DE2849708C2

DE2849708C2 -

Info

Publication number: DE2849708C2
Application number: DE2849708A
Authority: DE
Inventors: Anthony Keith Cycoed Cardiff Glamorgan Gb Campbell; John Stephen Heath Park Cardiff Glamorgan Gb Alexander; James Stuart Heath Park Cardiff Glamorgan Gb Woodhead
Original assignee: WELSH NATIONAL SCHOOL OF MEDICINE CARDIFF GLAMORGAN GB
Current assignee: WELSH NATIONAL SCHOOL OF MEDICINE CARDIFF GLAMORGAN GB
Priority date: 1977-11-17
Filing date: 1978-11-16
Publication date: 1990-04-26
Also published as: FR2409516B1; CH640061A5; US4478817A; GB2095830A; CA1113392A; DE2858792C2; DE2849708A1; CH645725A5; FR2409516A1; GB2095830B; SE7811630L

Description

Die Erfindung betrifft ein Reagenz, nachfolgend auch als "Lumineszenzreagenz" bezeichnet, zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung einer antigenen Substanz in oder aus biologischen Flüssigkeiten oder Geweben enthaltend einen gegen die antigene Substanz gerichteten Antikörper, der mit einem Lumineszenz-Chromophor gekoppelt ist. Das erfindungsgemäße Reagenz kann für verschiedene biologische Untersuchungen angewandt werden, wie

a) Immuno- und Proteinbindungsuntersuchungen,
b) für die Umsetzung von Substanzen in vivo und in vitro,
c) für die histologische Lokalisierung von Substanzen,
d) zur Feststellung von Substanzen, die einer Weiterverteilung in biologischen Systemen unterliegen, oder für Trennverfahren in vitro, z. B. für Zentrifugier- und Chromatographierverfahren sowie für die Elektrophorese.

Eine Lumineszenzreaktion ist eine unter Emission von Licht vor sich gehende Reaktion. Die Menge des "Lumineszenzreagenzes" wird durch Messung des emittierten Lichts festgestellt, nachdem man die entsprechenden Bedingungen für den Verlauf der Lumineszenzreaktion eingestellt hat. Das Licht kann intensiv oder ganz schwach sein. Seine Ausstrahlung muß aber genügend lang dauern, um eine Feststellung und Messung des Lichts zu ermöglichen. Die Lumineszenz ist klar von der Fluoreszenz und der Phosphoreszenz zu unterscheiden.

Eine Lumineszenzreaktion findet normalerweise zwischen mindestens zwei Molekülen (S und L) mit oder ohne anderen Reaktionsteilnehmern, Cofaktoren, Katalysatoren (D) oder unter dem Einfluß eines physikalischen Auslösemittels statt. L ist die Substanz, die Licht erzeugt, wie Luminol. S ist die Substanz, die sich mit L umsetzt, um einen Anregungszustand zu ergeben, z. B. mit Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid. D stellt, wenn es vorhanden ist, einen Cofaktor dar und/oder einen Katalysator oder eine Auslösemittel, wie ein Enzym, eine Luciferase oder Kaliumferricyanid. Die Umsetzung zwischen L und S führt zur Umwandlung von L in ein angeregtes Molekül L*, und die Rückführung dieses angeregten Moleküls in einen nicht angeregten Zustand verursacht die Emission eines Photons. Die Umsetzung zwischen L und S und der Rückgang von L* in den nicht angeregten Zustand kann spontan vor sich gehen, oder die Gegenwart eines Cofaktors oder eines Katalysators D oder eines physikalischen Auflösemittels, wie Temperatur oder Strahlung erfordern. Ein Beispiel für eine solche Reaktion ist die Oxydation von Luminol durch H₂O₂.

Die Katalysatoren und Cofaktoren stellen wie hier oft anorganische Verbindungen dar, können jedoch auch aus biologischen Materialien extrahiert sein, wie die Enzymperoxidase, die die Lumineszensreaktion von Luminol katalysiert.

Die Bildung und Feststellung des "Lumineszenzreagenzes" kann durch die folgenden allgemeinen Reaktionen beschrieben werden:

Die Synthese des "Lumineszenzreagenzes" läßt sicht veranschaulichen durch:

A+B+andere Reagenzien und/oder Katalysatoren → AB+andere Produkte

Hierbei bedeutet
A den Antikörper, der normalerweise nicht zu einer Lumineszenzreaktion fähig ist,
B die Substanz, die eine Lumineszenzreaktion eingehen kann, und
AB das "Lumineszenzreagenz".

B ist normalerweise aber nicht immer die bindende Substanz und hinsichtlich der Lumineszenz und anderen möglichen Reaktionen, die das Verfahren beeinträchtigen könnten, im wesentlichen beständig. B kann aus L und/oder S und/oder D bestehen und im allgemeinen eine oder mehrere beständige Komponenten eines Mehrfachkomponentenlumineszenzreagenzes umfassen. Gewöhnlich wird bei der synthetischen Herstellung von AB eine oder mehrere der wesentlichen Komponenten oder Bestandteile weggelassen, so daß die Lumineszenzreaktion durch Zugabe der fehlenden Komponente (n) ausgelöst werden kann.

