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DE2660391C2 - Fluoreszierender Antikörper - Google Patents

Fluoreszierender Antikörper

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DE2660391C2
DE2660391C2 DE2660391A DE2660391A DE2660391C2 DE 2660391 C2 DE2660391 C2 DE 2660391C2 DE 2660391 A DE2660391 A DE 2660391A DE 2660391 A DE2660391 A DE 2660391A DE 2660391 C2 DE2660391 C2 DE 2660391C2
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DE
Germany
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fluorescent
antibody
antigen
fluorescence
rare earth
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DE2660391A
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Keith Oweb Palo Alto Calif. Hodgson
Irwin Los Altos Calif. Wieder
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WIEDER, IRWIN, LOS ALTOS, CALIF., US
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Individual
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Description

Die Erfindung betrifft einen fluoreszierenden Antikörper, der spezifisch für ein nachzuweisendes Antigen ist.
Bei der Fluoreszenzspektroskopie wird eine Probe, die ein Material unbekannter Menge enthält, d. h. Targetmoleküle, in einem Halter angeordnet. Bei der Probe kann es sich um eine flüssige Lösung oder einen Feststoff auf einem Substrat, wie Filterpapier, handeln. Die Probe wird dann einer Strahlung mit bekannter Spektralverteilung ausgesetzt, im allgemeinen Licht mit einer begrenzten Bandbreite. Die Spektralverteilung der Anregungsstrahlung liegt im Anregungsspektrum von Targetmolekülen und vorzugsweise in der Nähe des Maximums. Das der Bestrahlung folgende Emissionsspektrum liegt bei längeren Wellenlängen und ist charakteristisch für die Targetmoleküle. Seine Intensität wird gemessen, um die Menge der Targetmoleküle anzuzeigen.
Bei derzeitigen Spektrofluorometern tritt das Problem auf, daß ihre Empfindlichkeit durch das Rauschen bzw. Störsignale in den Anregungs- und Nachweiseinrichtungen und zweitens durch eine konkurrierende bzw. störende Fluoreszenz umgebender Substanzen, z. B. Substratmaterialien, Probenbehältern, Teilchen in der Luft oder anderen fluoreszierenden Spezien in der Probe, Reagenzien und dergleichen, begrenzt ist.
Auf die Verwendung eines pulsierend betriebenen Farbstoff-Lasers in einem Spektrofluorometer ist in der Zeitschrift »Analytical Chemistry«, Band 47, Nr. 2, Februar 1975, Seiten 271 bis 276, hingewiesen.
Die Verwendung eines Impuls-Lasers zur Fluoreszenzemissions-Anregung von Targetmolekülen verbessert den Störabstand (das Verhältnis von Nutzsignal zu Störsignal bzw. Rauschsignal). Trotz dieser Verbesserung des Störabstands ist dennoch das Problem einer konkurrierenden Fluoreszenz vorhanden. Wenn die Targetmaterialmenge sehr gering ist, etwa einige Teile pro eine Milliarde oder geringer, kann es sein, daß die Fluoreszenz der Targetmoleküle nicht nachweisbar ist, da sie schwächer als die gesamte Fluoreszenz aller Hintergr-undquellen sein kann.
Von Coons und Mitarbeitern wurde im Jahre 1941 ein Verfahren mit einem fluoreszierenden Antikörper (FAB = fluorescent antibody) entwickelt. Die ursprüngliche Idee bestand darin, einen Farbstoff an einen Antikörper zu koppeln, der dann mit einem Antigen verbunden werden konnte. In seiner ursprünglichen Form wurde es hauptsächlich zur Sichtbarmachung oder Aufzeichnung der Verteilung bestimmter Antigene in Geweben oder Zellen angewandt Die Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs hatte eine Steigerung der Empfindlichkeit um das Tausendfache zur Folge, im Gegensatz zu normalen nicht fluoreszierenden Farbstoffen, die früher als Markierungen bzw. Indikatoren verwendet wurden. In den folgenden Jahren wurden die Verfahren der Konjugation fluoreszierender Farbstoffe verbessert und stabilere Farbstoffe künstlich hergestellt In den Jahren 1950 und 1951 entwickelten Coons und Mitarbeiter bessere Verfahren zur künstlichen Herstellung von Fluorescinisocyanat und zu dessen Konjugation mit Antikörpern.
