CZ299998A3

CZ299998A3 - Způsob chromatografického získávání velmi čistého cyklosporinu A a příbuzných cyklosporinů

Info

Publication number: CZ299998A3
Application number: CZ982999A
Authority: CZ
Inventors: Ullrich Voigt; Roland Hempel; Joachim Kinkel; Roger-Marc Nicoud
Original assignee: Arzneimittelwerk Dresden Gmbh
Priority date: 1996-03-21
Filing date: 1997-03-14
Publication date: 1999-10-13
Also published as: ATE210146T1; IL125807A0; NO984133L; DE19611094C2; EP0888382B1; SK282836B6; PL187763B1; CZ293243B6; DE59705670D1; DE19716167C2; RU2163607C2; WO1997034918A1; JP2000507237A; HUP9901801A3; PT888382E; KR20000064784A; DE19716167A1; NO321570B1; CN1212703A; EP0888382A1

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká novézo způsobu chromatografického čistění cyklosporinů A (Cy A) a příbuzných cyklosporinů, který je vhodný pro použití ve farmaceutickém průmyslu.

Přitom jsou účinné látky získávány za ekonomicky výhodných podmínek v dostatečné čistotě pro farmaceutické potřeby, to znamená, že například v případě cylkosporinu A jsou dodrženy požadavky na čistotu podle evropského lékopisu (PHARMEUROPA svazek 4, číslo 4, strana 270, prosinec 1992).

Dosavadní stav techniky

S úspěšnou izolací cyklosporinů A z Trichoderma polysporum (LINK EX PERS.) Rafai A. Rúeggerem a spolupracovníky [Helv. Chim. Acta .59, 112 (1976)] byl poprvé otevřen přístup k nové skupině silně imunosupresivních látek. Díky intenzivnímu výzkumu bylo zatím objeveno více než 25 příbuzných cyklosporinů s imunosupresivním a antifungálním účinkem [R. Traber a kolektiv, Helv. Chim. Acta 70, 13 (1987)].

Dnes je stěžejní význam cyklosporinů A jako prostředku volby při potlačování imunitní odpovědi po orgánových transplantacích nesporný. V důsledku toho nechyběla v minulosti snaha o to se zlepšením výrobního postupu vyrovnat se stále stoupajícími nároky na množství a kvalitu tohoto život zachraňujícího léku.

9

9 9 « ·

«· »♦ ·· • · 9 · · * • 9 9 9 9

9 999 ··· • · · 9999 99 99

Dosud známé technické řešení čistění cyklosporin

A obsahujících surových extraktů zahrnují většinou několik stupňů chromatografie za použití organických rozpouštědel jako elučních prostředků.

Ve výše zmíněné práci A. Rúeggera byla nejdříve prováděna chromatografie na silikagelu Kieselgel 60 Merck (0,063 až 0,2 mm) jako absorbentu s chloroformem při stoupajícím množství methanolu. Následovně byl získaný produkt podroben gelové chromatografii na Sephadex LH 20 v methanolu a poté chromatografii na oxidu hlinitém (Brockmann, Akt. I) v toluenu se stoupajícím podílem etylacetátu.

Podobné postupy používají i pozdější práce (tabulka l). Hojně našly využití adsorbenty Sephadex LH 20, Kieselgel 60 Merck (0,063 až 0,2 mm) a oxid hlinitý. Jako tekuté fáze byly většinou použity směsi organických rozpouštědel.

Z důvodu vysoké toxicity, vzhledem ke zbylým stopám rozpouštědel v účinné látce, a také, jak z tohoto vyplývá, kvůli bezpečnostně technickým problémům při zpracování větších množství těchto látek (destilace, odstraňování) jsou chloroform a metylenchlorid nevhodné.

Dále při použití gradientů nebo složitějších, například ternárních isokratických směsí, je nové nastavení tekuté fáze po destilaci eluátů zdlouhavé a drahé.

