CZ296807B6 - Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur proantigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, DNA kódující takové polypeptidy a zpusob jejich prípravy a pouzití - Google Patents
Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur proantigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, DNA kódující takové polypeptidy a zpusob jejich prípravy a pouzití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ296807B6 CZ296807B6 CZ0395998A CZ395998A CZ296807B6 CZ 296807 B6 CZ296807 B6 CZ 296807B6 CZ 0395998 A CZ0395998 A CZ 0395998A CZ 395998 A CZ395998 A CZ 395998A CZ 296807 B6 CZ296807 B6 CZ 296807B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- rhesus
- giant
- erythrocytes
- pairs
- antibodies
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 65
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 65
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 65
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 34
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 33
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 4
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 92
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 230000009102 absorption Effects 0.000 claims description 18
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 13
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 12
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 3
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 3
- 206010021245 Idiopathic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 claims description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 2
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims description 2
- 208000031981 Thrombocytopenic Idiopathic Purpura Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001031 fetal erythroblastosis Diseases 0.000 claims description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 2
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 claims 2
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 claims 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 claims 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 claims 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 claims 1
- 235000010678 Paulownia tomentosa Nutrition 0.000 claims 1
- 240000002834 Paulownia tomentosa Species 0.000 claims 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 claims 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 32
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 15
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 102100027544 Blood group Rh(D) polypeptide Human genes 0.000 description 11
- 101000580024 Homo sapiens Blood group Rh(D) polypeptide Proteins 0.000 description 11
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 230000001188 anti-phage Effects 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 5
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 4
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 3
- 101710192606 Latent membrane protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 101710109576 Terminal protein Proteins 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 0.000 description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108010043461 Deep Vent DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102100021260 Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000894906 Homo sapiens Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101100537375 Homo sapiens TMEM107 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N Reactive blue 2 Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC(S(O)(=O)=O)=C1 JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100036728 Transmembrane protein 107 Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)[C@@]1(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000032696 parturition Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/34—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood group antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/80—Antibody or fragment thereof whose amino acid sequence is disclosed in whole or in part
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/81—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, immunotolerance, or anergy
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
Abstract
Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur proantigen specifických pro Rhesus D antigeny obsahují sekvence ukázané na obr. 1a az 16b. Získané polypeptidy, které jsou Fab fragmenty, mohou být pouzity prímo jako aktivní slozka ve farmaceutických adiagnostických prostredcích. Fab a jejich DNA sekvence mohou také být pouzity pro prípravu kompletních rekombinantních anti-Rhesus D protilátek pouzitelných ve farmaceutických a diagnostických prostredcích.
Description
Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, DNA kódující takové polypeptidy a způsob jejich přípravy a použití
CD CD h* o co CD
O) Ol (57) Anotace:
Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen specifických pro Rhesus D antigeny obsahují sekvence ukázané na obr. la až 16b. Získané polypeptidy, které jsou Fab fragmenty, mohou být použity přímo jako aktivní složka ve farmaceutických a diagnostických prostředcích. Fab a jejich DNA sekvence mohou také být použity pro přípravu kompletních rekombinantních anti-Rhesus D protilátek použitelných ve farmaceutických a diagnostických prostředcích.
Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus
D antigeny, DNA kódující takové polypeptidy a způsob jejich přípravy a použití
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká polypeptidů tvořících vazebné struktury pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigen a zejména Fab molekul se specificitou pro Rhesus D antigen. Vynález se také týká jejich použití pro farmakologické a diagnostické přípravy. Výše uvedené Fab fragmenty, pokud jsou geneticky zpracovány tak, aby byly částí kompletních protilátek, jsou použitelné pro profylaxi hemolytické nemoci novorozenců (HDN). Předkládaný vynález poskytuje nové DNA a aminokyselinové sekvence výše uvedených polypeptidů.
Tak mohou být protilátky použity pro ochranu Rh negativní ženy před nebo ihned po porodu Rh pozitivního dítěte pro zabránění HDN v následujících těhotenstvích.
Vynález také obsahuje použití uvedených Fab molekul buď samostatně, nebo v kombinaci s Fc konstantními regiony, jako kompletních protilátek pro léčbu jiných onemocnění, u kterých může být přínosem použití anti-Rhesus D imunoglobulinu, například pro léčbu idiopatické trombocytopenické purpury.
Kromě toho může být Rhesus D imunoglobulin použit po chybné transfuzi Rh pozitivní krve Rh negativnímu příjemci, pro zabránění senzibilizace Rh D antigen. Dále se vynález týká použití těchto Fab fragmentů a protilátek jako diagnostických činidel.
Dosavadní stav techniky
HDN je obecný název pro hemolytickou anemii plodů a novorozenců způsobenou protilátkami matky. Tyto protilátky jsou zaměřeny proti antigenům na povrchu fetálních eiytrocytů. Tyto antigeny mohou náležet k Rhesus, ABO nebo jinému systému krevních skupin.
Rhesus systém krevních skupin obsahuje 5 hlavních antigenů: D, C, c, E a e (Issit, P.D. Med. Lab. Sci. 45: 395, 1988). D. antigen je nej důležitější z těchto antigenů, protože je vysoce imunogenní a vyvolává tvorbu Rhesus D protilátek v průběhu Rhesus inkopatibilního těhotenství a po transfusi Rhesus inkopatibilní krve. D. antigen je nacházen přibližně u 85 % Kavkazské populace v Evropě a o těchto jedincích se říká, že jsou Rh pozitivní. Jedinci, kteří nemají D antigen, se nazývají Rh negativní. Exprese D antigenu může být různá z důvodů nízké hustoty antigenu, dále známé jako slabé D nebo D11, nebo z důvodu částečné antigenicity, známé jako částečné D antigeny.
Rhesus D antigen, membránový protein erytrocytu, byl nedávno klonován a byla popsána jeho primární struktura (Le Van Kim, C. et al., PNAS 89: 10925, 1992). Modelové studie ukázaly, že Rhesus D antigen má 12 transmembránových domén s pouze velmi krátkým spojovacím regionem přesahujícím vně buněčné membrány nebo přesahujícím do cytoplazmy.
Parciální D fenotypy byly plně identifikovány u lidí majících D antigen na erytrocytech, ale nemají aloanti-D-v séru (Rose, R.R. a Sanger, R., Blood groups in man, Blackwell Scientific, Oxford, UK, 1975; Tippett, P. et al., Vox Sanguanis, 70: 123, 1996). Toto může být vysvětleno tak, že D antigen je mozaiková struktura s nejméně 9 odlišnými epitopy (epDl až epD9). Proto u některých lidí s D variantou nemají erytrocyty část této mozaiky a protilátky jsou namířeny proti chybějících D epitopům. Rh pozitivní jedinci, kteří vytvářejí protilátky proti částečným D antigenům byly klasifikovány do šesti hlavních odlišných kategorií (Dn až Dvn), kde každá má jinou abnormalitu D antigenu. Nověji bylo ukázáno, že tyto D kategorie dávají různý charakter reakce při testování proti panelu lidských monoklonálních anti-D protilátek (Tippett, P. et al.,
-1 CZ 296807 B6
Vox Sanguinis, 70: 123, 1996). Podle různých charakterů reakce bylo identifikováno 9 epitop a tak byly definovány různé parciální D kategorie. Počet epitopů přítomných na D antigenů se liší mezi jednotlivými parciálními D kategoriemi, kdy DVI kategorie exprivuje nejméně, epD3, 4 a 9.
DVI kategorie je klinicky významná, protože DVI ženy mohou být imunizovány dostatečně silně pro způsobení hemolytické nemoci novorozenců.
Profylaktická účinnost anti-RhD IgG pro prevenci hemolytické nemoci novorozenců je dobře prokázána a je rutinním postupem po mnoho let. V důsledku toho se závažné onemocnění stalo raritou. Nicméně, základní příčina onemocnění, tj. RhD inkompatibilita mezi RhD negativní matkou a RhD pozitivním dítětem, stále zůstává a tak vyžaduje kontinuální dodávání terapeutického anti-RhD IgG.
V posledních letech se zajištění kontinuálního dodávání anti-RhD IgG stává narůstajícím problémem. Zásoba dostupného hyperimunního séra od aloimunizovaných Rh negativních vícerodiček se drasticky snížila díku úspěchu profylaktického podávání anti-RhD. Proto současné metody produkce vyžadují opakovanou imunizaci stále více neochotnějších dárců pro produkci vysokého titru antiséra (Selinger, M. Br. J. Obstet. Gynaecol. 98: 509, 1991). Jsou zde také asociované rizikové faktory a technické problémy, jako je použití Rh pozitivních erytrocytů pro opakovanou imunizaci, což má riziko přenosu virových onemocnění jako je hepatitida B, AIDS a jiné doposud neznámí viry (Hugnes-Jones, N.C., Br. J. Haematol., 70: 263, 1988). Proto je žádoucí alternativní způsob pro produkci anti-RhD protilátek.
V posledních několika letech byly zkoušeny různé alternativní zdroje hyperimunního séra, ale všechny jsou spojeny s nevýhodami. Transformace lymfocytů virem Epstein-Barrové (EBV) za vzniku B lymfoblastoidních buněčných linií, které secemují specifickou protilátku včetně protilátky proti Rhesus D antigenů (Crawford et al., Lancet, 386: Feb. 19* 1983) jsou nestabilní a vyžadují extensivní klonování. Také z důvodů nízké účinnosti transformace (1 až 3 % B buněk) může být z potenciálního repertoáru získat pouze omezený rozsah protilátkových specificit. Dále se zdá, že myši neodpovídají na Rhesus D antigen a proto nejsou dostupné žádné myší monoklonální protilátky, které by mohly být použity pro výrobu chimérických nebo humanizovaných protilátek. Doposud byla jedinou alternativou produkce lidských protilátek hybridomní technikou, která je také omezena chyběním vhodného partnery pro fúzi s lidskými myelomovými buňkami (Kozbor, D. a Roder, J.C. Immunol Today, 4: 72, 1983).
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu proto jsou Fab fragmenty mající reaktivitu proti Rhesus D antigenů, stejně jako kompletní protilátky obsahující Fab fragmenty, které nemají výše uvedené nedostatky.
V posledních několika letech technika repertoárového klonování a konstrukce fágových zobrazovacích knihoven otevřela nové možnosti pro produkci lidských protilátek definované specificity (Williamson, R.A. et al., Pnas 90: 4141, 1993). Tyto metody byly proto použity pro přípravu polypeptidů schopných tvorby vazebných struktur pro antigen se specifickou pro Rhesus D antigeny, zejména pro přípravu Fab fragmentů majících aktivitu proti Rhesus D a částečným D antigenům.
