DE19926771A1 - Nukleinsäuremoleküle aus Weizen, transgene Pflanzenzellen und Pflanzen und deren Verwendung für die Herstellung modifizierter Stärke - Google Patents

Abstract

Es werden Nukleinsäuremoleküle beschrieben, die für ein R1-Protein aus Weizen codieren, und Verfahren und rekombinante DNA-Moleküle für die Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren. Außerdem werden die Pflanzenzellen und Pflanzen beschrieben, die aus diesen Verfahren resultieren, sowie die Stärke, die daraus erhältlich ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein für ein R1-Protein aus Weizen codierendes Nukleinsäuremolekül und Derivate und Teile davon, das genannte R1-Protein, Verfahren für die Herstellung des genannten R1-Proteins, transgene Pflanzenzellen und Pflanzen, die das genannte Nukleinsäuremolekül enthalten, und die modifizierte Stärke, die man aus den genannten transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen erhalten kann.

Das Polysaccharid Stärke stellt eine der wichtigsten Speichersubstanzen in Pflärizen dar. Stärke wird verbreitet für die Herstellung von Lebensmitteln eingesetzt und spielt auch eine wesentliche Rolle als nachwachsender Rohstoff für die Herstellung von Industrieprodukten. Um Stärke in vielen verschiedenen technischen Bereichen einzusetzen, ist eine große Vielfalt gezielt modifizierter Stärken erforderlich, um den verschiedenen Bedürfnissen der verarbeitenden Industrie gerecht zu werden.

Obwohl Stärke aus einer chemisch homogenen Basiskomponente besteht, nämlich Glukose, ist sie kein homogener Rohstoff. Sie ist ein komplexes Gemisch von Molekülen, die sich im Grad der Polymerisation und im Grad der Verzweigung der Glukoseketten voneinander unterscheiden: Stärke des Amylose-Typs ist im wesentlichen ein unverzweigtes Polymer, das aus α-1,4-glykosidisch verzweigten Glukosemolekülen besteht, während Stärke des Amylopektin-Typs ein Gemisch aus verzweigten Glukoseketten ist, das zusätzlich α-1,6-glykosidische Zwischenverbindungen enthält.

Die Molekularstruktur von Stärke ist im wesentlichen abhängig vom Grad ihrer Verzweigung, dem Amylose/Amylopektin-Verhältnis, der durchschnittlichen Kettenlänge, der Kettenlängenverteilung und dem Grad der Phosphorylierung, wodurch auch die funktionellen Eigenschaften der Stärke und deren wäßriger Lösungen bestimmt werden. Wichtige funktionelle Eigenschaften von Stärke bzw. deren wäßriger Lösungen sind beispielsweise die Löslichkeit, die Neigung zur Retrogradation, Filmbildungsfähigkeit, Viskosität, Verkleisterungseigenschaften (Bindung und Klebkraft) und Kältebeständigkeit. Ferner kann auch die Größe der Stärkekörner die Eignung der Stärke für bestimmte Anwendungen beeinflussen.

Da Stärke häufig durch chemische und/oder physikalische Modifikation angepaßt wird, um die Bedürfnisse der Industrie zu erfüllen, besteht ein großer Bedarf an der Bereitstellung modifizierter Stärken, so daß Pflanzenzellen oder Pflanzenteile, die modifizierte Stärke enthalten, besser für die industrielle Verarbeitung, z. B. für die Herstellung von Lebensmitteln oder technischen Produkten, geeignet wären. Es ist daher wünschenswert, eine chemische und/oder physikalische Modifikation, die zeitaufwendig und teuer ist, zu vermeiden und Pflanzen bereitzustellen, die eine Stärke synthetisieren, die die Bedürfnisse der stärkeverarbeitenden Industrie besser erfüllt.

Herkömmliche Verfahren für die Herstellung modifizierter Pflanzen, die modifizierte Produkte erzeugen, beispielsweise durch klassische Züchtung und/oder die Erzeugung von Mutanten, sind auf die Verwendung homologer Gene beschränkt und nicht immer zufriedenstellend. Insbesondere bei Weizen ist es schwierig, eine stabile Mutante durch klassische Züchtung herzustellen, da Weizen polyploid (tetra- oder hexaploid) ist. Dennoch wurde kürzlich durch Züchtung eine Weizenmutante erhalten, die eine wachsartige Stärke (amylosefreie Stärke) erzeugt (Nakamura et al., Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 253-259).

Eine weitere Alternative ist die Herstellung transgener Pflanzen, die geeignete Nukleinsäuremoleküle enthalten, die geeignet sind, den pflanzlichen Stärkestoffwechsel so zu modifizieren, daß sie eine modifizierte Stärke synthetisiert. Solche Pflanzen werden mit Hilfe rekombinanter molekularbiologischer Verfahren und der Einschleusung homologer und/oder heterologer Nukleinsäuremoleküle (z. B. codierende Regionen, regulierende Elemente, Introns) hergestellt, die den Stärkestoffwechsel beeinflussen. Der Einsatz rekombinanter molekularbiologischer Verfahren setzt jedoch die Verfügbarkeit geeigneter Nukleinsäuren voraus, die direkt oder indirekt (z. B. Cosuppression, Antisense-Technologie, Erzeugung eines Proteins oder Ribozyms) am Stärkestoffwechsel oder der Stärkebiosynthese (d. h. Synthese, Modifizierung und/oder Abbau von Stärke) im Hinblick auf die Quantität und/oder Qualität der Stärke beteiligt sind.

Zahlreiche Gene sind am Stärkestoffwechsel beteiligt. Daher wurden eine große Anzahl von Genen, die beispielsweise für Verzweigungsenzyme, Entzweigungsenzyme, Isoamylasen, Stärkesynthasen, ADP-Glukose- Pyrophosphorylasen etc. codieren, zur Modifizierung des Stärkestoffwechsels in Pflanzen eingesetzt.

Insbesondere ist bekannt, daß aus Kartoffeln und/oder Mais gewonnene R1- Proteine und für R1-Proteine codierende Gene am Stärkestoffwechsel im Hinblick auf den Phosphorylierungsgrad der Stärke beteiligt sind (WO 97111188-A1, WO 98/27212-A1, und Lorberth et al., Nature Biotechnology 16 (1998), 473-477).

Die Gegenwart eines R1-Proteins in Weizenpflanzen wurde jedoch nicht gezeigt, und die bekannten Nukleinsäuremoleküle, die für R1-Moleküle codieren, sind nicht immer zufriedenstellend für die gentechnische Veränderung von Weizenpflanzen und eine Modifizierung der Stärkebiosynthese und/oder des Stärkestoffwechsels in Weizen.

Daher besteht das von der vorliegenden Erfindung zu lösende Problem in der Bereitstellung eines aus Weizen gewonnenen Nukleinsäuremoleküls, das für ein R1-Protein codiert, und von Verfahren, die geeignet sind, den Stärkestoffwechsel von Pflanzen und insbesondere von Weizenpflanzen zu verändern, um eine modifizierte Stärke bereitzustellen, die sich von natürlich synthetisierter Stärke hinsichtlich ihrer physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften unterscheidet, insbesondere Weizenstärke, die verbesserte Merkmale für bestimmte Anwendungen in der Lebensmittel- und Nicht-Lebensmittel-Industrie aufweist.

Diese Probleme werden durch die Ausführungsformen dieser Erfindung gelöst.

Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein für ein R1-Protein codierendes Nukleinsäuremolekül, das eine Aminosäuresequenz gemäß Seq. ID Nr. 2 oder Derivate oder Teile davon gemäß dem cDNA-Insert von Plasmid pTaR1-11 (DSM Nr. 12810) enthält. Das genannte erfindungsgemäße R1-Protein ist am Stärkestoffwechsel beteiligt und ist direkt oder indirekt an der Stärkebiosynthese von Weizen im Hinblick auf den Phosphorylierungsgrad beteiligt.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff "Derivat" in bezug auf das R1-Protein (Polypeptid, Aminosäuresequenz) der Erfindung ein von Seq. ID Nr. 2 abgeleitetes Polypeptid, das etwa 60-79 Aminosäurereste, vorzugsweise mindestens 80, mehr bevorzugt mindestens 90, insbesondere mindestens 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 101-111 Aminosäurereste enthält, die aus der aus 1E, 2V, 3V, 5G, 6L, 7G, 8E, 9T, 10L, 11V, 12G, 13A, 14Y, 15P, 16 G, 17R, 18A, 20S, 21F, 23C, 24K, 25K, 27D, 28L, 30S, 31P, 34L, 35G, 36Y, 37P, 38S, 39K, 40P, 41I, 42G, 43L, 44F, 45I, 48S, 49I, 50I, 51F, 52R, 53S, 54D, 55S, 56N, 57G, 58E, 59D, 60L, 61E, 62G, 63Y, 64A, 65G, 66A, 67G, 68L, 69Y, 70D, 71S, 72V, 73P, 74M, 75D, 77E, 80V, 81V, 83D, 84Y, 87D, 88P, 89L, 901, 92D, 95F, 96R, 99I, 100L, 101S, 103I, 104A, 105R, 106A, 107G, 108H, 109A, 110I, 111E, 112E, 113L, 114Y, 115G, 116S, 117P, 118Q, 119D, 121E, 122G, 123V, 124V, 126D, 127G, 128K, 129I, 130Y, 131V, 132V, 133Q und 134T bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und die mindestens 1, vorzugsweise 2 und mehr bevorzugt 3 der Aminosäurereste enthält, die aus der aus 76V, 93S und 97N bestehenden Gruppe der Aminosäurereste (hier durch Einbuchstabencode angegeben) gemäß Seq. ID Nr. 2 ausgewählt sind.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff "Teil" in bezug auf das erfindungsgemäße R1-Protein (Polypeptid, Aminosäuresequenz) ein Poly- oder Oligopeptid, bestehend aus etwa 10-19, vorzugsweise mindestens 20, mehr bevorzugt mindestens 40, besonders bevorzugt mindestens 80 und am meisten bevorzugt etwa 100-140 der Aminosäurereste des erfindungsgemäßen R1-Proteins oder Derivats davon.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Nukleinsäuremolekül, das ein Nukleinsäuremolekül gemäß Seq. ID Nr. 1 enthält, oder Derivate oder Teile davon, das Insert 672 bp EcoRl/Kpn I des Plasmids pTa R1-11 (DSM Nr. 12810) oder Derivate oder Teile davon, insbesondere die codierende Region (die Nucleotide 1-­ 419) von Seq. ID Nr. 1 oder Derivate oder Teile davon oder die codierende Region des Inserts des Plasmids PtaR1-11 (DSM Nr. 12810) oder Derivate oder Teile davon.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff "Derivat" in bezug auf das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül (Nucleotidsequenz oder Polynucleotid) ein Polynucleotid, bestehend aus etwa 150-209 Nucleotiden, vorzugsweise mindestens 210, mehr bevorzugt mindestens 240, besonders bevorzugt 270 und am meisten bevorzugt etwa 280-294 Nucleotide, ausgewählt aus der Nucleotidgruppe, die aus 1C, 3G, 4A, 6G, 7T, 8G, 9G, 10T, 12A, 15G, 16G, 18C, 19T, 20T, 21G, 22G, 24G, 25A, 27A, 28C, 30C, 31T, 33G, 34T, 36G, 37G, 38A, 39G, 40C, 42T, 43A, 44T, 45C, 46C, 48G, 49G, 51C, 52G, 53T, 54G, 55C, 58T, 59G, 60A, 61G, 63T, 64T, 67T, 69T, 70G, 72A, 73A, 75A, 76A, 77A, 79A, 81G, 82A, 84C, 85T, 88A, 89C, 90T, 91C, 92T, 93C, 94C, 97A, 100T, 103T, 105G, 106G, 107T, 108T, 109A, 110C, 111C, 112C, 114A, 115G, 116C, 117A, 118A, 120C, 121C, 123A, 124T, 126G, 127G, 129C, 130T, 132T, 133T, 134C, 135A, 136T, 137A, 138A, 144T, 145C, 147A, 148T, 149C, 150A, 151 T, 152C, 153T, 154T, 155C, 156C, 157G, 159T, 160C, 162G, 163A, 165T, 166C, 168A, 169A, 171G, 172G, 174G, 175A, 177G, 178A, 181T, 182G, 183G, 184A, 185A, 186G, 187G, 188T, 189T, 190A, 1920,193C, 195G, 196G, 198G, 199C, 201G, 202G, 205T, 207T, 208A, 210G, 211A, 213A, 214G, 215T, 216G, 217T, 219C, 220C, 222A, 223T, 224G, 225G, 226A, 227T, 228G, 230G, 231G, 232A, 234G, 235A, 238A, 240G, 241T, 242T, 243G, 244T, 245A, 247T, 249G, 250A, 252T, 253A, 256C, 259C, 261G, 262A, 263C, 264C, 265C, 268T, 270A, 271T, 276G, 277A, 281 T, 285T, 286T, 287C, 288C, 289G, 295C, 296A, 297A, 298T, 299C, 300C, 301T, 303T, 304C, 306A, 308C, 309A, 310T, 312G, 313C, 315C, 316G, 318G, 319C, 320T, 321G, 322G, 324C, 325A, 327G, 328C, 330A, 331T, 332C, 333G, 334A, 335G, 336G, 337A, 338G, 339C, 340T, 342T, 343A, 344T, 345G, 346G, 348T, 349C, 351 C, 352C, 354C, 355A, 357G, 358A, 361T, 363G, 364A, 365G, 366G, 367G, 369G, 370T, 371A, 372G, 373T, 374G, 375A, 377G, 378G, 379A, 380T, 381G, 382G, 384A, 385A, 387A, 388T, 390T, 391A, 393G, 394T, 396G, 397T, 399C, 400A, 401G, 402A, 403C, 404A, 406A, 407C, 408C, 409A, 410C, 411A, 412G, 413A, 414T, 415G, 416T und 419T besteht und ferner etwa 15-19 Nucleotide, vorzugsweise mindestens 20, mehr bevorzugt mindestens 25, besonders bevorzugt mindestens 27 und am meisten bevorzugt etwa 30-32 Nucleotide enthält, ausgewählt aus der Gruppe, die sich aus 17A, 23A, 50C, 56C, 65C, 68G, 71T, 104G, 113T, 143G, 159C, 161A, 167T, 191C, 203G, 206G, 218C, 221T, 229T, 233A, 248C, 251C, 257G, 269C, 272C, 279T, 280C, 290G, 326C, 341C, 347G, 350A, 353A, 359T, 383G, 392C, und 405T der Seq. ID Nr. 1 zusammensetzt.

Ferner umfaßt der Begriff "Derivat" in bezug auf das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül, das für ein R1-Protein codiert, ein Nukleinsäuremolekül, das durch Addition, Deletion, Insertion oder Rekombination eines oder mehrerer Nucleotide von Seq. ID Nr. 1 abweicht und der oben genannten Definition gerecht wird.

Außerdem beinhaltet der Begriff "Derivat" in bezug auf das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül, das für ein R1-Protein codiert, eine komplementäre oder eine revers komplementäre Sequenz (Polynucleotid) des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder von Derivaten oder Teilen davon.

Der Begriff "Teil", der sich auf das für ein R1-Protein codierende Nukleinsäuremolekül gemäß dieser Erfindung bezieht, umfaßt ein Poly- oder Oligonucleotid, bestehend aus etwa 30-99, vorzugsweise mindestens 100, mehr bevorzugt mindestens 200, besonders bevorzugt mindestens 300 und am meisten bevorzugt etwa 400-420 der Nucleotide des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, das für ein R1-Protein codiert, oder ein Derivat oder einen Teil davon.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung schließen die Begriffe "Derivat" und/oder "Teil" gemäß der vorliegenden Erfindung ein Polynucleotid, bzw. ein wie oben definiertes Poly- oder Oligopeptid ein, das die funktionale und/oder strukturelle Äquivalenz des aus Weizen gewonnenen R1-Gens (d. h. des Nukleinsäuremoleküls, das für das R1-Protein codiert) bzw. R1-Proteins zeigt. Der Begriff "funktionale und/oder strukturelle Äquivalenz" bedeutet im allgemeinen die gleiche, eine äquivalente oder ähnliche Funktion des entsprechenden Moleküls der Erfindung, insbesondere biologische Funktion.

Die durch die erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle codierten R1-Proteine können gewisse gemeinsame Eigenschaften aufweisen, z. B. Enzymaktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktionsfähigkeit, Konformation, Mobilität bei der Gelelektrophorese, chromatographische Eigenschaften, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität, pH-Optimum und/oder Temperaturoptimum der Enzymaktivität usw.

Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann z. B. aus natürlichen Quellen isoliert, nach gentechnischen oder molekularbiolgischen Methoden (z. B. PCR) oder mit Hilfe chemischer Synthese hergestellt werden. Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ist vorzugsweise ein DNA- oder RNA-Molekül, z. B. ein cDNA- oder genomisches DNA-Molekül. Gegebenenfalls umfaßt das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül eine oder mehrere intervenierende Sequenzen (Introns).

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ein oder mehrere regulatorische Elemente, die die Transkription und Synthese eines RNA-Moleküls in einer prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zelle, vorzugsweise in einer Pflanzenzelle, sichern.

Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ist geeignet, die Stärkebiosynthese/- stoffwechsel in einer Zelle, vorzugsweise in einer Pflanzenzelle, mittels Sense- Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, Antisense-Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, Expression eines geeigneten Ribozyms, Cosuppression oder In-vivo-Mutagenese zu modifizieren.

Daher betrifft die Erfindung auch die Verwendung des Nukleinsäuremoleküls, insbesondere eines DNA-Moleküls, um die Synthese eines translatierbaren oder nicht-translatierbaren mRNA-Moleküls (Sense- bzw. Antisense-, Co­ suppressionseffekt oder Ribozym) in einer Zelle oder einer Pflanzenzelle, die den Expressionsgrad des R1-Proteins modifiziert, zu ermöglichen.

Im allgemeinen ist die Anwendung des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls für jede Pflanzenart geeignet. Jedoch werden ein- und zweikeimblättrige Pflanzen bevorzugt, insbesondere Kulturpflanzen, und am meisten bevorzugt stärkespeichernde Pflanzen, z. B. Roggen, Gerste, Hafer, Weizen, Hirse, Sago, Reis, Mais, Erbsen, Markerbsen, Kassaven, Kartoffeln, Tomaten, Ölraps, Sojabohnen, Hanf, Flachs, Sonnenblumen, Langbohnen, Arrowroot, Klee, Raygras oder Luzerne, insbesondere Kartoffel-, Mais-, Reis- oder Weizenpflanzen.