Dies stellte das FAB-Verfahren — in Verbindung mit der Entwicklung preiswerter Fluoreszenzmikroskope — auf feste Füße und bildete die Grundlage für seine weitverbreitete Anwendung in der Medizin.
Ende der fünfziger Jahre wurden drei andere wichtige stabile fluoreszierende Farbstoffe entwickelt: Rhodamin B 200, L-Dimethylaminonaphtylsulfonsäure5 (DANS) und Fluorescinisothiocyanat (FITC). Derzeit ist der am häufigsten verwendete Farbstoff für einen Fluoreszenz-Antikörper-Test das FITC.
Bis in die jüngste Zeit ist das Fluoreszenz-Antikörper-Verfahren hauptsächlich zum Nachweis bzw. zur Sichtbarmachung der Stelle von Antigenen auf einer Probe unter Verwendung eines Fiuoreszenzmikroskops angewandt worden. Hierbei wurden jedoch keine quantitativen Untersuchungen angestellt. Die Fluoreszenz des Fluoreszenz-Antikörpers wurde lediglich zur Anzeige des Vorhandenseins oder NichtVorhandenseins eines bestimmten Antigens oder seiner Verteilung auf einem Gewebe oder einer Zelle angewandt.
Zur Zeit ist man mit erheblichem Aufwand bestrebt, immunologische Verfahren zu entwickeln, die eine quantitative Messung bestimmter Antigene im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten ermöglichen. Diese Antigene können in der Natur auftretende Substanzen sein, z. B. Krebsantigene, Renin oder Thyroxin oder staatlich zugelassene Arzneimittel, z. B. Digoxin oder Methotrexat
Ein immunologischer Test, der erfolgreich bei Untersuchungen (Essays) angewandt wurde, die eine hohe Empfindlichkeit erfordern, ist der sogenannte Radioimmunoessay (RIA). Bei dem RIA wird das Antigen der zu untersuchenden Art radioaktiv markiert, dann läßt man verfügbare Antikörper mit dem zu untersuchenden Antigen in Konkurrenz treten, und nach geeigneten Prozeduren wird die Radioaktivität gemessen und die Menge des vorhandenen Antigens errechnet. Obwohl der RIA für die meisten subtilen Untersuchungen hinreichend empfindlich ist, ist doch die radioaktive Markierung nachteilig. Zu diesen Nachteilen gehört eine sorgfältige Handhabung radioaktiver Materialien, das Problem der Beseitigung radioaktiver Abfälle und die endliche Lebensdauer radioaktiver Antigene, gewöhnlich nur 60 Tage.
Die Möglichkeit der Verwendung eines fluoreszierenden Antikörpers anstelle eines radioaktiv markierten Antigens bei einem Immunoessay ist bereits in Fachkreisen wegen der hohen Empfindlichkeit der Fluoreszenz-Methode, insbesondere bei Anregung durch Laser-Licht, erörtert worden. Die Hintergrund-Fluoreszenz von Probenhaltern, Reagenzien, administrierten Drogen oder organischen Materialien im Blutserum oder Urin stört jedoch die Erzielung der hohen Empfindlichkeit, die bei einer immunofluorometrischen Untersuchung erforderlich ist.
Der US-PS 34 73 027 ist die Verwendung von Chelatcn seltener Erdmetalle wegen ihrer schmalbandigen Fluoreszenz als bekannt zu entnehmen. Sie werden jedoch zur Unterscheidung verschiedener Fluoreszenz-Farbstoffe verwendet, die teilweise aus diesen Chelaten in verhältnismäßig hoher Konzentration zusammengesetzt sind.
