DE1517819C - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Prolin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Prolin durch Züchten von Mikroorganismen bei hierfür üblichen Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium.

L-Prolin ist eine wirtschaftlich bedeutsame Aminosäure, die in Arznei- und Stärkungsmitteln und für andere Zwecke Verwendung findet. Bisher ist L-Prolin hauptsächlich durch Isolierung aus Hydrolysaten von Proteinen, wie Gelatine, oder durch organische Synthese hergestellt worden. Die nach diesen Verfahren erzielten Produktausbeuten sind jedoch sehr gering. Außerdem sind die Verfahren kompliziert. L-Prolin ist daher einer der teuersten Aminosäuren. Die Entwicklung eines Verfahrens zur Massenproduktion von L-Prolin durch Fermentation unter Verwendung billiger Kohlenhydratausgangsmaterialien wird daher seit langem angestrebt, doch ist in der Literatur über ein industrielles Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch Fermentation bisher nichts berichtet worden. In »Amino Acid«, Ed. 8, S. 51 (1963), wurde berichtet, daß nur eine geringe Menge —73 y/Liter L-Prolin in der Kulturflüssigkeit angesammelt wird, wenn Micrococcus glutamicus Nr. 541 gezüchtet wird.

Der vorliegenden Erfindung liegt als Aufgabe die Entwicklung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung von L-Prolin zugrunde, mit dessen Hilfe sich die Nachteile und Unzulänglichkeiten der bekannten Verfahren überwinden lassen, und das gewünschte Produkt in hoher Reinheit und guter Ausbeute liefert. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Prolin durchZüchten von Mikroorganismen bei hierfür üblichen Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in dem Nährmedium als Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC 19 223, -ATCC 19 224 oder -ATCC 19 225 züchtet. Es wurde nun gefunden, daß die angestrebten Ziele erreicht werden können, wenn man die genannten Mikroorganismenmutanten, die für ihr Wachstum Isoleucin, Arginin, Citrullin, Ornithin, Methionin oder Vitamin B₁₂ benötigen, in einem wäßrigen Nährmedium züchtet, das eine Quelle für Kohlenstoff, eine Quelle für Stickstoff, anorganische Substanzen und geringe Mengen von sonstigen Nährstoffen enthält. Auf diese Weise wird eine bemerkenswerte Ansammlung von L-Prolin in einer Menge von mehr als etwa 8 — 10 mg/ccm erhalten.

Bezüglich der erfindungsgemäß einsetzbaren Mikroorganismen ist zu sagen, daß Micrococcus glutamicus ATCC 19 223 von Isoleucin, Micrococcus glutamicus ATCC 19 224 von Arginin, Citrullin oder Ornithin und Micrococcus glutamicus ATCC 19 225 von Methionin oder Vitamin B₁₂ abhängig ist.

Was die Zusammensetzung des wäßrigen Nährmediums anbelangt, so können sowohl künstlich zusammengestellte als auch natürliche organische Medien verwendet werden, so lange sie die für das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen wesentlichen Nährstoffe enthalten. Diese Nährstoffe sind bekannt. Dazu gehören Substanzen wie Quellen für Kohlenstoff, Quellen für Stickstoff, anorganische Verbindungen und sonstige Nährstoffe, die von den Bakterien in bestimmten Mengen verwertet werden. Als Quellen für Kohlenstoff seien z. B. erwähnt, Kohlenhydrate, z. B. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Saccharose, Maltose, Lactose, Trehalose, Cellobiose, Raffinose, Arabinose, Mannit, Sorbit, Inosit, Xylose sowie Stärkehydrolysat, Abfallmelassen u. dgl. Auch Gemische aus zwei oder mehreren dieser Substanzen können verwendet werden. Als Quelle für Stickstoff können die verschiedenartigsten anorganischen oder organischen Salze oder Verbindungen, wie z. B. Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat, Ammoniumeitrat usw., Nitrate, Harnstoff oder andere stickstoffhaltige Verbindungen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Brennereischlempe, Caseinhydrolysat, Fischmehl, Fleischbrühe, entfetteter Sojabohnenrückstand, Seidenraupenpuppen u. dgl., verwendet werden. Gemische dieser Substanzen kann man ebenfalls benutzen. Weiterhin ist es erforderlich, zu dem Züchtungsmedium die bestimmten für das Wachstum der Bakterien erforderliche Nährstoffe zu geben, nämlich Isoleucin, Arginin, Citrullin, Ornithin, Methionin oder Vitamin B₁₂. Anorganische Verbindungen, die zu dem Züchtungsmedium gegeben werden können, sind unter- anderem Kaliumhydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Mangansulfat, * andere Salze des Mangans und des Magnesiums sowie Salze des Eisens, Kobalts, Zinks, Nickels u. dgl.

