MXPA99008621A

MXPA99008621A - Peptidos de union a ctla-4, inmunoterapeuticos

Info

Publication number: MXPA99008621A
Application number: MXPA/A/1999/008621A
Authority: MX
Inventors: K Kuchroo Vijay
Original assignee: Brigham And Women's Hospital Inc
Priority date: 1997-03-21
Filing date: 1999-09-20
Publication date: 2000-07-01

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y productos para inmunoterapia que dan como resultado la estimulación de la proliferación de células T. Los productos de la presente invención son péptidos que se unen a la CTLA-4 y coestimulan la proliferación de células T al inhibir la unión de B7 con CTLA-4. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen tales péptidos. La presente invención además proporciona métodos terapéuticos in vivo e in vitro que emplean los péptidos de la invención.

Description

PEPTIDOS DE UNION A CTLA-4 , INMUNOTERAPEUTICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general al campo de la inmunología y específicamente a péptidos que se unen a CTLA-4 y estimulan la proliferación de células T. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El complejo proceso de activación y proliferación de células T, está basado en diversas interacciones tales como la presentación del antígeno, contacto célula-célula y mediadores inmunes solubles, e.g. citocinas o linfocinas. Muchas de estas interacciones están mediadas en células T a través de los receptores de superficie. Las células T cooperadoras, por ejemplo, requieren para su activación tanto la presentación de un antígeno por una célula presentadora de antígeno (CPA) en asociación con el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) , como una señal secundaria. La señal secundaria puede ser un factor soluble o puede involucrar una interacción con otro conjunto de receptores en la superficie de las células T. La presentación del antígeno en ausencia de la señal secundaria, sin embargo, no es suficiente para activar a las células T cooperadoras . El sistema CTLA-4/CD28/B7 es un grupo de REF.: 31287 proteínas involucradas en la regulación de la proliferación de células T a través de su ruta de señalización secundaria. La respuesta proliferativa de las células T está controlada por la interacción de la familia de proteínas B7, las cuales se expresan en la superficie de las CPA, con CTLA-4 (antigeno de linfocitos T citotóxicos #4) y CD28. La familia de proteínas B7 está compuesta de glucoproteínas estructuralmente relacionadas, que incluyen las proteínas B7-1, B7-2 y B7-3 (Galea-Laure et al . , Cáncer Gene Therapy, vol. 3, p. 202-213 (1996); Boussiotis et al . , Proc. Nat . Acad. Sci . EUA, v. 90, p. 11059-11063 (1993)). Las diferentes proteínas B7 parecen tener diferentes patrones de expresión en la superficie de las células presentadoras de antígeno. Por ejemplo, la B7-2 se expresa constitutivamente en la superficie de monocitos, mientras que la B7-1 no lo hace, aunque la expresión de la B7-1 es inducida en estas células cuando dichas células son estimuladas con interferón gamma (IFN-?) . Los diferentes patrones de expresión pueden indicar una función distinta para cada uno de los miembros de la familia B7. Se cree que las proteínas B7 están involucradas en los eventos que se relacionan con la estimulación de una respuesta inmunitaria por su capacidad de interactuar con receptores de superficie de varias células inmunitarias. Por ejemplo, se cree que la B7 desempeña una función en el aumento de la proliferación de células T y la producción de citocinas, a través de su interacción con el receptor CD28. El CD28, que es una glucoproteína homodimérica, tiene dos subunidades de 44-kd ligadas por fuentes de disulfuro, se encuentra en el 95% de las células CD4 y en el 50% de las células CD8 . Estudios llevados a cabo utilizando anticuerpos monoclonales reactivos con DC28, han demostrado que el CD28 participa en una ruta de señal secundaria en la activación de la proliferación de las células T. Se ha encontrado que los anticuerpos que bloquean la interacción del CD28 con su ligando, inhiben la proliferación de células T in vitro, dando como resultado una anergia de células T específica de antígeno (Harding et al . , Nature, v. 356, p. 607 (1991)). Recientemente se identificó una proteína receptora de superficie de células T, la proteína CTLA-4, que tiene aproximadamente un 20% de homología de secuencia con el receptor CD28. Aunque la CTLA-4 no se expresa endógenamente en la superficie de las células T, su expresión es inducida cuando el CD28 interactúa con B7 en la superficie de una CPA. Una vez que se expresa la CTLA-4 en la superficie de la célula T, es capaz de interactuar con B7.

Varios grupos de investigadores tienen la hipótesis de que CTLA-4 y CD28 podrían tener efectos opuestos en una célula T y que CTLA-4 y CD28 podrían competir por unirse con B7 (Krummel et al . , International Immunology, v. 8, p. 519-523 (1995); Galea-Lauri et al . , Cáncer Gene Therapy, v. 3, p. 202-213 (1996)). Cuando un antígeno es presentado a una célula T por una CPA y la B7 interactúa con el CD28 en la superficie de la célula T, se crea una señal secundaria que estimula a la célula T para que prolifere. Sin embargo, cuando la B7 interactúa con la CTLA-4-4, no se crea la señal secundaria. Todavía no está claro si la interacción de la CTLA-4 con la B7 inicia una ruta de señalización inhibitoria para prevenir que la célula prolifere, o si la interacción de CTLA-4 con B7 simplemente actúa para reducir la cantidad de B7 disponible para unirse con el receptor CD28. En cualquier caso, parece que CTLA-4-4, CD28 y B7, cada uno de ellos, desempeña una función importante en la intrincada regulación de la proliferación de las células T. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiera a péptidos que se unen con CTLA-4 y que coestimulan la proliferación de células T. Los péptidos de la presente invención, que incluyen anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos funcionalmente activos y polipéptidos funcionalmente activos, interactúan específicamente con CTLA-4 humana y previenen la interacción de la B7 con la CTLA-4 humana. Estos péptidos tienen una utilidad particular como productos farmacéuticos para la inmunoterapia de trastornos sensibles a la proliferación de células T, debido a su capacidad de coestimular la proliferación de células T. Los péptidos de la presente invención son particularmente efectivos para la inmunoterapia de trastornos sensibles a la proliferación de células T, cuando se administran en combinación con agentes terapéuticos convencionales utilizados para el tratamientos de tales trastornos. Por ejemplo un tumor, el cual es un trastorno sensible a la proliferación de células T, se trata convencionalmente con un agente quimioterapéutico que funciona matando a las células que se dividen rápidamente. Los péptidos de la presente invención, cuando se administran en conjunto con un agente quimioterapéuticos, intensifican el efecto tumoricida del agente quimioterapéutico estimulando la proliferación de células T para incrementar el rechazo inmunológico de las células tumorales. Una principal ventaja de los péptidos de la presente invención, deriva del hecho de que interactúan específicamente con CTLA-4 humana. Debido a que los péptidos de la presente invención interactúan específicamente con CTLA-4 humana, se pueden utilizar in vivo en seres humanos para coestimular la proliferación de células T. La intensificación in vivo de la proliferación de células T es deseable como ayuda en el tratamiento de numerosos trastornos sensibles a la proliferación de células T del sistema inmunitario, tales como enfermedades resultantes por inmunodeficiencia, así como trastornos que involucran una invasión o crecimiento celular no deseado, tales como la invasión del cuerpo por microorganismos extraños o el crecimiento de tumores . En particular, la presente invención proporciona una composición de un péptido que se une selectivamente a la CTLA-4 humana y coestimula proliferación de células T. En una modalidad, el péptido tiene una región CDR3 de unión a CTLA-4. La región CDR3 de unión a CTLA-4 puede ser una CDR3A3.4H2 o una variante funcional de la misma de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.4H2, depositado en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection ATCC) con el número de acceso HB-12319. En otra modalidad, la región CDR3 de unión a CTLA-4 es una CDR3A3.6BIO Ó una variante funcional de la misma de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.6.B10, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12318.

