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DE2925565A1 - Inkubations-doppelplatzimmunonachweisverfahren und mittel zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents

Inkubations-doppelplatzimmunonachweisverfahren und mittel zur durchfuehrung des verfahrens

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Publication number
DE2925565A1
DE2925565A1 DE19792925565 DE2925565A DE2925565A1 DE 2925565 A1 DE2925565 A1 DE 2925565A1 DE 19792925565 DE19792925565 DE 19792925565 DE 2925565 A DE2925565 A DE 2925565A DE 2925565 A1 DE2925565 A1 DE 2925565A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
labeled
hormone
ligand
bound
receptor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19792925565
Other languages
English (en)
Inventor
Judith I Blakemore
Henry J Jeong
Nathan Lewin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bio Rad Laboratories Inc
Original Assignee
Bio Rad Laboratories Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Rad Laboratories Inc filed Critical Bio Rad Laboratories Inc
Publication of DE2925565A1 publication Critical patent/DE2925565A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/804—Radioisotope, e.g. radioimmunoassay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description

- 6 - 1325-1-10.64-3
Inkubat ions-Depp elplatsimmunonachv/eisverf ahren 'and. Kittel SUi1 Durchführung des Verfahrens
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren für einen xioppelplatz-
(£wo-rsite ,immunoassay) , , .··, , ,T ^. , jjnmunonachwexc/una ein Fate ei 'zur Jurcnxunruns des \ferl ahrens.
Eadiometrische Loppelplatz-immunonachv/eisverf ahren auf Antigene, welche v/enigstens zwei Antikörper zu binden vermögen, sind bekannt. Diese bekannten, radiometrie chen Doppelplata-Immunonachweisverfahren urifassen zuerst die Iril-iubation von nichtmarkiertem Antikörper, der an eine unlösliche rlatrix gebunden ist, mit den flüssigen Mediun, welches das mehr als eine antigene Determinante aufweisende Antigen enthält, hieran ech.lie.Sr sich eine zweite Inkubation "it einem markierten Antikörper an; siehe ¥oodhead, Addicon und Haies, 3r. 1-Ied. Bull., Vol. 39, Ur. 1 (197^), 44-49; Abraham (Herausgeber), Handbook of Eadioimriunoassay, Ch. 4- (1977), Xarcel Dekker, Inc..
Solche radionetrischen Doppeiplatz-Imm'jj.ionachweisverfahren sind auch in üadioimaunoassay and related Procedures in Medicine, Vol. 1 (1974), 13-1-4-7 und 14-9-6H-, Incemaöional Atcnic Energy Agency, Wien, beschrieben.
Von einer ersten Herstellerfirma, Corning Kedical Diagnostics, wurde ein nachweis zur Bestimmung von die menschliche Schilddrüse stimuliei"ende3i Hormon, das im folgenden mit 'χ·οΗ abgekürzt viird, auf den Karkt gebracht j siehe Corning, ίώΚ ( !~^J) Eadioimnunoassay Test System, Liirz 1977· Sei diesem ITachweisverfaliren, wie es von dieser Herstellerfirma -.Coming) beschrieben ist, wird der radioaktive '' 'J-Antikö:?per, der auf x'SE spezifisch ist, zu einer bekanuton her,\:~< von JoE™S"andarQ oder zu einer Patientenserumorobe zu-^esets". Iiex- radioaktive
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ORIGINAL INSPECTED
hy
ti·-
r.
^J-Antikorper bindet sich an beliebig-svorli-andenes ion imc
"bildet einen markierten komplex«, liach einer ersten Inkubations- oder Gleichgewichtsperiode vird ein weiterer .antikörper 5 der ebenfalls gegen 23E gezüchtet v.'iirde, su der: -Lsakrionsganisch zugesetzt«. Dieser Antikörper xiiirco kcvalent an nikroGkopicche Glasteilchen gebunden und dient z\^:. Binden des in der ersten Stufe gebildeten, markierten Kcnpiexe:;. ITacIi den Auftreten der Bindung kann ein Abtrennen durch einfaches Zentrifugieren erfolgen. Der ausgefällte Komplex vird auf die Kadiοaktivität
Ί25 "" —
von J ausgezählt. Es wird eine iickkurve oder otandardkurve ermittelt, in v/eIcher die an die Grlacceilcheü Ge"Duri(iene Hadio— aktivität gegenüber der ΐΒΗ-Konzentration aufgetragen ist. Die Zählimpulse, welche in Anwesenheit von nicht-bekannten Patientenproben in gebundener .Form ermittelt wurden, werden mit der Eichkurve verglichen, und die entsprechend. -ilSH-K.orizentration V7ird durch Interpolieren bestimmt.