Die Methode der Cosuppression ist den Fachleuten wohlbekannt (Jorgensen, Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344, Niebel et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103, Flavell et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-56, Palaqui & Vaucheret, Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159. Vaucheret et al., Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311-317 und de Borne et al., Mol. Gen. Genet 243 (1994), 613-621.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft diese Erfindung ein für ein RNA-Molekül codierendes DNA-Molekül, das Ribozymaktivität aufweist, die spezifisch die Transkripte des DNA-Moleküls der Erfindung spaltet. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA-Moleküle, die in der Lage sind, RNA-Moleküle und spezifische Targetsequenzen zu spalten. Mittels rekombinanter DNA-Verfahren kann die Spezifizität eines Ribozyms in bezug auf das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül bestimmt werden. Um ein DNA-Molekül herzustellen, das für ein Ribozym codiert, das speziell ein Transkript eines erfindungsgemäßen DNA- Moleküls abspaltet, wird z. B. eine DNA-Sequenz (DNA-Molekül), die für einen katalytischen Bereich eines Ribozyms codiert, doppelseitig mit einer DNA-Sequenz der Erfindung verbunden. Eine Nukleinsäuresequenz, die für den katalytischen Bereich codiert, ist z. B. der katalytische Bereich der Satelliten-DNA des SCMo- Viruses (Davies et al., Virology 177 (1990), 216-224) oder der Satelliten-DNA des TobR-Viruses (Steinecke et al., EMBO J. 11 (1992), 1525-1530; Haseloff and Gerlach, Nature 334 (1988), 585-591). Die DNA-Sequenz, die den katalytischen Bereich flankiert, ist vorzugsweise das erfindungsgemäße DNA-Molekül oder ein Teil davon, das als Ziel dienen soll. Das allgemeine Prinzip der Expression von Ribozymen und die Methode werden in EP-B1 0 321 201 beschrieben. Die Expression von Ribozymen in Pflanzenzellen wird ferner bei Feyter et al. (Mol. Gen. Genetic. 250 (1996), 329-338) beschrieben.

Eine Abnahme der Aktivität des R1-Proteins in einer Pflanzenzelle kann auch nach der Methode der "In-vivo-Mutagenese" erreicht werden. Hierbei wird ein hybrides RNAIDNA-Oligonucleotid (Chimeroplast) in eine Zelle eingeschleust (Kipp et al., Posterpräsentation auf dem 5. Internationalen Kongreß über Pflanzenmolekularbiologie, 21.-27. September 1997, Singapur; Dixon und Arntzen, Tagungsbericht zum Thema "Metabolic Engineering in Transgenic Plants", Symposium in Keystone, Copper Mountain, CO, USA, TIBTECH 15 (1997), 441-­ 447; WO 95/15972-A1; Kren et al., Hepatology 25 (1997), 1462-1468; Cole-Strauss et al., Science 273 (1996), 1386-1389).

Ferner betrifft die Erfindung einen Vektor, insbesondere ein Plasmid, Cosmid, Virus, Bakteriophagen u. ä., der für die Gentechnik geeignet ist und ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül (z. B. DNA und/oder RNA) enthält, insbesondere einen Vektor, der für die gentechnische Veränderungen von Bakterien und/oder Pflanzen geeignet ist. Der Begriff "Vektor" bedeutet ein geeignetes Mittel, das dem Durchschnittsfachmann bekannt ist und den zielgerichteten Transfer einzel- oder doppelsträngiger Nukleinsäuremoleküle in eine Wirtszelle ermöglicht, z. B. ein DNA- oder RNA-Virus oder ein Virusfragment, ein geeignetes Plasmid für den Transfer eines Nukleinsäuremoleküls in eine Zelle in An- oder Abwesenheit regulatorischer Elemente, und Metallpartikel, wie sie z. B. beim "particle-gun"- Verfahren verwendet werden, aber auch ein Nukleinsäuremolekül, das mit chemischen und/oder physikalischen Methoden direkt in eine Zelle eingeschleust werden kann.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine transgene Wirtszelle, insbesondere eine transgene prokaryotische oder eukaryotische Zelle, und bevorzugter eine transgene Bakterien- oder Pflanzenzelle, die durch ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor transformiert und/oder rekombinant manipuliert wird. Die erfindungsgemäße transgene Wirtszelle, insbesondere die transgene Bakterien- oder Pflanzenzelle, enthält ein oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle, die in das Genom der besagten Zelle stabil integriert werden, vorzugsweise nicht an der homologen Stelle im Genom bzw. nicht an der Stelle, an der das Gen im Genom natürlicherweise vorkommt. Die erfindungsgemäßen transgenen Zellen können mittels Southern Blot, Northern Blot und/oder Western Blot nachgewiesen werden.

Außerdem betrifft diese Erfindung eine transgene Zelle, die von einer erfindungsgemäßen transgenen Wirtszelle und/oder deren Abkömmlingen abstammt und die ein Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor gemäß dieser Erfindung enthält.

Durch Bereitstellung des erfindungsgemäßes Nukleinsäuremoleküls und/oder des Vektors wird mittels rekombinanter DNA-Verfahren eine transgene Pflanzenzelle oder Pflanze hergestellt, die ein Nukleinsäuremolekül und/oder einen Vektor gemäß dieser Erfindung enthält, insbesondere eine einkeimblättrige oder zweikeimblättrige Pflanzenzelle oder Pflanze, vorzugsweise eine Kulturpflanzenzelle oder eine Pflanze, insbesondere eine Pflanzenzelle oder eine Pflanze, die aus der Gruppe bestehend aus Kartoffeln, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Erbsen, Reis, Hirse, Markerbsen, Kassaven, Sago, Tomaten, Ölraps, Sojabohnen, Hanf, Flachs, Sonnenblumen, Langbohnen, Arrowroot, Klee, Raygras, Luzerne und Maniok ausgewählt wurde.

Die erfindungsgemäße transgene Pflanzenzelle oder Pflanze synthetisiert eine modifizierte Stärke, die sich von Stärke, die in einer (nicht transformierten) Wildtyppflanze synthetisiert wurde, in bezug auf die Struktur und/oder die physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften unterscheidet. Nach gentechnischen und/oder molekularbiologischen Methoden wird ein Vektor und/oder ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül in eine Pflanzenzelle eingeschleust, vorzugsweise an eines oder mehrere regulatorische Elemente gebunden, die eine Transkription und/oder Translation in der besagten Pflanzenzelle sicherstellen. Gegebenenfalls wird die erhaltene transgene Pflanzenzelle dann zu einer ganzen Pflanze regeneriert.

Daher betrifft diese Erfindung eine transgene Pflanzenzelle, insbesondere eine einkeimblättrige oder zweikeimblättrige Pflanzenzelle, vorzugsweise eine Kartoffel-, Mais-, Hafer-, Roggen-, Gerste-, Weizen-, Erbsen-, Reis-, Hirse-, Markerbsen-, Cassave-, Sago-, Tomaten-, Ölraps-, Sojabohnen-, Hanf-, Flachs-, Sonnenblumen-, Langbohnen-, Arrowroot-, Klee-, Raygras-, Luzerne- oder Maniokzelle, insbesondere Kartoffel-, Weizen-, Mais- oder Reiszeile, die ein Nukleinsäuremolekül und/oder einen Vektor gemäß dieser Erfindung enthält.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Herstellung einer transgenen Wirtszelle, vorzugsweise einer Pflanzenzelle, die den Schritt des Einschleusens eines Nukleinsäuremoleküls und/oder eines Vektors gemäß dieser Erfindung in das Genom einer Wirtszelle umfaßt, die eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle ist, vorzugsweise in das Genom einer Pflanzenzelle. Die besagte Zelle enthält vorzugsweise ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem oder mehreren regulatorischen Elementen verbunden ist, die die Transkription und/oder Translation in der besagten Zelle sicherstellen. Geeignete regulatorische Elemente sind vorzugsweise homolog oder heterolog in bezug auf das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül.

In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung eine transgene Pflanzenzelle, wobei die Anwesenheit eines (homologen oder gegebenenfalls heterologen) erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls direkt oder indirekt zur Expression des erfindungsgemäßen R1-Proteins führt oder alternativ zur Hemmung der Expression eines oder mehrerer endogener Gene, die für ein R1-Protein codieren. Vorzugsweise enthält die transgene Pflanzenzelle ein Nukleinsäuremolekül, das aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus:

• a) einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise einem DNA- Molekül, das in eine sense-RNA transkribiert wird, was zur Expression eines erfindungsgemäßen R1-Proteins führt;
• b) einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise einem DNA- Molekül, das in eine antisense-RNA transkribiert wird, was zu einer Reduzierung (Inhibierung) der Expression eines oder mehrerer endogener Gene führt, die für ein R1-Protein codieren;
• c) einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise einem DNA- Molekül, das in eine Cosuppressions-RNA (Sense-RNA) transkribiert wird, was zu einer Reduzierung (Inhibierung) der Expression eines oder mehrerer endogener Gene führt, die für ein R1-Protein codieren;
• d) einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise einem DNA- Molekül, das in ein Ribozym transkribiert wird, das spezifisch ein Transkript eines oder mehrerer endogener Gene spaltet, die für ein R1-Protein codieren; und
• e) einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül, das durch In-vivo- Mutagenese eingeschleust wird, wobei ein oder mehrere endogene Gene, die für ein R1-Protein codieren, modifiziert werden,

wodurch der Stärkestoffwechsel/die Stärkebiosynthese in der genannten Zelle modifiziert wird.

