusätzliche T7-Promotoren enthielt, so daß der Vektor für die T7-RNA-Polymerase induzierten pseudostabilen Knockouts verwendet werden konnte. Hierfür inserierten wir eine vorwärtsgerichtete T7 unter Verwendung eines T7-Linkers
(bestehend aus den folgenden Primern
aattcttaatacgactcactatagggcc und
catgggccctatagtgagtcgtattaag) in die EcoRI-Ncol-Stelle von pGAD424. Der resultierende Vektor wurde als pGAD424 ohne FULL-ICE-both-T7 bezeichnet. Es wurde Vorsicht geübt, um Stopp-Codons zu eliminieren und maximale mit Polylinker kompatible Aminosäuren zu verwenden. Wir verwendeten dieselbe Strategie für die reverse T7 (bestehend aus beiden Primern gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgca und gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg) mit BahmHl und Pstl. Um den Verlust von Sail zu vermeiden, brachten wir diese Stelle in den Primer ein. - -
Die Sall-Stelle ist wichtig, da die meisten Bibliotheken an dieser Stelle kloniert werden und Adaptoren erhältlich sind. Dies macht den neukonstruierten Vektor kompatibel mit existierenden Vektoren.
pAS2 mit vorwärts gerichteten und reversen T7/T3 und/oder Sp6
Ein analoger Yeast two hybrid-Vektor wurde basierend auf pAS2 (Clontech) konstruiert. Durch teilweisen EcoRV-Verdau waren wir in der Lage einen signifikanten Teil des cyh2-Gens zu entfernen. Das richtige Konstrukt konnte isoliert werden und durch einen Restriktionsverdau mit BgIII überprüft werden. Diese Restriktionsstelle liegt in dem EcoRV-Fragment von dem zu eliminierenden PAS2 vor. Dies eliminiert das cyh2-Gen, das ein leicht toxisches Gen ist und beteiligt an einer Verzögerung des Wachstum. Dieses Gen ist für die Durchführung von RNAi und Yeast two hybrid-Experimenten nicht essentiell. Nach Eliminierung des EcoRV-Fragments wird die EcoRI-Restriktionsstelle, die zwischen der DNA-Sequenz, die für GAL4DB codiert und HA (Epitop) lokalisiert ist, für das Plasmid einzigartig und kann verwendet werden um HA durch einen T7-Promotor enthaltenden Linker zu substituieren.
Dies stellt die Persistenz aller Restriktionsstellen sicher, ermöglich sowohl ein In-Frame-Cloning als auch eine Kompatibilität mit früheren Vektoren und pGAD424. Wir verwendeten die folgenden Linker (Primer: aattcttaatacgactcactatagggca und tatgccctatagtgagtcgtattaag) unter Verwendung von EcoRI und Ndel-Klonierungsstellen. Wir verwendeten dieselbe Strategie für reverse T7 (Primer: gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgca catgggccctatagtgagtcgtattaag und
gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg) mit BamHl und Pstl. Um einen Verlust von Sail zu vermeiden, führten wir dieses in den Primer ein. Der resultierende Vektor wurde als pAS2-c-yh2-HA+both T7-final bezeichnet.
Wenn der T7-Promotor (oder alternativ der T3- oder SP6-Promotor) in pGAD424 enthalten ist, wird es ermöglicht, von einem interagierenden Protein schnell zu RNAi fortzuschreiten und dem isolierten DNA-Fragment eine Funktion zuzuweisen. Ein zusätzlicher Vorteil ist die Fähigkeit, durch in vitro-Transkription gekoppelt mit in vitro-Translation (es gibt ein ATG mit Rahmen mit entweder GAL4DB oder GAL4AD) ein markiertes Protein zu erzeugen, das für in vitro-Kontrollen verwendet werden kann (z.B. pull down-Assays) der tatsächlichen Protein-Protein-Wechselwirkung.
Die Sequenzen der erzeugten Plasmide und der SP6- und T3-Polymerase sind dem unten bereitgestellten Sequenzprotokoll identifiziert:
·' : ·: mqdlhaiqlq leeemfnggi P06221 iaagsesdta wnrrllseli 1
keeyegkkgr apralaflqc mkvvmdmlnt datlqaiams
SP6DNA-abhängige RNA-Polymerase: SEQUENCE ID NO fskleghaak yfekvkkslk rrfeadqqrq hnvavvaeks vaekdadfdr
Swissprot-Zugangs-Nr. qigttlleil egsvfyngep venevaayit gktiyylqts esvgqwisaf apmaegiqay
43 Proteinsequenz: yapcvipprp wrtpfnggfh asrtksyrha vkgnrehvrk ltqkqmpkvy vaeriedqvr
1 wqinkdvlav ieevirldlg vfmramrtyg dkenkpanpv pvefqhlrgr weawpketql
61 wqqfinwkge carlytaetk tekvasrirl mvgqarkysa fesiyfvyam kehvaqlspa
121 stlspqsndl gkallrfteg ygvpsfkpli wfcinganlw gwdkktfdvr kainalqntq
181 dmcrdiaadp ltftqwakad rgsksaavvr eyaqyldlvd egradefrth elkemlspeq
241 giqhysamlr devgakavnl rpvngvealk gavaqvvikk nalymdadda dsrsrvyvqs
301 sgtelramas awdsigitrs apyeflawcf ygstrltcre svidyivdle vsnvldeefq
361 grtankvhpf eddrqdyltp kpsdapqdiy iwpsisevvk apivamkmir lpvhqdgscs
421 eglmytlptg fileqkimat ltkkpvmtlp gdikmslqve tdivdeaamm ttftsgsytl
W 4&THgr;1 hdashliltv celvdkgvts gaaynymtal hadntltlrv alkgqmvamy ekeaqkavae
541 eehevrwmvd tgievpeqge emlrvrtclm yvfa qlarfaakrn
601 iavihdsfgt gaaapnfvhg
661 fdlneimdse idgnalqkll
721
781
841
T3 DNA-abhängige RNA-Polymerase: SEQUENCE ID NO mniieniekn df seielaai P07659 salakeqlal ehesyelger 2
Swissprot-Zugangs-Nr. kageiadnaa akpllatllp eeyaskkgrk psayaplqll
Proteinsequenz: kvilasltst nntttiqaaag pfntladhyg rfgrirdlea khfkkhveeq
1 kafmqvvead migrgllgge klttrivewl mhvgirliem liestglvel rflkmlerqa
■P 61 dhealqlaqe yvdvlakrag mlgkaiedea pcvvppkpwv aitgggywan kpeasafitl
121 hskkglmrye dvympevyka awsswdkett inkkvlavvn eivnwkncpv lnkrhgqvyk
181 lppkpddidt neaalkewkk alagispmfq arvsrrisle fmleqankfa qrhnagnags
241 mdwrgrvyav prafnpqgndm vnlaqntawk kpigeegfyw lkihgancag grrplalvrt
301 afiekhvddi lacakdpinn aaagiyrldk cflafcfeya gvthhglsyn adipslerqe
361 csgiqhfsam lrdevggrav tkglltlakg iygivaqkvn eilkqdaing skkaiwfpyn
421 kdtgeisekl klgtstlaqq twwaeqdspf tkrsvmtlay gskefgfrqq vdkvpfperi
481 dsgkglmftq pnqaagymak nllpsetvqd vaaveamnwl ksaakllaae cslplafdgs
541 rhrcavhwtt pdgfpvwqey wlaygvtrsv iflgqfrlqp tintlkdsgi tpnemitvtd
601 pnfvhsqdgs hlrmtvvyah liwdavsvtv ihdsfgtipa dagklfkavr vlddtiqpai
661 dvladfysqf
* · · 		adqlhetqld
&Phi; &phgr; · &Phi;		 rkplqkrldm lnlqdilksd fafa vkdkktkeil
721 ekygiesfal &phgr; &phgr; &phgr;
&phgr; &phgr; &phgr; &Phi; &phgr;		 dahkqesgia
781 kmpplpkkgn
&Phi; &Phi; &phgr; &phgr;		 etmvityenn
841
44
pGN 108: SEQUENCE ID NO 3
gttgtcgtaaagagatgtmtattttactttacaccgggtcctctctctctgccagcacagctcagtgttggctgtgtgctcgggctcctgccaccggcgg cctcatcttcncttcttcttctctcctgctctcgcnatcacttcttcattcattctuttccttttcatcatcaaactagcatttcttactttatttattntttcaattttca atmcagataaaaccaaactacttgggttacagccgtcaacagatccccgggartggccaaaggacccaaaggtatgtttcgaatgatactaacataa catagaacattttcaggaggacccttgcttggagggtaccggatgactgctccaaagaagaagcgtaagctcatgaacacgattaacatcgctaagaa cgacttctctgacatcgaactggctgctatcccgttcaacactctggctgaccattacggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccttgagcatgag tcttacgagatgggtgaagcacgcttccgcaagatgmgagcgtcaacttaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcact acccuctccctaagatgattgcacgcatcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccagttcctgcaag aaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccattaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcgc aatcggtcgggccattgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaag cgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcncgtggca taaggaagactctancatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtagg tcaagactctgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgttccaaccttg cgtagttcctcctaagccgtggactggcattactggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagc actgatgcgctacgaagacgtttacatgcctgaggtgucaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcg gtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgac atgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgcaagacaaggctcgcaagtctcgccgtatcagccttgagitcatg