In einigen Fällen muß nur die Substanz A festgestellt, gemessen oder analysiert werden. Die beständige bindende Substanz B wird dann gewöhnlich in einer frühen Stufe des Verfahrens zu A gegeben, während man die übrige(n) Komponente(n) des Lumineszenzreagenzes erst in dem Augenblick zugibt, wenn das emittierte Licht wahrgenommen werden soll.

In anderen Fällen soll die Substanz A mit einer anderen Substanz C umgesetzt werden, wobei sowohl A oder C von Interesse sein können und ermittelt oder analysiert werden sollen. Die Umsetzung kann dann wie folgt veranschaulicht werden:

n AB+C→C(AB)n

wobei
C die mit A reagierende, normalerweise kein Licht emittierende Substanz ist,
n=die Anzahl der Moleküle an AB, die sich mit C vereinigt.

Für die Analyse wird C(AB)n oder die Abnahme von n AB aus der anfänglichen Anzahl von AB Molekülen gemessen.

Zur endgültigen Bestimmung des "Lumineszenzreagenzes" kann die Umsetzung wie folgt geschrieben werden:

AB+weggelassene Komponente (L, S oder D) oder physikalisches Auslösemittel → Produkt+Licht.

Die Menge emittiertes Licht (Lumineszenz) kann in direkte Beziehung zu der dem Reaktionsgemisch zugefügten Konzentration an AB gesetzt werden.

Das zur Zeit populärste Mittel zur Markierung von Antikörpern ist ein radioaktives Isotop, wie ¹²⁵I. Bei dieser Methode wird die Menge der AB-Umsetzung mit C durch Messung der Radioaktivität ermittelt. Radioaktive Reagenzien haben drei Hauptnachteile. Erstens, das Verfahren der Markierung erfordert die Anwendung stark radioaktiver und damit potentiell gefährlicher Reagenzien. Zweitens ist die Lebensdauer der radioaktiv markierten Antikörper oft verhältnismäßig kurz, nicht nur, weil das radioaktive Isotop kontinuierlich zerfällt, sondern auch, weil die radioaktiv markierten Proteine oft unbeständig sind. Drittens, es ist oft schwierig, Proteine in ausreichender Weise zu markieren, um sie zu einem empfindlichen und rasch feststellbaren Reagenz zu machen. Aufgrund der Schädigung des Antikörperproteins durch den radioaktiven Marker ist die Herstellung von Antikörperpräparaten mit hoher spezifischer Aktivität nicht möglich.

Die Erfindung geht demgemäß aus von der Aufgabe, ein nicht-isotopisch markiertes Reagenz zu schaffen, welches mindestens die Empfindlichkeit von ¹²⁵I-markiertem Reagenz aufweist, jedoch dessen Nachteile vermeidet.

Es ist bereits vorgeschlagen worden, fluoreszierende Markierungsmittel anstelle von Isotopen in nicht-kompetitiven immunologischen Nachweisverfahren einzusetzen (Science Progress, Nr. 3415, Seiten 417-422 (1969)). Fluoreszenzmarker weisen jedoch nur eine sehr geringe Empfindlichkeit auf. Während nämlich mit Jod¹²⁵ die Durchführung exakter Nachweisverfahren bis zu Mengen von unterhalb 5×10^-18 Mol möglich ist, liegt die Nachweisbarkeitsgrenze mit Fluoreszenzmarkern bei etwa 10^-13 bis 10^-14.

Ferner werden in der DE-OS 26 18 419 heterogene spezifische Bindungsverfahren zur Bestimmung von Liganden in einem flüssigem Medium mit Markern beschrieben, die in eine chemisch meßbare Reaktion eintreten. In dieser Veröffentlichung werden beiläufig auch Chemolumineszenzmarker erwähnt, ihre Anwendung und ihre vorteilhaften Eigenschaften im Zusammenhang mit der Markierung von Antikörpern für immunologische Nachweisverfahren werden jedoch an keiner Stelle offenbart oder durch den Gesamtinhalt der Publikation nahegelegt.

Überraschenderweise hat es sich erfindungsgemäß gezeigt, daß die Markierung von Antikörpern mit Chemolumineszenz-Chromophoren zu Reagenzien mit verblüffender spezifischer Aktivität und extrem hoher Empfindlichkeit führt.

Die Lumineszenzmessung ist nicht nur stark empfindlich, sondern läßt sich auch sehr rasch durchführen. Die Messung erfordert nur Sekunden im Gegensatz zur Messung der Radioaktivität, die gewöhnlich mehrere Minuten erfordert. Die Kopplung von Antikörpern an Substanzen, die zu einer Lumineszenzreaktion befähigt sind, liefert ein Reagenz, das schnell in sehr geringen Mengen gemessen werden kann.

Eine Substanz, die zur Herstellung eines "Lumineszenzreagenzes" und damit zur Markierung verwendet werden kann, muß vier Erfordernisse erfüllen:

a) Sie muß befähigt sein, eine Lumineszenzreaktion einzugehen,
b) sie muß sich unter Bildung eines Reagenzes, das verhältnismäßig beständig ist, an den Antikörper binden lassen,
c) sie muß nach der Bildung des Reagenzes noch fähig sein, eine Lumineszenzreaktion einzugehen,
d) sie darf die Eigenschaften des Antikörper-Proteins, an das sie gebunden ist, nicht wesentlich ändern, so daß mindestens 60% der markierten Antikörper zu einer Bindung mit der jeweiligen antigenen Substanz befähigt sind.