Wird die Modifizierung des Stärkestoffwechsels in den Pflanzen mit Hilfe eines antisense-Effektes erreicht, so wird das erfindungsgemäße DNA-Molekül in antisense-Richtung an eines oder mehrere regulatorische Elemente gebunden und sichert dadurch die Transkription und/oder Translation in einer Pflanzenzelle, gegebenenfalls ein oder mehrere Intron(s) einer entsprechenden Genomsequenz deszu exprimierenden Polynucleotids enthaltend. Die antisense-RNA sollte mindestens etwa 15-25 Nucleotide aufweisen, vorzugsweise mindestens etwa 50-100 Nucleotide und am meisten bevorzugt mindestens etwa 200-1000 Nucleotide.

In einer weiteren Ausführungsform wird die Abnahme der R1-Proteinmenge in der transgenen Pflanzenzelle durch ein Ribozym erreicht, das ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül enthält. Um das genannte Ribozymmolekül in einer erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzelle zu exprimieren, wird das DNA- Molekül, das für das genannte Ribozym codiert, an ein oder mehrere regulatorische Elemente gebunden, die die Transkription und/oder Translation sicherstellen.

Mit Hilfe von Methoden, die dem Fachmann wohlbekannt sind, kann die transgene Pflanzenzelle zu einer ganzen Pflanze regeneriert werden. Die transgene Pflanze, die eine erfindungsgemäße transgene Pflanzenzelle enthält, die durch Regenerierung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzelle erhältlich ist, sowie das Verfahren für die Herstellung der genannten transgenen Pflanze sind auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die erfindungsgemäße transgene Pflanze ist eine einkeimblättrige oder zweikeimblättrige Pflanze, vorzugsweise eine Kulturpflanze, insbesondere eine Roggen-, Gerste-, Hafer-, Reis-, Weizen-, Hirse-, Sago-, Mais-, Erbsen-, Markerbsen-, Cassave-, Kartoffel-, Tomaten-, Maniok-, Ölraps-, Sojabohnen-, Hanf-, Flachs-, Sonnenblumen-, Langbohnen-, Weißklee-, Raygras-, Luzerne- bzw. Arrowrootpflanze, am meisten bevorzugt eine Mais-, Weizen-, Reis- oder Kartoffelpflanze.

Ferner betrifft diese Erfindung das Vemehrungsmaterial, die Samen, Vermehrungsorgane und Teile der erfindungsgemäßen Pflanzen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Herstellung von Stärke, enthaltend den Schritt der Einführung einer transgenen Pflanzenzelle, Pflanze und/oder eines Teils einer Pflanze gemäß der Erfindung in ein Verfahren zur Stärkeproduktion/extraktion.

Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren für die Herstellung modifizierter Stärke, enthaltend den Schritt der Einführung einer erfindungsgemäßen Stärke in ein Verfahren für die chemische und/oder physikalische Stärkemodifikation/Stärkebehandlung.

Verfahren für die Stärkeextraktion aus Pflanzen, Pflanzenzellen oder deren Teilen sind dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt. Solche Verfahren werden z. B. bei Eckhoff et al. (Cereal Chem. 73 (1996), 54-57) beschrieben. Die Extraktion von Maisstärke wird z. B. durch "Naßmahlen" erreicht. Andere Methoden der Stärkeextraktion aus verschiedenen Pflanzen werden z. B. beschrieben in Starch: Chemistry and Technology (Hrsg.: Whistler, BeMiller and Paschall (1994) 2. Ausgabe, Academic Press Inc. London LTD; ISBN 0-12-746270-8; Kapitel XII, Seite 417-468: Corn and Sorghum Starches: Production; von Watson, S. A.; Kapitel XIII, Seite 469-479: Tapioca, Arrowroot and Sago Starches: Production; von Corbishley und Miller; Kapitel XIV, Seite 479-490: Potato Starch: Production and Uses; von Mitch; Kapitel XV, Seite 491-506: Wheat starch: Production, Modification and Uses; von Knight und Olson; und Kapitel XVI, Seite 507-528: Rice starch: Production and Uses; von Rohwer und Klem). Mittel, die gewöhnlich in Methoden zur Stärkeextraktion aus Pflanzenmaterial eingesetzt werden, sind Separatoren, Dekanter, Hydroklone und verschiedene Arten von Maschinen für das Trocknen der Stärke, z. B. Sprühtrockner oder Luftstromtrockner.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die aus erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen, Pflanzen und/oder Teilen einer Pflanze gewonnene modifizierte Stärke. Die erfindungsgemäßen transgenen Zellen oder Pflanzen synthetisieren eine modifizierte Stärke, die sich in bezug auf den Phosphorylierungsgrad von einer Stärke unterscheidet, die aus nichttransformierten Pflanzen gewonnen werden kann. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung weist die erfindungsgemäße Stärke einen erhöhten Phosphatgehalt auf, verglichen mit einer Stärke, die aus entsprechenden nichttransformierten Zellen oder Pflanzen gewonnen werden kann. Ein erhöhter Phosphatgehalt (Phosphatmonoestergehalt) bedeutet eine Stärke, die einen um etwa 10-30%, bevorzugter um mindestens 30%, noch bevorzugter um mindestens 50% und insbesondere bevorzugt um mehr als 100 bis zu etwa 1000-5000% höheren Phosphatgehalt aufweist, verglichen mit dem Phosphatgehalt einer Stärke, die aus einer entsprechenden nichttransformierten Pflanze gewonnen werden kann. Im allgemeinen beziehen sich die Prozentwerte auf den Glucose-6-Phosphat (Glu-6-P)-Gehalt von Weizenstärke von etwa 0,3 nMol Glu-6-P/mg Stärke, der z. B. nach der Methode von Lim et al., Cereal Chem., (1994) 71, 448 bestimmt wurde. Dementsprechend weist die Weizenstärke gemäß vorliegend Erfindung einen Glucose-6-Phosphatgehalt von mindestens 0,4 nmol/mg Stärke auf, vorzugsweise von mindestens 0,6 nmol/mg, bevorzugter von mindestens 0,8 nmol/mg, insbesondere von mindestens 1,0 nmol/mg, speziell von mindestens 1,5 nmol/mg, und am meisten bevorzugt von mindestens 3,0 nmol/mg Stärke.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung weist die erfindungsgemäße modifizierte Stärke einen verminderten Phosphatgehalt (Phosphatmonoestergehalt) von etwa 5-20%, vorzugsweise 21-50%, sogar noch bevorzugter einen verminderten Phosphatgehalt von etwa 51-95% auf, verglichen mit dem Phosphatgehalt einer Stärke, die aus einer entsprechenden nichttransformierten Pflanze gewonnen werden kann. Dementsprechend weist die erfindungsgemäße Weizenstärke einen Glucose-6-Phosphatgehalt von weniger als 0,2 nmol/mg Stärke, vorzugsweise von weniger als 0,1 nmol/mg, bevorzugter von weniger als 0,05 nmol/mg, insbesondere von weniger als 0,02 nmol/mg, speziell von weniger als 0,01 nmol/mg und am meisten bevorzugt von weniger als 0,001 nmol/mg Stärke auf.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines R1- Proteins oder eines Derivates oder Teils davon, enthaltend die Schritte der Kultivierung einer erfindungsgemäßen transgenen Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des genannten R1-Proteins oder eines Derivates oder Teils davon ermöglichen, und die Isolierung des genannten R1-Proteins oder eines Derivats oder eines Teils davon aus den genannten Zellen und/oder dem Kultivierungsmedium der genannten Zellen.

Außerdem betrifft die Erfindung ein R1-Protein (R1-Polypeptid) oder ein Derivat oder einen Teil davon, die von einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül codiert werden, das nach der Methode für die Herstellung eines erfindungsgemäßen R1-Proteins oder Derivates oder eines Teils davon, vorzugsweise eines R1-Proteins oder Derivates oder eines Teils davon aus Weizen, insbesondere gemäß Seq. ID Nr. 2, erhältlich ist.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat der Begriff "regulatorisches Element, das die Transkription und/oder Translation sicherstellt", vorzugsweise die Bedeutung eines Nukleinsäuremoleküls (z. B. DNA und/oder RNA), das die Einleitung und/oder Beendigung der Transkription in einer Zelle ermöglicht, wie etwa Promotoren, Enhancer, Terminatoren usw. Der Begriff "regulatorisches Element, das die Transkription und/oder Translation sicherstellt" kann auch ein Nukleinsäuremolekül umfassen, das zu einer zeitlich und/oder örtlich (Endosperm, Wurzel, Knolle, Blatt, Stengel, Samen, Frucht, Apoplast, Vacuole, Cytosol, Plastid, Mitochondrium, Lysosom) begrenzten Transkription in einer Pflanze oder Pflanzenzelle führt oder das chemisch induzierbar ist.

