CZ295272B6

CZ295272B6 - Polyvalentní vakcinační přípravek se smíšeným nosičem

Info

Publication number: CZ295272B6
Application number: CZ19994021A
Authority: CZ
Inventors: Odile Leroy
Original assignee: Pasteur Merieux Serums & Vaccins
Priority date: 1997-05-14
Filing date: 1998-05-14
Publication date: 2005-06-15
Also published as: JP2001525815A; PL189653B1; EP0983087A1; DE69827127T2; EP0983087B1; HUP0002322A3; IL183296A0; NO320415B1; KR100709628B1; NO995349L; KR20010012477A; CA2289009C; IL132669A; HUP0002322A2; CN1255861A; ES2227840T3; US20110117123A1; US8029798B2; CZ9904021A3; FR2763244A1

Abstract

Farmaceutický prostředek k léčbě nebo prevenci určitého množství infekcí způsobených patogenními agens jako jsou bakterie, který obsahuje imunogenní činitel, jeden nebo několik polyosidů odvozených z jednoho nebo několika patogenních agens. Polyosidy jsou ve formě konjugátů navázaných na nosičový protein. Prostředek obsahuje nejméně dva typy konjugátů, pro které jsou charakteristické různé nosičové proteiny.ŕ

Description

Oblast techniky

Předmětem tohoto vynálezu je farmaceutický prostředek určený k léčbě nebo prevenci řady infekčních onemocnění způsobených patogenními agens jako jsou bakterie, který jako imunogenně působící látku obsahuje polysacharidy odvozené z jednoho nebo více patogenních agens.

Dosavadní stav techniky

Bakterie stejně jako houby, jako například kvasinky, inkorporují polysacharidy do své povrchové struktury. Proto je většina bakterií pokryta výměškem polysacharidové podstaty, který je více či méně pevně připojen k bakterii, který však přesně řečeno není schránkou. Tento výměšek je nazýván glykokalyx nebo též pouzdro. Kromě toho se vnější membrána gramnegativních bakterií mimo jiné skládá rovněž z lipopolysacharidů (LPS). Polysacharidy byly nalezeny také ve stěně zhub. Tyto polysacharidy jsou ve skutečnosti povrchovými antigeny, kterémohou u infikovaných savců vyvolávat imunitní odpověď.

Takovéto polysacharidy jsou produkovány na základě jednotek, jejichž komponenty a vazby jsou definovány a které jsou charakteristické pro uvažované druhy bakterií a hub. Tyto opakující se jednotky obsahují epitopy, což je označení pro struktury, které určují antigenní vlastnosti.

Polysacharidy patogenních mikroorganismů mají pověst dobrých vakcinačních látek. Jako takové jsou účinné u dospělých a dětí starších dvou let. Na druhou stranu u kojenců jsou jen lehce nebo nejsou vůbec imunogenní a nevyvolávají žádnou imunitní odpověď. Tento problém je možno překonat metodou couplingu, tj. kovalentní vazbou polysacharidů natzv. nosičový protein jako je difterický nebo tetanový toxoid, čímž získáme konjugát polysacharidů a nosičového proteinu.

Jeden vakcinační prostředek může obsahovat několik konjugátů. Mimo jiné za účelem omezit množství přípravků podávaných jedinci během jeho života existuje trend kombinovat několik vakcinačních látek v smyslu zabránit vzniku nebo léčit infekce vyvolané patogenními agens různých druhů. Navíc i u stejných druhů může existovat několik séroskupin/sérotypů které jsou široce zastoupeny regionálně, nebo celosvětově. Připomeňme si, že séroskupiny/sérotypy jsou charakterizovány mj. polysacharidy pouzdra a že polysacharidy různých séroskupin obecně nevykazují zkříženou imunologickou reaktivitu. Proto, abychom mohli účinně bojovat s infekcemi způsobenými jedním a tím samým druhem, může být v tomto případě nutné kombinovat polysacharidy získané s různých séroskupin.

Z tohoto uvádíme například případ, kdy je zamýšleno očkovat proti infekci Streptococcus pneumoniae. Pneumokokové infekce jsou skutečným problémem veřejného zdravotnictví, zvláště od té doby, co byly objeveny v těžkých formách pneumonií, septikémií a meningitid. V průmyslových státech postihují každoročně 30 až 100 dětí na 100 000 dětí mladších tří let. Mortalita činí v případech bakteriémie a meningitidy 15 až 30 %, zatímco na pneumonií umírá 5 % dětí.