El péptido puede ser un anticuerpo monoclonal soluble intacto. De conformidad con una modalidad de la presente invención, el péptido es un anticuerpo monoclonal soluble intact?A3, 4H2 producido por la línea de células de hibridoma depositada en la ATCC con el número de acceso HB-12319 ó un anticuerpo intacto que tenga las características de unión del anticuerpo monoclonal depositado. En otra modalidad, el péptido es un anticuerpo monoclonal soluble intact?A3.6Bio producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC con el número de acceso HB-12318 ó un anticuerpo intacto que tenga las características de unión del anticuerpo monoclonal depositado. De conformidad con todavía otra modalidad de la presente invención, el péptido es un anticuerpo monoclonal humanizado. El péptido también puede ser un fragmento de anticuerpo monoclonal funcionalmente activo o un polipéptido funcionalmente activo. En una modalidad, el péptido es un fragmento de anticuerpo monoclonal que se selecciona del grupo que consiste de un fragmento F(ab')2 un fragmento Fd y un fragmento Fab. En otra modalidad, el péptido tiene una región CDR2 de cadena ligera que se selecciona del grupo que consiste de una CDR2A3.4H2 Ó una variante funcional de la misma de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.4H2 depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12319 y una CDR2A3.6B10 ó una variante funcional de la misma de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.6B10 depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12318. De conformidad con otra modalidad de la presente invención, el péptido tiene una región CDR1 de cadena ligera que se selecciona del grupo que consiste de una CDR1A3.4H2 Ó una variante funcional de la misma de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.4H2, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12319 y una CDR1A3.6B10 ó una variante funcional de la misma de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.6B10, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12318. De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno sensible a la proliferación de células T humanas . La composición farmacéutica incluye una cantidad efectiva para el tratamiento del trastorno sensible a la proliferación de células T humanas de un péptido que se une selectivamente con la CTLA-4 humana y que coestimula la proliferación de células T, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, el péptido tiene una CDR3 de unión a CTLA-4. De conformidad con una modalidad de la presente invención, la región CDR3 de unión a CTLA-4 es una CDR3A3.4H2 O una variante funcional de la misma de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.4H2, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12319. En otra modalidad, la región CDR3 de unión a CTLA-4 es una CDR3A3.6BIO Ó una variante funcional de la misma de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.6B10, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12318. El péptido puede ser un anticuerpo monoclonal soluble intacto. De conformidad con una modalidad de la presente invención, el péptido es un anticuerpo monoclonal soluble intact?A3.4H2 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC con el número de acceso HB-12319 ó un anticuerpo intacto que tenga las características de unión del anticuerpo monoclonal depositado. En otra modalidad, el péptido es un anticuerpo monoclonal soluble intact?A3.6Bio producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC con el número de acceso HB-12318 ó un anticuerpo intacto que tenga las características de unión del anticuerpo monoclonal depositado. De conformidad con todavía otra modalidad de la presente invención, el péptido es un anticuerpo monoclonal humanizado. El péptido también puede ser un fragmento de anticuerpo monoclonal funcionalmente activo o un polipéptido funcionalmente activo. En una modalidad, el péptido es un fragmento de anticuerpo monoclonal que se selecciona del grupo que consiste de un fragmento F(ab')2/ un fragmento Fd y un fragmento Fab. En otra modalidad, el péptido tiene una región CDR2 de cadena ligera que se selecciona del grupo que consiste de una CDR2A3. H2 ó una variante funcional de la misma de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.4H2, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12319 y una CDR2.A3.6BIO ó una variante funcional de la misma de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.6B10, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12318. De conformidad con otra modalidad de la presente invención, el péptido tiene una región CDR1 de cadena ligera que se selecciona del grupo que consiste del grupo que consiste de una CDR1A3.4H2 Ó una variante funcional de la misma de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.4H2, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12319 y una CDR1A3.6BIO Ó una variante funcional de la misma de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.6B10, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12318. La presente invención además proporciona un método para estimular la proliferación de células T in sitv. El método incluye el paso de agregar un péptido que se une a la CTLA-4 humana, a una población de células que incluya células T y células presentadoras de antígeno, para coestimular la proliferación de las células T. En una modalidad, el péptido tiene una región CDR3 de unión a CTLA-4. De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para el tratamiento de un trastorno sensible a la proliferación de células T. El método involucra el paso de administrar a un sujeto que padece de un trastorno sensible a la proliferación de células T, un péptido que se une a la CTLA-4 humana en una cantidad efectiva para incrementar la proliferación de células T. En una modalidad, el péptido tiene una región CDR3 de unión a CTLA-4. En otra modalidad, el trastorno sensible a la proliferación de células T es un tumor. En otra modalidad, el trastorno sensible a la proliferación de células T es una enfermedad de inmunodeficiencia. La presente invención también proporciona hibridomas productores de anticuerpos depositados en la ATCC con los números de acceso HB-12318 y HB-12319. Estos hibridomas producen los anticuerpos que tienen la región CDR3 que interactúa específicamente con CTLA-4 y coestimulan la proliferación de células T. De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico es la secuencia de ácido nucleico de los anticuerpos producidos por los hibridomas depositados. Cada uno de los hibridomas depositados hace posible la producción de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, debido a que está dentro de la rutina de los técnicos en la materia aislar y secuenciar el ADN de una línea celular establecida. De conformidad con otra modalidad, la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos monoclonales intactos que se unen selectivamente a la CTLA-4 humana, anticuerpos humanizados que se unen selectivamente a la CTLA-4 humana, fragmentos de anticuerpos que se unen selectivamente a la CTLA-4 humana y regiones CDR que se unen selectivamente a la CTLA-4 humana. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención involucra el hallazgo de que péptidos específicos que se unen a la CTLA-4 humana en las células T e inhiben a las moléculas B7 de su unión con la CTLA-4-4, coestimulan la proliferación de células T. Al estimular la proliferación de células T, los péptidos de la presente invención son útiles para intensificar una respuesta inmune in vivo, lo cual sería muy útil para el tratamiento de numerosos trastornos que se relacionan con la función inmunitaria. Los péptidos se pueden utilizar por sí solos como terapia primaria, o en combinación con otros agentes terapéuticos como terapia adyuvante para incrementar los beneficios terapéuticos de otros tratamientos médicos. Los péptidos de la presente invención son útiles típicamente cuando es deseable coestimular la proliferación de las células T. Como es bien conocido en la técnica, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo, son las porciones del anticuerpo que son responsables en gran medida de la especificidad del mismo. Las CDR interactúan directamente con el epítopo del antígeno (véase, en general, Clark, 1986; Roitt, 1991) . Tanto en las regiones variables de cadena pesada como de cadena ligera de las inmunoglobulinas IgG, existen cuatro regiones de armazón ( de FRl a FR4) separadas, respectivamente, por tres regiones determinantes de co plementariedad (de CDR1 a CDR3) . Las regiones de Armazón (FR) mantienen la estructura terciaria del paratopo, la cual es la porción del anticuerpo que está involucrada en la interacción con el antígeno. Las CDR y en particular las regiones CDR3 y más particularmente la CDR3 de cadena pesada contribuyen a la especificidad del anticuerpo. Debido a que estas regiones CDR y en particular la región CDR3 le confieren al antígeno especificidad sobre el anticuerpo, estas regiones se pueden incorporar en otros anticuerpos o péptidos para conferirles especificidad de antígeno idénticas sobre aquel anticuerpo o péptido. La presente invención abarca péptidos que incluyen una región de unión a CTLA-4 que se une específicamente a la CTLA-4 humana y previene que ésta interactúe con la B7. Opcionalmente, la región de unión a CTLA-4 es una región CDR3 de unión a CTLA-4. La CTLA-4 es una proteína receptora de superficie de las células T. El término WB7" tal como se utiliza en la presente, es una familia de glucoproteínas estructuralmente relacionadas que incluyen las proteínas B7-1, B7-2 y B7-3. El término "región CDR3 de unión a CTLA-4" tal como se utiliza en la presente, es una secuencia peptídica CDR3 derivada de los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas depositados en la ATCC bajo los números de acceso HB-12318 y HB-12319. Las líneas celulares de hibridoma productoras de anticuerpos (A3-4H2 y A3-6B10) fueron depositadas por los Solicitantes en la ATCC el 21 de marzo de 1997. El hibridoma A3.4H2 produce el anticuerpo monoclona1A3.4H2 que tiene especificidad de unión por CTLA-4. El anticuerpo monoclonalA3.4H2 incluye la región CDR3A3.4H2 dentro de su secuencia. Tal como se utiliza en la presente, el término "CD 3A3.4H2" incluye la región CDR3 del anticuerpo monoclonaiA3.4H2- El hibridoma A3.6B10 produce el anticuerpo monoclona A3.6Bio que tiene especificidad de unión por la CTLA-4. El anticuerpo monoclonal 3.6Bio incluye la región CDR3A3.6B10 dentro de su secuencia. Tal como se utiliza en la presente, el término "CDR3A3.6BIO" incluye la región CDR3 del anticuerpo monoclonal.A3.6Bio-Tanto el anticuerpo monoclonaiA3.4H2 como el anticuerpo monoclonaiA3.6Bi?/ se unen específicamente a la CTLA-4 y evitan que ésta interactúe con la B7. El término "región CDR3 de unión a CTLA-4" se refiere a las secuencias peptídicas CDR3A3.4H2 y CDR3.R3.6BIO' En una modalidad de la presente invención, los péptidos de la presente invención incluyen variantes funcionales de la región CDR3 de unión a CTLA-4. El término "variante funcional" tal como se utiliza en la presente, es un péptido que tiene la secuencia de las regiones CDR3.A3.4H2 Ó CDR3A3.6BIO con substituciones conservativas en las mismas. Tal como se utiliza en la presente, el término "substitución conservativa" se refiere a una substitución de aminoácidos que no altera la carga relativa ni las características de tamaño del péptido en el cual se hizo la substitución del aminoácido. Las substituciones conservativas de aminoácidos incluyen substituciones hechas entre aminoácidos con los siguientes grupos: (1) M, K,L,V; (2) F,Y,W; (3) K,R,H; (4) A,G; (5) S,T; (6) Q,N; y (7) E,D. Tales substituciones se pueden realizar mediante una variedad de métodos conocidos por los técnicos en la materia. Por ejemplo, las substituciones de aminoácidos se pueden realizar por RCP (reacción en cadena catalizada por polimerasa; Polymerase Chain Reaction, PCR) , mutagénesis dirigida a sitio de conformidad con el método de Kunkel (Kunkel, Proc. Nat Acad. Sci . U. S. A. 82: 488-492, 1985), o por síntesis química de un gen que codifica para la región CDR3. Estos y otros métodos para alterar el péptido de la región CDR3 son conocidos por los técnicos en la materia y se pueden encontrar en las referencias que compilan tales métodos, por ejemplo Sa brook o Ausubel, referidos ya anteriormente. Las variantes equivalentes en actividad o funcionalidad de la región CDR3 de unión a CTLA-4, se pueden probar mediante los ensayos de unión y actividad descritos con mayor detalle más adelante. Para propósitos de brevedad, el término "hibridoma depositado en la ATCC" se utiliza en la presente descripción para referirse a ambos hibridomas depositados en la ATCC el 21 de marzo de 1997. El término "anticuerpo monoclonal depositado" se utiliza en la presente para referirse a ambos anticuerpos monoclonales (anticuerpo monoclona A3.4H2 ó anticuerpo monoclonaiA3.6Bio) producidos por los hibridomas depositados en la ATCC. Para propósitos de definición, en las reivindicaciones anexas cada uno de los hibridomas y anticuerpos monoclonales se describe específicamente. Tal como se utiliza en la presente, el término "péptido" incluye anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos funcionalmente activos y polipéptidos funcionalmente activos. Los péptidos de la presente invención son péptidos aislados. Tal como se utiliza en la presente, con respecto a los péptidos, el término "péptidos aislados" significa que los péptidos están substancialmente puros y están substancialmente libres de otras substancias con las que se pudieran encontrar en la naturaleza o en sistemas in vivo, hasta un grado práctico y apropiado para su uso pretendido. En particular, los péptidos están suficientemente puros y suficientemente libres de otros constituyentes biológicos de sus células huésped, como para ser útiles, por ejemplo, en la producción de preparaciones farmacéuticas o en secuenciación. Debido a que un péptido aislado de la presente invención se puede mezclar con un vehículo farmacéuticamente aceptable en una preparación farmacéutica, el péptido puede comprender sólo un pequeño porcentaje en peso de la preparación. No obstante, el péptido está substancialmente puro porque ha sido substancialmente separado de las substancias con las que pudiera estar asociado en los sistemas vivos .