Tvorba lidských protilátek repertoárovým klonováním jak byla popsána v posledních letech (Barbas III, C.F. a Lerner, R.A. Companion Methods Enzymol. 2: 119, 1991) je založena na izolaci mRNA z periferních B buněk. Tato metoda nabízí nástroje pro izolaci přirozených protilátek, autoprotilátek nebo protilátek tvořených v průběhu imunitní odpovědi (Zebedee, S. L. et al., PNAS 89: 3175, 1992; Vogel, M. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1200, 1994). Tato metoda spočívá v konstrukci knihovny rekombinantních protilátek od jednotlivých dárců z mRNA kódující imunoglobulinové (Ig) molekuly. Protože pouze lymfocyty periferní krve (PBL) mohou být izo
-2CZ 296807 B6 lovány od dárce, jsou šance na nalezení B buněk produkujících specifickou protilátku v periferii zvýšeny, pokud je jedinci podána dávka požadovaného antigenů těsně před odběrem PBL (Persson, M.A.A. et al., PNAS 88: 2432, 1991). Celková RNA je potom izolována a mRNA Ig repertoáru může být klonována za použití Ig specifických primerů v polymerázové řetězové reakci (PCR), po které následuje současná exprese těžkých a lehkých řetězců Ig molekuly na povrchu filamentózního fágu, což vytvoří „organismus“, který analogicky s B buňkami může vázat antigen. V literatuře je také metoda také známá jako kombinatoriální přístup, jelikož umožňuje nezávislé kombinování těžkých a lehkých řetězců za vzniku funkčního Fab fragmentu protilátky připojeného na jeden z koncových proteinů, nazývaných plil, filamentózního fágu. Fágy nesoucí Fab molekuly (zde dále Phab částice) jsou podrobeny selekce na požadovanou antigenní specificitu procesem známým jako biopanorámování. Antigen může být navázán na pevný nosič, kdy specifická Phab se váže na antigen, zatímco nespecifické Phab jsou vypláchnuty a nakonec jsou specifické Phab eluovány z pevného nosiče. Specifické Phab jsou potom amplifikovány v bakteriích, je provedena opakovaná vazba na antigen na pevném nosiči a celý postup biopanorámování je opakován.
Postupné opakování panorámování a amplifikace vybrané Phab v bakterii vede k obohacení specifických Phab, což je pozorováno z vzestupu titru kolonie tvořících jednotek (cfu) očkovaných na plotny po každém kle panorámování. Naše dřívější zkušenosti a publikovaná data naznačují, že specifický fág může být detekován obvykle po 4 až 6 kolech panorámování (Vogel, M. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1200, 1994). Ve výše uvedené citaci nicméně není žádná zmínka, že naznačené kroky mohou být použity pro přípravu Fab fragmentů anti-RhD protilátek.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázky 1 a až 16b ukazují DNA sekvence kódující variabilní regiony (V regiony) anti-RhD Fab fragmentů a odpovídající polypeptidové sekvence.
Obrázek 17 ukazuje pComb3 expresní vektor použitý podle předkládaného vynálezu.
Obrázky 18 a 19 ukazují oddělenou přípravu genů pro těžký a lehký řetězec kompletní protilátky podle popisu v příkladu 6.
Předmětem předkládaného vynálezu jsou polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny podle definice v nároku 1. Tabulka 1 v nároku 1 se vztahuje k připojeným obrázkům. Je uvedeno identifikační číslo pro každou sekvenci. Lokalizace Rhesus D specifických CDR1 (komplementaritu určující region 1), CDR2 a CDR3 regionů jsou uvedeny na obrázkách a podle číslování párů bází v tabulce nároku 1. Výhodnými polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou anti-Rhesus D protilátky, které obsahují variabilní regiony těžkých a lehkých řetězců sekvencí uvedených na obrázkách la - 16b. Obrázky 1 a, 2a ... 16a se týkají variabilních regionů těžkých řetězců a obrázky lb, 2b ... 16b se týkají variabilních regionů lehkých řetězců.
Dalšími předměty předkládaného vynálezu jsou DNA sekvence kódující antigen vazebné polypeptidy podle nároku 6. Výhodné DNA sekvence jsou ty, které kódují variabilní regiony Fab fragmentů anti-RhD protilátek podle nároků la - 16b. Obrázky 1 a, 2a ... 16a se týkají těžkých řetězců a obrázky lb, 2b .... 16b se týkají lehkých řetězců.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob pro přípravu rekombinantních Fab polypeptidů podle nároku 11.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob pro selekci rekombinantních polypeptidů podle nároku 12.
-3CZ 296807 B6
Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou anti-RhD protilátky podle nároku 14, výhodně anti-RhD imunoglobulinové molekuly obsahující variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce podle obrázků la až 16b v kombinaci se známými konstantními regiony těžkého a lehkého řetězce.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou farmaceutické a diagnostické prostředky obsahující polypeptidy, anti-RhD protilátky nebo Fab fragmenty podle předkládaného vynálezu.
Celková reamplifíkovaná Phab populace získaná po každém panorámování může být testována na specifícitu za použití různých metod jako je ELISA a imunologické bodové testy. Toto je také určeno charakterem antigenů, například anti-Rhesus D Phab jsou detekovány nepřímou hemaglutinací za použití králičí anti-fágové protilátky nebo ekvivalentního Coomsova činidla jako zkřížené vazebné protilátky. Po identifikaci celkové Phab populace jako pozitivní pro požadovaný antigen jsou jednotlivé Phab klony izolovány a je sekvencována DNA kódující požadované Fab molekuly. Jednotlivé Fab mohou být potom vyrobeny za použití pComb 3 expresního systému, který je zobrazen na obr. 16. V tomto systému je glll gen, kódující koncový protein plil, vystřižen z fagemidového vektoru pComb3. Toto umožňuje produkci solubilního Fab v periplazmě bakterie. Takové jednotlivé Fab fragmenty mohou být potom testovány na antigenní specifícitu.
Fágový zobrazovací přístup byl také použit jako prostředek pro získání monoklonálních protilátek z nestabilních hybridomních buněčných linií. Toto bylo popsáno proti anti-Rhesus D protilátky (Siegel, D.L. a Silberstein, L.E. Blood, 83. 2334, 1994; Dziegiel, M. et al., J. Immunol. Methods, 182: 7, 1995). Fágová zobrazovací knihovna konstruovaná od neimunizovaných dárců byla také použita pro selekci Fv fragmentů (tj. variabilních regionů těžkého a lehkého řetězce, VH a VL) specifických pro antigen lidských krevních skupin, které obsahují jeden Fv fragment reaktivní s Rhesus D antigenem Marks, J. D. et al., Biotechnology, 11:1145,1993).
Důležitými podmínkami při konstrukci kombinatoriálních knihoven jsou zdroje buněk použitých pro extrakci RNA a charakter antigenů použitého pro panorámování. Proto předkládaný vynález používá hyperimunního dárce, kterému byla podána i.v. dávka Rhesus D+ erytrocytů. PBL dárce jsou odebrány +5 a +18 dní i.v. dávce a jsou použity pro konstrukci 2 kombinatoriálních knihoven zde dále označovaných jako knihovna Dl (LD1) a knihovna D2 (LD2), v příslušném pořadí. Dvojitá imunofluorescenční analýza získaných PBL, za použití markérů DC20 a CD38 pro spektrum B buněk a lymfoblastoidních buněk, v příslušném pořadí, ukázala vyšší než normální procento lymfoblastoidních B buněk, morfologie plazmatických buněk. Vyšší počet plazmatických buněk nalezených v periferní krvi je neobvyklý, protože v periferii je normálně méně než 1 % a pravděpodobně ukazuje na to, že dárce měl vyšší procento cirkulujících b buněk se specificitou pro Rhesus D antigen.
Po konstrukci knihovny byla selekce Phab specifických pro Rhesus D antigen provedena biopanorámováním čerstvých celých erytrocytů fenotypu R1R1 (CDe/CDe), tj. referenčních buněk pro Rhesus D typizaci. Toto bylo nezbytné, protože Rhesus D antigen, integrální membránový protein o 417 aminokyselinách (Le Van Kim C. et al., PNAS 89: 10925, 1992), ztrácí svou imunogenicitu v průběhu přečištění (Paradis, G. et al., J. Immunol. 137: 240, 1986) a proto nemůže být chemicky přečištěný D antigen navázán na pevnou fázi pro selekci imunoreaktivních Phab jak je to provedeno pro jiné antigenní specificity dříve selektované v tomto systému (Vogel, M. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1200, 1994). Modelové studie ukázaly, že pouze velmi krátký spojovací region Rhesus D antigenů přesahuje vně buněčné membrány nebo přesahuje do cytoplazmy Chérif-Zahar, B. et al., PNAS 87: 6T243, 1990). Proto jsou části RhD antigenů rozpoznatelné protilátkami relativně omezené a mohou být konformačně omezené. Tento aspekt Rhesus D antigenů se stává ještě důležitějším při selekci Phab s reaktivitou proti částečným D fenotypům, které postrádají některé definované epitopy D membránového proteinu (Mouro, I. et al., Blood, 83: 1129, 1994).
-4CZ 296807 B6
Kromě toho, protože celé erytrocyty neesprivují pouze D antigen, musí být provedena série negativních absorpcí na Rhesus D negativních erytrocytech z toho důvodu, aby se odabsorbovaly ty Phab, které reagují s jinými antigenními proteiny na erytrocytech.
Tento panorámovací postup provedený na Phab zobou LD1 a LD2 knihoven vedl kizolaci 6 různých klonů produkujících Fab z knihovny LD1, 8 různých klonů produkujících Fab z knihovny 2 a 2 klonů produkujících Fab ze souboru knihoven LD1 a LD2.
Nomenklatura a obrázky, kde jsou sekvence popsány, jsou uvedeny v tabulce 1.
Tabulka 1
| Knihovna | V - | V - I.» | Knihovna | V - H | V - |
| LD1 | sekvence | sekvence | LD2 | sekvence | sekvence |
| klon č. | obrázek | obrázek | klon č. | obrázek | obrázek |
| LD1-40 | la | lb | LD2-1 | 6a | 6b |
| LD1-52 | 2a | 2b | LD2-4 | 7a | 7b |
| LD1-84 | 3a | 3b | LD2-5 | 8a | 8b |
| LD1-110 | 4a | 4b | LD2-10 | 9a | 9b |
| LD1-117 | 5a | 5b | LD2-11 | 10 a | 10b |
| LD2-14 | 11a | 11b | |||
| LD2-17 | 12a | 12b | |||
| LD2-20 | 13a | 13b |
Výše uvedené Fab klony vykazují výlučnou reaktivitu s Rhesus D antigenem, 3 a 5 D“ testovali ných erytrocytů a aglutinační reaktivitu proti částečným D fenotypům: Rh33, DIII, DIVa, DIVb,
DVa, DVII.
