PL216037B1

PL216037B1 - Kaseta ekspresyjna, zastosowanie kasety ekspresyjnej, wektor, komórka gospodarza oraz sposób otrzymywania polipeptydu

Info

Publication number: PL216037B1
Application number: PL379905A
Authority: PL
Inventors: Andrzej Plucienniczak; Małgorzata Kęsik; Grażyna Płucienniczak; Diana Mikiewicz-Syguła
Original assignee: Inst Biotechnologii I Antybiotykow; Instytut Biotechnologii I Antybiotykow
Priority date: 2006-06-09
Filing date: 2006-06-09
Publication date: 2014-02-28
Also published as: US8628954B2; EP2109671B1; WO2007142547A2; WO2007142547A3; EP2109671A2; US20100297773A1; PL379905A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest kaseta ekspresyjna, zastosowanie kasety ekspresyjnej, wektor, komórka gospodarza oraz sposób otrzymywania polipeptydu zapewniający jego stabilną ekspresję przez prokariotycznego gospodarza oraz zastosowanie.

Możliwość produkcji w systemach prokariotycznych polipeptydów, których pozyskiwanie z naturalnych źródeł było trudne lub kosztowne spowodowało przełom w biotechnologii. Do produkcji tych polipeptydów od lat osiemdziesiątych powszechnie stosuje się układy oparte na użyciu obcych dla gospodarza zależnych od DNA polimeraz RNA, do których wprowadza się wektory z promotorami rozpoznawanymi przez te polimerazy. Jednym z najczęściej wykorzystywanych systemów tego typu jest układ, w którym polimeraza faga T7 rozpoznaje promotor faga T7. W układzie tym sekwencja kodująca polimerazę znajduje się w chromosomie bakteryjnym, a rozpoznawana sekwencja promotora jest obecna w wektorze ekspresyjnym.

Taki układ ekspresyjny, wektor i sposób ekspresji docelowego polipeptydu przedstawiono na przykład w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych nr nr 4,952,496 i 5,693,489. W rozwiązaniu opisanym w cytowanych opisach patentowych do komórki gospodarza, takiego jak Escherichia coli, zawierającego gen kodujący polimerazę RNA z faga T7 wprowadza się wektor zawierający docelowy gen związany funkcjonalnie z promotorem rozpoznawanym przez polimerazę RNA z faga T7 i hoduje się komórki gospodarza w znanych warunkach umożliwiających ekspresję.

W wielu wypadkach układ ten okazuje się bardzo wydajny i pozwala na otrzymywanie wysokiego poziomu ekspresji polipeptydów wynoszącego nawet 50% ogólnej produkcji komórki [Metlitskaia L, Cabralda JE. Suleman D, Kerry C, Brinkman J. Bartfeld D, Guama MM, Recombinant antimicrobial peptides efficiently produced using novel cloning and purification processes, Biotechnol Appl Biochem., (2004 Jun); 39 (Pt 3): 339-45].

Jednak napotyka się tu także pewne problemy. Jednym z nich jest zmniejszający się w czasie poziom ekspresji docelowego polipeptydu, którego produkcja zachodzi z promotora faga T7. Z problemem tym zmagano się bezskutecznie od początku stosowania systemu wykorzystującego promotor faga T7.

Początkowo sądzono, że obniżanie poziomu ekspresji białka jest spowodowane utratą lub mutacją plazmidu niosącego gen docelowego polipeptydu. W celu ograniczenia niedogodności związanych z optymalizacją ekspresji białek proponowano testowanie bakterii i ich ocenę odnośnie zdolności do wysokiej ekspresji [Studier FW, Moffatt BA, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol. (1986) 189; 113-130; Studier FW, Rosenberg AH, Dunn JJ, Dubendorff JW, Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Meth. Enzymol. (1990) 185 : 60-89].

Główną przyczynę zmniejszania się w czasie poziomu ekspresji docelowego polipeptydu po raz pierwszy zbadali i opisali Vethanayagam i wsp. [Vethanayagam JG and Flower AM, Decreased gene expression from T7 promoters may be due to impaired production of active T7 RNA polymerase, Microb Cell Fac. (2005 Jan 7); 4:3]. Jest ona związana z pojawiającymi się chromosomalnymi mutacjami w obrębie sekwencji kodującej obcą dla gospodarza zależną od DNA polimerazę RNA faga T7.

Wynalazek rozwiązuje wskazane wyżej problemy i umożliwia stabilną ekspresję docelowego polipeptydu.

Zgodnie z wynalazkiem problem stabilnej wysokiej ekspresji w układach, w których stosuje się zależną od DNA polimerazę RNA oraz promotor rozpoznawany przez tę polimerazę, rozwiązano przez opracowanie układu, w którym polimeraza rozpoznaje promotor regulujący zarówno syntezę docelowego polipeptydu, jak i czynnika selekcyjnego, warunkującego przeżycie gospodarza.

Przedmiotem wynalazku jest kaseta ekspresyjna zawierająca promotor fagowy funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą polipeptyd docelowy oraz z sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docelowy, gdzie pomiędzy z sekwencją kodującą polipeptyd docelowy a sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza, znajduje się terminator transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe, zaś kodon stop translacji S na 5' końcu przed terminatorem transkrypcji T, przy czym kaseta jest opisana wzorem P-X-(S)bT-M, gdzie P oznacza sekwencję promotora faga, X sekwencję docelową, S oznacza kodon stop translacji, b=1 (obecne) lub b=0 (brak) w sekwencji kasety, T oznacza sekwencję terminatora transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe i M oznacza sekwencję kodującą czynnik selekcyjny warunkujący przeżycie gospodarza, i gdzie sekwencja M kodująca czynnik selekcyjny

PL 216 037 B1 będący w kasecie, stanowi sekwencję kodującą białkowy czynnik selekcyjny wybrany z grupy obejmującej czynnik wprowadzający oporność na antybiotyk lub czynnik, który komplementuje defekt genetyczny gospodarza lub ich funkcjonalny fragment.

Stwierdzono, że kaseta według wynalazku spełnia swoją funkcję, jeśli produkcja czynnika selekcyjnego odbywa się tylko pod kontrolą promotora faga rozpoznawanego specyficznie przez polimerazę faga. Stąd przed 5' końcem genu kodującego czynnik selekcyjny wklonowano terminator transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe. Zapobiega on ekspresji genu kodującego czynnik selekcyjny z promotorów obecnych na wektorze ekspresyjnym i rozpoznawanych przez polimerazy gospodarza.

Włączenie sekwencji kodującej czynnik selekcyjny tak, aby jego ekspresja zależała wyłącznie od promotora faga powoduje zaprzestanie produkcji tego niezbędnego do przeżycia komórki białka i eliminację komórek, które na skutek mutacji utraciły zdolność produkcji funkcjonalnej polimerazy i/lub w których, w wyniku mutacji, stracił funkcjonalność promotor faga.

Nieoczekiwanie okazało się, że konstrukcja kasety zapewnia ekspresję docelowego polipeptydu w komórce prokariotycznego gospodarza na poziomie nie niższym niż w standardowo wykorzystywanym układzie zawierającym sam promotor faga T7. Jest to możliwe, ponieważ charakterystyczna dla promotora faga, zwłaszcza T7, wysoka ekspresja skierowana jest głównie na docelowy polipeptyd. Z drugiej strony poziom ekspresji czynnika selekcyjnego jest na tyle wysoki, że umożliwia przeżycie komórce gospodarza. Zostało to osiągnięte przez obecność terminatora transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe przed 5' końcem genu kodującego czynnik selekcyjny, a w korzystnym wariancie przez włączenie, przed terminatorem transkrypcji, kodonu stop translacji oraz przez modyfikację niekodującej części genu kodującego czynnik selekcyjny na końcu 5' (część zawierająca sekwencję Shine-Dalgarno).

Odpowiednim czynnikiem selekcyjnym warunkującym przeżycie gospodarza jest czynnik białkowy, którego brak ekspresji w komórce powoduje jej śmierć.

Określenie „funkcjonalny fragment” oznacza część genu kodującą polipeptyd lub białko o właściwościach czynnika selekcyjnego.

Korzystnie, gdy sekwencja kodująca czynnik selekcyjny ma zmodyfikowaną niekodującą część na końcu 5', zawierającą sekwencję Shine-Dalgarno, tak że jest gorzej rozpoznawana na mRNA przez rybosomy, przy czym zmiany w sekwencji Shine-Dalgarno wprowadza primer KanPIGP określony sekwencją nr 1, przy czym korzystnie w niekodującej części genu kodującego 3'-fosfotransferazę aminoglikozydową (APH) zamieniono nukleotydy: adeninę w pozycji -12 na guaninę; tyminę w pozycji -13 na cytozynę: adeninę w pozycji -14 na cytozynę: adeninę w pozycji -15 na guaninę; tyminę w pozycji -16 na guaninę.

Przykładami sekwencji kodujących czynnik wprowadzający oporność na antybiotyk są sekwencje nadające oporność na antybiotyki z grupy np. aminoglikozydów (jak kanamycyna, spektynomycyna, neomycyna), β-laktamów (jak ampicylina), chloramfenikoli, (jak chloramfenikol), tetracyklin (jak tetracyklina), peptydowych (jak bleomycyna, kolicyna).

Korzystnie, gdy zawiera sekwencję kodującą czynnik wprowadzający oporność na kanamycynę.

Korzystnie, gdy sekwencja kodująca czynnik oporności na kanamycynę ma zmodyfikowaną cześć niekodującą na końcu 5', zawierającą sekwencję Shine-Dalgarno, tak że jest gorzej rozpoznawana na mRNA przez rybosomy. Zmodyfikowaną część oznaczono pogrubionymi kapitalikami na fig. 7 oraz fig. 9.

Jak wspomniano, możliwe jest użycie sekwencji kodującej czynnik, który komplementuje genetyczny defekt w komórce gospodarza. Takim defektem może być defekt metaboliczny, który powoduje, że jeden lub więcej metabolitów istotnych dla życia komórki nie jest syntetyzowanych.

