DE1593460A1

DE1593460A1 - Verfahren zum mikrobiologischen Oxydieren von Alkylbenzolen

Info

Publication number: DE1593460A1
Application number: DE19661593460
Authority: DE
Inventors: Raymond Richard Laverne; Jamison Virginia Wray
Original assignee: Sun Oil Co
Current assignee: Sunoco Inc
Priority date: 1965-11-24
Filing date: 1966-11-11
Publication date: 1970-09-03
Also published as: FR1505650A; NL6616545A; GB1111309A; US3383289A; BE690154A

Description

15 9346 G

DA-675

KBQTMMW ,

zu der Patentanmeldung

-vU ;./-:;■ /'/.'' der Firma

SUN OIL ÜOMPAHY 1608 Walnut Street Philadelphia, Pennsylvania

betreffend

Verfahren zum mikrobiologischen Oxydieren von Alfcyl-

benzolen

Die Erfindung beaieht sich auf die Fermentlerung von methyl· substituierten Benzolkohlenwasserstoffen unter Bedingungen, die zur Bildung von einem oder von zwei Typen organischer Säuren führen« Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die mikrobiologische Oxydation von Methylbenzolen mit 7 10 Kohlenstoffatomen pro Molekül, mit Hilfe spezifisch wirkender Stämme an Mikroorganismen der Art Nooardla» Die für das erfindungsgemäSe Verfahren verwendeten Stamm· sind charakterisiert dureh Ihre Fähigkeit, aus C^ - G₁₀-Methylben- SQl®n₉ entweder ein© methylsubetituierte Muconsäure oder ein® Dihydroxybenzoesäure-oder beid® zu bilden_t wi® dies im folgenden besehrieben ist.

BAD ORIGINAL

T593460

Die mikrobiologische Oxydation aromatischer Kohlenwasserstoffe mit Hilfe verschiedener Ülypen an Mikroorganismen ist bereits mehrfach beschrieben worden,. Zahlreiche Veröffentlichungen beschäftigen sich mit dieser Materie. Davis and Raymond berichten in einem Aufsatz in *Applied Microbiology¹¹, Band 9* Nr₀ 5* September 1961» Seiten 383Hie 388 über die verschiedenen Veröffentlichungen zu diesem Verfahren. Diese Autoren beschreiben darin, sowie in der USA-Patentschrift 3 057 784 die Oxydation von Alkylbenzolen mit Hilfe bestimmter Kulturen von Nocardia. In allen Fällen scheint die Oxydation nur an der Alkylgruppe erfolgt zu sein» so daß Säureprodukte, wie Benzoesäure, Phenylessigsäure und Phenylacrylsäure in Abhängigkeit von dem jeweils verwendeten Alkylbenzol erhalten wurden* Wenn der Alkylembetituent eine ungerade Anzahl von Kohlenstoffatomen besitzt, war das hauptsächliche Oxydationaprodukt im allgemeinen Benzoesäure« während bei einer geraden Anzahl von Kohlenstoffatomen es Phenylessigsäure war. Die berichteten Brgebnisee gaben keinen Anlaß, daß irgend welche Stämme von Nocardia eine direkte Hydroxylierung dee Benzolringes bewirken könnten.

Ein neuerer Überblick über mikrobiologische Oxydationen ' von Kohlenwasserstoffen einschließlich Alkylbenzolen findet sich in dem Lehrbuch "Advances in Encymology", Band 27» Seiten 469 - 546 (Interseience Publishers, 1965)» Auf Seite

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BAD OFHGSNAL

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496 der Übersicht weisen die Autoren darauf hin, daß bei der mikrobiologischen Oxydation von Alkylbenzolen im allgemeinen die meisten, wenn nicht alle Mikroorganismen den Phenylring nicht angreifen, sondern vielmehr einen Alkyleubetituenten. In einem ifell wird berichtet, daß Toluol in Katechol (1,2-Dihydroxybenzol) durch Paeudomonas aeruglnosa tiberfuhrt worden 1st, doch schloß der Herstellungsweg die anfängliche Oxydation der Methylgruppe unter Bildung von Benzoesäure ein, worauf die Decarboxylierung des Oärboxylrestes und eine 1,2-DiTiydroxylierung erfolgte. Es wird von keinem fall berichtet, bei dem die Dihydroxylierung des Phenylringes eines Alkylbenzole ohne vorherige Bildung des Carboxylrestes aus den Alkylsubstituenten mit dessen anschließender Decarboxylierung stattfand· Nur im Falle von Benzol selbst wurde gefunden, daß einige Mikroorganismen befähigt sind, den Hing direkt zu dihydroxylieren.

Bei den Fällen, bei denen Benzol selbst mikrobiologisch Oxydiert wo'rden ist (vergl. Selten 506 - 510 des oben erwähnten Lehrbuches) wird Katechol gebildet. Es hat sich gezeigt, daß der StoffwechselraechanisiBue von wenigen Mikroorganismen befähigt ist, eine weitere Oxydation des Katechols su verursachen, während auch eine Hingaufspaltung zwischen benachbarten Hydroxylgruppen erfolgt. Dies hat zur Bildung von Muconsäure geführt, gewöhnlich in Form des

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Die gesamte Umwandlung kann wie folgt dar gestellt werden:

Benzol Katechol ciSgCis-Muconsäure

Wenn auch wenige Mikroorganismen die Umwandlung von Benzol in dieser Weise bewirken, so ist doch keine analoge Umwandlung von Alkylbenzol bisher mitgeteilt worden. Infolgedessen dürfte die Darstellung von Alkylbenzol aus einem 1~Carboxy-2₉3-dihydroxybenzol mit der gleichen Anzahl Kohlenstoffatome wie der Auegangskohlenwasserstoff oder aus einer alkylsubstituierten Muconsäure neu sein.