Nicméně, za použití výše uvedených R1R1 erytrocytů pro panorámování Phab nebyly izolovány žádné klony reaktivní s částečným DVI fenotypem. Protože bylo známo, že sérum původního 20 hyperimunního dárce testované v době tvorby rekombinantní knihovny je reaktivní s DVI fenotypem, měla by rekombinantní knihovna také obsahovat anti-DVI specifícitu.
Pro selekci DVI reaktivity byly podmínky pro panorámování změněny v tom, že byly použity jiné buňky. Speciální dárce, jehož erytrocyty byly typizovány a bylo známo, že exprimují 25 částečný DVI fenotyp, byl použit jako zdroj buněk pro opakované panorámování LD1 a LD2 knihoven. Tato druhá série panorámování byla provedena v podstatě stejným způsobem jako první sorie s výjimkou substituce DVI erytrocytů za R1R1 erytrocyty a přidání ošetření DVI erytrocytů za R1R1 erytrocyty a přidání ošetřením VI erytrocytů bromelasou. DVI fenotyp exprivuje nejméně Rhesus D epitopů a je proto obtížné vyrobit proti němu protilátky. Bylo popsáno, 30 že pouze 15 % neselektováných polyklonálních anti-D a 35 % selektovaných anti-D tvořených
Rhesus D negativními subjektu reaguje sDVI+ buňkami (Mouro, I. et al., Blood, 83: 1129, 1994). Ošetření bromelasou, která odstraňuje N-acetylneuraminovou kyseliny (sialovou kyselinu) z membrány erytrocytů bylo provedeno proti, aby byly epitopy Rhesus DVI lépe dosažitelné v průběhu panorámování s pre-absorbovanými Phab.
-5CZ 296807 B6
Tato druhá série panorámování na LD1 knihovně vedla k zisku 1 klonu produkujícího Fab, LD16-17. Nomenklatura je uvedena v tabulce 2.
Tabulka 2
| Knihovna LD1 | V -sekvence Xi obrázek | V -sekvence Li obrázek |
| Klon č. LD1-6-17 | 14a | 14b |
Nicméně, tento klon reagoval s Rhesus alelami C a E a vykazoval falešně pozitivní reakci s DVI pozitivními erytrocyty. Toto bylo způsobeno také fenotypem DVI dárce (Cc DVI ee), který exprivoval C alelu, která nebyla odabsorbována Rhesus negativními erytrocyty (ccddee).
Proto byla provedena třetí série panorámování na souboru LD1 a LD2 knihoven za použití jiných erytrocytů pro absorpční fázi. Po 6 kolech panorámování za použití jako bromelasou ošetřených, tak bromelasou neošetřených erytrocytů pro oba absorpční kroky a eluci z DVI pozitivních erytrocytů byla získána celková populace Phab, které reagovaly výlučně s erytrocyty fenotypu R1R1 (CCDDee) a 2 různí dárci exprivující DVI variantu.
Tato třetí série panorámování na LD1 knihovně vedla k zisku 2 klonů produkujících Fab reagujících s DVI+ erytrocyty. Nomenklatura je uvedena v tabulce 3.
Tabulka 3
| Knihovna LD1/LD2 | V -sekvence - obr. H | V^ - sekvence - obr. |
| Klon Č. LD1/2-6-3 | 15a | 15b |
| Klon č. LD1/2-6-33 | 16a | 16b |
Tak bylo izolováno 16 různých anti-Rhesus D Fab klonů. DNA z těchto klonů byla izolována a sekvenována za použití fluorescenčního cyklického sekvencování na ABI 373A Sequencing Systém. Nukleotidové a odpovídající aminokyselinové sekvence uvedených Fab klonů tvoří základ předkládaného vynálezu.
Analýza sekvence ukázala, že bylo izolováno několik klonů majících stejný VH genový segment, ale jiné VL genové segmenty. Tak je tomu v případě dvou klonů LD2-1 a LD2-10, dvou klonů LD2-4 a LD2-11 a tří klonů LD2-14, LD1/2-6-3 a LD1/2-6-33, v příslušném pořadí.
Získané DNA sekvence a Fab fragmenty jsou použitelné pro přípravu kompletních protilátek majících aktivitu proti Rhesus D antigenu. Vhodnými expresními systémy pro takové protilátky jsou myší myelomové buňky nebo ovariální buňky čínského křečka.
Následující příklady podrobně popisují vynález, bez jakéhokoliv omezení rozsahu vynálezu.
-6CZ 296807 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 popisuje konstrukci 2 kombinatoriálních knihoven; zejména výše uvedených LD1 a LD knihoven.
Příklad 2 popisuje podrobně sérii panorámování na LD1 a LD2 knihovnách za použití R1R1 erytrocytů.
Příklad 3 popisuje sérii panorámování za použití jak bromelasou ošetřených, tak bromelasou neošetřených erytrocytů za použití souboru uvedených LD1 a LD2 knihoval.
Příklad 4 popisuje nepřímý hemaglutinační test využívající králičí anti-fágovou protilátku, jako ekvivalentní Coombsovo činidlo, pro sledování obohacení a specifícity Rhesus D specifických Phabs po panorámování.
Příklad 5 popisuje přípravu a přečištění Fab fragmentů protilátky pro použití jako diagnostické činidlo.
Příklad 6 popisuje přípravu kompletní anti-Rhesus D imunoglobulinů za použití sekvencí podle předkládaného vynálezu.
Příklad 1 - Konstrukce rekombinantních LD1 a LD knihoven
a) Zdroj lymfocytů
Dospělému muži, který byl členem dobrovolné základny hyperimunních Rhesus D dárců, byla podána i.v. dávka 2 ml připravených erytrocytů od známého mužského dárce krevní skupiny O RhD+. PBL byly odebírány v den +5 a +18 po dárce a mononukleámí buňky byly izolovány centrifugací sFicollovým grafientem (Lymphoprep, Pharmacia, Milwaukee, WI). Výsledky analýzy dárcovských lymfocytů v den +5 jsou uvedeny v tabulce 4. MNC z den +5 byly použity přímo pro přípravu RNA za použití postupu fenol-chloroform-guanidiniumisothiokyanat (Chomzynski, P. a Sacchi, N. Anal. Biochem. 162: 156, 1987). MNC ze dne +18 byly nejprve kultivovány po dobu 3 dnů v RPMI-1640 médiu (Seromed, Basel) obsahujícím 103 U/ml IL-2 (Sandoz Research Center, Vienna, Austria) a 10 pg/ml mitogenu z líčidla amerického (PWM; Sigma L9379, Busch, Switzerland) před extrakcí RNA.
Tabulka 4 - Imunofluorescenční analýza dárcovských lymfocytů v den +5 po i.v. dávce erytrocytů
| Buněčný povrchový antigen | % pozitivních buněk | Buněčný povrchový antigen | % pozitivních buněk |
| CD20 | 15 | CD8 | 12 |
| CD38 | 20 | CD25 | 7,6 |
| CD20/CD38 | 15 | CD57 | 12,5 |
| CD3 | 47 | CD14 | 6 |
| CD4 | 34 | HLA-DR | 18 |
b) Konstrukce knihovny
Byly konstruovány jednotlivé knihovny nazvané LD1 a LD2 (jak je podrobněji uvedeno výše) odpovídající buňkám odebraným v den +5 a +18 (dohromady +21 dní včetně +3 dní PWM stimulace) po i.v. dávce, v příslušném pořadí. Celková RNA byla potom připravena z těchto buněk za použití postupu fenol-chloroform-guanidiniumisothiokyanat. Z této RNA bylo 10 pg použito pro výrobu cDNA za použití oligo(dT) primerů (400 ng) a bylo reverzně transkribováno za použití M-MuLV reverzní transkriptasy podle návodu dodavatele (Boehringer Mannheim Germany). PCR amplifikace byla provedena podle postupu popsaného v Vogel, M. et al., E.J. of Immunol. 24: 1200, 1994. Stručně, 100 μΐ PCR reakce obsahovala Perkin-Elmer pufr s 10 mM MgCl2, 5 μΐ cDNA, 150 ng, každého vhodného 5' a 3' primerů, všechny čtyři dNTP - 200 μΜ každý a 2 U/ml Taq polymerázy (Perkin Elmer, NJ). PCR amplifikace těžkého a lehkého řetězce Fab molekuly byla provedena jednotlivě se sadou primerů od Stratacyte (podrobnosti jsou uvedeny dále). Pro těžký řetězec bylo použito šest „upstream“ primerů, které hybridizovaly s každou ze šesti rodin VH genů, zatímco primer pro jeden kappa a jeden lambda řetězec byl použit pro lehký řetězec. „Downstream“ primery byly navrženy tak, aby odpovídaly pantovému regionu konstantních domén τΐ a τ3 pro těžký řetězec. Pro lehký řetězec odpovídaly „downstream“ primery 3' konci kappa a lambda konstantních domén. PCR produkty těžkého a lehkého řetězce byly shromážděny odděleně, byly přečištěny na gelu a tráveny Xhol/Spel a Sacl/Xbal restirkčními enzymy (Boehringer Mannheim), v příslušném pořadí. Po trávení byly produkty PCR extrahovány jednou fenol: chloroform: isoamylalkoholem a přečištěny gelovou excisí. Inserce Xhol/Spel tráveného Fd fragmentu a následná ligace Sacl/Xbal tráveného řetězce do pComb3 vektoru, transformace do XLl-Blue buněk a produkce fágů byly provedeny podle postupu popsaného vBarbas ΠΙ, C.F. a Lemer, R.A. Companion Methods Enzymol. 2: 119, 1991).
Po transformaci XLl-Blue E. coli buněk byly odebrány vzorky a byly titrovány na plotnách pro určení velikosti knihovny. Tyto výsledky ukazují expresní knihovny o 5 χ 106 a 7,7 χ 106 cfu (kolonie tvořící jednotky) pro LD1 a LD2, v příslušném pořadí.
c) PCR primery
VHI 5'~CAC TCC CAG G I G CAG CTG CTC GAG TCT GG-3’
VHII 5-GTG CTG TCC CAG GTC AAC TTA CTC GAG TCT GG-3’
VH11I 5’-GTC CAG GTG GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3’
VH1V 5'-GTC CTG TCC CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3'
VHV 5’-GTC TGT GCC GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3’
VHVI 5’-GTC CTG TCA CAG GTA CAG CTG CTC GAG TCA GG-3’ CHI(gl) ϋ'-AGC ATC ACT AGT ACA AGA TTT GGG CTC3’
VL(k) 5’-GT GCG AGA TGT GAG CTC GTG ATG ACC CAG TCT CCA-3’
CL(k) ΰ’-T CCT TCT AGA TTA CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT
CTT TGT GAC GGG CGA ACT C-3‘
VL(I) 5’C TGC ACA GGG TCC TGG GCC GAG CTC GTG GTG ACT CA-3’ CL(l) 5’G CAT TCT AGA CTA TTA TGA ACA TTC TGT AGG GGC-3’
d) Vektory a bakteriální kmeny pComb3 vektory použitý pro klonování Fd a lehkého řetězce byl získán od Scripps Research Institute La Jolla, CA; Bambas ΠΙ, C.F. a Lemer, R.A. Companion Methods Enzymol. 2: 119,
-8CZ 296807 B6
1991). Escherichia coli kmen XLl-Blue použitý pro transformaci pComb3 vektoru a VCSM13 pomocný fág byly zakoupeny od Stratacyte (L Jolla, CA).
