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KR102812816B1 - 다가 폐렴구균성 다당류-단백질 접합체 조성물 - Google Patents

다가 폐렴구균성 다당류-단백질 접합체 조성물 Download PDF

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KR102812816B1
KR102812816B1 KR1020207025714A KR20207025714A KR102812816B1 KR 102812816 B1 KR102812816 B1 KR 102812816B1 KR 1020207025714 A KR1020207025714 A KR 1020207025714A KR 20207025714 A KR20207025714 A KR 20207025714A KR 102812816 B1 KR102812816 B1 KR 102812816B1
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serotype
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안경준
함동수
김훈
김성현
신진환
로버트 홉퍼
리차드 디. 켄싱어
모에 캬우
필립 타라가
Original Assignee
사노피 파스퇴르 인코포레이티드
에스케이바이오사이언스(주)
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Abstract

21개의 상이한 폐렴구균성 협막 다당류-단백질 접합체를 포함하는 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물로서, 접합체의 각각이 파상풍 톡소이드 (TT) 또는 CRM197 중 어느 하나에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아의 상이한 혈청형으로부터의 협막 다당류를 포함하고, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형이 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F로부터 선택되고, 혈청형 1, 3, 및 5 중 2개 혈청형의 협막 다당류가 TT에 접합되고 잔여 협막 다당류가 CRM197에 접합되는 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물이 제공된다. 상기 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물의 생산 방법 그리고 대상체에서 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염 또는 질환에 대한 예방을 위한 동종의 이용 방법이 또한 제공된다.

Description

다가 폐렴구균성 다당류-단백질 접합체 조성물
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 2018년 2월 5일 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/626,482, 및 2018년 4월 18일 출원된 한국 특허 출원 번호 10-2018-0045246의 이익을 주장하고, 상기의 출원일을 신뢰하고, 이의 전체 개시내용은 참고로 본원에서 편입된다.
기술 분야
본원은 일반적으로 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물, 동종을 포함하는 백신 그리고 대상체에서 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 감염 또는 질환의 예방을 위한 이들 조성물 및 백신의 사용 방법에 관한 것이다.
배경
폐렴구균 (스트렙토코쿠스 뉴모니아)은 90개 넘는 공지된 혈청형을 가진 그람-양성, 란셋형, 통성 혐기성 박테리아이다. 대부분의 에스. 뉴모니아 혈청형은 전세계적 침습성 질환의 대략 90%를 차지하는 23개의 가장 흔한 혈청형으로, 질환을 야기시킨다고 밝혀졌다. 혈청형은 폐렴구균에 대하여 가장 중요한 독성 인자인 협막 다당류의 혈청학적 반응에 근거하여 분류된다. 협막 다당류는 T 헬퍼 세포의 부재 하에서 항체 생산을 유도하는 T-세포 비의존성 항원이다. T-세포 비의존성 항원은 일반적으로 거의 없는 면역 기억과 낮은 친화도 및 단명하는 면역 반응을 가진 항체를 유도한다.
초기 폐렴구균성 백신은 상이한 혈청형으로부터 협막 다당류의 조합을 포함하였다. 이들 백신은 발달된 또는 건강한 면역계를 가진 환자에서 에스. 뉴모니아에 대해 면역력을 부여할 수 있지만, 이들은 발달된 면역계가 부족한 유아, 그리고 종종 손상된 면역 기능을 가지고 있는 고령 대상체에서 효과적이지 않았다. 에스. 뉴모니아 감염 발병의 더욱 높은 위험에 처해 있는 유아 및 고령 대상체에서 특히, 폐렴구균성 백신에 면역 반응을 개선하기 위해, 협막 다당류는 적당한 담체 단백질에 접합되어 폐렴구균성 접합체 백신을 창출하였다. 적당한 담체 단백질에의 접합은 T-세포 비의존성 항원부터 T-세포 의존성 항원까지 협막 다당류를 변화시킨다. 이와 같이, 접합된 협막 다당류에 대한 면역 반응은 T 헬퍼 세포를 연루시키고, 이는 협막 다당류에 재-노출시 더욱 잠재적이고 신속한 면역 반응 유도를 돕는다.
폐렴구균성 접합체 백신 개발에 대한 적어도 2개의 접근법이 있다: 단일 담체 접근법 및 혼합 담체 접근법. 상이한 협막 다당류 접합체의 면역원성은 사용된 폐렴구균성 혈청형 및 담체 단백질에 따라 다양할 수 있다. 단일 담체 접근법에서, 상이한 혈청형으로부터의 협막 다당류는 단일 단백질 담체에 접합된다. 화이자(Pfizer) 사의 PREVNAR 시리즈의 백신은 글리신에 대한 글루탐산의 단일 아미노산 치환을 갖는 디프테리아 톡소이드의 비-독성 변이체인 CRM197 단백질 담체에 상이한 협막 다당류가 접합되는 단일 담체 접근법의 일례이다. 7-가 PREVNAR 백신 (PREVNAR)은 2000년에 최초 승인되었고 7개의 가장 유행하는 혈청형: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로부터 협막 다당류를 함유한다. 13-가 백신인 PREVNAR 13은 혈청형 1, 5, 7F, 3, 6A, 및 19A를 CRM197 단백질 담체에 첨가하였다. PREVNAR 백신에서 사용된 단일 담체인, 단백질 담체 CRM197은 폐렴구균성 접합체 백신에서 혼합 담체 시스템의 일부로서 전혀 사용되지 않았다.
제 2 폐렴구균성 백신 접근법은 혼합 담체 접근법이다. 혼합 담체 접근법에서, 단일 단백질 담체의 사용 대신, 2개 이상의 단백질 담체는, 제 1 단백질 담체에 접합된 특이적 혈청형으로부터 협막 다당류 및 적어도 제 2, 상이한 단백질 담체에 접합된 상이한 혈청형으로부터 협막 다당류와 사용된다. 예를 들어, 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline) 사는 단백질 담체로서 H 인플루엔자 (H influenzae) 단백질 D, 파상풍 톡소이드, 및 디프테리아 톡소이드를 사용하는 10-가 (혈청형 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F), 혼합 담체, 폐렴구균성 접합체 백신인, SYNFLORIX를 개발하였다. SYNFLORIX에서, 혈청형 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 및 23F는 단백질 D에 접합되고; 혈청형 18C는 파상풍 톡소이드에 접합되고; 혈청형 19F는 디프테리아 톡소이드에 접합된다 [2]. 혈청형 3이 SYNFLORIX에 대한 11-가 전구체로부터 제거되었던 것은, 부분적으로, 급성 중이염 시험에서 혈청형-특이적 효능을 나타내지 않았기 때문이었다 [1]. 또 다른 그룹인, 아벤티스 파스테르(Aventis Pasteur)는 단백질 담체로서 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드를 사용하는 11-가 (혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 및 23F), 혼합 담체, 폐렴구균성 접합체 백신을 개발하였다 [3]. 혈청형 3, 9V, 14, 및 18C로부터 협막 다당류는 이들이 파상풍 톡소이드에 접합하였던 경우 하는 것보다 디프테리아 톡소이드에 접합하였던 경우 더욱 양호한 반응을 유발시킬 수 있다 [6]. 따라서, 혈청형 3, 6B, 14, 및 18C는 디프테리아 독소에 접합되었고 혈청형 1, 4, 5, 7F, 9V, 19F, 및 23F는 파상풍 톡소이드에 접합되었다. 본 혼합 담체, 폐렴구균성 백신의 개발은 부분적으로, 무세포 백일해 백신으로 투여된 경우 감소된 반응의 잠재력 및 기술적 이유로 인해 종결되었다 [3]. 최근, 혈청형 5 뿐만 아니라 1은 모든 PREVNAR 13 혈청형으로부터 최저 관찰된 OPA 역가들 중 하나를 갖는 것으로 보고되었고, 여기에서 IgG 역가와 OPA 활성 사이 연관된 상관관계가 있었다 [4]. 또한 혈청형 3에 대하여, 훨씬 더 많은 혈청 IgG 농도가 보호를 위하여 필요할 것임이 제안되었다 [5].
개요
본원은 새로운 및 개선된 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물 그리고 동종을 포함하는 백신을 제공한다. 일 양태에서, 본원은, 21개의 상이한 폐렴구균성 협막 다당류-단백질 접합체를 포함하는, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물을 제공하고, 여기서 각 폐렴구균성 협막 다당류-단백질 접합체는 스트렙토코쿠스 뉴모니아의 상이한 혈청형으로부터 협막 다당류에 접합된 단백질 담체를 포함하고, 여기서 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형은 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터 선택되고, 여기서 단백질 담체는 CRM197 또는 파상풍 톡소이드이고, 여기서 협막 다당류들 중 2개는 파상풍 톡소이드에 접합되고 잔여 협막 다당류는 CRM197에 접합되고, 여기서 파상풍 톡소이드에 접합되는 2개의 협막 다당류는 혈청형 1, 3, 및 5로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물의 일부 구현예에서, 혈청형 1 및 5로부터 협막 다당류는 파상풍 톡소이드에 접합되고, 혈청형 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F으로부터 협막 다당류는 CRM197에 접합된다.
혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물의 또 다른 구현예에서, 혈청형 1 및 3으로부터 협막 다당류는 파상풍 톡소이드에 접합되고, 혈청형 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F로부터 협막 다당류는 CRM197에 접합된다.
혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물의 또 다른 구현예에서, 혈청형 3 및 5로부터 협막 다당류는 파상풍 톡소이드에 접합되고, 혈청형 1, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F으로부터 협막 다당류는 CRM197에 접합된다.
일부 구현예에서, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물은 추가로 아쥬반트, 예컨대, 비제한적으로 인산알루미늄, 황산알루미늄, 및 수산화알루미늄을 포함하는, 알루미늄계 아쥬반트를 포함한다.
또 다른 양태는 백신으로서 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물의 용도에 관련된다.
더욱 또 다른 양태는 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 백신에 관련된다.
더욱 또 다른 양태는 대상체, 예컨대 인간에서 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염 또는 질환의 예방 방법으로서, 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물 또는 동종을 포함하는 백신의 예방적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관련된다.
특정 구현예에서, 대상체는 적어도 50 세인 인간이고 질환은 폐렴 또는 침습성 폐렴구균성 질환 (IPD)이다.
다른 구현예에서, 대상체는 적어도 생후 6 주의 인간이고 질환은 폐렴, 침습성 폐렴구균성 질환 (IPD), 또는 급성 중이염 (AOM)이다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 생후 6 주 내지 5살이다. 다른 구현예에서, 인간 대상체는 생후 2 내지 15 개월 또는 6 내지 17살이다.
특정 구현예에서, 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물 또는 백신은 근육내 주사로 투여된다. 특정 구현예에서, 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물 또는 백신은 면역화 시리즈의 일부로서 투여된다.