Studie prováděná v letech 1985 až 1989 ve Finsku ukazuje, že 90 % invazivních infekcí je způsobeno 8 skupinami séroskupin/sérotypů. Séroskupiny/sérotypy 14, 6 a 19 jsou odpovědné za 54 % příkladů, sérotyp 14 převažuje u dětí mladších dvou let. Ostatní často izolované pneumokoky náleží k séroskupinám 7, 18 a 23; zatímco další mnohem vzácnější náleží kséroskupinám/sérotypům 9 a 4. Podobné rozdělení bylo demonstrováno v dalších průmyslových státech, zvláště ve Spojených státech.

Streptococcus pneumonie je navíc zodpovědný za řadu infekčních otitid, které jsou sice mnohem benignější, ale mnohem běžnější. Počet dětí, které prodělají před šestým rokem věku infekční

-1 CZ 295272 B6 otitidu se zvýšilo asi na 75 % a počet infekčních otitid způsobených pneumokokem na 30 až 50 %. V rozvinutých zemích jsou pneumokokové infekční otitidy způsobeny ve 25 % séroskupinou 19, následovanou ve 13 % séroskupinou/sérotypem 23, ve 12 % séroskupinami/sérotypy 9 a 18 a ve 2 % séroskupinami/sérotypy 4 a 1.

Pneumokoková vakcína obsahující polysacharidy 23 sérotypů je již dostupná na trhu. Tato vakcína umožňuje bojovat účinně proti invazivním infekcím u dospělých a má přechodný účinek u dětí starších sedmi měsíců.

Polysacharidy pouzdra pneumokoků jsou T- independentní antigeny, to znamená, že mohou indukovat protilátky, zejména typu IgM, bez pomocí T buněk a nejsou schopny vyprovokovat masivní odpověď typu IgG. Po navázání na nosičový protein získají tyto polysacharidy schopnost indukovat T-dependentní odpověď zvláště u novorozenců a mohou zajistit dlouhodobou ochranu.

Ve Finsku a v Izraeli byly provedeny klinické studie se čtyřvalentními pneumokokovými vakcínami obsahujícími konjugáty 6B, 9V, 18C a 23F, ve kterých byly polysacharidy navázány buď na Dt, nebo Tt. Dávky činily 1, 3 nebo 10 pg póly sacharidu na každou valenci. Každý z těchto přípravků byl podáván zároveň s antihemofílovou vakcínou (polyribitolfosfát vázaný na Tt; ActHIB uvedený na trh firmou Pasteur Mérieux Connaught) a vakcínou proti diftérii, tetatu a čer20 nému kašli (v případě Finska, D.T. Coq uvedený na trh firmou KTL). Tyto tři podávání byly dále prováděny buď se současným podáváním perorální, nebo injekční poliovakcíny nebo bez něho. Podávání byla opakována dvakrát v několikatýdenních intervalech a poté ještě jednou rok po první imunizaci.

Výsledky těchto studií, jak jsou uvedeny níže v tabulce, umožnily demonstrovat účinek negativní interference nálože diftérického a tetanového toxoidu na indukci anti-HiB protilátek po poslední imunizaci.

Finská studie anti-HIB protilátky v pg/ml

placebo	11,00
čtyřvalentní pneumovakcína
Tt 1 pg	10,1
3 pg	7,18
10 pg	4,11
Dt 1 pg	11,5
3 Pg	12,5
10 pg	7,18
Izraelská studie
	anti-HIB protilátky v pg/ml
placebo	6,62
čtyřvalentní pneumovakcína
Tt 3 pg	2,81
Dt 3 pg	4,62

Podobná interference byla pozorována v průběhu klinické studie na Islandu, ve které bylo kojeným dětem podáván namísto přípravku Act-HIV přípravek Pro HIBit (PRP vázaný na Dt; Connaught).

Obecněji se předpokládá, že pokud jde o vakcínu založenou na konjugovaných polysacharidech, 40 maximální nálož Dt a Tt nebo kteréhokoliv jiného proteinu, který se vyskytuje v konjugovaných

-2CZ 295272 B6 vakcínách nebo ve spojení či kombinaci s podáváním výše uvedených vakcín, může snižovat imunitní odpověď proti polysacharidu s tímto proteinem konjugovaným. K překonání problému plynoucího z fenomové negativní interference, který vzniká v polyvalentních vakcínách složených z polysacharidových konjugátů, navrhuje přihláška tohoto vynálezu používat nikoliv jeden, nýbrž nejméně dva nosičové proteiny, tak aby nebylo dosaženo maximální nálože nosičového proteinu.