crtgagcaagccaataagtngctaaccataaggccatctggttcccttacaacatggactggcgcggttcgtgtttacgctgtgtcaatgttcaacccgc aaggtaacgatatgaccaaaggacgtcttacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactg tgcgggtgtcgataaggmcgmcctgagcgcatcaagttcangaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactggagaacac "ggtgggctgagcaagattctccgnctgcttccrtgcgttctgcrttgagtacgctggggtacagcaccacggcctgagcüUactgctcccttccgc tggcgmgacgggtcngctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgcgcggttaacttgcttcctagtgaaaccgt tcaggacatcucgggangngctaagaaagtcaacgagattctgcaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgat gagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggctggcnacggtgttactcgcagtgtgactaagc gttcagtcargacgctggcttacgggtccaaagagttcggcttccgtcaacaagtgctggaagataccattcagccagctattgattccggcaagggtc tgatgttcactcagccgaatcaggctgctggatacatggctaagctgatttgggaatccgtgagcgtgacggtggtagctgcggrtgaagcaatgaac tggcttaagtctgctgcaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagancncgcaagcgngcgctgtgcattgggtaactcct gatggmccctgtgtggcaggaatacaagaagcctancagacgcgcRgaacctgatgncctcggtcagttccgcttacagcctaccattaacacca acaaagatagcgagarrgatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaactrtgtacacagccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtg tgggcacacgagaagtacggaatcgaatcttttgcactgancacgactccttcggtaccattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgc gaaactatggngacacatatgagtcttgtgatgtactggctgatttctacgaccagttcgctgaccagngcacgagtctcaanggacaaaatgccagc 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46
pGN105: SEQUENCE ID NO 4
aagcttgcatgcctgcaggccRggtcgactctagacacRttcagctacctagatacatggaUtccccgcctcccaatccacccacccagggaaaaa gaagggctcgccgaaaaatcaaagttatctccaggctcgcgcatcccaccgagcggngacttctctccaccacttttcattttaaccctcggggtacg ggattggccaaaggacccaaaggtatgtRcgaatgatactaacataacatagaacaRttcaggaggacccRgcttggagggtaccgagctcagaa aaaatgactgctccaaagaagaagcgtaaggtaccggtaatgaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggctgctatccc gttcaacactctggctgaccatucggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccttgagcatgagtcttacgagatgggtgaagcacgcttccgcaa gatgtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgcatcaa cgactggRtgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccRccagRcctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatca ccaRaagaccactctggcRgcctaaccagtgctgacaatacaaccgRcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggccaRgaggacgaggctcg cttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtcUcaagaaagcattta tgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtacgct gcatcgagatgctcaRgagtcaaccggaatggRagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcacct gaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgttccaaccttgcgtagttcctcctaagccgtggactggcatt actggtggtggctaRgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagcactgatgcgctacgaagacgtRacatgcct gaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtccUgcggtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcat tgtccggtcgaggacatccctgcgaRgagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaa cgtgctgccgctgctgtgtaccgcaaggacagggctcgcaagtctcgccgtatcagccttgagttcatgcRgagcaagccaataagtttgctaiccat aaggccatctggttcccttacaacatggactggcgcggtcgtgtttacgccgtgtcaatgRcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggactgctt acgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgauaggttccgttccctg agcgcatcaagncangaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactggagaacacnggtgggctgagcaagattctccgRct gcttccttgcgttctgctngagücgctggggtacagcaccacggcctgagctataactgctcccttccgctggcgtttgacgggtcngctctggcatc cagcacnctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgcgcggttaacngcttcctagtgagaccgttcaggacatctacgggattgRgctaag aaagtcaacgagaRctacaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaa gtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggctggctcacggtgttactcgcagtgtgactaagcgttcagtcatgacgctggcttacgggtc caaagagRcggcRccgtcaacaagtgctggaagataccaRcagccagctaRgaRccggcaagggtccgatgRcactcagccgaatcaggctg ctggatacatggctaagctgamgggaatctgtgagcgtgacggtggtagctgcggngaagcaatgaactggcrtaagtctgctgcuagctgctgg ctgctgaggtcaaagaüagaagactggagagaRcRcgcaagcgttgcgctgtgcangggtaactcctgatggtRccctgcgtggcaggaataca agaagcctaRcagacgcgcRgaacctgatgttcctcggtcagttccgcRacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgagaRgatgcacaca aacaggagtctggtatcgctcctaacmgtacacagccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcga atcrtttgcactgancacgactccncggtaccartccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtctt gtgatgtactggctgacnctacgaccagRcgctgaccagRgcacgagtctcaaRggacaaaatgccagcacttccggctaaaggtaacRgaacct ccgtgacatcRagagtcggacRcgcgRcgcgtaagaaRccaactgagcgccggtcgctaccattaccaacttgtctggtgtcaaaaataataggg gccgctgtcatcagagtaagtttaaactgagRcUctaactaacgagtaatatttaaatRtcagcatctcgcgcccgtgcctctgacRctaagtccaaR actcncaacatccctacatgctcmctccctgtgctcccaccccctatttttgttattatcaaaaaaacttcttcttaatnctttgtttmagcttcttttaagtca cctctaacaatgaaartgtgtagattcaaaaatagaattaattcgtaataaaaagtcgaaaaaaattgtgctccctccccccattaataataattctatccca aaatctacacaatgnctgtgtacacncnaigmttmacttctgataaattttmtgaaacatcatagaaaaaaccgcacacaaaataccttatcatatgtt acgmcagrttatgaccgcaattraatncttcgcacgtctgggcctctcatgacgtcaaatcatgctcatcgigaaaaagtntggagtatttttggaatttn caatcaagtgaaagtnatgaaaRaaRRcctgcRttgcRtttgggggrttcccctaRgmgtcaagagRtcgaggacggcgttmcttgctaaaatca caagtaRgatgagcacgatgcaagaaagatcggaagaaggntgggRtgaggctcagtggaaggtgagtagaagRgataaRtgaaagtggagta gtgtctatggggtTTttgccttaaatgacagaatacattcccaatataccaaacataactgtrtcctactagtcggccgtacgggccctttcgtctcgcgcg mcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcRgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtca
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tgcacacagcccagcRggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaa aggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtc gggtttcgccacctctgacngagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttc ctggccttRgctggcctntgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtatuccgcctngagtgagctgataccgctcgccg cagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattca ttaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggcR tacactttatgcRccggctcgtatgngtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctgtaagttt aaacatgatcttactaactaactanctcatttaaattttcagagcttaaaaatggctgaaatcactcacaacgatggatacgctaacaacnggaaatgaa
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PGN4 00: SEQUENCE ID NO 5
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pAS2-cyh2-HA+bothT7-final: SEQUENCE ID NO 8
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Claims (13)

1. In einen Mikroorganismus transferierte Bibliothek von C. elegans cDNA, C. elegans cDNA-Fragmenten und/oder von PCR-Produkten, abgeleitet von C. elegans, erhalten durch ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfaßt:
Transformation eines Mikroorganismus mit einem oder mehreren Expressionsvektoren, der cDNA (cDNAs), ein oder mehrere cDNA-Fragmente und/oder PCR-Produkte, abgeleitet von C. elegans, inseriert in die multiple Klonierungsstelle des Expressionsvektors aufweist, wobei der Expressionsvektor einen Promotor oder Promotoren umfaßt, die relativ zu der multiplen Klonierungsstelle orientiert sind, so daß der Promotor oder die Promotoren in der Lage sind, die Transkription der cDNA, des cDNA- Fragments oder der PCR-Produkte, inseriert in die multiple Klonierungsstelle, in eine doppelsträngige RNA bei Bindung eines geeigneten Transkriptionsfaktors an den Promotor oder die Promotoren zu initiieren.