Příklad 2 - Selekce Rhesus D Phab z LD1 a LD2 knihoven na R1R1 erytrocytech.
a) Absorpce a biopanorámování
Série tří negativních absorpcí na erytrocytech skupiny 0 Rh negativní byly provedeny před každým kolem panorámování před pozitivní selekcí na erytrocytech skupiny 0 Rh pozitivní (R1R1). Čerstvé erytrocyty byly odebrány v ACD (kyselá citratová dextrosa) antikoagulačním činidlu a byly promyty 3 krát v 0,9% NaCl. Erytrocyty byly počítány vHayemsově roztoku a jejich počet byl upraven na 40 x 106/ml. Absorpce: 1 ml fágového přípravku v PBS/3% BSA byl přidán k peletě erytrocytů skupiny 0 Rh negativní (16 x 106 erytrocytů) ve 12 ml tubách (Greiner 187261, Reinach, Switzerland) a byla provedena inkubace při pokojové teplotě po dobu 30 minut s jemným třepáním. Všechny tuby byly předem blokovány v PBS/3% BSA po dobu minimálně 1 hodiny při pokojové teplotě. Erytrocyty byly peletovány centrifugací po dobu 5 minut při 300 x g při 4 °C. Vzniklý fágový supematant byl opatrně odebrán a proces byl opakován ještě dvakrát. Po konečné absorpci byl fágový supematant přidán k peletě erytrocytů skupiny 0 Rh pozitivní (16 x 106 erytrocytů) a znovu byla provedena inkubace při pokojové teplotě po dobu 30 minut s mírným třepáním. Potom byly erytrocyty promyty alespoň 5-krát v 10 ml ledově chladného PBS, byla provedena centrifugací při 300 x g po dobu 5 minut při 4 °C a potom následovala eluce s 200 pg 76 mM kyseliny citrónové pH 2,8 po dobu 6 minut při pokojové teplotě a neutralizace 200 μΐ 1 M Tris. Erytrocyty byly centrifugo vány při 300 x g po dobu 5 minut při 4 °C a vzniklý supematant obsahující eluované fágy byl pečlivě odebrán a skladován s proteinovým nosičem (0,3% BSA) při 4 °C připravený pro re-amplifikaci. Počet Rhesus D specifických Phab každého kola panorámování je uveden v tabulce 5.
Tabulka 5 - Selekce Rhesus D Phab z LD1 a LD2 knihoven na R1R1 erytrocytech
| Počet eluovaných Rhesus D specifických fágů | ||
| Panorámování kolo č.~ | Knihovna Dl cfu | Knihovna D2 cfu |
| 1 | 8 x 10s | 4,6 x 10’ |
| 2 | 6 x 10’ | 1,4 x 10’ |
| 3 | 1 x 108 | 7,9 X 10’ |
| 4 | 3 x 108 | 1,3 X 10a |
| 5 | 3 x 108 | 1 X 108 |
| 6 | nd | 2,8 X 108 |
a) Pro každé kolo bylo 1012 Phab inkubováno v tubách s erytrocyty skupiny 0 Rh negativní (absorpční fáze) a potom následovala eluce z erytrocytů skupiny 0 Rh pozitivní (R1R1).
nd = neprovedeno cfu = kolonie tvořící jednotky
Příklad 3 - selekce Rhesus D Phab ze souboru knihoven LD1 a LD2 na DVI+ erytrocytech
a) Absorpce na erytrocytech skupiny 0 Rh negativní, fenotypu 1 (r'r, Ccddee) a 2 (ryry, CCddEE)
Série čtyř negativních absorpcí na erytrocytech skupiny 0 Rh negativní byly provedeny pro každé kolo panorámování před pozitivní selekcí na erytrocytech skupiny 0 Rh DVI pozitivní. Negativní absorpce byly provedeny v následujícím pořadí: krok 1) fenotyp 1 ošetřený bromelasou; krok 2) fenotyp 1 neošetřený bromelasou; krok 3) fenotyp 2 ošetřený bromelasou; krok 4) fenotyp 2 neošetřený bromelasou. Zmražené erytrocyty se nechaly roztát ve směsi sorbitu a fosfátem pufrovaného salinického roztoku, nechaly se stát v tomto roztoku po dobu minimálně 10 minut a potom se promyly 5 až 6-krát ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku a nakonec se uskladnily ve stabilizačním roztok (DiaMed EC-roztok) připravené pro použití. Před panorámováním byly erytrocyty promyty 3-krát v 0,9% NaCl a potom následovalo počítání v Hayemově roztoku. Absorpce: 1 ml fágového přípravku v PBS/3%BSA byl přidán k peletě erytrocytů (2 x 108) stejně jako v kroku 1 ve 12 ml tubách (Greiner 187261, Reinech, Switzerland) a byla provedena inkubace při pokojové teplotě po dobu 30 minut s jemným třepáním. Všechny tuby byl předem blokovány v PBS/3%BSA po dobu minimálně 1 hodiny při pokojové teplotě. Erytrocyty byly peletovány centrifugací po dobu 5 minut při 300 x g při 4 °C. Vzniklý fágový supematant byl pečlivě odebrán a proces byl opakován za použití erytrocytů jak je podrobněji popsáno výše v krocích 2, 3 a 4.
b) Ošetření erytrocytů Rhesus D negativní ťr a ryry a Rhesus DVI+ bromelasou
Bromelasa 30 (Baxter, Dubingen, Switzerland) byla použita pro ošetření erytrocytů Rhesus DVI ve stejných poměrech, jako je používána v rutinním hemaglutinačním testu, tj. 10 μΐ bromelasy na 2 x 106 erytrocytů. Bromelasa byla přidána do požadovaného množství erytrocytů a byla inkubována při 37 °C po dobu 30 minut a potom následoval promytí 3-krát v 0,9% NaCl, opětovné počítání v Hayemově roztoku a upravení na požadovanou koncentraci v PBS/3% BSA a byly připraveny pro Phab panorámování.
c) Biopanorámování na bromelasou ošetřených Rhesus DVI+ erytrocytech
Po konečné absorpci na erytrocytech ryry neošetřených bromelasou byl fágový supematant rozdělen na dvě stejné části a byl přidán buď k enzymem ošetřené, nebo enzymem neošetřené peletě erytrocytů skupiny 0 Rh DVI+ (40 x 106), v příslušném pořadí, a byla znovu provedena inkubace při pokojové teplotě po dobu 30 minut s jemným třepáním. Potom byly dvě populace erytrocytů promyty alespoň 5-krát v 10 ml ledově chladného PBS, byla provedena centrifugace při 300 x g po dobu 5 minut při 4 °C a potom následovala eluce s 200 μΐ 76 mM kyseliny citrónové pH 2,8 po dobu 6 minut při pokojové teplotě a neutralizace 200 μΐ 1 M Tris. Erytrocyty byly centrifugovány při 300 x g po dobu 5 minut při 4 °C a vzniklý supematant obsahující eluované fágy z bromelasou ošetřených a bromelasou neošetřených DVI+ erytrocytů byl pečlivě odebrán a skladován s proteinovým nosičem (0,3% BSA) při 4 °C připravený pro re-amplifikaci. V dalších kolech panorámování byly eluované fágy z bromelasou ošetřených a neošetřených DVI+ erytrocytů uchovávány odděleně a po každém následovaly kroky 1 až 4 absorpčního protokolu. Krok eluce byl mírně odlišný ve srovnání s kolem 1 panorámování, protože fágové populace nebyla znovu rozděleny na dvě části. Pouze ty fágy, které byly eluovány z bromelasou ošetřených DVI+ erytrocytů byly také znova eluovány z bromelasou ošetřených DVI+ erytrocytů a pouze ty fágy, které byly eluovány z bromelasou neošetřených DVI+ erytrocytů byly také znova eluovány z bromelasou neošetřených DVI+ erytrocytů. Počet Rhesus D specifických Phab každého kola panorámování je uveden v tabulce 6.
-10CZ 296807 B6
Tabulka 6 - Selekce Rhesus D Phab ze souboru LD1 a LD2 knihoven na Rhesus DVI+ erytrocytech
| Počet eluovaných DVI+ | specifickýcl | i fágů | |
| Panorámování | - bromelasa | + bromelasa | |
| kolo č.~ | cfu | cfu | |
| 1 | 1,9 x 10s | 4,4 x | 10e |
| 2 | 1,6 x 10e | 4 x | 10s |
| 3 | 2,4 x 107 | 4,1 x | 107 |
| 4 | 3 x 10e | 5 X | 10’ |
| 5 | 1 x 10a | 1 X | 10® |
| 6 | nd | 3 x | 108 |
a) Pro každé kolo bylo 1012 Phab inkubováno v tubách se 2 různými fenotypy erytrocytů skupiny 0 Rh negativní (absorpční fáze) a potom následovala eluce z erytrocytů skupiny 0 Rh DVI+.
Příklad 4 - Monitorování kol panorámování a určení specifícity obohacený Phab za použití králičí anti-fágové protilátky
Nepřímý hemaglutinační test
Čerstvě odebrané erytrocyty různých ABO a Rhesus krevních skupin byly promyty 3-krát v 0,9% NaCl a byly upraveny na 3 až 5% roztok (45 až 50 x 107/ml) buď v 0,9% NaCl, nebo vPBS/3%BSA. Pro každé testovací podmínky bylo 50 μΐ erytrocytů a 100 μΐ testované vzorky (vysrážený a amplifikovaný fág nebo kontrolní protilátky) inkubováno společně ve skleněných trubičkách pro určování krevních skupin (Baxter, Dudingen, Switzerland) po dobu 30 minut při 37 °C. Erytrocyty byly promyty 3-krát v 0,9% NaCl a potom byly inkubovány se dvěma kapkami Coomsova činidla (Baxter, Dudinten, Switzerland) pro pozitivní kontrolu nebo se 100 μΐ králičích anti-fágových protilátek (vyrobených imunizací králíků přípravkem fágu VCSM13 a potom přečištěním na Affí-Gel Blue koloně a absorpcí na E. coli specifických protilátek) ředěných 1/1000. Tuby byly inkubovány po dobu 20 minut při 37 °C, centrifugovány po dobu 1 minuty při 125 xg a erytrocyty byly vyšetřovány na aglutinaci pečlivým protřepáním a za použití lupy.