Es hat sich nun gezeigt, daß es einige Stämme an Mikroorganismen der Art Nocardia gibt, die in einer neuen Weise methylsubstituierte Benzole oxydieren, die wenigstens 2 aufeinanderfolgende unsubstituierte Ringkohlenstoffatome besitzen. Diese Kohlenwasserstoffsubstrate, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind die Cy-C₁₀-aethylsubetituierten Benzole mit 1-4 Methylgruppen und wenigstens 2 benachbarten lüngkohlenstoffatomen, die keine Substituenten tragen. Nach einem neuen Gesichtspunkt wird eine Methylgruppe an einem Kohlenstoffatom, das sich unmittelbar neben zwei nicht-substituierten Kohlenstoffatomen befindet, in eine Carboxylgruppe umgewandelt, während auch

009836/2121 bad ormnal

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eine ©rthohydroxylierung des Ringβa an den beiden benachbarten offenen Kohlenstoffatomen stattfindet. Ferner findet Reaktion, ohne Decarboxylierung statt« Das Ergebnis

Sto-ffweehaelreaktionen ist die Bildung von 2 „3-ijihydroxybenaoesäure oder deren Homologen in Abhängigkeit •worn, ä®m als Ausgangsmateriial verwendeten-. Me thylbenzol« Beispielsweise körnen aus p-Xylol geeignete Stäma© von Nocardia '25,3-Bihyöroxy-p-toluolsäure (im folgenden als DHPT ) bilden» Ie solohea Fällen, scheint es₉ daß p-

(im folgenden-ale PTA bezeichnet)- ©in Vorläu- ■ der Stoffwechselfolge zu DHPT ist und eich deshalb wesentliche Mengen ron PTA im allgemeinen ansammeln, wenn immer JMBX gebildet -wird. Dies trifft besonders für die spaten Stufen der Fe-nsentierung. su_o Analoge Ansammlungen* won anderen5, nicht-hydroxyllerten Benzoesäuren finden gew'dhnlich -.gleichzeitig mit ä.er Bildung von anderen 2,3-

statt,

St'Mama

noeh andsx»©. n©ia© ße-slchtspunkte d©r Os^dation für s©ig©a_? die wenigstens

Dies© Stamm© fizad bafPiigty d©a Miag Oxydation des Methylsubstituenten usiä

BAD

Ringspaltung zwischen den hydroxyl:ierten Kohlenstoffatomen zu diorthohydroxylierenc Diese Ringspaltung ist das Ergebnis einer weiteres! Oxydation_? welche die hydroxylierten Kohlenstoffatome in Carboxylgruppen überführt. So. kann Dimethy!muconsäure (im folgenden als DMMA bezeichnet) dureh biologische Oxydation hergestellt werden, wie sich di©a durch die' folgende Gleichung darstellen läßt: C G C

σ σ

3,6--Dimethyl- et,et' -Dimethylmucon katechol säure (DMMA)

Das in der Gleichung gezeigte substituierte Kateehol ist ein Übergangsswischenprodukt. bei der mikrobiologischen Reaktion und kommt im allgemeinen im Fermentierungsmedium aioht in großen Mengen vor_s doch können sich in manchen Fällen kieia© Mengen ansammeln und in Endprodukt anwesend B(SiMo Wie angegeben liegt das bei der Fermentierung von .p-Xylol ©Etelten© DMMA in Form seines cl8,ci3-Isoaaers vor. kanu leicht in das eisjtrane-lsomer und/oder

Isomer unter entsprechenden Isomerisierungabeäingungen ieoaserisiert werden.

_s daß aus C^-C^Q«H@thylbens©len geeign®t© Stämme toä Mocardia₉ entvfeder 2₉3-Mliydr©xjb®iizoe-

BAD ORIGINAL

säuren oder ein Homologes von Muconsäure oder beides erzeugen. Jeder Säuretyp hat die gleiche Anzahl Kohlenstoffatome wie der Ausgangskohlenwasserstoff» Bas Muconsäure-Horaologe hat ebenfalls die gleiche Anzahl Methylsubstituenten wie der Stammkohlenwasiäerstoff, während die Dihydroxybenzoeeäure eine Methylgruppe weniger besitzt. Beispielsweise erzeugen aus p~Xylol einige Nocardiastämme T)HPT, aber kein DMMA _s während einige sowohl DHPT als auch DMMA produzieren* Unter den letzteren Stämmen können einige dazu gebracht werden, daß sie IXlIiA unter im wesentlichen Ausschluß von DHPT unter selektiven Fermentierungsbedingungen erzeugen. Wie oben bereits erwähnt, bildet sich eine wesentliche Menge von PTA im allgemeinen, wenn immer DHPT erzeugt wird.'

Geeignete Typen an Nocardia, die sich für die i)urehfUhrung des erfindungsgemäBen Verfahrene eignen, werden als ortho« dihydroxylierende und nicht deoarboxylierende Stämme bezeichnet. Mit dem Ausdruck "orthodihydroxylierend" wird ausgedrückt; daß der Mikroorganismus befähigt ist, an dem Ring des Methylbenzole 2 Hydroxylgruppen zu bilden, die zueinander in ortho-Stellung stehen, wovon sich eines in ortho-Stellung zu einem substituierten Kohlenstoffatom des Benzolringes befindet. Dieser Ausdruck zeigt natürlich nicht an, daQ das letztlich bei der ?ermentierung gebildete Produkt notwendigerweise irgendwelche Hydroxylgruppen ent-■■■■■■ . BA

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α —

hält, wie diea bei den Muconsäure-Homologen tatsächlich nicht der JPaIl ist, Der Ausdruck "nicht-decarboxylierend¹¹ sagt, daß die Mikroorganismen keine Zerstörung von Carboxylgruppen verursachen, die sich während der Oxydation bilden, indem sie daraus Kohlendioxyd in Freiheit setzen. Deshalb ist es für das erfindungsgemäße Fermentationeverfahren charakteristisch, daB Irgendwelche sich bildende Carboxylgruppen während der Fermentation unangegriffen bleiben.