더욱 또 다른 양태는, 하기를 함유하는, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N의 면역원성 접합체에 관련된다: 스트렙토코쿠스 뉴모니아로부터 혈청형 9N 협막 당류; 및 협막 당류에 결합된 담체 단백질, 여기서 담체 단백질은 CRM197임. 면역원성 혈청형 9N 접합체, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물 및 백신 (및 동종의 방법/용도)의 특정 구현예에서, 혈청형 9N 당류는 2-19 또는 5-10의 산화도 및 200-700 kDa의 분자량을 갖도록 활성화되는 상태에서 접합체를 형성하기 위해 CRM197에 결합될 수 있다. 면역원성 혈청형 9N 접합체, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물 및 백신 (및 동종의 방법/용도)의 특정 구현예에서, 면역원성 혈청형 9N 접합체는 500-4,000 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
면역원성 혈청형 9N 접합체, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물 및 백신 (및 동종의 방법/용도)의 특정 구현예에서, 면역원성 혈청형 9N 접합체에 있어서 혈청형 9N 협막 당류 대 담체 단백질의 비율은 0.1-5 (w/w)이다. 특정 구현예에서, 비율은 0.5-2.5이다.
면역원성 혈청형 9N 접합체, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물 및 백신 (및 동종의 방법/용도)의 특정 구현예에서, 면역원성 혈청형 9N 접합체의 15-60%는 CL-4B 컬럼에서 0.3 이하의 Kd를 가질 수 있다.
면역원성 혈청형 9N 접합체, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물 및 백신 (및 동종의 방법/용도)의 특정 구현예에서, 면역원성 혈청형 9N 접합체는 2-19의 산화도를 달성하기 위해 활성화된 혈청형 9N 다당류로 제조되어 왔다. 특정 구현예에서, 면역원성 혈청형 9N 접합체는 5-10의 산화도를 달성하기 위해 활성화된 혈청형 9N 다당류로 제조되어 왔다.
면역원성 혈청형 9N 접합체, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물 및 백신 (및 동종의 방법/용도)의 특정 구현예에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N 당류가 당의 1 μg 당 과요오드산염의 0.02-0.19 μg을 첨가함으로써 CRM197과 접합되는 경우, 접합체는 500-4,000 kDa의 분자량, 15-60%의 분자량 분포 (Kd ≤0.3) 및 0.5-2.5의 당류/단백질 비율을 가질 수 있다.
더욱 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 또한, 하기 단계를 포함하는, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N의 면역원성 접합체의 제조 방법을 제공한다:
(a) 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N 협막 다당류를 발효시킴으로써 상기 동종을 생산하는 박테리아성 세포를 용해시키는 단계;
(b) 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N 협막 당류를 용해된 세포로부터 정제시키는 단계;
(c) 산화제와 반응시킴으로써 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N 협막 다당류를 활성화시켜 2-19 또는 5-10의 산화도를 달성하는 단계; 및
(d) 활성화된 당류를 CRM197과 혼합시킴으로써 CRM197에 결합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N 협막 당류의 접합체를 형성하는 단계.
특정 구현예에서, 단계 (d)에서 혼합된 CRM197은 환원제와 반응되어 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N 협막 다당류를 가진 접합체를 형성할 수 있다. 특정 구현예에서, 단계 (c)에서, 과요오드산염의 0.02-0.19 μg은 20-25 ℃에서 15-20 시간 동안 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N 협막 다당류의 1 μg과 반응될 수 있다.
특정 구현예에서, 단계 (c)에서 산화제와 반응된 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N 협막 다당류는 400-900 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 단계 (d)에서 CRM197과 혼합된 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N 협막 다당류는 200-700 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N의 면역원성 접합체는 500-4,000 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, CRM197 대 활성화된 혈청형 9N 협막 당류의 초기 투입 비율 (담체 CRM197:당류)는 0.5-2.5:1일 수 있다. 특정 구현예에서, 면역원성 접합체의 적어도 15-60%는 CL-4B 컬럼에서 측정된 경우 0.3 이하의 Kd를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N 다당류는 당의 1 μg 당 과요오드산염의 0.02-0.19 μg을 첨가함으로써 CRM197과 접합되고, 면역원성 접합체는 500-4,000 kDa의 분자량, CL-4B 컬럼에서 측정된 경우 15-60%의 분자량 분포 (Kd ≤ 0.3) 및 0.5-2.5의 CRM197/다당류 비율을 갖는다.
혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물의 상기 및 기타 목표, 특성, 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
정의
본 개시내용이 더욱 용이하게 이해되기 위해, 특정 용어는 먼저 아래 정의된다. 후속 용어 및 기타 용어에 대한 추가의 정의는 본 명세서를 통해 제시될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수의 형태 "한", "하나", 및 "상기"는 문맥이 달리 명확히 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 따라서 예를 들어, "한 방법" 지칭은 본 개시내용 및 기타 등등을 읽자마자 당업자에게 명백해질 및/또는 본원에서 기재된 유형의 하나 이상의 방법, 및/또는 단계를 포함한다.
투여하다: 본원에서 사용된 바와 같이, 대상체에게 조성물 "투여"는 조성물을 대상체에게 주거나, 바르거나 또는 접촉하는 것을 의미한다. 투여는 임의의 다수의 경로, 예컨대, 예를 들어, 국부, 구강, 피하, 근육내, 복막내, 정맥내, 척수내 및 피내로 달성될 수 있다.
대략: 본원에서 사용된 바와 같이, 하나 이상의 값에 적용되는 경우, 용어 "대략" 또는 "약"은 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되지 않는 한 또는 달리 문맥으로부터 분명하지 않는 한 언급된 참조 값의 어느 한쪽 방향 (초과 또는 미만)으로 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 또는 그 미만의 값 내에 해당하는 값의 범위를 지칭한다 (그와 같은 수가 가능한 값의 100 %를 초과할 경우 제외).
접합체: 본원에서 사용된 바와 같이, 그리고 적합한 문맥으로부터 이해되는 바와 같이, 용어들 "접합체(들)" 또는 "당접합체(들)"은 임의의 공유 또는 비-공유 생접착 전략을 사용하여 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아 다당류를 지칭한다.
산화도: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "산화도" (DO)는 정제된 또는 크기조절된 당류가 산화제로 활성화되는 경우 생성된 알데히드기당 당 반복 단위의 수를 지칭한다. 당류의 산화도는 종래 기술에서 숙련가에 공지된 일상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
부형제: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는, 예를 들어 원하는 지속성 또는 안정화 효과를 제공하거나 이에 기여하기 위해 조성물에서 포함될 수 있는 비-치료 제제를 지칭한다.
혼합 담체: 본원에서 사용된 바와 같이, 혼합 담체, 폐렴구균성 접합체 조성물은 단백질 담체의 1 초과 유형을 갖는 폐렴구균성 접합체 조성물을 지칭한다.
혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물(들)"은 21개의 상이한 폐렴구균성 협막 다당류-단백질 접합체를 포함하거나 상기로 이루어지는 조성물을 지칭하고, 여기서 각 폐렴구균성 협막 다당류-단백질 접합체는 스트렙토코쿠스 뉴모니아의 상이한 혈청형으로부터 협막 다당류에 접합된 단백질 담체를 포함하고, 여기서 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형은 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F이고, 여기서 단백질 담체는 CRM197 또는 파상풍 톡소이드이고, 여기서 협막 다당류들 중 2개는 파상풍 톡소이드에 접합되고 잔여 협막 다당류는 CRM197에 접합되고, 여기서 파상풍 톡소이드에 접합되는 2개의 협막 다당류는 혈청형 1, 3, 및 5로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 혈청형 1 및 5로부터 협막 다당류는 파상풍 톡소이드에 접합되고, 잔여 혈청형으로부터 협막 다당류는 CRM197에 접합된다. 일부 구현예에서, 혈청형 1 및 3으로부터 협막 다당류는 파상풍 톡소이드에 접합되고, 잔여 혈청형으로부터 협막 다당류는 CRM197에 접합된다. 또 다른 구현예에서, 혈청형 3 및 5로부터 협막 다당류는 파상풍 톡소이드에 접합되고, 잔여 협막 다당류는 CRM197에 접합된다.
분자량: 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, 협막 당류 또는 협막 당류-담체 단백질 접합체의 용어 "분자량"은 다각도 레이저 광산란 (MALLS)와 조합으로 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 계산된 평균 분자량을 지칭한다.
다가: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "다가"는 1 초과 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형으로부터 폐렴구균성 협막 다당류를 갖는 폐렴구균성 접합체 조성물을 지칭한다.
약제학적으로 허용가능한 부형제: 본 개시내용에서 유용한 약제학적으로 허용가능한 부형제는 종래이다. Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin 저, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)는 백신, 및 추가의 약제학적 제제를 포함하는 하나 이상의 치료적 조성물의 약제학적 전달에 적당한 조성물 및 제형을 기재한다. 적당한 약제학적 부형제는 예를 들어, 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 및 기타 등등을 포함한다. 일반적으로, 부형제의 성질은 이용중인 투여의 특정 방식에 좌우될 것이다. 예를 들면, 비경구 제형은 일반적으로 약제학적으로 및 생리학적으로 허용가능한 유체 예컨대 물, 생리학적 염수, 평형 염액, 완충액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 또는 기타 등등을 비히클로서 포함하는 주사가능 유체를 포함한다. 고체 조성물 (예를 들어, 분말, 알약, 정제, 또는 캡슐 형태)에 대하여, 종래 비-독성 고체 부형제는, 예를 들어, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 또는 스테아르산마그네슘을 포함할 수 있다. 생물학적으로-중성 담체 이외에, 투여되어야 하는 약제학적 조성물은 소량의 비-독성 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 계면 활성제, 보존제, 및 pH 완충제 및 기타 등등, 예를 들어 아세트산나트륨 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다.
예방적 유효량: 본원에서 정의된 바와 같이, 용어 "예방적 유효량" 또는 "예방적으로 유효 용량"은 스트렙토코쿠스 뉴모니아로의 감염에 의해 야기된 하나 이상의 증상을 빈도 및/또는 심각도에서 감소시키고/거나 개시를 지연시키는데 충분한 면역 반응을 유도하기 위해 필요한 양 또는 용량을 지칭한다.
예방: 용어 "예방"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 질환 발현의 회피, 개시의 지연, 및/또는 특정 질환, 장애 또는 병태 (예를 들면, 스스트렙토코쿠스 뉴모니아로의 감염)의 하나 이상의 증상의 빈도 및/또는 심각도에서 감소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 예방은 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 발달, 빈도, 및/또는 강도에서 통계적으로 유의미한 감소가 질환, 장애, 또는 병태에 취약한 모집단에서 관찰되면 제제가 특정 질환, 장애 또는 병태에 대해 예방을 제공한다고 간주되도록 모집단 기준으로 평가된다.
대상체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 마우스, 토끼, 및 인간을 포함하는 임의의 포유동물을 의미한다. 특정 구현예에서 대상체는 성인, 청소년 또는 유아이다. 일부 구현예에서, 용어들 "개체" 또는 "환자"는 사용되고 "대상체"와 호환되기 위한 것이다.
상세한 설명
개시된 구현예(들) 및 실시예의 하기 기재는 사실상 단순히 예시적이고 본 발명, 이의 응용, 또는 용도를 결코 제한하기 위한 것은 아니다.