Dieser Hersteller I (Corning) hat weiterhin ein iTachweisverfahren zur Bestimmung von menschliches I'h^.a?o;cin-bindende2i Globulin, abgekürzt !TBG, auf den Karkt eingeführt; siehe Corning 'iSG ' ^Z-Radioimmunoassay Test System, Dezember 19??· Bei diesem Sachweisverfahren wird ein für i3G spezifischer, immobilisierter Antikörper zu einer bekannten Menge an OBG-Standard oder zu einer Patientenserumprobe zugegeben. iTach dem ocliütteln v/ird mit radioaktivem "^J markiertes Thyroxin ( >c~jJ-'j:^-) dem Se akt ions gemisch zugesetzt. i\ach Angaben dieses Herstellers 1 (Corning) tritt dann eine Verteilung von "~'?o-2^ zwischen den Bindeplätzen auf TBG und Sinderser\ima3.bumir-molekU.ien, welche in den Puffern vorhanden sind, auf. Das T3G kann auf diese Weise sowohl an den immobilisierten AntikcrOor als auch das
^J-TA- gebunden werden.
Die Verwendung von !covalent an eine feste Phase gebundenen Antikörper in Kadioimnunoriachweisverfaliren für Proteine und Polypeptide v/ird in der US-Patents ehr if χ; 3 555 "!4-3 vom
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BAD ORIGINAL
12. 1, ":971 beschriebe:., ΙΓ:...η -weiter Hersteller (Firma Pharmacia; verwendet diese Methode toi einer. kG:^.-r:;iell eingeführten Eadioinmunonachweisverfahron auf Iü;l. hei dieser Arbeitsweise ist der Antikörper !covalent an ein Pcljäo^rran gebunden. Sie zu bestimmende Probe und der ^.ntiköprer in Tester Phase v/erden bei Zimmertemperatur für 13 eis 2·': Runden inkubiert:, hieran schlieft sich, die Zugabe von radioaktiv markierten 1LbK und die weitere Inkubation unter Pühren während IS bis 2k- Stunden an. Die feste Phase wird abgetrennt, dreimal ge-wacchen und ihre Radioal'.tivität ausgeraccsen.
In dar DE-OS 26 4-1 ?13 ist ein I.T^unfl ren beschrieben, bei vrelchcin die ir:j::unroal:"jionsx;eilneh2ier Covalent an in V/acser unlösliche, hydrophile I-ci^Tierteilchen nit einei" Größe von ef;;a 0,1 bis 10 ur, rsbunden sind- Der Antikörper in fester jrhaeo v.'ird nit aer das zu b33-jiLünende Antigen (oder Ha.pten) enthaltenden Probe und entsprechendem Antigen (oder Hapten) , das fluoreszierend ir.arkiert vrurde, vermischt, so daß eine Kence von markierten und nicht;-r:arkierten Antigen gebunden v;ird. Die feste Phase wird abgetrennt und die Pluoreszenz wird mit Hilfe von optischer Spektroskopie ausgemessen, wobei die Konzentration des iiicnt-beksjnnten Iirjnunreaktionsteilnebxiors eine i^unlrtion des V/ertes der fluoreszenz ist. In dieser DE-OS ist auch eine Doppeipiat£-Irj:;unonachvraismethcde beschrieben, bei welcher ein Überschuß von Antikörper in fester Phase zuerst mit der das zu bestimr-endo ^nrigen (oder Hapten) enthaltenden Probe vermischt wird und der komplex anschließend mit einem Lberschuß von fluoreszierend markiertem Antikörper in Reaktion Β"οΊ°Γε·0^ wird.
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Doppelplatz-Immunonachweisverfahren für einen Lifanden uircer Verwendung einer Einfacloj-nkubation. Hierbei wird die den zu bestimnenden, multivalenten bzw. mehrwertigen Lirjandon enthaltende Probe, ein markierter Eezeptor für diesen Liganden und ein nicht-maricierter
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Eezeptor für diese Liganden, der kovalent an einen Träger in fester Phase gebunden ist und im folgenden als S'estphasenrezeptor "bezeichnet wird, in einem wäßrigen Kedium unter Bildung einer im wesentlichen stabilen Suspension zusammengebracht, und in einer einzigen Inkubationsstufe wird ein Zweiphasensystem gebildet, in welchem die feste Phase den yestphasenreseptor enthält, von welchem ein Anteil an den Liganden gebunden wurde, der seinerseits an einen Anteil des markierten Rezeptors gebunden wurde, und. worin die flüssige Phase den ungebundenen Anteil des markierten Rezeptors enthält. Die feste Phase und die flüssige Phase werden voneinander getrennt, und jede Phase wird auf markierten .Rezeptor analysiert, dessen Konzentration eine Punktion der Konzentration an Liganden in der Probe ist.