Przykładem jest gen ASD kodujący dehydrogenazę β-semialdehydu asparaginianowego stanowiący enzym wspólny dla ścieżek syntezy aminokwasów z rodziny kwasu asparaginowego (asparagina, metionina, treonina, lizyna).

Odpowiednim terminatorem transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe jest terminator zdolny zapobiec ekspresji czynnika selekcyjnego, warunkującego przeżycie gospodarza, z promotorów obecnych na wektorze ekspresyjnym i rozpoznawanych przez polimerazy bakteryjnego gospodarza.

Kaseta według wynalazku może zawierać promotory różnych fagów, zwłaszcza podobnych do T7. Korzystny jest promotor wybrany spośród promotorów faga T7, T3, T5 i SP6, szczególnie T7.

Fagi T3, T5 i SP6 są podobne do T7. Są fagami litycznymi, kodującymi własną polimerazę RNA, która jest wysoce procesywna i rozpoznaje konserwatywne sekwencje w rejonie pomiędzy po4

PL 216 037 B1 zycją -17 i +6 pz przed miejscem startu mRNA. Promotory tych fagów są silnymi promotorami dla mikroorganizmów i stanowią systemy powszechnie wykorzystywane do otrzymywania rekombinowanych białek. Korzystnie, gdy terminatorem transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe jest terminator tryptofanowy.

Korzystnie, gdy zawiera promotor wybrany spośród promotorów faga T7, T3, T5 i SP6, a zwłaszcza promotor faga T7.

Korzystnie, gdy promotor fagowy jest połączony z nukleotydowym segmentem o sekwencji przedstawionej jako sek. nr 7.

Korzystnie, gdy promotor fagowy jest połączony z nukleotydowym segmentem o sekwencji przedstawionej jako sek. nr 12.

W korzystnym przykładzie wykonania kaseta zawiera terminator tryptofanowy [Molecular Cell Biology Darnell J. Loodish H., Baltimore D.] o sekwencji zaznaczonej pogrubioną kursywą na fig. 7. Określenie terminator tryptofanowy oznacza miejsce terminacji operonu tryptofanowego (tryp t).

Docelowy polipeptyd może być kodowany przez dowolną sekwencję kodującą polipeptyd homologiczny lub heterologiczny dla komórki gospodarza. Może to być np. białko o znaczeniu terapeutycznym, diagnostycznym, biokatalitycznym, w tym także białko hybrydowe lub fragment takiego polipeptydu, wydzielane na zewnątrz albo pozostające w komórce. Sekwencją kodującą może być gen strukturalny, cDNA, sekwencja syntetyczna lub półsyntetyczna.

Konstrukcja kasety według wynalazku jest przedstawiona schematycznie na fig. 1, gdzie P oznacza sekwencję fagowego promotora, X oznacza sekwencję kodującą docelowy polipeptyd, S oznacza kodon stop translacji, b wynosi 1 lub 0, T oznacza sekwencję terminatora transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe, a M oznacza sekwencję kodującą czynnik selekcyjny warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docelowy.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kasety ekspresyjnej określonej powyżej w konstrukcji wektora dla układu ekspresyjnego promotor polimeraza faga w komórce gospodarza prokariotycznego.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor ekspresyjny, znamienny tym, że posiada kasetę ekspresyjną określoną powyżej.

Korzystnie, gdy zawiera sekwencję kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza, stanowiącą jednocześnie gen markera selekcyjnego, umożliwiający selekcję komórek niosących wektor.

Korzystnie, gdy jest wybrany spośród wektorów plGCmT7KesKrE2, pIGCmT7KesPA-4D i pT7RSKesKrE2.

Metody ligowania elementów kasety i wprowadzania do wektora odpowiedniego do klonowania i ekspresji w gospodarzu prokariotycznym, zdolnego do replikacji w tych organizmach, są znane.

Do konstrukcji wektora według wynalazku dogodnie jest stosować wektor plazmidowy. Takie wektory są znane fachowcom i zawierają zazwyczaj co najmniej jeden z następujących elementów: sekwencję lub kilka sekwencji rozpoznawanych przez endonukleazy restrykcyjne, sekwencję umożliwiającą replikację, gen markerowy umożliwiający selekcję niosących go komórek.

Konstrukcję kasety i wektora można prowadzić następująco: 1) przygotować najpierw sekwencję całej kasety i włączyć ją do wektora lub 2) fragmenty kasety włączać kolejno do odpowiedniego wektora (który może już zawierać pewne elementy, np. sekwencję promotora fagowego, sekwencję terminatora transkrypcji i inne).

Zgodnie z wariantem wynalazku sekwencja kodująca czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docelowy, może jednocześnie stanowić gen markera selekcyjnego umożliwiający selekcję komórek niosących wektor.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka prokariotycznego gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny jak określono powyżej.

Korzystnie, jest nią komórka prokariotycznego gospodarza niosąca gen kodujący polimerazę RNA rozpoznającą promotor fagowy.

Korzystnie, gdy jest nią komórka E. coli.

Korzystnie, gdy jest nią E. coli BL21 (DE3).

Może to być komórka E. coli. Może to być także komórka E. coli posiadająca defekt w genie

ASD kodującym dehydrogenazę β-semialdehydu asparaginianowego.

Gen kodujący polimerazę RNA rozpoznającą promotor fagowy może być włączony do genomu prokariotycznego gospodarza. Przykładem jest szczep E. coli BL21 (DE3).

PL 216 037 B1

Wektor według wynalazku wprowadza się do komórki prokariotycznego gospodarza znanymi sposobami.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania polipeptydu w prokariotycznym gospodarzu, w układzie promotor polimeraza faga, charakteryzujący się tym. że hoduje się komórki prokariotycznego gospodarza zawierające: a) wektor ekspresyjny z kasetą opisaną wzorem P-X-(S)bT-M, gdzie P oznacza sekwencję promotora faga, X sekwencję docelową. S oznacza kodon stop translacji. b=1 (obecne) lub b=0 (brak) w sekwencji kasety, T oznacza sekwencję terminatora transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe i M oznacza sekwencję kodującą czynnik selekcyjny warunkujący przeżycie gospodarza, zaś kodon stop translacji S na 5' końcu przed terminatorem transkrypcji T, i gdzie sekwencja M kodująca czynnik selekcyjny będący w kasecie, stanowi sekwencję kodującą białkowy czynnik selekcyjny wybrany z grupy obejmującej czynnik wprowadzający oporność na antybiotyk lub czynnik, który komplementuje defekt genetyczny gospodarza lub ich funkcjonalny fragment oraz b) gen kodujący polimerazę RNA rozpoznającą promotor fagowy, przy czym hodowlę prowadzi się w warunkach umożliwiających ekspresję docelowego polipeptydu oraz czynnika selekcyjnego i jednocześnie zahamowanie wzrostu oraz eliminację komórek, w których brak ekspresji spod promotora fagowego.

Korzystnie, gdy sekwencja kodująca czynnik selekcyjny ma zmodyfikowaną niekodującą część na końcu 5', zawierającą sekwencję Shine-Dalgarno. tak że jest gorzej rozpoznawana na mRNA przez rybosomy, przy czym zmiany w sekwencji Shine-Dalgarno wprowadza primer KanPIGP określony sekwencją nr 1, przy czym korzystnie w niekodującej części genu kodującego 3'-fosfotransferazę aminoglikozydową (APH) zamieniono nukleotydy: adeninę w pozycji - 12 na guaninę: tyminę w pozycji - 13 na cytozynę: adeninę w pozycji - 14 na cytozynę: adeninę w pozycji - 15 na guaninę: tyminę w pozycji - 16 na guaninę.

Zgodnie z wynalazkiem środek powodujący eliminację komórek, w których brak jest ekspresji spod promotora fagowego, może być w ich środowisku, co oznacza, że środowisko zawiera dodatkowy składnik lub jest pozbawione określonego składnika niezbędnego dla życia komórki.

Jest to, na przykład, dodany do pożywki antybiotyk, jeśli sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza, jest sekwencja wprowadzająca oporność na antybiotyk

Jeśli czynnikiem selekcyjnym jest czynnik białkowy komplementujący genetyczny defekt komórki gospodarza, wówczas środkiem powodującym śmierć komórki w przypadku braku ekspresji tego czynnika będzie środowisko (podłoże) pozbawione składnika uzupełniającego genetyczny defekt. W przypadku komplementacji defektu, np. w genie dehydrogenazy β-semialdehydu asparaginianowego, jest to środowisko (pożywka pełna) niezawierające kwasu diaminopimelinowego (DAP).

W sposobie według wynalazku stosuje się konwencjonalne podłoża hodowlane dobrane w zależności od użytego organizmu gospodarza. Dla Escherichia coli może to być kompleksowa pożywka, taka jak podłoże LB.

Jest korzystnie, jeśli gen kodujący polimerazę RNA faga jest pod kontrolą indukowalnego promotora, co pozwala na kontrolowanie procesu produkcji polimerazy, a także ekspresji docelowego polipeptydu.

Ekspresja jest wówczas indukowana przez dodatek induktora, jak IPTG (izopropylotiogalaktozyd) lub inny znany induktor.

W systemie ekspresyjnym wykorzystującym promotor faga, zwłaszcza T7, polimeraza produk o wana jest na niskim poziomie również bez indukcji IPTG. Jest to zjawisko określane w literaturze mianem „cieknięcia”. Dzięki temu środek powodujący śmierć komórki w przypadku braku ekspresji może być np. dodany do pożywki od początku hodowli, bez konieczności czekania do momentu indukcji. W związku z tym czynnik selekcyjny, którym jest np. sekwencja kodująca oporność na kanamycynę (APH), spełnia dwojaką funkcję: pozwala na selekcję komórek gospodarza niosących wektor ekspresyjny (funkcja markera selekcyjnego) oraz tych, które produkują docelowy polipeptyd (funkcja czynn ika selekcyjnego), warunkujący przeżycie komórek gospodarza). Dzięki zjawisku „cieknięcia” nie ma potrzeby stosowania dodatkowego czynnika selekcyjnego na wstępnych etapach hodowli poprzedzających indukcję, co obniża koszt hodowli i ewentualnej utylizacji ścieków pohodowlanych.