Generell ausgedrückt, betrifft die Erfindung ein Reagenz zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung einer antigenen Substanz in oder aus biologischen Flüssigkeiten oder Geweben, enthaltend einen gegen die antigene Substanz gerichteten Antikörper, der mit einem Lumineszenz-Chromophor gekoppelt ist, wobei mindestens 60% der markierten Antikörper zu einer Bindung mit der antigenen Substanz befähigt sind.

Die Reaktion kann chemisch mit einem chemischen Reagenz oder Katalysator, oder durch Veränderung des pH-Wertes, oder physikalisch, z. B. durch Anwendung von Wärme oder Bestrahlung, ausgelöst werden. Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das Lumineszenzreagenz mindestens zwei chemische Komponenten, mit oder ohne Cofaktor oder Katalysator, und die bindende oder Markierungskomponente umfaßt eine unvollständige Anzahl der Komponenten oder Elemente, so daß die Lumineszenzreaktion durch nachfolgende Zugabe der wesentlichen fehlenden Komponente(n) oder Elemente ausgelöst wird.

In jedem Fall ist (sind) die Markierungskomponente(n) für die Umsetzung vorzugsweise beständig und verändern die Substanz, an die sie gebunden sind, nicht wesentlich.

Vorzugsweise ist die antigene Substanz ein Protein, ein Antigen, Hapten, ein Hormon, ein Stoffwechselprodukt, Nukleinsäure oder ein Steroid. Das erfindungsgemäße Reagenz enthält Antikörper, die an ein lumineszierendes Material gebunden sind. Die so markierten Antikörper werden verwendet, um die entsprechenden Antigene aufzufinden, zu analysieren und quantitativ festzustellen, wobei mindestens 60% und insbesondere mindestens 80% der Antikörper im Lumineszenzreagenz biologisch wirksam sind, d. h., sie vermögen die entsprechenden Antigene zu binden.

Die gebundenen bzw. markierten Antikörper können dadurch hergestellt werden, daß man ein die Antikörper enthaltendes Medium, wie Serum, vorzugsweise in fester Phase mit den entsprechenden Antigenen in Berührung bringt, um eine Antikörper- Antigen-Bindung herbeizuführen, bevor oder nachdem die Bindung eingetreten ist, eine lumineszierende Substanz zufügt und anschließend die markierten bzw. gebundenen Antikörper von den Antigenen trennt. Die Antigene binden nur die für sie spezifischen Antikörper, und die nachfolgende Dissoziation ergibt lumineszierende Antikörper mit hoher biologischer Wirksamkeit. Die Dissoziation kann durch Einstellung des pH-Wertes des Systems oder durch eine Reduktionsreaktion herbeigeführt werden. Aufgrund der Selektivität der Antigen-Antikörper-Reaktion erhält man "gereinigte" markierte Antikörper. Die Antigene werden vorzugsweise an ein in fester Phase vorliegendes Immuno-Adsorptionsmittel gebunden. Die lumineszierende Substanz kann dem die Antikörper enthaltenden Medium zugegeben werden, bevor oder nachdem dieses Medium mit den Antigenen in Kontakt gebracht wurde. Das Ergebnis ist das gleiche, insofern, als die nicht an die Antigene gebundenen Komponenten des Mediums ausgewaschen werden können und so einen markierten Antigen-Antikörper-Komplex zurücklassen, aus dem die markierten Antikörper dissoziiert werden können. Diese Art der Reinigung ist als immunologische Reinigung bekannt und, wenn das Antigen ein Immunoglobulin ist, kann es zur Herstellung markierter Anti-Immunoglobuline verwendet werden, die in immunologischen Untersuchungen als Universalreagenzien eingesetzt werden können.