본원은 새로운 및 개선된 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물 그리고 동종을 포함하는 백신을 제공한다. 단백질 담체, CRM197이 단일 담체, 폐렴구균성 접합체 백신에서 이전에 사용된 반면, 본원은 혼합 담체, 폐렴구균성 접합체 백신에서 CRM197의 용도를 기재한다. 특히, 본원은 다가 폐렴구균성 접합체 조성물 및 백신에서 특이적 폐렴구균성 혈청형에 대하여 담체 단백질로서 파상풍 톡소이드 및 CRM197의 조합된 용도를 기재한다.
상기 논의된 바와 같이, 상이한 협막 다당류 접합체의 면역원성은 사용된 폐렴구균성 혈청형 및 담체 단백질에 따라 다양할 수 있다. 본원은 혈청형 3이 파상풍 톡소이드보다 디프테리아 톡소이드에 접합된 경우 더욱 면역원성이었다는 이전 교시에도 불구하고, 혼합 담체 백신의 일부로서 파상풍 톡소이드에 혈청형 3의 성공적 접합을 기재한다 [6]. 혼합 담체 백신의 일부로서 파상풍 톡소이드에 혈청형 1 및 5의 성공적 접합을 또한 기재한다. 혼합 담체, 다가, 예를 들어 21-가, 폐렴구균성 접합체 조성물에서 파상풍 톡소이드에 접합된 혈청형 3에 대한 항체 반응이 단일 담체, 13-가 폐렴구균성 접합체 조성물 (PREVNAR 13)에서 CRM197에 혈청형 3이 접합된 경우보다 약 4-5 배 더 높았다는 의외의 발견을 또한 개시한다.
추가로, 의외의 발견은 혈청형 3에 제한되지 않았고 또한 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물에서 파상풍 톡소이드에 접합된 다른 혈청형에 대하여 관찰되었다. 실시예에서 나타난 바와 같이, CRM197 (예를 들면, PCV21(1/5)-TT 및 PCV21(3/5)-TT)에 접합된 잔여 혈청형을 가진 혼합 담체, 폐렴구균성 접합체 조성물에서 파상풍 톡소이드에 혈청형 1 및 5 또는 3 및 5의 접합은 단일 담체, 폐렴구균성 접합체 조성물 (PREVNAR 13)에서 CRM197에 접합된 동일 혈청형에 대해 항체 반응 (IgG 반응 또는 MOPA 역가)와 비교하여 파상풍 톡소이드에 접합된 혈청형에 유의미하게 향상된 항체 반응을 일관되게 유도하였다.
본원에서 기재된 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 세계 시장에서 현재 이용가능한 3개의 폐렴구균성 접합체 백신: PREVNAR (일부 국가에서 일명 Prevenar), SYNFLORIX 및 PREVNAR 13에 의해 현재 포함되지 않은 폐렴구균성 혈청형을 또한 포함한다. 현재 포함되지 않은 폐렴구균성 혈청형에 의해 야기된 질환은, 부분적으로, 항균 내성의 발달, 면역손상된 환자의 증가된 수, 그리고 면역 압력의 부족으로 인해 상승중이다. 예를 들어, 현재 이용가능한 폐렴구균성 접합체 백신의 어느 것도 혈청형 9N을 포함하지 않는다. 또한, 현재 이용가능한 폐렴구균성 접합체 백신의 어느 것도 혈청형 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F 및 33F를 포함하지 않는다. 본 개시내용은 혼합 담체 (파상풍 톡소이드 및 CRM197), 폐렴구균성 접합체 백신, 뿐만 아니라 PREVNAR13보다 약 40- 내지 50-배 높았던 혈청형 9N 유도된 항체 반응에 혈청형 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F 및 33F의 성공적 이행을 증명한다.
폐렴구균성 다당류 혈청형 9N
혈청형 9N 다당류는 (비제한적으로, 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0228380에서 개시된 방법을 포함하는) 종래 기술에서 숙련가에 공지된 단리 절차를 이용함으로써 박테리아로부터 직접적으로 수득될 수 있다. 또한, 당류는 합성 프로토콜을 사용하여 생산될 수 있다.
혈청형 9N 스트렙토코쿠스 뉴모니아 균주는 확립된 배양 수집 (예를 들면, 질병통제예방센터의 연쇄구균 관련 연구소 (조지아주, 애틀란트); Streptococcal Reference Laboratory of the Centers for Disease Control and Prevention (Atlanta, Georgia)) 또는 임상 표본으로부터 수득될 수 있다.
박테리아성 세포는 배지, 예컨대 대두계 배지에서 전형적으로 성장된다. 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N 협막 다당류를 생산하는 박테리아성 세포의 발효 이후, 박테리아성 세포는 용해되어 세포 용해물을 생산한다. 그 다음, 혈청형 9N 다당류는, (비제한적으로, 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0228380에서 개시된 방법 포함하는) 원심분리, 심층 여과, 침전, 한외여과, 활성탄 처리, 정용여과 및/또는 컬럼 크로마토그래피를 포함하는, 종래 기술에서 공지된 정제 기술을 사용하여 세포 용해물로부터 단리될 수 있다. 정제된 혈청형 9N 협막 다당류는 면역원성 접합체의 제조에 사용될 수 있다. 스트렙토코쿠스 뉴모니아 용해물로부터 혈청형 9N 다당류의 정제 그리고 선택적으로 정제된 다당류의 크기조절에 의해 수득된 혈청형 9N 협막 다당류는, 예를 들어, 혈청형 9N 협막 다당류의 분자량 (MW)를 포함하는 상이한 파라미터를 특징으로 할 수 있다.
특정 구현예에서, 구현예, 접합 이전 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N으로부터 정제된 정제 다당류는 5-5,000 kDa의 분자량을 갖는다. 특정 구현예에서, 접합 이전 혈청형 9N 협막 다당류는 50-1,000 kDa의 분자량을 갖는다. 특정 구현예에서, 접합 이전 혈청형 9N 협막 다당류는 70-900 kDa의 분자량을 갖는다. 특정 구현예에서, 접합 이전 혈청형 9N 협막 다당류는 100-800 kDa의 분자량을 갖는다. 특정 구현예에서, 정제된 혈청형 9N 협막 다당류는 접합에 앞서 50-800 kDa, 80-780 kDa, 100-770 kDa, 120-760 kDa, 140-750 kDa, 150-740 kDa, 160-730 kDa, 170-735 kDa, 180-720 kDa, 190-710 kDa, 200-700 kDa, 220-690 kDa, 240-680 kDa, 260-670 kDa, 270-660 kDa의 분자량 또는 유사한 분자량 범위를 갖도록 활성화될 수 있다. 임의의 상기 범위 내에서 임의의 전체 수는 본 개시내용의 한 구현예로서 고려된다.
활성화된 혈청형 9N 다당류는 산화도 및 분자량을 특징으로 할 수 있다. 특정 구현예에서, 활성화된 혈청형 9N 다당류는 0.5-25, 0.6-23, 0.8-21, 1-20.8, 1.1-20.5, 1.2-20.3, 1.3-20, 1.4-19.5, 1.5-19.3, 1.6-19.2, 1.7-19.1 2-19, 3-18, 4-15, 또는 5-10의 산화도를 가질 수 있다.
다당류는 정상 정제 절차 동안 크기에서 약간 감소될 수 있다. 추가적으로, 본 개시내용에서 기재된 바와 같이, 다당류는 접합 이전 크기조절될 수 있다. 상기 언급된 분자량 범위는 최종 크기조절 단계 이후 (예를 들면, 정제, 가수분해 및 활성화 이후) 접합 이전 정제된 다당류의 범위를 지칭한다.
혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물 및 이의 제조 방법
본 개시내용은 21개의 상이한 폐렴구균성 협막 다당류-단백질 접합체를 포함하거나 상기로 이루어지는 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물을 제공하고, 여기서 각 폐렴구균성 협막 다당류-단백질 접합체는 스트렙토코쿠스 뉴모니아의 상이한 혈청형으로부터 협막 다당류에 접합된 단백질 담체를 포함하고, 여기서 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형은 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F이고, 여기서 단백질 담체는 CRM197 또는 파상풍 톡소이드이고, 여기서 협막 다당류들 중 2개는 파상풍 톡소이드에 잡합되고 잔여 협막 다당류는 CRM197에 접합되고, 여기서 파상풍 톡소이드에 접합되는 2개의 협막 다당류는 혈청형 1, 3, 및 5로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 혈청형 1 및 5로부터 협막 다당류는 파상풍 톡소이드에 접합되고, 잔여 혈청형으로부터 협막 다당류는 CRM197에 접합된다. 또 다른 구현예에서, 혈청형 1 및 3으로부터 협막 다당류는 파상풍 톡소이드에 접합되고, 잔여 협막 다당류는 CRM197에 접합된다. 또 다른 구현예에서, 혈청형 3 및 5로부터 협막 다당류는 파상풍 톡소이드에 접합되고, 잔여 협막 다당류는 CRM197에 접합된다.
다당류-단백질 접합체 백신에서, 담체 단백질은 다당류 항원에 대한 면역 반응 (예를 들면 항체 반응) 향상을 주로 돕기 위해 다당류 항원에 접합된다. 담체 단백질은 바람직하게는 비-독성인 단백질이다. 담체 단백질은, 아래 추가로 상세히 논의된 바와 같이, 표준 접합 절차를 사용하여 폐렴구균성 다당류와 접합할 수 있어야 한다. 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물에서 사용된 담체 단백질은 파상풍 톡소이드 (TT) 및 CRM197이고, 이들 각각은 폐렴구균성 접합체 백신의 설계에서 사용되지만 동일한, 혼합 담체 백신에서 결코 사용되지 않는다.
CRM197은 야생형 디프테리아 독소의 면역학적 특성을 보유하는 디프테리아 독소의 비-독성 변이체 (즉, 톡소이드)이다. CRM197은 구조적 유전자에서 단일 염기에 야생형 디프테리아 독소와 상이하고, 이는 글루탐산에서 글리신으로의 단일 아미노산 치환을 발생시킨다. CRM197은 전형적으로 카사미노산 및 효모 추출물계 배지에서 성장된 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphitheria) 균주 C7 (β197)의 배양물로부터 단리된다. CRM197은 한외여과, 황산암모늄 침전, 및 이온-교환 크로마토그래피를 통해 정제될 수 있다. 대안적으로, CRM197은 전체가 참고로 본원에 편입되는, 미국 특허 번호 5,614,382에 따라 재조합으로 제조될 수 있다. CRM197은 폐렴구균성 접합체 백신의 설계에서 사용되었지만 혼합 담체 백신의 일부로서 결코 사용되지 않았다.