Wynalazek pozwala na otrzymanie kilkakrotnie większej ilości docelowego polipeptydu z tej samej objętości hodowli i utrzymanie jego wysokiej stabilnej w czasie produkcji, co również obniża koszt produkcji, w tym koszt oczyszczania białka. Eliminowanie z hodowli komórek nie produkujących docelowego polipeptydu, które rosną i dzielą się szybciej, zapobiega „przerastaniu” hodowli takimi komórkami.

PL 216 037 B1

Na załączonych rysunkach fig. 1 pokazuje schematycznie kasetę ekspresyjną.

Fig. 2 przedstawia mapę plazmidu pIGDMCT7RS, przy czym ARG t-RNA oznacza gen argininowy tRNA dla kodonów AGA i AGG, ORI oznacza origin replikacji plazmidu pPIGDM1, CatA1 oznacza gen kodujący acetylotransferazę chloramfenikolu, T7 Promotor oznacza promotor faga T7, Stop Transkrypcji oznacza terminację transkrypcji z promotora faga T7.

Fig. 3 przedstawia mapę plazmidu pT7RS, przy czym ArgU - gen argininowy tRNA dla kodonów AGA i AGG, Amp - gen kodujący oporność na ampicylinę, Promotor T7 - promotor faga T7, Stop Transkrypcji - terminacja transkrypcji z promotora faga T7.

Fig. 4 pokazuje sekwencje syntetycznych oligonukleotydów stosowane do otrzymywania terminatora tryptofanowego (o nazwach: Term Try1, Term Try2, Term Try3 i Term Try4) oraz sekwencje syntetycznych primerów reakcji PCR Podkreślono sekwencję primera komplementarną do sekwencji powielanego genu.

Fig. 5 przedstawia mapę plazmidu pIGCmT7Kes, gdzie ARG t-RNA - gen argininowy tRNA dla kodonów AGA i AGG; ORI - origin replikacji plazmidu pPIGDM1; CatA1 - gen kodujący acetylotransferazę chloramfenikolu, T7 promotor - Promotor faga T7, Stop Transkrypcji - terminacja transkrypcji z promotora faga T7; Stop+Term+APH- nukleotydowy fragment kasety, gdzie Stop-kodon stop translacji; Term-sekwencja terminatora tryptofanowego, (oznaczona pogrubioną kursywą na fig. 7); APH-zmodyfikowana sekwencja kodująca 3'-fosfotransferazę aminoglikozydową (oznaczona kapitalikami na fig. 7).

Fig. 6 przedstawia mapę plazmidu pIGCmT7KesKrE2 z kasetą zawierającą promotor faga T7 oraz nukleotydowy segment KrE2+Stop+Term+APH (pokazany na fig. 7), gdzie KrE2 oznacza sekwencję kodującą fragment białka E2 CSFV; Stop Transkrypcji - terminacja transkrypcji; ARG t-RNA gen argininowy tRNA dla kodonów AGA i AGG; ORI - origin replikacji plazmidu pPIGDM1; CatA1 - gen kodujący acetylotransferazę chloramfenikolu.

Fig. 7 pokazuje nukleotydowy segment KrE2+Stop+Term+APH wklonowany do wektora pIGCmT7KesKrE2 oraz do wektora pT7RSKesKrE2.

Kursywą oznaczono sekwencję kodującą fragment białka E2 CSFV (KrE2); pogrubioną czcionką wyróżniono kodon stop translacji; pogrubioną kursywą oznaczono terminator tryptofanowy (Term); kapitalikami oznaczono gen kodujący APH, pogrubionymi kapitalikami oznaczono zmodyfikowaną część niekodującą na końcu 5' genu APH.

Segment włączono do wektora pIGCmT7KesKrE2 w miejsca powstałe po trawieniu nukleazami restrykcyjnymi NdeI i HindIII (podkreślone).

Fig. 8 przedstawia mapę plazmidu pIGCmT7KesPA-4D z kasetą zawierającą promotor faga T7 oraz nukleotydowy segment PA-4D+Stop+Term+APH (pokazany na fig. 9), gdzie PA-4D oznacza sekwencję kodującą czwartą domenę antygenu protekcyjnego Bacillus anthracis; Stop Transkrypcji terminacja transkrypcji, ARG t-RNA - gen argininowy tRNA dla kodonów AGA i AGG, ORI - origin replikacji plazmidu pPIGDM1, CatA1 - gen kodujący acetylotransferazę chloramfenikolu.

Fig. 9 pokazuje wklonowany do wektora pIGCmT7KesPA-4D nukleotydowy segment PA-4D+Stop+Term+APH. Kursywą oznaczono sekwencję kodującą czwartą domenę antygenu protekcyjnego Bacillus anthracis (PA-4D); pogrubioną czcionką wyróżniono kodon stop translacji; pogrubioną kursywą oznaczono terminator tryptofanowy;

kapitalikami oznaczono gen kodujący APH, pogrubionymi kapitalikami oznaczono zmodyfikowaną część niekodującą na końcu 5' genu APH.

Segment włączono do wektora pIGCmT7KesPA-4D w miejsca powstałe po trawieniu nukleazami restrykcyjnymi NdeI i HindIII (podkreślone).

Fig. 10 pokazuje nukleotydową sekwencję kodującą PA-4D wklonowaną do wektora pIGCmT7PA-4D w miejsca powstałe po trawieniu nukleazami restrykcyjnymi NdeI i HindIII (podkreślone).

Fig. 11 przedstawia mapę plazmidu pIGCmT7PA-4D, gdzie ARG t-RNA - gen argininowy tRNA dla kodonów AGA i AGG, ORI - origin replikacji plazmidu pPIGDM1, CatA1 - gen kodujący acetylotransferazę chloramfenikolu, T7 Promotor - promotor faga T7; Stop Transkrypcji - terminacja transkrypcji PA-4D - sekwencja kodująca czwartą domenę antygenu protekcyjnego Bacillus anthracis.

Fig. 12 przedstawia mapę plazmidu pT7RSKesKrE2, z kasetą zawierającą promotor faga T7 oraz nukleotydowy segment KrE2+Stop+Term+APH (fig. 7); Arg t-RNA - gen argininowy tRNA dla kodonów AGA i AGG, Amp - gen kodujący oporność na ampicylinę. Stop Transkrypcji - terminacja transkrypcji z promotora faga T7.

PL 216 037 B1

Fig. 13 i 14 przedstawiają rozdział elektroforetyczny lizatów bakteryjnych ekspresjonujących fragment białka E2 CSFV (KrE2).

Fig. 15 przedstawia rozdział elektroforetyczny lizatów bakteryjnych ekspresjonujących fragment białka E2 CSFV (KrE2).

Fig. 16 i 17 przedstawiają rozdział elektroforetyczny lizatów bakteryjnych ekspresjonujących czwartą domenę antygenu protekcyjnego Bacillus anthracis (PA- 4D).

Wynalazek ilustrują niżej podane przykłady.

P r z y k ł a d I. Konstrukcja kasety oraz wektora pIGCmT7KesKrE2

Wektory użyte do klonowania kasety

Kasetę wklonowano w dwa bakteryjne plazmidy ekspresyjne: pIGDMCT7RS i pT7RS.

A. Plazmid pIGDMCT7RS (4057 pz.) (fig. 2, sekwencja zdeponowana w Amerykańskim Banku Genów, dostępna pod numerem DQ485721) powstał w pracowni prof. A. Płucienniczaka w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie w oparciu o plazmid pIGDM1 [Mikiewicz D, Wróbel B, Węgrzyn G, Płucienniczak A. Isolation and characterisation of a ColE1-Iike plasmid from Enterobacter agglomerans with a novel variant of rom gene. Plasmid. 1997;38(3):210-9], który jest plazmidem z grupy ColE1 wyizolowanym z bakterii Enterobacter agglomerans. Nukleotydowa sekwencja pPIGDM1 jest zdeponowana w Amerykańskim Banku Genów (sekwencja dostępna pod numerem AF014880). Plazmid pIGDMCT7RS powstał przez dostawienie genu acetylotransferazy chloramfenikolu (CatA1), wprowadzającego oporność na chloramfenikol, polilinkera wraz z promotorem rozpoznawanym przez polimerazę RNA z faga T7 oraz sekwencją kodującą kodon stop transkrypcji pochodzącą z faga T7 (nie publikowane). Plazmid pIGDMCT7RS niesie gen kodujący tRNA dla kodonów AGA i AGG. Kodony AGA i AGG tRNA uzupełniają niedobór tych tRNA wynikający z częstości użycia kodonów w E. coli. Nukleotydowa sekwencja pIGDMCT7RS jest zdeponowana w Amerykańskim Banku Genow pod numerem DQ485721. Plazmid zawiera sekwencje ROM - RNA one modulator; jeden z genów regulujących liczbę kopii dla plazmidów z grupy ColE1, ORF1- rom-like ORF kodujący białko wykazujące 55,7% identyczności do białka ROM plazmidu ColE1 oraz sekwencję RH - region homologiczny do ColE1.

B. Plazmid pT7RS (2840 pz.) (fig. 3) powstał w pracowni prof. A. Płucienniczaka w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie. Nukleotydowa sekwencja pT7RS jest zdeponowana w Amerykańskim Banku Genów (sekwencja dostępna pod numerem AY923866). Plazmid pT7RS zawiera promotor rozpoznawany przez polimerazę RNA z faga T7 oraz sekwencję kodującą kodon stop transkrypcji pochodzącą z faga T7. Wektor niesie gen kodujący tRNA dla kodonów AGA i AGG.