Ein Doppelplatz—Immunonachweisverfahren unter Verwendung einer Einfachinkubationsstufe oder einer einzigen Inkubationsstufe ergibt einen beträchtlichen Vorteil gegenüber nachweisverfahren, welche mehr als eine Inkubation erfordern, indem die Durchführung des ITachweises vereinfacht, abgekürzt und bequemer gemacht wird. Diese Verbesserung der Nachweismethode wird erreicht, während akzeptierte I'lachweischaraktoristika/'/ie Präzision, Spezifität und S^abilirät aufrecht; erhalt en werden, und zusätzlich können weniger Fehler bei der Z-eitnahme, den Zugaben und anderen Handhabungen auftreten.
Das erfindungsgemäße, neue Doppelplatz-lrnmunonachi-zeisverfahren kann auf einen beliebigen Liganden angewandt werden, der gleichzeitig durch zwei .Rezeptoren gebunden werden kann. Diese Gruppe von Liganden umfaßt beispielsweise Polypeptidhormone der Plazenta, pituitäre Hormone, calciumregulierende Polypeptidhormone und Hebennierenmarkpolypeptidhormone; Proteine und Proteinfragmente, Immunoglobuline (Antikörper) verschiedener Klassen, virusartige, bakterienartige und protozoenarrigo Organismen oder leuchen; Enzyme; sowie mit 'iumoren verbundene Antigene. In einem bevorzugten Beispiel wird ein Kacr-weisv erfahren auf die menschliche Schilddrüse stimulierendes Hormon bzw. 'Thyroidstimulierungshormon, abgekürzt 1I1SII, beschrieben.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann bevorzugt zur Bestimmung eines solchen l'hyroidstimulierungshoz-ir.orj.G verwendet werden, wobei gereinigte, radioaktiv markierte .Antikörper und nichtmarkierte Antikörper, welche kovalent an hydrolysierten Polyacrylamidteilchen gebunden sind, verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren bedient sich eines Rezeptors für den Liganden, wobei dies eine beliebige Substanz ist, welche den Liganden mit annehmbarer Spezifität und Affinität bindet. Dementsprechend kann der xiezeptor beispielsweise ein Antikörper für den Liganden sein. Bei einem bevorzugten Beispiel werden Antikörper als .Rezeptoren verwendet.
Der markierte Rezeptor kann nit einer beliebigen Art einer Anzahl von bekannten Spurensubstanzen markiert sein, einschließlich beispielsweise radioaktiven harkierungselementen wie Jod-125 oder fluoreszierenden Karkierun£ssubstanzen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsf orrri werden radioaktiv markierte Antikörper verwendet.
Einewesentliche Komponente des erf indungs geraäßen Kachweisverfahrens ist der Träger in fester I-hase für den nicht-markierten Sezeptor, der im wesentlichen stabile Suspensionen in wäßrigen Medien zu bilden vermag, kovalent an den nicht-markierten Rezeptor gebunden werden kann, in bequemer »/eise während der Handhabung wie einem Pipettieren und Zentrifugieren gehandhabt werden kann und der geringe, nicht-spezifische Adsorptionseigenschaften aufweist oder so behandelt werden kann, daß er solche Adsorptionseigoris chafe cn zei^;t. Mo Suspendierfähigkeit des Pestphasenträgers, auf weichem der nicht-markierte xiezeptor immobilisiert ist, ermöglicht die Zugabe eines Überschusses von JTestphasenrezeptor, welcher den Liganden in der Probe bindet und ermöglicht weiterhin die -reilri&hnie des Zooplexes aus Pestphasenrezeptor-Ligand in Reaktionen nit dem markierten Rezeptor. Ein geeigneter i'esrphasenträgor besteht aus ieilchen
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2'
aus derivatisierteia Polyacrylamid mit ein ex· Grölie ir. Bereich iron 0,10 bis 10 /anο der eine in wesentlichen stabile Suspension während der Einmal-lnkubaticnsperiode ergibt«,
Sine "bevorzugte Ausführungsforn des erf iivdungsgeiaäßen Doppelplatz-Immunonachweisverfahrens τη.±ν Einmal-Inkubation ergibt eine hohe Spezifit αϊ auf SSH unter Verwendung iron star-: gereinigten Antikörpern. Die Hormone 'χίζ,χΐ^ HGG, IVSH und LH bestehen jeweils aus ähnlichen alpha-Polypeptidketten und verschiedenen beta-Polypeptidketten. Die Hormone Ii1SH, LK und HGG können dae Nachweisverfahren auf !PSE als Folge der Kreuzreaktivität dex· •Antikörper mit solchen Hormonen stören» Eine verbesserte Sp e— zifität für !ESH des erfindungs gemäß en iiachweisverfahrens wird mittels einer Zweistufenreinigungsarbeitsvreise für den narkierten Antikörper und, falls erforderlich, die !Reinigung des nichtmarkierten Antikörpers erreicht, um Antiköprer mit hoher Affinität für TSH und geringer Affinität für die anderen Hormone, z. B. HGG, zu erreichen. Eine Vorreinigung von Jäezeptor durch solche Maßnahmen stellt eine Verbesserung im Hinblick auf die gegebene Kreuzreaktivität als Jb1OIge der gemeinsamen, antigenen Determinanten in verschiedenen Unterklassen von Liganden dar und ist gegenüber dem Stand der Technik vorteilhaft» Zusätzlich kann eine vorherige reinigung von Antikörpern die Einführung von ^J in einem höheren Anteil von spezifischen Antikörpermolekülen (Unterklasse der igG-i'raktion) ermöglichen, so daß mehr radioaktive Harkierungssubstanz bei dem Nachweisverfahren einsetzbar ist.
