DE1642699C3

DE1642699C3 - Verfahren zur Herstellung von Mykophenolsäure

Info

Publication number: DE1642699C3
Application number: DE1967J0034534
Authority: DE
Inventors: Antony Borrow; Edward Garstang Jefferys; Stuart Dennett Mills; William Brian Turner
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1966-09-27
Filing date: 1967-09-08
Publication date: 1978-08-17
Also published as: CH494755A; BE704325A; NL6712598A; DK118762B; DE1642699B2; DE1642699A1; FR1552921A

Description

Mykophenolsäure besitzt die Formel

ΓΗ ^OH

Y"3 !

HO₂C ■ CH₂ ■ CH₂ · C=CH · CH₂ —f\- CO_x

I ο

CH₃OA/-CH/

CH₃

In der GB-PS 11 57 100 wird berichtet, daß diese Säure und deren Salze und Ester mitotische Unterdrükker sind und Antitumoraktivität sowie immunosuppressive Aktivität aufweisen.

In der Literatur ist die Herstellung dieser Säure sowohl durch Oberflächenkultivierung als auch durch submerse aerobe Kultivierung von Mykophenolsäure erzeugenden Penicilliumarten, wie z. B. Penicillium brevicompactum, beschrieben. Ganz allgemein sind einem Fachmann geeignete Mikroorganismen, die Zusammensetzung geeigneter Nährböden, die Kultivierungsbedingungen, das Verfahren zur Isolierung der Mykophenolsäure aus dem Medium und Methoden zur Überführung derselben in pharmazeutisch brauchbare Salze geläufig. Das bisher verwendete Verfahren zur Herstellung von Mykophenolsäure durch submerse aerobe Kultivierung war sehr schlecht und ergab nur eine Ausbeute von etwa 9 mg Säure/l Kiilturfiltrat.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Mykophenolsäure zu schaffen, das höhere Ausbeuten ermöglich!.

Es wurde nunmehr die überraschende Feststellung gemacht, daß bei einer submersen aeroben Kultivierung erhöhte Ausbeuten an Mykophenolsäure erhalten werden können, wenn man dafür sorgt, daß die Nährlösung während des gesmaten Kultivierungsverfahrens eine bestimmte Menge assimilierbares Magnesium enthält.

Demgemäß wird die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Mykophenolsäure durch aerobe submerse Kultivierung eines Mykophenolsäure erzeugenden Penicillium-Vertreters, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Nährmedium verwendet, das zu Beginn der Fermentation Quellen von C, N, P, S und K und geringfügige Mengen von Spurenelementen sowie zusätzlich pro Liter des Nährmediums eine Magnesiumquelle in einer Konzentration von 10 bis 100 mg Magnesium enthält, und daß im Nähmedium während im wesentlichen des ganzen Verfahrens eine Magnesiumqueile vorhanden ist.

Geeignete aktive Penicillium-Arten sind:

Penicillium brevicompactum, D i e r c k χ (beispielsweise Stämme, die in The Commonwealth Mycological Institute, Kew, England unter der Bezeichnung I.M.I. 40225, 92034, 92044, 92262, 92274 und 94149 niedergelegt sind),

Penicillium stoloniferum. Thorn (beispielsweise I.M.I. 39824, 91960, 92219 und 126540, wobei der letztere Stamm der Stamm I.C.I. Nr. ACC 438 ist) und

Penicillium viridicatum, W e s 11 i η g (beispielsweise I.M.I 49096).

Die Kultivierung wird üblicherweise bei einer Temperatur im Bereich von 18 bis 38° C und vorzugsweise im Bereich von 20 bis 27° C ausgeführt.

Beispiele für eine geeignete Magnesiumquelle sind nichtgiftige lösliche Derivate oder Salze des Magnesiums, wie z. B. Magnesiumsulfat und die magnesiumhaltigen Verbindungen, die in Maisauszugsflüssigkeiten und ähnlichen Materialien enthalten sind. Es ist darauf hinzuweisen, daß das Verfangen der Mikroorganismen nach Magnesium der Konzentration der Zellen proportional ist, die wiederum der Menge der im Nährboden vorhandenen assimilierbaren Stickstoffquelle proportional ist. Je nach den Bedingungen werden 0,00175 bis 0,00288 mg Magnesium benötigt, damit 1 mg Zellen (Trockengewicht) gebildet werden können, die Mykophenolsäure erzeugen. Wenn die Stickstoffquelle gerade aufgebraucht werden ist, dann führen 0,09 bis 0,26 mg assimilierbare Stickstoffquelle je nach den Bedingungen zur Bildung von 1 mg Zellen (Trockengewicht).