Schemat otrzymywania wektora pIGCmT7KesKrE2

Etap I. Z plazmidu powielono metodą PCR gen kodujący 3'fosfotransferazę aminoglikozydową (APH), wprowadzający oporność na kanamycynę, z zastosowaniem primerów KanPIGP (primer wiodący o sekwencji pokazanej na fig. 4 oraz jako sek. nr 1) i KanPIGk (primer odwrotny o sekwencji pokazanej na fig. 4 oraz jako sek. nr 2). Primer KanPIGP wprowadza miejsce rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne Sall i NotI, a KanPIGk miejsce rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną HindIII. Dodatkowo primer KanPIGP wprowadza zmiany w sekwencji Shine-Dalgarno tak, że jest ona gorzej rozpoznawana na mRNA przez rybosomy. Zmiany te są następujące: w niekodującej części genu kodującego 3'-fosfotransferazę aminoglikozydową (APH) zamieniono nukleotydy: adeninę w pozycji - 12 na guaninę; tyminę w pozycji - 13 na cytozynę; adeninę w pozycji - 14 na cytozynę; adeninę w pozycji - 15 na guaninę; tyminę w pozycji - 16 na guaninę.

Otrzymany po reakcji PCR produkt rozdzielono elektroforetycznie i wyizolowano z żelu PAA, a następnie trawiono enzymami restrykcyjnymi SalI i HindIII i odbiałczano. Uzyskany fragment wklonowano do wektora pIGDMCT7RS trawionego tymi samymi enzymami restrykcyjnymi co klonowany fragment. Poprawność klonowanej wstawki zweryfikowano przez sekwencjonowanie.

Etap II. Syntetyczne poligonukleotydy TermTry1, TermTry2, TermTry3 i TermTry4 (o sekwencjach pokazanych na fig. 4 oraz jako sek. nr 3, 4, 5, i 6 odpowiednio) ligowano w celu otrzymania syntetycznego terminatora tryptofanowego. Oligonukleotyd TermTry1 wprowadza miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne Sall i NotI oraz kodon (TAA) terminacji translacji, a TermTry4 miejsca rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną NotI. Otrzymany fragment o długości 57 pz rozdzielono elektroforetycznie i wyizolowano z żelu PAA, a następnie trawiono enzymami restrykcyjnymi Sall, NotI. Uzyskany fragment wklonowano do wektora otrzymanego w etapie I trawionego tymi samymi enzymami restrykcyjnymi co klonowany fragment. Poprawność klonowanej wstawki zweryfikowano przez sekwencjonowanie. W wyniku prac opisanych w etapie I i II uzyskano wektor pIGCmT7Kes przedsta8

PL 216 037 B1 wiony schematycznie na fig. 5 z zaznaczonym nukleotydowym fragmentem Stop+Term+APH stanowiącym część sekwencji przedstawionej na fig. 7.

Etap III. Z plazmidu zawierającego pełną sekwencję nukleotydową antygenu E2 wirusa CSFV powielono w reakcji PCR z użyciem primerów BRESAMA (primer wiodący, o sekwencji pokazanej na fig. 4 oraz jako sek. nr 8) i UBIBREK1 (primer odwrotny, o sekwencji pokazanej na fig. 4 oraz jako sek. nr 9) fragment o długości 1023 pz od pozycji 2428 do 3087 (zgodnie z numeracją sekwencji E2 z GeneBank, numer dostępu M31768). Primery BRESAMA i UBIBREK1 zaprojektowano na podstawie sekwencji genu kodującego białko E2 wirusa CSFV bez fragmentu transbłonowego. Primer wiodący BRESAMA wprowadza na końcu 5' cząsteczki DNA zmiany w sekwencji nukleotydowej, zmieniając guaninę w pozycji 2430 na tyminę. Wprowadzona zmiana w sekwencji nukleotydowej nie powoduje zmian w sekwencji aminokwasowej. Dodatkowo primer BRESAMA wydłuża koniec 5' cząsteczki DNA, wprowadzając kodon alaniny GCA oraz miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne NdeI i BamHI. Primer UBIBREK1 wydłuża koniec 3' cząsteczki DNA, wprowadzając kodon terminacyjny TAA oraz miejsca rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne HindIII i XhoI. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment DNA o długości 1058 pz wyeluowano z żelu poliakryloamidowego, a następnie trawiono nukleazami restrykcyjnymi NdeI oraz HindIII, i odbiałczono. Otrzymany fragment (KrE2) ligowano z wektorem pIGCmT7Kes trawionym enzymami restrykcyjnymi NdeI i HindIII i odbiałczonym po trawieniu. Poprawność sekwencji fragmentu włączonego do wektora zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Otrzymano wektor pIGCmT7KesKrE2 (fig. 6) z kasetą ekspresyjną zawierającą pod promotorem T7 nukleotydowy segment KrE2+Stop+Term+APH o sekwencji przedstawionej na fig. 7 oraz jako sek. nr 7.

P r z y k ł a d II. Konstrukcja wektora pIGCmT7KesPA-4D oraz wektora porównawczego pIGCmT7PA-4D

Z plazmidu zawierającego pełną sekwencję nukleotydową czwartej domeny antygenu protekcyjnego Bacillus anthracis powielono w reakcji PCR z użyciem primerów PA-4DP (primer wiodący, o sekwencji pokazanej na fig. 4 oraz jako sek. nr 10) i PA4DKXho (primer odwrotny, o sekwencji pokazanej na fig. 4 oraz jako sek. nr 11) fragment o długości 429 pz (zgodnie z numeracją sekwencji z GeneBank, numer dostępu AF065404). Primery PA-4DP i PA-4DKXho zaprojektowano na podstawie sekwencji czwartej domeny antygenu protekcyjnego Bacillus anthracis. Primer wiodący wprowadza miejsce rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne EcoRI i NdeI, a odwrotny miejsce rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną XhoI. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment DNA wyeluowano z żelu poliakryloamidowego, a następnie trawiono nukleazami restrykcyjnymi NdeI oraz XhoI, i odbiałczono. Otrzymany fragment ligowano z wektorem pIGCmT7Kes trawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi i odbiałczonym po trawieniu. Poprawność sekwencji fragmentu włączonego do wektora zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Otrzymano wektor pIGCmT7KesPA-4D (fig. 8) z kasetą ekspresyjną zawierającą pod promotorem T7 nukleotydowy segment PA-4D+Stop+Term+APH o sekwencji przedstawionej na fig. 9 oraz jako sek. nr 12.

Z plazmidu zawierającego pełną sekwencję nukleotydową czwartej domeny antygenu protekcyjnego Bacillus anthracis powielono w reakcji PCR z użyciem primerów PA-4DP (primer wiodący, o sekwencji pokazanej na fig. 4 oraz jako sek. nr 10) i PA-4DK (primer odwrotny, o sekwencji pokazanej na fig. 4 oraz jako sek. nr 13) fragment o długości 429 pz (zgodnie z numeracją sekwencji z GeneBank, numer dostępu AF065404). Primery PA-4DP i PA-4DK zaprojektowano na podstawie sekwencji czwartej domeny antygenu protekcyjnego Bacillus anthracis. Primer wiodący wprowadza miejsce rozpoznawane przez nukleazy restrykcyjne EcoRI i NdeI, a odwrotny miejsce rozpoznawane przez nukleazę restrykcyjną HindIII. Mieszaninę po reakcji PCR rozdzielono elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym. Powielony fragment DNA wyeluowano z żelu poliakryloamidowego, a następnie trawiono nukleazami restrykcyjnymi NdeI i HindIII, i odbiałczono. Otrzymany fragment, o sekwencji przedstawionej na fig. 10 oraz jako sek. nr 14, ligowano z wektorem pIGDMCT7RS trawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi i odbiałczonym po trawieniu. Poprawność sekwencji fragmentu włączonego do wektora zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Otrzymano wektor pIGCmT7PA-4D (fig. 11).

P r z y k ł a d III. Konstrukcja wektora pT7RSKesKrE2.

Z wektora pIGCmT7KesKrE2 wytrawiono enzymami restrykcyjnymi NdeI i HindIII nukleotydowy segment kodujący fragment białka E2 CSFV (KrE2), terminator w tryptofanowy i APH. Fragment ten ligowano z wektorem pT7RS trawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi i odbiałczonym po

PL 216 037 B1 trawieniu. Poprawność sekwencji fragmentu włączonego do wektora zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Otrzymano wektor pT7RSKesKrE2 (fig. 12) z kasetą ekspresyjną zawierającą pod promotorem T7 nukleotydowy segment KrE2+Stop+Term+APH o sekwencji przedstawionej na fig. 7 oraz jako sek. nr 7.

P r z y k ł a d IV układ ekspresyjny i jego działanie

Działanie układu w obecności kasety w wektorach według wynalazku, w których ekspresja jest oparta na promotorze faga T7, sprawdzono dla dwu różnych docelowych polipeptydów i dwu wektorów ekspresyjnych. Oryginalnie użyte sekwencje kodujące białka rekombinowane pochodzą z różnych organizmów: białko E2 (KrE2) z wirusa, białko PA-4D z bakterii.

Plazmidami zawierającymi sprawdzoną wstawkę transformowano komórki E. coli szczep BL21(DE3). Szczep E. coli BL21(DE3) i jego pochodne zawierają wprowadzony do chromosomu gen kodujący polimerazę RNA faga T7 pod kontrolą promotora lacUV5, rozpoznawanego przez bakteryjną polimerazę RNA. Transkrypcja z promotora IacUV5 jest indukowana przez IPTG. Pomiędzy promotorem, a genem kodującym polimerazę RNA T7 znajduje się sekwencja operatorowa, wiążąca białko represorowe blokujące inicjację transkrypcji. Dopiero po związaniu represora z IPTG, co prowadzi do utraty powinowactwa białka do miejsca operatorowego, może rozpocząć się transkrypcja genu polimerazy fagowej. Polimeraza fagowa transkrybuje gen w wektorze ekspresyjnym znajdujący się pod kontrolą promotora rozpoznawanego przez polimerazę RNA T7.

Do transformacji komórek E. coli wykorzystano metodę transformacji kompetentnych komórek bakteryjnych E. coli opisaną przez Chung i Miller [Chung CT, Miller RH. A rapid and convenient method for preparation and storage of competent bacterial cells, Nucleic Acids Res. 1988 Apr 25; 16(8):3580].