Podobně lze hodnotit i- metodu popsanou firmou BIOGAL v kanadském patentu CA 2 096 892, při které je surový extrakt před chromatografii podroben tepelnému zpracování. Polotovar je zde zahříván asi 1 hodinu na přibližně 110 °C a následně více než 5 hodin chlazen na teplotu místnosti. Při nasazení

* ·· · * · ♦ * • · · · · « · « · · · ···«·· • · · · · • · ··«· · · ·· vysokého podílu chlorovaných uhlovodíků je ve dvou po sobě jdoucích jednostupňových chromatografických postupech na silikagelu Kieselgel 60 jako absorbentu izolováno asi 15 % podaného množství cyklosporinu A o čistotě asi 97,6 %. Tento výsledek však vzhledem k velikosti výtěžku a čistotě získané účinné látky není s ohledem na průmyslové využití uspokojivý. Mimo to by tyto složité přírodní látky neměly být vystavovány teplotním změnám kvůli své teplotní nestabilitě a možné izomerizaci.

Podle dosavadního stavu znalostí se zdají jako vhodné pouze přihlášené postupy firem FUJISAWA (WO 9 213094) a BIOGAL (CA 2 096 892) a jednostupňovým chromatografikcým čištěním.

K tomu je však nutná nákladná kombinace tekutých fází popřípadě gradient, což regeneraci tekuté fáze ztěžuje.

K přesnějšímu posouzení těchto postupů však často chybí údaje o jejich výtěžnosti a dosahované čistotě produktů.

• ·· ·· ·· « 4 4 · · · ·

4 4 4 4 *

444 4 4 4 · • 4 4 4 4

444 44 44 4444

44

4 4

444 444

4

4«

Příklady některých dosud známých metod chromatografického čistění cyklosporinu A

Patent Firma Stupně čistění

US 4 117 118

US 4 215 199

SANDOZ 1

Sephadex LH, metanol neutrální oxid hlinitý, toluen/etylacetát, gradient Kieselgel 60, chloroform/metanol 98:2

Kieselgel 60, chloroform/methanol 98:2

Sephadex LH 20, metanol

Kieselgel 60, chloroform/metanol 98:2

BE 879 402

WO 9 213 094

SANDOZ 1

FUJISAWA 1

GB 2 227 489

BIOGAL 1

CA 2 096 892

BIOGAL 1

Sephadex LH 20, metanol

Kieselgel 60, hexan/aceton 66:33 krystalizace, aceton, -15 °C

Kieselgel, hexan hexan/etylacetat, gradient aceton

Kieselgel 60,chloroform/metanol/ aceton 92:4:4

Kieselgel 60, hexan/aceton, gradient

Kieselgel 60,chloroforra/dichlormethan/etanol 48:50:2 chloroform/etylacetát/etanol 48:50:2 • ·· · · ·· · * · · • · · · · » · · · ·· ♦ • · · · · · · · · · • ··· · · · * ♦ ······ • · · · · · · ··» *· ·· ···· ·* ··

Krátký popis SMB - techniky lze najít například v R.M.

Nicoud, LC-GC INTL sv. 5, č. 5, str. 43 až 47. a K.K. Unger (red.), Handbuch der HPLC, díl 2, GIT Verlag, Darmstadt,

1994 ( viz také obr. 1).

Podstata vynálezu

Vycházíme-li ze zde nastíněného stavu techniky, vyplývají pro řešení chromatografického čistění cyklosporinu A s vysokými nároky na čistotu produktu a výtěžnost následující požadavky:

. Nový postup by měl produkovat více než 70% vloženého množství cyklosporinu A v kvalitě odpovídající evropskému lékopisu (PHARMEUROPA) (vztaženo stupně chromatograf ického čistění).

. Postup by měl dostačovat nejvyšším nárokům na roční výkon a zároveň drasticky snížit potřebu rozpouštědel a materiálu pro stacionární fázi.

. Technické řešení by mělo být jednoduché, rychlé a robustní, to znamená, že rozpouštědla a adsorbenty musí být pokud možno po dlouhou dobu opětovně použitelné. Tím odpadá také nasazení těžko nastavitelných popřípadě těžko regenerovatelných, isokraticky používaných směsí rozpouštědel a gradientů.

. Neměly by být používány chlorované uhlovodíky.

. Postup by měl mít možnost automatizace, to znamená poskytovat možnost kontinuálního provozu a zároveň vyhovovat požadavkům GMP produkce.