Für die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle in einer Pflanzenzelle kann jeder aktive Promotor verwendet werden. Der genannte Promotor kann in bezug auf die zu transformierende Pflanzenzelle homolog oder heterolog sein, z. B. für eine konstitutive Expression der 35S Promotor des Blumenkohlmosaikviruses (CaMV) (Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812; Mitsuhara et al., Plant and Cell Physiology 37 (1996), 49-59) oder des Promotorkonstrukts, das in WO 95/01571-A1 beschrieben wird. Geeignet sind auch Promotoren, die zu einer örtlich und/oder zeitlich begrenzten Expression führen, die durch endogene und/oder exogene Faktoren (z. B. WO 93/07279-A1) bestimmt/induziert wird, z. B. eine begrenzte Expression in bezug auf ein besonderes Gewebe oder einen Pflanzenteil (Stockhaus et al. EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). Promotoren, die im stärkespeichernden Teil der zu transformierenden Pflanze aktiv sind, werden bevorzugt. Bevorzugte Pflanzenteile für die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle sind z. B. Mais-, Weizen- und Reiskörner oder -samen und Kartoffelknollen u. a.. Für die Transformation von Kartoffeln kann der knollenspezifische Promotor B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) verwendet werden. Außer Promotoren können DNA-Bereiche, die die Transkription einleiten, auch DNA-Sequenzen enthalten, die eine weitere Zunahme der Transkription sichern, wie die sog. Enhancerelemente. Für die Expression in Pflanzenzellen und insbesondere in Weizenzellen können folgende Promotoren verwendet werden: Promotor 35S (Odell et al. supra; Mitsuhara et al., supra), Ubiquitinpromotor (US 5,614,399, Christensen et al.., Plant Mol. Biol. 18 (1992), 675-689; Takimoto et al., Plant Mol. Biol. 26 (1994), 1007-1012; Cornejo et al., Plant Mol. Biol. 23 (1993), 567-581; Toki et al., Plant Phys. 100 (1992), 1503- 1507), Glutelinpromotor (Leisy et al., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng et al., Plant J. 4 (1993), 357-366; Kononowicz et al., Joint annual meeting of The American Society of Plant Physiologists and The Canadian Society of Plant Pyhsiologists, Minneapolis, Minnesota, USA, 1. Juli bis 4. August 1993, Plant Physiol. 102 (Suppl.) (1993) 166; Zhao et al., Annual Meeting of the American Society of Plant Physiologists, Pittsburgh, Pennsylvania, USA, 1.-5. August 1992. Plant Physiol. 99 (1 Suppl.) (1992), 85; Yoshihara et al., FEBS Lett. 383 (1996), 213-218), Actinpromotor (McElroy et al., Plant Cell 2 (1990), 163-171), Cab-6-Promotor (Plant and Cell Physiology 35 (1994), 773-778), RTBV-Promotor (Yin et al., Plant J. 12 (1997), 1179-1188), CVMV-Promotor (Verdaguer et al., Plant Mol. Biol. 31 (1996), 1129-1139), Rab 16B-Promotor (Plant Physiol. 112 (1996), 483-491), Promotor des PsbD-C-Operon (To et al., Plant and Cell Physiology 37 (1996), 660-666), Tpi- Promotor (Snowden et al., Plant Mol. Biol. 31 (1996), 689-692), Osgrpl-Promotor (Xu et al., Plant Mol. Biol. 28 (1995), 455-471, Ltp2-Promotor (Kalla et al., Plant J. 6 (1994), 849-860), ADH1-Promotor (Kyozuka et al., Mol. Gen. Genet. 228 (1991), 40- 48) und LHCP-Promotor (EMBO J. 10 (1991), 1803-1808).

Ferner schließt der Begriff "regulatorisches Element" auch ein Terminationssignal ein, das die Transkription beenden kann und/oder an das transkribierte Nukleinsäuremolekül einen Poly-A-Schwanz anfügen kann. Beispiele für ein Terminationsssignal sind die 3'-nicht-translatierbaren Regionen, die das Polyadenylierungssignal des Nopalinsynthasegens (NOS-Gen) oder des Octopinsynthasegens (Gielen et al., EMBO J. 8 (1989) 23-29) der Agrobakterien einschließen, die 3'-nicht-translatierbare Region des Gens des Speicherproteins der Sojabohne oder eine kleine Untereinheit von Ribulose-1,5-Biphosphat-Carboxylase (ssRUBISCO). Gegebenenfalls schließt der Begriff "regulatorisches Element" ein Nukleinsäuremolekül ein, das z. B. die spezifische Stelle der Transkription und/oder Translation des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung in einem spezifischen Gewebe (z. B. Endosperm, Blatt, Stengel, Knolle, Meristem, Frucht, Wurzel, Samen) oder einem Zellkompartiment (z. B. Cytosol, Apoplast, Plastid, Mitochondrium, Vacuole, Lysosom) einschließt. Gegebenenfalls schließt der Begriff "regulatorisches Element" auch Nukleinsäuremoleküle ein, die z. B. eine zeitlich begrenzte Transkription und/oder Translation des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls sichern.

Überdies kann das "regulatorische Element" gegebenenfalls chemisch induziert werden.

Das Einschleusen eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls in eine Pflanzenzelle, vorzugsweise eines DNA- oder RNA-Moleküls, erfolgt gewöhnlich unter Verwendung von Klonierungsvektoren, die eine stabile Integration des Nukleinsäuremoleküls in das Pflanzengenom sicherstellen. Für das Einschleusen eines Nukleinsäuremoleküls in eine höhere Pflanze stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen für die Selektion transformierter Bakterienzellen, z. B. pBR322, pUC- Reihen, M13mp-Reihen, pACYC184, enthalten. Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann durch Verwendung eines oder mehrerer Restriktionsendonucleaseenzyme an einer geeigneten Schnittstelle in den Vektor integriert werden. Das gewonnene Plasmid wird für die Transformation von z. B. E. coli-Zellen verwendet. Die transformierten Zellen werden in einem geeigneten Medium kultiviert und dann geerntet und lysiert, die Plasmid-DNA wird mit Standardmethoden zurückgewonnen und wird im allgemeinen durch eine Restriktions- und/oder Sequenzanalyse analysiert. Nach der jeweiligen Manipulation kann die Plasmid-DNA abgespalten werden, und die gewonnenen DNA-Fragmente können mit anderen DNA-Sequenzen verbunden werden. Für das Einschleusen einer DNA in eine Pflanzenwirtszelle steht ein großer Bereich von Transformationsmethoden und -verfahren zur Verfügung, z. B. die T-DNA- Transformation unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes, die Fusion von Protoplasten, die Injektion von DNA, die Elektroporation von DNA und das Einschleusen von DNA mittels Membranpermeation (PEG) oder mit Hilfe des biolistischen Verfahrens und anderer. Sind ganze Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen zu regenerieren, so sollte ein selektierbares Markergen vorhanden sein. Wird das Ti- oder Ri-Plasmid z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle verwendet, so sollten zumindest die rechte Grenze, vorzugsweise die rechte und die linke Grenze der T-DNA des Ti- und des Ri-Plasmids, als flankierende Region mit dem in die Pflanzenzelle einzuschleusenden Polynucleotid verbunden werden.

Werden Agrobakterien für die Transformation verwendet, so sollte die einzuschleusende DNA entweder in einen Zwischenvektor oder einen binären Vektor kloniert werden. Aufgrund der Sequenzhomologien mit den T-DNA- Sequenzen können die Zwischenvektoren durch homologe Rekombination in das Ti- oder das Ri-Plasmid des Agrobakteriums integriert werden. Die genannten Zwischenvektoren enthalten auch die vir-Region, die für den Transfer der T-DNA notwendig ist. Da Zwischenvektoren in Agrobakterien nicht replizieren können, kann ein Helferplasmid den Zwischenvektor in das Agrobakterium transferieren (Konjugation). Binäre Vektoren können in E. coli und in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein selektierbares Markergen und einen Linker oder Polylinker, der durch die rechte und die linke T-DNA-Grenzregion flankiert ist. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Die für die Transformation der Agrobakterien verwendeten Plasmide enthalten außerdem ein selektierbares Markergen, z. B. das NPT II-Gen, das die Selektion der transfomierten Bakterien ermöglicht. Das Plasmid kann weitere Selektionsmarker-Gene einschließen, die z. B. eine Resistenz verleihen gegen Spectinomycin (Svab et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 87 (1990), 8526-8530; Sval et al., Plant. Mol. Biol. 14 (1990), 197-206), Streptomycin (Jones et al., Mol. Gen. Genet. 91 (1987), 86-91; Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (1990), 8526-8530; Svab et al., Plant. Mol. Biol. 14 (1990), 197-206), Phosphinothricin (De Block et al., EMBO J. 6 (1987), 2513-2518), glyphosate (Thompson et al., EMBO J. 6 (1987), 2519-2523; Thompson et al., Weed Sci. 35 (1987), 19-23 (suppl.)), oder Hygromycin (Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5 (1985), 103-108). Die Agrobakterienwirtszelle sollte eine vir-Region aufweisen, die ein Plasmid enthält. Die Vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das transformierte Agrobakterium wird ferner für die Transformation von Pflanzenzellen verwendet.

Die Verwendung der T-DNA für die Transformation der Pflanzenzellen wird in EP- A-120 516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Kapitel V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 und An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287 beschrieben. Binäre Vektoren sind im Handel erhältlich, z. B. pBIN19 (Clontech Laboraties, Inc., USA).