Der Zeitschrift »Instruments and Experimental Techniques« 17, 1974, Seite 846 bis 849, sind Verfahren zur Untersuchung der Fotolumineszenzabnahme einer Lumineszenzsubstanz nach einem Abtastimpuls als bekannt zu entnehmen.
In »Science«, 164,1969, Seiten 301 bis 302, wird darauf hingewiesen, daß eine sehr rasche Fluoreszenzabnahme organischer Farbstoffe nach einem Anregungsimpuls eines Lasers gemessen werden kann.
Nach »Review of Scientific Instruments«, 36, 1965, Seite 1854, läßt eine rotierende Schlitzscheibe Lumineszenzlicht in einem genau vorherbestimmten Zeitpunkt nach der Anregung über eine weitere Schlitzscheibe durch.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen fluoreszierenden Antikörper der gattungsgemäßen Art anzugeben, der es ermöglicht, die Meßempfindlichkeit bei einer immunofluorometrischen Untersuchung oder Fluoreszenz-Spektroskopie zu steigern.
Die erfindungsgemäße Lösung zeichnet sich aus durch ein fluoreszierendes Seltene-Erde-Chelat, das mit dem Antikörper konjugiert ist, aus einem Seltene-Erde-Ion besteht, das durch Chelatbildungsliganden koordiniert ist. Das Seltene-Erde-Chelat weist eine scharf begrenzte spektrale lang andauernde Fluoreszenz auf.
Die Anwendung dieses fluoreszierenden Seltene-Erde-Chelats ermöglicht es, nach Markierung der Targetsubslanz mittels dieses Chelats und nach Anregung der markierten Substanz durch einen Strahlungsimpuls, dessen Impulsdauer kurz im Vergleich zur Fluoreszenz-Zcrfallszeit bzw. -Abklingzeit des Chelats ist, den Nachweis bzw. die Messung erst dann durchzuführen, wenn eine störende bzw. konkurrierende Fluoreszenz von Umgebungssubstanzen im wesentlichen abgeklungen ist, da die Fluoreszenz des Seltene-Erde-Chelats wesentlich langer andauert, so daß allein die Emissionsspektren der Targetmoleküle gemessen und/oder nachgewiesen werden können. Auf diese Weise läßt sich die Meß- bzw. Nachweisempfindlichkeit erheblich steigern.
Nachstehend werden Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Materials und Verfahren für seine Anwendung näher beschrieben.
Targetsubstanzen, deren Menge bestimmt werden soll, werden mit einer fluoreszierenden Markierung markiert, die eine verhältnismäßig lange Fluoreszenz-Zerfallzeit im Vergleich zur Zerfallzeit von Umgebungssubstanzen hat. Das Targetmaterial wurde zuvor von anderen Substanzen auf bekannte Weise getrennt, z. B. durch Chromatographie oder durch Antikörperfixation.
Im folgenden wird ein Baispiel für die Trennung durch Antikörperfixation gegeben: Eine Menge des für ein Targetmaterial spezifischen Antikörpers wird auf einer festen Matrix, z. B. Zelluloseacetat, aufgebracht. F.ine unbekannte Menge von Targetmolekülen in Lösung und spezifisch für die gewählten Antikörper wird der Matrix ausgesetzt und reagiert mit den ausgewählten Antikörpern so, daß sie am Substrat fixiert wird. Hierzu wird auf »Proc. Soc. Experimental Biology«, Vol. 11, Seiten 394 bis 397,1963, verwiesen.
Nach einer Abtrennung des Targetmaterials wird es mit einer Fluoromarkierung, d. h. mit einem fluoreszierenden Markierungsmaterial, versehen, das eine Affinität zum Targetmaterial hat, wobei überschüssiges Markierungsmaterial abgewaschen wird.