Při testování přečištěných Fab na aglutinaci byla afinitně přečištěna anti-Fab protilátka (The Binding Site, Birmingham, U.K.) použita místo králičí anti-fágové protilátky.
Tabulka 7 ukazuje výsledky hemaglutinačních testů Phab vzorků po různých kolech panorámování na R1R1 erytrocytech.
Tabulka 8 ukazuje výsledky hemaglutinačních testů Phab vzorků po různých kolech panorámování na Rhesus DVI1+ erytrocytech.
Tabulka 9 ukazuje charakter reaktivity jednotlivých Fab klonů z knihoven LD1 a LD s částečnými D variantami
-11 CZ 296807 B6
Tabulka 7 - Monitorování Phab zLDl a LD knihoven nepřímo hemaglutinací po panorámování na R1R1 erytrocytech
| Phab vzorek kolo panorámování | Knihovna LD1 testováno na | Knihovna LD2 erytrocytech 0 Rh D+ <a> |
| č. 4 | ||
| neředěný | + | + |
| 1/4 | + | ± |
| 1/20 | - | - |
| Č. 5 | ||
| neředěný | + | |
| 1/4 | ++ | + |
| 1/20 | - | |
| č. 6 | ||
| neředěný | nd | + + + |
| 1/4 | nd | + + |
| 1/20 | nd | nd |
| Pomocný fág ’ | ||
| neředěný, 1/4, 1/20 | - | - |
nepřímá hemaglutinace byla provedena ve skleněných trubičkách za použití 50 μΐ erytrocytů (40 x 107/ml) a 100 μΐ Phab s počátkem při 4 x 10n/ml. Po 30 minutách při 37 °C byly erytrocyty promyty 3-krát a byly dále inkubovány po dobu 20 minut při 37 °C s králičí anti-fágovou protilátkou při ředění 1/1000.
b) Aglutinace byla hodnocena vizuálně od +++ (silná aglutinace) do - (žádná aglutinace) . nd = neprovedeno
-12CZ 296807 B6
Tabulka 8- Monitorování Phab ze souboru LD1 a LD knihoven nepřímou hemaglutinací po panorámování na Rhesus DVI+ erytrocytech
Phab vzorek fenotypy erytrocytů
Kolo panorámování
| CCDDee ccddee | Ccddee | CCddEE | DVI (E. J.) | i DVI(K.S.) | |
| Bromelasou | neošetřené | ||||
| erytrocyty | DVI+ | ||||
| Kolo č. 3 | &)+++ | ± | ( + ) | ± | + |
| Kolo č. 5 | + + | - | - | - | - |
| Bromelasou | ošetřené | ||||
| erytrocyty | DVI + | ||||
| Kolo č. 4 | ++ + | ± | - | (+) | + |
| Kolo č. 5 | + + + | + | ± | (+++) | + + |
| Kolo č. 6 | + +++ | - | - | + + + | 4-4- + |
| LD1-6-17 | |||||
| LD1/2-6-3 | + + + + — | - | - | ± | nd |
| LD1/2-6-33 | + + + + | - | - | 4- | nd |
a) Aglutinace byla hodnocena vizuálně od +++ (silná aglutinace) do - (žádná aglutinace) . nd = 5 neprovedeno.
Povšimněte si: Pouze ty Phab, které byly eluovány zbromelasou ošetřených DVI+ erytrocytů vykazovaly známky aglutinace proti 2 různých DVI+ dárcům.
-13 CZ 296807 B6
Tabulka 9 - Klonování analýzy reaktivita Fab anti-Rehesus D klonů z knihoven Dia LD2 pro částečným D variantám
| <a*5 Fab klon | č. | Částečné D varianty | DVII | ||||||
| Rh33 | DIII | DIVa | DIVb | DVa | DVI | ||||
| LD1 - | 40 | - | +++ | 4- | + | ± | - | + + | |
| - | 52 | - | + 4- + | - | - | ++ + | - | + + + | |
| - | 84 | - | 4-4- | - | - | - | - | + | |
| - | 110 | ( + ) | 4-4-4· | + 4- | + | + | - | + + | |
| - | 117 | - | + + + | - | - | - | - | ++ | |
| LD2 - | 1 | +++ | nd | 4-4-4- | + + + | + | - | + + + | |
| - | 4 | - | ++ + | - | + | - | - | + | |
| - | 5 | - | nd | +++ | +++ | - | - | +++ | |
| - | 10 | (-) | 4-4-4- | 4-4-4- | ++ + | + | - | + + | |
| - | 11 | - | ++ + | - | - | - | - | ++ | |
| - | 14 | +++ | 4-4-4- | + 4-4- | + + + | ++ + | - | + + + | |
| - | 17 | - | +++ | +++ | + | + | - | +++ | |
| - | 20 | - | + + + | + + + | - | ± | - | +++ | |
| LD1/2 | - 6 - | 3 | + + | +++ | + 4 + | + + | ++ + | + | ++ |
| LD1/2 | - 6 - | 33 | + | + + + | + + + | + + | + + + | + | ++ |
a) solubilní Fab přípravky byly vyrobeny z každého klonu a následovala nepřímá hemaglutinace b) Aglutinace byla hodnocena vizuálním hodnocením od +++ (všechny buňky aglutinovány ve shluku) do - (žádné buňky nejsou aglutinovány)
Příklad 5 - Příprava a přečištění Fab fragmentů protilátky pro použití jako diagnostická činidla
Po postupech biopanorámování podrobně popsaných v příkladech 2 a 3 byla fágová populace, která vykazovala specifickou aglutinaci na Rhesus D+ erytrocytech selektována a byla použita pro přípravu fagemidové DNA. Přesněji, Phab selektované na R1R1 erytrocytech byly použity po 5. a 6. kole biopanorámování pro LD1 a LD knihovny, v příslušném pořadí, a po 5. kole biopanorámování na DVI+ erytrocytech pro izolaci klonu LD 1-6-17. Pro produkci solubilního Fab musí být sekvence glll kódující plil koncový protein na fágové částici deletována.
Fagemidová DNA byla připravena za použití Nucleotrap kitu (Machery-Nagel) a glll sekvence byla odstraněna trávením takto izolované fagemidové DNA Nhel/Spel jak je popsáno (Burton, D.R. et al., PNAS, 1989). Po transformaci do XL-1 Blue byly jednotlivé klony selektovány (nomenklatura je uvedena v tabulce 1) a kultivovány v LB (Luna Broth) obsahujícím 50 pg/ml karbencilinu při 37 °C do OD 0,6 při 600 nm. Kultury byly inkubovány 2 mM isopropyl β-Dthiogalaktopyranosidu (IPTG) (Biofínex, Praroman, Switzerland) a byly kultivovány přes noc při 37 °C. Celá kultura byla centrifugována při 10 000 x g po dobu 30 minut při 4 °C pro peletování bakterií. Bakteriální peleta byla ošetřena roztokem lysozym/DNAsa pro uvolnění Fab fragmentů uvnitř buněk. Protože některé Fab fragmenty byly uvolněny do supernatantu kultury, byl super
-14CZ 296807 B6 natant odebrán zvlášť. Tyto Fab přípravky byly potom shromážděny a vysráženy 60% síranem amonným (Měrek, Darmstadt, Germany) pro koncentrování Fab a potom následovala extensivní dialýza ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) a ultracentrifugace při 200 000 x g pro peletování jakýchkoliv nerozpustných komplexů. Fab přípravky byly potom přečištěny na keramické hydroxyapatitové koloně (HTP Econo cartridge, BioRad, Glattbrugg, Switzerland) za použití gradientově eluce PBS (pufr A) a PBS + 0,5 M NaCl (Pufr B). Lineární gradient byl programován na růst od 0 do 100 % pufru B ve 40 min. Fab byl eluován jako jediný pík mezi 40 až 60 % pufru B. Pozitivní frakce, jako byly identifikovány „imunodot“ testem za použití konjugátu anti-Fab peroxidasa (The Binding Site, Birmingham, U.K.) byly shromážděny, koncentrovány za použití polyethylenglykolu a extensivně dialyzovány proti PBS. Pozitivní frakce z hydroxyapatitové kolony pro každý klon byly použity v klasickém nepřímém hemaglutinačním testu ve skleněných trubičkách za použití buď standardního Coombsova činidla (Baxter Diagnostice AG Dade, anti-lidské sérum), nebo anti-Fab (The Binding Site, Birmingham, U.K.) jako činidla pro zkříženou vazbu. Tyto Fab definované specificity k částečným D variantám jak je ukázána na str. 25 mohou být použity pro typizaci erytrocytů neznámého částečného D fenotypu.
Příklad 6 - Konstrukce kompletních imunoglobulinových genů
V gen LD2-14 pro těžký řetězec (VH gen) byl amplifikován z anti-Rhesus D-Fab-kódujícího plazmidu LD2-14 za použití polymerázové řetězové reakce (PCR) se specifickými primery.
5'-primer měl sekvenci:
5’-GGGTCGACGCACAGGTGAAACTGCTCGAGTCTGG-3’, zatímco 3' - primer měl sekvenci:
5’-GCCGATGTGTAAGGTGACCGTGGTCCCCTTG-3’.
PCR reakce byla proveden s Deep Vent DNA polymerázou a pufrovacím roztokem (2 mM Mg++) od New England Biolabs za podmínek doporučených výrobcem včetně 100 pmol každého primeru a čtyřech deoxynukleotidů v koncentraci 250 μΜ každý. Reakce byla provedena při 30 cyklech s následujícími teplotními kroky: 60 s při 94 °C (prodlouženo o 2 minuty v průběhu prvního cyklu), 60 s při 57 °C a 60 s při 72 °C (prodlouženo o 10 minut v průběhu posledního cyklu). Postamplifikační adice 3' A-přesahujících konců byla provedena následnou inkubací po dobu 10 minut při 72 °C za přítomnosti 1 jednotky Taq DNA polymerázy (Boehringer Mannheim, Germany). PCR produkt byl přečištěn za použití QIAquick PCR purifikačního kitu (Qiagen, Switzerland) a byl klonován do vektoru pCRII za použití klonovacího kitu od Invitrogen (San Diego, USA). Po trávení vzniklého plazmidu TAVH14 Sall a BstEII byl izolován VH gen za použití preparativní agarosové gelové elektroforesy za použití QIAquick gel extraction kitu od Qiagen.