Podstata vynálezu

V souladu s tím je předmětem tohoto vynálezu prostředek obsahující „n“ konjugátů Cl až Cn, každý konjugát se skládá z 1) polysacharidu, zejména polysacharidu odvozeného z druhu Streptococcus pnezumoniae sérotypů/séroskupin S1 až Sn a 2) z nosičových proteinů PÍ až Pn, ve kterých „n“ je číslo rovno nebo vyšší než 2; ve kterém polysacharidy S1 až Sn jsou identické nebo odlišné, a ve kterém jsou nosičové proteiny PÍ až Pn nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z „m“ nosičových proteinů AI až Am, kde „m“ je číslo rovno nebo vyšší než 2, za předpokladu, že alespoň jeden z nosičových proteinů PÍ až Pn je odlišný od ostatních.

V souladu s dalším aspektem je předmětem tohoto vynálezu rovněž prostředek obsahující „n“ konjugátů Cl až Cn, každý konjugát se skládá z 1) polysacharidu S1 až Sn a 2) z nosičového proteinu PÍ až Pn, kde „n“ je číslo rovno nebo vyšší než 2; a ve kterém polysacharidy S1 až Sn jsou identické nebo odlišné, a ve kterém nosičové proteiny PÍ až Pn jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z difterického toxoidu neboli Dt a tetanového toxoidu neboli Tt, za předpokladu, že alespoň jeden z nosičových proteinů PÍ až Pn se liší od ostatních; a který je charakterizován množství Dt, popřípadě Tt v dávce menším nebo rovným 200 pg (v případě Dt) a 50 pg (v případě Tt). Jinými slovy obsahuje přípravek podle tohoto vynálezu jeden nebo více polysacharidových konjugátů, ve kterých je polysacharid navázán na difterický toxoid (Dt) ajeden nebo více polysacharidových konjugátů, ve kterých je polysacharid navázán na tetanový toxiid (Tt) a zároveň je množství Dt v jedné dávce menší nebo rovno 200 pg a množství Tt v jedné dávce menší nebo rovno 50 pg.

Pro ilustraci jsou uvedeny následující prostředky:

1) Prostředek obsahující nejméně tři konjugáty Cl, C2, C3, ... Cn, obecných vzorců Sl-Pl, S2-P2, S3-P3, ... Sn-Pn, ve kterých S1 až Sn jsou všechny identické a zároveň PÍ až Pn jsou všechny navzájem odlišné;

2) Prostředek obsahující nejméně tři konjugáty Cl, C2, C3,... Cn, obecných vzorců Sl-Pl, S2-P2, S3-P3, ... Sn-Pn, ve kteiých S1 až Sn jsou všechny navzájem odlišné, PÍ a P2 jsou navzájem identické, P3 až Pn jsou všechny identické a PÍ a P2 jsou odlišné od P3 až Pn; a

3) Prostředek obsahující nejméně tři konjugáty Cl, C2, C3, ...Cn, obecných vzorců Sl-Pl, S2-P2, S3-P3, ... Sn-Pn, ve kterých S1 a S2 jsou navzájem identické, S3 až Sn jsou navzájem identické, S1 a S2 jsou odlišné od S3 až Sn, PÍ a P3 jsou navzájem identické, P2 až Pn, s výjimkou P3, jsou všechny identické a PÍ a P3 jsou různé od P2 až Pn (s výjimkou P3).

Takto pro účely tohoto vynálezu mohou být konjugáty Cl až Cn, které jsou vždy nezbytně navzájem odlišné, spárovány podle svých polysacharidů nebo podle svých nosičových proteinů nebo podle svých polysacharidů a podle svých nosičových proteinů. V určitém provedení jsou všechny použité polysacharidy navzájem odlišné.