Schemat eksperymentów

Przeprowadzono 3 eksperymenty, w których:

1. Hodowano bakterie E. coli niosące plazmid pIGCmT7KesKrE2.

2. Hodowano bakterie E. coli niosące plazmid pT7RSKesKrE2.

3. Hodowano bakterie E. coli niosące plazmid pIGCmT7KesPA-4D i bakterie E. coli niosące pIGCmT7PA-4D.

W eksperymencie 1 sprawdzono poziom ekspresji białka KrE2 w E. coli niosących pT7RSKesKrE2 w hodowli zawierającej jako czynnik selekcyjny chloramfenikol (selekcjonuje bakterie niosące wektor ekspresyjny) względem poziomu ekspresji białka KrE2 w hodowli zawierającej jako czynnik selekcyjny kanamycynę (selekcjonuje bakterie niosące wektor ekspresyjny i ekspresjonujące białko KrE2).

W eksperymencie 2 sprawdzono poziom ekspresji białka KrE2 w E. coli niosących pT7RSKesKrE2 w hodowli zawierającej jako czynnik selekcyjny ampicylinę (selekcjonuje bakterie niosące wektor ekspresyjny) względem poziomu ekspresji białka KrE2 w hodowli zawierającej jako czynnik selekcyjny kanamycynę (selekcjonuje bakterie niosące wektor ekspresyjny i ekspresjonujące białko KrE2).

W eksperymencie 3 sprawdzono poziom ekspresji białka PA-4D w E. coli niosących pIGCmT7PA-4D w hodowli zawierającej jako czynnik selekcyjny chloramfenikol (selekcjonuje bakterie niosące wektor ekspresyjny) względem E. coli niosących pIGCmT7KesPA-4D w hodowli zawierającej jako czynnik selekcyjny kanamycynę (selekcjonuje bakterie niosące wektor ekspresyjny i ekspresjonujące białko PA-4D). Dodatkowo w tym eksperymencie porównano poziom ekspresji docelowego polipeptydu otrzymywanego w standardowo wykorzystywanym systemie zawierającym sam promotor faga T7 i poziom ekspresji tego docelowego polipeptydu otrzymywanego w układzie według wynalazku. W tym celu użyto standardowy wektor z promotorem faga T7, do którego wklonowano sekwencję kodującą PA-4D (pIGCmT7PA-4D) i wektor zmodyfikowany (pIGCmT7KesPA-4D), zawierający sekwencję kodującą PA-4D jako część nukleotydowego segmentu kasety według wynalazku.

W każdym z eksperymentów przeprowadzano ekspresję białek. W tym celu bakterie E. coli szczep BL21(DE3) niosące odpowiedni rekombinowany plazmid hodowano w 3 ml pożywki LB zawierającej chloramfenikol (17 μg/ml) w 37°C przez 3 godziny, po czym rozcieńczono świeżym podłożem LB (1:100) zawierającym kanamycynę (25 μg/ml) i wytrząsano w 37°C do momentu osiągnięcia A600=0,4. Następnie indukowano ekspresję docelowego polipeptydu przez dodanie izopropylotiogalactozydu (IPTG, do końcowego stężenie 0,1 mM) i wytrząsano przez kolejne 18 godzin. W trakcie hodowli prowadzonej po indukcji co 2 godziny pobierano próby do pomiaru A600 i do nałożenia na żel poliakryloamidowym (SDS-PAGE).

PL 216 037 B1

Obecność i ilość docelowego polipeptydu w komórkach bakteryjnych analizowano poddając lizaty bakteryjne rozdziałowi elektroforetycznemu w 15% żelu SDS-PAGE, zgodnie z metodą opisaną przez Laemmli [Laemmli UK. Cleavage of structurals proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15; 227(5259):680-5].

Białka wizualizowano barwnikiem Coomassie Brillant Blue G.

Obrazy rozdziałów elektroforetycznych lizatów bakteryjnych z prób pobranych w eksperymencie 1 przedstawiono na figurach 13 i 14.

Ścieżki:

LMW - Wzorzec mas białkowych LMW. Zawiera polipeptydy o masach: 97, 66, 45, 30, 20,1 i 14,4 kDa.

1. Lizat bakterii E. coli transformowanych wektorem pIGCmT7KesKrE2 hodowanych w pożywce bez kanamycyny (Km^-), z chloramfenikolem (Cm⁺) Hodowla przed indukcją.

2. Lizat bakterii E. coli transformowanych wektorem pIGCmT7KesKrE2, hodowanych w pożywce z kanamycyną (Km⁺). Hodowla przed indukcją.

3, 5, 7, 9, 11, 13. Lizaty bakterii E. coli transformowanych wektorem pIGCmT7KesKrE2 hodowanych w pożywce Km^-, Cm⁺. Próby pobierane z hodowli po indukcji co 2 godziny.

4, 6, 8, 10, 12, 14. Lizaty bakterii E. coli transformowanych wektorem pIGCmT7KesKrE2 hodowanych w pożywce Km⁺. Próby pobierane z hodowli po indukcji co 2 godziny.

Na rozdziałach tych poziom ekspresji białka KrE2 oznaczono strzałką. Widoczny jest zmniejszający się poziom ekspresji tego białka w czasie hodowli prowadzonej bez dodatku kanamycyny w porównaniu z poziomem ekspresji tego białka w hodowli zawierającej kanamycynę. Różnica w poziomie ekspresji widoczna jest w ścieżkach z rozdziałów elektroforetycznych lizatów bakterii pobranych już po 6 godzinach od indukcji ekspresji docelowego polipeptydu. Różnica ta zwiększa się w czasie na niekorzyść poziomu ekspresji w hodowli bez dodatku kanamycyny.

Obrazy rozdziałów elektroforetycznych lizatów bakteryjnych z prób pobranych w eksperymencie 2 przedstawiono na fig. 15.

Ścieżki:

1. Lizat bakterii E. coli transformowanych wektorem pT7RSKesKrE2 hodowanych w pożywce bez kanamycyny (Km^-), z ampicyliną (Amp⁺). Hodowla przed indukcją.

2. Lizat bakterii E. coli transformowanych wektorem pT7RSKesKrE2 hodowanych w pożywce z kanamycyną (Km⁺). Hodowla przed indukcją.

3, 5, 7, 9, 11. Lizaty bakterii E. coli transformowanych wektorem pT7RSKesKrE2 hodowanych w pożywce Km^-, Amp⁺. Próby pobierane z hodowli po indukcji co 2 godziny.

4, 6, 8, 10, 12. Lizaty bakterii E. coli transformowanych wektorem pT7RSKesKrE2 hodowanych w pożywce Km⁺. Próby pobierane z hodowli po indukcji co 2 godziny.

Na rozdziałach tych poziom ekspresji białka KrE2 oznaczono strzałką. Widoczny jest zmniejszający się poziom ekspresji tego białka w czasie hodowli prowadzonej bez dodatku kanamycyny w porównaniu z poziomem ekspresji tego białka w hodowli zawierającej kanamycynę. Różnica w poziomie ekspresji widoczna jest w ścieżkach z rozdziałów elektroforetycznych lizatów bakterii pobranych już po 8 godzinach od indukcji ekspresji docelowego polipeptydu. Różnica ta zwiększa się w czasie na niekorzyść poziomu ekspresji w hodowli bez dodatku kanamycyny.

Obrazy rozdziałów elektroforetycznych lizatów bakteryjnych z prób pobranych w eksperymencie 3 przedstawiono na fig. 16 i 17.

Ścieżki:

LMW - Wzorzec mas białkowych LMW. Zwiera polipeptydy o masach: 97, 66, 45, 30, 20,1

14,4 kDa.

1. Lizat bakterii E. coli transformowanych wektorem pIGCmT7KesPA-4D hodowanych w pożywce z kanamycyną (Km⁺). Hodowla przed indukcją.

2. Lizat bakterii E. coli transformowanych wektorem pIGCmT7PA-4D hodowanych w pożywce z chloramfenikolem. Hodowla przed indukcją.

3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21. Lizaty bakterii E. coli transformowanych wektorem pIGCmT7PA-4D hodowanych w pożywce z chloramfenikolem. Próby pobierane z hodowli po indukcji co godziny.

4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22. Lizaty bakterii E. coli transformowanych wektorem pIGCmT7KesPA-4D hodowanych w pożywce z kanamycyną. Próby pobierane z hodowli po indukcji co 2 godziny.

PL 216 037 B1

Na rozdziałach tych poziom ekspresji białka PA-4D oznaczono strzałką. Widoczny jest zmniejszający się poziom ekspresji tego białka w czasie hodowli prowadzonej bez dodatku kanamycyny (hodowla z chloramfenikolem) w porównaniu z poziomem ekspresji tego białka w hodowli zawierającej kanamycynę. Różnica w poziomie ekspresji widoczna jest w ścieżkach z rozdziałów elektroforetycznych lizatów bakterii pobranych już po 8 godzinach od indukcji ekspresji docelowego polipeptydu. Różnica ta zwiększa się w czasie na niekorzyść poziomu ekspresji w hodowli bez dodatku kanamycyny. Dodatkowo w tym eksperymencie porównano poziom ekspresji docelowego polipeptydu otrzymywanego w standardowo wykorzystywanym systemie zawierającym sam promotor faga T7 i poziom ekspresji tego docelowego polipeptydu otrzymywanego w układzie według wynalazku. W tym celu użyto standardowy wektor z promotorem faga T7, do którego wklonowano sekwencję kodującą PA-4D (pIGCmT7PA-4D) i wektor zmodyfikowany (pIGCmT7KesPA-4D), zawierający sekwencję kodującą PA-4D jako część nukleotydowego segmentu kasety według wynalazku. Z obrazu prób pobranych na wczesnych etapach hodowli (pierwsze 4 godziny po indukcji ekspresji docelowego polipeptydu) wynika, że ekspresja docelowego polipeptydu odbywa się na tym samym poziomie w standardowo wykorzystywanym układzie zawierającym sam promotor faga T7 i układzie według wynalazku. Jest to możliwe, ponieważ w układzie według wynalazku charakterystyczna dla promotora faga T7 wysoka ekspresja skierowana jest głównie na polipeptyd docelowy.