44 44 44 ·· ·· • ••4 4 4 4 4 4 44 4 · 4 44 4 4444

444 444 · 4 ·44 444

4 4 4 4 · »

444 44 ·· 4444 ·· ··

Jako výchozí bod pro chromatografické čistění slouží například surový extrakt, získaný pomocí známých metod (např. DD 295 872 A5) z cyklosporin A obsahujícího suchého mycelia extrakcí (etylacetát) a odstraněním tuků (petrolbenzen/metanol/voda), který vedle řady většinou neznámých žlutě a červeně zabarvených substancí a olejovitých produktů vykazuje například i následující složení cyklosporinů:

Cyklosporiny Nestandardizovaná relace

C 14,9

B 13,7

L 0,2

A 65,1

G 1,2

D 1,2 ostatní 3,7 ) ' ' HPLC-analyticke stanoveni podle evropského lékopisu (PHARMEUROPA, sv. 4, č. 4, str. 270 a dále)

V prvním stupni chromatografie jsou polární cyklosporiny (C, B, L, U) odděleny od nepolárních (G, D), takže vzniknou dvě hodnotné frakce, které kromě cyklosporinu A obsahují buď pouze polární nebo pouze nepolární znečištění. Proto může být v druhém stupni chromatografie cyklosporin A tohoto znečištění výhodně zbaven.

Podle vynálezu je ultračistění cyklosporinu A pomocí

4 4 4

4 4

4

(náhradní stráija}..

444 444 • 44 44 chromatografické metody čistění za použití konvenční HPLC v kombinaci s technikou simulované pohyblivé vrstvy (Simulated Moving Bed - SMB) prováděno následovně:

1. Chromatografie HPLC nebo SMB-technikou

2. Chromatografie SMB-technika

Viz schéma 1 až 4.

Přesněji řečeno vynález představuje způsob čistění cyklosporinu A a příbuzných cyklosporinů ze surového extraktu obsahujícího cyklosporin za použití chromatografického postupu se silikagelem jako adsorbentem, vyznačující se tím, že se cyklosporin A a příbuzné cyklosporiny separují ze surového extraktu obsahujícího cyklosporin za použití chromatografického postupu se silikagelem jako adsorbentem

a) v prvním stupni chromatografie pomocí preparativní HPLC nebo SMB-techniky surový extrakt frakčními kroky v oddělených koncentračních profilech rozdělí na hodnotnou frakci 1 obsahující nepolární doprovodné látky a hodnotnou frakci 2 obsahující doprovodné látky více polární a

b) hodnotná frakce 1 (rafinát) a hodnotná frakce 2 (extrakt) podrobí následnému druhému stupni chromatografie pomocí SMB-techniky.

Přitom lze první i druhý stupeň chromatografie provádět v systému normální fáze/etylacetát nebo obrácená fáze, acetonitril/voda.

Zejména nasazením SMB-techniky je dosaženo následujících výhod:

(náhradní strá>i4) ί ί X * ϊ X ϊ ϊ X • · 9 · · 9 9 · * · · · · · · • · · · · · ♦ «99 9« ·· *··· ·· ··

- 8 . Lze realizovat naprosto kontinuální pracovní proces, to znamená, že s novým způsobem chromatografie odpadnou diskrétní injekce substancí. Takováto kontinuálně pracující chromatografie je výhodná především pro průmyslové využití.

. SMB technika umožňuje práci s koncentrovanějšími roztoky než doposud. Tím klesnou náklady na rozpouštědla a zároveň se zkrátí čas nutný na jejich zpětné získávání.

Na základě těchto příznivých ekonomických parametrů se SMB-technika ve vzrůstajícím měřítku nasazuje také k chromatografickému dělení proteinů produkovaných biotechnologicky (Nadler T.K., Sch. Sci., Purdue Univ. East Lafayette, IN 479907, USA) a aminokyselin (Adachi S. se spolupracovníky, Agric. Biol. Chem. 55, 925-932 (1991)).

Také v předloženém případě čištění produktů obsahujících cyklosporin A by mohla být zjištěna převaha SMB ve srovnání s konvenčními chromatografickými způsoby.

·· ·

• * • 44 • t *· • · · · * · • · · · • · · ·· <*···

4« *· • 4 · · • 4 4 · • ·S 4 ··4 • 4 ·· (náhradní strana) - 8a . Srovnání SMB techniky s technikou HPLC

Fázový systém Parametr Poměr (SMB:HPLC) normální fázový spotřeba etylacetátu 0,7 systém spotřeba materiálu Si 60 0,25 produktivita 2,5 (g vložené/d/kg adsorbens) obrácený fázový spotřeba acetonitril/voda 0,15 systém spotřeba materiálu RP-18 0,15 produktivita 10 (g vložené/d/kg adsorbens)

Nejdůležitějším technickým předpokladem pro realizaci SMB-dělení je přesné nastavení různých dílčích toků (viz příklady), aby bylo možné zajistit takřka stacionární stav elučních front v závislosti na spínacích časech.