De conformidad con una modalidad, el péptido de la presente invención es un anticuerpo monoclonal anti-CTiA-4 soluble intacto en forma aislada o en una preparación farmacéutica. Un anticuerpo monoclonal soluble intacto, tal como es bien conocido en la técnica, es un ensamblaje de cadenas polipeptídicas unidas por puentes de disulfuro. Dos cadenas polipeptídicas principales, referidas como la cadena ligera y la cadena pesada, conforman las clases estructurales principales (isotipos) de los anticuerpos. Tanto las cadenas pesadas como las ligeras están divididas adicionalmente en subrregiones, referidas como las regiones variables y las regiones constantes. Tal como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población homogénea de inmunoglobulinas que se unen específicamente a un epítopo (i.e. determinante antigénico) de la CTLA-4. El péptido de la presente invención en una modalidad, por ejemplo, es el anticuerpo monoclonal depositado. La preparación y uso del anticuerpo monoclonal depositado se describe más completamente en los Ejemplos anexos. En otra modalidad, el péptido de la presente invención es un anticuerpo intacto que tiene las características de unión del anticuerpo monoclonal depositado. Un anticuerpo que tiene las características de unión del anticuerpo monoclonal depositado, es aquel que se una a la CTLA-4 y que inhiba a la CTLA-4 de su interacción con la B7. Un técnico en la materia podrá identificar fácilmente anticuerpos que tengan las características de unión del anticuerpo monoclonal depositado utilizando ensayos de selección y unión, los cuales se presentan con mayor detalle más adelante. En un conjunto de modalidades, el péptido útil de conformidad con los métodos de la presente invención es un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 humanizado intacto en forma aislada o en una preparación farmacéutica. Los siguientes Ejemplos de métodos para la preparación de anticuerpos monoclonales humanizados que interactúan con la CTLA-4 y coestimulan la activación de células T, son ejemplares y se proporcionan únicamente con propósitos ilustrativos. El término "anticuerpo monoclonal humanizado" tal como se utiliza en la presente, es un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento funcionalmente activo del mismo que tiene regiones constantes humanas y una región CDR3 de unión a CTLA-4, proveniente de un mamífero de una especie diferente al ser humano. Los anticuerpos monoclonales humanizados se pueden preparar por cualquier método conocido en la materia. Los anticuerpos monoclonales humanizados, por ejemplo, se pueden construir reemplazando las regiones no CDR de un anticuerpo de un mamífero no humano por regiones similares de anticuerpos humanos, mientras que se retiene la especificidad epitópica del anticuerpo original. Por ejemplo, los CDR no humanos y opcionalmente algunas regiones de armazón se pueden unir covalentemente a las regiones VF y/o Fc/pFc' humanas para producir un anticuerpo funcional. Existen entidades en Estados Unidos que sintetizan comercialmente anticuerpos humanizados a partir de regiones de anticuerpos murinos específicos, tales como Protein Design Labs (Mountain Vie , California, EUA) . La Solicitud de Patente Europea 0239400, cuyo contenido completo se incorpora en la presente como referencia, proporciona una enseñanza ejemplar de la producción y uso de los anticuerpos monoclonales humanizados en los que cuando menos la porción CDR de un anticuerpo murino (o de algún otro mamífero no humano) se incluye en el anticuerpo humanizado. En breve los siguientes métodos son útiles para construir un anticuerpo monoclonal CDR humanizado incluyendo cuando menos una porción de un CDR murino. Se prepara un primer vector de expresión replicable que incluye un promotor adecuado ligado de manera operable a una secuencia de ADN que codifica para cuando menos un dominio variable de una cadena pesada o ligera de una Ig y el dominio variable que comprende las regiones de armazón de un anticuerpo humano y una región CDR de un anticuerpo murino. Opcionalmente, se prepara un segundo vector de expresión replicable el cual incluye un promotor adecuado ligado de manera operable a una secuencia de ADN que codifica para cuando menos el dominio variable de una cadena ligera o pesada de una Ig humana complementaria, respectivamente. Después se transforma una línea celular con los vectores. De preferencia, la línea celular es una línea celular de mamífero inmortalizada de origen linfoide, tal como una línea celular de mieloma, hibridoma, trioma o cuadroma, o es una línea linfoide normal que ha sido inmortalizada mediante una transformación con un virus. La línea celular transformada posteriormente se cultiva bajo condiciones conocidas por los técnicos en la materia, para producir el anticuerpo humanizado. Tal como se establece en la Solicitud de Patente Europea 0239400, en este campo se conocen varias técnicas para crear los dominios de anticuerpos particulares que van a ser insertados en el vector replicable (los vectores y técnicas recombinantes preferidos se describen con mayor detalle más adelante) . Por ejemplo, la secuencia de ADN que codifica para el dominio se puede preparar por síntesis de oligonucleótidos . De manera alternativa, un gen sintético que carece de las regiones CDR en las cuales cuatro regiones de armazón están fusionadas juntas con sitios de restricción adecuados en las uniones, tales como filamentos sintéticos de doble cadena o cartuchos de CDR subclonados restringidos con extremos pegajosos, se podría ligar en las uniones de las regiones de armazón. Otro método involucra la preparación de la secuencia de ADN que codifica para el dominio que contiene CDR variable por mutagénesis de oligonucleótido dirigida a sitio. Cada uno de estos métodos es conocido en la técnica. Por lo tanto, los técnicos en la materia podrían construir anticuerpos humanizados que contienen una región CDR murina sin destruir la especificidad del anticuerpo por su epítopo. En modalidades preferidas, los anticuerpos humanizados de la presente invención son anticuerpos monoclonales humanizados que incluyen cuando menos la región CDR3 de unión a CTLA-4 del anticuerpo monoclonal depositado. Tal como se anotó anteriormente, se pueden producir tales anticuerpos humanizados en los cuales algunas o la totalidad de las regiones FR del anticuerpo monoclonal depositado han sido reemplazadas por regiones FR humanas homologas. Además, las porciones Fe se pueden reemplazar para producir IgA o IgM, así como anticuerpos IgG portadores de la totalidad o una parte de las regiones CDR del anticuerpo monoclonal depositado. Es de importancia particular la inclusión de la región CDR3 de unión a CTLA-4 del anticuerpo monoclonal depositado y, en menor medida, las otras porciones CDR y regiones de armazón del anticuerpo monoclonal depositado. Tales anticuerpos humanizados tendrán utilidad clínica particular porque reconocerán específicamente la CTLA-4 humana, pero no inducirán ninguna respuesta inmunitaria en seres humanos contra los anticuerpos propios. En una modalidad más preferida, se injerta un CDR murino en la región de armazón de un anticuerpo humano para preparar el "anticuerpo humanizado". Véase e.g., L. Riechmann et al . , Nature 332, 323 (1988); M. S. Neuberger et al . , Nature 314, 268 (1985) y Patente Europea EP A 0 239 400 (publicada el 30 de septiembre de 1987) . En una modalidad de la presente invención, el péptido que contiene una región de unión a CTLA-4 es un fragmento de anticuerpo funcionalmente activo. De manera significativa, tal como es conocido en la materia, sólo una pequeña porción de una molécula de anticuerpo, el paratopo, está involucrada en la unión del anticuerpo con su epítopo (véase, en general, Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7a edición, Blackwell Scientific Publications, Oxford) . Las regiones pFc' y Fe del anticuerpo, por ejemplo, son efectoras de la cascada del complemento, pero no participan en la unión con el antígeno. Un anticuerpo del cual las regiones pFc' han sido enzimáticamente desprendidas, o el cual ha sido producido sin la región pFc' , designado entonces como fragmento (ab')2/ retiene ambos sitios de unión con el antígeno de un anticuerpo intacto. Un fragmento aislado de F(abf)2 es referido como fragmento monoclonal bivalente debido a sus dos sitios de unión con el antígeno. De manera similar, un anticuerpo del cual se ha desprendido enzimáticamente la región Fe, o el cual ha sido producido sin a región Fe, designado como fragmento Fab, retiene uno de los sitios de unión con el antígeno de una molécula de anticuerpo intacta. Ahondando más, los fragmentos Fab consisten de una cadena ligera de anticuerpo enlazada covalentemente y una porción de la cadena pesada del anticuerpo denotada como Fd (región variable de cadena pesada) . Los fragmentos Fd son el principal determinante de la especificidad del anticuerpo (un sólo fragmento Fd se puede asociar con hasta diez diferentes cadenas ligeras, sin alterar la especificidad del anticuerpo) y los fragmentos Fd retienen la capacidad de unirse con su epítopo al ser aislados. Los términos Fab, Fe, pFc' , F(ab')2 y Fv son empleados con sus significados inmunológicos [Klein, Immunology (John Wiley, Nueva York, N. Y. 1982); Clark, W.