Wenn als Quelle für Stickstoff Ammoniumsulfat verwendet wird, führt seine Zugabe in einer Menge von 1,5 bis 2,5 °/₀ zu einer sehr hohen Ansammlung von L-Prolin. Im Falle von Ammoniumchlorid erlaubt seine Zugabe in einer Menge von 1,0 bis 3,0 °/₀ eine hohe Ansammlung von L-Prolin.

Was die anorganischen Substanzen in dem Züchtungsmedium anbelangt, so wurde gefunden, daß die Zugabe von mehr als 0,4 °/₀ MgSO₄ die gebildete Menge an L-Prolin beeinflußt, wie die folgende Zusammenstellung zeigt.

Deshalb ist eine besondere Ausführungsform des beanspruchten Verfahrens dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt des Nährmediums an Magnesiumsulfat wenigstens 0,4 Gewichtsprozent/Volumprozent beträgt.

Die entsprechenden Versuche wurden in der Weise durchgeführt, daß Micrococcus glutamicus ATCC 19 223 96 Stunden unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Medium gezüchtet wurde, das (in Gewicht/ Volumen) 12°/₀ Glucose, 1,5 °/o Ammoniumsulfat, 0,5 °/₀ Ammoniumchlorid, 0,75 °/₀ Hefeextrakt, 3°/₀ CaCO₃, 0,15 °/o KH₂PO₄, 0,15 °/„ K₂HPO₄, 50y/Liter Biotin sowie die in obiger Zusammenstellung genannten Mengen MgSO₄ enthielt.

Die verwendete Menge an Biotin hat keinen Einfluß auf die gebildete Menge an L-Prolin.

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen, wie als aerobe Schüttelkultur oder durch Rühren einer Tauchkultur unter Einleiten von Luft, bei einer Temperatur von etwa 23 bis 37° C ,vorzugsweise 26 bis 32° C, und einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 6,5 durchgeführt.

Zugegebene Menge	Gebildete Menge
MgS04(»/o)	L-Prolin (mg/ccm)
0,05	0,1
0,40	3,1
0,60	5,5
0,80	6,4 .
1,0	7,5
1,4	8,0
1,6	6,9

Wenn ein pH-Wert oberhalb von 7 angewendet wird, besteht die Gefahr, daß sich die angesammelte Menge L-Prolin rasch wieder verringert, Ammoniak, Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Calciumcarbonat oder Calciumhydroxyd können als Neutralisationsmittel zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums verwendet werden. Weiterhin kann Harnstoff zu dem Züchtungsmedium gegeben werden, um dem Medium Ammoniumionen zuzuführen sowie seinen pH-Wert einzustellen.

Es wird im allgemeinen 2 bis 4 Tage gezüchtet, wobei sich L-Prolin in dem wäßrigen Züchtungsmedium als Hauptprodukt ansammelt. Nach beendetem Züchten wird im allgemeinen gefunden, daß sich in dem Züchtungsmedium außerdem etwa 1 bis 2 mg/ccm Lysin, etwa 3 mg/ccm Alanin und weniger als etwa 1 mg/ccm Leucin als Nebenprodukte gebildet haben. Weiterhin werden Valin, Glutaminsäure und Asparaginsäure in geringen Mengen als Nebenprodukte gebildet. Die Bildung von Lysin kann durch Verwendung von Ammoniumsulfat als Quelle für Stickstoff gehemmt werden.

Nach beendetem Züchten wird die Kulturfiüssigkeit filtriert, wonach die Aminosäuren an einem Kationeriaustauschharz adsorbiert und von diesem wieder eluiert werden. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und sodann durch ununterbrochene Zugabe von Methanol entwässert. Das in der Lösung enthaltene Methanol wird wieder durch Wasser verdrängt, nachdem diejenigen Aminosäuren abfiltriert worden sind, die in Methanol nur schwach löslich sind. Die noch verbliebenen geringen Mengen an basischen und sauren Aminosäuren werden entfernt, indem die wäßrige Lösung durch Säulen mit Kationen- und Anionenaustauschharzen geleitet wird. Beim Einengen und Entwässern des Eluats unter Zugabe von Methanol, gefolgt von einem Eindampfen bis zur Trockne unter vermindertem Druck, wird rohes kristallines L-Prolin erhalten.