Dále je pro optimální nastavení SMB-dělení nutná přesná znalost adsorpční isotermy žádaného produktu stejně jako φφφ • ·· • · · · • · · • φ·· · • · • ΦΦ ·· znečisťujících látek v používaném chromatografickém systému. Toto musí být předem analyticky stanoveno.

Také se, díky zavedení takzvané páté zóny, podařilo vypustit obvyklé dvoukomponentní dělení klasické čtyřzónové SMB.

Pomocí promývacího systému instalovaného v přídavné zóně je umožněna souběžná eliminace znečistění, která ve vztahu k cyklosporinu A vykazuje vysoké hodnoty k'. Tím je dosaženo dalšího zvýšení kvality produktu.

Obvykle mohou být standartní SMB-technikou dobře rozděleny směsi s hodnotami k' mezi 0,6 a 2,0 (k'=l odpovídá žádanému produktu). Avšak běžně jsou komponenty, které leží mimo toto rozmezí, odstraněny pouze neúplně, takže dojde k obohacení v rafinátu oproti vloženému materiálu (feed) (obr. 1).

Při přepínání mezi čtvrtou a první zónou se podle nově vynalezeného postupu kolony dostanou do definovaného stavu promýváním rozpouštědlem o silné eluční síle (např. metanol). Příslušné kolony aparatury, které se nacházejí v této páté zóně, jsou tak po dobu jednoho taktu úplně vyřazeny z uzavřeného kruhu ostatních čtyř zón (obr. 1).

Tato pátá zóna je rozdělena do dvou dílčích kroků:

1. Během trvání prvního dílčího kroku se kolony páté zóny propláchnou vhodným rozpouštědlem o vysoké eluční síle, aby se stacionární fáze očistila od zbylých nečistot.

Jako promývací prostředek je přednostně využíván metanol. V případě promývání RP-materiálu může být nasazen čistý acetonitril, čímž se díky odpadnutí

• *· • · ·	··	·· • ·	·· * · ·
•	•
• · ·· ·	•	•	•	• ···
• · »« ··	• • ·	•	• ····	• ··

jednoho přídavného rozpouštědla zjednoduší problém zpětného získávání rozpouštěcích prostředků.

2. Ve druhém dílčím kroku se promývacím prostředkem oplachuje eluční prostředek nutný pro oddělování.

Jsou-li kolony rozděleny do zón tak, že se jich v páté zóně nachází víc, může být promývací proces zintenzivněn, když se tyto kolony během promývání zapojí paralelně.

Další optimalizace postupu bylo dosaženo při ultračistění takzvané hodnotné frakce 2 prvního stupně chromatografie.

Tato frakce obsahuje kromě cyklosporinu A především polární nečistoty jako cyklosporin U a L. Zde bylo překvapivě zjištěno, že tato hodnotná frakce 2 může být velmi dobře oddělena po záměně místa odběru pro extrakt a rafinát na SMB-zařízení. Přitom jsou polární nečistoty eluovány před hodnotným produktem, cyklosporinem A, to znamená, že vykazují kratší retenční časy. Toto znamená, že při použití tohoto speciálního SMB-režimu ve druhém stupni chromatografie pak lze v tomto stupni pracovat se systémem RP-18, čímž se velmi zjednoduší zpětné získávání rozpouštěcích prostředků (schéma 1).

Výchozí substance použité v následujících třech příkladech, které dokládají vhodnost SMB-techniky pro druhý stupeň chromatografié, odpovídají svým profilem znečistění typickým hodnotným frakcím vzniklým z prvního stupně chromatografie při použití konvenční preparativní HPLC.

Příklady provedení vynálezu

V příkladu 1 se demonstruje ultračistění meziproduktu prvního ·· w · · · · ·♦ ·· • · · · * • · · e • · · · • · · • · · • · ·

stupně chromatografie pomocí SMB-techniky v běžném fázovém systému Si 60/etylacetát. Použitá látka obsahuje kromě cyklosporinu A převážně polárnější nečistoty.

Jako výsledek lze pozorovat zřetelné ochuzení polárních cyklosporinů (zejména U a L stejně jako B a C), tím se zdůrazní principielní vhodnost dělícího systému ve spojení se SMB-technikou.