R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., Nueva York); Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7a edición, (Blackwell Scientific Publications, Oxford) ] . Tal como se utiliza en la presente, el término "fragmento de anticuerpo funcionalmente activo" significa un fragmento de una molécula de anticuerpo que incluye una región de unión a CTLA-4 de la presente invención, el cual retiene la funcionalidad de estimular a las células de T de un anticuerpo intacto que tiene la misma especificidad que la de los anticuerpos monoclonales depositados. Tales fragmentos también son conocidos en la técnica y se emplean regularmente tanto in vi tro como in vivo. En particular, los fragmentos de anticuerpo funcionalmente activos conocidos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos F(ab )2/ Fab, Fv y Fd de anticuerpos. Estos fragmentos que carecen del fragmento Fe del anticuerpo intacto, son depurados más rápidamente de la circulación sanguínea y pueden presentar menos uniones no específicas a tejidos que los anticuerpos intactos (Wahl et al . , J. Nucí . Med. , 24: 316-325 (1983) ) . Por ejemplo, se pueden construir anticuerpos de una sola cadena de conformidad con los métodos descritos en la Patente Norteamericana No. 4,946,778 de Ladner et al . Tales anticuerpos de una sola cadena incluyen las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas unidas por una porción de unión flexible. También se han reportado métodos para obtener un anticuerpo con un solo dominio ("Fd") el cual comprende un sólo dominio de cadena pesada variable aislado (véase por ejemplo Ward et al . , Nature, 341: 644-646 (1989), describiendo un método de selección para identificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo (anticuerpo con un solo dominio VH) con suficiente afinidad por su epítopo blanco para unirse al mismo en forma aislada. En la técnica se conocen y se han descrito métodos para preparar fragmentos Fv recombinantes basados en secuencias de regiones variables de cadena ligera y cadenas pesadas de anticuerpos conocidos, e.g., Moore et al . , Patente Norteamericana No. 4,462,334. Otras referencias que describen el uso y generación de fragmentos de anticuerpos, incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab (Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevieer, Amsterdam, 1985)), fragmentos Fv (Hochman et al . , Biochemistry 12: 1130 (1973); Sharon et al . , Biochemistry 15: 1591 (1976); Ehrilch et al . , Patente Norteamericana No. 4,355,023) y porciones de moléculas de anticuerpo (Audilore-Hargreaves, Patente Norteamericana No. 4,470,925). Así pues, los técnicos en la materia podrían construir fragmentos de anticuerpos a partir de varias porciones de anticuerpos intactos, sin destruir la especificidad de los anticuerpos por el epítopo CTLA-4. Los fragmentos de anticuerpos funcionalmente activos también abarcan a los "fragmentos de anticuerpos humanizados". Tal como reconocería un técnico en la materia, tales fragmentos se podrían preparar mediante una digestión enzimática tradicional de los anticuerpos humanizados intactos. Sin embargo, si los anticuerpos intactos no son susceptibles a tal degradación, debido a la naturaleza de la construcción involucrada, las construcciones se pueden preparar con fragmentos de inmunoglobulina utilizados como materias primas; o, si se utilizan técnicas recombinantes, las secuencias de ADN mismas se pueden acondicionar para codificar el "fragmento" deseado el cual, cuando se exprese, se pueda combinar in vivo o in vitro por medios químicos o biológicos, para preparar el fragmento de inmunoglobulina intacto final deseado. Fragmentos de anticuerpo más pequeños y pequeños polipéptidos de unión que tienen especificidad de unión por la CTLA-4, también están abarcados dentro de los péptidos de la presente invención. Se pueden utilizar varios ensayos rutinarios para identificar fácilmente tales péptidos. Los ensayos de selección para identificar los péptidos de la presente invención, se realizar por ejemplo, utilizando procedimientos con fagos tales como los descritos en Hart, et al . , J. Biol . Chem. , 259: 12468 (1994). Hart et al . , reportan una biblioteca de fagos filamentosos para identificar nuevos ligandos peptídicos para receptores de células de mamíferos. En general, las bibliotecas de fagos que utilizan, por ejemplo, los fagos M13 o fd, se preparan utilizando los procedimientos convencionales tales como los descritos en las referencias anteriores. Los insertos de bibliotecas contienen de 4 a 80 residuos de aminoácidos. Los insertos opcionalmente representan un arreglo completamente degenerado o desviado de péptidos. Se obtienen ligandos que se unen selectivamente a la CTLA-4 seleccionando aquellos fagos que expresen en su superficie un ligando que se una a la CTLA-4. Después, estos fagos son sometidos a varios ciclos de reselección para identificar a los fagos que expresan al péptido ligando que tengan las características de unión más útiles. Típicamente, los fagos que exhiben las mejores características de unión (e.g., la más alta afinidad) son caracterizados adicionalmente mediante un análisis de ácidos nucleicos, para identificar las secuencias de aminoácidos particulares de los péptidos utilizados en la superficie del fago y la longitud óptima del péptido expresado para alcanzar una unión óptima con la CTLA-4. De manera alternativa, tales ligandos peptídicos se pueden seleccionar a partir de bibliotecas de combinación de péptidos que contienen uno o más aminoácidos . Tales bibliotecas pueden ser procesadas adicionalmente para contener porciones sintéticas no peptídicas que estén menos sujetas a la degradación enzimática en comparación con sus contrapartes de origen natural . Adicionalmente, se pueden sintetizar o producir por medios recombinantes pequeños polipéptidos incluyendo aquellos que contienen la región CDR3 de unión a CTLA-4, para producir el péptido de la presente invención. Tales métodos son conocidos para los técnicos en la materia. Los péptidos se pueden sintetizar, por ejemplo, utilizando sintetizadores de péptidos automáticos los cuales están disponibles en el comercio. Los péptidos se pueden producir por técnicas recombinantes incorporando el ADN que expresa el péptido a un vector de expresión y transformando células con el vector de expresión para producir el péptido. La secuencia de las regiones CDR, para utilizarse en la síntesis de los péptidos de la presente invención, se puede determinar por método conocidos en la técnica. La región variable de la cadena pesada es un péptido que generalmente varía de 100 a 150 aminoácidos de longitud. La región variable de la cadena pesada es un péptido que generalmente varía de 80 a 130 aminoácidos de longitud. Las secuencias CDR dentro de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras que incluyen sólo aproximadamente de 3 a 25 secuencias de aminoácidos, fácilmente pueden ser secuenciadas por un técnico en la materia. Los péptidos incluso se pueden sintetizar por fuentes comerciales tales como Scripps protein and Nucleic Acids Core Sequencing Facility (La Jolla, California, EUA) . Para determinar si un péptido se une a CTLA-4, se puede utilizar cualquier ensayo de unión conocido. Por ejemplo, el péptido se puede inmovilizar en una superficie y después poner en contacto con CTLA-4 marcado. La cantidad de CTLA-4 que interactúa con el péptido o la cantidad que no se une al péptido, posteriormente se pueden cuantificar para determinar si el péptido se une a CTLA- . Una superficie que tenga el anticuerpo monoclonal depositado inmovilizado en la misma, puede servir como control positivo. La selección de los péptidos de la presente invención también se puede llevar a cabo utilizando un ensayo de competencia. Si el péptido que va a ser probado compite con el anticuerpo monoclonal depositado, tal como se demuestra por una disminución de la unión del anticuerpo monoclonal depositado, entonces es probable que el péptido y el anticuerpo monoclonal depositado se unan al mismo epítopo o a uno estrechamente relacionado. Todavía otra manera de determinar si el péptido tiene la especificidad del anticuerpo monoclonal depositado de la presente invención, es preincubar el anticuerpo monoclonal depositado con CTLA-4 con el cual normalmente es reactivo, y después agregar el péptido que se está probando para determinar si dicho péptido es inhibido en su capacidad de unirse a la CTLA-4. Si el péptido que está siendo probado es inhibido, entonces hay la posibilidad de que tenga el mismo epítopo o un equivalente funcional y la misma especificidad que el anticuerpo monoclonal depositado. Utilizando procedimientos de rutina conocidos por los técnicos en la materia, se puede determinar si un péptido que se une a la CTLA-4 es útil de conformidad con la presente invención, determinando si el péptido bloquea la unión de la CTLA-4 con B7 y coestimula la proliferación de células T en un ensayo in vi tro. Un péptido que coestimula la proliferación de células T, es uno que cuando se agrega a una célula T da como resultado una señal secundaria de estimulación de proliferación de la célula T o la producción de mediadores inmunes solubles por la célula T, cuando la célula T es expuesta a una señal primaria, tal como aquella causada por un antígeno en el contexto del CMH en la superficie de una CPA. Un ejemplo de un ensayo de proliferación de células T se describe en Walunas et al . , J. Exp. Med. , vol. 183, p. 2541-2550 (1996) . Brevemente, se aislan células de ganglio linfático y se enriquecen en células T haciéndolas pasar por una columna de lana de nylon y se evalúa la pureza de células T por citometría de flujo utilizando un anticuerpo monoclonal anti-CDR3. Las células T se siembran a una densidad de 2 x 10 células/pozo en presencia de 1 x esplenocitos B6 libres de eritrocitos, irradiados singénicamente. Una vez que se preparan las células, se establecen las condiciones del ensayo. Una primera condición del ensayo incluye incubar la mezcla de células T con 0.1 mg/ml de anti-CDR3 y 1.0 mg/ml de anti-CD28 durante 72 horas a 37°C. La segunda condición del ensayo incluye incubar la mezcla de células T con 0.1 mg/ml de anti-CDR3 solo durante 72 horas a 37°C. Cada una de las condiciones de ensayo se mezcla con Ig de control (50 mg/ml) o con anti-CTLA-4 (50 mg/ml) (tal como el anticuerpo monoclonal depositado) , o con el péptido de prueba de la presente invención (50 mg/ml) . Durante las últimas 16 horas de incubación, la mezcla se pulsa con 1 mCi/pozo [ H] timidina. Las muestras posteriormente se cuentan en un contador de centelleo y se mide la proliferación de las células como función de la [ H] timidina incorporada en las células . Otros ensayos serán evidentes para los técnicos en la materia una vez habiendo leído la presente descripción, siendo dichos ensayos útiles para determinar si un péptido que se une a CTLA-4 también coestimula la activación de células T. Mediante el uso del anticuerpo monoclonal depositado de la presente invención, ahora es posible producir anticuerpos antiidiotípicos que se pueden utilizar para seleccionar otros anticuerpos para identificar si el anticuerpo tiene la misma especificidad de unión que el anticuerpo monoclonal depositado de la presente invención. Además, tales anticuerpos antiidiotípicos se pueden utilizar para inmunización activa (Herlyn, et al . , Science, 232: 100, 1986) . Tales anticuerpos antiidiotípicos se pueden producir utilizando las técnicas de hibridoma ya conocidas (Kohler y Milstein, Nature, 256: 495, 1975) . Un anticuerpo antiidiotípico es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos presentes en el anticuerpo monoclonal depositado. Estos determinantes están localizados en la región hipervariable del anticuerpo. Es esta región la que une a un epítopo dado y, por lo tanto, es responsable de la especificidad del anticuerpo. Un anticuerpo antiidiotípico se puede preparar inmunizando un animal con el anticuerpo monoclonal depositado. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo monoclonal depositado inmunizante y producirá un anticuerpo contra estos determinantes idiotípicos. Al utilizar los anticuerpo antiidiotípicos del animal inmunizado, los cuales son específicos para el anticuerpo monoclonal depositado de la presente invención, es posible identificar otras clonas con el mismo idiotipo que el anticuerpo monoclonal depositado utilizado para la inmunización. La identidad idiotípica entre anticuerpo monoclonales de dos líneas celulares, demuestra que los dos anticuerpos monoclonales son el mismo con respecto a su reconocimiento del mismo determinante epitópico. Así pues, utilizando anticuerpos antiidiotípicos es posible identificar otros hibridomas que expresen anticuerpos monoclonales que tengan la misma especificidad epitópica. También es posible utilizar la tecnología de anticuerpos antiidiotípicos para producir anticuerpos monoclonales que imiten a un epítopo. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal antiidiotípico preparado contra un primer anticuerpo monoclonal, tendrá un dominio de unión en la región hipervariable que es la imagen del epítopo al que se une el primer anticuerpo monoclonal. Así pues, el anticuerpo monoclonal antiidiotípico se puede utilizar para inmunización, ya que el dominio de unión del anticuerpo monoclonal antiidiotípico actúa efectivamente como antígeno . Cada una de las composiciones anteriormente descritas incluye un péptido que tiene una región de unión a CTLA-4. Tal como se describió anteriormente, la región variable de una anticuerpo que incluye la región CDR3 es responsable de la especificidad del anticuerpo. Las secuencias responsables de la especificidad del anticuerpo monoclonal depositado, pueden ser fácilmente determinadas por un técnico en la materia, para que los péptidos de conformidad con la presente invención se puedan preparar utilizando tecnología de ADN recombinante. Existen entidades en los Estados Unidos que realizan esta labor comercialmente, tales como Thomas Jefferson University y la Scripps Protein and Nucleic Acids Core Sequencing Facility (La Jolla, California, EUA) . Por ejemplo, se puede preparar el ADNc de región variable mediante una reacción en cadena catalizada por polimerasa, a partir del ARN del hibridoma depositado, utilizando cebadores degenerados o no degenerados (derivados de la secuencia de aminoácidos) . El ADNc puede ser subclonado para producir cantidades suficientes de ADN de doble cadena para secuencias mediante reacciones o equipo convencional de secuenciación. Estos procedimientos se establecen con mayor detalle en los Ejemplos anexos. Una vez que las secuencias de ácido nucleico de la región Fd de la cadena pesada y de los dominios variables de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal CTLA-4 depositado han sido determinadas, un técnico en la materia podrá producir ácidos nucleicos que codifiquen para este anticuerpo o que codifiquen para los diversos fragmentos de anticuerpo, anticuerpos humanizados o polipéptidos como los anteriormente descritos. Queda contemplado que tales ácidos nucleicos estarán operablemente unidos con otros ácidos nucleicos, formando un vector recombinante para la clonación o para la expresión de los péptidos de la presente invención. La presente invención incluye cualquier vector recombinante que contenga las secuencias codificantes, o parte de las mismas, ya sea para transformación de células procarióticas o eucarióticas, para transfección o para terapia de genes. Tales vectores se pueden preparar utilizando las técnicas de biología molecular convencionales conocidas por los técnicos en la materia y comprenderán secuencias de ADN codificante para la región CDR3 y secuencias variables adicionales que contribuyen a la especificidad de los anticuerpos o partes de los mismos, así como otras secuencias peptídicas no específicas y un promotor adecuado, ya sea con (Whittle et al . , Protein Eng. , 1: 499, 1987; y Burton et ai., Science, 266: 1024-1027, 1994), o bien, sin (Marasco et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . (EUA) , 90: 7889, 1993; y Duan et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . (EUA) , 91: 5075-5079, 1994) una secuencia de señal para exportación o secreción. Tales vectores se pueden transformar o transfectar en células procarióticas (Huse et al . , Science, 246: 1275, 1989; Ward et al . , Nature, 341: 644-646, 1989; Marks et al . , J. Mol . Biol . , 222: 581, 1991; y Barbas et ai., Proc. Nati . Acad. Sci . (EUA) , 88: 7978, 991) o en células eucarióticas (Whittle et ai., 1987; y Burton et al . , 1994) o se pueden utilizar para terapia de genes (Marasco et al . , 1993; y Duan et al . , 1994) mediante las técnicas convencionales conocidas para los técnicos en la materia. Tal como se utiliza en la presente, el término "vector" puede ser cualquiera de un número de ácidos nucleicos en los cuales se pueda insertar una secuencia deseada mediante restricción y ligamiento, para ser transportada entre diferentes ambientes genéticos o para su expresión en una célula huésped. Los vectores típicamente están compuestos de ADN, aunque también se dispone de vectores de ARN. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos y fagémidos. Un vector de clonación es aquel que es capaz de replicarse en una célula huésped y el cual además está caracterizado por uno o más sitios de restricción de endonucleasas en los cuales el vector puede ser cortado de una manera determinada y en el cual se puede ligar una secuencia de ADN de tal modo que el nuevo vector recombinante retenga su capacidad de replicarse en la célula huésped. En el caso de los plásmidos, la replicación de la secuencia deseada puede ocurrir muchas veces a medida que el plásmido incrementa su numero de copias dentro de la bacteria huésped o una sola vez por cada huésped antes de que el huésped se reproduzca por mitosis. En el caso del fago, la replicación puede ocurrir activamente durante una fase lítica o pasivamente durante una fase lisogénica. Un vector de expresión es aquel en el cual se puede insertar una secuencia de ADN deseada mediante restricción o ligamiento, de tal modo que se una operablemente a secuencias reguladoras y pueda ser expresado como una transcripción de ARN. Los vectores además pueden contener una o más secuencias marcadoras adecuadas para utilizarse en la identificación de las células que se hayan o no se hayan transformado o transfectado con el vector. Los marcadores incluyen, por ejemplo, proteínas codificadoras de genes que incrementan o disminuyen ya sea su resistencia o sensibilidad a antibióticos u otros compuestos, genes que codifican para enzimas cuyas actividades son detectables por ensayos estándar conocidos en la técnica (e.g., ß-galactosidasa o fosfatasa alcalina) y genes que afectan visiblemente el fenotipo de las células, huéspedes, colonias o placas transformadas o transfectadas. Los vectores preferidos son aquellos capaces de la replicación autónoma y de expresar productos génicos estructurales presentes en los segmentos de ADN a los cuales están operablemente unidos. Los vectores de expresión de la presente invención incluyen secuencias reguladoras unidas operablemente a una secuencia nucleotídica que codifica para uno de los péptidos de la presente invención. Tal como se utiliza en la presente, el término "secuencias reguladoras" significa secuencias de nucleótidos que son necesarias para, o que conducen a, la transcripción de una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido deseado y/o que son necesarias para, o que conducen, la traducción de la transcripción resultante para obtener el polipéptido deseado. Las secuencias reguladoras incluyen, pero no se limitan a, secuencias 5' tales como operadores, promotores y secuencias de unión a ribosomas; y secuencias 3' tales como señales de poliadenilación. Los vectores de la presente invención también opcionalmente incluyen secuencias líder 5' ó secuencias de señal, secuencias 5' ó 3' que codifican para productos de fusión para ayudar a la purificación de proteínas y diversos marcadores que ayudan a la identificación o selección de las transformantes. La selección y diseño del vector apropiado queda dentro de las capacidades y discreción de los técnicos en la materia. la subsecuente purificación de los péptidos puede ser llevada a cabo por cualquiera de una variedad de medios estándar conocidos en la técnica.