Für den Transfer von DNA in die Pflanzenzellen können Explantate mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes co-kultiviert werden. Aus infiziertem Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücken, Stengelsegmenten, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierten Pflanzenzellen) können ganze Pflanzen in einem geeigneten Medium regeneriert werden, das die Selektion transformierter Zellen ermöglicht (die z. B. Antibiotika oder Biozide usw. enthalten). Die gewonnenen Pflanzen werden auf das Vorhandensein eingeschleuster DNA hin geprüft. Dem Fachmann sind andere Möglichkeiten für das Einschleusen fremder DNA durch Anwendung z. B. der biolistischen Methode oder durch Protoplasten- Trarlsformation bekannt (z. B., Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H. J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, Hrsg.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel- Cambridge).

Die Transformation zweikeimblättriger Pflanzen durch Ti-Plasmid-Vektorsysteme mittels Agrobacterium tumefaciens ist eine gut eingeführte Methode. Agrobakterien können auch für die Transformation einkeimblättriger Pflanzen verwendet werden. (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282).

Alternative Methoden für die Transformation einkeimblättriger Pflanzen sind z. B. die Transformation mit Hilfe der biolistischen Methode, die Protoplastentransformation, die Elektroporation teilweise permeabilisierter Zellen, das Einschleusen von DNA mit Hilfe von Glasfasern. Verschiedene Quellen nehmen auf die Transformation von Mais Bezug (WO 95/06128-A1, EP-A-0 513 849; EP-A-0 465 875). EP-A-292 435 beschreibt eine Methode, wie, ausgehend von schleimfreiem, krümeligem, körnigem Maiskallus fruchtbare Pflanzen gewonnen werden können. Shillito et al. (BiolTechnology 7 (1989), 581) gingen von Kallus-Suspensionskulturen aus, die teilungsfähige Protoplasten produzieren, die zu ganzen Pflanzen regenerieren können.

Für die Transformation von Weizen können verschiedene Methoden angewendet werden, z. B. der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer (Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282; Hiei et al., Plant Mol. Biol. 35 (1997), 205-218; Park et al., J. Plant Biol. 38 (1995), 365-371), die Transformation von Protoplasten (Daten in "Gene transfer to plants", I. Potrykus, G. Spangenberg lEds.), Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1995, Seiten 66-75; Datta et al., Plant Mol. Biol. 20 (1992), 619-629; Sadasivam et al., Plant Cell Rep. (1994), 394-396) die biolistische Methode (Li et al., Plant Cell Rep. 12 (1993), 250-255; Cao et al., Plant Cell Rep. 11 (1992), 586-­ 591; Christou, Plant Mol. Biol. 81997), 197-203) und die Elektroporation (Xu et al., in "Gene transfer to plants", I. Potrykus, G. Spangenberg (Bds.), Springer-Verlag Berlin Heidelberg (1995), 201-208).

Nachdem die eingeschleuste DNA in das Genom der Pflanzenzeile integriert ist, ist sie gewöhnlich stabil integriert und verbleibt im Genom der Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle. Gewöhnlich enthält die transformierte Zelle ein selektierbares Markergen, das die Selektion von Transformanden in Gegenwart bestimmter Zucker, Aminosäuren, Biozide oder Antibiotika, z. B. Kanamycin, G 428, Bleomycin, Hygromycin bzw. Phosphinothricin, ermöglicht. Daher gestattet ein individuelles Markergen die Selektion der transformierten Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeschleuste DNA fehlt.

Nach der Selektion werden die transformierten Zellen unter normalen Bedingungen kultiviert und wachsen zu einer ganzen Pflanze (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die erhaltenen Pflanzen können mit Pflanzen gekreuzt werden, die das gleiche transformierte genetische Erbgut oder ein anderes genetisches Erbgut aufweisen. Die erhaltenen Pflanzen oder Hybride haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Es sollten zwei oder mehr Generationen gezüchtet werden, um sicherzustellen, daß die phänotypischen Merkmale stabil und übertragbar sind.

Überdies sollten Samen geerntet werden, um zu sichern, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenschaften erhalten bleiben.

Die modifizierte Stärke, die aus erfindungsgemäßen Pflanzenzellen, den Pflanzen oder dem Verfahren gemäß dieser Erfindung erhältlich ist, ist für zahlreiche Anwendungen in der Industrie geeignet. Grundsätzlich kann Stärke in zwei Hauptbereiche unterteilt werden. Ein Bereich umfaßt die Hydrolyseprodukte der Stärke und die sogenannten nativen Stärken. Die Hydrolyse umfaßt im wesentlichen Glucose- und Glucankomponenten, die mit enzymatischen oder chemischen Verfahren gewonnen werden. Sie können für weitere Verfahren wie Fermentierung und chemische Modifikationen verwendet werden. In diesem Zusammenhang könnte von Bedeutung sein, daß das Hydrolyseverfahren einfach und kostengünstig ausführbar ist. Es wird derzeit im wesentlichen enzymatisch bei Anwendung von Amyloglucosidase durchgeführt. Es wäre denkbar, daß die Kosten bei Verwendung geringerer Enzymmengen für die Hydrolyse aufgrund von Veränderungen in der Stärkestruktur, z. B. Vergrößerung der Kornoberfläche, bessere Verdaulichkeit aufgrund einer weniger verzweigten oder sterischen Struktur, die die Zugänglichkeit für die verwendeten Enzyme einschränkt, gesenkt werden könnten.

Die Verwendung sogenannter nativer Stärke, die aufgrund ihrer Polymerstruktur verwendet wird, kann in folgende Bereiche unterteilt werden:

(a) Verwendung für die Herstellung von Lebensmitteln

Stärke ist ein klassischer Zusatzstoff für verschiedene Lebensmittel, wobei sie im wesentlichen dem Zweck dient, wäßrige Zusatzstoffe zu binden und/oder zu einer erhöhten Viskosität oder einer verstärkten Gelbildung führt. Wichtige charakteristische Eigenschaften sind das Fließ- und Sorptionsverhalten, die Quell- und Verkleisterungsstemperatur, die Viskosität und Eindickungsfähigkeit, die Löslichkeit der Stärke, die Transparenz und die Kleisterstruktur, die Hitzebeständigkeit, Scher- und Säurestabilität, die Neigung zur Retrogradation, die Filmbildungsfähigkeit, die Gefrier-/Taustabilität, die Verdaulichkeit sowie die Komplexbildungsfähigkeit, z. B. mit anorganischen oder organischen Ionen. Die Stärke gemäß dieser Erfindung, insbesondere die aus Reis gewonnene, kann z. B. für die Herstellung von Nudeln verwendet werden, die als chinesische oder asiatische Nudeln bezeichnet werden. Überdies kann die Stärke gemäß der Erfindung als Fettersatzstoff verwendet werden.

(b) Verwendung für die Herstellung von Nicht-Nahrungsmittel-Produkten

Der andere wichtige Anwendungsbereich ist die Verwendung von Stärke als Hilfsstoff bei verschiedenen Produktionsverfahren oder als Zusatzstoff zu technischen Produkten. Die wichtigsten Anwendungsbereiche für Stärke als Zusatzstoff sind in erster Linie die Papier- und Pappeherstellung. In diesem Bereich wird Stärke hauptsächlich für die Retention (Zurückhalten von Feststoffen), für das Abbinden von Füllstoff- und Feinstoff-Partikel, als Verfestigungsmittel und für die Entwässerung verwendet. Außerdem werden die vorteilhaften Eigenschaften der Stärke in bezug auf Steifigkeit, Härte, Haltbarkeit, Griffigkeit, Glanz, Glätte, Reißfestigkeit sowie die Oberflächen genutzt.

Beim Papierherstellungsprozeß kann zwischen vier Anwendungsbereichen unterschieden werden, nämlich Oberfläche, Beschichtung, Masse und Sprühen. Die Anforderungen an die Stärke in bezug auf die Oberflächenbehandlung sind im wesentlichen ein hoher Helligkeitsgrad, eine entsprechende Viskosität, eine hohe Viskositätsstabilität, eine gute Filmbildung sowie eine geringe Staubbildung. Wenn sie als Überzug verwendet wird, spielen der Feststoffgehalt, eine entsprechende Viskosität, eine hohe Bindefähigkeit sowie eine hohe Pigmentaffinität eine wichtige Rolle. Als Zusatzstoff zur Masse sind die schnelle, gleichmäßige, verlustfreie Verteilung, die hohe mechanische Festigkeit und die vollständige Retention im Papierzellstoff von Bedeutung. Wird Stärke für das Sprühen verwendet, so sind ein entsprechender Feststoffgehalt, eine hohe Viskosität sowie eine hohe Bindefähigkeit auch wichtig. Ein bedeutender Anwendungsbereich ist z. B. in der Klebstoffindustrie, wo der Anwendungsbereich in vier Bereiche unterteilt wird: die Verwendung als reiner Stärkeleim, die Verwendung für Stärkeleime, die mit Spezialchemikalien hergestellt werden, die Verwendung der Stärke als Zusatz zu synthetischen Harzen und Polymerdispersionen sowie die Verwendung von Stärken als Streckmittel für synthetische Klebstoffe. 90% aller Klebstoffe auf Stärkebasis werden für die Herstellung von Wellpappe, Papiertüten und -säcken, Verbundwerkstoffen für Papier und Aluminium, Kartons und Befeuchtungskleber für Briefumschäge, Briefmarken usw. verwendet.