Ein markierter Antikörper ist von Natur aus ein Immunoglobulin. In den meisten Fällen können diese gegen Antigene, wie Proteinhormone, Haptene oder andere Moleküle gerichtet werden. In besonderen Fällen können Immunoglobuline selbst als Antigene verwendet werden, z. B. verhält sich Kaninchen IgG (ein Immunoglobulin) wie ein Antigen, wenn es Schafen injeziert wird. Der erzeugte Antikörper bindet Kaninchen IgG, einschließlich spezifischer in Kaninchen erzeugter Antikörper. Zum Beispiel kann Alphafoetoprotein (AFP) dadurch quantitativ bestimmt werden, daß man markierten Kaninchenantikörper an AFP bindet. Alternativ kann AFP dadurch quantitativ bestimmt werden, daß man es zuerst mit nicht markierten Kaninchen- AFP Antikörper umsetzt und dann den gebildeten Komplex durch die Aufnahme von markiertem Schaf-(anti-Kaninchen IgG) Antikörper feststellt. Dieses indirekte Verfahren hat den Vorteil, daß viele immunologische Testsysteme Kaninchenantikörper anwenden. Anstatt sie einzeln zu markieren, kann markieter Schaf-(anti- Kaninchen IgG) Antikörper als "Universalreaktionsmittel" verwendet werden. Andere bevorzugte Universalreagenzien sind Antikörper für Meerschweinchen IgG, Schaf IgG, Zeigen IgG und Esel IgG, da Antiseren gegen bestimmte Moleküle in diesen Arten erzeugt werden können. Die am häufigsten verwendeten Universalreagenzien sind jedoch Schaf-(anti-Kaninchen IgG) und Schaf-(anti-Meerschweinchen IgG). Das "gereinigte" markierte Antikörperpräparat ist außerordenlich beständig, insbesondere, wenn es bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 8 und einer Temperatur unter 0°C, vorzugsweise von etwa -20°C, aufbewahrt wird. Es hat eine Lebensdauer von vielen Monaten. Gegenüber den Radioisotopen, die aufgrund ihrer kontinuierlichen Zersetzung nur eine begrenzte Lebensdauer haben, ist dies von großem Vorteil. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die Radioisotopen Proteine zerstören, während dies die Lumineszenzmarkierungsmittel nicht tun. Markierte Antikörper können für die folgenden Hormone und Proteine erhalten werden: Insulin, Wachstumshormon, Parathyroidhormon, Follikel stimulierendes Hormon, luteinierendes Hormon, Thyroid stimulierendes Hormon, adrenocorticotrophes Hormon, Glucagon, Prolactin, Calcitonin, Alpha- Ferritin, Alphafoetoprotein, Humanimmunoglobulin G (IgG), Kaninchen IgG, Schaf IgG, Meerschweinchen IgG, Esel IgG, die Humanimmunoglobuline E und M und Zellenoberflächenantigene. Markierte Antikörper für Haptene können ebenfalls hergestellt werden. Sie binden Arzneimittel oder cyclische Nucleotide. Die von diesen Hormonen, Proteinen und Haptenen abgeleiteten Antikörper sind besonders wertvoll für die rasche Durchführung immunologischer Untersuchungen. Diese Untersuchungen werden zweckmäßig unter Anwendung sogenannter immunoradiometrischer oder "Doppeltests" durchgeführt.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein die interessierende Substanz, z. B. Antigene, enthaltendes Medium mit Antikörpern in Berührung gebracht, so daß die Antikörper die Substanz selektiv binden, worauf das Bindungsprodukt mit durch lumineszierende Stoffe markierten Antikörpern in Kontakt gebracht und eine Lumineszenzreaktion ausgelöst wird, so daß der Grad der erzeugten Lumineszenz die Menge der interessierenden Substanz angibt.

Vorzugsweise wird die interessierende Substanz an Antikörper auf einer festen Phase gebunden, die aus Zellulosepulver oder der Wandung des Reaktionsgefäßes bestehen kann, z. B. einem Glas- oder Kunststoffrohr. Andere Substanzen des Mediums werden nicht durch die Antikörper gebunden und können so ausgewaschen werden.

Diese "doppelte" Technik ist besonders wirksam, wenn man an Schaf-(anti-Kaninchen IgG) Antikörper gebundenes Luminol oder ein Luminolderivat als Lumineszenzmarkierungsmittel verwendet. Die Wirksamkeit dieses mit Luminol markierten Antikörpers wird durch 9monatige Lagerung bei -20°C nicht beeinträchtigt.

Die Vielzahl der erfindungsgemäß verwendbaren Lumineszenzmarkierungsmittel ist außerordentlich groß.

Die erfindungsgemäßen Lumineszenzmarkierungsmittel können zweckmäßig in zwei Klassen unterteilt werden, nämlich in

1) chemische Lumineszenzmarkierungsmittel und
2) biologische Lumineszenzmarkierungsmittel.

Chemische Lumineszenzmarkierungsmittel umfassen anorganische oder organische Moleküle, die unter Erzeugung von Licht mit anderen Molekülen reagieren können. Diese Substanzen können aus biologischen Materialien extrahiert sein, sind aber in diesem Fall in ihrer natürlichen Umgebung normalerweise nicht an der Emission von Licht beteiligt. Die Lumineszenzreaktion unter Verwendung chemischer Lumineszenzmarkierungsmittel wird durch Zugabe eines bzw. mehrerer geeigneter Reagenzien ausgelöst.

Das Auslösemittel kann ein oxydierendes Mittel, vorzugsweise in einem alkalischen Medium, oder ein Katalysator sein. Ein bevorzugter chemischer Lumineszenzmarkierungsstoff ist eine Verbindung der allgemeinen Formel (I)(a) oder (I)(b)

in denen R₁, R₂ und R₃ Wasserstoff, gegebenenfalls substituierte C₁- bis C₁₀-Alkyl- oder Alkenylgruppen, Amino-, substituierte Amino-, Carboxyl- oder Hydroxylgruppen bedeuten, R₄ und R₅ jeweils die gleiche Bedeutung wie R₁, R₂ oder R₃ haben oder eine Diazobindung, eine Hemi-dicarboxylatbindung oder eine Amidbindung, ein organisches Säurehalogenid oder eine Isothiocyanatgruppe darstellen, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten R₁ bis R₅ eine Amino- oder substituierte Aminogruppe ist. Vorzugsweise ist die Verbindung Luminol (R₁ bis R₃ sind jeweils Wasserstoff).