Un vector preferido para la selección de péptidos, pero que no necesariamente es preferido para la producción masiva de los péptidos de la presente invención, es una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia nucleotídica que codifica para, y que es capaz de, expresar un polipéptido de fusión que contiene, en dirección del extremo amino terminal hacia el carboxilo terminal, (1) un dominio de señal de secreción procariótica, (2) un polipéptido de la presente invención y, opcionalmente, (3) un dominio de proteína de fusión. El vector incluye secuencias reguladoras de ADN para expresar el polipéptido de fusión, de preferencia secuencias reguladoras procarióticas . Tales vectores pueden ser construidos por los técnicos en la materia y han sido descritos por Smith et ai. (Science, 228: 1315-1317, 1985), Clalkson et ai. (Nat?re, 352: 624-628, 1991); Kang et ai. (en "Methods: A Companion to Methods in Enzymology: Vol. 2"; R. A. Lerner y D. R. Burton, ed. Academic Press, N. Y., pp 111-118, 1991); Barbas et al . ( Proc. Nati . Acad. Sci . (EUA) , 88: 7978-7982, 1991); Roberts et al . ( Proc. Nati . Acad. Sci . (EUA) 89: 2429-2433, 1992) . Un polipéptido de fusión puede ser útil para la purificación de los péptidos de la presente invención. El dominio de fusión, por ejemplo, puede incluir una cola poli-His, la cual permite la purificación en columnas Ni+ o la proteína de unión a maltosa del vector pMAL disponible en el comercio (New England BioLabs, Beverly, MA) . Un dominio de fusión actualmente preferido, pero no forzosamente necesario, es un anclaje de membrana de fago filamentoso. Este dominio es particularmente útil para seleccionar bibliotecas de fagos de anticuerpos monoclonales, pero puede ser de menor utilidad para la producción masiva de los anticuerpos. El anclaje de membrana de fago filamentoso de preferencia es un dominio de la proteína de revestimiento cpIII o cpVIII, capaz de asociarse con la matriz de un fago filamentoso, incorporando de esta manera el polipéptido de fusión en la superficie de fago, para hacer posible la unión sólida del fago a antígenos específicos o epítopos y, por lo tanto, permitir el enriquecimiento y la selección de anticuerpos específicos o fragmentos codificados por el vector fagémido . La señal de secreción es un dominio peptídico líder de una proteína que tiene como blanco la membrana proteica de la célula huésped, tal como la membrana periplásmica de las bacterias gram negativas. Una señal de secreción preferida para E. coli, es una señal de secreción de pelB. Las secuencias predichas de residuos de aminoácidos del dominio de señal de secreción de dos variantes productoras del gen pelB de Erwinia carotova, se describen en Lei, et al . {Nature, 381: 543-546, 1988) . La secuencia líder de la proteína pelB ha sido previamente utilizada como señal de secreción para proteínas de fusión (Better et al . , Science, 240: 1041-1043, 1988; Sastry et al . , Proc. Nati . Acad. Sci (EUA) , 86: 5728-5732, 1989; y Mullinax, et ai., Proc. Nati . Acad. Sci . (EUA) , 87: 8095-8099, 1990) . Las secuencias de residuos de aminoácidos para otros dominios polipeptídicos de señal de secreción de E. coli útiles en la presente invención, se pueden encontrar en Oliver, en Neidhard, F. C. (ed) , Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1: 56-69 (1987). Para lograr altos niveles de expresión génica en E. coli, es necesario utilizar no sólo fuertes promotores para generar grandes cantidad de ARNm, sino que también sitios de unión a ribosomas para asegurar que el ARNm está siendo eficientemente traducido. En E. coli, el sitio de unión a ribosomas incluye un codón de iniciación (AUG) y una secuencia de 3 a 9 nucleótidos de longitud localizada de 3 a 11 nucleótidos cadena arriba del codón de iniciación (Shine et al . , Nature, 254: 34, 1975). La secuencia AGGAGGU, la cual es denominada la secuencia Shine-Dalgarno (SD) , es complementaria al extremo 3' del ARNr 16S de E. coli. La unión del ribosoma con el ARNm y la secuencia en el extremo 3' del ARNm, pueden ser afectadas por varios factores : (i) El grado de complementariedad entre la secuencia Fd y extremo 3' del ARNr 16S. (ii) La separación y posiblemente la secuencia de ADN que yace entre la secuencia SD y el AUG (Roberts et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (EUA), 76: 760, 1979a; Roberts et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (EUA), 76: 5596, 1979b; Guarente et al., Science, 209: 1428, 1980; y Guarente et al., Cell, 20: 543, 1980) . La optimización se logra midiendo el nivel de expresión de genes en plásmidos en los que se altera sistemáticamente esta separación. La comparación de diferentes ARNm demuestra que existen secuencias estadísticamente preferidas desde la posición -20 hasta la posición +13 (en donde A del AUG está en posición 0) (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35:365, 1981). Las secuencias líder han demostrado influenciar drásticamente la traducción (Roberts et al., 1979a, b, supra). (iii) La secuencia nucleotídica después del AUG, la cual afecta la unión al ribosoma (Tainiguchi et al., J. Mol. Biol., 118: 533, 1978). Las secuencias reguladoras 3' definen cuando menos un codón de terminación o de parada (stop) en el armazón, estando unidas de manera operable al polipéptido de fusión heterólogo. En modalidades preferidas con un huésped de expresión procariótico, el vector utilizado incluye un origen procariótico de replicación o replicón, i.e., una secuencia de ADN que tiene la capacidad de dirigir la replicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante extracromosómicamente en la célula huésped procariótica, tal como una célula huésped bacteriana, transformada con el mismo. Tales orígenes de replicación son conocidos en la técnica. Los orígenes preferidos de replicación son aquellos que son eficientes en el organismo huésped. Una célula huésped preferida es E. coli . Para utilizarse como vector en E. coli, un origen de replicación preferido es el ColEl encontrado en pBR322 y una variedad de otros plásmidos comunes . También se prefieren el origen de replicación pl5A encontrado en pACYC y sus derivados. Los replicones ColEl y pl5A han sido utilizados extensamente en la biología molecular, están disponibles en una variedad de plásmidos y se describen en Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Además, aquellas modalidades que incluyen un replicón procariótico, de preferencia también incluyen un gen cuya expresión confiere una ventaja selectiva, tal como resistencia a fármacos, a una bacteria huésped transformada con el mismo. Los genes típicos bacterianos de resistencia a fármacos son aquellos que le confieren resistencia a la ampicilina, tetraciclina, neomicina/kanamicina o cloranfenicol. Los vectores típicamente también contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de secuencias de ADN traducibles. Ejemplos de vectores son los plásmidos pUC18 y pUC19 y vectores derivados tales como pcDNAII, disponibles en Invitrogen (San Diego, CA, EUA) . Cuando el péptido de la presente invención es un anticuerpo que incluye tanto secuencias de cadena pesada como de cadena ligera, estas secuencias pueden ser codificadas en vectores separados o, de manera más conveniente, pueden ser expresadas por un solo vector. La cadena pesada y la cadena ligera, después de la traducción o después de la secreción, pueden formar la estructura heterodimérica de las moléculas de anticuerpo naturales . Tal anticuerpo heterodimérico puede o no ser estabilizado por puentes de disulfuro entre las cadenas pesadas y ligeras. Un vector para la expresión de anticuerpos heterodiméricos tales como los anticuerpos intactos de la presente invención o los fragmentos de anticuerpo F(ab')2, Fab o Fv de la presente invención, es una molécula de ADN recombinante adaptada para recibir y expresar una primera y una segunda secuencias de ADN traducibles. Es decir, un vector de expresión de ADN para expresar un anticuerpo heterodimérico proporciona un sistema para clonar independientemente (insertar) las dos secuencias de ADN traducibles en dos cartuchos separados presentes en el vector, para formar dos cistrones separados para la expresión del primero y segundo polipéptidos de un anticuerpo heterodimérico. El vector de expresión de ADN para expresar dos cistrones es denominado vector de expresión dicistrónico. De preferencia, el vector comprende un primer cartucho que incluye secuencias reguladoras de ADN cadena arriba y cadena abajo, unidas operablemente a través de una secuencia de nucleótidos adaptados para unión direccional a un inserto de ADN. La secuencia traducible cadena arriba de preferencia codifica para la señal de secreción tal como la anteriormente descrita. El cartucho incluye secuencias reguladoras de ADN para expresar el primer polipéptido de anticuerpo que es producido cuando un inserto de secuencia de ADN traducible (inserto de ADN) se inserta direccionalmente en el cartucho a través de la secuencia de nucleótidos adaptados para unión direccional. El vector de expresión dicistrónico también contiene un segundo cartucho para expresar el segundo polipéptido de anticuerpo. El segundo cartucho incluye una segunda secuencia de ADN traducible que codifica preferiblemente para una señal de secreción tal como la anteriormente descrita, unida operablemente en su extremo 3' a través de una secuencia de nucleótidos adaptados para unión direccional a una secuencia de ADN cadena abajo del vector que define típicamente cuando menos un codón de parada en el armazón de lectura del cartucho. La segunda secuencia de ADN traducible está unida operablemente por su extremo 5' a secuencias reguladoras de ADN que forman los elementos 5' . El segundo cartucho es capaz, después de insertar una secuencia de ADN traducible (inserto de ADN) , de expresar el segundo polipéptido de fusión que comprende una señal de secreción con un polipéptido codificado por el inserto de ADN. Los péptidos de la presente invención también, por supuesto, pueden ser producidos por células eucarióticas tales como células CHO, hibridomas humanos, células B-linfoblastoides inmortalizadas y similares. En este caso, se construye un vector en el cual las secuencias reguladoras eucarióticas están unidas operablemente a las secuencias nucleotídicas que codifican el péptido. El diseño y selección de un vector eucariótico apropiado queda dentro de las capacidades y discreción de los técnicos en la materia. La purificación subsecuente de los péptidos se puede llevar a cabo mediante cualquiera de una variedad de métodos estándar conocidos en la técnica. En otra modalidad, la presente invención proporciona células huésped, tanto procarióticas como eucarióticas, transformadas o transfectadas con, y por lo tanto que incluyen a, los vectores de la presente invención. Tal como se utiliza en la presente con respecto a los ácidos nucleicos, el término "aislado" significa: (i) amplificado in vi tro, por ejemplo mediante una reacción en cadena catalizada por polimerasa (RCP) ; (ii) producido recombinantemente por clonación; (iii) purificado, por ejemplo por rompimiento y separación en gel; o (iv) sintetizado, por ejemplo, por síntesis química. Un ácido nucleico aislado es aquel que es fácilmente manipulable por las técnicas de ADN recombinante conocidas en la materia. Así pues, una secuencia nucleotídica contenida en un vector del cual se conocen sitios de restricción 5' y 3' ó para el cual se han descrito secuencias cebadoras para una reacción en cadena catalizada por polimerasa (RCP) , se considera aislado; pero una secuencia de ácido nucleico existente en su estado nativo en su huésped natural, no se considera aislada. Un ácido nucleico aislado puede ser substancialmente purificado, pero no necesita serlo. Por ejemplo, un ácido nucleico que es aislado dentro de un vector de clonación o expresión no está puro, ya que puede comprender sólo un pequeño porcentaje del material de la célula en la cual reside. Sin embargo, tal ácido nucleico es aislado según el término utilizando en la presente invención, debido a que es fácilmente manipulable por las técnicas estándar conocidas por los técnicos en la materia. Tal como se utiliza en la presente, se dice una secuencia codificadora y las secuencias reguladoras están "unidas operablemente" cuando están enlazadas covalentemente de tal modo que se coloca la expresión o transcripción de la secuencia codificante bajo la influencia o control de las secuencias reguladoras . Si se desea que las secuencias codificadoras sean traducidas en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están unidas operablemente si la inducción de un promotor en las secuencias reguladoras de 5' da como resultado la treinscripción de la secuencia codificadora y si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación de cambio de armazón, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de las secuencias codificadoras, o (3) interfiere con la capacidad de la transcripción de ARN correspondiente para ser traducida en una proteína. Así pues, una región promotora estaría unida operablemente a una secuencia codificadora si la región promotora fuera capaz de efectuar la transcripción de la secuencia de ADN de tal modo que la transcripción resultante pudiera ser traducida en la proteína o polipéptido deseado. La naturaleza precisa de las secuencias reguladoras necesarias para la expresión génica puede variar entre especies o tipos celulares, pero en general incluirá, según sea necesario, secuencias 5' de no transcripción y de no traducción involucradas con la iniciación de la transcripción y la traducción, respectivamente, tales como una caja TATA, una secuencia capping, una secuencia CAAT y similares. Especialmente, tales secuencias reguladoras de no transcripción incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen unido operablemente. Las secuencias reguladoras también pueden incluir secuencias intensificadoras o secuencias activadoras cadena arriba, como sea deseado. Los péptidos también se pueden utilizar inmunoterapéuticamente para trastornos sensibles a la proliferación de células T en seres humanos. El término "inmunoterapéuticamente" o "inmunoterapia", tal como se utiliza en la presente, en conjunto con los anticuerpos monoclonales de la presente invención, denota tanto la administración profiláctica como la administración terapéutica. Así pues, los péptidos se pueden administrar a sujetos de alto riesgo con el fin de disminuir la probabilidad y/o la gravedad de una enfermedad sensible a la proliferación de células T, tal como un tumor, o se puede administrar a sujetos que ya tienen evidencias de tumores . En un aspecto, la presente invención abarca un método para estimular la proliferación de célula T in si tu. El método incluye el paso de agregar un péptido de la presente invención a una población de células que incluye células T y células presentadoras de antígeno. Tal como se utiliza en la presente, el término "células T" se refiere a células T que expresan CTLA-4 y CD28 en la superficie de las mismas y el término "células presentadoras de antígeno" se refiere a cualquier célula inmunitaria que exprese B7 y que presente un antígeno en el contexto del CMH en la superficie. Cuando un péptido de la presente invención es agregado a una población de células T y células presentadoras de antígeno, el péptido interactúa con la CTLA-4, evitando que ésta interactúe con la B7 en la superficie de la célula presentadora de antígeno. Entonces, la célula presentadora de antígeno queda libre para interactuar con la célula T para generar una señal primaria y secundaria que da como resultado la proliferación de células T. Por definición, la palabra "in situ" abarca e incluye los términos ^in vivo", "ex-vivo" e "in vi tro" . Las composiciones de la presente invención son útiles para muchos propósitos in vi tro. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención son útiles para seleccionar compuestos que inhiben la proliferación de células T. Tal ensayo de selección se puede realizar in vi tro preparando ensayos de proliferación celular incluyendo un péptido de la presente invención y una población de células que incluya células T y células presentadoras de antígeno. Se pueden agregar inhibidores potenciales de la proliferación de células T a la mezcla y se puede medir el efecto sobre la proliferación. Otros usos in vi tro, tales como propósitos de investigación, también son conocidos para los técnicos en la materia. Los usos ex-vivo también serán fácilmente identificados por los técnicos en la materia. Los usos exvivo incluyen, por ejemplo, la estimulación de la proliferación de células T que han sido removidas de un sujeto humano y que subsecuentemente son regresadas al cuerpo del sujeto humano. Los usos ex-vivo son útiles cuando se están realizando otros procesos ex-vivo en un sujeto y cuando es deseable separar las células T de los demás componentes de la sangre antes de la manipulación. La presente invención también incluye un método para el tratamiento de un trastorno sensible a la proliferación de células T. El método incluye el paso de administrar un péptido de la presente invención a un sujeto que padezca de un trastorno sensible a la proliferación de células T, en una cantidad efectiva para incrementar la proliferación de las células T. Tal como se utiliza en la presente, el término "trastorno sensible a la proliferación de células T" es cualquier trastorno asociado con las consecuencias fisiológicas adversas en las cuales una intensificación de la función de las células inmunitarias, caracterizada por un incremento de la proliferación de las células T, da como resultado una mejoría de las consecuencias fisiológicas adversas. Los trastornos sensibles a la proliferación de células T incluyen trastornos del sistema inmunitario, tales como inmunodeficiencia, así como trastornos que involucran la invasión celular indeseable por microorganismos o el crecimiento de células indeseables tales como tumores . El péptido de la presente invención es una señal coestimuladora secundaria que requiere un evento coestimulador primario para iniciar la proliferación de las células T. El evento coestimulador primario puede ser la interacción de una célula T con un antígeno en el contexto del CMH. Cuando una célula T ha sido expuesta a un antígeno en el contexto del CMH, no es necesario agregar una señal primaria coestimuladora cuando se agrega la señal coestimuladora secundaria con el fin de estimular la proliferación de la célula. Por ejemplo cuando el péptido de la presente invención se administra a un sujeto humano infectado con un antígeno particular o que expresa un antígeno particular en una célula tumoral, de tal modo que el antígeno se incorpora y se expresa en la superficie de las CPA circulantes, no es necesario administrar una señal coestimuladora primaria con el fin de estimular la proliferación de las células T. El antígeno presentado en la superficie de las CPA circulantes del sujeto, funciona como señal coestimuladora primaria. Cuando el antígeno no se expresa en la superficie de CPA circulantes, se puede administrar una señal coestimuladora primaria en conjunto con la señal coestimuladora secundaria (el péptido de la presente invención) . Por ejemplo, un antígeno podrían no estar expresado en la superficie de las CPA circulantes de un sujeto cuando dicho sujeto no ha sido expuesto a una agente infeccioso particular. Podría ser deseable estimular la proliferación de células T en tal sujeto cuando el sujeto puede estar expuesto al agente infeccioso en el futuro. La estimulación de la proliferación de células T bajo tales condiciones, intensifica la inmunidad del sujeto contra el agente infeccioso particular cuando dicho sujeto es expuesto al agente en el futuro. Las composiciones de la presente invención se administran en cantidades terapéuticamente efectivas. Tal como se utiliza en la presente, el término "cantidad efectiva" del péptido de la presente invención, es una dosis que es suficiente para inhibir la unión de la B7 con CTLA-4 a un grado en el cual se coestimulará la proliferación de las células T. La estimulación de la proliferación de las células T es suficiente para producir el efecto deseado en el cual los síntomas asociados con el trastorno sensible a la proliferación de células T mejoran o disminuyen. De preferencia una cantidad efectiva del péptido es una cantidad efectiva para promover la proliferación de células T in vivo. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva puede variar según la edad, condición y sexo del paciente, así como el grado de la enfermedad del paciente, y puede ser determinada por un técnico en la materia. La dosificación puede ser ajustada por el médico individual en el caso de cualquier complicación. Una cantidad terapéuticamente efectiva típicamente variará de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 500 mg/kg, típicamente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 200 mg/kg y a menudo de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 20 mg/kg, en una o más administraciones diarias, durante o varios días (dependiendo del curso o del modo de administración y de los factores anteriormente descritos) . Un técnico en la materia puede determinar cuál es una cantidad efectiva de un péptido seleccionando la capacidad del mismo para inhibir la activación de la proliferación de células T en un ensayo in vi tro. La efectividad del péptido se puede definir en términos de la capacidad del mismo para inhibir la proliferación de células T. Un ensayo de ejemplo para medir la capacidad de un péptido putativo de la presente invención para inhibir la proliferación de células T, se proporciona en los Ejemplos y se describió anteriormente. El ensayo de ejemplo es predictivo de la capacidad de un péptido para coestimular la proliferación de células T in vivo y, por lo tanto, se puede utilizar para seleccionar péptidos para aplicaciones terapéuticas. Los ensayos de proliferación miden la capacidad de un péptido para coestimular la proliferación de células T. De conformidad con los métodos de la presente invención, el péptido se puede administrar en una composición farmacéuticamente aceptable. En general, los vehículos farmacéuticamente aceptables para anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpo y péptidos, son conocidos por los técnicos en la materia. Tal como se utiliza en la presente, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos, i.e., la capacidad del péptido para coestimular la activación de células T. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, rellenadores, sales, soluciones reguladoras, estabilizantes, solubilizadsres y otros materiales que son conocidos en la técnica. Vehículos farmacéuticamente aceptables de ejemplo para péptidos en particular, se describen en la Patente Norteamericana No. 5,211,657. Los péptidos de la presente invención se pueden formular en preparaciones sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como tabletas, cápsulas, polvos, granulos, ungüentos, soluciones, implantes depositados, inhaladores e inyecciones; y las formas normales de administración son oral, parenteral o quirúrgica. La presente invención también abarca composiciones farmacéuticas que son formuladas para administración local, tales como implantes . De conformidad con los métodos de la presente invención, los péptidos se pueden administrar por inyección, por infusión gradual con el tiempo o por cualquier otro método médicamente aceptable. La administración, por ejemplo, puede ser intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidad, subcutánea o transdérmica. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones y emulsiones. Ejemplos de disolventes no acuosos son el propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal tal como aceite de oliva, esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios con pH regulado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, solución de Ringer con dextrosa, solución de dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reabastecedores de fluidos y de nutrientes, reabastecedores de electrolitos (tales como aquellos basados en solución de Ringer con dextrosa) y similares. También pueden estar presentes conservadores y otros aditivos tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y gases inertes y similares. Los técnicos en la materia podrán determinar fácilmente los diversos parámetros para preparar estas composiciones farmacéuticas alternativas, sin recurrir a mayor experimentación.