Příklad 2 popisuje ultračistění meziproduktu, který jako hodnotnou frakci 1 obsahuje převážně nepolární nečistoty, pomocí SMB-techniky v systému obrácené fáze RP-18/ acetonitril, voda (60:40, objemově). Po dělení SMB lze pozorovat zřetelné ochuzení nepolárních cyklosporinů (především G a D).

V příkladu 3 se popisuje ultračistění meziproduktu, který obsahuje hodnotnou frakci 1 s nepolárním znečištěním, pomocí SMB-techniky v systému normální fáze/etylacetát.

Ve srovnání s příkladem 1 se při'záměně míst odběru pro extrakt/rafinát dosáhne výraznějšího ochuzení nepolárních nečistot, a také úspory rozpouštěcích prostředků.

Možnost takto jemného dělení je do té míry překvapivá, protože v minulých letech nebylo ani pomocí analytické HPCL možné tyto chromatograficky výjimečně podobné doprovodné substance od-cyklosporinů A oddělit.

Získaný cylosporin A odpovídá po rekrystalizaci požadavkům na kvalitu jak USP XXIII, tak evropského lékopisu (EUROPEAN PHARMACOPOEIA, 2. vydání, 1995).

- 12 ·· . 1

t v

• · · ·>

Přehled obrázku na výkrese

Schéma principu pětizónové SMB je uvedeno na obr. 1.

Popis obrázku 1

Tekutý prostředek je veden v kruhu mezi zónami 1 a 4. Přidání vzorku se děje mezi zónami 2 a 3.· Čerstvý eluent se přidává mezi zónami 4. a .1. Rafinát (cyklosporin A) se odebírá mezi zónami 3 a 4 a extrakt (cyklosporin A + nečistoty) mezi zónou 1 a 2. Každá kolona je opatřena čtyřmi ventily pro přidání substance (feed), eluent, extrakt (hodnotný produkt + nečistoty), a rafinát (hodnotný produkt). Pohyb nosného materiálu je simulován posunem sběrných a vstupních bodů proti směru eluce. Tím se docílí kontinuální rozložení substance mezi fázemi v systému kolon a koncentrace eluátu se na sběrných bodech zdají konstantním

Dále bylo v pokusném testu překvapivě zjištěno, že oddělení vedlejších cyklosporinů U a L na jedné straně a G a D na druhé straně se daří lépe SMB technikou než konvenční chromatografií a zároveň jsou v jednotlivých stupních dosažitelné vyšší výtěžky. Z toho vyplývá, že je při srovnatelné produktivitě možné využit menších zařízení, která mají také menší spotřebu náplně kolon a elučních prostředků.

Principielně je možné využít SMB techniky také v prvním stupni chromátografie (schéma 3). Přitom může být v podstatě za použití vhodných surových extraktů (s malým obsahem balastních látek především lipofilního charakteru) provedeno SMB dělení také v prvním stupni v systému obrácená fáze/acetonitril, voda (schéma 4). Jak bylo dále zjištěno, mohou být po záměně pozic rafinátu a extraktu v systému • *

- 13 obrácená fáze/acetonitril, voda od cyklosporinu A odděleny také polární nečistoty. Proto je také možné provést čistění cyklosporinu A za použití systému obrácená fáze/acetonitril, voda dvoustupňové pomocí SMB techniky nebo mohou být také nepolární nečistoty odděleny od cyklosporinu A systémem normální fáze/etylacetát po záměně pozic rafinátu a extraktu; je také potom možné provést čistění cyklosporinu A za použití systému normální fáze/etylacetát dvoustupňové pomocí SMB techniky.

Schéma 1 . ‘ cyklosporin A - surový extrakt

V

1. chromatografický konv. prep. HPLC	stupeň	Kieselgel Si 60 'etylacetát
Hodnotná frakce 1 nepolární Cy A + Cy G, Cy D atd.	Hodnotná frakce 2 polární Cy A + Cy Cy U atd.
		5'	y
2. chromatografický	stupeň	Si 60	Si 60
SMB		etylacetát	etylacetát

Schéma 2

1. chromatograf. stupeň konv. prep. HPLC

2. chromatograf. stupeň SMB ·· » « »

·« cyklosporin A - surový extrakt

Hodnotná frakce 1 nepolární Cy A + Cy Cy D atd.