Nocardiastäinme, die orthodihydroxylierend und nicht decarboxylierend wirken, wurden unter vielen Spezies gefunden, die in der Natur vorkommen, einschließlich von Spezies, die nach Bergey's Manual klassifiziert sind als Nocardia coraUina, Nocardia salmonieolor und Nocardia minima« Für die Zwecke des vorliegenden Verfahrene werden im allgemeinen die Stämme von Nocardia corallina bevorzugt. Ea wurden viele Versuche unternommen, üb unter anderen bekannten Kohlenwasserstoff verbrauchenden Gattungen Stumme zu finden, die ähnliche orthodlhydroxylierende und niohtdecarboxylierende Eigenschaften besitzen. Zu den geprüften Gattungen gehören Spezies von Brevibakterium, Pseudomonas, Streptomyces, Candida und Bazillus. Bis jetzt hat jedoch keiner hiervon die gewünschten Eigenschaften gezeigt, die von geeigneten Nocardiastämmen, die für das .

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erfindüngsgeiää3e Verfahren verwendet werden, entfaltet werden.

In Übereinstimmung mit der Erfindung wird ein Methylbenz.gI des Cv-CjQ-Bereiches in eine organische Säure mit Hilfe eines Nocardiamikroorganismus der oben beschriebenen Eigenschaften überführt= Der Ausgan^ekohlenwasserstoff kann irgend ein Mono-, Di™, Tri- oder Tetramethylbenzol sein, das wenigstens zwei aufeinanderfolgende nicht-substituierte Hingkohlenstoffatome besitzt. Insbesondere können die folgenden Methylbenzole verwendet werden: Toluol, o«, m- oder p-Xylol, Pseudocumen, Hemimellithol und Prehnitol« Das Säureprodukt ist entweder ein nie t hy 1 subs ti tuiertes höheres Homologes von Muconsäure, oder ein 2,3-Dihydroxybenzoesäure oder beides. Wenn eine 2,3-Dihydroxybenzoesäure gebildet wird, ist sie im allgemeinen von der entsprechenden nicht-hydroxylierten Benzoesäure begleitet, die -wie oben erwähnt - der Stoffweehselvorläufer für das dihydroxylierte Produkt zu sein scheint« Die Umwandlung wird bewirkt, indem man das methylsubstituierte Benzol in Gegenwart eines Nähri-iediume und unter Fermentierungsbedingungen der Einwirkung eines orthodihydroxylierenden und nichf-decarboxylierenden liocardiastammee aussetzt. Nachdem die gewünschte JPermentierungsoxydation stattgefunden hat, wird wenigstens eine Säure des obengenannten Types aus dem Permentierungamedium isoliert.

BADCRiGlNAL

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~ 10

Bei einigen Mikroorgani emens tämmen werden eovrohl ein Muconsaurehomologee ale auch eine 2,3-Dihydroxybenzoesäure gebildet und isoliert, während in anderen Fällen in wesentlichen nur die eine oder die andere Säure gebildet wird.

Die folgende Tabelle zeigt im einzelnen die Kohlenwasserstoff substrate, die bei der Durchführung des erfindungsgemä(3en Verfahrens verwendet werden können und die daraus gebildeten Säuren, Me Tabelle enthält die Substrate und die Säuren, sowohl hinsichtlich ihres Namens, als auch ihrer Formel_o

Erhältliche Säuren

Kohlenwasserstoffeubetrat

Aromatische Säure

Substituierte Muconsäure

(Toluol)

COOH

(2,3-Dihydroxy benzoesäure)

HOOC-C=C

C -C=C-

COOH

{βς-Methy !Muconsäure)

(o-Xylol)

COOH

(2,3-Dihydroxyo-toluolsäure)

C C HOOC-C=C-C=C-COOH

(χ,^-Dimethylmuc.on säure)

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Erhältliche Säuren

Kohlenwasserstoff substrat

Aromatische Säure Substituierte Muconsäure

(m-Xylol)

0OH

(2,3-Dihydroxym-toluolsäure) CC HOOU-C=C-C=C-COOH

(oc>/J«-Dimethylmuconsäure)

(p-Xylol)

0OH

(2,3-Dihydroxyp-toluolsäure) HOOC

-X=C-C=C-

COOH

(βί,βς'-Dimethylmuconsäure)

0OH

(Pseudocumen)

(2,3~Dihydroxy-4,6-dimethylbenzoesäure)

COOH

(2,3-Dihydroxy· 4,5-dimethylmuconsäure) CCC

111

HOOC-C=C-C=C-COOH

(«c, *c· ,/5-Trimethylmuconsäure)

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Erhältliche Säuren

Kohlenwaeserstoffsubstrat

Aromatische Säure

Substituierte Muconsäure

0OH

(Hemimellithol)

(2,3-Dihydroxy-5,6~dimethylbeneoesäure)

HOOC-C=

J C C J-C=C-COOH

(rf, /*, /S* -Trimethylmuconsäure)

(Prehnitol)

0OH

(2,3-Dihydroxy-4,5,6-trin»thylbenzoesäure)

CCCC litt

HOOC-C=C-C=C-COOH

O*,*'t/M'-Tetramethylmuoonsäure)

Aus der Tabelle kann man entnehmen, daß die dihydroxyIierenden und nicht-decarboxylierenden Nocardiastämme, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden, jedes angegebene Methylbenxol in eine aromatische Säure überführen können, die eine 2,3-Bihydroxybenzoesäure und/ oder in ein Hueoneäurehomologee ist, die nur einen Methylsubstituenten in der alpha-Stellung hat und die in Abhängigkeit von den verwendeten Kohlenwasseretoffsubstraten keine anderen Methylgruppen oder andere Methylgruppen haben kann. PUr alle Substrate - mit Ausnahme von Fseudocumen - resultiert nur eine dihydroxylierte aromatische Säure und/oder

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ein Huconsäurehomologes aus den Stoffwecheelreaktionen, die von diesen N-oeardiaetänmen gezeigt werden. Im Falle von Pseudocumen gibt es zwei dihydroxylierte, aromatische Säureisomere, die auftreten können; diese Isomere unterscheiden sich nur in der Stellung einer Methylgruppe. Es 1st zu erkennen, daß alle Säureprodukte die gleiche Ansah! Kohlenstoffatome haben, wie der Ausgangskohlenwasserstoff, daß die Muconsäure die gleiche Anzahl Methylsubetituenten wie das Substrat hat und daß die aromatische Säure nur einen Methylsubstituenten weniger hat» wobei letzterer in eine Carboxylgruppe überführt worden ist.