파상풍 톡소이드는 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani)에 의해 야기된 파상풍 (또는 개구장애)에 대해 대규모 면역화를 위하여 세계적으로 제조되고 사용된다. 파상풍 톡소이드는 디프테리아 및/또는 백일해 백신과 조합으로 그리고 단독으로 둘 모두에서 또한 사용된다. 친 단백질, 파상풍 독소는 클로스트리디움 테타니의 배양물에서 일반적으로 수득된다. 파상풍 독소는 약 150 kDa의 단백질이고 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 하위단위 (약 100 kDa 및 약 50 kDa)로 이루어진다. 상기 독소는 전형적으로 포름알데히드로 해독되고, 예를 들어, WO 1996/025425에서 개시된 바와 같이, 공지된 방법, 예컨대 황산암모늄 침전 (참고, 예를 들면, [7], [8]) 또는 크로마토그래피 기술을 사용하여 배양 여과물로부터 정제될 수 있다. 파상풍 독소는 또한 재조합 유전자 수단에 의해 불활성화될 수 있다.
파상풍 톡소이드는 폐렴구균성 접합체 백신을 포함하는 다른 백신에서 담체 단백질로서 또한 사용되어 왔다. 그러나 CRM197과 조합으로 혼합 담체, 폐렴구균성 접합체 백신에서 파상풍 독소의 사용은 신규이다. 파상풍 톡소이드와 비교하여 디프테리아 톡소이드에 접합된 경우 혈청형 3이 더욱 면역원성인 것으로 나타났기 때문에 종래 기술은 또한 혼합 담체, 폐렴구균성 접합체 백신에서 파상풍 톡소이드에 혈청형 3 접합에 떨어져서 교시한다 [6].
혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F로부터 협막 다당류를 포함하는, 본원에서 기재된 조성물 및 백신에서 사용된 폐렴구균성 협막 다당류는, 예를 들어, WO 2006/110381, WO 2008/118752, WO 2006/110352, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, 2008/0102498 및 2008/0286838에서 개시된 것들을 포함하여, 종래 기술에서 숙련가들 중 한명에 공지된 표준 기술을 포함하는, 임의의 이용가능한 기술을 사용하여 스트렙토코쿠스 뉴모니아로부터 제조될 수 있고, 이들 모두는 전체가 참고로 편입된다. 예를 들어, 각 폐렴구균성 협막 다당류 혈청형은 배양 배지 (예를 들면, 대두계 배지)에서 성장될 수 있다. 세포는 용해되고, 개별 다당류는 원심분리, 침전, 한외여과, 및/또는 컬럼 크로마토그래피를 통해 용해물로부터 정제될 수 있다. 또한, 폐렴구균성 협막 다당류는 합성 프로토콜을 사용하여 생산될 수 있다.
스트렙토코쿠스 뉴모니아의 협막 다당류는 최대 8개 당 잔기를 함유할 수 있는 반복 올리고당류 단위를 포함한다. 협막 당류 항원은 전장 다당류일 수 있거나, 크기가 감소될 수 있다 (예를 들면, 단일 올리고당류 단위, 또는 반복하는 올리고당류 단위의 천연 길이 당류 사슬보다 더 짧음). 협막 다당류의 크기는 종래 기술에서 공지된 다양한 방법, 예컨대 산 가수분해 처리, 과산화수소 처리, 고압 균질기에 의한 크기조절, 선택적으로 이어서 올리고당류 단편을 생성하기 위한 과산화수소 처리, 또는 미세유동화에 의해 감소될 수 있다.
각각의 혈청형의 폐렴구균성 접합체는 담체 단백질에 각 혈청형의 협막 다당류를 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 상이한 폐렴구균성 접합체는, 단일 복용 제형을 포함하는, 조성물로 제형화될 수 있다.
다당류-단백질 접합체를 제조하기 위해, 각 폐렴구균성 혈청형으로부터 제조된 협막 다당류는 협막 다당류가 담체 단백질과 반응할 수 있도록 화학적으로 활성화될 수 있다. 일단 활성화되면, 각 협막 다당류는 담체 단백질에 별도로 접합되어 당접합체를 형성할 수 있다. 다당류의 화학적 활성화 및 담체 단백질에의 후속 접합은 종래 방법으로 달성될 수 있다.
예를 들어, 협막 다당류의 단부에서 근접 히드록실기는, 예를 들어, 전체가 참고로 본원에 편입되는, 미국 특허 번호 4, 365,170, 4,673,574 및 4,902,506에서 개시된 바와 같이, 산화제 예컨대 (과요오드산나트륨, 과요오드산칼륨, 또는 과요오드산을 포함하는) 과요오드산염에 의해 알데히드기로 산화될 수 있다. 과요오드산염은 탄수화물의 근접 히드록실기를 무작위로 산화시켜 반응성 알데히드기를 형성하고 C-C 결합을 절단시킨다. 용어 "과요오드산염"은 과요오드산염 및 과요오드산 둘 모두를 포함한다. 상기 용어는 또한 메타과요오드산염 (IO4-) 및 오르토과요오드산염 (IO65-) 둘 모두를 포함한다. 용어 "과요오드산염"은 또한 과요오드산나트륨 및 과요오드산칼륨을 포함하는 과요오드산염의 다양한 염을 포함한다. 특정 구현예에서, 다당류는 메타과요오드산나트륨의 존재 하에서 산화될 수 있다.
특정 구현예에서, 과요오드산염은 다당류의 1 μg 당 약 0.03-0.17 μg의 양으로 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 과요오드산염은 다당류의 1 μg 당 약 0.025-0.18 μg 또는 약 0.02-0.19 μg의 양으로 사용될 수 있다. 당류는 상기 범위 내에서 원하는 대로 활성화될 수 있다. 상기 범위 밖에서, 효과는 불만족일 수 있다.
다당류는 또한 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP)로 활성화되어 시아네이트 에스테르를 형성할 수 있다. 활성화된 다당류는 그 다음 담체 단백질에서 아미기에 직접 또는 스페이서나 링커기를 통해 커플링된다.
예를 들어, 스페이서는 (예를 들어 N-[y-말레이미도부티를록시]석신이미드 에스테르 (GMBS)를 사용하는) 말레이미드-활성화된 담체 단백질 또는 (예를 들어 요오도아세트이미드, N-석신이미딜 브로모아세테이트 (SBA; SIB), N-석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트 (SlAB), 설포석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트 (설포-SIAB), N-석신이미딜 요오도아세테이트 (SIA) 또는 석신이미딜 3-[브로모아세트아미도]프로피오네이트 (SBAP)를 사용하는) 할로아세틸화된 담체 단백질과 반응 이후 수득된 티오에테르 연결기를 통해 담체에 커플링될 수 있는 티올화된 다당류를 제공하기 위해 시스타민 또는 시스테아민일 수 있다. 바람직하게는, (COAP 화학으로 선택적으로 만들어진) 시아네이트 에스테르는 헥산 디아민 또는 아디프산 디히드라지드 (AOH)와 커플링되고 아미노-유도체화된 당류는 단백질 담체에서 카르복실기를 통해 카르보디이미드 (예를 들면, EDAC 또는 EDC) 화학을 사용하여 담체 단백질에 접합된다. 그와 같은 접합체는 예를 들어 WO 93/15760, WO 95/08348 및 WO 96/129094에서 기재되고, 이들 모두는 전체가 본원에 참고로 편입된다.
활성화된 협막 다당류 및 담체 단백질의 접합은, 예를 들어, 환원성 아민화로, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0228380, 2007/0231340, 2007/0184071 및 2007/0184072, WO 2006/110381, WO 2008/079653, 및 WO 2008/143709에서 기재된 바와 같이, 달성될 수 있고, 이들 모두는 전체가 참고로 편입된다. 예를 들어, 활성화된 협막 다당류 및 담체 단백질은 환원제와 반응되어 접합체를 형성할 수 있다. 적당한 환원제는 보로하이드라이드, 예컨대 소듐 시아노보로하이드라이드, 보란-피리딘, 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드, 나트륨 또는 보로하이드라이드, 또는 보로하이드라이드 교환 수지를 포함한다. 환원 반응의 마지막에, 접합체에서 잔류하는 미반응된 알데히드기가 있을 수 있다. 미반응된 알데히드기는 적당한 캡핑제, 예컨대 소듐 보로하이드라이드 (NaBH4)를 사용하여 캡핑될 수 있다. 일 구현예에서, 환원 반응은 수성 용매에서 실시된다. 또 다른 구현예에서 반응은 비양성자성 용매에서 실시된다. 일 구현예에서, 환원 반응은 DMSO (디메틸설폭시드) 또는 DMF (디메틸포름아미드) 용매에서 실시된다. 다른 가능한 환원제는 비제한적으로 아민-보란 예컨대 피리딘-보란, 2-피콜린-보란, 2,6-디보란-메탄올, 디메틸아민-보란, t-BuMeiPrN-BH3, 벤질아민-BH3 또는 5-에틸-2-메틸피리딘-보란 (PEMB)를 포함한다.
활성화된 협막 다당류는 직접적으로 담체 단백질에 또는 간접적으로 스페이서 또는 링커, 예컨대 2기능성 링커의 사용을 통해 접합될 수 있다. 링커는 예를 들어 반응성 아미노기 및 반응성 카르복실산기, 2 반응성 아미노기 또는 2 반응성 카르복실산기를 갖는, 선택적으로 이종2기능성 또는 동종2기능성이다.
접합을 위한 다른 적당한 기술은, 예를 들어, 전체가 참고로 편입되는, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 98/42721에서 기재된 바와 같이, 카르보디이미드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-히드록시석신이미드, S--NHS, EDC, TSTU를 사용한다. 접합은 카르바메이트 연결기를 형성하기 위해 당류의 자유 히드록실기와 1,1'-카르보닐디이미다졸 (CD1)과의 반응 (참고 Bethell 등 (1979) J. Biol. Chem. 254:2572-2574; Hearn 등 (1981) J. Chromatogr. 218:509-518) 이어서 단백질과의 반응에 의해 형성될 수 있는 카르보닐 링커를 연루시킬 수 있다. 이것은 일차 히드록실기에 대한 아노머성 말단의 감소, 일차 히드록실기의 선택적 보호/탈보호, CDI 카르바메이트 중간체를 형성하기 위한 일차 히드록실기와 CDI와의 반응 그리고 CD1 카르바메이트 중간체와 단백질에서 아미노기와의 커플링을 연루시킬 수 있다.
폐렴구균성 접합체 백신에 대하여 다당류 대 담체 단백질의 비율은 전형적으로 범위 0.3-3.0 (w/w)이지만 혈청형으로 다양할 수 있다. 비율은 존재하는 단백질 및 다당류의 독립적 측정에 의해, 또는 종래 기술에서 공지된 비율의 직접 측정을 제공하는 방법에 의해 어느 한쪽으로 결정될 수 있다. 이중 모니터링 (예를 들면, 총 물질 및 단백질 함량 각각에 대하여, 굴절률 및 UV)와 1H NMR 분광법 또는 SEC-HPLC-UV/RI를 포함하는 방법은 접합체의 크기 분포에 대해 당류/단백질 비율을, 뿐만 아니라 SEC-HPLC-MALLS 또는 MALDI-TOF-MS로 프로파일링할 수 있다.