2. Bibliothek gemäß Anspruch 1, wobei der Expressionsvektor zwei identische Promotoren umfaßt, die die cDNA, die cDNA-Fragmente und/oder die PCR-Produkte flankieren.
3. Bibliothek gemäß Anspruch 1, wobei der Expressionsvektor die cDNA, cDNA-Fragmente und/oder PCR-Produkte in einer Sinn- und einer Antisinn-Orientierung relativ zum Promotor umfaßt.
4. Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Promotor oder die Promotoren von der Art sind, daß sie in der Lage sind, die Transkription der cDNA, cDNA- Fragmente und/oder PCR-Produkte zu doppelsträngiger RNA bei Bindung einer Phagen-Polymerase und insbesondere T7 RNA-Polymerase daran zu initiieren.
5. Bibliothek gemäß Anspruch 4, wobei der Promotor (die Promotoren) T7-, T3- oder SP6-Promotor (Promotoren) ist (sind) und insbesondere T7-Promotor (Promotoren).
6. Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Mikroorganismus angepaßt ist um den Transkriptionsfaktor zu exprimieren.
7. Bibliothek gemäß Anspruch 6, wobei der Mikroorganismus angepaßt ist um T7-Polymerase zu exprimieren.
8. Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Mikroorganismus ein Bakterium ist.
9. Bibliothek gemäß Anspruch 8, wobei der Mikroorganismus E. coli ist.
10. Bibliothek gemäß Anspruch 9, wobei der E. coli-Stamm ein RNAse III negativer Stamm ist.
11. Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Bibliothek in hierarchische Pools organisiert ist.
12. In einen Mikroorganismus transformierte Bibliothek von C. elegans cDNA, cDNA-Fragmenten und/oder PCR-Produkten, abgeleitet von C. elegans-Genen, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.
13. Futter für C. elegans, enthaltend eine Bibliothek gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche.
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Families Citing this family (257)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
ATE526405T1 (de) 1998-03-20 2011-10-15 Commw Scient Ind Res Org Synthetische gene und genetische zusammensetzungen diesen enthaltend
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
EP2314700A1 (de) * 1999-01-28 2011-04-27 Medical College of Georgia Research Institute, Inc Zusammensetzung und Verfahren zur in vivo und in vitro Abschwächung der Genexpression mittels dobbelsträngiger RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
US7601494B2 (en) 1999-03-17 2009-10-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method of screening candidate compounds for susceptibility to biliary excretion
KR20010112944A (ko) * 1999-04-21 2001-12-22 이곤 이 버그 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 억제하기 위한 방법 및조성물
US20040138168A1 (en) * 1999-04-21 2004-07-15 Wyeth Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US6924109B2 (en) * 1999-07-30 2005-08-02 Agy Therapeutics, Inc. High-throughput transcriptome and functional validation analysis
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9927444D0 (en) * 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
GB9930691D0 (en) * 1999-12-24 2000-02-16 Devgen Nv Improvements relating to double-stranded RNA inhibition
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US8202846B2 (en) 2000-03-16 2012-06-19 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for RNA interference
JP2003526367A (ja) 2000-03-16 2003-09-09 ジェネティカ インコーポレイテッド Ｒｎａ干渉の方法とｒｎａ干渉組成物
KR20080023768A (ko) 2000-03-30 2008-03-14 화이트헤드 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치 Ｒｎａ 간섭의 ｒｎａ 서열 특이적인 매개체
US7083947B2 (en) 2000-05-19 2006-08-01 Devgen Nv Assay techniques using nematode worms
GB2362383B (en) * 2000-05-19 2003-12-31 Devgen Nv Gene expression system
GB0012233D0 (en) * 2000-05-19 2000-07-12 Devgen Nv Vector constructs
GB0012229D0 (en) 2000-05-19 2000-07-12 Devgen Nv Lipid uptake assays
WO2001096584A2 (en) * 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
US20030190635A1 (en) * 2002-02-20 2003-10-09 Mcswiggen James A. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering RNA
KR100909681B1 (ko) 2000-12-01 2009-07-29 막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우. Ｒｎａ 간섭을 매개하는 작은 ｒｎａ 분자
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
MXPA03006624A (es) * 2001-01-25 2004-11-12 Virxsys Corp Metodos y composiciones para la identificacion de la funcion de genes.