Außer der Magnesiumquelle enthält das Kulturmedium zumindest am Anfang des Verfahrens Quellen für wesentliche Elemente, d. h. Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor, Schwefel und Kalium.

Auch enthält das Kulturmedium gewöhnlich geringfügige Mengen von sogenannten Spurenelementen, wie z. B. Eisen, Mangan, Zink, Molybdän und Kupfer. Die Kohlenstoffquelle kann aus einem Zucker, wie z. B. Saccharose oder Glucose, einem mehrwertigen Alkohol, wie z. B. Glycerin oder einem Ester davon, einem Polysaccharid, wie z. B." Stärke oder einem pflanzlichen öl bestehen. Die Stickstoffquelle kann eine anorganische oder eine organ'sche Quelle sein. Beispiele für anorganische Stickstoffquellen sind Ammoniumsalze oder Nitrate, wie z. B. Ammoniumnitrat, Ammoniumtar-

trat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Natriumnitrat, Kaliumnitrat und Calciumnitrat Beispiele für organische Stickstoffquellen sind Aminosäuren, wie z, B. Glycin, ein Samenmehl, wie z, B. Baumwollsamenmehl, Maisauszugsflüssigkeit, Pepton, Harnstoff, Hefeextrakte und Fleischextrakte. Die Quellen für Phosphor, Schwefel und Kalium können beispielsweise aus Kalium-dihydrogen-phosphat, einem Sulfat bzw. Kaliumchlorid bestehen.

Bei einer Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren in einem sogenannten unausgewogenen Kulturmedium durchgeführt, d.h., daß die Menge der verschiedenen Nährstoffe im Kulturmedium derart gewählt wird, daß bei einem Zwischenstadium des Verfahrens eine Quelle von einem lebenswichtigen Element (mit Ausnahme von Magnesium), z. B. die Stickstoff- oder Kohlenstoffquelle, verbraucht ist, während die Quellen der anderen lebenswichtigen Elemente noch vorhanden sind. Bei einem solchen Verfahren wird vorzugsweise die Stickstoffquelle zuerst verbraucht Dabei kann man so vorgehen, daß das Kulturmedium zu Beginn des Verfahrens i bis 300 g Kohlenstoffquelle (z.B. 100g Glucose) pro Liter Kulturmedium und 0,01 bis 10 g, z. B. 0,65 g. Stickstoffquelle (als Gewicht des elementaren Stickstoffs ausgedrückt) pro Liter Kulturmedium enthält Wenn das erfindungsgemäße Verfahren in einen> unausgewogenen Kulturmedium ausgeführt wird, bei dem die Stickstoffquelle zuerst verbraucht wird, dann erhält man erfahrungsgemäß bessere Ausbeuten an Mykophenolsäure gegenüber der Verwendung eines ausgewogenen Kulturmediums (d. h. i-ines Kulturmediums, bei dem die Nährstoffe jeweils zu annähernd derselben Zeit verbraucht sind). Bei der Anwendung eines unausgewogenen Kulturmediums kann man auch so vorgehen, daß die Stickstoffquelle verbraucht ist, während immer noch etwas Kohlenstoffquelle und natürlich auch Magnesiumquelle im Kulturmedium vorhanden sind, worauf die verfügbare Kohlenstoffquelle aufrechterhalten oder erhöht wird, indem weitere Mengen der Kohlenstoffquelle zugegeben werden.

Nach beendeter Kultivierung kann die Mykophenolsäure aus dem Kulturmedium in an sich bekannter Weise abgetrennt werden. Man kann hierzu das verbesserte Verfahren gemäß GB-PS 11 58 387 verwenden. Hierbei wird zunächst der pH-Wert der Kulturbrühe vor dem Filtrieren auf 10 bis 11 eingestellt, worauf dann das Filtrat und die Waschflüssigkeiten bei einem alkalischen oder sauren pH-Wert mit einem geeigneten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch extrahiert werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Es- wurde ein Kulturmedium zubereitet, das die folgenden Bestandteile pro Liter enthielt:

ZnSO₄
MnSO₄ · 4 H₃O

Glucose

NH₄NO₃

KH₂PO₄

MgSO₄ · 7 H₂O

Spurenelementkonzentrat

Destilliertes Wasser auf

100g
3,72 g
5g

Ig
2 ml
1 ml

Die Zusammensetzung des Spurenelementkonzcntrats war wie folgt:

Destilliertes Wasser auf

I₁Og
0,1g
0,1g
11

Einige Tropfen konzentrierter Salzsäure wurden zur Erzielung einer klaren Lösung hinzugegeben.