Los métodos de la presente invención también abarcan el paso de administrar los péptidos de la presente invención en conjunto con la terapias convencionales para el tratamiento del trastorno sensible a la proliferación de células T subyacente. Por ejemplo, el método de la presente invención se puede practicar simultáneamente con el tratamiento convencional. El tratamiento convencional particular depende del curso y de la naturaleza del trastorno sensible a la proliferación de células T. Cuando por ejemplo el trastorno sensible a la proliferación de células T es ,un tumor, un modo convencional de tratamiento es la quimioterapia. Los péptidos de la presente invención se pueden administrar en conjunto con quimioterapia en el tratamiento de los tumores, con el fin de intensificar los efectos tumoricidas. Los siguientes Ejemplos se proporcionan para ilustrar casos específicos de la práctica de la presente invención y no se debe considerar que la presente invención está limitada a estos Ejemplos. Como será evidente para los técnicos en la materia, la presente invención encontrará aplicaciones en una variedad de composiciones y métodos .

EJEMPLOS Ejemplo 1: Preparación de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales an i-CTLA-4 1. Inmunización Se aplicó como inmunización una inyección 7 intraperitoneal de 10 clonas de células T humanas activadas en solución salina de Dulbecco regulada con fosfatos, y después emulsificada con un volumen igual de adyuvante completo de Freund (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) en ratones hembra de tipo Balb/c (Jackson Laboratories, Bar Habor, ME, EUA) . A los ratones se les administraron dos inmunizaciones intraperitoneales de refuerzo con 10 clonas de células T humanas activadas suspendidas en solución salina de Dulbecco regulada con fosfatos (GIBCO, Grand Island, NY, EUA) y emulsificada con un volumen igual de adyuvante incompleto de Freund (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) a intervalos de 14 días después de la inmunización inicial. 2. Selección de Ratones por Citometría de Flujo La presencia de anticuerpos contra proteínas de superficie en las clonas de las células T se ensayó por citometría de flujo. Diez días después de la tercera y última inmunización, se tomó una pequeña cantidad de sangre por sangrado retroorbital de cada ratón y se dejó coagular. Se hicieron crecer clonas de células T activadas en matraces de cultivo de tejidos y se colectaron y lavaron perfectamente (3X) con solución salina de Dulbecco regulada con fosfatos con albúmina sérica bovina al 1% (solución BSA 1%). Una dilución 1:1000 de cada una de las muestras de suero colectadas de los ratones inmunizados (50 µl) fueron agregados a 10 clonas de células T, se mezcló bien y se incubó durante 30 minutos a 4°C. Después de la incubación, las células fueron lavadas 3X con solución BSA 1%, después se incubaron durante 30 minutos en 50 µl de un detector de anticuerpos (suero de cabra con inmunoglobulina de ratón, conjugado con isotiocianato de fluoresceína; Zy ed Laboratories, San Francisco, CA, EUA) diluido 1:40 en solución BSA 1%. Las células fueron lavadas 3X con solución BSA 1%, después se fijaron con solución de parafo maldehído al 1% (paraformaldehído disuelto en solución salina de Dulbecco regulada con fosfatos; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) . Después, las muestras fueron analizadas en un citómetro de flujo FACSort (Becton-Dickinson, San José, CA, EUA) . Los sueros de ratón que exhibían el más alto grado de fluorescencia en las clonas de células T, fueron seleccionados para fusión celular, para crear los anticuerpos monoclonales . 3. Preparación de Hibridomas Después de que se seleccionó el ratón con el mejor título de anticuerpos contra las clonas de células T, éste se dejó reposar durante un total de 4 semanas después de la última inmunización. Después se le aplicó un 7 refuerzo con 10 clonas de células T por inyección intraperitoneal en solución salina de Dulbecco regulada con fosfatos. Cuatro días después, el ratón fue sacrificado por dislocación cervical y se extirpó el bazo, se molió para formar una suspensión celular y se lavó con solución salina de Dulbecco regulada con fosfatos. Después, las células de bazo se contaron y se mezclaron con células de mieloma SP 2/0 (ATCC número de acceso CRL8006, Rockville, MD) que eran incapaces de secretar cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulina (Kearney et al . , Journal of Immunology, 1979, 123: 1548) a una relación de 2:1 (células de bazo/células de mieloma) y después se fusionaron utilizando polietilenglicol 1450 (ATCC, Rockville, MD) de conformidad con el procedimiento estándar desarrollado por Kohler y Miltein (Nature, 1975, 256: 495) en ocho placas de cultivos de tejidos de 96 pozos, en medio HAT selectivo. Entre 10 y 21 días después de la fusión, las colonias de hibridomas fueron visibles y se seleccionaron por citometría de flujo utilizando clonas de células T, de la manera anteriormente descrita. Todas las colonias de hibridoma que dieron una respuesta positiva con las clonas de células T, fueron propagadas en cultivos de 24 pozos y subclonadas por dilución limitante para producir líneas celulares productoras de anticuerpos monoclonales. En este punto, se realizó una selección adicional con los hibridomas para identificar qué hibridoma producía un anticuerpo anti-CTLA-4. Se sometieron a selección los medios de cultivo de los que se cosecharon cultivos de hibridoma (sobrenadantes) por ELISA (ensayo inmunoabsorbente de enzima ligada) con un panel de antígenos de superficie de células T conocidos, incluyendo CTLA-4. La prueba de ELISA se realizó revistiendo placas de EIA de 96 pozos con alta unión de proteínas (Costar, Cambridge, MA) con 50 µl/pozo de una solución 1 µg/ml (0.02 µg/pozo) de Ig-CTLA-4 humana, la cual tiene la porción de unión extracelular de CTLA-4 acoplada a una porción Fe de una inmunoglobulina (Repligen Corporation, Cambridge, MA) disuelta en solución salina de Dulbecco regulada con fosfatos, pH 7.2 (PBS) durante una noche a 4°C. La Ig-CTLA-4 fue aspirada de las placas y las placas se lavaron bien con PBS (3X) . Después, las placas fueron bloqueadas con solución BSA 1% durante 1 hora a temperatura ambiente, para inhibir la unión no específica. Después de que las placas fueron suficientemente bloqueadas, se retiró la solución BSA y se añadieron 50 µl/pozo de sobrenadante de hibridoma. Las placas incubaron durante 45 minutos a 37 °C y después se lavaron 3X con PBS. Después se diluyó un anticuerpo detector (suero de cabra con Ig de ratón, conjugado con peroxidasa de rábano; Zymed Laboratories, San Francisco, CA, EUA) 1:400 en PBS y se agregaron 50 µl a cada pozo durante 45 minutos a 37 °C. Después las placas fueron lavadas nuevamente con PBS, seguido por la adición de 50 µl/pozo de ABTS 1 mM en una solución de citrato de sodio 0.1 M, pH 4.2 (ácido 2, 2-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico; Zymed Laboratories, San Francisco, CA, EUA) a la cual se le había agregado una dilución 1:1000 de peróxido de hidrógeno al 30%, durante 30 minutos a temperatura ambiente en la obscuridad. Las muestras que tenían sobrenadantes de hibridoma conteniendo anticuerpos contra CTLA-4 humano, se destacaban en un color verde, el cual se forma a medida que la peroxidasa reacciona con el ABTS y el peróxido de hidrógeno. La intensidad del color verde (absorbancia a 405 nm) fue evaluada en un lector de microplacas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA, EUA) . Se identificaron dos anticuerpos monoclonales de ratón contra CTLA-4 humana, los cuales se identificaron como A3.4H2 y A3.6B10.

Ejemplo 2: Análisis de anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 Se examinaron los anticuerpos monoclonales para determinar la subclase de anticuerpo utilizando un paquete o kit ISOstrip Kit (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN, EUA) . Se diluyeron 5 µl de sobrenadante de hibridoma en PBS y se vaciaron en un tuvo de ensayo conteniendo cuentas de látex azules unidas a anticuerpos contra Ig murina. Después se colocó una tira de isotipificación en cada tubo y la solución de cuentas/anticuerpo asciende por la tira por capilaridad hasta que la solución pasa una línea de anticuerpos conteniendo anticuerpos específicos para los diferentes isotipos. Apareció una línea azul en el área de la tira para cada isotipo detectado en el sobrenadante del hibridoma. Se encontró que tanto el anticuerpo A3.4H2 como el A3.6B10 son de la subclase IgG2a, con cadenas ligera kappa . Se analizaron subclonas de los hibridomas por ELISA y citometría de flujo utilizando una línea de células CHO transfectada con CTLA-4 (obtenida del Dr. Gordon Freeman a través de Repligen Corporation, Cambridge, MA) . Los anticuerpos también se probaron con respecto a su capacidad de bloquear la unión de las proteínas B7.1 y B7.2, que son los ligandos naturales para el receptor CTLA-4, al CTLA-4. Tanto el A3.4H2 como el A3.6B10 fueron capaces de bloquear la unión del ligando B7 (Tabla 1) Tabla 1 Ejemplo 3: Separación y secuenciación de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoclonal an i-CTLA-4 El anticuerpo se puede aislar de los hibridomas y purificar por cualquier método conocido en la técnica. Se pueden utilizar cuando menos dos métodos para separar las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo purificado, para determinar la secuencia. El primer método emplea una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (EGPA-DSS) , seguida por una electrotransferencia en una membrana de difluoruro de polivinilo (DFPV) . Brevemente, el anticuerpo purificado es sometido a una electroforesis en gel con SDS después de una reducción con 2-mercaptoetanol. Las cadenas pesadas y ligeras resueltas, posteriormente, son transferidas a una membrana tal como una membrana IMMOBILON® (una membrana con DFPV de Millipore, Bedford, Mass.) utilizando el método de inmunoelectrotransferencia de Matsudaira [J. Biol. Chem., 261: 10035 (1987)]. Las bandas que corresponden a las cadenas pesadas y ligeras, que se identifican con tinción de azul brillante de Coomassie, se pueden cortar de la membrana y procesar para la secuenciación N-terminal . Un segundo método más complicado permite el aislamiento en solución de cantidades mayores de cadenas pesadas y ligeras. El método incluye una etapa de diálisis en la cual el anticuerpo purificado es dializado contra Tris-HCl 0.1 M, AEDT 1 mM, pH 8.0, a 4°C y después se someten a sulfitolisis oxidativa en NaS?3Na2S2Oo, esencialmente de la manera descrita por Morehead et ai. [Biochemistry 23: 2500 (1984)]. Después de la sulfitolisis, la preparación de anticuerpo se dializa contra ácido acético 1 M liofilizado a sequedad, reconstituido en ácido acético 1 M, y se somete a filtración en gel en una columna de 1 x 30 cm SEPHADEX G-75®, en ácido acético 1 M. La pureza de las cadenas pesadas y ligeras después de esta etapa, se puede evaluar por EGPA-DSS analítica y después se concentran para la secuenciación. La secuenciación de aminoácidos N-terminal se puede realizar utilizando cualquier secuenciador de aminoácidos comercial, tal como el secuenciador de proteína-péptido de Applied Biosystems modelo 477A. El análisis de las cadenas aisladas se realiza siguiendo las instrucciones del fabricante del secuenciador. E emplo : Diseño del cebador oligonucleótido y clonación del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 1. Preparación de Oligonucleótidos Basándose en la información obtenida de los anteriores análisis de secuenciación de aminoácidos, se pueden diseñar cebadores de oligonucleótido degenerado para su uso en RCP. Se pueden diseñar otros cebadores no degenerados con base en la información de secuencia de nucleótidos obtenida después de una amplificación por RCP del ADNc que codifica para las cadenas pesadas y ligeras completas (que se describe más adelante) . Los cebadores de oligonucleótido se sintetizan por los métodos normales utilizando un secuenciador disponible en el comercio, tal como el sintetizador de Applied Biosystems Modelo 380B. Alternativamente, se puede realizar una amplificación por RCP de cadenas ligeras y fragmentos de cadenas pesadas IgGi Fd utilizando las familias de genes de región variable de cadenas ligeras y pesadas individuales, y cebadores de la región constante 3' para IgG?, K o 1, tal como describió previamente (Kang et al . , "Methods, A Companion to Methods in Enzymology: Vol . 2", R. A. Lerner y D. R. Burton, ed. Academic Press, NY, pp 111-118, 1991) . Tales cebadores se pueden obtener comercialmente en empresas tales como Operon (Alameda, CA) . Los cebadores pueden contener sitios de enzimas de restricción para permitir la unión secuencias de Fd y bibliotecas de cadenas ligeras para otros diversos usos recombinantes en un vector de fago . 2. Amplificación por RCP de Cadenas Pesadas y Ligeras Se puede aislar ARN citoplásmico total de las líneas celulares de hibridoma mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo lisando las células en una solución reguladora lítica que consiste de Tris-HCl 10 mM, pH 7.4, NaCl 10 mM, MgCl2 2 mM y Nonidot P40 al 0.5%, seguido por una centrifugación para separar las fracciones nucleares y citoplásmicas . La pella nuclear se desecha y el líquido sobrenadante se mezcla con un volumen igual de una solución que contiene NaCl 200 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7.4, etilendiaminotetraacetato (EDTA) 20 mM y dodecilsulfato de sodio al 2% (SDS) . La mezcla se somete a extracción una vez con un volumen igual de fenol regulado con Tris/cloroformo (1:1) y una vez con cloroformo. Después de las extracciones, la mezcla se precipita con acetato de sodio y etanol absoluto a -20°C. El método se puede realizar con kits o paquetes comercialmente disponibles tales como el vendido por Stratagene, La Jolla, CA.