Die Fluoromarkierung ist so ausgewählt, daß ihre Fluoreszenz-Zerfallzeit lang im Vergleich zu einer konkurrierenden Hintergrund-Fluoreszenz ist. Vorzugsweise wird eine Fluoromarkierung gewählt, deren Zerfallzeit zumindest das Zehnfache der Dauer der konkurrierenden Hintergrund-Fluoreszenz beträgt. Alle nachstehend als Beispiel angegebenen Fluoromarkierungen können zusammen mit jeder der Trennmethoden verwendet werden.
Die Fluoromarkierung gemäß der Erfindung besteht aus Seltene-Erde-Organokomplexen. Diese bestehen aus einer seltenen Erde, die an eine organische Verbindung gebunden ist, so daß der resultierende Komplex gewünschte Eigenschaften hat. Diese Eigenschaften sind effiziente Anregung bei gebräuchlichen Wellenlängen, eine gute Anregungsübertragung auf die seltene Erde, ein hoher Mengenwirkungsgrad bei gewöhnlichen Temperaturen, ein schmales Emissionsspektrum und sehr lange Lebensdauer bzw. Zerfallzeiten von etwa 10~3 see. Es wird angenommen, daß der Komplex seine Anregung auf die seltene Erde überträgt, und es ist die Intensität des Emissionsspektrums der seltenen Erde, die gemessen und zur Menge des vorhandenen seltenen Erdorganokomplexes in Beziehung gesetzt wird. Wenn Seltene Erdorganokomplexmoleküle in einem festen Verhältnis an ein Targetmolekül gebunden sind, läßt sich die Menge des Targetmaterials durch das Verfahren nach der DE-PS 26 28 158 bestimmen.
Repräsentative Seltene-Erde-Organokomplexe mit den gewünschten Eigenschaften sind Europiumbenzoylacetonat und Europiumbenzoyltrifluoroacetonat. Die Fluoreszenz der zuerst genannten Verbindung und anderer ähnlicher Verbindungen wird von S. I. Weissmann in dem »Journal of Chemical Physics«, Vol. 10, Seiten 214 bis 217,1942, behandelt.
Eine andere Gruppe von Fluoromarkierungen mit verhältnismäßig langen Zerfallzeiten, mehr als 100 Nanosekunden, bilden die Pyrenbutyrate. Die Herstellung von Pyrenbutyrat und typischen Fluoreszenz-Zerfallzeiten sind in dem »Journal of Biological Chemistry«, Vol.242, Seite 1353 (1967) und Vol.244, Seite 6309 (1969) angegeben.
Die Fluoromarkierungen können auf zwei Arten an Targetmolekülen, in Abhängigkeit vom jeweiligen Target, angebracht werden: Durch gewöhnliche chemische Kombination (nicht spezifisch) oder durch biochemische Wirkung (spezifisch). In dem zuletzt genannten Fall werden fluoreszierende Antikörper, die spezifisch für die Targetantigene sind, zum Einfangen durch die Antigene in einem bekannten Verhältnis gewählt, und die überschüssige Fluoromarkierung wird abgewaschen. Das Verfahren der Markierung von Antigenen mit fluoreszierenden Antikörpern ist in »Fluorescent Antibody Techniques and Their Applications« von A. Kawamura, Ed., University Park Press, Baltimore, M. D., 1969, beschrieben.
Die Herstellung eines mit Pyrenbutyrat konjugierten Antikörpers, d. h. eines fluoreszierenden Antikörpers, ist in dem »Journal of Biological Chemistry«, Vol. 244, Nr. 23,1969, Seiten 6543 bis 6547, beschrieben.