상기 수득된 다당류-단백질 접합체는 다양한 방법으로 정제 및 농축될 수 있다. 이들 방법은 농축/정용여과, 컬럼 크로마토그래피, 및 심층 여과를 포함한다. 정제된 다당류-단백질 접합체는, 백신으로서 사용될 수 있는, 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물을 제형화하기 위해 조합된다.
백신 조성물의 제형은 업계-인식된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 백신 조성물은 이의 의도된 투여의 경로와 양립하기 위해 제형화된다. 개별 폐렴구균성 협막 다당류-단백질 접합체는 생리학적으로 허용가능한 비히클과 함께 제형화되어 조성물을 제조할 수 있다. 그와 같은 비히클의 예는 비제한적으로 물, 완충 염수, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 덱스트로스 용액을 포함한다.
일부 구현예에서, 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 추가로 아쥬반트를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "아쥬반트"는 항원에 대한 면역 반응을 비-특이적으로 향상시키는 물질 또는 비히클을 지칭한다. 아쥬반트는 항원이 흡착되는 미네랄 (명반, 알루미늄 염, 예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄, 알루미늄 히드록시 포스페이트 설페이트, 등)의 현탁액; 또는 항원 용액이 미네랄 오일에서 유화되는 유중수 유탁액 (예를 들어, 프로인트 불완전 아쥬반트)를 포함할 수 있고, 때때로 사멸된 미코박테리아 (프로인트 완전 아쥬반트)를 포함하여 항원성을 추가로 향상시킬 수 있다. 면역자극성 올리고뉴클레오티드 (예컨대 CpG 모티프를 포함하는 것들)은 또한 아쥬반트로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 참고 미국 특허 번호 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; 6,339,068; 6,406,705; 및 6,429,199). 아쥬반트는 또한 생물학적 분자, 예컨대 지질 및 공자극 분자를 포함한다. 예시적인 생물학적 아쥬반트는 AS04 [9], IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L 및 41 BBL을 포함한다.
일부 구현예에서, 아쥬반트는 알루미늄계 아쥬반트이다. 전형적으로, 단일 0.5 ml 백신 용량은 알루미늄계 아쥬반트의 약 0.1 mg 내지 2.5 mg을 함유하기 위해 제형화된다. 다른 구현예에서, 단일 0.5 ml 백신 용량은 알루미늄계 아쥬반트의 0.1 mg 내지 2 mg, 0.1 mg 내지 1 mg, 0.1 mg 내지 0.5 mg, 0.1 mg 내지 0.2 mg, 0.125 mg 내지 2.5 mg, 0.125 mg 내지 0.5 mg, 0.125 mg 내지 0.2 mg 또는 0.125 내지 0.25 mg을 함유하기 위해 제형화된다. 특정 구현예에서, 단일 0.5 ml 백신 용량은 알루미늄계 아쥬반트의 약 0.125 mg 내지 약 0.250 mg을 함유하기 위해 제형화된다. 특정 구현예에서, 단일 0.5 ml 백신 용량은 알루미늄계 아쥬반트의 약 0.125 mg을 함유하기 위해 제형화된다. 특정 구현예에서, 단일 0.5 ml 백신 용량은 알루미늄계 아쥬반트의 약 0.250 mg을 함유하기 위해 제형화된다.
특정 구현예에서, 아쥬반트는 인산알루미늄, 황산알루미늄, 및 수산화알루미늄으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 아쥬반트는 인산알루미늄이다.
일부 구현예에서, 조성물은 스트렙토코쿠스 뉴모니아의 감염에 대한 백신으로서 사용하기 위한 것이다.
폐렴구균성 협막 다당류-단백질 담체 접합체의 특성규명
특정 구현예에서, 다당류-단백질 담체 접합체는 100-10,000 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 접합체는 200-9,000 kDa의 분자량을 갖는다. 특정 구현예에서, 접합체는 300-8,000 kDa의 분자량을 갖는다. 특정 구현예에서, 접합체는 400-7,000 kDa의 분자량을 갖는다. 특정 구현예에서, 접합체는 500-6,000 kDa의 분자량을 갖는다. 특정 구현예에서, 접합체는 600-5,000 kDa의 분자량을 갖는다. 특정 구현예에서, 접합체는 500-4,000 kDa 분자량의 분자량을 갖는다. 임의의 상기 범위 내에서 임의의 전체 수는 본 개시내용의 구현예로서 고려된다.
분자량이 상기 범위 내인 경우, 접합체는 고수율로 안정하게 형성될 수 있다. 또한, 자유 다당류의 분율은 감소될 수 있다. 또한, 우수한 면역원성은 상기 분자량 범위 내에서 달성될 수 있다.
개별 다당류-단백질 접합체가 정제된 이후, 이들은 본 개시내용의 면역원성 조성물을 제형화하기 위해 배합된다.
본 개시내용의 혈청형의 당류-단백질 접합체는 다당류 대 단백질 담체의 비율 (다당류의 양/단백질 담체의 양, w/w)를 특징으로 할 수 있다.
특정 구현예에서, 각 혈청형에 대하여 다당류-단백질 담체 접합체에서 다당류 대 단백질 담체의 비율 (w/w)는 0.5-2.5, 0.4-2.3, 0.3-2.1, 0.24-2, 0.2-1.8, 0.18-1.6, 0.16-1.4, 0.14-1.2, 0.12-1 또는 0.1-1 (예를 들면, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4 또는 약 2.5)이다.
다당류 대 단백질 담체의 비율이 상기 범위 내인 경우, 접합체는 고수율로 안정하게 형성될 수 있다. 또한, 자유 다당류의 분율은 감소될 수 있다. 또한, 우수한 면역원성은 달성될 수 있고 접합체는 상기 범위 내에서 다른 혈청형에 의해 간섭 없이 안정하게 유지될 수 있다.
본 개시내용의 접합체 및 면역원성 조성물은 단백질 담체에 공유적으로 접합되지 않지만 그럼에도 불구하고 다당류-단백질 담체 접합체 조성물에서 존재하는 자유 다당류를 함유할 수 있다. 자유 다당류는 다당류-단백질 담체 접합체와 비-공유적으로 관련 (즉, 다당류-단백질 담체 접합체에 비-공유적으로 결합, 상기에 흡착, 또는 상기에서 또는 상기에 의해 포착)될 수 있다.
특정 구현예에서, 다당류-단백질 담체 접합체는 각 혈청형의 다당류의 총량에 근거하여 각 혈청형의 자유 다당류의 약 60 %, 약 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 % 또는 15 % 미만을 함유한다. 특정 구현예에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 담체 접합체는 각 혈청형의 다당류의 총량에 근거하여 각 혈청형의 자유 다당류의 약 60% 미만을 함유한다. 특정 구현예에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 담체 접합체는 각 혈청형의 다당류의 총량에 근거하여 각 혈청형의 자유 다당류의 약 50 % 미만을 함유한다 특정 구현예에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 담체 접합체는 각 혈청형의 다당류의 총량에 근거하여 각 혈청형의 자유 다당류의 약 40 % 미만을 함유한다. 특정 구현예에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 담체 접합체는 각 혈청형의 다당류의 총량에 근거하여 각 혈청형의 자유 다당류의 약 30 % 미만을 함유한다. 특정 구현예에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 담체 접합체는 각 혈청형의 다당류의 총량에 근거하여 각 혈청형의 자유 다당류의 약 25 % 미만을 함유한다 특정 구현예에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 담체 접합체는 각 혈청형의 다당류의 총량에 근거하여 각 혈청형의 자유 다당류의 약 20 % 미만을 함유한다. 특정 구현예에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 담체 접합체는 각 혈청형의 다당류의 총량에 근거하여 각 혈청형의 자유 다당류의 약 15 % 미만을 함유한다 특정 구현예에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 담체 접합체는 각 혈청형의 다당류의 총량에 근거하여 각 혈청형의 자유 다당류의 약 10 % 미만을 함유한다.
각 혈청형의 다당류-단백질 담체 접합체는 또한 이의 분자 크기 분포 (Kd)를 특징으로 할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 배지 (CL-4B; 가교 아가로스 비드, 4%)는 접합체의 상대 분자 크기 분포를 결정하는데 사용될 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 접합체의 분자 크기 분포를 프로파일링하기 위해 중력-공급된 컬럼에서 사용된다. 배지에서 기공으로부터 배제된 대형 분자는 소형 분자보다 더욱 빨리 용출된다. 분획 수집기는 컬럼 용출물을 수집하는데 사용된다. 분획물은 당류 검정에 의해 비색계로 시험된다. Kd의 결정을 위하여, 컬럼은 분자가 완전하게 배제되는 분획 (V0; Kd = 0) 및 최대 체류를 나타내는 분획 (Vi; Kd = 1)을 확립하기 위해 측정된다. 특정된 샘플 속성이 도달하는 (Ve) 분획은 식 Kd = (Ve - V0)/(Vi - V0)에 의해 Kd에 관련된다.
특정 구현예에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 담체 접합체의 적어도 15 %는 CL-4B 컬럼에서 0.3 이하의 Kd를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 담체 접합체의 적어도 20 %는 CL-4B 컬럼에서 0.3 이하의 Kd를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 담체 접합체의 적어도 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % 또는 90 %는 CL-4B 컬럼에서 0.3 이하의 Kd를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 담체 접합체의 적어도 60 %는 CL-4B 컬럼에서 0.3 이하의 Kd를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 담체 접합체의 적어도 50-80 %는 CL-4B 컬럼에서 0.3 이하의 Kd를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 담체 접합체의 적어도 65-80 %는 CL-4B 컬럼에서 0.3 이하의 Kd를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 각 혈청형의 당류-단백질 접합체의 적어도 15-60 %는 CL-4B 컬럼에서 0.3 이하의 Kd를 가질 수 있다.
예방 방법 및 용도
일 양태에서, 본 개시내용은 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 백신을 제공한다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 부형제는 적어도 완충액, 예컨대 석시네이트 완충액, 염, 예컨대 염화나트륨, 및/또는 계면 활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 (예를 들면, 폴리소르베이트 80)을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈청형 1, 3, 및 5로 이루어지는 군으로부터 선택된 2개의 다당류는 파상풍 톡소이드에 접합되고, 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F 중에서 잔여 협막 다당류는 CRM197 (21-가)에 접합된다.
일 구현예에서, 혈청형 1 및 5로부터 협막 다당류는 파상풍 톡소이드에 접합되고, 혈청형 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F로부터 협막 다당류는 CRM197 (21-가)에 접합된다.
또 다른 구현예에서, 혈청형 1 및 3으로부터 협막 다당류는 파상풍 톡소이드에 접합되고, 혈청형 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F로부터 협막 다당류는 CRM197 (21-가)에 접합된다.
또 다른 구현예에서, 혈청형 3 및 5로부터 협막 다당류는 파상풍 톡소이드에 접합되고, 혈청형 1, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F로부터 협막 다당류는 CRM197 (21-가)에 접합된다.
일부 구현예에서, 백신은 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염에 의해 야기된 질환에 대해 인간 대상체에서 보호성 면역 반응을 이끌어낸다.