Vektor č. 50 (Sandoz Pharma, Basel), který obsahoval irelevantní, ale intaktní lidský genomový imunoglobulinový VH gen, byl tráven Sall a BstEII a vektorový fragment byl izolován preparativní agarosovou gelovou elektroforesou za použití QIAquick gel extraction kitu od Qiagen. Ligace vektoru a PCR produktu byla provedena při 25 °C po dobu 2 hodin v celkovém objemu 20 μΐ za použití rychlého DNA Ligation kitu (Boehringer Mannheim, Germany). Po ligaci byla reakční směs ředěna 20 μΐ H2O a extrahována 10 objemy n-butanolu pro odstranění solí. DNA byla potom peletována centrifugací, sušena ve vakuu a resuspendována v 10 μΐ H2O. 5 μΐ tohoto DNA roztoku bylo elektroporováno (0,1 cm kyvety, 1,9 kV, 200 Ω, 25 pFD) za použití GenePulser (BioRad, Gaithersburg) do 40 μΐ pro elektroporaci kompetentních E. coli XL-lblue MRF' (Stratagene, La Jolla), bylo provedeno ředění v SOC médiu, inkubace při 37 °C po dobu 1 hodiny a buňky byly umístěny na LB plotny obsahující ampicilin (50 pg/ml). Plazmidové mini
-15CZ 296807 B6 přípravky (Qiagen, Basel) vzniklých kolonií byly ověřeny restrikčními tráveními na přítomnosti požadovaného insertu.
Při tomto postupu byl irelevantní původní VH gen ve vektoru č. 150 nahrazen amplifíkovanou anti-Rhesus D VH sekvencí LD2-14 a byl získán plazmid cassVH14. Struktura vzniklého imunoglobulinového VH genového konstruktu byla potvrzena sekvencováním, byl rozstřižen trávením EcoRI a BamHI a přečištěn na gelu jak je popsáno výše. Expresní vektor č. 10 (Sandoz Pharma, Basel) obsahující lidský genomový imunoglobulinový Cxl genový segment, byl také tráven EcoRI a BamHI, izolován preparativní agarosovou gelovou elektroforesou, ligován s EcoRI/BamHI-Vn genovým segmentem předem získaným z plazmidu cassVH14 a elektroporován do E. coli XLl-Blue MRF' jak bylo popsáno výše. Toto vedlo ke vzniku genu pro kompletní těžký řetězec anti-Rhesus D imunoglobulinu v expresním vektoru 14IgGl (obrázek a).
V gen LD2-14 pro lehký řetězec (VL gen) byl amplifikován ze stejného anti-Rhesus D-Fab plazmidu LD2-14 PCR se specifickými primery. 5'-primer měl sekvenci:
5'-TACGCGTTGTGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAT-3', zatímco 3' - primer měl sekvenci:
5'-AGTCGCTCAGTTCGTTTGATTTCAAGCTTGGTCC-3'.
PCR reakce, přečištění produktu a následující kroky klonování byly analogické s kroky popsanými pro VH gen s tou výjimkou, že byly použity vhodné vektory pro lehlý řetězec. Stručně, VL PCR produkt byl klonován do pCRH vektoru za vzniku plazmidu TAVL14, byl z něj excidován za použití Mlul a HindlII a byl izolován gelovou extrakcí. VL gen byl potom klonován do Mlul a HindlII míst vektoru č. 151 (Sandoz Pharma, Basel) a tak nahradil irelevantní původní VL gen amplifíkovanou anti-Rhesus D VL sekvencí LD2-14. Po potvrzení sekvence vzniklého plazmidu cassVL-14 byl EcoRI/Xbal fragment obsahující VL gen potom subklonován do restrikčních míst EcoRI a Xbal vektoru č. 98 (Sandoz Pharma, Basel), který obsahuje lidský genomový genový segment pro imunoglobulin CK. Tento postup nahrazuje irelevantní původní VL gen v plazmidu č. 98 a je získán expresní vektor 14 kappa, který obsahuje gen pro kompletní lehlý řetězec antiRhesus D imunoglobulinu.
Myší myelomová buněčná linie SP2/0-Ag 17 (ATCC CRL 1581) byla současně transfektována expresními vektory 14IgGl a 14 kappa předem linearizovaných v jedinečných EcoRI a Notl restrikčních místech, v příslušném pořadí. Elektroporace byla provedena následujícím způsobem: exponenciálně rostoucí buňky byly dvakrát promyty a suspendovány ve fosfátem pufrované sacharóze (272 mM sacharózy, 1 mM mgCl2, 7 mM NaH2PO4, pH 7,4) v hustotě 2 x 107 buněk na ml. 0,8 ml buněk bylo přidáno do 0,4 cm kyvet, smíseno s 15 pg linearizovaných plazmidů 14IgGl a 14 kappa, ponecháno na ledu po dobu 15 minut, elektroporováno za s 290 V, 200 Ω, 25 pFD, umístěno zpět na led na dobu 15 minut, přeneseno do buněčné kultivační nádoby T75 s20ml chladného RPMI 1640 média (10% teplem inaktivované fetální hovězí sérum, 50 pM beta-merkaptoethanolu), ponecháno po dobu 2 hodin při pokojové teplotě a potom inkubováno po dobu 60 hodin při 37 °C. Po této době byly buňky přeneseny do 50 ml media obsahujícího 1 mg/ml G418 pro selekci. Stabilní transfektanty byly potom selektovány za přítomnosti zvyšujících se koncentrací metotrexatu pro amplifíkaci integrované DNA a tak zvýšení exprese odpovídající protilátky rD2-14.
Exprese rD2-14 vsupematantu kultury (SrD2-14) byla sledována enzymově vázaným imunosorbentním testem (ELISA) specifickým pro lidské τΐ a kappa řetězce. Kvantifikace Rhesus D specifických imunoglobulinů v anti-D testu podle Ph. Eur. ukázala mezi 1,1 až 11,4 pg/ml aglutinační protilátky v takových supematentech. Byly testovány jako aglutinaci negativní pro Rhesus
-16CZ 296807 B6 negativní erytrocyty a vykazovaly stejný aglutinační potenciál proti částečným D variantám jako
Fab LD2-14 exprivované v E. coli. Data jsou ukázána v tabulce 10.
Tabulka 10- Srovnávací analýza reaktivity Fab anti-Rhesus D klonu LD2-14 a protilátky rD2-14 proti částečným D variantám
| Částečné D varianty | ||||||||
| R1R1 | rr | Rh33 | DUI | DIVa | DIVb | DVa DVI | DVII | |
| LD2-14 | + + + | - | + + + | 4 + + | 4· + + | + + + | +++ | +++ |
| SÍD2-14 | ++ + | - | + 4 + | + + + | + + + | +++ | +-Í + | ++ + |
| TCB | - | - |
Aglutinace byla hodnocena vizuálním hodnocením od +++ (všechny buňky aglutinovány ve shluku) do - (žádné buňky nejsou aglutinovány).
LD2-14: Fab fragment připravený jak je popsáno v příkladu 5;
SrD2-14: supematant buněčné kultury obsahující protilátku rD2-14;
TCB: supematant buněčné kultury netransfektovaných buněk.
-17CZ 296807 B6
1. Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus
D antigeny, které obsahují Rhesus D-specifické CDR1, CDR2 a CDR3 regiony párů aminokyselinových sekvencí VH a VL se stejnými nebo odlišnými identifikačními čísly podle obrázků v tabulce uvedené dále:
PATENTOVÉ NÁROKY
| vH | vL | |
| Identifikační číslo | Obr. CDR1 CDR2 CDR3 páry páry páry bází č. ba'zí č. bází č. | Obr. CDR1 CDR2 CDR3 páry páry páry bází č. bází č. bází č. |
| LD1-40 | Obr.la 91-105 148-198 295-342 | Obr.lb 64-96 142-162 259-288 |
| LD1-52 | Obr.2a 91-105 148-198 295-342 | Obr.2b 64-96 142-162 259-288 |
| LD1-84 | Obr.3a 91-105 148-198 295-342 | Obr.3b 64-96 142-162 259-285 |
| LD1-110 | Obr.4a 91-105 148-198 295-342 | Obr.4b 64-96 142-162 259-285 |
| LD1-117 | Obr.Sa 91-105 148-198 295-345 | Obr.5b 64-96 142-162 259-288 |
| LD2-1 | Obr.6a 91-105 148-198 295-342 | Obr.6b 64-99 142-165 262-294 |
| LD2-4 | Obr.7a 91-105 148-198 295-342 | Obr.7b 64-96 142-162 259-282 |
| LD2-5 | Obr.8a 91-105 148-198 295-342 | Obr.8b 64-96 142-162 259-288 |
| LD2-10 | Obr.9a 91-105 148-198 298-345 | Obr.9b 61-102 148-168 265-294 |
| LD2-11 | Obr.lOa 91-105 148-198 295-342 | Obr. 10b 64-96 142-162 259-285 |
| LD2-14 | Obr.11a 91-105 148-198 295-342 | Obr. 11b 64-96 142-162 259-285 |
| LD2-17 | Obr.12a 91-105 148-198 295-342 | Obr.12b 64-96 142-162 259-285 |
| LD2-20 | Obr.13a 91-105 148-198 295-342 | Obr. 13b 64-96 142-162 259-285 |
| LD1-6-17 | Obr.14a 91-105 148-198 295-351 | Obr. 14b 64-96 142-162 259-285 |
| LD1/2-6-3 | Obr.15a 91-105 148-198 295-342 | Obr. 15b 64-96 142-162 259-285 |
| LD 1/2-6- 33 | Obr.16a 91-105 148-198 295-342 | Obr.16b 64-96 142-162 259-285 |
Claims (19)
- PATENTOVÉ NÁROKY
vH vL Identifikační číslo Obr. CDR1 CDR2 CDR3 páry páry páry bází č. ba'zí č. bází č. Obr. CDR1 CDR2 CDR3 páry páry páry bází č. bází č. bází č. LD1-40 Obr.la 91-105 148-198 295-342 Obr.lb 64-96 142-162 259-288 LD1-52 Obr.2a 91-105 148-198 295-342 Obr.2b 64-96 142-162 259-288 LD1-84 Obr.3a 91-105 148-198 295-342 Obr.3b 64-96 142-162 259-285 LD1-110 Obr.4a 91-105 148-198 295-342 Obr.4b 64-96 142-162 259-285 LD1-117 Obr.Sa 91-105 148-198 295-345 Obr.5b 64-96 142-162 259-288 LD2-1 Obr.6a 91-105 148-198 295-342 Obr.6b 64-99 142-165 262-294 LD2-4 Obr.7a 91-105 148-198 295-342 Obr.7b 64-96 142-162 259-282 LD2-5 Obr.8a 91-105 148-198 295-342 Obr.8b 64-96 142-162 259-288 LD2-10 Obr.9a 91-105 148-198 298-345 Obr.9b 61-102 148-168 265-294 LD2-11 Obr.lOa 91-105 148-198 295-342 Obr. 10b 64-96 142-162 259-285 LD2-14 Obr.11a 91-105 148-198 295-342 Obr. 11b 64-96 142-162 259-285 LD2-17 Obr.12a 91-105 148-198 295-342 Obr.12b 64-96 142-162 259-285 LD2-20 Obr.13a 91-105 148-198 295-342 Obr. 13b 64-96 142-162 259-285 LD1-6-17 Obr.14a 91-105 148-198 295-351 Obr. 14b 64-96 142-162 259-285 LD1/2-6-3 Obr.15a 91-105 148-198 295-342 Obr. 15b 64-96 142-162 259-285 LD 1/2-6- 33 Obr.16a 91-105 148-198 295-342 Obr.16b 64-96 142-162 259-285 - 2. Polypeptidy podle nároku 1, které obsahují Rhesus D-specifické CDR1, CDR2 a CDR310 regiony párů aminokyselinových sekvencí VH a VL se stejnými identifikačními čísly podle obrázků uvedených v tabulce podle nároku 1.