Spezifische Mikroorganismen, die für das erfindungsgemäß· Verfahren verwendet worden sind, sind s. Bo folgende:

- ο

(1) Ein wildgewachsener Stamm, erhalten aus Erdboden in Alabama, mit Eigenschaften, die ungefähr denjenigen entsprechen, die für Nocardia coralline in Sergey's Manual angegeben und infolgedessen als derartige Spezies klassifiziert sind. Eine Kultur dieses Stammes wurde bei der American Type Culture Collection in Washington, D. C, unter der Nummer ATCC 19 070 hinterlegt. Kolonien dieses Mikroorganismus haben eine orange Farbe.

(2) Ein rötlich gefärbter Mutant, erhalten durch U.VO Bestrahlung von ATCC Nummer 19 070. Der Mutant wurde eben-

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falle bei der American Type Culture Collection hinterlegi und trägt die Nummer ATCC 19 071«

(3) Ein Stamm.aus Pennsylvania-Brdboden isoliert, und in gleicher Weise als Nocardia corallina klassifiziert. Dieser MikroOrganismus*ist orangefarben, ähnlich wie 4i· zuerst erwähnte wilde Spezies« doch zeigt er deutliche Unterschiede .Tia enzymatisch-oxydativen Verhalten, wie dies im folgenden beschrieben ist. Üine Kultur hiervon wurde als Stamm hinterlegt; er trägt die Nummer ATCC 19 148.

(4) Ein aus Erdboden isoliertes Material mit Eigenschaften, die ungefähr denjenigen entsprechen, die in Bergey's Manual als Nocardia salmonicolor angegeben sind und infolgedessen als solche klassifiziert werden, üine Kultur hiervon wurde unter der Nummer ATCC 19 H9 niedergelegt.

(5) Ein anderes aus Erdboden isoliertes Material, klassi fiziert nach Bergey's Manual als Nocardia minima mit der Nummer ATCC 19 150.

Das für die Zwecke der Erfindung zu verwendende Nährmedium für die Kultur von Nocardiastämmen sollte Quellen für verfügbaren Stickstoff, Phosphor, Schwefel und Magnesium sowie für verschiedene Spurenelemente enthalten, wie dies üblicher- _f weise verwendet wird» Gebräuchliche Mineralsalze zum Zuführen solcher Elemente bei der biologischen Fermentation

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können verwendet werden. Beispiele für geeignete Stickstoff quellen sind Ammoniumsalze, wie (NH₄J₂SO₄ .oder NH₊Cl₉ Nitratsalze, wie NH₄NO₅ oder NaNO,, Harnstoff, Sojabohnenmehl oder andere organische Stickstoffquellen. Die folgenden Angaben erläutern eine geeignete Mineralsalzmischung für das erfindungsgemäße Verfahren,,

Konz,, g/1 H₂O

MgSO₄ -	7H₂O	•	Harnstoff	0.2
Na₂CO₅		0.1
CaCl₂ ·	2H₂O	• 0.01
MnSO₄ ·	H₂O	0.02
PeSO₄ 0	7H₂O	0.005
Na₂KPO₄		3,0
KH₂PO₄	2.0
2„0

Diese Mineralsalzmiechung würde normalerweise einen pH von etwa 7,1 haben. Wenn nan die Fermentation bei einem pH unterhalb 7 ausführen will, wie dies der Pail ist, wenn man die Produktion des Muconsäurehomologes einem maximalen Wert zuführen will, so kann die Menge an KH₂PO₄ im Verhältnis zu Na₂HPO₄ erhöht werden, um den pH auf einen niedrigeren Wert zu bringen»

Das erfindungsgemäSe Verfahren wird im allgemeinen bei einer Temperatur von 20 - 40°C und vorzugsweise bei 28 -32⁰C unter aeroben Bedingungen unter Rühren durchgeführt.

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Das Nährmedium sollte einen pH von 4-9 und insbesondere von 6-8 haben. Wenn der Nocardiaatamm zu einer Hingspaltung unter Bildung eines Mueoneäurehomologes befähigt ist, kann die Bildung einer derartigen Säure zu einem Maximum geführt werden, indem man den pH im Bereich von 6-7 hält, wobei ein pH von etwa 6,8 - 7,0 gewöhnlich die besten Ergebnisse bringt. Wenn eine Dihydroxybenzoesäure das bevorzugte Produkt ist, kann seine Bildung durch Arbeiten bei einem pH in dem.Bereich von 7-8 begünstigt werden, wobei ein Wert von 7»8 im allgemeinen bevorzugt wird.

Bei der Herstellung einer für die Zwecke der Erfindung geeigneten Nocardiakulturen wird eine Probe eines geeigneten Noeardiastamraes von einer Reagensglasagarkultur in einen SchUttelkolben überführt, der die MineralsalzlÖeung und eine geeignete Kohlenstoffquelle für das Wachstum enthält. Die Kohlenstoffquelle kann ein geeigneter Kohlenwasserstoff, wie Hexadecan, gesättigte, vom Kerosen oder Toluol abgeleitete Derivate oder ein Kohlehydrat oder ein hydrolyeiertee Protein sein. Vorzugsweise wird die Kohlenstoff quelle periodisch in kleinen Mengen während der Inkubation zugegeben. In manchen Fallen mag es erwünscht sein, daß auch Wachstum stimulierendes Material, wie Fep-'ton, ?leischbrüh~Extrakt oder Hefeextrakt anwesend ist, doch ist dies oft nicht notwendig. Im ifelle des oben er-

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wäkaten Mutanten ATCC Hr* 19 071 sollte ein solches Material zugegeben werden, da dieser Organisarus im Gegensatz zu dem wilden Stammtyp ATCC Nr. 19 070 eine Quelle des Vitamins, p-Aminobenzoesäure, wenigstens für das Anfangswachstum benötigt. Ein solches Material kann diesen Wache- -tums faktor darstellen«. Die Mischung wird bei 30⁰C inkubiert und es wird Hexadecan (oder eine andere Kohlenstoffquelle) von Zeit zu Zeit zugegeben, wenn das Zellwachetun stattfindet; vorzugsweise wird es in zunehmenden Mengen sugefügt. Nach einer Inkubationsperiode, die typischerweise 24 Stunden beträgt, können die Zellen für die Zwecke der Erfindung verwendet werden.