추가 양태에 따르면, 본 개시내용은 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염 또는 질환의 예방 방법으로서, 인간 대상체에게 예방적 유효량의 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물 또는 동종을 포함하는 백신을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물 또는 동종을 포함하는 백신은, 예를 들어, 추가로 상세히 아래 기재된 바와 같이, 전신 또는 점막 경로를 포함하는, 임의의 경로로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 인간 대상체는 고령 대상체이고 질환은 폐렴 또는 침습성 폐렴구균성 질환 (IPD)이다. 특정 구현예에서, 고령 대상체는 적어도 50 세이다. 다른 구현예에서, 고령 대상체는 적어도 55 세이다. 더욱 다른 구현예에서, 고령 대상체는 적어도 60 세이다.
다른 구현예에서, 인간 대상체는 유아이고 질환은 폐렴, 침습성 폐렴구균성 질환 (IPD), 또는 급성 중이염 (AOM)이다. 특정 구현예에서, 유아는 0-2세이다. 다른 구현예에서, 유아는 생후 2 내지 15 개월이다.
더욱 또 다른 구현예에서, 인간 대상체는 생후 6 주 내지 17살이고 질환은 폐렴, 침습성 폐렴구균성 질환 (IPD) 또는 급성 중이염 (AOM)이다. 특정 구현예에서, 인간 대상체는 생후 6 주 내지 5살이다. 다른 구현예에서, 인간 대상체는 5 내지 17살이다.
각 백신 용량에서 접합체의 양 또는 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물의 예방적 유효량은 유의미한 역효과 없이 예방을 유도하는 양으로서 선택될 수 있다. 그와 같은 양은 폐렴구균성 혈청형에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로, 각 용량은 다당류의 약 0.1 μg 내지 약 100 μg, 구체적으로, 약 0.1 내지 10 μg, 및, 더욱 구체적으로, 약 1 μg 내지 약 5 μg을 포함할 수 있다. 특정 백신용 성분의 최적량은 대상체에서 적절한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 규명될 수 있다. 예를 들어, 인간 대상체의 백신화를 위한 양은 동물 시험 결과를 외삽함으로써 결정될 수 있다. 또한, 용량은 경험적으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신 또는 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 각 협막 다당류의 약 1 μg 내지 약 5 μg; TT의 약 1 μg 내지 약 30 μg; CRM197의 약 20 μg 내지 약 85 μg; 및 선택적으로 원소성 알루미늄 아쥬반트의 약 0.1 mg 내지 약 0.5 mg을 함유하기 위해 제형화된 단일 0.5 ml 용량일 수 있다. 일부 구현예에서, 백신 또는 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은, 약 4 μg 내지 약 5 μg의 양으로 존재하는, 혈청형 6B 및 선택적으로 혈청형 3을 제외한 각 협막 다당류의 약 2 μg 내지 약 2.5 μg; TT의 약 2 μg 내지 약 25 μg; CRM197의 약 40 μg 내지 약 75 μg; 및 선택적으로 원소성 알루미늄 아쥬반트의 약 0.1 mg 내지 약 0.25 mg을 함유하기 위해 제형화된 단일 0.5 ml 용량일 수 있다.
일부 구현예에서, 백신 또는 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 약 4.4 μg의 양으로 존재하는, 혈청형 6B를 제외한 각 협막 다당류의 약 2.2 μg을 함유하기 위해 제형화된 단일 0.5 ml 용량일 수 있다.
일부 구현예에서, 백신 또는 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 9V, 19A, 및 19F로 이루어지는 군으로부터 선택된 최대 6개의 협막 다당류를 제외한 각 협막 다당류의 약 2 μg 내지 약 2.5 μg을 함유하기 위해 제형화된 단일 0.5 ml 용량일 수 있고, 이들 각각은 약 4 μg 내지 약 5 μg의 양으로 존재한다. 일 구현예에서, 약 4 μg 내지 약 5 μg의 양으로 존재하는 최대 6개의 협막 다당류는 혈청형 1, 3, 4, 6B, 9V, 19A, 및 19F로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 백신 또는 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 9V, 19A, 및 19F로 이루어지는 군으로부터 선택된 최대 6개의 협막 다당류를 제외한 각 협막 다당류의 약 2.2 μg을 함유하기 위해 제형화된 단일 0.5 ml 용량일 수 있고, 이들 각각은 약 4.4 μg의 양으로 존재한다. 일 구현예에서, 약 4.4 μg의 양으로 존재하는 최대 6개의 협막 다당류는 혈청형 1, 3, 4, 6B, 9V, 19A, 및 19F로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 백신 또는 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 혈청형 1, 5, 6A, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 22F, 23F, 및 33F의 협막 다당류의 약 2 μg 내지 약 2.5 μg 및 혈청형 3, 4, 6B, 9V, 19A, 및 19F의 협막 다당류의 약 4 μg 내지 약 5 μg을 함유하기 위해 제형화된 단일 0.5 ml 용량일 수 있다.
특정 구현예에서, 백신 또는 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 혈청형 1, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F의 협막 다당류의 약 2 내지 약 2.5 μg 및 혈청형 3 및 6B의 협막 다당류의 약 4 내지 약 5 μg을 함유하기 위해 제형화된 단일 0.5 ml 용량일 수 있다.
일부 구현예에서, 백신 또는 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 혈청형 1, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F의 협막 다당류의 약 2 내지 약 2.5 μg 및 혈청형 6B의 협막 다당류의 약 4 내지 약 5 μg 및 혈청형 3의 협막 다당류의 약 8 내지 약 9 μg, 및 더욱 바람직하게는 혈청형 3의 협막 다당류의 약 8.8 μg을 함유하기 위해 제형화된 단일 0.5 ml 용량일 수 있다.
특정 구현예에서, 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물 또는 동종을 포함하는 백신은 염화나트륨 및 석신산나트륨 완충액을 부형제로서 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 혈청형 1 및 3의 폐렴구균성 협막 다당류의 각각이 TT에 접합되고 혈청형 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F로부터 협막 다당류가 CRM197 (21-가)에 접합되는 액체 제형으로 제형화될 수 있다. 각 0.5 mL 용량은 하기를 함유하는 액체로 제형화될 수 있다: 약 4.4 μg에서 혈청형 6B를 제외한, 각 협막 다당류의 약 2.2 μg; (혈청형 1 및 3에 대해서만) TT 담체 단백질의 약 2 μg 내지 약 25 μg 및 CRM197 담체 단백질의 약 40 μg 내지 약 75 μg; 아쥬반트로서 원소성 알루미늄의 약 0.125 내지 0.250 mg (약 0.5 내지 약 1.2 mg 인산알루미늄); 및 부형제로서 염화나트륨 및 석신산나트륨 완충액.
일부 구현예에서, 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 혈청형 1 및 5의 폐렴구균성 협막 다당류의 각각이 TT에 접합되고 혈청형 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F로부터 협막 다당류가 CRM197 (21-가)에 접합되는 액체 제형으로 제형화될 수 있다. 일 구현예에서, 각 0.5 mL 용량은 하기를 함유하는 액체로 제형화될 수 있다: 약 4.4 μg에서 혈청형 6B 및 약 2.2-8.8 μg에서 혈청형 3을 제외한, 각 협막 다당류의 약 2.2 μg; (혈청형 1 및 5에 대해서만) TT 담체 단백질의 약 2 μg 내지 약 25 μg 및 CRM197 담체 단백질의 약 40 μg 내지 약 75 μg; 원소성 알루미늄 (약 0.5 내지 1.2 mg 인산알루미늄) 아쥬반트의 약 0.125 내지 0.250 mg; 및 부형제로서 염화나트륨 및 석신산나트륨 완충액. 특정 구현예에서, 혈청형 3은 약 2.2 μg에서 존재한다. 다른 구현예에서, 혈청형 3은 약 4.4 μg에서 존재한다. 다른 구현예에서, 혈청형 3은 약 8.8 μg에서 존재한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 각 0.5 mL 용량은 하기를 함유하는 액체로 제형화될 수 있다: 약 4.4 μg에서 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 9V, 19A, 및 19F로 이루어지는 군으로부터 선택된 최대 6개의 협막 다당류를 제외한, 각 협막 다당류의 약 2.2 μg; (혈청형 1 및 5에 대해서만) TT 담체 단백질의 약 2 μg 내지 약 25 μg 및 CRM197 담체 단백질의 약 40 μg 내지 약 75 μg; 원소성 알루미늄 (0.5 mg 내지 1.2 mg 인산알루미늄) 아쥬반트의 약 0.125 mg 내지 0.250 mg; 및 부형제로서 염화나트륨 및 석신산나트륨 완충액. 일 구현예에서, 약 4.4 μg에서 최대 6개의 협막 다당류는 혈청형 1, 3, 4, 6B, 9V, 19A, 및 19F로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 각 0.5 mL 용량은 하기를 함유하는 액체로 제형화될 수 있다: 약 4.4 μg에서 혈청형 3, 4, 6B, 9V, 19A, 및 19F를 제외한, 각 협막 다당류의 약 2.2 μg; (혈청형 1 및 5에 대해서만) TT 담체 단백질의 약 2 μg 내지 약 25 μg 및 CRM197 담체 단백질의 약 40 μg 내지 약 75 μg; 원소성 알루미늄 (0.5 mg 내지 1.2 mg 인산알루미늄) 아쥬반트의 약 0.125 mg 내지 0.250 mg; 및 부형제로서 염화나트륨 및 석신산나트륨 완충액. 또 다른 구현예에서, 각 0.5 mL 용량은 하기를 함유하는 액체로 제형화될 수 있다: 약 4.4 μg에서 혈청형 3 및 4를 제외한, 각 협막 다당류의 약 2.2 μg; (혈청형 1 및 5에 대해서만) TT 담체 단백질의 약 2 μg 내지 약 25 μg 및 CRM197 담체 단백질의 약 40 μg 내지 약 75 μg; 원소성 알루미늄 (0.5 mg 내지 1.2 mg 인산알루미늄) 아쥬반트의 약 0.125 mg 내지 0.250 mg; 및 부형제로서 염화나트륨 및 석신산나트륨 완충액.
일부 구현예에서, 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 혈청형 3 및 5의 폐렴구균성 협막 다당류의 각각이 TT에 접합되고 혈청형 1, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F로부터 협막 다당류가 CRM197 (21-가)에 접합되는 액체 제형으로 제형화될 수 있다. 각 0.5 mL 용량은 하기를 함유하는 액체로 제형화될 수 있다: 약 4.4 μg에서 6B를 제외한, 각 협막 다당류의 약 2.2 μg; (혈청형 3 및 5에 대해서만) TT 담체 단백질의 약 2 μg 내지 약 25 μg 및 CRM197 담체 단백질의 약 40 μg 내지 약 75 μg; 원소성 알루미늄 (약 0.5 내지 1.2 mg 인산알루미늄) 아쥬반트의 약 0.125 내지 0.250 mg; 및 부형제로서 염화나트륨 및 석신산나트륨 완충액.