Die zum Anbringen von Seltene-Erde-Chelaten an Antikörpern gewählten Verfahren sollten mehrere Bedingungen erfüllen. Ein Chelatbildungsligand, eine chemische Gruppe, die Seltene-Erde-Ionen koordiniert,
sollte leicht mit Antikörpern unter milden Bedingungen konjugieren, so daß sich ein kovalent gebundenes, irreversibles Additionsprodukt ergibt Das Kopplungsverfahren und Vorhandensein eines Etitetts bzw. einer Markierung am Antikörper sollte die Antikörperspezifität und Reaktivität nicht wesentlich verringern. Das nach seinen P.uoreszenzeigenschaften ausgewählte SeI-tene-Erde-Chelat sollte einen guten Mengenwirkungsgrad bei Zimmertemperatur und eine scharf spektrale, lang andauernde Fluoreszenzcharakteristik des Seltene-Erde-Ions aufweisen.
Bei den meisten Chelatbildungsliganden wird dadurch die Wahl der seltenen Erde auf Europium +3 beschränkt, das im folgenden mit Eu (III) bezeichnet wird, und Terbium +3, das im folgenden mit Tb (III) bezeichnet wird, da diese Seltene-Erde-Ionen günstige Lagen ihrer niedrigliegenden Anregungszustände relativ zum niedrigsten Triplettzustand der Donator-Chelatbildungsligandmoleküle aufweisen. Dies verbessert den Mechanismus, durch den diese Seltene-Erde-Ionen fluoreszieren, nämlich die Absorption ultravioletter Energie im Ligandeinzelsystem, die Übertragung der Energie ins Ligandtriplettsystem und die anschließende Übertragung von Energie in die Seltene-Erde-Ionenzustände. Dieses Verfahren wird ausführlicher von R. F. Whan und G. A. Crosby in »J. Molec. Spect« 8, Seiten 315 bis 327 (1962) geschildert.
Eu(III)- und Tb(III)-Chelate wiesen die höchste Fluoreszenzintensität bei Zimmertemperatur im festen Zu-• V
C-CH3-
io
und unter Anwendung des von S. Nishimura und E. Irnoto in »Nippon Kagaku Zasshi« 82, 1411 (1961) beschriebenen Verfahrens erzeugt man 5-Cyano-2-acetylthiophen, nachstehend mit 3 bezeichnet:
N = C-
15
-C -ClI.
20
25
Die »blockierte« Form wird dann nach Standardverfahren hergestellt. Hier/u wird beispielsweise auf »| Amer. Chem. Soc.« 78, 6300 (1956) verwiesen. Dies er gibt die Verbindung 4
N = C
Die Verbindung 4 wird dann nach geläufigen Verfahren, z. B. dem in »J. Amer. Chem. Soc.« 70, 3738 (1948)
stand und in Lösung auf, und zwar bei Kombination mit 30 beschriebenen, reduziert und dann »deblockiert« (siehe verschiedensten Liganden. Die verschiedenen Liganden, z. B. »J. Amer. Chem. Soc.« 78,6300,1956), um 2-Acetyldie verwendet werden können, sind in »J. Chem. Phys.« 10, Seiten 214 bis 217 (1942), in »J. Chem. Phys.« 39, Seite 272 (1963) und in »J. Opt. Soc. Amer.« 54, Seite 1211 (1964) angegeben. 35
Beispiele geeigneter Seltene-Erde-Chelate zur Anbringung an Antikörpern für Immunoessay-Zwecke sind
5-(aminomethyl)-thiophen 5 zu erhalten:
NH2-CH2
C-CH,
40
Eu(III)-trii-(hexafluoroacetylacetonat),
Eu(III)tris-oder
-tetrakis-(thenoyltrifluoroacetonat),
Eu(III)tris- oder
-tetrakis-(benzoyltrifluoroacetonat)und Tb(III)tris-(acetylacetonat).
Als erstes Beispiel wird Eu(III)tris-(thenoyltrifluoroacetonat) als fluoreszierendes Chelat gewählt, das an einem Antikörper oder Protein angebracht werden soll.
Zunächst erfolgt die Synthese eines modifizierten Thenoyltrifluoroacetonatliganden, nachstehend mit 1 bezeichnet, der eine Aminomethyigruppe am Platz 5 des Thiophenrings hat.