- 3. Polypeptidy podle nároku 1, které obsahují regiony s aminokyselinovými sekvencemi VH a VL a mají identifikační čísla podle obrázků uvedených v tabulce podle nároku 1.
- 4. Polypeptidy podle nároků 1, 2 nebo 3, které jsou Fab fragmenty vážící antigen.-18 CZ 296807 B6
- 5. Polypeptidy podle nároků 1, 2 nebo 3 obsahující těžké a lehké imunoglobulinové řetězce schopné tvorby kompletních anti-Rhesus D protilátek.5
- 6. DNA sekvence kódující polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specifícitou pro Rhesus D antigeny, které obsahují regiony s Rhesus D-specifickými CDR1, CDR2 a CDR3 segmenty párů DNA sekvencí VH a VL se stejnými nebo odlišnými identifikačními čísly podle obrázků uvedených v tabulce uvedené dále:
vH vL Identifikační číslo Obr. CDR1 CDR2 CDR3 páry páry páry baží č. bází č. bází č. Obr. CDR1 CDR2 CDR3 páry páry páry bází č. baží č. bází č. LD1-40 Obr.la 91-105 148-198 295-342 Obr.lb 64-96 142-162 259-288 LD1-52 Obr.2a 91-105 148-198 295-342 Obr.2b 64-96 142-162 259-288 LD1-84 Obr.3a 91-105 148-198 295-342 Obr.3b 64-96 142-162 259-285 LD1-110 Obr.4a 91-105 148-198 295-342 Obr.4b 64-96 142-162 259-285 LD1-117 Obr.5a 91 -105 148-198 295-345 Obr.5b 64-96 142-162 259-288 LD2-1 Obr.óa 91-105 148-198 295-342 Obr.6b 64-99 142-165 262-294 LD2-4 Obr.7a 91-105 148-198 295-342 Obr.7b 64-96 142-162 259-282 LD2-5 Obr.8a 91-105 148-198 295-342 Obr.8b 64-96 142-162 259-288 LD2-10 Obr.9a 91-105 148-198 298-345 Obr.9b 61-102 148-168 265-294 LD2-11 Obr.lOa 91-105 148-198 295-342 Obr. 10b 64-96 142-162 259-285 LD2-14 Obr.lla91-105 148-198 295-342 Obr.llb 64-96 142-162 259-285 LD2-17 Obr.l2a91-105 148-198 295-342 Obr.l2b 64-96 142-162 259-285 LD2-20 Obr.l3a91-105 148-198 295-342 Obr. 13b 64-96 142-162 259-285 LD1-6-17 Obr.l4a91-105 148-198 295-351 Obr.l4b 64-96 142-162 259-285 LD 1/2-6-3 Obr.l5a 91-105 148-198 295-342 Obr. 15b 64-96 142-162 259-285 LD1/2- -6-33 Obr. 16a 91-105 148-198 295-342 Obr. 16b 64-96 142-162 259-285 - 7. DNA sekvence podle nároku 6 kódující polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, které obsahují regiony s Rhesus D-specifickými CDR1, CDR2 a CDR3 segmenty párů DNA sekvencí VH a VL se stejnými identifikačními čísly podle obrázků uvedených v nároku 6.
- 8. DNA sekvence podle nároku 6 nebo 7, které obsahují regiony s DNA sekvencemi VH a VL s identifikačními čísly podle obrázků uvedených v nároku 6.-19CZ 296807 B6
- 9. DNA sekvence podle nároků 6, 7 nebo 8 kódující polypeptidy schopné tvorby Fab fragmentů vážících antigen.
- 10. DNA sekvence podle nároků 6, 7 nebo 8 kódující polypeptidy schopné tvorby kompletních anti-Rhesus D protilátek.
- 11. Způsob pro selekci rekombinantních polypeptidů schopných tvorby vazebných struktur pro antigen se specifitou pro Rhesus D antigeny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 a zejména vykazujících reaktivitu s částečnými Rhesus DVI variantami a bez známek reaktivity s erytrocyty Rhesus negativního fenotypu, zejména bez reaktivity proti Rhesus alelám C, c, E, a e, vy znáčů j í c í se tím, že:a) se provede několik negativních absorpcí na následujících erytrocytech: fenotyp 1 (r'r, Ccddee) ošetřený bromelasou, fenotyp 1 neošetřený bromelasou, fenotyp 2 (ryry, CCddEE) ošetřený bromelasou a fenotyp 2 neošetřený bromelasou,b) se provede pozitivní absorpce na DVI+ erytrocytech s nebo bez ošetření bromelasou,c) se určí titr fágu vážícího se na DVI+ erytrocyty,d) se opakuje krok a), b) a c), dokud titr fágu vážícího se na DVI+ erytrocyty nedosáhne uspokojivé hladiny.
- 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že se jako rekombinantní polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen použijí Fab fragmenty.-20CZ 296807 B6
- 13. Anti-Rhesus D protilátky mající variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce obsahujícíRhesus D-specifické CDR1, CDR2 a CDR3 sekvence párů aminokyselinových sekvencí VH a VL mající stejná nebo odlišná identifikační čísla podle tabulky uvedené dále:
VH vL Identifikační číslo Obr. CDR1 CDR2 CDR3 páry páry páry bází č. bází č. bází č. Obr. CDR1 CDR2 CDR3 páry páry páry bází č. bází č. bází č. LD1-40 Obr. 1a 91-105 148-198 295-342 Obr.lb 64-96 142-162 259-288 LD1-52 Obr.2a 91-105 148-198 295-342 Obr.2b 64-96 142-162 259-288 LD1-84 Obr.3a 91-105148-198 295-342 Obr.3b 64-96 142-162 259-285 LD1-110 Obr.4a 91-105 148-198 295-342 Obr.4b 64-96 142-162 259-285 LD1-117 Obr.5a 91-105 148-198 295-345 Obr.5b 64-96 142-162 259-288 LD2-1 Obr.6a 91-105 148-198 295-342 Obr.6b 64-99 142-165 262-294 LD2-4 Obr.7a 91-105 148-198 295-342 Obr.7b 64-96 142-162 259-282 LD2-5 Obr.8a 91-105 148-198 295-342 Obr.8b 64-96 142-162 259-288 LD2-10 Obr.9a 91-105 148-198 298-345 Obr.9b 61-102 148-168 265-294 LD2-11 Obr.lOa 91-105 148-198 295-342 Obr. 10b 64-96 142-162 259-285 LD2-14 Obr.11a 91-105 148-198 295-342 Obr.11b 64-96 142-162 259-285 LD2-17 Obr. 12a 91-105 148-198 295-342 Obr. 12b 64-96 142-162 259-285 LD2-20 Obr.13a 91-105 148-198 295-342 Obr. 13b 64-96 142-162 259-285 LD1-6-17 Obr.14a 91-105 148-198 295-351 Obr. 14b 64-96 142-162 259-285 LD1/2-6-3 Obr.15a 91-105 148-198 295-342 Obr. 15b 64-96 142-162 259-285 LD1/2- -6-33 Obr.16a 91-105 148-198 295-342 Obr.16b 64-96 142-162 259-285 5 - 14. Anti-Rhesus D protilátky mající variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce obsahujícíRhesus D-specifícké CDR1, CDR2 a CDR3 sekvence párů aminokyselinových sekvencí VH a V] mající stejná identifikační čísla podle tabulky uvedené v nároku 13.
- 15. Anti-Rhesus D protilátky podle nároku 13 nebo 14, které obsahují páry aminokyselinových ío sekvencí VH a VL mající identifikační čísla podle obrázků, jak jsou uvedeny v tabulce v nároku 13.
- 16. Anti-Rhesus D protilátky podle nároků 13, 14 nebo 15, kde jsou imunoglobulinové konstantní regiony alespoň jeden z definovaných izotypů IgGl, IgG2, IgG3 nebo IgG4.-21 CZ 296807 B6
- 17. Způsob pro přípravu kompletních anti-Rhesus D protilátek podle jakéhokoliv z nároků 13 až 16, vy z n a č u j í c í se tím, že:a) se odděleně amplifikují členy páru V genového segmentu těžkého řetězce a V genového segmentu lehkého řetězce obsahující Rhesus D-specifické CDR1, CDR2 a CDR3 regiony jak jsou znázorněny na obr. la - 16a a lb - 16b, v příslušném pořadí, z anti-Rhesus D-Fab-kódujícího plazmidů pomocí polymerázové řetězové reakce se specifickýmiprimery,b) se odděleně připraví geny pro kompletní těžký řetězec anti-Rhesus D imunoglobulinu a pro kompletní lehký řetězec anti-Rhesus D imunoglobulinu ve vhodných plazmidech obsahujících genové segmenty pro konstantní region imunoglobulinu kódující jeden z lidských 1, 2, 3 a 4 těžkých řetězců a pro lidský kappa nebo lambda lehký řetězec a transformaci získaných plazmidů jednotlivě ve vhodných bakteriích E. coli, ac) se současně transfekují získané plazmidy do vhodných eukaryotických hostitelských buněk, buňky se kultivují, separují se netransformované buňky, kultury se klonují, selektují se nejlépe produkující klon, použije se jako produkční kultury a izolují se kompletní protilátky ze supematantu buněčné kultury.
- 18. Farmaceutický prostředek pro profylaxi hemolytické choroby novorozenců, pro léčbu idiopatické trombocytopenické purpury a chybné transfuze Rhesus inkompatibilní krve, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden polypeptid podle nároků 1, 2 nebo 3 nebo alespoň jeden anti-Rhesus D protilátku podle jakéhokoliv z nároků 13 až 16.