Kieselgel Si 60 etylacetát

Hodnotná frakce 2 polární

G, . Cy A + Cy L,

Cy U atd.

RP-18 Si 60 acetonitril, voda etylacetát nebo po záměně pozic extrakt/rafinát: RP-18/ acetonitril, voda » · a *·

Schéma 3 *· »4» ·· • ta··* i « a · * 5 · «« < a ·* cyklosporin A - surový extrakt

1»

1. chromatograf. SMB	stupeň	Si 60 etylacetát
Rafinát Cy A + nepolární nečistoty	Extrakt obohacení polárních nečistot (příklad 1)

2. chromatograf.	stupeň	RP-18
SMB '		acetonitril,	voda
		Rafinát	Extrakt
		Cy A	obohacení
			nepolárních
			nečistot
			(příklad 2)

• · * · i

• · « i ··

4·

Schéma 4 cyklosporin A - surový extrakt v

1 chromatograf. stupeň SMB	RP-18
Rafinát Cy A + polární nečistoty	Extrakt obohacení nepolárních nečistot (příklad 2)
'5
2. chromatograf. stupeň	RP-18
SMB	acetonitril,	voda
	Rafinát	Extrakt
	obohacení	Cy A
	polárních nečistot

• · * · · «ι · 8 · 9 I * 4 « · · 9 · >· «· «· «·· ··

-- *

Á · · · « Μ» * 8· • e « » .· ·

Příklad 1

Oddělení převážně polárních cyklosporinů (cyklosporiny C, B, L, U) od cyklosporinu A ve druhé chromatografii pomocí SMB

techniky v systému	normální fáze/etylacetát.
Zařízení	LiChrosep(^R) 8-50, pilotní zařízení
Kolona	8 kolon, délka 100 mm x 50 mm vnitřní průměr axiální komprese
Stacionární fáze	LiChrosespher'^R' Si 60, 15 μπι
Mobilní fáze	etylacetát
Surová substance	# 011194 cyklosporin	čistota
	C	2,3
	B	6,9
	L	0,7
	U	1,2
	A	86,2
	G	1,0
	D	0,1
	souhrn znečistění	13,8 %
Vklad substance	roztok v etylacetátu 5,8 g/1
Vkládaný materiál	5,3 ml/min
Eluent	100 ml/min
Recyklace	151 ml/min
Detekce Výsledky	HPLC - analýza v proudu extraktu a	rafinátu

9 9 · * » ·* *·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9*99

99999 9 Λ 9 999999 • 9 9 9 9 9 9

9»9 9.9. 99 · · ·# * · ♦ ·

- 18 Rafinát

Extrakt cyklosporiny

C

B

L

U

A

G

D souhrn znečistění výtěžnost, cyklosporin A:

cyklosporin A souhrn znečistění čistota [%] 0,2 0,4 0,0 0,4

97,4 1,1 0,1 2,6 % >95 %

75.5 %

24.5 %

Výsledek pokusu ukazuje principielní možnost oddělení převážně polárních nečistot z cyklosporinu A v systému Si 60/etylacetát.

ť ··

9 «9 ·· • 9 · 9 · • « 9·· 999

9 · •999 ·· *9

Příklad 2

Oddělení převážně nepolárních cyklosporinů (cyklosporiny G, D) od cyklosporinů A pomocí SMB techniky v systému RP-18/acetonitril, voda.

Zařízení	LiChrosep(^R) 8-50, pilotní	zařízení
Kolona	8 kolon, délka 100 mm x 50 mm	vnitřní průměr
	axiální komprese
Stacionární fáze	LiChrospherRP-18, 15 um
Mobilní fáze	acetonitril/voda - 60/40, objemově
Surová substance	# 251094 cyklosporiny	čistota [%
	L	0,3
	U	0,8
	A	92,5
	G	4,1
	D	1,6
	souhrn znečistění	7,5 %
Přívod substance	roztok v acetonitrilu
Vkládaný materiál	i g/i
	12,7 ml/min
Eluent	81 ml/min
Recyklace	151 ml/min
Detekce	HPLC analýza v proudu extraktu	a rafinátu
Výsledky
Rafinát	cyklosporiny	čistota [%

neznámé (a =3,4) 0,1

	L	0,2
	U	0,5
	A	99,1
	G	0,0
	D	0,0

neznámé (a =20,1) 0,1 ··« · · * * * * * ·>· ·· * ♦ ··· • 999 9 9 9 9 ¢ 99 9 9 99 • « 9 · 4 · · « « « » · 49 999 9 9 9 ·9 souhrn znečistění 0,9 % obsah, cyklosporin A (sušina) 99,4 % stupňová výtěžnost, cyklosporin A >95 %

V pokusu dosažená čistota rafinátu činí 99,1 % . Po usušení této substance byl stanoven obsah cyklosporinu A na 99,4

Výsledek ukazuje možnost oddělení nepolárních nečistot od cyklosporinu A v systému RP-18/acetonitril, voda (60:40, objemově).