Die Eeinigungsarbeitsweise für Antikörper, "welche markiert werden sollen, umfaßt bekannte Prinzipien der Affinitätschromatografie an einem Immunoglobulinschnitt von Kaninchenantiserum für TSH. Bei einer Zweistufenarbeitsweise werden die Immunoglobuline zuerst über eine IICG-Säule zur Entfernung von Anti—alpha—Kettenantikörpern und dann über eine TSH-Säule
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geschickt. Die spezifischen Anti-beta-iSH-Ant!körper binden sich an der TSH-Säule, und sie werden ir. otufen eluiert, so daß der letztlich erhaltene Antikörper für die harkierung aus im wesentliciien reinen Anti-beta-u.SH-Ant:ikörpern rr.it hoher Affinität besteht. Zusätzlich zu der Reinigung des markierten Antikörpers kann der nicht-iaai'kierte Antikörper auf _3H-Spezifität untersucht werden, und, falls erforderlich, kann er entweder über eine HGG-Säule vor der Kupplung an den j'estphasenträger geschickt werden oder mit i&± nach der Kupplung an den Festphasenträger absorbiert werden, um ein spezifisches System bereitzustellen. Das Kachweisverfahren unter Verwendung dieser gereinigten Antikörper ergibt keine kreuzreaktioE. mit HGG, PSH oder LH bei normalen V/er ten ai^sex· Iiornone, so daß die Spezifität des Nachweisverfahrens auf -2SH. verbessert wird.
Im. folgenden wird die bevorzugte Ausführun^sform ger.ä2 der Erfindung näher erläutert, bei welcher das erfindungsgemälie ITaeh. weisverfahren auf die Bestimmung von 1I1SH in Serum angewandt wird.
Die Reagentien fur ein .xadionetrisclies Eim"achinkubations-Doppelplatz-Immunonachweisverf ahren- auf 'xb'd werden typischerweise wie folgt hergestellt:
Ί25
1£ζίι11ΐΐ1ί£ϊί£Ξ
Die Antikörper für TSH werden durch injektion von TSH bei ilaninchen nach den üblichen Arbeitsweisen erzeugt. Diese werden nach den zuvor angegebenen Arbeitsweisen der Affinitäts—
chromatografie gereinigt. Die Tracersubstanz wird durch Jodieren
125 des gereinigten Antikörpers mir dem Jodisotop ^J bis zu
■ Zi. _Λ
einer spezifischen Aktivität von etwa 5,7 bis 3VO χ 10 sec yUg , vorzugsweise etwa 18,5 bis 222 :■: 10 see .ug~ ' hergestellt. Jedoch können auch andere spezifische Aktivitäten
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angewandt werden. Der Antikörper kann r.^cii Konventionellen Methoden, wie sie in der Literatur beschrieben sind, jcdiert werden. Die Tracersubstanz kann aus einer Phosphatpuffer und •X-rägerprotein enthaltenden Lösung iyophiliciert werden.
An^
.HT:"!