- 19. Diagnostický prostředek pro Rhesus D typizaci, vyznačující se tím, že obsahuje Fab fragmenty podle nároku 4 nebo anti-Rhesus D protilátky podle jakéhokoliv z nároků 13 až 16.70 sekvencí +34 výkresů-22CZ 296807 B6Seznam sekvencí (1) Obecné informace:(i) Přihlašovatel:(A) Jméno: Rotkreuzstif tung ZentrallaboratoriumBlutspeňdedienst (B) Ulice: Wankdorfstrasse 10 (C) Město-. Bern 22 (E) Stát: Švýcarsko (F) Poštovní kod (ZIP): CB-3000 (ii) Název vynálezu: Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, DNA kódující takové polypeptidy a způsob pro jejich přípravu a použití (iii) Počet sekvencí: 64 (iv) Počítačová čtecí forma:(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30 (EPO) (v) Údaje o současné přihlášce:(A) Číslo přihlášky: PCT/EP97/03253 (vi) Předchozí data přihlášky:(A) Číslo přihlášky: EP 96810421.6 (B) Datum podání: 24.6.1996 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:(i) Charakteristiky sekyence:(A) Délka: 375 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Ne (iv) Antisense: Ne
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96810421 | 1996-06-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ395998A3 CZ395998A3 (cs) | 1999-05-12 |
| CZ296807B6 true CZ296807B6 (cs) | 2006-06-14 |
Family
ID=8225636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0395998A CZ296807B6 (cs) | 1996-06-24 | 1997-06-20 | Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur proantigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, DNA kódující takové polypeptidy a zpusob jejich prípravy a pouzití |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7038020B1 (cs) |
| EP (1) | EP0920509B1 (cs) |
| JP (1) | JP3841360B2 (cs) |
| KR (1) | KR100361449B1 (cs) |
| AT (1) | ATE272116T1 (cs) |
| AU (1) | AU722127B2 (cs) |
| BG (1) | BG64534B1 (cs) |
| BR (1) | BR9709958A (cs) |
| CA (1) | CA2258494C (cs) |
| CZ (1) | CZ296807B6 (cs) |
| DE (1) | DE69730031T2 (cs) |
| DK (1) | DK0920509T3 (cs) |
| ES (1) | ES2224255T3 (cs) |
| HU (1) | HUP9902605A3 (cs) |
| IL (1) | IL127595A (cs) |
| IS (1) | IS2220B (cs) |
| NO (1) | NO327947B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ333329A (cs) |
| PL (1) | PL186019B1 (cs) |
| RU (1) | RU2204602C2 (cs) |
| SK (1) | SK284879B6 (cs) |
| TR (1) | TR199802692T2 (cs) |
| WO (1) | WO1997049809A1 (cs) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000029583A2 (en) * | 1998-11-19 | 2000-05-25 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Immunoglobulin superfamily proteins |
| EP1106625A1 (en) * | 1999-11-17 | 2001-06-13 | ZLB Bioplasma AG | Rhesus D specific peptide sequences |
| FR2807767B1 (fr) | 2000-04-12 | 2005-01-14 | Lab Francais Du Fractionnement | Anticorps monoclonaux anti-d |
| US8288322B2 (en) | 2000-04-17 | 2012-10-16 | Dyax Corp. | Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries |
| DK1276855T3 (da) | 2000-04-17 | 2012-11-26 | Dyax Corp | Fremgangsmåde til konstruktion af visningsbiblioteker over genetiske pakker for medlemmer af en diversificeret peptidfamilie |
| AU2002226049A1 (en) * | 2000-12-05 | 2002-06-18 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Engineered plasmids and their use for in situ production of genes |
| US20030119056A1 (en) | 2000-12-18 | 2003-06-26 | Ladner Robert Charles | Focused libraries of genetic packages |
| AU2016225923B2 (en) * | 2001-04-17 | 2018-07-05 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Novel Methods of Constructing Libraries Comprising Displayed and/or Expressed Members of a Diverse Family of Peptides, Polypeptides or Proteins and the Novel Libraries |
| RU2209434C1 (ru) * | 2001-11-15 | 2003-07-27 | Российский центр судебно-медицинской экспертизы Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения резус-пептидов анти-d, специфически выявляющих антиген rhd в следах крови и выделений |
| US20040067532A1 (en) | 2002-08-12 | 2004-04-08 | Genetastix Corporation | High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody |
| WO2006007850A1 (en) | 2004-07-20 | 2006-01-26 | Symphogen A/S | Anti-rhesus d recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture |
| CA2574146C (en) | 2004-07-20 | 2015-06-30 | Symphogen A/S | A procedure for structural characterization of a recombinant polyclonal protein or a polyclonal cell line |
| GB0706558D0 (en) * | 2007-04-03 | 2007-05-09 | Common Services Agency For The | Diagnostic assay |
| US8877688B2 (en) | 2007-09-14 | 2014-11-04 | Adimab, Llc | Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor |
| EP3753947A1 (en) | 2007-09-14 | 2020-12-23 | Adimab, LLC | Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor |
| US20090093004A1 (en) | 2007-10-04 | 2009-04-09 | Symphogen A/S | Potency assay |
| US9873957B2 (en) | 2008-03-13 | 2018-01-23 | Dyax Corp. | Libraries of genetic packages comprising novel HC CDR3 designs |
| US9388510B2 (en) | 2008-04-24 | 2016-07-12 | Dyax Corp. | Libraries of genetic packages comprising novel HC CDR1, CDR2, and CDR3 and novel LC CDR1, CDR2, and CDR3 designs |
| JP6266343B2 (ja) | 2010-07-16 | 2018-01-24 | アディマブ， エルエルシー | 抗体ライブラリー |
| BR112015010240A2 (pt) * | 2012-11-06 | 2017-08-22 | Medimmune Ltd | Terapias de combinação através do uso de mo-léculas de ligação de psl e de pcrv anti-pseudomonas |
| US20200247903A1 (en) * | 2017-10-20 | 2020-08-06 | Csl Ltd. | Method |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991007492A1 (en) * | 1989-11-13 | 1991-05-30 | Central Blood Laboratories Authority | Monoclonal antibodies |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2127434A (en) | 1982-09-17 | 1984-04-11 | Univ London | A human monoclonal antibody against Rhesus D antigen |
| GB8722018D0 (en) * | 1987-09-18 | 1987-10-28 | Central Blood Lab Authority | Human anti-rh(d)monoclonal antibodies |
-
1997
- 1997-06-20 US US09/147,443 patent/US7038020B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-20 SK SK1761-98A patent/SK284879B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-06-20 HU HU9902605A patent/HUP9902605A3/hu unknown
- 1997-06-20 AT AT97929244T patent/ATE272116T1/de active
- 1997-06-20 BR BR9709958A patent/BR9709958A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-06-20 PL PL97330794A patent/PL186019B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-06-20 DE DE69730031T patent/DE69730031T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-20 EP EP97929244A patent/EP0920509B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-20 WO PCT/EP1997/003253 patent/WO1997049809A1/en not_active Ceased
- 1997-06-20 DK DK97929244T patent/DK0920509T3/da active
- 1997-06-20 ES ES97929244T patent/ES2224255T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-20 JP JP50232398A patent/JP3841360B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-20 IL IL12759597A patent/IL127595A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-06-20 RU RU99101121/13A patent/RU2204602C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-06-20 AU AU33423/97A patent/AU722127B2/en not_active Expired
- 1997-06-20 CZ CZ0395998A patent/CZ296807B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-06-20 TR TR1998/02692T patent/TR199802692T2/xx unknown
- 1997-06-20 NZ NZ333329A patent/NZ333329A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-06-20 CA CA002258494A patent/CA2258494C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-20 KR KR10-1998-0710975A patent/KR100361449B1/ko not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-12-11 IS IS4922A patent/IS2220B/is unknown
- 1998-12-15 BG BG103016A patent/BG64534B1/bg unknown
- 1998-12-23 NO NO19986088A patent/NO327947B1/no not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-06-20 US US11/155,775 patent/US7399471B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-01-18 US US11/333,197 patent/US7429647B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991007492A1 (en) * | 1989-11-13 | 1991-05-30 | Central Blood Laboratories Authority | Monoclonal antibodies |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Marks, J.D. et al.: "Human Antibody Fragments Specific for Human Blood Group Antigens from a Phage Display Library", Bio/Technology, 11, 1145-1149, 1993 * |
| Siegel, D.L.:"Isolation of HUman Anti-Red Blood Cell Antibodies by Repertoire Cloning", Annals N.Y. Acad. of Sciences, 764, 547-558, 1995 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ296807B6 (cs) | Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur proantigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, DNA kódující takové polypeptidy a zpusob jejich prípravy a pouzití | |
| Smith et al. | The extent of affinity maturation differs between the memory and antibody‐forming cell compartments in the primary immune response | |
| JP6827021B2 (ja) | 単一抗原抗ｐｄ−ｌ１およびｐｄ−ｌ２二重結合抗体およびその使用方法 | |
| Persson et al. | Generation of diverse high-affinity human monoclonal antibodies by repertoire cloning. | |
| US6335163B1 (en) | Polyclonal antibody libraries | |
| JPH07502882A (ja) | 抗体の製造 | |
| HU228845B1 (en) | Improved anti-ige antibodies and method of improving polypeptides | |
| PT1597280E (pt) | Produção de anticorpo monoclonal através da transformação de células b pelo ebv | |
| IL179658A (en) | Anti-rhesus d recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture | |
| EP1414492B1 (en) | Method for treating multiple myeloma | |
| CN102272160A (zh) | 抗rhd单克隆抗体 | |
| Fischer et al. | Platelet‐reactive IgG antibodies cloned by phage display and panning with IVIG from three patients with autoimmune thrombocytopenia | |
| Song et al. | Regulation of VH gene repertoire and somatic mutation in germinal centre B cells by passively administered antibody | |
| JPH03502401A (ja) | ヒト抗Ｒｈ（Ｄ）モノクローナム抗体 | |
| Czerwinski et al. | A molecular approach for isolating high‐affinity Fab fragments that are useful in blood group serology | |
| US20010049107A1 (en) | Polyclonal antibody libraries | |
| US20040115764A1 (en) | Desoxyribonucleic acids coding for the equine ige-allotype heavy chain constant region, the recombinant immunoglobulin obtained therewith and corresponding isotype-specific monoclonal antibodies and the utilization thereof | |
| US20060078561A1 (en) | Polyclonal antibody libraries | |
| TW201012477A (en) | Treatment of thrombocytopenia | |
| Paul | 6 The Origin of Xenoreactive Natural Antibodies | |
| Yu | The humoral immune response to Galα1-3Gal | |
| Haurum et al. | Recombinant polyclonal antibodies: Therapeutic antibody technologies | |
| Usip | Preparation of monoclonal antibodies directed against the natural killer cell glycolipid asialo-gm1 | |
| MXPA99008621A (es) | Peptidos de union a ctla-4, inmunoterapeuticos | |
| Sutherland | The immunoglobulin molecule |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20120620 |