EP1354035B1 (de) 2001-01-26 2016-08-24 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Verfahren und mittel zur herstellung eines wirksamen silencing-konstrukts mit rekombinationsklonierung
CA2369944A1 (en) 2001-01-31 2002-07-31 Nucleonics Inc. Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
CA2434881A1 (en) * 2001-02-02 2002-08-15 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Method for identifying functional nucleic acids
US9994853B2 (en) 2001-05-18 2018-06-12 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US7517864B2 (en) 2001-05-18 2009-04-14 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003070888A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (chk-1) gene expression using short interfering nucleic acid
EP3231445A1 (de) 2001-05-18 2017-10-18 Sirna Therapeutics, Inc. Konjugate und zusammensetzungen zur zellulären verabreichung
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
ES2606290T3 (es) 2001-07-12 2017-03-23 University Of Massachusetts Producción in vivo de ARN de interferencia pequeños que median el silenciamiento génico
US7612194B2 (en) * 2001-07-24 2009-11-03 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof
ATE465258T1 (de) * 2001-08-31 2010-05-15 Riken Pflanzensystem zur umfassenden genfunktionsanalyse unter verwendung einer vollängen-cdna
US7745418B2 (en) 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
DE10163098B4 (de) 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
US20030150017A1 (en) * 2001-11-07 2003-08-07 Mesa Jose Ramon Botella Method for facilitating pathogen resistance
DE10202419A1 (de) 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
CA2474910A1 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Sequitur, Inc. Oligonucleotide compositions with enhanced efficiency
WO2003064621A2 (en) * 2002-02-01 2003-08-07 Ambion, Inc. HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
EP1472265A4 (de) * 2002-02-20 2005-06-15 Sirna Therapeutics Inc DURCH RNA-INTERFERENZ VERMITTELTE INHIBIERUNG DER GENEXPRESSION VON POLYCOMB GROUP PROTEIN EZH2 UNTER ANWENDUNG VON KURZER INTERFERIERENDER NUKLEINSÄURE (siNA)
EP1474433A4 (de) * 2002-02-20 2005-02-23 Sirna Therapeutics Inc DURCH RNA-INTERFERENZ VERMITTELTE TARGET-LOKALISIERUNG UND TARGET-VALIDIERUNG MIT KURZER INTERFERIERENDER NUKLEINSÄURE (siNA)
EP1432724A4 (de) 2002-02-20 2006-02-01 Sirna Therapeutics Inc Durch rna-interferenz vermittelte inhibierung von map-kinase-genen
AU2003219833A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
AU2003216255A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MDR P-GLYCOPROTEIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7667029B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (CHK-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003228667A1 (en) * 2002-04-22 2003-12-19 Sirna Therapeutics Inc. Nucleic acid mediated disruption of hiv fusogenic peptide interactions
US20040180438A1 (en) 2002-04-26 2004-09-16 Pachuk Catherine J. Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity
AU2003239851A1 (en) * 2002-05-08 2003-11-11 Xantos Biomedicine Ag Expression constructs for producing double-stranded (ds) rna and the use thereof
AU2003239706A1 (en) * 2002-05-23 2003-12-12 Devgen Nv Method for determining the influence of a compound on cholesterol transport
WO2004001044A1 (en) * 2002-06-21 2003-12-31 Sinogenomax Company Ltd. Randomised dna libraries and double-stranded rna libraries, use and method of production thereof
US7803984B2 (en) * 2002-07-10 2010-09-28 Kansas State University Research Foundation Compositions and methods for controlling plant parasitic nematodes
US7655790B2 (en) 2002-07-12 2010-02-02 Sirna Therapeutics, Inc. Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives
US7452987B2 (en) 2002-08-05 2008-11-18 Silence Therapeutics Aktiengesellschaft (Ag) Interfering RNA molecules
US8729036B2 (en) 2002-08-07 2014-05-20 University Of Massachusetts Compositions for RNA interference and methods of use thereof
AU2003264727A1 (en) * 2002-09-04 2004-03-29 Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin Compositions and methods for tissue specific or inducible inhibition of gene expression
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003298733B2 (en) 2002-11-27 2009-06-18 Agena Bioscience, Inc. Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery
EP1597361A2 (de) * 2002-12-23 2005-11-23 Devgen NV Zur entwicklung von verbindungen zur vorbeugung und/oder behandlung von stoffwechselkrankheiten geeignete kinasesequenzen sowie solche kinasesequenzen codierende nukleotidsequenzen
EP1622572B1 (de) 2003-04-30 2017-12-20 Sirna Therapeutics, Inc. Konjugate und zusammensetzungen für die zelluläre abgabe
IL155783A (en) 2003-05-05 2010-11-30 Technion Res & Dev Foundation Multicellular systems of multi-potential embryonic human stem cells and cancer cells and their use
EP1633784B1 (de) 2003-05-09 2011-07-13 Diadexus, Inc. Ovr110-antikörperzusammensetzungen und anwendungsverfahren
US20070092910A1 (en) * 2003-06-17 2007-04-26 Devgen Nv Alcohol dehydrogenase sequences useful for developing compounds for the prevention and/or treatment of metabolic diseases
WO2005024068A2 (en) 2003-09-05 2005-03-17 Sequenom, Inc. Allele-specific sequence variation analysis
ATE526407T1 (de) * 2003-11-17 2011-10-15 Commw Scient Ind Res Org Insektenresistenz durch inhibierung von genexpression
CN102989009B (zh) 2003-12-31 2015-06-03 宾夕法尼亚州研究基金会 预测并克服对卵巢癌化疗的抗性的方法及预测结肠癌发生的方法
ATE452188T1 (de) 2004-02-10 2010-01-15 Sirna Therapeutics Inc Rna-interferenz-vermittelte hemmung der genexpression unter verwendung multifunktioneller sina (short interfering nucleic acid)
WO2005078848A2 (en) 2004-02-11 2005-08-25 University Of Tennessee Research Foundation Inhibition of tumor growth and invasion by anti-matrix metalloproteinase dnazymes
US7622301B2 (en) * 2004-02-24 2009-11-24 Basf Plant Science Gmbh Compositions and methods using RNA interference for control of nematodes
AU2005230936B2 (en) 2004-03-26 2010-08-05 Agena Bioscience, Inc. Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis
US7608394B2 (en) * 2004-03-26 2009-10-27 Sequenom, Inc. Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation
HRP20130782T1 (en) 2004-04-02 2013-09-30 The Regents Of The University Of California, Office Of Technology Transfer Methods and compositions for treating and preventing disease associated with alpha v beta 5 integrin
CA2762011C (en) 2004-04-09 2019-05-07 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for control of insect infestations in plants
EP1747022A4 (de) 2004-04-23 2010-03-31 Univ Columbia Hemmung von haarloser protein mrna
US10508277B2 (en) 2004-05-24 2019-12-17 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
WO2006009575A1 (en) 2004-06-22 2006-01-26 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois METHODS OF INHIBITING TUMOR CELL PROLIFERATION WITH FOXM1 siRNA
US7968762B2 (en) 2004-07-13 2011-06-28 Van Andel Research Institute Immune-compromised transgenic mice expressing human hepatocyte growth factor (hHGF)
EP1782321A4 (de) 2004-07-23 2009-11-04 Univ North Carolina Verfahren und materialien zur bestimmung von schmerzempfindlichkeit und vorhersage und behandlung zugehöriger störungen
US20080255065A1 (en) 2004-08-18 2008-10-16 Genesense Technologies, Inc. Small Interfering Rna Molecules Against Ribonucleotide Reductase and Uses Thereof
CA2581440C (en) * 2004-09-24 2016-11-29 J.R. Simplot Company Gene silencing
US20060247197A1 (en) 2004-10-04 2006-11-02 Van De Craen Marc Method for down-regulating gene expression in fungi
CN101056534B (zh) * 2004-10-13 2012-10-10 乔治亚大学研究基金会公司 抗线虫的转基因植物
KR20070085421A (ko) 2004-10-21 2007-08-27 벤간자 아이엔씨 식물들의 해충들 및 병원균들에 대한 내성을 제공하기 위한방법들 및 물질들
WO2006045591A2 (en) * 2004-10-25 2006-05-04 Devgen N.V. Method and constructs for delivering double stranded rna to pest organisms
US20100170000A9 (en) 2004-10-25 2010-07-01 Devgen Nv Rna constructs
DK1841793T3 (da) 2005-01-07 2010-07-19 Diadexus Inc Ovr110-antistofsammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US8088976B2 (en) * 2005-02-24 2012-01-03 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of plant pest infestation and compositions thereof
US8519225B2 (en) 2006-02-10 2013-08-27 Monsanto Technology Llc Identification and use of target genes for control of plant parasitic nematodes
DE202005004135U1 (de) * 2005-03-11 2005-05-19 Klocke Verpackungs-Service Gmbh Mehrkomponentenverpackung mit Applikator
CA2603730A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
CA2605508A1 (en) 2005-05-12 2006-11-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Blockade of pin1 prevents cytokine production by activated immune cells
EP2500429A3 (de) 2005-05-31 2015-10-28 Devgen N.V. RNAi zur Kontrolle von Insekten und Spinnen
US8703769B2 (en) 2005-07-15 2014-04-22 The University Of North Carolina At Chapel Hill Use of EGFR inhibitors to prevent or treat obesity
BRPI0616181B1 (pt) 2005-09-16 2024-03-05 Monsanto Technology Llc Construção de polinucleotídeo isolada, sequência de ribonucleotídeo de fita dupla, microrganismo transgênico, seu método de produção, e métodos para controle de infestação por coleóptero praga, para melhorar o rendimento e a tolerância a estiagem de um cultivo, e para produção de um produto comercial, alimento ou ração
BRPI0615791B1 (pt) 2005-09-16 2018-04-03 Devgen Nv Rna de fita dupla isolado compreendendo fitas complementares aneladas, método de controle de infestação de peste e uso de uma ração artificial compreendendo a sequência de ribonucleotídeo de fita dupla para tratar infestação de plantas por insetos
MX348513B (es) 2005-09-16 2017-06-16 Devgen Nv Metodos para controlar plagas utilizando arni.