Vorteilhaft bedeuten R₄ und R₅ jeweils durch Hemisuccinat, Aminoethyl oder Chloracetyl substituierte Aminogruppen.

Ein wichtiger Vorteil der Verbindungen der Formel (I) ist, daß sie leicht mit Antikörpern, z. B. über Peptidbindungen, Brücken bilden können. Die Bindung an Peptide kann dadurch bewirkt werden, daß man eine Kupplung mit gemischten Anhydriden, Carbodiimid, Suberimidat oder Hemisuccinat herbeiführt. Andere bevorzugte chemische Lumineszenzmarkierungsstoffe sind

(i) Lophin und dessen Derivate, d. h. Verbindungen der allgemeinen Formel (II) in der R₆, R₇ und R₈ jeweils gegebenenfalls substituierte Phenylreste darstellen,
(ii) Lucigenin und dessen Derivate, d. h. Verbindungen der allgemeinen Formel (III): in der R₉, R₁₀, R₁₁ und R₁₂ jeweils die gleiche Bedeutung haben wie R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ in der allgemeinen Formel (I)
(iii) Verbindungen der allgemeinen Formel (IV) in der R₁₃ und R₁₄ jeweils die gleiche Bedeutung haben wie R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ in der allgemeinen Formel (I)
(iv) trans-Azodicarboxylate der allgemeinen Formel (V) in der R₁₅ und R₁₆ jeweils Wasserstoff oder niedere Alkylreste sind,
(v) Oxalatester der allgemeinen Formel (VI) in der R₁₇ und R₁₈ jeweils niedere Alkylreste bedeuten,
(vi) Pyrogallol.

Bevorzugte Auslösemittel sind Wasserstoffperoxid, Kaliumpermanganat, Kaliumferricyanid oder Sauerstoff in Gegenwart von Dimethylsulfoxid. Katalysatoren aus biologischen Quellen, wie Enzyme, können ebenfalls als Auslösemittel verwendet werden. Ein bevorzugter Katalaysator ist Peroxidase.

Beispiele für Umsetzungen unter Verwendung von Luminol, die zur Emission von Licht führen, sind:

Die Lumineszenzreaktion kann auch durch eine Veränderung des pH-Wertes oder der physikalischen Bedingungen, wie durch die Temperatur, die Polarität des Lösungsmittels und durch Strahlungen, z. B. durch Röntgenstrahlen, Gammastrahlen und Teilchen von radioaktiven Isotopen ausgelöst werden.

Biologische Lumineszenzmarkierungsstoffe sind Komponenten, die an einer Reaktion unter Erzeugung von Licht teilnehmen, wobei mindestens eine der Komponenten aus einem biologischen Material extrahiert und in ihrer natürlichen Umgebung bei der Erzeugung von Licht beteiligt ist. Dies schließt Reaktionen ein, die mit synthetischen Verbindungen der gleichen oder einer ähnlichen Struktur durchgeführt werden und die synthetisiert wurden, um die natürlich auftretende Verbindung nachzuahmen.

Bevorzugte biologische Lumineszenzmarkierungsstoffe sind

(i) Firefly-Luciferin und dessen Derivate der allgemeinen Formel (VII) in der X₁, X₂, X₃ und X₄ jeweils die gleiche Bedeutung haben wie R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ in der allgemeinen Formel (I).
(ii) Coelenteratchromophore der allgemeinen Formel (VIII) in der X₅, X₆ und X₇ jeweils die gleiche Bedeutung haben wie R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ in der allgemeinen Formel (I) oder sind.

Im allgemeinen sind alle beständigen Luciferin- und Coelenteratderivate geeignet.

Eine große Anzahl der mit biologischen Lumineszenzmarkierungsstoffen durchgeführten Reaktionen erfordert Sauerstoff. Ein Beispiel hierfür ist wie folgt:

Die Reaktion wird durch ein Enzym katalysiert, das als Luciferase bekannt ist. Für die Umsetzung können auch andere oxydierende Mittel, wie sie bei Verwendung chemischer Lumineszenzmarkierungsstoffe eingesetzt werden, verwendet werden.

Bei einigen, die Emission von Licht bewirkenden Komponenten trifft dieses Schema jedoch nicht zu. Einige der erfindungsgemäßen Umsetzungen werden durch Zugabe geeigneter Cofaktoren ausgelöst. Ein Beispiel hierfür ist die Zugabe von Calciumionen zu den Photoproteinen, die aus einer Anzahl von Coelenteraten isoliert werden:

wobei X₅, X₆ und X₇ die für die allgemeine Formel (VII) angegebene Bedeutung haben. Erfindungsgemäß kann jede, eine Lumineszenzreaktion eingehende Komponente als Markierungsstoff für ein "Lumineszenzreagenz" verwendet werden. Ein chemischer Lumineszenzmarkierungsstoff kann eine organische Verbindung, wie Luminol, ein anorganisches Ion oder Molekül, oder ein Katalysator, wie das Enzym Peroxidase sein. In ähnlicher Weise kann ein biologischer Lumineszenzmarkierungsstoff ein Luciferin oder Luciferase, ein Strukturanaloges eines Luciferins oder einer der folgenden Cofaktoren sein:

1. Firefly
ATP
2. Bakterien	NADH
	FMNH
	RCHO, wobei R eine aliphatische Gruppe ist
3. Fungi	NADH
	NADPH

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Menge des Lumineszenzreagenzes (AB) normalerweise dadurch bestimmt, daß man eine Probe in ein Röhrchen gibt, eine oder mehrere Komponenten oder das Auslösemittel für die Lumineszenzreaktion wegläßt und dann die Umsetzung physikalisch oder chemisch durch Zugabe der fehlenden Komponente(n) oder des Katalysators auslöst. Das emittierte Licht kann festgestellt oder quantitativ unter Verwendung einer Standardmeßvorrichtung ermittelt werden, z. B. einer Photoverstärkungszelle, deren ausgesandte Signale festgestellt oder von einer Aufzeichnungsvorrichtung, einem Oszilloskop oder Skalar aufgezeichnet werden. In einigen Fällen kann das Licht auch mit dem bloßen Auge festgestellt oder von einer photographischen Platte oder einem Bildverstärker aufgenommen werden, insbesondere wenn eine Information über die Position erforderlich ist, z. B. bei histologischen Untersuchungen eine Information über die Position der maximalen Lichtintensität, oder der Farbe, oder der Intensität in bezug auf einen Standard.

Die Erfindung umfaßt die Anwendung des "Lumineszenzreagenzes" auf eine Vielzahl von Verfahren, insbesondere auf die folgenden vier wichtigen analytischen Verfahren:

1) Immunologische und Proteinbindungsuntersuchungen

Dieses analytische Verfahren ist üblich und umfaßt normalerweise die Umsetzung des zu analysierenden Moleküls (A) mit dem bindenden Antikörper (C).

Das wesentliche Merkmal dieser analytischen Methode besteht darin, daß es notwendig ist, das an den Antikörper gebundene A vom freien A oder den gebundenen Antikörper vom freien Antikörper zu trennen. Die Umsetzung läßt sich quantitativ durchführen, wenn man entweder den Antikörper, A, oder ein anderes Molekül, das mit den freien oder gebundenen Anteilen reagieren kann, nach der Trennung markiert. Das Markierungsmittel ist entweder ein chemisches oder biologisches Lumineszenzmarkierungsmittel, wie oben angegeben. Ein Beispiel für diesen Untersuchungstyp ist die oben beschriebene "doppelte Technik".

2) Umwandlung

Es gibt viele Situationen, in denen es notwendig ist, die Umwandlung eines antigenen Moleküls in vivo oder in vitro quantitativ zu verfolgen. Das Molekül kann biologischen Ursprungs oder eine pharmakologische Verbindung sein. Um die Umwandlung dieser Substanzen zu messen, wird eine kleine Standardmenge der mit einem chemischen oder biologischen lumineszierenden Stoff markierten Antikörper wie oben angegeben zu dem die nichtmarkierte Substanz enthaltenden Medium gegeben. Die Umwandlung der Substanz kann dann dadurch gemessen werden, daß man den Verlust an markierten Antikörpern feststellt.

3) Histologische Lokalisierung von Substanzen

Um eine Substanz innerhalb oder außerhalb einer Zelle unter Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenz zu lokalisieren, werden die markierten Antikörper zu einem Gewebepräparat gegeben und nach dem Waschen unter einem Mikroskop untersucht. Das "Lumineszenzreagenz" wird dann mit dem Auge oder unter Verwendung einer Verstärkungsvorrichtung festgestellt. Das Bild kann dann photographiert werden.

4) Feststellung von Substanzen, die einer Wiederverteilung unterliegen

In einer Reihe von biologischen Systemen und bei in vivo Trennverfahren, z. B. beim Zentrifugieren, Chromatographieren und der Elektrophorese ist es notwendig, eine Substanz zu verfolgen, die einer Wiederverteilung unterliegt. Dies geschieht dadurch, daß man das Ausgangspräparat eine geringe Standardmenge der mit einem chemischen oder biologischen Lumineszenz-Chromophor gekoppelten Antikörper zugibt. Die Verteilung der Substanz kann dann durch Verfolgung der Verteilung des "Lumineszenzreagenzes" festgestellt werden.

Beispiele 1. Anregung von Luminol-Schaf-(anti-Kaninchen IgG)

Ein Lumineszenzreagenz wird durch Kupplung des Diazoniumsalzes von Luminol an Schaf-(anti-Kaninchen IgG) Antikörper hergestellt. Die Lumineszenzreaktion wird durch Anregung des Reagenzes mit Sauerstoff in Gegenwart von Alkali ausgelöst, worauf Licht einer Wellenlänge von 400 bis 500 mm emittiert und mit einer Photon-Zählvorrichtung gemessen wird.

Die Lichtemission aus dem Reagenz nach der Anregung verläuft außerordentlich rasch. Es sind weniger als 2 Sekunden erforderlich, um das vorhandene Luminol exakt zu messen.