W procesie prowadzonym sposobem według wynalazku z hodowli eliminowane są komórki bakteryjne, w chromosomie których pojawiła się mutacja powodująca brak produkcji funkcjonalnej polimerazy faga T7 i/lub w których, w wyniku mutacji, stracił funkcjonalność promotor faga T7. Funkcjonalna polimeraza i rozpoznawany przez nią promotor faga T7 są niezbędne do uzyskania ekspresji. Oznacza to, że z hodowli eliminowane są komórki bakteryjne nie produkujące docelowego polipeptydu, które rosną i dzielą się szybciej. Unika się więc „przerastania” hodowli komórkami bakteryjnymi nie ekspresjonującymi docelowego polipeptydu.

PL 216 037 B1

WYKAZ SEKWENCJI

Zgłaszający: INSTYTUT BIOTECHNOLOGII I ANTYBIOTYKÓW

Tytuł: „Kaseta ekspresyjna, wektor, komórka gospodarza, sposób otrzymywania polipeptydu oraz zastosowanie”

Ilość sekwencji: 14

Sek. nr 1 ( syntetyczny primer KanPIGP):

ggggtcgacg cggccgcaag gggtgttatg agcca

Sek. nr 2 (syntetyczny primer KanPIGk):

aaaagcttag aaaaactcat cgagca

Sek. nr 3 (syntetyczny oligonukleotyd Term Tryl):

tcgacctaag cggccgcta atcccacagc cgccagttc

Sek. nr 4 (syntetyczny oligonukleotyd Term Try2):

cgctggcggc atttt

Sek. nr 5 (syntetyczny oligonukleotyd Term Try3):

gcggaactgg cggctgtggg attagcggcc gcttagg

Sek. nr 6 (syntetyczny oligonukleotyd Term Try 4):

ggccaaaatg ccgcca

PL 216 037 B1

Sek. nr 7 +1 MetAlaArg LeuAlaCys LysGluAsp HisArgTyrAla IleSerThr ThrAsnGlu Ndel

CATATGGCAC GTCTAGCCTG CAAGGAAGAT CACAGGTACG CTATATCAAC AACCAATGAG GTATACCGTG CAGATCGGAC GTTCCTTCTA GTGTCCATGC GATATAGTTG TTGGTTACTC +1 IleGlyLeuHis GlyAlaGlu GlyLeuThr ThrThrTrpLys GluTyrAsn HisAsnLeu 61 ATAGGGCTAC ATGGGGCCGA AGGTCTCACT ACCACCTGGA AAGAATACAA CCACAATTTG TATCCCGATG TACCCCGGCT TCCAGAGTGA TGGTGGACCT TTCTTATGTT GGTGTTAAAC +1 GlnLeuAspAsp GlyThrVal LysAlalle CysMetAlaGly SerPheLys ValThrAla 121 CAACTGGATG ATGGGACCGT CAAGGCCATC TGCATGGCAG GTTCCTTTAA AGTCACAGCA GTTGACCTAC TACCCTGGCA GTTCCGGTAG ACGTACCGTC CAAGGAAATT TCAGTGTCGT +1 LeuAsnValVal SerArgArg TyrLeuAla SerLeuHisLys AspAlaLeu ProThrSer 181 CTTAATGTGG TTAGTAGGAG GTATCTGGCA TCATTACATA AGGACGCTTT ACCCACTTCC GAATTACACC AATCATCCTC CATAGACCGT AGTAATGTAT TCCTGCGAAA TGGGTGAAGG +1 ValThrPheGlu LeuLeuPhe AspGlyThr SerProLeuThr GluGluMet GlyAspAsp 241 GTGACATTCG AGCTCCTGTT CGACGGGACC AGCCCATTGA CCGAGGAAAT GGGAGATGAC CACTGTAAGC TCGAGGACAA GCTGCCCTGG TCGGGTAACT GGCTCCTTTA CCCTCTACTG +1 PheGlyPheGly LeuCysPro TyrAspThr SerProValVal LysGlyLys TyrAsnThr 301 TTCGGGTTCG GACTGTGTCC GTATGATACG AGCCCTGTAG TCAAGGGAAA ATACAACACA AAGCCCAAGC CTGACACAGG CATACTATGC TCGGGACATC AGTTCCCTTT TATGTTGTGT +1 ThrLeuLeuAsn GlySerAla PheTyrLeu ValCysProIle GlyTrpThr GlyValIle 361 ACCTTGTTGA ATGGTAGTGC ATTCTACCTA GTTTGCCCAA TAGGGTGGAC GGGTGTTATA TGGAACAACT TACCATCACG TAAGATGGAT CAAACGGGTT ATCCCACCTG CCCACAATAT +1 GluCysThrAla ValSerPro ThrThrLeu ArgThrGluVal ValLysThr PheArgArg 421 GAGTGCACGG CAGTGAGCCC GACAACTCTG AGAACAGAAG TGGTAAAGAC CTTCAGAAGA CTCACGTGCC GTCACTCGGG CTGTTGAGAC TCTTGTCTTC ACCATTTCTG GAAGTCTTCT +1 GluLysProPhe ProTyrArg ArgAspCys ValThrThrThr ValGluAsn GluAspLeu 481 GAGAAACCCT TTCCGTACAG AAGGGATTGT GTGACCACTA CAGTGGAAAA TGAAGATCTA CTCTTTGGGA AAGGCATGTC TTCCCTAACA CACTGGTGAT GTCACCTTTT ACTTCTAGAT +1 PheTyrCysLys TrpGlyGly AsnTrpThr CysValLysGly GluProVal ThrTyrThr 541 TTCTACTGTA AATGGGGGGG CAATTGGACA TGTGTGAAAG GTGAACCAGT GACCTACACG AAGATGACAT TTACCCCCCC GTTAACCTGT ACACACTTTC CACTTGGTCA CTGGATGTGC +1 GlyGlyProVal LysGlnCys ArgTrpCys GlyPheAspPhe AsnGluPro AspGlyLeu 601 GGGGGGCCAG TAAAACAATG CAGATGGTGT GGCTTCGACT TCAATGAGCC TGACGGACTC CCCCCCGGTC ATTTTGTTAC GTCTACCACA CCGAAGCTGA AGTTACTCGG ACTGCCTGAG

PL 216 037 B1 +1 ProHisTyr***

661 CCACACTACT AACTCGACCT AAGCGGCCGC TAATCCCACA GCCGCCAGTT CCGCTGGCGG GGTGTGATGA TTGAGCTGGA TTCGCCGGCG ATTAGGGTGT CGGCGGTCAA GGCGACCGCC +2 MetSerHis IleGlnArg GluThrSerCys SerArgPr

721 CATTTTGGCC GCAAGGGGTG TTATGAGCCA TATTCAACGG GAAACGTCTT GCTCGAGGCC GTAAAACCGG CGTTCCCCAC AATACTCGGT ATAAGTTGCC CTTTGCAGAA CGAGCTCCGG +2 oArgLeuAsn SerAsnMetAsp AlaAspLeu TyrGlyTyr LysTrpAlaArg AspAsnVa 781 GCGATTAAAT TCCAACATGG ATGCTGATTT ATATGGGTAT AAATGGGCTC GCGATAATGT CGCTAATTTA AGGTTGTACC TACGACTAAA TATACCCATA TTTACCCGAG CGCTATTACA +2 lGlyGlnSer GlyAlaThrlle TyrArgLeu TyrGlyLys ProAspAlaPro GluLeuPh 841 CGGGCAATCA GGTGCGACAA TCTATCGATT GTATGGGAAG CCCGATGCGC CAGAGTTGTT GCCCGTTAGT CCACGCTGTT AGATAGCTAA CATACCCTTC GGGCTACGCG GTCTCAACAA +2 eLeuLysHis GlyLysGlySer ValAlaAsn AspValThr AspGluMetVal ArgLeuAs 901 TCTGAAACAT GGCAAAGGTA GCGTTGCCAA TGATGTTACA GATGAGATGG TCAGACTAAA AGACTTTGTA CCGTTTCCAT CGCAACGGTT ACTACAATGT CTACTCTACC AGTCTGATTT +2 nTrpLeuThr GluPheMetPro LeuProThr IleLysHis PhelleArgThr ProAspAs 961 CTGGCTGACG GAATTTATGC CTCTTCCGAC CATCAAGCAT TTTATCCGTA CTCCTGATGA GACCGACTGC CTTAAATACG GAGAAGGCTG GTAGTTCGTA AAATAGGCAT GAGGACTACT +2 pAlaTrpLeu LeuThrThrAla IleProGly LysThrAla PheGlnValLeu GluGluTy 1021 TGCATGGTTA CTCACCACTG CGATCCCCGG AAAAACAGCA TTCCAGGTAT TAGAAGAATA ACGTACCAAT GAGTGGTGAC GCTAGGGGCC TTTTTGTCGT AAGGTCCATA ATCTTCTTAT +2 rProAspSer GlyGluAsnlle ValAspAla LeuAlaVal PheLeuArgArg LeuHisSe 1081 TCCTGATTCA GGTGAAAATA TTGTTGATGC GCTGGCAGTG TTCCTGCGCC GGTTGCATTC AGGACTAAGT CCACTTTTAT AACAACTACG CGACCGTCAC AAGGACGCGG CCAACGTAAG +2 rIleProVal CysAsnCysPro PheAsnSer AspArgVal PheArgLeuAla GlnAlaGl 1141 GATTCCTGTT TGTAATTGTC CTTTTAACAG CGATCGCGTA TTTCGTCTCG CTCAGGCGCA CTAAGGACAA ACATTAACAG GAAAATTGTC GCTAGCGCAT AAAGCAGAGC GAGTCCGCGT +2 nSerArgMet AsnAsnGlyLeu ValAspAla SerAspPhe AspAspGluArg AsnGlyTr 1201 ATCACGAATG AATAACGGTT TGGTTGATGC GAGTGATTTT GATGACGAGC GTAATGGCTG TAGTGCTTAC TTATTGCCAA ACCAACTACG CTCACTAAAA CTACTGCTCG CATTACCGAC +2 pProValGlu GlnValTrpLys GluMetHis LysLeuLeu ProPheSerPro AspSerVa 1261 GCCTGTTGAA CAAGTCTGGA AAGAAATGCA TAAACTTTTG CCATTCTCAC CGGATTCAGT CGGACAACTT GTTCAGACCT TTCTTTACGT ATTTGAAAAC GGTAAGAGTG GCCTAAGTCA +2 lValThrHis GlyAspPheSer LeuAspAsn LeullePhe AspGluGlyLys LeulleGI 1321 CGTCACTCAT GGTGATTTCT CACTTGATAA CCTTATTTTT GACGAGGGGA AATTAATAGG GCAGTGAGTA CCACTAAAGA GTGAACTATT GGAATAAAAA CTGCTCCCCT TTAATTATCC +2 yCysIleAsp ValGlyArgVal GlylleAla AspArgTyr GlnAspLeuAla IleLeuTr 1381 TTGTATTGAT GTTGGACGAG TCGGAATCGC AGACCGATAC CAGGATCTTG CCATCCTATG