Es wurden 51 Kulturmedium mit Sporen des Organismus Penicillium stoloniferum (I.C.I.-Stamm Nr.

κι ACC 438, d.h. l.M.I.-Stamm 126540) in einem Gefäß geimpft, das bei einer Rührdrehzahl von 712 U/min und einem Luftstrom von einem halben Volumen/Volumen/ Minute auf 25° C gehalten wurde. Nach 93 st wurden 65 ml einer 80%igen (G/V) Glucoselösung zugegeben.

Nach 215 st wurde das Mycel von der Kulturbrühe abfilu iert 1 1 Filtrat wurde mit konzentrierter Salzsäure auf pH 2 eingestellt und mit Äthylacetat extrahiert Die erste Extraktion erfolgte mit 200 ml Lösungsmittel und die zweite und dritte Extraktion jeweils mit 100 ml

:» Lösungsmittel. Die vereinigten Äthylacetatextrakte wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, worauf dann das Natriumsulfat durch Filtration entfernt wurde. Die Äthylacetatlösung wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei 2,5 g eines blaßbraunen

:". Feststoffs erhalten wurden, der in 100 ml Äthylacetat aufgelöst wurde. Der Lösung wurden dann 5 g Aktivkohle zugesetzt. Das Gemisch wurde ! 0 min auf Rückfluß gehalten, und die Aktivkohle wurde dann durch Filtration entfernt Jetzt wurden 5CC ml verdünnte

in Salzsäure (4%ige [V/V] Lösung von konzentrierter Salzsäure in Wasser) langsam zugegeben, worauf die Mischung stehengelassen wurde, bis die Auskristallisation beendet war. Das Gemisch wurde filtriert, und der kristalline Rückstand wurde zunächst mit verdünnter

j-, Salzsäure und dann mit Petroläther (Kp. 40 bis 60⁰C) gewaschen. Die Kristalle wurden dann im Vakuum getrocknet Auf diese Weise wurden 190 g Kristalle in Form von Nadeln mit einem Fp. von 139° C und mit einem Gehalt von 95,4% Mykophenolsäure (bestimmt

4(i in Methanollösung durch Absorption bei 304 μπι) erhalten.

Beispiel 2

In einem 1136 1 fassenden Gefäß wurden 654 1 eines ι". Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung eingebracht.

Glucose

NH₄NO₃

KH₂PO₄

MgSO₄ · H₂O

Hefeextrakt

Spurenelementkonzentrat

(siehe Beispiel 1)

12% G/V
0,52% G/V
0,5% G/V
0,056% G/V
0,1% G/V

0,2% V/V

FeSO.!
CuSO.,

7H₂O
5 H₂O

1.0g
0.15g

Nach Impfung mit 73 I einer wachsenden Kultur von Penicillium stoloniferum (I.C.I.-Stamm Nr. ACC 438; d. h. I.M.I.-Stamm Nr. 126540) wurde das Kulturmedium unter Rühren mit 200 U/min einer Inkubation bei 23°C unterworfen, wobei die stündliche Luftzufuhr etwa 25,5 m³ betrug. Nach 99 st hatte sich die Menge der Mykophenolsäure gemäß Fluoreszenzspektralfotometrie (siehe Beispiel 3) auf 1114 mg pro Liter erhöht. Das Ernten erfolgte wie üblich.

Vergleichsbeispiel I

Es wurden zwei Kultivierungsverstiche (auf 5-l-Basir.) unter gleichen Bedingungen mit den folgenden Kulturmedien durchgeführt.

Behälter A

Bedingungen

Luftstrom (l/min)
Temperatur CQ
Rührdrehzahl (U/min)

Kulturmedium

Glucose
NH₄NO₃
KH₂PO₄

Spurenelementkonzentrat (siehe Beispiel 1)
MgSO₄ · 7 H₂O

2,5
23
712

12% G/V 0,19% G/V 0,01% G/V 0,2% V/V

2,5 23 712

12% G/V 0,19% G/V 0,5% G/V 0,2% V/V

0,1% G/V 0,002% G/V Die Behälter wurden mit Sporen von Penicillium stoloniferum (I.CI.-Stamm Nr. ACC 438; d.h. I.M.I.Stamm Nr. 126540) geimpft, worauf in Abständen Proben entnommen wurden. Jede Probe wurde mit einer 10 n-Kaliumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 10 gebracht, gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde dann mit Zitronensäure auf einen pH-Wert von 2 gebracht und anschließend mit Benzol extrahiert Die Benzollösung wurde mit einer 0,02 n-Natriumhydroxydlösung rückextrahiert Die Konzentration der Mykophenolsäure (als Natriumsalz vorhanden) in der wäßrigen Lösung wurde fluoreszenzspelciralfotometrisch gemessen (Messung der Fluoreszenzemission bei 428 μιη mit einer Aktivierungswellenlänge von 338 μπι).