CN101268194A (zh) 2005-09-20 2008-09-17 巴斯福植物科学有限公司 使用ta-siRNA调控基因表达的方法
US9286469B2 (en) * 2005-12-16 2016-03-15 Cisco Technology, Inc. Methods and apparatus providing computer and network security utilizing probabilistic signature generation
WO2007087153A2 (en) 2006-01-06 2007-08-02 University Of Georgia Research Foundation Cyst nematode resistant transgenic plants
EP2377939A3 (de) 2006-01-12 2012-01-18 deVGen N.V. Verfahren auf Basis transgener Pflanzen für Pflanzenschädlinge mit RNAi
US8906876B2 (en) 2006-01-12 2014-12-09 Devgen Nv Methods for controlling pests using RNAi
US20090285784A1 (en) 2006-01-12 2009-11-19 Devgen Nv DSRNA As Insect Control Agent
US20080022423A1 (en) * 2006-02-03 2008-01-24 Monsanto Technology Llc IN PLANTA RNAi CONTROL OF FUNGI
WO2007095496A2 (en) * 2006-02-13 2007-08-23 Monsanto Technology Llc Selecting and stabilizing dsrna constructs
WO2007104570A2 (en) * 2006-03-16 2007-09-20 Devgen N.V. Nematode control
WO2007123777A2 (en) 2006-03-30 2007-11-01 Duke University Inhibition of hif-1 activation for anti-tumor and anti-inflammatory responses
PL216037B1 (pl) * 2006-06-09 2014-02-28 Inst Biotechnologii I Antybiotykow Kaseta ekspresyjna, zastosowanie kasety ekspresyjnej, wektor, komórka gospodarza oraz sposób otrzymywania polipeptydu
US7981866B2 (en) 2006-07-11 2011-07-19 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey MG53 compositions and methods of use
AU2007279205B2 (en) 2006-07-28 2013-09-26 Children's Memorial Hospital Methods of inhibiting tumor cell aggressiveness using the microenvironment of human embryonic stem cells
JP5391073B2 (ja) 2006-11-27 2014-01-15 ディアデクサス インコーポレーテッド Ｏｖｒ１１０抗体組成物および使用方法
CN101195821A (zh) * 2006-12-04 2008-06-11 中国科学院上海生命科学研究院 利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法
EP2913341A1 (de) 2006-12-22 2015-09-02 University of Utah Research Foundation Verfahren für den Nachweis von Augenerkrankungen und leiden sowie ihre Behandlung
CN101641010A (zh) 2007-01-26 2010-02-03 路易斯维尔大学研究基金会公司 用作疫苗的外来体组分的修饰
US20080184391A1 (en) * 2007-01-29 2008-07-31 Kuppuswamy Subramaniam Pathogen resistant transgenic plants, associated nucleic acids and techniques involving the same
AU2008218813B2 (en) * 2007-02-20 2014-04-17 Monsanto Technology, Llc Invertebrate microRNAs
HUE027018T2 (en) 2007-03-21 2016-08-29 Brookhaven Science Ass Llc Combination hairpin antisense compositions and methods for modulating expression
WO2009014565A2 (en) 2007-04-26 2009-01-29 Ludwig Institute For Cancer Research, Ltd. Methods for diagnosing and treating astrocytomas
EP2607477B1 (de) 2007-05-03 2020-09-23 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Multipotente stammzellen und ihre verwendung
US8097422B2 (en) 2007-06-20 2012-01-17 Salk Institute For Biological Studies Kir channel modulators
CN107129957A (zh) * 2007-06-29 2017-09-05 北京强新生物科技有限公司 促使长dsRNA可用于哺乳动物和其他所选动物细胞中的基因寻靶
US9689031B2 (en) 2007-07-14 2017-06-27 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids
WO2009012263A2 (en) 2007-07-18 2009-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tissue-specific micrornas and compositions and uses thereof
CN101932708A (zh) 2007-08-14 2010-12-29 联邦科学工业研究组织 改进的基因沉默方法
KR101142209B1 (ko) 2007-09-22 2012-05-04 재단법인서울대학교산학협력재단 섭취 ＲＮＡｉ를 이용한 꼬마선충에서 두 유전자의동시발현 억제방법
US7968525B1 (en) 2007-12-03 2011-06-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Use of RNA interference to validate new termiticide target sites and a method of termite control
WO2009123764A2 (en) 2008-04-04 2009-10-08 Calando Pharmaceuticals, Inc. Compositions and use of epas1 inhibitors
CN107267514A (zh) 2008-04-10 2017-10-20 孟山都技术公司 用于根结线虫防治的方法和组合物
GB0807018D0 (en) 2008-04-17 2008-05-21 Fusion Antibodies Ltd Antibodies and treatment
US9289475B2 (en) 2008-11-06 2016-03-22 The Johns Hopkins University Treatment of chronic inflammatory respiratory disorders
EP2687609B1 (de) 2008-11-10 2017-01-04 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Behandlung von soliden Tumoren
DK2379722T3 (da) 2008-12-16 2017-01-02 C-Lecta Gmbh Ekspressionsvektor
JP2012513464A (ja) 2008-12-23 2012-06-14 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニヴァーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク ホスホジエステラーゼ阻害剤及びその使用
WO2010074783A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Phosphodiesterase inhibitors and uses thereof
EP2408915A2 (de) 2009-03-19 2012-01-25 Merck Sharp&Dohme Corp. Rna-interferenz-vermittelte hemmung der genexpression von gata-bindungsprotein 3 (gata3) unter verwendung von sina (short interfering nucleic acid)
KR20110137799A (ko) 2009-03-19 2011-12-23 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 짧은 간섭 핵산 (ｓｉＮＡ) 서열 목록을 사용한 ＢＴＢ 및 ＣＮＣ 상동체 1, 염기성 류신 지퍼 전사 인자 1 (ＢＡＣＨ1) 유전자 발현의 ＲＮＡ 간섭 매개 억제
EP2408916A2 (de) 2009-03-19 2012-01-25 Merck Sharp&Dohme Corp. Rna-interferenz-vermittelte hemmung der genexpression von ctgf (connective tissue growth factor) unter verwendung von sina (short interfering nucleic acid)
US20120035247A1 (en) 2009-03-19 2012-02-09 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Signal Transducer and Activator of Transcription 6 (STAT6) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
EP2411019A2 (de) 2009-03-27 2012-02-01 Merck Sharp&Dohme Corp. Rna-interferenz-vermittelte hemmung der signal transducer and activator of transcription 1 (stat1) gen-expression mittels sina (short interfering nucleic acid)
US20120010272A1 (en) 2009-03-27 2012-01-12 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Apoptosis Signal-Regulating Kinase 1 (ASK1) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
AU2010229847A1 (en) 2009-03-27 2011-10-13 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of the intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1)gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
JP2012521764A (ja) 2009-03-27 2012-09-20 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いた胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
WO2010111468A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF THE NERVE GROWTH FACTOR BETA CHAIN (NGFß) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (SINA)
US20100257634A1 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 Venganza Inc. Bioassay for gene silencing constructs
US8283332B2 (en) 2009-04-17 2012-10-09 University Of Louisville Research Foundation, Inc. PFKFB4 inhibitors and methods of using the same
EP2258858A1 (de) 2009-06-05 2010-12-08 Universitätsklinikum Freiburg Für LSD1 transgenisches Tiermodell für Krebs
HUE026708T2 (en) 2009-07-14 2016-07-28 Mayo Foundation Peptide-mediated, non-covalent delivery of active substances in blood glucose
US10087252B2 (en) 2009-07-24 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with αvβ5 integrin
CA2771178A1 (en) 2009-08-28 2011-03-03 Karen E. Broglie Compositions and methods to control insect pests
EP2509628B1 (de) 2009-12-07 2017-10-25 The Johns Hopkins University Sr-bi als ein prädiktor der menschlichen weiblichen unfruchtbarkeit und der reaktion auf behandlung
TWI611021B (zh) 2009-12-09 2018-01-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ４７表現之調節
US10640457B2 (en) 2009-12-10 2020-05-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Histone acetyltransferase activators and uses thereof
WO2011072243A1 (en) 2009-12-10 2011-06-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Histone acetyltransferase activators and uses thereof
EP3406720A1 (de) 2009-12-18 2018-11-28 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Organische zusammensetzungen zur behandlung von hsf1-bedingten erkrankungen
MX348474B (es) 2009-12-23 2017-06-14 Novartis Ag * Lipidos, composiciones de lipido, y metodos de uso de los mismos.