Množství konjugátů „n“ přítomných v prostředku podle tohoto vynálezu je rovno nebo vyšší než 2, zejména může být rovno nebo vyšší než 3, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 15 nebo 20. Obecně může být toto množství „n“ určeno odborníkem v oboru jako funkce množství kritérií spojených zejména s podstatou prostředku, s podmínku, které umožňují vytvoření prostředku, s podmínkami, které

-3CZ 295272 B6 umožňují vytvoření prostředku a s populací pro kterou je prostředek určen. Například u prostředku určeného k léčbě nebo prevenci pneumokokových infekcí u kojenců, je nutno uvážit, že takovýto prostředek by měl k tomu, aby dosáhl vhodnou úroveň ochrany, a to celosvětově, obsahovat nejméně 8, vhodněji nejméně 10, nejlépe nejméně 11 valencí, které mohou být reprezentovány nejméně 11 nebo více konjugáty.

Pod pojmem „polysacharid“ se rozumí polysacharid obsahující množství opakujících se sacharidových jednotek, zejména více než 4 opakující se sacharidové jednotky, nehledě na délku sacharidového řetězce a nehledě na průměrnou molekulární hmotnost polysacharidu. Tento pojem zahrnuje rovněž oligosacharidy.

Pod pojmem „konjugát“ se rozumí sloučenina, ve které je polysacharid kovalentně navázán na nosičový protein.

V souladu s tím, co bylo dříve uvedeno, by měl prostředek podle tohoto vynálezu využívat nejméně dva nosičové proteiny. Tyto nosičové proteiny mohou být vybrány z jakéhokoliv nosičového proteinu běžně používaného v oblasti vakcín. Může to být zejména difterický toxoid (Dt), tetanový toxoid (Tt), netoxická hybridní forma CRM197 difterického toxinu a proteinu vnější membrány typu jedna (ONP1) odvozený zNeisseria menningitidis nebo jakákoliv varianta, analog či fragment posledně uvedeného, u kterého je zachována nosičová schopnost. Metody, které umožní získat tyto proteiny v purifíkované formě, jsou dobře známy odborníkovi v oboru. Pojem „protein“, jak je používán v této přihlášce, zahrnuje jakékoliv aminokyselinové řetězce, bez ohledu na délce řetězce. Tento pojem zahrnuje rovněž peptid.

Obecně lze říci, že skupina proteinů AI až Am, ze kterých jsou nezávisle vybírány nosičové proteiny PÍ až Pn představuje proto všechny proteiny, které vykazují nosičový účinek. Pro svoji osobní potřebu může odborník v oboru připustit omezení výběru na určité množství proteinů a v souvislosti s tím mohou definovat skupinu, ze které budou provádět výběr, jako množství komponent „m“, které je rovno nebo vyšší než 2 a rovná se nejvýše „n“, přičemž „n“ odpovídá definici uvedené výše. Odborník v oboru může rovněž určit minimální množství různých nosičových proteinů, které jsou nutné k zamezení fenoménu interference. K tomuto musí vzít v úvahu maximální nálož, která by pro každý z nosičových proteinů neměla být překročena. Pojem „maximální nálož“ se vztahuje k množství nosičových proteinů uvedených výše, u kterých je pozorována snížená imunitní odpověď vůči jednomu nebo více polysacharidům, ve srovnání s příslušným monovalentním prostředkem (konjugáty jsou podávány separátně).

Zejména pokud se týká difterického a tetanového toxoidu odhaduje se, že výhodně by množství těchto proteinů přítomných v dávce prostředku sloučeniny podle tohoto vynálezu nemělo přesáhnout 200 pg, v druhém případě 50 pg, přičemž tato dávka je určena pro podání savcům, výhodně člověku. Výhodná nálož Dt je menší nebo rovna 150, 120 nebo 100 pg, výhodněji 80 nebo 60 pg. Výhodná Tt nálož je menší nebo rovna 35 pg nebo 25 pg, výhodněji 20 pg nebo 10 pg.

Z tohoto může být učiněn závěr, že u prostředku využívající pouze dva různé nosičové proteiny, bude protein vybrán ze skupiny sestávající z proteinů AI a A2. Výhodně budou AI a A2 difiterický toxoid (Dt) a tetovaný toxoid (Tt) pro každý prostředek nebo naopak.

Na základě specifického proteinu, je prostředek využívající pouze dva různé nosičové proteiny charakterizován vyváženou distribucí množství polysacharidů konjugovaných s prvním nosičovým proteinem a množstvím polysacharidů konjugovaných s druhým nosičovým proteinem. Například když „n“ je sudé číslo, „n“/2 nosičové proteiny od PÍ do Pn jsou AI a„n“/2 nosičové proteiny od PÍ do Pn jsou A2, nebo pokud „n“ je liché číslo, („n“+l)/2 nosičové proteiny od PÍ do Pn jsou AI a („n“-l)/2 nosičové proteiny od PÍ do Pn jsou A2.