Die Fermentation kann ausgeführt werden, indem man das Methylbenzolsubstrat in Gegenwart des Nährmediums der KLnwirkung von Nocardiaorganismen unter Wachstums- oder Nicht-Wachstumsbedingungen aussetzt. Venn Wachstumsbedingungen angewendet werden, wird eine Probe des nach obigen Angaben hergestellten Impfmaterials einem Mlneralsalsmediuin in einem FermentierungsgefäB zugegeben und die Zellen werden zuerst bei 30⁰C auf Hexadecara gezüchtet, s. B. etwa 24 Stunden, ohne Zugabe des Methylbenzolsubstrates. Nach gutes Wachstum erfolgen periodische Zugaben des Methylbenzole susaimaen mit zusätzlichen Mengen Hesadeoan, um das Wachstum aufrechtzuerhalten und die Hermentierung wird fortgesetst» bis eine

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maximale Ausbeute der gewünschten Dihydroxybenzoesäure und/oder des Mueonsäurehomologen erhalten vdrd. Eine Gesamtfermentierungszeit von 96 Stunden iet gewöhnlich typisch, um eine maximale Ausbeute zu erhalten.

Wenn der Nocardiaorganismus zur Durchführung des erfindungsgemäflen Verfahrens unter Nicht-Wachstumsbedingungen verwendet wird, werden die gewachsenen Zellen, wie oben erwähnt, von der Brühe durch Zentrifugieren abgetrennt und mit Phosphat-Puffer-Lösung gewaschen und dann in einer Phosphat-Pufferlösung erneut suspendiert. Die Suspension wird z. B. bei 3O°C gehalten und das Methylbenzolsubstrat wird periodisch in zunehmenden Mengen oder kontinuierlich zugegeben, während die Mischung belüftet und gerührt wirdc Die Zugabe des Substrates wird fortgesetzt, bis die Fermentation eine optimale Auebeute des gewünschten Säureproduktes ergeben hat.

Nach Beendigung der Fermentation werden die Zellen von der Brühe durch Zentrifugieren abgetrennt und die klare Brühe kanu dann in irgend einer geeigneten Weise behandelt werden, um die Säureprodukte zu isolieren. In den Fällen, bei denen ein Kuconsäure-Homologes (z. B. DMMA) gebildet wird, kann es gesondert durch Ansäuern der Brühe mit einer Mineralsäure (ζ» B. HCl) auf einer pH von s. B. 2 isoliert werden, worauf das DMMA selektiv aus der Lösung ausfällt, dann

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abfiltriert und durch Waschen mit Wasser gereinigt werden kann. Irgend ein in der Brühe vorhandenes DHPT und PTA verbleibt in der wäßrigen Lösung und kann daraus durch Extrahieren mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie Äther, Dioxan oder Amylazetat isoliert werden. Das DHPT und PTA können anschließend voneinander unter Verwendung eines Anlonaustauscherharzes chromatographisch getrennt werden. Hach einem anderen Verfahren kann die angesäuerte wässrige Lösung, die beim Abfiltrieren des ausgefällten BMMA erhalten worden ist, eingedampft werden, wobei man ein Konsentrat von DHPT und PTA erhält; diese Produkte können voneinander durch Extraktion des !Concentrates mit einem geeigneten selektiven Lösungsmittel abgetrennt werden.

,Ein für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bevorzugter Mikroorganismus zur Herstellung der Derivate vom Muconsäuretyp ist das oben erwähnte Mooardla oorallina ATCO Rr. 19 070. Die physiologischen und Kultureigenschaften, welche diese Mikroorganismen Identifizieren und unterseheidungskräftig machen, sind folgende:

AnfärbungseigenBchaften

Alters 24 bis 168 Std. Gram; Gm , Granulat

Zellenmorphologie

Form: Stäbchen mit Verzweigungen in der jungen Kultur (0-48 Std.) Beweglichkeit: nicht beweglich

Größe: 24 Stunden - 1-1.5 mal 3-2-0 Micron* Verzweigungen

48 Stunden - 0.5-1.5 mal 1-5 Micron, einige Yerzweigun-72 Stunden - 1 mal 1-2 Micron gen

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Agarkolonien	72 Stunden
Alter:	kreisförmig
Form:	konvex
Erhebung:	butterähnlich
Oberfläche:	vollständig
Rand:	orange
Farbbildungs
Agarstrich

Alter: 72 Stunden Form: faserartig Konsistenz: butterähnlich Farbbildung; hellorange Nährmittelbrühe Oberflächenwachstum: Wachstum unter der Oberfläche:

Menge:

Sediment:

flockenartig keines mäßigeβ Wachstum körnig, orange

Gelatinestich

Verflüssigung: keine Wachstum: keines

Kartoffeldextrose-Agar

Alter: Wachsturn:

72 Stunden keines

Im Reagenzglas schräg angelegte Kartoffelkultur

Alter:

Farbbildung: Konsistenz:

72 Stunden tief orange butterähnlich

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Qlucoaeagar

Alter:

Farbbildung: Konsistenz:

72 Stunden

hellorange - cremefarbig

butterähnlich

Einwirkung auf Zuckerarten

Maltose

Sorbit

Dextrose

Mannit

Lactose

keine Säure keine Gasbildung

μ ti ti η

M H M I» M ··

schwach alkalisch ⁿ

keine Säure

aß-Arabinose Saccharose Lävulose Inosit schwach alkalisch "

M M

N N H It

ti sehr gutes Wachstum M Il M

Wachstum mäßiges Wachstum gutes Wachstum Wachstum

gutes Wachstum Il H

Einwirkung auf Milch Reaktion: keine - Kingwachstum, orange Eigenschaften Nitrite aus Nitraten

Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet Indol wird nicht gebildet Es wird kein Phenol oder Naphthalin verwendet Stärke wird nicht hydrolysiert

Natrium- und Ammoniumsalze werden als Stickstoffquelle verwendet.