Die Hydrolyse von PolyacrylanidperleiT- :o£G die Kupplung von Antikörper an solche Perlen ict i~ weceiiülicL/vn in der üS-Pstentschrift 1V 038 7^ beschrieben, jedoch kann die Hydrolyse auch bei Zimmertemperatur durchgeführt v.'crdcr.. Der Antikörper, der gekuppelt wird, ist vorsugsweiso ein GlobulinscfcniJi^t^äe^^örti^"*="=- serums, obwohl auch Gesaiatserun verwendet werden kann, üblicherweise werden 0,25 bis 2,0 nl Antikörper an jeweils 1 g der Perlen und vorzugsweise 0,75 bis 1,5 ^l P^o Grasm. gekuppgli., ~ -^. Das Waschen der gekuppelten Perlen v;ird un^g^Jfeiweridung; von Phosphatpuffer und 1h ^ux^oniur^hjl^spsia^^bav/ex'kstellict. Die Perlen icörinen ,^us^ei^^r-^Pflo^pha t puff or, Protein und HCG enthaltenden Losung-JLyophilisiert werden, obwohl eie auch in flüssiger Suspension belassen werden können.
Der 5'estphasenrezeptor wird in einer solchen Konzentration angewandt, daß die Ausfällung von ΐ'οίί unrer aesi liodingungen des Nachweis verfahr ens im we sent; lichen abgeschlossen ist. Die pro Nachweisröhrchen verwendete Lenge beträgt erva 1,0 bis 5,0 iag, jedoch können auch andere liengen verwendet werden.
Standards b2wz_Eicjip_räOarate
Die Standards bzv/. Eichpräparate enthalten menschliches TSH in einer Lösung auf Basis von nenschlicheLi oerun. Dieses Serum wird von endogenem 'jiSli durch Aktivkohle und Filtration vor der Verwendung befreit. Alternativ kann die Pz^oteinurageburig des Serums durch Verwendung von aufgelöst oil Serum oder anderen Proteinen menschlichen oder tierischer. Irsr-rungs simuliert werden.
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Vorzugsweise v/erden dem Serum. Konservierung^ stoffe zugesetzt, geeigneterweise iiatriumazid in einer Iier;cje von 0,1 Gew.-%. lias in den Standardpräparaten enthaltene menschliche Γ3Η wird gegen die internationale lieferenspräparation von menschlichem ISH geeicht, welche von der World Health urbanisation (Medical Research Council, Holly Hill, London) reliefert wird. Jedoch können auch andere Standardisierungen angewandt v/erden. Vorzugsweise werden Standardpräparafce lyophilisiert, und sie können so hergestellt werden, daß sie 0, 2,5, 5,0, 10, 25, 50 und /uIE/ml TSH enthalten, jedoch können auch andere Werte verwenaet werden.
Die Keaktionsparameter sind typischerweine so, wie im folgenden beschrieben:
Volumen
Die Heaktionsvolumina werden in vernünftigen Grenzen gering gehalten, obwohl größere Volumina verwenden werden können und die Konzentrationen entsprechend eingestellt werden können. Typischerweise werden 50/al Tr ac er sub stanz mit etwa 50.000 bis 300.000 Zfa/min, vorzugsweise 100.COu bis 200.000 Zfa/miri, (Zfa/min = Zerfallsakte pro Minute) ^u jedem iiachveisröhrchen zugegeben. Das Volumen des i'estphasenreseprors, das in Jedes .Rohr zugesetzt wird, kann von etwa 100 ui bis 500 ill und vorzugsweise von 150/Ul bis ^00 -al variieren. Lie Spurensubstanz und der tfestpliasenrezeptor weruen vor'zu;"i:weise vermischt, und es wird eine einzige Zugabestufe angewandt, jedoch können sie auch in zwei Stufen zugesetzt werden, wobei der iestphasenrezeptor zuerst zugegeben wird.
Inkubationsbedingungen
Die Inkubationstemperatur liegt vorzugsweise im Bereich von 2 bis 50 0G, vorzugsweise 35 bis 40 0G. 3a± 3? 0G liegt die Inkubationszeit geeigneterweise wie in 3oisoiel 1 angegeben,
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ORIGINAL INSPECTED
obwohl Zeiten von etwa 1 Stunde bis et»a 3 Stunden angewandt und annehmbare Standardkurven oder Eichkurven erhalten werden können. Vor der Inkubation wird das Vermischen der Röhrchen in geeigneter Weise in einem Labor-Vortex-Kischer durchgefülart s obwohl die Röhrchen auch mittels Schütteln von Hand vermischt werden könnten.