Polysacharidem vhodným pro účely tohoto vynálezu může být zejména polysacharid bakteriálního nebo houbového původu. Může to být zejména polysacharid mikrobů Streptococcus, napří

-4CZ 295272 B6 klad druhu Streptococcus pneumoniae, Staphyloccocus, Klebsiella, Salmonella, například Salmonella typhi, Escherichia, Shigella, Neisseria, například Neisseria meningitidis, Haemophilus, například Haemophilus influenzae, Moraxella, Vibrio cholerae nebo Mycobacterium tuberculosis.

V prostředku podle vynálezu mohou být polysacharidy odvozené od různých druhů nebo naopak mohou všechny být odvozeny od stejného druhu, například od stejného bakteriálního druhu, případně od různých séroskupin/sérotypů. Pro ilustraci této poslední možnosti může být zmíněn prostředek podle tohoto vynálezu zamýšlený k očkování proti pneumokokovým infekcím, který obsahuje nejméně 8 valencí, výhodně 10 nebo 11 valencí vybraných ze sérotypů 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19Fa23F.

Proto prostředek tvořící pneumokokovou vakcínu výhodně obsahuje 10 nebo 11 valencí, představovaných například 10 nebo 11 konjugáty, ve kterých se polysacharidy vzájemně jeden od druhého liší a jsou odvozeny (mají jako původ) sérotypy/séroskupin vybrané ze sérotypů 1, 3, 4, 5, 6b, 7F, 9 V, 14, 18C, 19F a 23F Streprotoccus pneumoniae. Může to být zejména prostředek obsahující 10 nebo 11 konjugátů vybraných z:

- polysacharidu sérotypů 1 navázaného na Tt nebo Dt;

- polysacharidu sérotypů 3 navázaného na Dt;

- polysacharidu sérotypů 4 navázaného na Tt;

- polysacharidu sérotypů 5 navázaného na Tt nebo Dt;

- polysacharidu sérotypů B6 navázaného na Dt;

- polysacharidu sérotypů F7 navázaného na Tt nebo Dt;

- polysacharidu sérotypů 9V navázaného na Tt;

- polysacharidu sérotypů 14 navázaného na Dt;

- polysacharidu sérotypů 18C navázaného na Dt;

- polysacharidu sérotypů 19F navázaného na Tt; a

- polysacharidu sérotypů 23F navázaného na Tt.

Z jiného hlediska může prostředek tvořící pneumokokovou vakcínou obsahovat 10 nebo 11 valencí představovaných 12 až 22, zvláště 12 až 15 konjugáty, ve kterých jsou polysacharidy odvozené od sérotypů vybraných ze sérotypů 1, 3, 5, 6, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F a 23F, ve kterých se konjugáty prostředku stejné valence liší navzájem nosičovým proteinem.

Může to být zejména prostředek zahrnující:

- polysacharidu sérotypů 1 navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypů 3 navázaný na Dt;

- polysacharidu sérotypů 4 navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypů 5 navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypů 6B navázaný na Dt;

- polysacharidu sérotypů 6B navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypů 7F navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypů 9V navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypů 9V navázaný na Dt;

- polysacharidu sérotypů 14 navázaný na Dt;

- polysacharidu sérotypů 18C navázaný na Dt;

- polysacharidu sérotypů 18C navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypů 19F navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypů 23F navázaný na Tt; a

- polysacharidu sérotypů 23F navázaný na Dt.

-5 CZ 295272 B6

Takový polysacharid může být výhodně běžnými metodami extrahován a purifíkován z mikroorganismu. Tento polysacharid může být po extrakci/purifíkaci použit v surové podobě. Alternativně může být fragmentován, abychom získali polysacharid s nižší průměrnou molekulovou hmotností než je hmotnost původně extrahovaného polysacharidu. Zvláště výhodná metoda fermentace je popsána v publikaci WO 93/7178, která je včleněna ve formě reference.