Der oben erwähnte und als ATCC Nr. 19 071 identifizierte Mutant besitzt, ähnlich wie ATCG Nr. 19 070 ringspaltende Eigenschaften und erzeugt einen Muconsäuretypo Dieser Mutant hat dieselben unterscheidungskräftigen Eigenschaften, wie oben angegeben, erfordert jedoch im Gegensatz «u dem

BAD öniGiNÄL

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Stammorganismue ein spezielles Vitamin für das Wachstum, nämlich p-Aminobenzoesäure. Bei der Pennentation von p-Xylol ist der Mutant besser dazu veranlagt, eine Ansammlung von PTA und PHPT in der Brühe zu ergeben, als ATCC Nr. 19 070, doch bildet er nicht notwendigerweise diese Produkte und in manchen Fällen zeigt sich nur eine wesentliche Ansammlung von DMMA.

. Die folgenden Beispiele erläutern einige AusfUhrungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Analysen der erhaltenen Produkte wurden für diese Ansätze durch U.V. Spektroskopie ermittelt. Die anfallenden speziellen Produkte wurden durch Elementaranalysen sowie U.V., I.R. und Massenspektrogrammverfahren identifiziert.

Beispiel 1

Wooardia corallina ATCC Hr. 19. 070 wurde verwendet, um alpha,alpha'-ΟΜΜΑ aus ρ-Xylol in einem 40-Ltr. Termentierungsgefäß herzustellen, das kontinuierlich wie ein Wirbelsystem betrieben wurde. J&ne Mlneralsalzlusung der oben angegebenen angenäherten Zusammensetzung wurde verwendet und h-Hexadeoan wurde als Wachstumseubstrat verwendet. Die Mischung wurde mit dem Organismus geimpft und bei 30⁰C kräftig gerührt, während sie durch Hindurcheaugen von Luft in dem Wirbel« der von der geführten Mischung gebildet wurde,

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belüftet wurde. Zunächst ließ man den Organismus in Gegenwart dee Hexadecane zusammen mit Spurenraengen p-Xylol wachsen, bis eich etwa 5 - 6 g Zellen angesammelt hatten. Hierfür wurden etwa 24 Stunden benötigt. Danach wurde die Fermentation bei 3O⁰C fortgesetzt, während kontinuierlich ein· Mischung von 90 i» p-Xylol und 10 # n-Hexadecan (Volumenteile) in einer solchen Geschwindigkeit zugegeben wurde, daß sich die Geschwindigkeit der Zugabe von p-Xylol im Bereioh von 20 - 40 ml/Stunde bewegte. Auf diese Weise wurde die p-Xylol-Konzentration in der Permentationsbrühe im Bereich von 80 ■- 350 p.pc-m.- gehalten. Der pH schwankte während des Ansätze8 etwas, doch blieb er im allgemeinen innerhalb des Bereiches von 6,5 - 7»0„ Proben der Brtihe wurden zu verschiedenen Zeitpunkten während der Fermentation gezogen und man untersuchte sie auf den Gehalt an DMMA, DHFT und auch PTA. Es wurde keine nennenswerte Menge an einer der beiden zuletzt genannten Verbindungen ermittelt. Die DMMA-Ergebnisee waren folgende:

Sunden seit Beginn ,*:,*.'-DMMA, g./l. Brühe

30 '	1.8
41 .	4.5
56	9.8
65	11.6

Unter den angewendeten Bedingungen sammelte sich als einziges Produkt im wesentlichen nur DMMA an. iJiee zeigt, daß

BAD

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der Organismus ATCO Nr. 19 070 stark selektiv bei der Herstellung des Muconsäureprodukts unter entsprechenden Bedingungen sein kann.

Beispiel II ...

Ein anderer Ansatz wurde unter ähnlichen Bedingungen wie im Beispiel I durchgeführt, mit der Abweichung, daß eine geringere Rührgeschwindigkeit angewendet wurde, und man die Fermentation 106 Stunden lang durchführte. Die Analyse der Brühe nach Ablauf dieser Zeit ergab die folgenden Ergebnisse:

oc,<x.«-DMMA 13c 4 g./Liter PTA Io1 go/Liter

IHPT vernachlässigter

Beispiel III

Eine Reihe von 4 Permentationsversuchen von p-Xylol wurde unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen wie in Beispiel I durchgeführt mit der Abweichung, daß der Mutant ATCC Nr, 19 071 verwendet wurde, der pH zwischen den Ansätzen variiert wurde und die Ansätze bei etwa 120 Stunden beendigt wurden. In allen diesen Fällen sammelte sich nur ein einziges Produkt, nur alpha,alpha'-DMMA an, dessen Mengen folgende waren:

6/2111 * _Bad original

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maximale Ausbeute an DMMA

6.0 4.4 g./l.

6.5 8.1 ^rt

7.0 11,6 »

8.0 Oo06 » .

Biese Ergebnisse zeigen, daß die beste Bildung des Hueonsäurehomologes bei einem pH in der Gegend von 7 erhalten wird, und daß die Bildung des Produktes mit diesem besonderen Mikroorganismus deutlich bei einem höheren pH herabgesetzt wird. Das gleiche gilt für ATCC Nr» 19 070.

Beispiel IV

Nocardia salmonicolor ATCC Kr. 19 149 wurde bei dem Fermentieren von p-Xylol unter Bildung DHPT verwendet. Das 40 1 Fermentierungsgefäß wurde im allgemeinen in der gleichen Weise wie in Beispiel I verwendet. Man ließ die ersten 36 Stunden den Organismus auf n-Hexadecan, bei einem pH von ötwa7,0, wachsen, worauf der pH in dem Bereich von 7,5 bis 8,0 gehalten wurde. Dann wurde eine 90:10 Mischung von p-XylonsHexsd®can kontinuierlich in einer solchen Geschwindigkeit eingeführt, daß die p-Xylolkonzentration in der Flüssigkeit bei 50-200 p.p.m. gehalten wurde. Das Produkt bestand in diesem Pail nur aus DHPT und PTA und ihre Konzentration in der Flüssigkeit für die 3 Proben war folgende:

BAD ORIGINAL

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Zeit von Beginn: Std.	Konso,	RoZl₉
	BHPT	*HL.*
51	2.2	1c2
60	3.5	3.9
75	5.0	8.3