Reagensher st e llung _,„— — =—^_- -._
Die Tracersubstanz \irird geeigneterweise in lyophilisierter J1OrDi angeliefert, obwohl auch flüssige Tracersubstanz; verwendet werden könnte und ähnliche Stabilitätscharakteristika zu ergeben scheint.__Der i'estphasenrezeptor wird geeigneterweise in Flaschen abgefüllt und als Buspension -aageliefert, obwohl lyophilisierte Präparationen von i'esxiphaseiirezepTor'Bin-gleicI gutes Verhalten beim Arbeiten zu zeigen scheinen. Die Kengen
an Spurensubstanz und an i'estphasenrezeptor in federn Röhrchen
werden so eingestellt, daß vor dein Kachweisverfahren exrr Röhrchen von Spurensubstanz wieder angesetst xierden kann und mit einem Röhrchen des Pestphasenrezeptors vermischt werden kann. Alternativ kann die Anzahl von Röhrchen bei eines bestimmten Uachweisverfahren bestimmt werden und die entsprechenden Mengen an Spurensubstanz und i'cctphaßenrezeptor könnten in einem getrennten Glas vor dem ITachweisverfahrer. vermischt werden. Die Standards werden geeigneterweise in lyophilisierter Form angeliefert.
Beispiel 1
verfahren Etwa 30 Minuten vor dem Kachweisverfahren werden folgende Arbeiten durchgeführt:
1. -ιΓ-Antikörper für menschliches I1SE (Tracer substanz)
werden mit 2,5 ml destilliertem Wasser wieder angesetzt;
2. Der Nullstandard wird mit 5,0 ml destilliertem V/asser wieder angesetzt;
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3. Standards, welche 2,5 bis Ί0O λΐϊΖ/Ί·.1 nenochliches '1'3ZI enthalten, werden nit 2,0 ml destilliertem './asser wieder angesetzt;
4. Es wird normale Salzlösung (0,9 /^ oder· 0,15^ molares natriumchlorid) in destillierten V.'s^er hergestellt 'cna "bei Zimmertemperatur c/af bewahrt; ,
^. Es wird Seagens aus Tracersubstanr-/oi-len durch Zonbination
/IOC
von eines. Tiöhrchen von """-^J-Airrikörpern nit einen xvohrchen von Jestphasenrezeptor hor^esrellt.
Jedes Eeagens suii vcllständic aufholeg~ und izli der.i zujesatzten Wasser vor der Verwendung vermischt; werdsn. Alle Itea^eivcier.
und Proben sollten auf Zinrr.ertor.rieratur ve·,:1 der 7^v'.vendun-~
UxIu. 1^
gebracht werden. Das lieagenc auc Tracer^ubstanz-Tterlen ist eine feine Suspension ν cn Pol;T..ert;eilcLen und erscheint trübe. Palis mehr als 50 Hohrchen ;-lcici:^ci~i.;; verarbeitet werden nüssen, sollten zwei Gläcer von Tracersubsuar.3 wieder angesetzt Zierden und mit zwei G-läsern an 2;'estpha3enreseptor in einem Glas vor der Verwendung bei den. L'aciiv.'oicvorl'alxren vermischt werden.
Ί. Es wurden 16 Hchrchen doppelt v;ie folgt markiert: jC, Hull, 2,5, 55O, 10, 25, 50 und ICO ulü'/ml. Zwoi iiöhrciien wurden doppelt für jedes Patientenscrun und jede Probe und für jedes handelsübliche liontroilserun markiert;
2. Es wurden 200 ul der Standards L'ull bis 100 zu den entsprechenden Iiöhrciien zugesetzt;
3. Es wuixlen 200 ul Seruri von jeden Patienten oder handelsüblichem Kontroll serum zu den entsprechenden ^iöhrclicn zugegeben;
4. Es vmrde das Reagens aus Tracersubstanz-jterlen gründlich vermicclit und 200 al hiervon zu allen i-iblirclicn zugegeben. Die !rC-üchrchen wjccden zur Seite gestelle.
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ORIGINAL INSPECTED
^. Die- Röhrchen, wurden der Schutt ölbehandlung unr-srzogen und für sv/ei Stunden "bei 37 0G (nit Ausnahme der /JC-ixöhrch.er.) inkübiert. Diese Stufe entspricht der Einmal-Ialrabationsweise oder -stufe genu.fi dex* Erfindung;
6. Es wurden 55O ml Salzlösung zu allen liohrchen (mit Ausnahrae der TC-Eöhrchen) zugesetzt, und es wurde für Ί0 Minuten "bei 1500 χ g zentrifugiert. Unmittelbar nach dem Hair der Zentrifuge vrarden die iiöhr.chen dekantiert und die !röhrchen gegen filterpapier oder mit Kunststoff hinterlegten, absorptionsfähigem Papier abgestrichen;
7· Alle iiöhrchen einschließlich der iC-Höhrchen vrarden für 1 Minut e aus ge ζ ählt.