일부 구현예에서, 액체 제형은 보존제 없이 단일 용량 주사기에 충진될 수 있다. 진탕 이후, 액체 제형은 근육내 투여를 위하여 준비된 균질, 백색 현탁액인 백신이 된다.
혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 면역화 시리즈의 일부로서 또는 단일 주사로 투여될 수 있다. 예를 들어, 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 적절하게 이격된 간격, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개월 간격 또는 이들의 조합에서 2, 3, 4, 또는 초과 횟수 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은, 예를 들어, 생후 약 2, 3, 4, 및 12-15 개월; 생후 약 3, 4, 5, 및 12-15 개월; 또는 생후 약 2, 4, 6, 및 12-15 개월을 포함하는, 생후 첫 15 개월 내에 4회 유아에 투여된다. 이러한 최초 용량은 생후 6 주만큼 빨리 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은, 예를 들어, 약 2, 4, 및 11-12 개월을 포함하는, 생후 첫 15 개월 내에 3회 유아에 투여된다.
혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물은 스트렙토코쿠스 뉴모니아로부터 하나 이상의 단백질을 또한 포함할 수 있다. 혼입에 적당한 스트렙토코쿠스 뉴모니아 단백질의 예는 국제 특허 출원 WO02/083855에서 확인된 것들, 뿐만 아니라 국제 특허 출원 WO02/053761에서 기재된 것들을 포함한다.
혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 종래 기술에서 숙련가 중 한명에 공지된 하나 이상의 투여 경로 예컨대 비경구, 경피, 또는 경점막, 비강, 근육내, 복강내, 피내, 정맥내, 또는 피하 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있고 따라서 제형화될 수 있다. 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 이의 의도된 투여의 경로와 양립하기 위해 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 액체 제형으로서 근육내, 복강내, 피하, 정맥내, 동맥내, 또는 피내 주사 또는 호흡기 점막 주사로 투여될 수 있다. 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 액체 형태로 또는 동결건조 형태로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 주사가능한 조성물은 종래의 형태로, 어느 한쪽 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사에 앞서 액체내 용액 또는 현탁액에 적당한 고체 형태, 또는 유탁액으로서 제조된다. 일부 구현예에서, 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말 또는 과립으로부터 제조된다. 이들 경로로 투여를 위한 약제학적 제제의 제조 및 제형에서 일반 고려사항은, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995에서 발견될 수 있고; 참고로 본원에서 편입된다. 현재 경구 또는 (예를 들면, 흡입에 의한) 경비 스프레이 또는 에어로졸 경로는 폐 및 호흡기계에 직접적으로 치료제를 전달하기 위해 가장 흔하게 사용된다. 일부 구현예에서, 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 조성물의 계량된 복용량을 전달하는 디바이스를 사용하여 투여된다. 본원에서 기재된 피내 약제학적 조성물 전달에서 사용에 적당한 디바이스는 짧은 바늘 디바이스 예컨대 미국 특허 번호 4,886,499, 미국 특허 번호 5,190,521, 미국 특허 번호 5,328,483, 미국 특허 번호 5,527,288, 미국 특허 번호 4,270,537, 미국 특허 번호 5,015,235, 미국 특허 번호 5,141,496, 미국 특허 번호 5,417,662 (이들 모두는 참고로 본원에서 편입된다)에서 기재된 것들을 포함한다. 피내 조성물은 또한 피부에 바늘의 유효 침투 길이를 제한하는 디바이스, 예컨대, 참고로 본원에서 편입된, WO1999/34850에서 기재된 것들, 및 이의 기능성 등가물로 투여될 수 있다. 또한 적당한 것은 액체 백신을 진피에 액체 제트 주사기를 통해 또는 각질층을 뚫고 진피에 도달하는 제트를 생산하는 바늘을 통해 전달하는 제트 주사 디바이스이다. 제트 주사 디바이스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,480,381, 미국 특허 번호 5,599,302, 미국 특허 번호 5,334,144, 미국 특허 번호 5,993,412, 미국 특허 번호 5,649,912, 미국 특허 번호 5,569,189, 미국 특허 번호 5,704,911, 미국 특허 번호 5,383,851, 미국 특허 번호 5,893,397, 미국 특허 번호 5,466,220, 미국 특허 번호 5,339,163, 미국 특허 번호 5,312,335, 미국 특허 번호 5,503,627, 미국 특허 번호 5,064,413, 미국 특허 번호 5,520,639, 미국 특허 번호 4,596,556, 미국 특허 번호 4,790,824, 미국 특허 번호 4,941,880, 미국 특허 번호 4,940,460, WO1997/37705, 및 WO1997/13537 (이들 모두는 참고로 본원에서 편입된다)에서 기재된다. 또한 적당한 것은 피부의 외층을 통해 진피에 분말 형태로 백신을 촉진시키기 위해 압축된 가스를 사용하는 탄도 분말/입자 전달 디바이스이다. 추가적으로, 종래 주사기는 피내 투여의 고전적 망투 (Mantoux) 방법에서 사용될 수 있다.
비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 유탁액을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 오일 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트이다. 오일의 예는 식물성 또는 동물성 오일, 피넛 오일, 대두 오일, 올리브 오일, 해바리기 오일, 간유, 합성 오일 예컨대 미네랄 오일, 및 우유 또는 계란으로부터 수득된 지질을 포함한다. 수성 담체는, 염수 및 완충 배지를 포함하는, 물, 알코올성/수성 용액, 유탁액 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산 링거, 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충액, 전해질 보충액 (예컨대 링거 덱스트로스에 기반된 것들), 및 기타 등등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제 예컨대, 예를 들어, 항균제, 항-산화제, 킬레이트제, 및 불활성 기체 및 기타 등등은 또한 존재할 수 있다.
혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 단위 용량 바이알, 다중 용량 바이알, 또는 사전-충진된 주사기의 형태로 제형화될 수 있다. 액체 제형을 위한 약제학적으로 허용가능한 담체는 수성 또는 비수성 용매, 현탁액, 유탁액, 또는 오일을 포함한다. 조성물은 등장성, 고장성, 또는 저장성일 수 있다. 하지만, 주입 또는 주사용 조성물이 기본적으로 등장성인 것이 바람직하다. 따라서, 등장성 또는 고장성은 조성물의 저장에 유리할 수 있다. 조성물이 고장성인 경우, 조성물은 투여 이전 등장성으로 희석될 수 있다. 등장화제는 이온성 등장화제 예컨대 염 또는 비-이온성 등장화제 예컨대 탄수화물일 수 있다. 이온성 등장화제는, 비제한적으로, 염화나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 및 염화마그네슘을 포함한다. 비이온성 등장화제는, 비제한적으로, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다. 바람직하게는, 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 완충액은 포함된다. 예를 들어, 조성물이 주입 또는 주사용인 경우, pH 4 내지 pH 10, 예컨대 pH 5 내지 pH 9, 또는, pH 6 내지 pH 8에서 완충 용량을 가진 완충액에서 제형화되는 것이 바람직하다. 완충액은 미국 약전 (USP)에 적당한 것들로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 완충액은 일염기산, 예컨대 아세트산, 벤조산, 글루콘산, 글리세르산, 및 락트산; 이염기산, 예컨대 아코니트산, 아디프산, 아스코르브산, 탄산, 글루탐산, 말산, 석신산, 및 타르타르산; 다염기산 예컨대 시트르산 및 인산; 그리고 염기 예컨대 암모니아, 디에탄올아민, 글리신, 트리에탄올아민, 및 TRIS로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 계면 활성제를 포함할 수 있다. 계면 활성제의 예는, 비제한적으로, (일반적으로 Tweens으로서 지칭된) 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 특히, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; 에틸렌 옥시드 (EO), 프로필렌 옥시드 (PO), 부틸렌 옥시드 (BO)의 공중합체 (예컨대 DOWFAX); 에톡시(옥시-1,2-에탄디일)기의 상이한 반복부를 가진 옥톡시놀, 특히, 옥톡시놀-9 (Triton-100); 에틸페녹시폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질 예컨대 레시틴; 노닐페놀 에톡실레이트 예컨대 TERGITOL NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴, 올레일 알코올-유도된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르 (Brij 계면활성제), 특히, 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르 (Brij 30); SPAN으로서 공지된 소르비탄 에테르, 특히, 소르비탄 트리올레에이트 (Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트를 포함한다.
계면 활성제 예컨대 Tween 80/Span 85의 혼합물은 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 예컨대 Tween 80 및 옥톡시놀 예컨대 Triton X-100의 조합은 또한 적당하다. Laureth 9 및 Tween 및/또는 옥톡시놀의 조합은 또한 유리하다. 바람직하게는, 포함된 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 (예컨대 Tween 80)의 양은 0.01 % 내지 1 % (w/v), 0.01 % 내지 0.1 % (w/v), 0.01 % 내지 0.05 % (w/v), 또는 약 0.02 %일 수 있고; 포함된 옥틸페녹시 폴리옥시에탄올 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 (예컨대 Triton X-100)의 양은 0.001 % 내지 0.1 % (w/v), 특히 0.005 % 내지 0.02 %일 수 있고; 포함된 폴리옥시에틸렌 에테르 (예컨대 Laureth 9)의 양은 0.1 % 내지 20 % (w/v), 가능하게는 0.1 % 내지 10 %, 특히 0.1 % 내지 1 % 또는 약 0.5 %일 수 있다.
일부 구현예에서, 혼합 담체, 21-가 폐렴구균성 접합체 조성물은 방출 제어 시스템을 통해 전달될 수 있다. 예를 들어, 정맥내 주입, 경피 패치, 리포좀, 또는 다른 경로는 투여용으로 사용될 수 있다. 일 양태에서, 거대분자 예컨대 미소구체 또는 임플란트는 사용될 수 있다.
상기 개시내용은 일반적으로 본 발명을 기재한다. 더욱 완벽한 이해는 하기 특정 실시예를 참고로 수득될 수 있다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 기재되고 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 에스. 뉴모니아 협막 다당류의 제조
에스. 뉴모니아의 양성 및 협막 다당류의 정제는 종래 기술의 숙련가에 공지된 대로 수행되었다. 에스. 뉴모니아 혈청형은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection; ATCC) (혈청형 1: ATCC 번호 6301; 혈청형 3: ATCC 번호 6303; 혈청형 4: ATCC 번호 6304; 혈청형 5: ATCC 번호 6305; 혈청형 6A: ATCC 번호 6306; 혈청형 6B: ATCC 번호 6326; 혈청형 7F: ATCC 번호 10351; 혈청형 9N: ATCC 번호 6309; 혈청형 9V: ATCC 번호 10368; 혈청형 14: ATCC 번호 6314; 혈청형 18C: ATCC 번호 10356; 혈청형 19A: ATCC 번호 10357; 혈청형 19F: ATCC 번호 6319; 혈청형 23F: ATCC 번호 6323)으로부터 수득되었다. 혈청형 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F, 및 33F용 내부 균주는 사용되었지만, 임의의 공공으로 이용가능한 균주는 사용될 수 있다. 에스. 뉴모니아는 캡슐 및 운동성, 그람-양성, 란셋형 쌍구균, 그리고 혈액 우무 배지에서 알파 용혈을 특징으로 하였다. 혈청형은 특이적 항-혈청 (미국 특허 번호 5,847,112)를 사용하는 쿠엘링(Quelling) 시험으로 확인되었다.