Unter den Bedingungen dieses Ansatzes war die Konzentration von IWPT größer als die von PTA zu einer bestimmten Zeit, doch sammelte sich später bei der Ferment!erung PTA schneller an, als DHPT und überstieg dessen Konzentration. Die relativen Anteile von KiPT und PTA variieren typischerweiae bei dieser Fermentierungsform, wenn Noeardiastämme verwendet werden* die zur Bildung von DHPT anstelle von DMMA fähig sindc

Beispiel V

Brei Ansätze wurden unter Bedingungen durchgeführt, die im allgemeinen denen des Beispiels 4 ähnlich waren; es wurde wiederum ATGG Nr. 19 149 verwendet, und die p-Xylol-Konzentration in der Brühe₈ die der Wachstumsstufe auf n~Hexadecan folgte, wurd© auf Werte von etwa 50, 150 bzw. 250 mg/l eingestellt. Die anfängliehe Blldungsgesehwindigkeit von SHPT und PTA nach dem Einführen eines 90s1G-Gemisch@s von p-Xylol und n-Hexadeean wurde bestimmt und es wurden auch Ausbeuten dieser Produkte nach etwa 96 Stunden erhalten» Die Ergebnisse waren folgende:

0.0 9-8'3.6721 Ii'

BAD ORIGINAL

~ 27 -

p-Xylol Konss., Anfangsbildungs- Ausbeutenach . mg./l. geschwindigkeit 96 3td.. g./l<

/l/ta

DHPT PTA DHPT" PTA

50 0_P09 0.27 lc? 6„8

150 0.11 0.17 2.9 5.5

250 Q«20 0.0.9· 5o0 4-5

Pie Werte zeigen, daß das Erhöhen u: XyIol-Konzentration innerhalb der ausprobierten ßrensen die Bildung von PTA herabdrückt und die KaximumauBbeute von DHPT erhöht«

Beispiel VI

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von. Zellen von Nocardia salaonicolor ATCC Hr. 19-14.9 unter Nicht-Weoh·- tiuaebedingungen bei der BienOxydation von p-Xylol. Zunftohst lies «an verschiedene Proton der Zellen auf n-Hsxadeoan i*i einen 40 1 FeraentiensngsgvfäS bei eines pH von etwa 7 34 Stunden lang wachsen. Die. Zellen wurden von der Brühe abzentrifugiert und dann in einer Phosphat-Pufferlösung suspendiert, die nur HagHPO^ und KHgPOj in eolchen Mengen enthielt, dafi der pH bei etwa 8 gehalten wurde. Ss waren keine Stickstoffquellen eier Spurenelemente anwesend. Zwei Proben der Zellen in der Pufferlösung wurden mit einer Zellenkonzentration von etwa 5 bzw. 15 g/l hergestellt.

009836/2121

■ BAD

Eine Fermentierung jeder Probe bei 30⁰C wurde unter Wirbel* belüftungsbedingungen durchgeführt, indem kontinuierlich in die Suspension eine 10:90 Mischung von p-Xylol:n-Hexadecan in einer solchen Menge eingeleitet wurde, daß die p-Xylol-Konzentration in der Mischung bei 200 - 300 p.p.in. gehalten wurde. Von jedem Ansatz wurden Proben der Flüssigkeit nach 16, 26 bzw. 34 Stunden nach der Zugabe p-Xylol gezogen und analysiert. Die Ergebnisse waren folgende:

Zellenkonzentration

15.

Zeit von der von p-Xylol,	Zugabe Stdo	Produktkon zentration,	PTA
		So/1.	0o8
		DHPT	1-3
16		0o5	2o1
26		0.5	5.°4
34		0o5	6.6
16 26		1.3 1o5
34		1c8

Diese Ergebnisse zeigen, daß entsprechende Stämme Hocardl® DHPT aus p-Xylol unter Nicht-Wachstumsbedingungen produzieren können. In diesen Fällen übersteigt die Menge an PTA im wesentlichen die Menge des angesammelten DHPT, doch kann bei Fermentierungen unter unterschiedlichen Bedingungen der relative Anteil der beiden Produkttypen umgekehrt werden. i>ie Werte zeigen, daß die Mengen an angesam- :

0 09836/2121

BAD

melten Produkten von der angewendeten Zellenkonzentration in dea Phosphat-Puffermedium abhängen.

Beispiel VII

Es wurden Schüttelkolbenansätze unter Verwendung drei verschiedener dihydroxylierender und nicht-decarboxylierender Stämme von Nocardia bei der Fermentierung von p-Xylol durchgeführte Im einzelnen handelte es sich um Nocardia aalmonicolor ATCC Nr. 19 149 der Beispiele IV bis VI, einen anderen Stamm von Nocardia corallina, identifiziert als ATCC Nr-, 19 148 und einen Stamm Nocardia minima, identifiziert als ATCC Nr, 19 150. Das Verfahren dieser Ansätze besteht darin, daß 100 ml Kinerälsalzlösung in einem 500 ml SchUttelkolben mit dem Organismus geimpft werden, daß man 0,05 ml n-Hexadecan zugibt, 24 Stunden lang bei 30⁰C schüttelt, danach kleine Mengen p-Xylol zusammen mit n-Hexadecan von Zeit zu Zeit zugibt und insgesamt etwa 96 Stunden lang schüttelt. Die Pensen tationabiere (fermentation beers) wurden dann durch U.V. Absorptionsanalyse untersucht. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse für zwei Ansätze mit jedem Mikroorganismusstamm.

Produktkonzentration,

Specie«	ATCC Nr.	149
salmonicolor	19	148
Gorallina	19	150
minima	19

DHPT PTA

0,30 Io 15

0,37 U08

Oo27 U 13

0*19 UOT

O 15 Oo45

O₁,15 0.41

BAP o^v 0 0 98 36/2121

Die Werte zeigen, da3 jeder der genannten Stämme auch den Benzolring dihydroxylieren kann, ohne daß er gleichzeitig eine Decarboxylierung verursacht. Jedoch echeint keiner dieser Stämme die Bildung des Muconsäurehomologes zu verursachen, wenigstens nicht unter den hier angewendeten JPermentierungsbedingungen.