Die Konzentrationen an die menschliche Schilddrüse stimulierendem Hormon bzw. TSH in den Patientenproben und den handelsüblichen Kontrollserum wurden mit Hilfe einer S^andardkurTe bestimmt. Die Standardlcurven können nach verschiedenen Methoden erhalten werden, beispielsweise dux'ch Auftragung der Zählakte pro Plinute, abgekürzt Zäa/min ,gegenüber der Konzentration. Die J?ig. 1 zeigt eine Probeneichl:urve, worin die V/er te Zäa/min. gegenüber der konzentration aufgetragen sind. Die Standardkurve muß für jedes IVachwe is verfahr en ersteilt werden, da die ratsächlichen Werte mit; dem Älter der Iteagentien variieren.
Die während dieses Hachweisverfahrens ermittelten Probenwerte sind im folgenden zusammengestellt«. Diese- Werte wurden zur Erstellung der Standardkurve von ifig» 1 der Zeichnung verwendet.
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· ■ ■■
ORIGINAL INSPECTED
Probe
Mull
2, 5 uIE/ml
/
62
14406, 6094,5464
,5
10 uIE/ml
25 ,uIE/ml
50 uIE/ml
100 uIE/ml
handelsübl.
liandelsübl.
halide lsübl.
Patient 1
Patient 2
Patient 3
Standard
Standard
Standard
Standard
Standard
Standard
Kontrollprobe I Kontrollprobe II Kontrollprobe HEI
11359,1174-5 17992,15301 25203,25241
37265,35871
^9535,48365 13"S?,12766 19773,19^-13 24519,25028
7009,6139 23466,2-1-102 8373,7694
0 nIE/ml //
2 ,5
10 ,ulE/ml
iIE/ml 50 ,uJE/ml 100 uIE/ml
23,5
0,8 ηΙΞ/ml
21 ,6 uIE/ml 1,4 uIE/ml
Die Hauptanwendung des erfindungsgeaiäßen Verfahrens von einem praktischen Standpunkt erfolgt in klinischen Laboratorien. /, - j_ 'Typischerweise erhalten solche Laboratorier: Nachweisausstattungeri/ welche die verschiedenen zur Durchführung des ITachv/eisverfahrens erforderlichen üeagentien enthalten. Die Erfindung betrifft dalier ebenfalls Aissta ttungen für den ITachweis einer Probe auf einen multivalenten Liganden, wobei aieseAusstattuigen verbesserte Eeagentien umfaßt, welche die Anwendung einer Einmal-I.hkubaticnsmethode, wie sie zuvor beschrieben wurde, ermöglichen. Solche Ausstattungen oder Analysenmaterialien umfassen Behälter mit: (a) markiertem lieseptor füi* den multivalenten Liganden, und (b) einen nicht-markierten üeseptor für den multivalenten Liganden, der kovalent an einen festen träger gebunden ist, der eine im wesentlichen stabile, wäßrige Suspension bildet. Üblicherweise umlassen die Kombinationen ebenfalls Behälter von Standardpräparaten des multivalenter- liganden, der bestimmt werden soll. Bio Ausstattungen können i:i allgsmsinsn Behälter enthalten, welche die verschiedenen anu^re.,:.} zuvc-r- beschriebenen üeagentnen enthalten, einschließlich ^or ":3i Ausführungsfcm gemäß der Erfindung verv;3::'..letsn 1.
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ORiGiNAL INSPECTED

Claims (18)

PATENTANSPRÜCHE
1.) Doppelplatz-Iiumunonachweisverfahren, dadurch gekennzeichnet } daß man in einem wäßrigen Medium nach einer Einzelinkubationsweise (a) eine den multivalenten,, zu bestimmenden Liganden enthaltende Probe, (b) einen markierten Rezeptor für den Liganden und ( c) einen nicht-narkierten Rezeptor für den Liganden* der an einem Träger in fester Phase !covalent gebunden ists zur Eildung einer praktisch stabilen Suspension zusammenbringt? das wäßrige Medium unter Bildung eines Zweiphasensystems inkubiert,, in welchem die feste Phase einen Teil des markierten Rezeptors enthältr, der- an den Liganden gebunden ist, der seinerseits an den nicht-markierten Rezeptor gebunden ist, und in welchem die flüssige Phase den nicht-gebundenen Anteil des markierten Rezeptors enthält? die feste Phase von der flüssigen Phase trennt| und jede Phase auf markierten Rezeptor analysiert, wobei dieser eine Funktion der Konzentration des Liganden in der Probe darstellt. 0 30011/0 5 63
2. Doppelplatz-Immunonachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der in fester Phase vorliegende Träger aus Teilchen aus derivatisiertem Polyacrylamid mit einer Größe von etwa 0,1 bis 10/um besteht.