El primer filamento de ADNc se puede sintetizar directamente a partir del ARN citoplásmico total a 37°C durante 90 minutos, utilizando una transcriptasa inversa en una solución reguladora de reacción, tal como la vendida por Gibco-BRL, Grand Island, NY. Después, se pueden realizar amplificaciones por reacción en cadena catalizada por polimerasa (RCP) utilizando un ciclizador térmico programable Technc o un equipo similar. La mezcla de reacción de RCP por lo general consiste de 10 µl del primer filamento de la mezcla de reacción de ADNc, 53.5 mi de H2O destilada, 10 µl de solución reguladora de reacción de polimerasa Taq 10X (KC1 500 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8.3, MgCl2 15 mM, gelatina al 0.1%), 16 µl de mezcla de dNTP 1.25 mM (DATP, TTP, dCTP, dGTP), 5 µl de cada cebador de interés (20 pmol/µl) y 5 µl de ADN polimerasa. Después de la RCP, LAS mezclas de ADN son sometidas a electroforesis en geles de agarosa conteniendo bromuro de etidio. Los fragmentos de RCP de interés, posteriormente, se pueden cortar de los geles y purificar por electroelusión. 3. Subclonación y Secuenciación de ADN Los fragmentos de RCP purificados en gel se someten a digestión con enzimas de restricción tales como Not I y Spel y después se ligan a un vector apropiado tal como el vector del plásmido Bluescript digerido con Not I/Spel. Se transforman células competentes tales como E. coli cepa DH5-alfa (Max Efficiency) con la mezcla ligada o se introducen en una biblioteca de fagémido para subsecuentes procedimientos de recombinación. Se purifica ADN plasmídico de doble cadena por cualquier técnica conocida en la materia para purificar el ADN, tal como el paquete o kit Qiagen plasmid maxiprep (Qiagen, Chatsworth, CA) . Posteriormente se realiza la secuenciación en un secuenciador de ADN automático (e.g., Applied Biosystems, Inc. (ABI) , Foster City, CA) , utilizando un paquete o kit de secuenciación cíclica con terminador didesoxifluorescente de Taq (ABI) . Las secuencias derivadas de fragmentos Fd de cadena pesada y las cadenas ligeras, posteriormente se alinean utilizando un MacVector y la base de datos Genbank (International Biotechnologies Inc., New Haven, CT) . Depósitos Se depositaron los hibridomas A3.4H2 y A3.6B10 el 21 de marzo de 1997 en la colección Norteamérica de Cultivos Tipo (siendo sus siglas en inglés ATCC) , con los números de acceso HB-12319 y HB-12318, respectivamente. El cesionario de los Solicitantes, el Brigham and Women' s Hospital, representa que el ATCC es un depositario que se encarga de la permanencia del depósito y accesibilidad rápida al mismo por el público si se otorga una patente. Todas las restricciones de disponibilidad al público del material así depositado, serán irrevocablemente removidas al otorgamiento de una patente. El material estará disponible en tanto que dure la solicitud de patente, determinado por el Comisionado encargado de ello, bajo el 37 CFR 1.14 (37 Código de Normas Federales) y el 35 U.S.C. 122 (35 Código de los Estados Unidos) . El material depositado será mantenido con todo el cuidado necesario para mantenerlo viable y sin contaminación durante un periodo de cuando menos cinco años después del requerimiento más reciente de una muestra del hibridoma depositado y, en cualquier caso, durante un periodo de cuando menos treinta (30) años después de la fecha del depósito o durante toda la vigencia de la patente, cualquier periodo que sea el más prolongado. El cesionario de los solicitantes reconoce su deber para reemplazar el depósito si el depositario es incapaz de proporcionar una muestra cuando es requerida debido a las condiciones del depósito. La solicitud aquí escrita se debe considerar como suficiente para hacer posible que un técnico en la materia practique la invención. La presente invención no está limitada en alcances por las líneas celulares depositadas, ya que la modalidad depositada se entiende como una sola ilustración de un aspecto de la presente invención y cualquier línea celular funcionalmente equivalente queda dentro de los alcances de la presente invención. De manera similar, los anticuerpos y péptidos particulares descritos en la presente no se deben considerar como limitantes de la invención, ya que se entienden únicamente como ilustrativos de modalidades particulares de la presente invención. Por lo tanto, cualquier línea celular, anticuerpo y péptido que sea funcionalmente equivalente a aquellos descritos en la presente, queda dentro del espíritu y los alcances de las reivindicaciones de la presente invención. De hecho, serán evidentes para los técnicos en la materia varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente, después de leer la descripción, y que caen dentro de las alcances de las reivindicaciones anexas . Todas las referencias, patentes y publicaciones de patente que se citan en esta solicitud, se incorporan en su totalidad como referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una composición caracterizada porgue comprende un péptido aislado que se une selectivamente al CTLA-4 humano (siglas de antígeno de linfocitos T citotóxicos número 4, en inglés) y que coestimula la proliferación de células T.
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido aislado tiene una región CDR3 de unión a CTLA-4 o una variante funcional de la misma.
3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la región CDR3 de unión a CTLA-4 es una CDR3A3.4H2 de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.4H2, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12319.
4. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la región CDR3 de unión a CTLA-4 es una CDR3.R .6BIO de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.6B10, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12318.
5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido aislado es un anticuerpo monoclonal soluble intacto.
6. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido aislado es un anticuerpo monoclonalA3.4H2 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC con el número de acceso HB-12319.
7. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido aislado es un anticuerpo monoclonaiA3.6Bio producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC con el número de acceso HB-12318.
8. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido aislado es un anticuerpo monoclonal humanizado.
9. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido aislado es un fragmento de anticuerpo monoclonal que se selecciona del grupo que consiste de un fragmento F(ab')2/ un fragmento Fd y un fragmento Fab .
10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido aislado tiene una región CDR2 de cadena ligera que se selecciona del grupo que consiste de una CDR2 3. H2 de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.4H2, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12319 y una CDR2A3.6BIO de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.6B10, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12318.
11. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido aislado tiene una región CDR1 de cadena ligera que se selecciona del grupo que consiste de una CDR1A3. H2 de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.4H2, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12319 y una CDR1.R3.6BIO de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.6B10, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12318.
12. Una línea celular de hibridoma depositada en la ATCC con el número de acceso HB-12319.
13. Una línea celular de hibridoma depositada en la ATCC con el número de acceso HB-12318.
14. Una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno sensible a la proliferación de células T humanas, caracterizada porque comprende: una cantidad efectiva para el tratamiento del trastorno sensible a la proliferación de células T humanas de un péptido aislado que se une selectivamente al CTLA-4 y que coestimula la proliferación de células T; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el péptido aislado tiene una región CDR3 de unión a CTLA-4 o una variante funcional de la misma.
16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la región CDR3 de unión a CTLA-4 es una CDR3A3.4H2 de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.4H2, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12319.
17. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la región CDR3 de unión a CTLA-4 es una CDR3.R3.6BIO de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.6B10, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12319.
18. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el péptido aislado se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo monoclonal intacto soluble y un fragmento de anticuerpo monoclonal funcionalmente activo.
19. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el péptido aislado es un anticuerpo humanizado.
20. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el péptido aislado es un anticuerpo monoclonal.R3.4H2 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC con el número de acceso HB-12319.
21. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el péptido aislado es un anticuerpo monoclonal.R3.6Bio producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC con el número de acceso HB-12318.
22. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el péptido aislado es un fragmento de anticuerpo monoclonal que se selecciona del grupo que consiste de un fragmento F(ab')2, un fragmento Fd y un fragmento Fab.
23. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el péptido aislado tiene una región CDR2 de cadena ligera que se selecciona del grupo que consiste de una CDR2.A3.4H2 de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.4H2 depositado en la ATCC con el numero de acceso HB-12319 y una CDR2A3.6BIO de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.6B10, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12318.
24. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el péptido aislado tiene una región CDR1 de cadena ligera que se selecciona del grupo que consiste de una CDR1A3.4H2 de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.4H2 depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12319 y una CDR1A3.6BIO de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A3.6B10, depositado en la ATCC con el número de acceso HB-12318.
25. Un método para estimular la proliferación de células T, caracterizado porque comprende agregar un péptido aislado que se une al CTLA-4 humano a una población de células que incluye células T y células presentadoras de antígeno, in si tu.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el péptido aislado tiene una región CDR3 de unión a CTLA-4 o una variante funcional de la misma.
27. Un método para el tratamiento de un trastorno sensible a la proliferación de células T, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto que padezca de un trastorno sensible a la proliferación de células T, un péptido aislado que se une al CTLA-4 humano en una cantidad efectiva para incrementar la proliferación de las células T.
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el péptido aislado tiene una región CDR3 de unión a CTLA-4 o una variante funcional de la misma.
29. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el trastorno sensible a la proliferación de células T es un tumor.
30. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el trastorno sensible a la proliferación de células T es una enfermedad de inmunodeficiencia.