50
NH2-CH2-
■>. II J>—C — CH2
Die Verbindung 1 läßt sich künstlich nach üblichen Verfahren der Synthese von /?-Diketonen herstellen. Der erste Verfahrensschritt ist die reduktive Synthese von 2-Acetyl-5-(aminomclhyl)-thiophen, nachstehend mit Verbindung 5 bezeichnet, aus dem blockierten 5-Cyano-2-acetyl-thiophen, nachstehend als Verbindung 4 bezeichnet.
Beginnend mit der leicht erhältlichen Verbindung 2, also 5-lodo-2-acetylthiophen
Unter Anwendung der Claisen-Kondensationstechnik, wie sie in »J. Amer. Chem. Soc.« 72, 2948 (1950) beschrieben ist, wird dann der Chelatligand 1 hergestellt, der nachstehend mit TTFA-NH2 abgekürzt wird. Der Eu(III)-Komplex, der das Anion eines funktionalisierten Liganden, TTFA-NH2, und die Anionen -cweier unsubstituierter Thenoyltrifluoroacetonatliganden enthält, die jeweils mit TTFA abgekürzt werden, können nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Ein Verfahren mit dem Ammoniumsalz desyi'-Ketoenols und dem richtigen seltenen Erdsalz ist in »J. Amer. Chem. Soc.« 70, 3142 (1948) angegeben. Dies ergibt die Verbindung Eu(IlI) (TTFA)2 (TTFA - N H2).
Um den fluoreszierenden Eu(III)-Komplex an einen O Antikörper zu koppeln, muß der Aminobestandieil des
Il TTFA — NH2-Liganden in ein Isothiocyanat umgcwan-
— C — CF3 55 delt werden. Hierfür gibt es verschiedene Möglichkeiten, die einen niedrigen pH-Wert vermeiden, der eine Säurezersetzung des Komplexes bewirken könnte. Derartige Umwandlungsarten sind von H.A. Staab und G. Walther in den »Ann.« 657, 98 (1962) und 657, 104 (1962) sowie von D. Hodson et al., in »J. Chem. Soc.« (C) 1970,971 angegeben worden.
Die eigentliche Ankopplung des fluoreszierenden Lu (III) an den Antikörper kann nach den verschiedenen Verfahren erfolgen, die bereits erfolgreich zur Anbringung von Fluorescin-Isothiocyanat an Antikörpern angewandt wurden, z. B. das von J. L. Riggs et al. in »Amer. J. Pathol.« 1.34, 1081 (1958) oder das von |. D. Marshall in »Proc. Soc. Exd. Biol. Med.« 98.898 (1958) beschriebe-
7
ne Verfahren. Fluoreszenz-Antikörpermenge auf dem festen Substrat
Um die oben angegebenen synthetisch hergestellten wird durch eine Fluoreszenz-Messung bestimmt. Fluoreszenz-Antikörper in einem direkten Immunofluo- Ein Verfahren zur Fluoreszenz-Spektroskopie, bei
reszenzessay von Blutserum für ein bestimmtes Antigen dem die erfindungsgemäßen fluoreszierenden Antiköranzuwenden, wird das Serum zuerst in der üblichen 5 per eingesetzt werden können, sowie eine Vorrichtung Weise hergestellt, und dann wird das Antigen an einem zur Durchführung dieses Verfahrens werden in der festen Substrat fixiert, einem für das Antigen spezifi- DE-PS 26 28 158 beschrieben, sehen Fluoreszenz-Antikörper ausgesetzt und mit diesem kombiniert, und schließlich wird überschüssiger Fluoreszenz-Antikörper abgetrennt.