PL 216 037 B1

AACATAACTA CAACCTGCTC AGCCTTAGCG TCTGGCTATG GTCCTAGAAC GGTAGGATAC +2 pAsnCysLeu GlyGluPheSer ProSerLeu GlnLysArg LeuPheGlnLys TyrGlyll 1441 GAACTGCCTC GGTGAGTTTT CTCCTTCATT ACAGAAACGG CTTTTTCAAA AATATGGTAT CTTGACGGAG CCACTCAAAA GAGGAAGTAA TGTCTTTGCC GAAAAAGTTT TTATACCATA +2 eAspAsnPro AspMetAsnLys LeuGlnPhe HisLeuMet LeuAspGluPhe Phe***

Hindlll

1501 TGATAATCCT GATATGAATA AATTGCAGTT TCATTTGATG CTCGATGAGT TTTTCTAAGC ACTATTAGGA CTATACTTAT TTAACGTCAA AGTAAACTAC GAGCTACTCA AAAAGATTCG

1561 TT AA

Sek. nr 8 (syntetyczny primer BRESAMA):

gaggggatcc atatggcacg tctagcctgc aaggaagat

Sek. nr 9 (syntetyczny primer UBIBREKI):

aaaagcttct cgagttagta gtgtgggagt ccgtcag

Sek. nr 10 (syntetyczny primer PA-4DP):

ggggaattca tatgaaacgt tttcattatg atcgcaataa c

Sek. nr 11 (syntetyczny primer PA4DKXho):

aaaagcttct cgagttatcc tatctcatag ccttttttag

PL 216 037 B1

Sek. nr 12 +1 MetLysArg PheHisTyr AspArgAsn AsnIleAlaVal GlyAlaAsp GluSerVal Ndel

CATATGAAAC GTTTTCATTA TGATCGCAAT AACATAGCAG TTGGGGCGGA TGAGTCAGTA GTATACTTTG CAAAAGTAAT ACTATCTTTA TTGTATCGTC AACCCCGCCT ACTCAGTCAT +1 ValLysGluAla HisArgGlu ValIleAsn SerSerThrGlu GlyLeuLeu LeuAsnlle 61 GTTAAGGAGG CTCATAGAGA AGTAATTAAT TCGTCAACAG AGGGATTATT GTTAAATATT CAATTCCTCC GAGTATCTCT TCATTAATTA AGCAGTTGTC TCCCTAATAA CAATTTATAA +1 AspLysAspIle ArgLyslle LeuSerGly TyrIleValGlu IleGluAsp ThrGluGly 121 GATAAGGATA TAAGAAAAAT ATTATCAGGT TATATTGTAG AAATTGAAGA TACTGAAGGG CTATTCCTAT ATTCTTTTTA TAATAGTCCA ATATAACATC TTTAACTTCT ATGACTTCCC +1 LeuLysGluVal IleAsnAsp ArgTyrAsp MetLeuAsnlle SerSerLeu ArgGlnAsp 181 CTTAAAGAAG TTATAAATGA CAGATATGAT ATGTTGAATA TTTCTAGTTT ACGGCAAGAT GAATTTCTTC aatatttact gtctatacta tacaacttat aaagatcaaa tgccgttcta +1 GlyLysThrPhe IleAspPhe LysLysTyr AsnAspLysLeu ProLeuTyr IleSerAsn 241 ggaaaaacat ttatagattt taaaaaatat aatgataaat taccgttata tataagtaat CCTTTTTGTA AATATCTAAA ATTTTTTATA TTACTATTTA ATGGCAATAT ATATTCATTA +1 ProAsnTyrLys ValAsnVal TyrAlaVal ThrLysGluAsn Thrllelle AsnProSer 301 CCCAATTATA AGGTAAATGT ATATGCTGTT ACTAAAGAAA ACACTATTAT TAATCCTAGT GGGTTAATAT TCCATTTACA TATACGACAA TGATTTCTTT TGTGATAATA ATTAGGATCA +1 GluAsnGlyAsp ThrSerThr AsnGlylle LysLysIleLeu IlePheSer LysLysGly 361 GAGAATGGGG ATACTAGTAC CAACGGGATC AAGAAAATTT TAATCTTTTC TAAAAAAGGC CTCTTACCCC TATGATCATG GTTGCCCTAG TTCTTTTAAA ATTAGAAAAG ATTTTTTCCG +1 TyrGluIleGly ***

421 TATGAGATAG GATAACTCGA CCTAAGCGGC CGCTAATCCC ACAGCCGCCA GTTCCGCTGG ATACTCTATC CTATTGAGCT GGATTCGCCG GCGATTAGGG TGTCGGCGGT CAAGGCGACC +2 MetSer HisIleGln ArgGluThrSer CysSerAr

481 CGGCATTTTG GCCGCAAGGG GTGTTATGAG CCATATTCAA CGGGAAACGT CTTGCTCGAG GCCGTAAAAC CGGCGTTCCC CACAATACTC GGTATAAGTT GCCCTTTGCA GAACGAGCTC +2 gProArgLeu AsnSerAsnMet AspAlaAsp LeuTyrGly TyrLysTrpAla ArgAspAs 541 GCCGCGATTA AATTCCAACA TGGATGCTGA TTTATATGGG TATAAATGGG CTCGCGATAA CGGCGCTAAT TTAAGGTTGT ACCTACGACT AAATATACCC ATATTTACCC GAGCGCTATT +2 nValGlyGln SerGlyAlaThr HeTyrArg LeuTyrGly LysProAspAla ProGluLe 601 TGTCGGGCAA TCAGGTGCGA CAATCTATCG ATTGTATGGG AAGCCCGATG CGCCAGAGTT ACAGCCCGTT AGTCCACGCT GTTAGATAGC TAACATACCC TTCGGGCTAC GCGGTCTCAA

PL 216 037 B1 +2 uPheLeuLys HisGlyLysGly SerValAla AsnAspVal ThrAspGluMet ValArgLe 661 GTTTCTGAAA CATGGCAAAG GTAGCGTTGC CAATGATGTT ACAGATGAGA TGGTCAGACT CAAAGACTTT GTACCGTTTC CATCGCAACG GTTACTACAA TGTCTACTCT ACCAGTCTGA +2 uAsnTrpLeu ThrGluPheMet ProLeuPro ThrlleLys HisPhelleArg ThrProAs 721 AAACTGGCTG ACGGAATTTA TGCCTCTTCC GACCATCAAG CATTTTATCC GTACTCCTGA TTTGACCGAC TGCCTTAAAT ACGGAGAAGG CTGGTAGTTC GTAAAATAGG CATGAGGACT +2 pAspAlaTrp LeuLeuThrThr AlallePro GlyLysThr AlaPheGlnVal LeuGluGl 781 TGATGCATGG TTACTCACCA CTGCGATCCC CGGAAAAACA GCATTCCAGG TATTAGAAGA ACTACGTACC AATGAGTGGT GACGCTAGGG GCCTTTTTGT CGTAAGGTCC ATAATCTTCT +2 uTyrProAsp SerGlyGluAsn IleValAsp AlaLeuAla ValPheLeuArg ArgLeuHi 841 ATATCCTGAT TCAGGTGAAA ATATTGTTGA TGCGCTGGCA GTGTTCCTGC GCCGGTTGCA TATAGGACTA AGTCCACTTT TATAACAACT ACGCGACCGT CACAAGGACG CGGCCAACGT +2 sSerllePro ValCysAsnCys ProPheAsn SerAspArg ValPheArgLeu AlaGlnAl 901 TTCGATTCCT GTTTGTAATT GTCCTTTTAA CAGCGATCGC GTATTTCGTC TCGCTCAGGC AAGCTAAGGA CAAACATTAA CAGGAAAATT GTCGCTAGCG CATAAAGCAG AGCGAGTCCG +2 aGlnSerArg MetAsnAsnGly LeuValAsp AlaSerAsp PheAspAspGlu ArgAsnGl 961 GCAATCACGA ATGAATAACG GTTTGGTTGA TGCGAGTGAT TTTGATGACG AGCGTAATGG CGTTAGTGCT TACTTATTGC CAAACCAACT ACGCTCACTA AAACTACTGC TCGCATTACC +2 yTrpProVal GluGlnValTrp LysGluMet HisLysLeu LeuProPheSer ProAspSe 1021 CTGGCCTGTT GAACAAGTCT GGAAAGAAAT GCATAAACTT TTGCCATTCT CACCGGATTC GACCGGACAA CTTGTTCAGA CCTTTCTTTA CGTATTTGAA AACGGTAAGA GTGGCCTAAG +2 rValValThr HisGlyAspPhe SerLeuAsp AsnLeulle PheAspGluGly LysLeuIl 1081 AGTCGTCACT CATGGTGATT TCTCACTTGA TAACCTTATT TTTGACGAGG GGAAATTAAT TCAGCAGTGA GTACCACTAA AGAGTGAACT ATTGGAATAA AAACTGCTCC CCTTTAATTA +2 eGlyCysIle AspValGlyArg ValGlyIle AlaAspArg TyrGlnAspLeu AlalleLe 1141 AGGTTGTATT GATGTTGGAC GAGTCGGAAT CGCAGACCGA TACCAGGATC TTGCCATCCT TCCAACATAA CTACAACCTG CTCAGCCTTA GCGTCTGGCT ATGGTCCTAG AACGGTAGGA +2 uTrpAsnCys LeuGlyGluPhe SerProSer LeuGlnLys ArgLeuPheGln LysTyrGl 1201 ATGGAACTGC CTCGGTGAGT TTTCTCCTTC ATTACAGAAA CGGCTTTTTC AAAAATATGG TACCTTGACG GAGCCACTCA AAAGAGGAAG TAATGTCTTT GCCGAAAAAG TTTTTATACC +2 ylleAspAsn ProAspMetAsn LysLeuGln PheHisLeu MetLeuAspGlu PhePhe** Hindlll