Konjugát, ve kterém je polysacharid spojen kovalentní vazbou s nosičovým proteinem, může být získán běžnou metodou dobře známou odborníkovi v oboru. Pro realizaci konjugace lze využít mezičlánek nebo můstek. V závislosti na druhu použité konjugace může být výsledkem této konjugace konjugát, ve kterém je polysacharid spojen s proteinem jednoduchou chemickou funkcí (radiální nebo neoglykokonjugátový typ) nebo několika funkcemi (náhodně spirálový typ). Odborník zkušený v oboru je schopen určit nejvhodnější způsob konjugace jako funkci odpovídající povaze polysacharidu a zejména chemických skupin umístěných na polysacharidu, které mohou být využity během konjugační reakce.

Prostředek podle tohoto vynálezu může být vyráběn běžným způsobem. Může být zejména zpracován s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo vehikulem, například vodou nebo roztokem chloridu sodného. Navíc může prostředek obsahovat obvyklé složky jako pufr, konzervační prostředek, stabilizátor, adjuvans jako je sloučenina hliníku, např. hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý nebo hydroxyfosforečnan hlinitý a pokud je to vhodné lyofilizační činidlo. Obecně vzato mohou být tyto prostředky vybrány jako funkce způsobu a cestu podání a založeny na standardní farmaceutické praxi. Příslušné nosiče nebo ředidla, stejně jako důležité součásti přípravy farmaceutických prostředků jsou popsány v Remingtonově Pharmaceutical Sciences, základní referenční publikaci oboru.

Prostředek podle tohoto vynálezu může být podáván jakoukoliv běžnou cestou, obvyklou pro vakcíny, zejména systémovou, např. parenterální cestou, např. subkutánně, intramuskulámě, intradermálně nebo intravenózně nebo na sliznici, např. orálně nebo nazálně.

Podání se může uskutečnit v jedné dávce nebo v opakovaných dávkách jednou nebo vícekrát, např. jednou, dvakrát nebo třikrát, po určitých časových intervalech. Příslušná dávka se bude lišit jako funkce podle různých parametrů, například počtu valencí obsažených v prostředku, povahy použitého (ých) polysacharidu(ů) nebo způsobu podání. Jako vodítko může posloužit fakt, že dobrých výsledků může být dosaženo pomocí dávky polysacharidu od 0,5 do 100 pg na jednu valenci, výhodně od 1 do 50 pg, výhodněji od 1 do 10 pg. Dávka prostředku podle tohoto vynálezu může být výhodně podána v objemu od 0,1 do 2 ml.

Dále následují, formou příkladů, různé polyvalentní pneumokokové vakcíny, ve kterých jsou valence vybrané ze sérotypů 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F a 23F. Polysacharidy odvozené do těchto sérotypů mohou být fragmentovány způsobem, popsaným v publikaci WO 93/7178. Polysacharidy navázané na Tt (vyjma polysacharidu typu 1) byly navázány podle konjugační metody popsané v publikaci WO 93/7178. Ve stručnosti, polysacharid je podroben redukční aminaci za přítomnosti kyanborhydridu sodného tak, aby se spojila molekula diaminohexanu s koncovou redukující skupinou. Takto derivovaný polysacharid je následně aktivován sukcinimidovou skupinou pomocí disukcinimidylsuberátu (DSS). Takto aktivovaný polysacharid přímo reaguje s nosičovým proteinem. Polysacharid sérotypů 1 byl navázán na Dt až Tt (přesná citace) konjugační metodou popsanou v patentu SU 5 204 098, který je začleněn formou reference. Ostatní polysacharidy navázané na Dt se připojí následně: hydrazidové skupiny se včlení do polysacharidu reakcí polysacharidu s přebytkem dihydrazidu kyseliny adipové (ADH) za přítomnosti aethyldimethylaminopropylkarbodiimidu (EDAC) a kyanborhydridu sodného (pro všechny typy kromě 3) nebo jednoduše za přítomnosti kyanborhydridu sodného (v případě typu 3). Takto odvozený polysacharid se nechá reagovat s nosičovým proteinem za přítomnosti EDAC. Experimentální podmínky se řídí tak, aby se získal konjugát, ve kterém je množství proteinu jednou až čtyřikrát, výhodně dvakrát větší než množství polysacharidu. Takto se v rámci jedné dávky 3 pg

-6CZ 295272 B6 určitého polysacharidu naváží na asi 6 pg Dt a 1 pg určitého polysacharidu se naváže na asi 2 pg

Tt.