In den folgenden Beispielen, die das Verfahren erläutern, beziehen sich die Prozentangaben auf Gewicht/Volumen.

Beispiel 1

Micrococcus glutamicus ATCC 19 223 wird als Impfkultur verwendet. 200 ecm einer Impfkultur dieses Mikroorganismenstammes werden in einen Fermentationsbehälter mit einem Fassungsvermögen von 5 1 gegeben. Sodann werden 2 1 eines Kulturmediums, das 12°/₀ Glucose, 2,0 % Ammoniumsulfat, 0,5 °/₀ Ammoniumchlorid, 1,5 % MgSO₄,0,75 % Hefeextrakt, 0,15% KH₂PO₄, 0,05% K₂HPO₄, 50y/Liter Biotin und 3,0% CaCO₃ enthält, in den Fermentationsbehälter gegeben.

Es wird dann 96 Stunden bei 28° C mit einer Rührgeschwindigkeit von 450 Umdrehungen pro Minute und unter Einleiten von 2 1 Luft pro Minute gezüchtet. Der pH-Wert des Mediums wird während des Züchtens mit einer 15%igen wäßrigen Ammoniaklösung auf 5,8 bis 6,0 eingestellt. Die in dem Züchtungsmedium gebildete Menge an L-Prolin beträgt 9,2 mg/ccm.

Nach beendetem Züchten wird der pH-Wert mit Schwefelsäure auf etwa 2,0 eingestellt, und die Verunreinigungen werden abfiltriert. Das Filtrat wird durch eine mit einem Kationenaustauschharz vom Sulfonsäuertyp beschickte Säule gegeben, um die Aminosäuren zu adsorbieren, die sodann mit wäßriger Ammoniaklösung eluiert werden. Nach Einengen des Eluats unter vermindertem Druck auf etwa 0,5 1 werden diejenigen Aminosäuren, die in Methanol nur

ίο schwach löslich sind, so vollständig wie möglich entfernt, indem während des Einengens ununterbrochen Methanol zugegeben wird, um die Lösung von Wasser zu befreien. Nach Abfiltrieren der ungelösten Aminosäuren wird das in der Lösung enthaltene Methanol wieder durch Wasser verdrängt und die wäßrige Lösung durch ein Kationenaustauschharz und sodann durch ein An ionenaustauschharz geleitet. In dem Eluat wird das Wasser nach teilweisem Einengen wieder durch Methanol verdrängt, und die unlöslichen Substanzen werden abfiltriert. Etwa 200 ecm der auf diese Weise erhaltenen methanolischen· Lösung werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Es werden 13,5 g rohes kristallines L-Prolin mit-einefm Reinheitsgrad von 85% erhalten.

^ ... „

B eispie I 2

Es wird mit dem gleichen Medium und unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 gezüchtet, nur daß eine Impfkultur von Micrococcus glutamicus ATCC 19 224 verwendet wird. Man findet, daß die Kulturflüssigkeit 9,5 mg/ccm L-Prolin enthält. Bei der Behandlung der Kulturflüssigkeit wie im Beispiel 1 werden 14,0 rohes kristallines L-Prolin mit einem Reinheitsgrad von 86 % erhalten.

B e i s ρ i e 1 3

Es wird unter den gleichen Bedingungen und mit dem gleichen Medium wie im Beispiel 1 gezüchtet, nur daß das Medium außerdem 50 mg/Liter Vitamin B₁₂ enthält und daß Micrococcus glutamicus ATCC19 225 (Methionin oder Vitamin B₁₂ erfordernde Mutante) als Impfkultur verwendet wird. Man findet, daß die Kulturflüssigkeit 9,8 mg/ccm L-Prolin enthält. Bei weiterer Behandlung wie im Beispiel 1 werden 14,5 g rohes kristallines L-Prolin mit einem Reinheitsgrad von 86% erhalten.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Prolin durch Züchten von Mikroorganismen bei hierfür üblichen Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man in dem Nährmedium als Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC 19223, -ATCC 19 224 oder -ATCC 19 225 züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt des Nährmediums an Magnesiumsulfat wenigstens 0,4 Gewichts/Volumprozent beträgt.