ES2636671T3 (es) 2010-01-26 2017-10-06 National Jewish Health Métodos para predicción del riesgo, diagnóstico, pronóstico de trastornos pulmonares
JP2013519869A (ja) 2010-02-10 2013-05-30 ノバルティス アーゲー 筋肉成長のための方法および化合物
US9273316B2 (en) 2010-05-21 2016-03-01 Peptimed, Inc. Reagents and methods for treating cancer
GB201009601D0 (en) 2010-06-08 2010-07-21 Devgen Private Ltd Method for down-grading gene expression in fungi
WO2011163466A1 (en) 2010-06-23 2011-12-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Regulation of skin pigmentation by neuregulin-1 (nrg-1)
CN103068980B (zh) 2010-08-02 2017-04-05 瑟纳治疗公司 使用短干扰核酸（siNA）的RNA干扰介导的联蛋白（钙粘蛋白关联蛋白质），β1（CTNNB1）基因表达的抑制
LT2606134T (lt) 2010-08-17 2019-07-25 Sirna Therapeutics, Inc. Hepatito b viruso (hbv) geno raiškos slopinimas, tarpininkaujant rnr interferencijai naudojant mažą interferuojančią nukleorūgštį (sina)
KR20130137160A (ko) 2010-08-24 2013-12-16 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 내부의 비－핵산 스페이서를 함유하는 단일－가닥 ＲＮＡｉ 작용제
WO2012027467A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PROLYL HYDROXYLASE DOMAIN 2 (PHD2) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20140134231A1 (en) 2010-10-11 2014-05-15 Sanford-Burnham Medical Research Institute Mir-211 expression and related pathways in human melanoma
CN103391784A (zh) 2010-10-15 2013-11-13 纽约市哥伦比亚大学理事会 肥胖症-相关的基因和它们的蛋白和其用途
EP2632472B1 (de) 2010-10-29 2017-12-13 Sirna Therapeutics, Inc. Durch rna-interferenz vermittelte inhibition einer genexpression unter verwendung von short-interfering-nukleinsäuren (sina)
AU2011323508B2 (en) 2010-11-01 2017-04-27 Peptimed, Inc. Compositions of a peptide targeting system for treating cancer
CN103370076A (zh) 2010-11-02 2013-10-23 纽约市哥伦比亚大学托管会 治疗毛发脱落疾病的方法
US9198911B2 (en) 2010-11-02 2015-12-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for treating hair loss disorders
AU2011338682B2 (en) 2010-12-06 2017-04-27 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded oligonucleotide compounds comprising threose modifications
US9150926B2 (en) 2010-12-06 2015-10-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Diagnosis and treatment of adrenocortical tumors using human microRNA-483
CN106432137B (zh) 2010-12-22 2020-11-06 纽约市哥伦比亚大学理事会 组蛋白乙酰转移酶调节剂和其用途
CN103492572A (zh) 2011-03-03 2014-01-01 夸克医药公司 用于治疗肺疾病和损伤的组合物和方法
TWI658830B (zh) 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
MX2014002535A (es) 2011-09-02 2015-07-17 Univ Columbia Inhibidores de camkii, ip3r, calcineurina, p38 y mk2/3 para tratar las alteraciones metabolicas de la obesidad.
US9352312B2 (en) 2011-09-23 2016-05-31 Alere Switzerland Gmbh System and apparatus for reactions
LT2766393T (lt) 2011-10-14 2018-10-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Antikūnai prieš htra1 ir jų naudojimo būdai
CA2852917C (en) 2011-10-18 2020-07-07 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Amine cationic lipids and uses thereof
BR112014010769B1 (pt) 2011-11-03 2021-08-03 Quark Pharmaceuticals, Inc Uso de um composto de rna de fita dupla para preparar um medicamento para tratar doença de ménière
CN104334191A (zh) 2012-03-29 2015-02-04 纽约市哥伦比亚大学托管会 治疗毛发脱落疾病的方法
BR112014025983A2 (pt) 2012-04-20 2018-07-03 Futuragene Israel Ltd molécula de ácido ribonucleico, dsrna, vetor, célula hospedeira, tecido vegetal, ácido nucleico e métodos de produção de plantas e de inibição de infestação de pragas
US20150082490A1 (en) 2012-04-23 2015-03-19 Futuragene Israel Ltd. Glycaspis Brimblecombei Control Agents
EP3453762B1 (de) 2012-05-02 2021-04-21 Sirna Therapeutics, Inc. Sina-zusammensetzungen
WO2014018554A1 (en) 2012-07-23 2014-01-30 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ptprs and proteoglycans in autoimmune disease
WO2014053910A2 (en) 2012-10-03 2014-04-10 Futuragene Israel Ltd. Gall wasp control agents
US9540439B2 (en) 2012-10-08 2017-01-10 St. Jude Children's Research Hospital Therapies based on control of regulatory T cell stability and function via a neuropilin-1:semaphorin axis
US9920316B2 (en) 2013-03-14 2018-03-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
EP2968551B1 (de) 2013-03-15 2021-05-05 The Trustees of Columbia University in the City of New York Fusionsproteine und verfahren dafür
EP2810952A1 (de) 2013-06-03 2014-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Neuartige Schädlingsbekämpfungsverfahren
EP3016716B1 (de) 2013-07-03 2020-06-17 City of Hope Antikrebskombinationen einer bakterienzelle und eines penetrationsmittel für tumore
EP3055426B1 (de) 2013-10-09 2019-06-19 The United States of America as represented by The Secretary Department of Health and Human Services Nachweis von hepatitis delta virus (hdv) zur diagnose und behandlung von sjögren-syndrom und lymphom
JP6672156B2 (ja) 2013-11-11 2020-03-25 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 親油性部分にコンジュゲートされたミオスタチン低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）の全身性送達
US9682123B2 (en) 2013-12-20 2017-06-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating metabolic disease
JP6372930B2 (ja) 2013-12-27 2018-08-15 国立大学法人高知大学 悪性腫瘍の治療薬
CN106794141B (zh) 2014-07-16 2021-05-28 诺华股份有限公司 将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法
WO2016059187A1 (en) * 2014-10-16 2016-04-21 Universite De Strasbourg Method of capturing and identifying novel rnas
EP3218497A1 (de) 2014-11-12 2017-09-20 NMC Inc. Transgene pflanzen mit manipulierter redoxempfindlicher modulation von komplexen pigmenten fotosynthetischer antennen und verfahren zur herstellung davon
WO2016105517A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fusion proteins and methods thereof
US10264976B2 (en) 2014-12-26 2019-04-23 The University Of Akron Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging
US10781446B2 (en) 2015-03-09 2020-09-22 University Of Kentucky Research Foundation RNA nanoparticle for treatment of gastric cancer