Eine weitere mögliche Anwendung als Zusatzstoff und Hilfsstoff ist in der Herstellung von Textilpflegemitteln. In der Textilindustrie können folgende vier Anwendungsbereiche unterschieden werden: Verwendung von Stärke als Schlichte, d. h. als Hilfsstoff für das Glätten und die Verstärkung des Klettverhalten zum Schutz gegen Zugkräfte, die beim Weben auftreten sowie für die Erhöhung der Verschleißbeständigkeit beim Weben, als Mittel für die Textilausrüstung, hauptsächlich nach qualitätsverschlechternden Vorbehandlungen wie Bleichfärben usw., als Verdickungsmittel bei der Herstellung von Färbepasten zur Verhinderung einer Farbstoffdiffusion und als Zusatz zu Schärmitteln für Nähgarne.

Darüber hinaus kann Stärke auch als Zusatzstoff zu Baumaterialien verwendet werden. Ein Beispiel ist die Herstellung von Gipskartonplatten, wobei die Stärke, die mit dünnem Gips vermischt wurde, mit Wasser eine Paste bildet, an die Oberfläche der Gipsplatte diffundiert und somit die Pappe mit der Platte verbindet. Andere Anwendungsbereiche sind das Beimischen zu Gips und Mineralfasern. Im Fertigbeton kann Stärke für die Verzögerung des Abbindeprozesses verwendet werden.

Überdies ist die Stärke für die Herstellung von Bodenstabilisierungsmitteln von Vorteil, die für den zeitweiligen Schutz der Bodenpartikel gegen Wasser bei künstlicher Erdbewegungen verwendet werden. Nach dem derzeitigen Stand der Technik können Verbundstoffe, die sich aus Stärke und Polymeremulsionen zusammensetzen, als genauso Erosions- und Verkrustungsvermindernd wie die bisher verwendeten Produkte betrachtet werden, sie sind jedoch weitaus billiger.

Ein weiterer Anwendungsbereich ist die Verwendung von Stärke in Pflanzenschutzmitteln für die Modifikation der spezifischen Eigenschaften dieser Mittel. Stärken werden z. B. verwendet für die Verbesserung der Benetzungseigenschaften von Pflanzenschutzmitteln und Düngemitteln, für die dosierte Freisetzung von Wirkstoffen, für die Umsetzung flüssiger, flüchtiger und/oder geruchsentwickelnder Wirkstoffe in mikrokristalline, stabile, formbare Substanzen, für das Mischen inkompatibler Zusammensetzungen und für die Verlängerung der Wirkung aufgrund reduzierter Zersetzung.

Stärke kann auch in den Bereichen der Arzneimittel, Medizin und in der Kosmetikindustrie verwendet werden. In der pharmazeutischen Industrie kann die Stärke als Bindemittel für Tabletten und für die Verdünnung des Bindemittels in Kapseln verwendet werden. Außerdem ist Stärke als Sprengmittel für Tabletten geeignet, da sie beim Schlucken die Flüssigkeit absorbiert und nach kurzer Zeit so stark quillt, daß der Wirkstoff freigesetzt wird. Aus qualitativen Gründen wird sie auch in Gleit- und Wundpudern eingesetzt. Im Bereich der Kosmetik kann Stärke z. B. als Träger für Puderzusatzstoffe wie Duftstoffe und Salicylsäure verwendet werden. Ein relativ breiter Anwendungsbereich für Stärke ist Zahnpasta.

Die Verwendung von Stärke als Zusatzstoff für Kohle und Briketts ist auch denkbar. Durch den Zusatz von Stärke kann die Kohle quantitativ agglomeriert und/oder in hoher Qualität brikettiert werden, um so einen vorzeitigen Zerfall der Briketts zu verhindern. Grillkohle enthält zwischen 4 und 6% zugesetzte Stärke, und kalorierte Kohle zwischen 0,1 und 0,5%. Außerdem ist Stärke als Bindemittel geeignet, da sie, wenn sie Kohle und Briketts zugesetzt wird, die Emission toxischer Substanzen beträchtlich vermindern kann. Ferner kann Stärke als Flockungsmittel in der Verarbeitung von Erz- und Kohleschlämmen verwendet werden.

Ein weiterer Anwendungsbereich ist die Verwendung als Verarbeitungszusatz zu Hilfsstoffen beim Gießen. Für verschiedene Gießverfahren werden Kerne benötigt, die aus mit Bindemittel vermischtem Sand hergestellt werden. Heutzutage ist das am meisten verwendete Bindemittel Bentonit, vermischt mit modifizierten Stärken, meistens quellenden Stärken.

Der Zweck des Stärkezusatzes ist ein erhöhter Strömungswiderstand sowie eine bessere Bindefähigkeit. Überdies können quellende Stärken weitere Voraussetzungen für den Produktionsprozeß erfüllen, wie Dispergierbarkeit in kaltem Wasser, Rehydratisierbarkeit, gute Mischfähigkeit mit Sand und ein hohes Wasserbindevermögen.

In der Kautschukindustrie kann Stärke für die Verbesserung der technischen und optischen Qualität verwendet werden. Gründe dafür sind ein besserer Oberflächenglanz, bessere Griffigkeit und Aussehen. Dazu wird die Stärke auf klebenden gummierten Flächen von Kautschuksubstanzen vor der Kaltvulkanisierung dispergiert. Sie kann auch zur Verbesserung der Bedruckbarkeit von Gummi verwendet werden.

Ein weiterer Anwendungsbereich für modifizierte Stärke ist die Herstellung von Lederersatzstoffen.

Im Kunststoffmarkt entstehen folgende Anwendungsbereiche: Integration von aus Stärke gewonnenen Produkten in den Verarbeitungsprozeß (Stärke ist nur ein Füllstoff, es besteht keine direkte Bindung zwischen dem synthetischen Polymer und der Stärke) oder alternativ die Integration von aus Stärke gewonnenen Produkten in die Polymerproduktion (Stärke und Polymer bilden eine stabile Bindung).

Die Verwendung von Stärke als reinem Füllstoff kann nicht mitanderen Substanzen wie Talk konkurrieren. Anders ist es, wenn die spezifischen Stärkeeigenschaften wirksam werden und somit das Eigenschaftsprofil der Endprodukte dadurch eindeutig verändert wird. Ein Beispiel ist die Verwendung von Stärkeprodukten in der Verarbeitung von Thermoplasten wie Polyethylen. Dabei verbinden sich Stärke und synthetisches Polymer in einem Verhältnis von 1 : 1 mittels Coexpression, um ein Masterbatch zu bilden, aus dem unter Verwendung von granuliertem Polyethylen verschiedene Produkte mit den üblichen Methoden gewonnen werden. Die Integration von Stärke in Polyethylenfilme kann zu einer erhöhten Substanzdurchlässigkeit in Hohlkörpern, zu einer besseren Wasserdampfdurchlässigkeit, zu einem besseren antistatischen Verhalten, zu einem besseren Antihaftverhalten sowie einer besseren Bedruckbarkeit mit Farbstoffen auf Wasserbasis führen.

Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von Stärke in Polyurethanschäumen. Aufgrund der Anpassung der Stärkederivate sowie der Optimierung der Verarbeitungsverfahren ist es möglich, die Reaktion zwischen synthetischen Polymeren und den Hydroxygruppen der Stärken zu steuern. Das Ergebnis sind Polyurethanfilme, die aufgrund der Verwendung von Stärke folgende Eigenschaftsprofile aufweisen: einen verminderten Wärmeausdehnungskoeffizienten, ein vermindertes Schrumpfverhalten, ein besseres Druck-/Spannungsverhaiten, eine erhöhte Wasserdampfdurchlässigkeit ohne eine Veränderung der Wasseraufnahme, eine verminderte Entflammbarkeit und Rißbildungsdichte, kein Abtropfen brennbarer Teile, Halogenfreiheit und ein vermindertes Altern. Die jetzt noch vorhandenen Mängel sind eine verminderte Druck- und Schlagfestigkeit.

Die Entwicklung von Folienprodukten ist nicht nur die einzige Möglichkeit. Auch feste Kunststoffprodukte wie Töpfe, Platten und Schüsseln können mit Hilfe eines Stärkegehaltes von mehr als 50% hergestellt werden. Des weiteren bieten Stärke-/­ Polymergemische den Vorteil, daß sie weitaus leichter biologisch abbaubar sind.

Außerdem haben Stärkepfropfpolymere aufgrund ihrer extremen Wasserbindefähigkeit höchste Bedeutung gewonnen. Hier handelt es sich um Produkte, die ein Stärkerückgrat und ein nach dem Prinzip des Radikalkettenmechanismus aufgepfropftes Seitengitter aus einem synthetischen Monomer aufweisen. Die heutzutage erhältlichen Stärkepfropfpolymere sind durch eine verbesserte Binde-und Rückhaltefähigkeit von bis zu 1000 g Wasser pro g Stärke bei hoher Viskosität gekennzeichnet. Diese Superabsorber werden hauptsächlich im Hygienebereich verwendet, z. B. in Produkten wie Windeln und Bettlaken, sowie im landwirtschaftlichen Bereich, z. B. in Saatgutpellets.

Das Plasmid pTaR1-11, das in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, wurde in Übereinstimmung mit den Erfordernissen des Budapester Vertrages am 20. Mai 1999 in der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, unter der Zugangsnummer DSM Nr. 12810 hinterlegt.