Příklad 3

Oddělení převážně nepolárních cyklosporinu (cyklosporiny C, G, D) od cyklosporinu A ve druhé chromatografií pomocí SMB

techniky v systému normální fáze/etylacetát při záměně místa odběru pro extrakt a rafinát.
Zařízení	LiChrosep^R) 12 -	96, pilotní zařízení
Kolona	8 kolon, délka 100 axiální komprese	mm x 26 mm vnitřní průměr,
Stacionární fáze	LiChrospher(^R)	Si 60, 15 - 25 μπι
Mobilní fáze	etylacetát
Surová substance	cyklosporiny	čistota [%]
	C	0,04
	B	0,122
	L	0,075
	A	92,462
	G	2,934
	D	4,177
	souhrn znečistění	7,538 %

«· · • *

Přívod substance Vkládaný materiál Eluent

Detekce

Výsledky

Extrakt roztok v etylacetátu 28 g/1

1,5 ml/min

16,4 ml/min

HPLC analýza v proudu extraktu a rafinátu cyklosporiny

C

B

L

A neznámé

G souhrn znečistění výtěžnost, cyklosporin A čistota [%] 0,02 0,075 0,063

99,364 0,219 0,175 0,636 % >95 %

Výsledek ukazuje, že pomocí výše zmíněného režimu zapojení SMB technikou mohou být v systému Si 60/etylacetát velmi dobře odděleny také nepolární nečistoty.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob čistění cyklosporinu A a příbuzných cyklosporinů z cyklosporin A obsahujícího surového extraktu, který využívá chromátogafický postup se silikagelem jako adsorbentem, vyznačující se tím, že se

a) v prvním stupni chromatografie pomocí preparativní HPLC nebo techniky simulated moving bed surový extrakt frakčních kroků v odělených koncentračních profilech rozdělí na nepolární doprovodné látky obsahující hodnotnou frakci 1 a polárnější látky obsahující hodnotnou frakci 2 a

b) hodnotná frakce 1 (rafinát) a hodnotná frakce 2 (extrakt) v následujícím druhém stupni chromatografie podrobí dalšímu čistění pomocí SMB techniky.
2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t í m, že se

a) jak pryní, tak také druhý stupeň chromatografie provádí v systému normální fáze/etylacetát nebo obrácená fáze/ acetonitril, voda,

b) hodnotná frakce 1 (rafinát) pomocí SMB techniky v systému obrácená fáze, acetonitril/voda a hodnotná frakce 2 (extrakt) podrobí druhému stupni chromatografie v systému normální fáze/etylacetát,

c) hodnotná frakce 2 (extrakt) pomocí SMB techniky v systému obrácená fáze/acetonitril, voda a hodnotná frakce 1 (rafinát)

• • · • · 9 • a • · 44 • • · t> 9 • « 9 4 • 4 · • 4 4 • 9 * 4 • 4 4 » · 4 « 4 9 9 4 4 4 *

podrobí druhému stupni chromatografie v systému normální fáze/etylacetát.
3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se zavedením páté zóny provede promývání nejprve alkoholem a následně tekutým prostředkem a že se více kolon v páté zóně takto promývá v paralelním zapojení.
4. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se dělení ve druhém stupni chromatografie provádí v systému obrácená fáze acetonitril/voda v poměru acetonitril/voda 40 až 80 k 20 až 60, přednostně 60:40, kde poměry jsou uvedeny objemově.
5. Způsob podle nároku la2, vyznačující se tím, že se kolony a tekutý prostředek v SMB zařízení udržují v rozmezí teplot od 40 do 80 °C, přednostně ale při 60 °C.
6. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se v systému obrácená fáze/acetonitril, voda hodnota pH tekutého prostředku nastavuje v rozmezí 2 až 5, přednostně ale na 3.