US10584144B2 (en) 2015-03-09 2020-03-10 University Of Kentucky Research Foundation RNA nanoparticles for brain tumor treatment
WO2016145008A2 (en) 2015-03-09 2016-09-15 University Of Kentucky Research Foundation Mirna for treatment of breast cancer
US11279768B1 (en) 2015-04-03 2022-03-22 Precision Biologics, Inc. Anti-cancer antibodies, combination therapies, and uses thereof
CN107614685B (zh) 2015-04-17 2021-10-19 肯塔基大学研究基金会 Rna纳米颗粒及其使用方法
EP3289104B1 (de) 2015-04-29 2020-11-04 New York University Verfahren zur behandlung von hochwertigen gliomen
EP3313420B1 (de) 2015-06-25 2024-03-13 The Children's Medical Center Corporation Verfahren und zusammensetzungen in bezug auf hämatopoetische stammzellenexpansion, -anreicherung und -pflege
US10072065B2 (en) 2015-08-24 2018-09-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Peptide-mediated delivery of immunoglobulins across the blood-brain barrier
WO2017044807A2 (en) 2015-09-09 2017-03-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reduction of er-mam-localized app-c99 and methods of treating alzheimer's disease
US11285142B2 (en) 2015-09-29 2022-03-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and methods for identifying and treating dystonia disorders
ES2870141T3 (es) 2015-10-30 2021-10-26 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-HtrA1 y procedimientos de uso de los mismos
KR102740699B1 (ko) 2015-12-13 2024-12-09 닛토덴코 가부시키가이샤 높은 활성 및 감소한 오프 타겟을 위한 sirna 구조
US11072777B2 (en) 2016-03-04 2021-07-27 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods and compositions for ex vivo expansion of very small embryonic-like stem cells (VSELs)
WO2017161001A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion
WO2017173327A1 (en) 2016-03-31 2017-10-05 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Endomucin inhibitor as an anti-angiogenic agent
US10933081B2 (en) 2016-09-21 2021-03-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Myostatin iRNA compositions and methods of use thereof
CN107858405B (zh) * 2017-10-12 2021-09-24 华南农业大学 一种测定外源dsRNA对瓢虫毒性影响的方法
WO2019199673A1 (en) 2018-04-09 2019-10-17 President And Fellows Of Harvard College Modulating nuclear receptors and methods of using same
CN109183158B (zh) * 2018-08-31 2021-11-23 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法
CN109266677B (zh) * 2018-08-31 2021-11-23 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法
CN113015746A (zh) 2018-09-19 2021-06-22 拉荷亚免疫研究所 在类风湿性关节炎中的ptprs和蛋白聚糖
TWI840449B (zh) 2018-11-16 2024-05-01 日商日東電工股份有限公司 用於惡性腫瘤之rna干擾輸送配方及方法
CN113287013B (zh) * 2019-01-04 2025-04-15 国立大学法人京都大学 溃疡性大肠炎以及原发性硬化性胆管炎的检查方法
US12215382B2 (en) 2019-03-01 2025-02-04 The General Hospital Corporation Liver protective MARC variants and uses thereof
CN110229839B (zh) * 2019-06-04 2021-06-08 中国农业大学 一种提升大肠杆菌dsRNA表达产率的方法
CN110746497A (zh) * 2019-11-18 2020-02-04 维塔恩(广州)医药有限公司 肺炎衣原体相关抗原短肽及其应用
CN110804088A (zh) * 2019-11-18 2020-02-18 维塔恩(广州)医药有限公司 巨细胞病毒相关抗原短肽及其应用
EP3825408A1 (de) 2019-11-19 2021-05-26 FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur insektenschädlingsbekämpfung für mehrere arten
CN114828959B (zh) 2019-12-18 2024-04-02 诺华股份有限公司 3-(5-甲氧基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
EP4077676A1 (de) 2019-12-18 2022-10-26 Novartis AG Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von hämoglobinopathien
CA3164168A1 (en) 2020-01-08 2021-07-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of fibrodysplasia ossificans progressiva
US20210222128A1 (en) 2020-01-22 2021-07-22 Massachusetts Institute Of Technology Inducible tissue constructs and uses thereof
WO2021173965A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Massachusetts Institute Of Technology Identification of variable influenza residues and uses thereof
CN113638055B (zh) * 2020-05-22 2023-07-07 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 一种制备双链rna测序文库的方法
TW202241479A (zh) 2020-12-30 2022-11-01 美商安迅生物製藥公司 遞送外來抗原之溶瘤病毒及表現靶向外來抗原之嵌合受體之經工程化免疫細胞之組合療法
EP4359527A2 (de) 2021-06-23 2024-05-01 Novartis AG Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von hämoglobinopathien
WO2023012165A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Universite De Montpellier Compositions and methods for treating cmt1a or cmt1e diseases with rnai molecules targeting pmp22
CN113533007B (zh) * 2021-08-06 2023-11-24 青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司 一种抗体染色标记装置及其方法
EP4416292A2 (de) 2021-10-14 2024-08-21 Arsenal Biosciences, Inc. Immunzellen mit koexprimierten shrnas und logik-gate-systemen
TW202417626A (zh) 2022-09-13 2024-05-01 美商亞森諾生物科學公司 具有共表現的ｔｇｆｂｒ ｓｈｒｎａ之免疫細胞
JP2025532585A (ja) 2022-09-16 2025-10-01 アーセナル バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 組み合わせ遺伝子摂動を有する免疫細胞
AU2024233625A1 (en) 2023-03-03 2025-09-18 Arsenal Biosciences, Inc. Systems targeting psma and ca9
US20250297255A1 (en) 2024-03-20 2025-09-25 Arsenal Biosciences, Inc. Systems targeting tmprss4 and slc34a2

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US589801A (en) * 1897-09-07 woltereck
EP0477994B1 (de) 1985-03-21 2001-06-13 Johnston, Stephen, Ph.D. Von Parasit gewonnener Widerstand
US6608241B1 (en) 1985-10-29 2003-08-19 Monsanto Technology Llc Protection of plants against viral infection
IL81737A (en) 1986-03-28 1992-11-15 Calgene Inc Regulation of gene expression in plant cells
US5017488A (en) * 1986-04-01 1991-05-21 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Highly efficient dual T7/T3 promoter vector PJKF16 and dual SP6/T3 promoter vector PJFK15
US4970168A (en) * 1989-01-27 1990-11-13 Monsanto Company Virus-resistant plants
JPH04507083A (ja) * 1989-05-19 1992-12-10 ヘム・リサーチ・インコーポレーテッド 規定された構造の短い治療用ｄｓＲＮＡ
HUT57265A (en) 1989-11-03 1991-11-28 Zaadunie Bv Process for producing plants of diminished infection-sensitivity
US5837848A (en) * 1990-03-16 1998-11-17 Zeneca Limited Root-specific promoter