Die erhaltenen Resultate waren wie folgt:

Alter Behälter A

Trocken- Magnesium gewicht

(st) (mg/g) (m_c-nil)

Mykophenolsäure

(mg/1) Behälter B

Trockengewicht

(mg/g)

Magnesium MylOphenol-

(mg/ml)

(mg/1)

168
191

10,1
9,5

0,12 0,12

125 195 6,0

Null
Null

55 <50

Diese Ergebnisse zeigen die Vorteile der Verwendung einer Magnesiumquelle.

Obwohl das Kulturmedium unterschiedliche Gehalte an KH2PO4 enthielt, sind die Ergebnisse aussagekräftig, weil nämlich kein Anzeichen besteht, daß die Erzeugung von Mykophenolsäure durch einen Mangel an Phosphor angeregt wird. Dies wurde durch das Vergleichsbeispiel 2 bestätigt.

Vergleichsbeispiel 2

Um die wesentliche Rolle des Magnesiums zu bestätigen, wurden Versuche in Schüttelgefäßen mit dem folgenden Kulturmedium durchgeführt:

Kulturmedium

Glucose

Ammoniumtartrat
KH₂PO₄

Spurenelementkonzentrat
(siehe Beispiel 1)

10% G/V 0,427% G/V 0,5% G/V

0,2% V/V

Temperatur 25° C

Schüttlergeschwindigkeit 200 U/min

Schüttleramplitude 50,8 mm

Die Konzentration des Produkts in einer jeden Flasche wurde wie in Vergleichsbeispiel 1 gemessen, mit dem Unterschied, daß die Meßempfindlichkeit auf die niedrigeren zu erwartenden Konzentrationen angepaßt wurde. Die Ergebnisse waren wie folgt:

Zu Proben von 100 ml des Kulturmediums in 500-ml-FIaschen wurden verschiedene Mengen von Magnesium-, Kalzium , Strontium- oder Bariumsalzen, wie weiter unten angegeben, zugegeben. Nach Sterilisierung wurden jeweils drei Replikate aus einer jeden Probe mit 'Sporen von Penicillium stoloniferum (I.CI.-Stamm Nr. ACC 438; d.h. I.M.I.-Stamm Nr. 126540) geimpft, worauf die Kultivierung unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wurde:

Salzzusatz

Mykophenolsäure nach 164 st

(mg/1)

4-, Vergleichsversuche
MgSO₄ · 7 H₂O

Ca(NO,)₂ -4 H₂O
Ba(NO₁):
Si(NOj)₂-4 H₂O

(kein

Salzzusatz)

0,001%

0,010%

0,050%

0,006%

0,030%

0,002 %

0,010%

0,003 %

0,016%

42

48

211

226

28

42

21

14

Die Ergebnisse zeigen
Magnesiums.

die wesentliche Rolle des

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Mykophenolsaure durch aerobe submerse Kultivierung eines Mykophenolsäure erzeugenden Penicillium-Vertre- -. ters, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium verwendet, das zu Beginn der Fermentation Quellen von C, N, P, S und K und geringfügige Mengen von Spurenelementen sowie zusätzlich pro Liter des Nährmediunis eine Magnesi- ι ο umquelle in einer Konzentration von 10 bis 100 mg Magnesium eüthält, und daß im Nährmedium während im wesentlichen des ganzen Verfahrens eine Magnesiumqueile vorhanden ist

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- r> zeichnet, daß die Mengen der Nährmediumbestandteile im Nährmedium zu Beginn der Fermentation so gewählt werden, daß die N-Quelle bei einem Zwischenstadium des Verfahrens verbraucht ist, während die Quellen der anderen lebenswichtigen :» Elemente noch vorhanden sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium zu Beginn der Fermentation 1 bis 300 g C-Quelle pro Liter Nährmedium und 0,01 bis 10 g N-Quelle, als Gewicht r> des elementaren N ausgedrückt, pro Liter Nährmedium enthält

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die N-Quelle verbraucht wird, während immer noch etwas C-Quelle im Nährmedium m vorhanden ist, worauf die verfügbare C-Menge aufrechterhalten oder erhöht wird, indem weitere Mengen der C-Quelle dem Nährmedium zugegeben wurden.