2. Immunologische Untersuchung von Parathyroidhormon unter Verwendung von mit Luminol markierten Antikörpern a) Allgemeine Methode

Eine Methode zur Messung der Konzentration von Parathyroidhormon in menschlichem Serum ist bekannt (Woodhead und Mitarbeiter, British Medical Bulletin, Band 30, Seiten 44-49, 1974). Bei dieser Methode werden mit ¹²⁵I markierte Antikörper verwendet.

b) Herstellung der mit Luminol markierten Antikörper

Die chemische Grundreaktion besteht in der Diazotierung zwischen Luminol und Antikörpern für menschliches Parathyroidhormon. 2 mg Luminol werden bei 0°C in 1 ml n HCl suspendiert. Dann werden 10 mg NaNO₂ zugefügt, und die Lösung wird etwa 3 Minuten leicht gemischt. Darauf wird der pH-Wert mit NaOH auf 8,0 bis 9,0 eingestellt. 2 ml einer Lösung von Antikörpern für menschliches Parathyroidhormon, die an menschliches Parathyroidhormon auf Aminocellulose (Immunadsorptionsmittel) gebunden sind, in 0,2 m Natriumborat, pH 8,2, werden dann zugefügt. Nachdem diese Mischung etwa 16 Stunden bei 4°C inkubiert wurde, wird das Immunadsorptionsmittel 4× mit Boratpuffer ausgewaschen. Dann wird das Immunadsorptionsmittel 3× mit 0,9%igem (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid gewaschen. Die mit Luminol markierten Antikörper werden mit einem Puffer von pH 2 eluiert.

c) Untersuchung von Parathyroidhormon (PTH)

Diese wird in ähnlicher Weise durchgeführt wie eine immunoradiometrische Untersuchung, mit der Abweichung, daß die Antikörper nicht mit ¹²⁵I sondern mit Luminol markiert werden. PTH Standards (0,08 bis 50 mg/ml) werden in NIGP hergestellt (20,6 g Natriumbarbiton, 10 g NaCl, 1 g Natriumazid, 2 g menschliches Serum Albumin, 40 mg Meerschweinchen γ-Globulin, nicht immun, auf 2 Liter aufgefüllt und mit 1,0 n HCl auf pH 8,0 eingestellt). 100 µl jedes Standards werden in vierfacher Ausfertigung in Beckman-Polyäthylenröhrchen (EET 23) gegeben. 50 µl der zu untersuchenden Probe werden in ähnliche Röhrchen gegeben, und es werden 50 µl NIGP Puffer zugefügt. Dann werden 10 µl des "Lumineszenzreagenzes" (mit Luminol markierter PTH Antikörper) zugesetzt. Nach dem Vermischen werden die Röhrchen 3 Tage bei 4°C inkubiert. 50 µl PTH ImAd (covalent an Zellulose gebundenes PTH) werden darauf zugegeben. Nach 20 Minuten werden die Röhrchen 1 Minute zentrifugiert und 90 µl der überstehenden Flüssigkeit werden durch Untersuchung auf Luminol auf das "Lumineszenzreagenz" untersucht.

d) Untersuchung des "Lumineszenzreagenzes"

90 µl der überstehenden obigen Flüssigkeit werden zu 900 µl n/10 NaOH gegeben, dann werden 10 µl H₂O₂ zugefügt, und das Röhrchen wird vor eine Photoverstärkungsröhre gebracht. Die in den ersten 10 Sekunden nach der Zugabe von 1 ml von 1-mmolarem K₃Fe(CN)₆ festgestellten Gesamtzählungen werden gegen die PTH- Konzentration aufgezeichnet. Die Werte der Proben können dann von dieser Standardkurve abgelesen werden.

3. Umwandlung - Umwandlung von Albumin in einem Leberhomogenat

Mit Luminol markiertes Rinderserum Albumin (RSA) wird wie in Beispiel 2 für die Antikörper für PTH beschrieben hergestellt. Ein Homogenat von Rattenleber (2 : 1 Gewicht/Volumen) wird in 150 mMol KCl, 2 mMol MgCl₂, 1 mMol Mercaptoäthanol, 20 mMol tris, pH 7,4 hergestellt. 1 ml Proben werden in Luckam LP3- Kunststoffröhrchen gegeben, 10 µl Proben von RSA, die mit Luminol markiert sind, +10 µl nicht markiertes RSA (0,01 bis 100 mg/ml) werden zugefügt, und die Röhrchen werden bis zu 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach einer bestimmten Zeit wird das Albumin durch Zugabe eines gleichen Volumens von gesättigtem (NH₄)₂SO₄ ausgefällt. Die Röhrchen werden dann zentrifugiert, der Niederschlag gewaschen und in 0,5 ml n/50 NaOH wieder gelöst. 100 µl Proben werden für die Untersuchung des "Lumineszenzreagenzes" entnommen, wie in Beispiel 2 für die mit Luminol markierten Antikörper beschrieben ist. Der Abfall in der Lumineszenz des Niederschlages stellt ein Maß für den Abbau des Albumins dar.