Zur Isolierung bzw. Absonderung des Antigen-Fluoreszenz-Antikörper-Komplexes für Messungen können verschiedene Verfahren angewandt werden. Ein bevorzugtes Verfahren ist die von F. Paronetto in »Proc. Soc. Exp. Biol.« 113, 394 (1963) beschriebene »Sandwichw-Technik, bei der ein festes Substrat mit nicht fluoreszierender Antikörperflüssigkeit darauf der Probe ausgesetzt wird und sich im wesentlichen das gesamte Antigenmaterial in der Probe mit dem Antikörper kombiniert (dessen Menge über diejenige hinausgeht, die für den gewünschten Meßbereich erforderlich ist). Das feste Substrat wird dann in eine fluoreszenz-antikörperhaltige Lösung getaucht, so daß sich der Fluoreszenz-Antikörper an den Antigenen anlagert, die auf dem Substrat befestigt sind, dann wird das Substrat von überschüssigem Fluoreszenz-Antikörper befreit, so daß die Messung anhand der Fluoreszenz des festen Substrats durchgeführt werden kann. Dieses Verfahren läßt sich anwenden, wenn das Antigen mehr als eine Bindestelle für eine Antikörperkombination hat, d. h. für größere Moleküle aufweisende Antigene.
Für kleinere Moleküle mit nur einer antikörperspezifischen Bindungsstelle pro Molekül kann ein indirektes Untersuchungsverfahren angewandt werden. Mit den zu untersuchenden identische Antigene können an ein Festkörpersubstrat gebunden werden, das eine chemische Bindung mit einem Antigen in der Weise eingeht, daß eine antikörperspezifische Bindestelle bzw. Bindung freibleibt. Um dies zu erreichen, können chemische Verfahren angewandt werden, wie sie zur Kombination von Antigenen mit großer. Proteinen angewandt werden, bevor das konjugierte Antigen-Protein in ein Tier eingespritzt wird, um Antikörper gegen das Antigen zu bilden. Diese Verfahren erfordern die Ausbildung einer chemischen Verbindung des Antigens mit einem Protein, wobei die Antigen-Bindestelle dem tierischen Immunsystem ausgesetzt bleibt, so daß geeignete Antikörper erzeugt werden können. Ein derartiges Beispiel ist in »Structural Basis of Antibody Specificity«, Pressman & Goldberg, W. A. Benjamin (1968), Seiten 9 bis 10, zitiert. Ein festes Substrat oder Festkörpersubstrat, das zur chemischen Kombination mit einem Antigen geeignet ist, ist beispielsweise ein Styrolpolymer mit Seitenketten, die so funktionalisiert sind, daß sie einer geeigneten Gruppe am Antigen, das untersucht werden soll, angepaßt sind. Für jedes Antigen wird dann das zugehörige Festkörpersubstrat mit einem identischen Antigen überzogen, daß in dem Essay bzw. der Untersuchung für das Antigen verwendet werden soll.
Das feste Substrat wird dann in die Lösung getaucht, die die unbekannte Antigenmenge enthält, und dann wird der mit dem Antigen spezifisch reagierende Fluoreszenz-Antikörper zugesetzt. Das in der Lösung enthaltene Antigen und das Antigen auf dem festen Substrat konkurrieren um den Fluoreszenz-Antikörper, und die Menge des Festkörper-Antikörpers, die eine Kombination mit dem festen Substrat bildet, ist umgekehrt abhängig von der Antigenmenge in der Lösung. Die

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Fluoreszierender Antikörper, der spezifisch für ein nachzuweisendes Antigen ist gekennzeichnet durch ein fluoreszierendes Seltene-Erde-Chelat, das mit dem Antikörper konjugiert ist und aus einem Seltene-Erde-Ion besteht, das durch Chelatbildungsliganden koordiniert ist
2. Fluoreszierender Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß das Seltene-Erde-Ion Eu(III) und/oder Tb (III) ist.
3. Fluoreszierender Antikörper nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Chelatbildungsliganden Thenoyltrifluoroacetonate, Hexafluoroacetylacetonate und/oder Benzoyltrifluoroacetonate sind.
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