Použité Dt a Tt se připraví detoxifínací s formaldehydem z výchozích toxinů extrahovaných z Corynebacterium diphtheriae, popřípadě z Clostridium tetani.

Přípravky obsahují fosfátový pufr v množství obsahujícím 0,475 mg iontů PO₄ ²' na dávku a chlorid sodný v množství 4,5 mg na dávku a mohou být doplněny adjuvans hydroxidem hlinitým (alum) v množství obsahujícím 300 pg iontu Al³⁺ na dávku se mohou obsahovat konzervační přípravek jako fenoxyethanolformalin. Dávka je v objemu 0,5 ml.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Osmivalentní přípravek

nosičový protein	sérotyp	polysacharid
množství n	a jednorázovou dávku
Dt	3		3 pg
Tt	4		i pg
Dt	6B		10 pg
Tt	9V		1 pg
Dt	14		3 pg
Dt	18C		3 pg
Tt	19F		i pg
Tt	23F		1 Pg

Příklad 2

Přípravky F3, F4 a F3 bis obsahující 11 valencí polysacharid

nosičový protein	séroskupina/sérotyp	množství na jednotí, dávku přídavku F3 (pg)	množství na jednotí, dávku přípravku F4 (pg)	množství na jednotí, dávku přípravku F3 bis (pg)
Tt	1	1	—	1
Dt	1	—	3	—
Dt	3	3	3	3
Tf	4	1	1	1
Tt	5	1	—	1
Dt	5	-	3
Dt	6B	10	10	3
Tt	6B	—	—	1
Tt	7F	1	—	1
Dt	7F	-	3	—
Tt	9V	1	1	1
Dt	9V		—	3
Dt	14	3	3	3
Dt	18C	3	3	3
Tt	18C	-	—	1
Tt	19F	1	1	1
Tt	23F	1	1	1
Dt	23F	-	-	3
Přibližná nálož proteinu v každém ze tří přípravků je následující:
	F3		F4	F3 bis

Dt

Tt asi 40 pg asi 60 pg asi 40 pg asi 15 pg asi 8 pg asi 18 pg (což odpovídá poměru hmotností protein/polysacharid v hodnotě asi 2).

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Prostředek, vyznačující se tím, že je tvořen „n“ konjugáty Cl až Cn, každý konjugát se skládá z 1) polysacharidu odvozeného z druhu Streptococcus pneumoniae sérotypu/séroskupiny S1 až Sn a 2) znosičového proteinu PÍ až Pn; ve kterém „n“ je číslo rovno nebo vyšší než 2; přičemž prostředek, ve kterém póly sacharidy S1 až Sn jsou identické nebo odlišné, a ve kterém jsou nosičové proteiny PÍ až Pn nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z „m“ nosičových proteinů AI až Am, kde „m“ je číslo rovno nebo vyšší než 2, za předpokladu, že alespoň jeden z nosičových proteinů PÍ až Pn je odlišný od ostatních.

2. Prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že všechny konjugáty Cl až Cn jsou navzájem odlišné buď svým polysacharidem, nebo svým nosičovým proteinem nebo svým polysacharidem a nosičovým proteinem.

3. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že všechny polysacharidy S1 až Snj

4. Prostředek podle nároků 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že „n“ je číslo rovno nebo větší než 6.

5. Prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že „n“je číslo rovno nebo větší než 10.

6. Prostředek podle jednoho z nároků 1 až 5,vyznačující se tím, že nosičové proteiny PÍ až Pn jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající ze dvou nosičových proteinů AI a A2.

7. Prostředek podle nároku 6, vyznaču j ící se tím, že pokud „n“ je liché číslo „n“/2 nosičové proteiny PÍ až Pn jsou AI a „n“/2 nosičové proteiny PÍ až Pn jsou A2, nebo pokud „n“ je sudé číslo, („n“+l)/2 nosičové proteiny PÍ až Pn jsou AI a („n“-l/2 nosičové proteiny PÍ až Pn jsou A2.

8. Prostředek podle jednoho z nároků 1 až 7, v y z n a č u j í c í se t í m , že alespoň jeden z nosičových proteinů PÍ až Pn je difterický toxoid neboli Dt a alespoň jeden z nosičových proteinů PÍ až Pn je tetanový toxoid neboli Tt.

9. Prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že nosičové proteiny PÍ až Pn jsou vybrány ze skupiny sestávající z Dt a Tt.