EP0524254A4 (en) * 1990-03-30 1993-04-28 The President And Fellows Of Harvard College A binary genetic system to control expression of a transgene in a transgenic animal
US5831011A (en) * 1990-07-27 1998-11-03 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis genes encoding nematode-active toxins
US5459252A (en) * 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
AU676471B2 (en) 1992-03-20 1997-03-13 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Fungus-responsive chimaeric gene
DE4234131C2 (de) * 1992-10-09 1995-08-24 Max Planck Gesellschaft Transgener pathogen-resistenter Organismus
CA2088379A1 (en) * 1993-01-29 1994-07-30 University Of British Columbia Biological systems incorporating stress-inducible genes and reporter constructs for environmental biomonitoring and toxicology
IL104830A (en) * 1993-02-23 2001-01-28 Yissum Res Dev Co A chimeric plasmid containing a non-structural gene for the protease of the potato virus and its various uses
DE4317845A1 (de) 1993-05-28 1994-12-01 Bayer Ag Desoxyribonukleinsäuren
US5482845A (en) * 1993-09-24 1996-01-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for construction of normalized cDNA libraries
EP0770143A4 (de) * 1994-06-15 1999-09-01 Univ Columbia Methode zur identifizierung von tumorsuppressorgenen
US5691140A (en) * 1995-05-18 1997-11-25 New England Biolabs, Inc. Bidirectional in vitro transcription vectors utilizing a single RNA polymerase for both directions
GB9510944D0 (en) * 1995-05-31 1995-07-26 Bogaert Thierry Assays and processes for the identification of compounds which control cell behaviour,the compounds identified and their use in the control of cell behaviour
EP1041143A3 (de) * 1995-06-02 2000-11-29 M &amp; E Biotech A/S Verfahren zur identifikation von biologish activen Peptiden und Nukleinsäuren
US5679551A (en) * 1995-10-31 1997-10-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Unique double-stranded RNAS associated with the Trichomonas vaginalis virus
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
DE19631919C2 (de) * 1996-08-07 1998-07-16 Deutsches Krebsforsch Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
EP1493817B1 (de) * 1996-08-09 2010-12-29 Keygene N.V. Resistenz gegen Schädlinge
CZ88199A3 (cs) * 1996-09-18 1999-08-11 Christian Jung Gen indukující odolnost proti nematodům (hlísticím)
AU4470697A (en) 1996-10-03 1998-04-24 Hajime Kato Method for hydrocarbon steam reforming
EA199900535A1 (ru) 1996-12-18 2000-02-28 Эксон Кемикэл Пейтентс Инк. Смеси полимеров, которым придана совместимость, приготовленные с использованием полифункционального агента
GB9703146D0 (en) 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
EP2267139B1 (de) * 1998-04-08 2017-03-22 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Verfahren und Mittel zum Erhalt von modifizierten Phänotypen
AR020078A1 (es) * 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
GB9814536D0 (en) 1998-07-03 1998-09-02 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
BRPI0616181B1 (pt) 2005-09-16 2024-03-05 Monsanto Technology Llc Construção de polinucleotídeo isolada, sequência de ribonucleotídeo de fita dupla, microrganismo transgênico, seu método de produção, e métodos para controle de infestação por coleóptero praga, para melhorar o rendimento e a tolerância a estiagem de um cultivo, e para produção de um produto comercial, alimento ou ração

Also Published As

Publication number Publication date
CZ200114A3 (en) 2001-06-13
JP4353639B2 (ja) 2009-10-28
CZ303494B6 (cs) 2012-10-24
NO20010019L (no) 2001-03-05
US20040187170A1 (en) 2004-09-23
MXPA00012955A (es) 2002-04-10
CZ304897B6 (cs) 2015-01-07
CA2789083C (en) 2016-03-15
AU4907999A (en) 2000-01-24
GB9827152D0 (en) 1999-02-03
PT1197567E (pt) 2009-04-09
IL140467A (en) 2007-07-04
US8114980B2 (en) 2012-02-14
DK1197567T3 (da) 2009-05-04
CA2789083A1 (en) 2000-01-13
NZ509182A (en) 2004-01-30
EP1484415A2 (de) 2004-12-08
IN2006DE03568A (de) 2007-08-31
EP1484415B1 (de) 2009-06-10
MX234065B (es) 2006-02-01
JP2009112311A (ja) 2009-05-28
US20040133943A1 (en) 2004-07-08
EP2374901A1 (de) 2011-10-12
EP1484415A3 (de) 2008-02-13
KR20010074639A (ko) 2001-08-04
DE1093526T1 (de) 2001-10-11
ES2327334T3 (es) 2009-10-28
GB2362885A (en) 2001-12-05
CY1109324T1 (el) 2014-07-02
DE69940984D1 (de) 2009-07-23
US20030061626A1 (en) 2003-03-27
PL216779B1 (pl) 2014-05-30
ZA200007653B (en) 2002-09-19
EP1093526A2 (de) 2001-04-25
CA2332619C (en) 2012-12-11
HUP0103571A3 (en) 2006-01-30
IS2816B (is) 2012-11-15
EP1197567B2 (de) 2015-10-07
NO327729B1 (no) 2009-09-14
ES2320527T5 (es) 2015-11-16
WO2000001846A3 (en) 2000-06-15
CA2332619A1 (en) 2000-01-13
KR20070041607A (ko) 2007-04-18
CY1108920T1 (el) 2014-07-02
GB2349885A (en) 2000-11-15
GB0118514D0 (en) 2001-09-19
CN1900319A (zh) 2007-01-24
GB0206600D0 (en) 2002-05-01
AU769223B2 (en) 2004-01-22
BR9911802A (pt) 2002-01-22
RU2240349C2 (ru) 2004-11-20
PT1484415E (pt) 2009-07-27
DE69940219D1 (de) 2009-02-12
ES2320527T3 (es) 2009-05-25
IL181727A (en) 2015-08-31
EP1197567A2 (de) 2002-04-17
JP5847776B2 (ja) 2016-01-27
ATE419383T1 (de) 2009-01-15
HU230602B1 (hu) 2017-02-28
ATE433500T1 (de) 2009-06-15
KR100563295B1 (ko) 2006-03-27
KR20040066200A (ko) 2004-07-23
DE29924298U1 (de) 2002-09-12
IL140467A0 (en) 2002-02-10
CN1657620A (zh) 2005-08-24
KR20060071438A (ko) 2006-06-26
IL181727A0 (en) 2007-07-04
CN1198938C (zh) 2005-04-27
GB2370275A (en) 2002-06-26
GB0020485D0 (en) 2000-10-11
GB2362885B (en) 2002-07-31
WO2000001846A2 (en) 2000-01-13
DK1197567T4 (en) 2015-12-07
GB2370275B (en) 2002-11-27
PL213379B1 (pl) 2013-02-28
CN1323354A (zh) 2001-11-21
PL347978A1 (en) 2002-05-06
GB2349885B (en) 2003-01-29
EP2045336A2 (de) 2009-04-08
EP1197567B1 (de) 2008-12-31
IS5802A (is) 2001-01-02
JP2014058514A (ja) 2014-04-03
HUP0103571A2 (hu) 2002-01-28
NO20010019D0 (no) 2001-01-02
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