Die folgenden Beispiele sollen nur die Erfindung erläutern und schränken die Erfindung in keiner Weise ein.

Beispiel 1 Herstellung einer für R1-Protein codierenden cDNA aus Triticum aestivum L., cv Florida

Für den Nachweis und die Isolation einer aus Weizen gewonnenen für R1-Protein codierenden cDNA wurde eine Weizen-cDNA-Bibliothek aus Poly-(A)⁺RNA von 21 Tage alten Karyopsen ("Stärke"-Endosperm) von Weizenpflanzen unter Verwendung des Lambda-zap II-Vektors (Lambda ZAP II-cDNA Synthesis Kit, Stratagene GmbH, Heidelberg, Deutschland) nach dem Herstellerprotokoll erstellt. Der Primärtiter der cDNA-Bibliothek betrug etwa 1,26 × 10⁶ pfu/ml.

Das Durchmustern der cDNA-Bibliothek erfolgte unter Verwendung der Oligonucleotide R1A und R1B als Primer für die PCR (Polymerasekettenreaktion)- Amplifikation eines DNA-Inserts des Plasmids pBinAR Hyg (DSM 9505), das eine für das R1-Protein codierende cNDA enthält, die aus Mais gewonnen wurde. Das genannte Plasmid kann z. B. gemäß Beispiel 14 von WO 98/27212 gewonnen werden. Daher ist der Offenbarungsgehalt der WO 98/27212-A1 durch Zitat ausdrücklich hier aufgenommen.

Nach Xba I/Asp 718-Restriktionsendonuclease-Verdau des Vektors pBluescript wurde ein cDNA-Fragment mittels Agarosegelelektrophorese und nach Standardprotokollen aufgereinigt.

Als Matrize für die PCR-Amplifikation des genannten Mais-cDNA-Fragments wurden etwa 10 pg des oben genannten, isolierten Mais-cDNA-Fragments verwendet.

Der PCR-Puffer enthielt 1,5mM MgCl₂, 20mM Tris-HCL (pH 8,4), 50mM KCl, 0,8mM dNTP Mix, 1µM Primer R1A, 1µM Primer R1B und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase.
R1A: 5' TATTGGAAGCTCGAGTTGAAC 3' (Seq. ID Nr. 3)
R1B: 5' TTGAGCTGTCTAATAGATGCA 3' (Seq. ID Nr. 4)

Die PCR-Zyklen wurden in einem Trioblock® PCR-Thermocycler (Biometra, Deutschland) nach folgendem Protokoll durchgeführt: 4' bei 95°C; 1' bei 96°C; 45'' bei 62°C; 1' 15'' bei 72°C; 30 Zyklen und 5" bei 72°C, um ein für das R1-Protein codierendes cDNA-Fragment aus Mais zu amplifizieren.

Dann wurde das gewonnene Fragment gemäß dem Herstellerprotokoll mit Zufalls- Primern Digoxygenin markiert (Boehringer Mannheim, The DIG system users Guide).

Das amplifizierte und markierte cDNA-Fragment von 1924 bp wurde weiter als heterologe Sonde für das Durchmustern der oben erstellten cDNA-Bibliothek aus Weizen verwendet.

Etwa 3,5 × 10⁵ Phagen wurden nach Standardprotokollen durchmustert.

Nach einer Vorhybridisierung in 5 × SSC, 3% Blocking (Boehringer Mannheim), 0,2% SDS, 0,1% Natriumlaurylsarcosine und 50 µg/ml Heringsperma-DNA bei 55°C wurden die Filter über Nacht mit 1 ng/ml der mit Digoxigenin markierten (Random Primed DNA-labeling Kit) R1-Proteinsonde (das 1924 bp Xbal/Asp718 cDNA- Fragment aus Mais) hybridisiert. Die Filter wurden 2 Mal 5' lang mit 2X SSC, 1% SDS bei Raumtemperatur; 2 Mal 10' lang mit 1X SSC, 0,5% SDS bei 55°C, und 2 Mal 10' lang in 0,5X SSC, 0,2% SDS bei 55°C gewaschen.

Die positiven Klone wurden erneut gescreent und gereinigt. Die Plasmide (pBluescript SK Phagemid) wurden durch eine In-vivo-Excision gemäß dem Herstellerprotokoll (Stratagene, Heidelberg) isoliert. Nach Charakterisierung der Klone durch eine Restriktionsanalyse wurden die längsten cDNA-Inserts weiter analysiert.

Beispiel 2 Sequenzanalyse des cDNA-Inserts von pTaR1-11

Die Nucleotidsequenz des isolierten cDNA-Inserts des Klons pTaR1-11 wurde nach der Dideoxynucleotid-Methode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) analysiert.

Der Klon TaR1-11 enthält ein 672bp-Insert, das eine Teil-cDNA gemäß Seq. ID Nr. 1 darstellt, die für das aus Weizen gewonnene R1-Protein gemäß Seq. ID Nr. 2 codiert.

Seq. ID Nr. 1:

Die zum Polynucleotid Seq ID Nr. 1 entsprechende Aminosäuresequenz wird in Seq. ID Nr. 2 angegeben:

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (22)

1. Nukleinsäuremolekül, das für ein R1-Protein codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

• a) einem für ein R1-Protein codierenden Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid gemäß Seq. ID Nr. 2 enthält, oder einem Teil oder einem Derivat davon;
• b) einem Nukleinsäuremolekül, das die Seq. ID Nr. 1 enthält, oder einem Teil oder einem Derivat davon;
• c) einem Nukleinsäuremolekül, das die codierende Region des cDNA-Inserts des Plasmids pla R1-11 gemäß DSM Nr. 12810 umfaßt, oder einem Teil oder einem Derivat davon;
• d) einem für ein Polypeptid codierendes Nukleinsäuremolekül, umfassend das Polypeptid, das auf dem cDNA-Insert des Plasmids pTa R1-11 gemäß DSM Nr. 12810 codiert ist, oder einem Teil oder Derivat davon.

2. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, das ein oder mehrere regulatorische Elemente enthält, die die Transkription und/oder Translation in einer Zelle sicherstellen.

3. Nukleinsäuremolekül gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 2, das ein DNA-Molekül ist.

4. Nukleinsäuremolekül gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 2, das ein RNA-Molekül ist.

5. Vektor, der ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 enthält.

6. Vektor gemäß Anspruch 5, der ein oder mehrere regulatorische Elemente enthält, die die Transkription und/oder Translation in eine Bakterien- und/oder Pflanzenzelle sichern.

7. Transgene Wirtszelle, die ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 und/oder einen Vektor gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 6 enthält.

8. Wirtszelle gemäß Anspruch 7, die eine Pflanzenzelle ist.

9. Verfahren für die Herstellung einer transgenen Zelle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 8, das den Schritt des Einschleusens eines Nukleinsäuremoleküls gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 und/oder eines Vektors gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 6 in das Genom einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle einschließt.

10. Das Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die genannte Zelle eine Pflanzenzelle ist.

11. Transgene Pflanze, die die Wirtszelle gemäß Anspruch 8 enthält.

12. Verfahren für die Herstellung einer Pflanze gemäß Anspruch 11, das die Schritte des Einschleusens eines Nukleinsäuremoleküls gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 und/oder eines Vektors gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 6 in eine Pflanzenzelle und der Regeneration einer ganzen Pflanze aus der Pflanzenzelle einschließt.

13. Vermehrungsmaterial aus der Pflanze gemäß Anspruch 11.

14. Samen aus der transgenen Pflanze gemäß Anspruch 11.

15. Verfahren für die Herstellung einer Stärke, die den Schritt der Integration einer Pflanzenzelle gemäß Anspruch 8, einer Pflanze gemäß Anspruch 11, von Vermehrungsmaterial gemäß Anspruch 13 und/oder Samen gemäß Anspruch 14 in ein Verfahren für die Stärkeproduktion einschließt.

16. Stärke, erhältlich aus einer Pflanzenzelle gemäß Anspruch 8, einer Pflanze gemäß Anspruch 11, Vermehrungsmaterial gemäß Anspruch 13 und/oder Samen gemäß Anspruch 14 oder nach dem Verfahren gemäß Anspruch 15.

17. Verfahren für die Herstellung einer modifizierten Stärke, die den Schritt der Integration einer Stärke gemäß Anspruch 16 in ein Verfahren zur chemischen und/oder physikalischen Stärkemodifikation einschließt.

18. Verfahren für die Herstellung eines R1-Polypeptids gemäß Seq. ID Nr. 2 oder von Derivaten oder Teilen davon, das die Schritte der Kultivierung der Wirtszelle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 8 unter Bedingungen, die die Expression des Proteins ermöglicht, und die Isolierung des genannten R1-Polypeptids aus den genannten Zellen und/oder dem Kulturmedium umfaßt.

19. R1-Polypeptid, das von einem Nukleinsäuremolekül gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 oder einem Derivat oder einem Teil davon codiert wird.

20. Verwendung eines R1-Polypeptids gemäß Anspruch 19 für die Herstellung eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers.

21. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Derivates oder Teils davon gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 für das Durchmustern von Nukleinsäurebibliotheken und/oder als Sonde für die Hybridisierung, wobei das genannte Nukleinsäuremolekül oder Derivat oder Teil davon gegebenenfalls markiert werden.

22. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls oder Derivats oder Teils davon gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 für die Herstellung einer transgenen Zelle oder einer transgenen Pflanze.