Beispiel VIII

Zwei Ansätze wurden in Permentationsrührgefaßen unter Verwendung von Nocardia corallina ATCC Nr. 19 070 und ATCC 19 071 durchgeführt. Bei jedem Ansatz wurde eine Mischung von 480 ml eines Anionaustauscherharzes mit genügend Mineralsalzlösung verwendet, so daB ein gesamtes Volumen von 3000 ml erhalten wurde. Das Medium enthielt auch 0,2 $> fepton und 0,1 < Fleischbrühe und sein pH wurde auf etwa 6,5 gehalten. Nach dem Impfen der Organismen lieS man sie auf n-Hexadecan 36 Stunden lang wachsen, worauf p-Xylol in kleinen Mengen von Zeit zu Zeit zugegeben wurde, während man die Mischung rührte und bei 30⁰C belüftete„ Jeder Ansatz wurde insgesamt 120 Stunden durchgeführt und es wurden insgesamt 24 al p-Xylol verwendet. Die Arten und Mengen der Produkte einschließlich derjenigen, die auf dem Anionaustauscherharz absorbiert waren, als auch diejenigen in der Brühe wurden dann bestimmt. Die kombinierten Ergebnisse sind folgende:

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ATCC Hr.	ATCC Nr. 19 071
12,2	14,6
0.7	0,8 .
1,0	O08
Oo 5	O₀ 6

Menge dee Produkts, g./l. Brühe Progtikt

ΚΙΜΑ
DHPT
PTA
DMC²

^a 3,6-Dimethyleateehol

Aus diesen Vierten kann man entnehmen^ daß beide Mikroorganiemen unter den bei diesen Ansätzen verwendeten Bedingungen eine Ansammlung sowohl des substituierten Huconsaureproduktes als euch des substituierten 2,3-Bihydroxybenzoeeäureproduktes verursachen können. Ferner zeigen die Werte, daß es unter manchen Umständen möglich 1st, daß sich substituiertes Katechol als Zwischenprodukt aneaamelt, doch ist dessen Anteil für die speziellen, hler verwendeten Mikroorganismentämme kleiner.

Bei des £uletst beschriebenen Beispiel wurde ~ wie erwähnt - ein Anionauetaueeherhars in der FerDentierungeaiechung während der Fermentierung verwendet. Die Verwendung eines solchen Harzes während der Fenaentierung verursacht eine unerwartete Verbesserung d@r Ausbeute des gewünschten Säureproduktes. Jedoch let sine derartige Verwendung hier nicht beansprucht, da si© Gegenstand einer gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung der gleichen Anmelderin mit

BAD

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•52 -

dem Titel "Verfahren zum Hersteilen von Karbonsäuren durch mikrobiologische Oxydation von Kohlenwasserstoffen" (unser Zeichen DA-678) ist»

Die obigen Beispiele erläutern die Herstellung von methylsubstituierten Muconsäuren und/oder 2,3-Dihydroxybenzqeeäuren aus C«-C₁₀-Methylbenzolen der angegebenen Art* Wenn auch die Beispiele im einzelnen auf die Biooxydation von p-XyIo1 gerichtet sind, so geben doch Fermentierungen mit anderen Methylbenzolen der oben definierten Art analoge Ergebnisse. PUr diese anderen Kohlenwasserstoffsubstrate verlaufen die Fermentierungereaktionen nach analogen Stoffwechselwegen, so daß eine oder die andere oder beide dieser Säurearten gebildet werden, wenn iiamer dihydroxylierende und nicht-decarboxylierende Stämme von Nocardia für die Fermentierung verwendet werden.

Die nach dem ©rfindungegemäßen Verfahren herstellbaren Säuren sind wertvolle Produkte mit verschiedenen kommerziellen Anwendungsmöglichkeiten« Beispielsweise sind die substituierten Muconsäuren, die doppelt endständige Säuren sind, für die Herstellung von Polymeren verschiedener Typen geeignet. Die Dihydroxybenzoesäuren eignen sich als chelatbildend« Substanzen, Metallentaktivierungemittel und Farbstoffzwischenprodukte.

Patentansprüche

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Claims

_-3 593460

Darf nicht r-änl-r? ν.'

Patentansprüche

U Verfahren zum Herstellen einer methylsubstituierten Muconsäure und/oder einer 2,3-dihydroxybenzoesäure jeweils mit 7 - 10 Kohlenstoffatomen,«dadurch g e kenn ζ e ic h η e t , das man ein C₇-C₁₀~Methylbenzol mit 1 - 4 Methyl« gruppen und wenigstens 2 aufeinanderfolgenden nieht-substituierten Ringkohlenstoffatomen in Gegenwart eines Nährmediums und unter Permentierungsbedingungen der Einwirkung eines orthodihydroxylierenden und nicht-decarboxylierenden Mikroorganismusstammes aussetzt und die Säuren aus dem ?ermentierungsgemisch isoliert.

2_O yerfahren nach Anspruch 1_P dadurch g e k e η η -. ze i c h η e t ₉ daß man die JPermentierung im Äille der Herstellung von 2,3-Dihydroxybenzoesäure bei einem pH oberhalb von7 durchführt.

3, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k β η η -

ζ e i c h η e t , daß man die Permentierung im Pfeile der Herstellung einer methylsubstituierten Muconsäure bei einem pH unterhalb 7 durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, daduroh gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Stämme von Nooardia coralllna, Nocardia salmonioolor oder Hocardia

BAD OFfIGfNAL

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rS9346O

minima verwendet,

5ο Verfahren nach Anspruch 1 bis 4» dadurch gekennzeichnet , daß. man Stämme der Bezeichnung ATCC Nr₃ 19 07O₉ ATGC^Nr₀ 19 071, ATOC Nr. 19 148, ATCC Nr. 19 149 oder ATCC Nr. 19.150 verwendet,

6 ο Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß man als Cy-C_1Q-Methylbenzol ρ»Xylol verwendet»

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man bei Nocardia corallina einen pH unterhalb 7, bei Nocardia salmonicolor einen pH oberhalb 7 anwendet.

009836/2121 ^BÄD