3. Doppelplatz-Immunonachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand die menschliche Schilddrüse stimulierendes Hormon ist und daß die Rezeptoren für den Liganden Antikörper gegen dieses Hormon sind.
4. Doppelplatz-Immunonachweisverzahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Antikörper gegen das die menschliche Schilddrüse stimulierende Hormon vorher gereinigt v/orden ist und im wesentlichen aus solchen Arten von Antikörpern gegen das die Schilddrüse stimulierende Hormon besteht, welche eine relativ hohe Affinität und Spszifität für das die menschliche Schilddrüse stimulierende Hormon aufweisen.
5. Doppelplatz-Imaiunonachv/sisverfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Antikörper gegen das die menschliche Schilddrüse stimulierende Hormon mit einem Traceratom oder -molekül markiert ist.
6. Doppelplatz-Iminunonachweisverfalareri nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Tracersubstanz ein radioaktives Atom oder radioaktives Molekül ist.
7. Doppelplatz-Immunonachweisverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daS die Tracersubstanz, radioaktives Jod125 ist.
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8. Radiometrysehes Doppelplatz-inuauiionachv/eisverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem wäßrigen Medium nach einer Einzelinkubationsweise (a) die das zu bestimmende, die menschliche Schilddrüse stimulierende Hormon enthaltende Probe, (b) einen radioaktiv markierten Antikörper gegen das die menschliche Schilddrüse stimulierende Hormon und (c) einen nicht-markierten Antikörper gegen das die menschliche Schilddrüse stimulierende Hormon, der kobalent an Teilchen aus derivatisiertem Polyacrylamid mit einer Größe von etwa 0,1 bis 10/um gebunden ist zur Bildung einer praktisch stabilen Suspension zusammenbringt; das wäßrige Medium zur Bildung eines Zv/eiphasensystems inkubiert, in -welchem die feste Phase einen Anteil des markierten Antikörpers enthälx, der an das Hormon gebunden ist, das seinerseits an den nicht-markierten Antikörper gebunden ist, und in welchem die flüssige Phase den nichtgebundenen Anteil des markierten Antikörpers enthält; die feste Phase von der flüssigen Phase trennt; und jede Phase auf markierten Antikörper analysiert, wobei dieser eine Punktion der Konzentration des Hormons in der Probe darstellt.
9. Radiometrisches Doppelplatz-Immunonachweisverfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Antikörper vorher gereinigt worden ist und im wesentlichen aus solchen Arten von Antikörpern bestehx, welche eine relativ hohe Affinität und Spezifität auf das die menschliche Schilddrüse stimulierende Hormon besitzen.
10. Radiometrisches Doppelplatz-Immunonachweisverfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Antikörper mit radioaktivem Jod-125 markiert ist.
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ORIGINAL INSPECTED
11. Ausstattung (kit;) zur Analyse einer Probe auf einen multivalenten Liganden, '.vocei die Rsagorxien eine Eiiizelinkubation bei der Bestimmung ermöglichen, gekennzeichnet durch Behälter mit (a) einia raarkierten Rezeptor für multivalente Liganden, und (b) einea nicht-markierten Rezeptor für den nuitivalenten Ligandsn, der kovalent an einen in fester Phase vorliegenden Träger gebunden ist und der eine im wesentlichen stabile, wäßrige Suspension bildet,
12. Ausstattung nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch Behälter mit Standardpräparaten für den zu bestimmenden multivalenten Liganden.
13· Ausstattung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet daß der in fester Phase vorliegende Träger aus Teilchen aus derivatisiertem Polyacrylamid mit einer Größe von etwa 0,1 bis 10/um besteht.
14. Ausstattung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand die menschlische Schilddrüse stimulierendes Hormon ist, und daß die Rezeptoren für den Liganden Antikörper gegen dieses Hormon sind.
15. Ausstattung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Antikörper gegen das die menschliche Schilddrüse stimulierende Hormon vorher gereinigt worden ist und im wesentlichen aus solchen Arten von Antikörpern gegen dieses Hormon besteht, welche eine relativ hohe Affinität und Spezifität für dieses Hormon besitzen.
16. Ausstattung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Antikörper gegen das die menschliche Schilddrüse stimulierende Hormon mit einem Traceratom oder -molekül markiert ist.
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Original inspected
17. Ausstattung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Tracersubstanz ein radioaktives Atom oder ein radioaktives Molekül ist.
18. Ausstattung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Tracersubstanz radioaktives Jod-125 ist.
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