1261 TATTGATAAT CCTGATATGA ATAAATTGCA GTTTCATTTG ATGCTCGATG AGTTTTTCTA ATAACTATTA GGACTATACT TATTTAACGT CAAAGTAAAC TACGAGCTAC TCAAAAAGAT +2 *

1321 AGCTT TCGAA

PL 216 037 B1

Sek. nr 13 (syntetyczny primer PA-4DK): aaaagcttat cctatctcat agcctttttt ag

Sek. nr 14 +1 MetLysArg PheHisTyr AspArgAsn AsnIleAlaVal GlyAlaAsp GluSerVal Ndel

CATATGAAAC GTTTTCATTA TGATCGCAAT AACATAGCAG TTGGGGCGGA TGAGTCAGTA GTATACTTTG CAAAAGTAAT ACTATCTTTA TTGTATCGTC AACCCCGCCT ACTCAGTCAT +1 ValLysGluAla HisArgGlu ValIłeAsn SerSerThrGlu GlyLeuLeu LeuAsnlle 61 GTTAAGGAGG CTCATAGAGA AGTAATTAAT TCGTCAACAG AGGGATTATT GTTAAATATT CAATTCCTCC GAGTATCTCT TCATTAATTA AGCAGTTGTC TCCCTAATAA CAATTTATAA +1 AspŁysAspIle ArgLysIle LeuSerGly TyrIleValGlu IleGluAsp ThrGluGly 121 GATAAGGATA TAAGAAAAAT ATTATCAGGT TATATTGTAG AAATTGAAGA TACTGAAGGG CTATTCCTAT ATTCTTTTTA TAATAGTCCA ATATAACATC TTTAACTTCT ATGACTTCCC +1 LeuLysGluVal IleAsnAsp ArgTyrAsp MetLeuAsnlle SerSerLeu ArgGlnAsp 181 CTTAAAGAAG TTATAAATGA CAGATATGAT ATGTTGAATA TTTCTAGTTT ACGGCAAGAT GAATTTCTTC AATATTTACT GTCTATACTA TACAACTTAT AAAGATCAAA TGCCGTTCTA +1 GlyLysThrPhe IleAspPhe LysLysTyr AsnAspLysLeu ProLeuTyr IleSerAsn 241 GGAAAAACAT TTATAGATTT TAAAAAATAT AATGATAAAT TACCGTTATA TATAAGTAAT CCTTTTTGTA AATATCTAAA ATTTTTTATA TTACTATTTA ATGGCAATAT ATATTCATTA +1 ProAsnTyrLys ValAsnVal TyrAlaVal ThrLysGluAsn Thrllelle AsnProSer 301 CCCAATTATA AGGTAAATGT ATATGCTGTT ACTAAAGAAA ACACTATTAT TAATCCTAGT GGGTTAATAT TCCATTTACA TATACGACAA TGATTTCTTT TGTGATAATA ATTAGGATCA +1 GluAsnGlyAsp ThrSerThr AsnGlylle LysLysIleLeu IlePheSer LysLysGly 361 GAGAATGGGG ATACTAGTAC CAACGGGATC AAGAAAATTT TAATCTTTTC TAAAAAAGGC CTCTTACCCC TATGATCATG GTTGCCCTAG TTCTTTTAAA ATTAGAAAAG ATTTTTTCCG +1 TyrGluIleGly ***

Hindlll

421 TATGAGATAG GATAAGCTT ATACTCTATC CTATTCGAA

Claims

1. Kaseta ekspresyjna zawierająca promotor fagowy funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą polipeptyd docelowy oraz z sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza ekspresjonującego polipeptyd docelowy, gdzie pomiędzy sekwencją kodującą polipeptyd docelowy a sekwencją kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza, znajduje się terminator transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe, zaś kodon stop translacji S na 5' końcu

PL 216 037 B1 przed terminatorem transkrypcji T, przy czym kaseta jest opisana wzorem P-X-(S)bT-M, gdzie P oznacza sekwencję promotora faga, X sekwencję docelową, S oznacza kodon stop translacji, b=1 (obecne) lub b=0 (brak) w sekwencji kasety, T oznacza sekwencję terminatora transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe i M oznacza sekwencję kodującą czynnik selekcyjny warunkujący przeżycie gospodarza, i gdzie sekwencja M kodująca czynnik selekcyjny będący w kasecie, stanowi sekwencję kodującą białkowy czynnik selekcyjny wybrany z grupy obejmującej czynnik wprowadzający oporność na antybiotyk lub czynnik, który komplementuje defekt genetyczny gospodarza lub ich funkcjonalny fragment.

2. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja kodująca czynnik selekcyjny ma zmodyfikowaną niekodującą część na końcu 5', zawierającą sekwencję Shine-Dalgarno, tak że jest gorzej rozpoznawana na mRNA przez rybosomy, przy czym zmiany w sekwencji Shine-Dalgarno wprowadza primer KanPIGP określony sekwencją nr 1, przy czym korzystnie w niekodującej części genu kodującego 3'-fosfotransferazę aminoglikozydową (APH) zamieniono nukleotydy: adeninę w pozycji - 12 na guaninę; tyminę w pozycji - 13 na cytozynę; adeninę w pozycji - 14 na cytozynę; adeninę w pozycji - 15 na guaninę; tyminę w pozycji - 16 na guaninę.

3. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera sekwencję kodującą czynnik wprowadzający oporność na kanamycynę.

4. Kaseta według zastrz. 3, znamienna tym, że sekwencja kodująca czynnik oporności na kanamycynę ma zmodyfikowaną część niekodującą na końcu 5', zawierającą sekwencję Shine-Dalgarno, tak że jest gorzej rozpoznawana na mRNA przez rybosomy.

5. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że terminatorem transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe jest terminator tryptofanowy.

6. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera promotor wybrany spośród promotorów faga T7, T3, T5 i SP6.

7. Kaseta według zastrz. 6, znamienna tym, że zawiera promotor faga T7.

8. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że promotor fagowy jest połączony z nukleotydowym segmentem o sekwencji przedstawionej jako sek. nr 7.

9. Kaseta według zastrz. 1, znamienna tym, że promotor fagowy jest połączony z nukleotydowym segmentem o sekwencji przedstawionej jako sek. nr 12.

10. Zastosowanie kasety ekspresyjnej określonej zastrzeżeniami 1 do 9 w konstrukcji wektora dla układu ekspresyjnego promotor/polimeraza faga w komórce gospodarza prokariotycznego.

11. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że posiada kasetę ekspresyjną określoną zastrzeżeniami 1 do 9.

12. Wektor według zastrz. 11, znamienny tym, że zawiera sekwencję kodującą czynnik selekcyjny, warunkujący przeżycie gospodarza, stanowiącą jednocześnie gen markera selekcyjnego, umożliwiający selekcję komórek niosących wektor.

13. Wektor według zastrz. 11, znamienny tym, że jest wybrany spośród wektorów pIGC m T7KesKrE2, pIGCmT7KesPA-4D i pT7RSKesKrE2.

14. Komórka prokariotycznego gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny jak określono w zastrzeżeniach od 11 do 13.

15. Komórka według zastrz. 14, znamienna tym, że jest nią komórka prokariotycznego gospodarza niosąca gen kodujący polimerazę RNA rozpoznającą promotor fagowy.

16. Komórka według zastrz. 14, znamienna tym, że jest nią komórka E. coli.

17. Komórka według zastrz. 16, znamienna tym, że jest nią E. coli BL21 (DE3).

18. Sposób otrzymywania polipeptydu w prokariotycznym gospodarzu, w układzie promotor/polimeraza faga, znamienny tym, że hoduje się komórki prokariotycznego gospodarza zawierające: a) wektor ekspresyjny z kasetą opisaną wzorem P-X-(S)bT-M, gdzie P oznacza sekwencję promotora faga, X sekwencję docelową, S oznacza kodon stop translacji, b=1 (obecne) lub b=0 (brak) w sekwencji kasety, T oznacza sekwencję terminatora transkrypcji dla promotorów innych niż fagowe i M oznacza sekwencję kodującą czynnik selekcyjny warunkujący przeżycie gospodarza, zaś kodon stop translacji S na 5' końcu przed terminatorem transkrypcji T, i gdzie sekwencja M kodująca czynnik selekcyjny będący w kasecie, stanowi sekwencję kodującą białkowy czynnik selekcyjny wybrany z grupy obejmującej czynnik wprowadzający oporność na antybiotyk lub czynnik, który komplementuje defekt genetyczny gospodarza lub ich funkcjonalny fragment oraz b) gen kodujący polimerazę RNA rozpoznającą promotor fagowy, przy czym hodowlę prowadzi się w warunkach umożliwiających eks20

PL 216 037 B1 presję docelowego polipeptydu oraz czynnika selekcyjnego i jednocześnie zahamowanie wzrostu oraz eliminację komórek, w których brak ekspresji spod promotora fagowego.

19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że sekwencja kodująca czynnik selekcyjny ma zmodyfikowaną niekodującą część na końcu 5', zawierającą sekwencję Shine-Dalgarno, tak że jest gorzej rozpoznawana na mRNA przez rybosomy, przy czym zmiany w sekwencji Shine-Dalgarno wprowadza primer KanPIGP określony sekwencją nr 1, przy czym korzystnie w niekodującej części genu kodującego 3'-fosfotransferazę aminoglikozydową (APH) zamieniono nukleotydy: adeninę w pozycji - 12 na guaninę; tyminę w pozycji - 13 na cytozynę; adeninę w pozycji - 14 na cytozynę; adeninę w pozycji - 15 na guaninę; tyminę w pozycji - 16 na guaninę.