4. Histologische Lokalisierung - Lokalisierung von Antigenen auf Erythrocyten

Antikörper für menschliche Erythrocyten werden mit Luminol wie in Beispiel 2 für die Antikörper für PTH beschrieben markiert. 10 µl dieses "Lumineszenzreagenzes" werden zu 1 ml 0,9 %igem (Gewichts/Volumen) NaCl gegeben, der 10⁸ menschliche Erythrocyten enthält. Nach 30 Minuten langer Inkubation bei 37°C werden die Zellen zentrifugiert und 3× mit 0,9%igem (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid gewaschen. Die Zellen werden dann auf einem Mikroskop-Objektträger ausgestrichen und unter einem Lichtmikroskop mit einem Bildverstärker festgestellt. 1 mMol KMnO₄ wird zur Stimulierung der Lumineszenz des Luminols zugefügt. Zellen mit an sie gebundenen Antikörpern (und demzufolge Antigenen auf ihrer Zelloberfläche) emittieren Licht, das durch den Bildverstärker sichtbar gemacht und dann photographiert wird. Die Antigene enthaltenden Zellen können dann durch Vergleich der Photographie mit einer unter Phasenkontrast aufgenommenen Photographie lokalisiert werden.

5. Verteilung von Zellmembranantigenen während der Fraktionierung von Rattenadipocyten

Antikörper für Rattenadipocyten werden wie in Beispiel 2 für die Antikörper für PTH beschrieben mit Luminol markiert. 10 µl Proben des "Lumineszenzreagenes" werden zu 1 ml einer Lösung gegeben, die 144 mMol Na⁺, 5,9 mMol K⁺, 1,2 mMol Mg²⁺, 2,6 mMol Ca²⁺, 128,9 mMol Cl^-, 1,2 mMol SO₄^2-, 1,2 mMol Pi, 25 mMol HCO₃^-, 4% RSA 2/Volumen, pH 7,4 und 10⁶ bis 10⁷ Rattenadipocyten enthält. Nach 30 Minuten langer Inkubation bei 37°C wird die Suspension zentrifugiert, und die Zellen werden 3× gewaschen. Die Zellen werden dann in 5 ml einer Lösung von 150 mMol KCl, 2 mMol MgCl₂, 1 mMol Mercaptoäthanol, 20 mMol tris, pH 7,4 homogenisiert. Dann führt man eine übliche Differentialzentrifugation durch, worauf die 500 g, 10 000 g, 100 000 g Niederschläge und die 100 000 g überstehende Flüssigkeit gesammelt werden. Von jeder Fraktion werden 100 µl Proben auf Luminol untersucht, wie in Beispiel 2 beschrieben. Ein Vergleich der Menge Luminol jeder Fraktion mit derjenigen auf den ganzen Zellen ermöglicht eine quantitative Feststellung der Menge an Zellmembranantigenen in jeder erhaltenen Fraktion.

6. Doppeluntersuchung von Alphafoetoprotein unter Verwendung von mit Luminol markierten Antikörpern

Eine Immunoglobulinfraktion eines Antiserums für Alphafoetoprotein (AFP) wird durch Natriumsulfatfällung hergestellt. Die Antikörper für AFP enthaltende Fällung wird covalent unter Verwendung von Glutaraldehyd an ein Silanderivat von Borsilikatglas in Form von Reaktionsröhrchen gebunden. AFP enthaltende Proben werden 3 Stunden in den Röhrchen inkubiert. Während dieser Zeit verbindet sich das AFP mit den Antikörpern. Antikörper für AFP, die mit Luminol markiert sind, werden wie für die PTH-Untersuchung beschrieben, hergestellt und dann zugegeben. Nach der Inkubation über Nacht werden die Röhrchen geleert und 2× in phosphatgepufferter (0,05 Mol, pH 7,4) Kochsalzlösung gewaschen, die 0,1% Rinderserum Albumin enthält. Die Röhrchen werden zu der Photon-Zählvorrichtung gebracht, und die Licht emittierende Reaktion wird wie bei der PTH-Untersuchung ausgelöst. Die Menge emittiertes Licht ist eine Funktion der Menge an vorhandenem Luminol und damit der Konzentration an AFP in den Proben.

Claims

1. Reagenz zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung einer antigenen Substanz in oder aus biologischen Flüssigkeiten oder Geweben, enthaltend einen gegen die antigene Substanz gerichteten Antikörper, der mit einem Lumineszenz- Chromophor gekoppelt ist, wobei mindestens 60% der markierten Antikörper zu einer Bindung mit der antigenen Substanz befähigt sind.

2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lumineszenz-Chromophor Luminol ist.

3. Verfahren zur Herstellung des Lumineszenz-Reagenz nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antikörper enthaltendes Medium unter Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes mit entsprechenden Antigenen des Komplexes das Lumineszenz-Chromophor zufügt und anschließend die markierten Antikörper von den Antigenen dissoziiert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Antigene zu Beginn an ein in fester Phase vorliegendes Immuno-Adsorptionsmittel bindet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das in fester Phase vorliegende Immuno-Adsorptionsmittel zur Reinigung von Antikörpern verwendet, die zuvor in Lösung durch Kontakt mit einem Lumineszenz- Chromophor markiert wurden.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die interessierende Substanz an Antikörper auf feste Phase gebunden wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phase Cellulosepulver oder die Wandung eines Reaktionsgefäßes ist.