10. Prostředek podle nároku 8 nebo 9, v y z n a č u j í c í se tí m , že množství Dt v dávce je menší nebo rovno 200 pg.

11. Prostředek podle nároků 8, 9 nebo 10, vyznačující se tím, že množství Tt v dávce je menší nebo rovno 50 pg.

12. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje 10 nebo 11 valencí představovaných 10 nebo 11 konjugáty, ve kterých se všechny polysacharidy navzájem liší a jsou odvozeny ze sérotypů vybraných ze sérotypů 1 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F a 23F druhu Stroptococcus pneomoniae.

13. Prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že obsahuje 10 nebo 11 konjugátů vybraných z:

- polysacharidu sérotypů 1 navázaného na Tt nebo Dt;

- polysacharidu sérotypů 3 navázaného na Dt;

- polysacharidu sérotypů 4 navázaného na Tt;

- polysacharidu sérotypů 5 navázaného na Tt nebo Dt;

- polysacharidu sérotypů 6B navázaného na Dt;

- polysacharidu sérotypů 7F navázaného na Tt nebo Dt;

polysacharidu sérotypů 9V navázaného na Tt;

- polysacharidu sérotypů 14 navázaného na Dt;

- polysacharidu sérotypů 18C navázaného na Dt;

- polysacharidu sérotypů 19F navázaného na Tt; a

- polysacharidu sérotypů 23F navázaného na Tt.

14. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje 10 nebo 11 valencí představovaných 12 až 22, zejména 12 až 15 konjugáty, ve kterém jsou polysacharidy odvozené ze sérotypů vybraných ze sérotypů 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F a 23F, a ve kterém se konjugáty stejné valence navzájem liší nosičovým proteinem.

15. Prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že obsahuje:

- polysacharidu sérotypů 1 navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypů 3 navázaný na Dt;

-9CZ 295272 B6

- polysacharidu sérotypu 4 navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypu 5 navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypu 6B navázaný na Dt;

- polysacharidu sérotypu 6B navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypu 7F navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypu 9V navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypu 9V navázaný na Dt;

- polysacharidu sérotypu 14 navázaný na Dt;

- polysacharidu sérotypu 18C navázaný na Dt;

- polysacharidu sérotypu 18C navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypu 19F navázaný na Tt;

- polysacharidu sérotypu 23F navázaný na Tt; a

- polysacharidu sérotypu 23F navázaný na Dt.

16. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje „n“ konjugáty Cl až Cn, každý konjugát se skládá z 1) polysacharidu SI až Sn a 2) z nosičového proteinu PÍ až Pn; kde „n“ je číslo rovné nebo vyšší než 2; přičemž v prostředku polysacharidy SI až Sn jsou identické nebo různé, a ve které nosičové proteiny PÍ až Pn jsou vybrány nezávisle ze skupiny sestávající z difterického toxoidu neboli Dt a tetanového toxoidu neboli Tt, za předpokladu, že alespoň jeden z nosičových proteinů PÍ až Pn se liší od ostatních; a kteiý je charakterizován množstvím Dt, popřípadě Tt v dávce menší nebo rovné 200 pg v případě Dt a 50 pg v případě Tt.

17. Prostředek podle nároku 16, vyznačující se tím, že všechny konjugáty Cl až Cn jsou navzájem odlišné buď svým polysacharidem, nebo svým nosičovým proteinem nebo svým polysacharidem a nosičovým proteinem.

18. Prostředek podle nároku 17, vyznačující se tím, že polysacharidy SI až Sn jsou všechny navzájem odlišné.

19. Prostředek podle nároků 16, 17 nebo 18, vyznačující se tím, že „n“ je číslo rovno nebo vyšší než 6.

20. Prostředek podle nároku 19, vyznačující se tím, že „n“ je číslo rovno nebo vyšší než 10.

21. Prostředek podle jednoho z nároků 16 až 20, vyznačující se tím, že polysacharidy SI až Sn jsou bakteriálního původu.

22. Prostředek podle nároku 21,vyznačující se tím, že všechny polysacharidy SI až Sn jsou odvozeny od stejného druhu bakterií.

Prostředek podle nároku 22, vyznačující se tím, že všechny polysacharidy SI až Sn jsou odvozeny od druhu Streptococcus pneumoniae.