세포 은행의 제조
씨드 스톡의 몇몇 세대는 균주를 확장시키기 위해 그리고 동물 기원 (세대 F1, F2, 및 F3)의 구성요소를 제거하기 위해 생성되었다. 씨드 스톡의 2개 추가의 세대는 생산되었다. 제 1 추가의 세대는 F3 바이알로부터 배양되었고, 후속 세대는 제 1 추가의 세대의 바이알로부터 배양되었다. 씨드 바이알은 동결보존제로서 합성 글리세롤로 (-70℃ 미만) 냉동 저장되었다. 세포 은행 제조를 위하여, 모든 배양물은 대두계 배지에서 성장되었다. 냉동에 앞서, 세포는 원심분리로 농축되었고, 소비된 배지는 제거되었고, 세포 펠렛은 동결보존제 (예컨대 합성 글리세롤)을 함유하는 신선 배지에서 재-현탁되었다.
배양 및 수확
작업하는 세포 은행으로부터 배양물은 대두계 배지를 함유하는 씨드 병에 주입되었고 배양되었다. 표적 광학 밀도 (흡광도)가 달성된 후, 씨드 병은 대두계 배지를 함유하는 발효기를 접종하는데 사용되었다. 광학 밀도 값이 일정하게 유지되기 시작한 경우 배양은 종결되었다. 배양 종결 이후, 소듐 데옥시콜레이트는 배양물에 첨가되어 세포를 용해시켰다. 생성된 발효기 내용물은 냉각되었고, 단백질 침전은 유도되었다. 그 다음, 혼합물은 원심분리되어 침전된 단백질 및 세포 잔해를 제거하였다.
정제
원심분리로부터 수득된 용액은 심층 필터를 통해 여과되어 원심분리에서 침전되지 않았던 단백질 및 세포 잔해를 제거하였다. 여과물은 100 kDa MW 막에서 농축되었고 농축물은 25 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.2)의 10 용적으로 정용여과되어 샘플을 수득하였다. 샘플은 여과되어 다당류가 침전되고 여과된 상청액을 수집하였다. 여과물은 30 kDa 막에서 농축되었고, 농축물은 삼중 증류수의 약 10 용적을 사용하여 정용여과되었다. 정용여과 수행 이후, 잔여 용액은 0.2 μm 필터를 사용하여 여과되었다. 인-프로세스 제어 시험은 여과물에서 수행되었다 (외관, 잔여 단백질, 잔여 핵산, 내독소, 분자량, 및 다당류의 총량). 농축물은 멸균 여과되었고 -20 ℃에서 저장되었다.
실시예 2. 에스. 뉴모니아 협막 다당류 및 담체 단백질의 접합체의 제조
상이한 혈청형의 다당류는 상이한 경로를 따라 활성화되었고 그 다음 담체 단백질, CRM197 또는 TT에 접합되었다. 구체적으로, 접합체는 CRM197에 모든 혈청형의 협막 다당류의 각각을 접합시킴으로써 그리고 TT에 혈청형 1, 3, 및 5의 협막 다당류의 각각을 접합시킴으로써 제조되었다. 천연 혈청형의 크기에 의존하여 활성화 공정은 표적 분자량에 대한 각 협막 다당류의 크기 감소, 화학적 활성화, 및 한외여과를 통한 완충액 교환을 포함할 수 있다. 접합체는 한외여과를 사용하여 정제되었고 최종적으로 0.2 μm 필터를 통해 여과되었다. 공정 파라미터 예컨대 pH, 온도, 농도, 및 시간은 다음과 같았다.
(1) 활성화 공정
단계 1: 가수분해
환원성 아민화는 단백질의 일차 아민 (-NH2) 기와 당류의 알데히드 사이 아미드 결합이 형성되는 중합체를 접합하기 위한 공지된 방법이다. 알데히드기는 폐렴구균성 협막 다당류에 첨가되어 담체 단백질에 접합을 촉진시킨다. 단당류의 근접 디올 구조는 과요오드산나트륨 (NaIO4)에 의해 산화되어 알데히드기를 형성할 수 있다. 혈청형 1, 3, 4, 6A, 8, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 22F, 및 33F로부터 협막 다당류는 하기와 같이 사전-처리되었다.
혈청형 1의 경우에서, (0.05 M의 최종 염기 농도에) 수산화나트륨은 협막 다당류의 용액에 첨가되었고, 상기 용액은 50±2 ℃에서 인큐베이션되었다. 상기 용액은 그 다음 약 21 ℃ 내지 약 25 ℃ 범위의 온도로 냉각되었고, 염산은 거기에 6.0±0.1의 최종 pH이도록 첨가되었고, 이에 의해 가수분해를 중지시켰다.
혈청형 3, 8, 11A, 및 15B의 경우에서, (0.01 M의 최종 산 농도에) 염산은 협막 다당류의 용액에 첨가되었고, 용액은 60±2 ℃에서 인큐베이션되었다. 상기 용액은 그 다음 약 21 ℃ 내지 약 25 ℃ 범위의 온도로 냉각되었고, 0.1M 인산나트륨은 거기에 6.0±0.1의 최종 pH이도록 첨가되었고, 이에 의해 가수분해를 중지시켰다.
혈청형 4의 경우에서, (0.1 M의 최종 산 농도에) 염산은 협막 다당류의 용액에 첨가되었고, 용액은 45±2 ℃에서 인큐베이션되었다. 용액은 그 다음 약 21 ℃ 내지 약 25 ℃ 범위의 온도로 냉각되었고, 1M 인산나트륨은 거기에 6.0±0.1의 최종 pH이도록 첨가되었고, 이에 의해 가수분해를 중지시켰다.
혈청형 6A의 경우에서, (0.1 M의 최종 산 농도에) 빙초산은 협막 다당류의 용액에 첨가되었고, 용액은 60±2 ℃에서 인큐베이션되었다. 용액은 그 다음 약 21 ℃ 내지 약 25 ℃ 범위의 온도로 냉각되었고, 1M 수산화나트륨은 거기에 6.0±0.1의 최종 pH이도록 첨가되었고, 이에 의해 가수분해를 중지시켰다.
혈청형 12F의 경우에서, (0.01 M의 최종 산 농도에) 염산은 협막 다당류의 용액에 첨가되었고, 용액은 70±2 ℃에서 인큐베이션되었다. 용액은 그 다음 약 21 ℃ 내지 약 25 ℃ 범위의 온도로 냉각되었고, 0.1M 인산나트륨은 거기에 6.0±0.1의 최종 pH이도록 첨가되었고, 이에 의해 가수분해를 중지시켰다.
혈청형 14 및 18C의 경우에서, (0.2 M의 최종 산 농도에) 빙초산은 협막 다당류의 용액에 첨가되었고, 용액은 94±2 ℃에서 인큐베이션되었다. 용액은 그 다음 약 21 ℃ 내지 약 25 ℃ 범위의 온도로 냉각되었고, 1M 인산나트륨은 거기에 용액의 최종 pH가 6.0±0.1이도록 첨가되었고, 이에 의해 가수분해를 중지시켰다.
혈청형 22F 및 33F의 경우에서, (0.01 M의 최종 산 농도에) 염산은 협막 다당류의 용액에 첨가되었고, 용액은 60±2 ℃에서 인큐베이션되었다. 용액은 그 다음 약 21 ℃ 내지 약 25 ℃ 범위의 온도로 냉각되었고, 0.1M 인산나트륨은 거기에 6.0±0.1의 최종 pH이도록 첨가되었고, 이에 의해 가수분해를 중지시켰다.
수득된 협막 다당류의 각각은 주사용수 (WFI), 아세트산나트륨, 및 인산나트륨에서 약 1.0 mg/mL 내지 약 2.0 mg/mL의 최종 농도로 희석되었다.
단계 2: 과요오드산염 반응
각 폐렴구균성 당류 활성화를 위한 과요오드산나트륨 몰 당량은 반복 단위 몰 질량에 근거하여 결정되었다. 철저한 혼합으로, 산화 반응은 1, 7F, 및 19F를 제외한 모든 혈청형에 대하여 21 ℃ 내지 25 ℃에서 16 내지 20 시간 동안 진행하게 되었고, 이에 대하여 온도는 10℃ 이하이었다. 접합체의 일관되고 안정한 생산 유지를 돕기 위해, 각 혈청형에 대한 산화도 (Do) 수준의 범위는 접합 공정 동안 표적된다. 각 혈청형에 대한 Do 수준을 위한 바람직한, 표적된 범위는 표 1 및 표 2에서 나타난다.
단계 3: 한외여과
산화된 당류는 농축되었고 100 kDa MWCO 한외여과기 (혈청형 1에 대하여 30kDa 한외여과기 및 혈청형 18C에 대하여 5 kDa 한외여과기)에서 WFI로 정용여과되었다. 정용여과는 혈청형 1에 대하여 0.9 % 염화나트륨 용액, 혈청형 7F 및 23F에 대하여 0.01 M 아세트산나트륨 완충액 (pH 4.5), 그리고 혈청형 19F에 대하여 0.01 M 인산나트륨 완충액 (pH 6.0)을 사용하여 수행되었다. 투과물은 폐기되었고, 체류물은 0.2 μm 필터를 통해 여과되었다.
단계 4: 동결건조
수성 용매를 사용함으로써 담체 단백질에 접합되어야 하는 혈청형 3, 4, 5, 8, 9N, 9V, 10A, 14, 15B, 22F, 및 33Fd의 협막 다당류에 대하여, 다당류 및 담체 단백질의 혼합된 용액은 추가 수크로스 첨가 없이 제조되었고, 동결건조되었고, 그 다음 -25 ℃ ± 5 ℃에서 저장되었다.
수성 용매를 사용함으로써 담체 단백질에 접합되어야 하는 혈청형 1 및 18C의 협막 다당류에 대하여, 다당류 및 담체 단백질은, 추가 수크로스 첨가 없이, 독립적으로 제조되었고, 동결건조되었고, 그 다음 -25 ℃ ± 5 ℃에서 저장되었다.
DMSO 용매를 사용함으로써 담체 단백질에 접합되어야 하는 혈청형 6A, 6B, 7F, 19A, 19F, 및 23F의 협막 다당류에 대하여, 5 % ±3 % (w/v)의 최종 수크로스 농도에 도달하기 위한 수크로스의 소정량은 활성화된 당류에 첨가되었고, 샘플은 독립적으로 제조되었고, 동결건조되었고, 그 다음 -25 ℃ ± 5 ℃에서 저장되었다.
혈청형 11A의 협막 다당류에 대하여, 20 % ± 5 % (w/v)의 최종 수크로스 농도에 도달하기 위한 수크로스의 소정량은 활성화된 당류에 첨가되었고, 다당류 및 담체 단백질은 독립적으로 제조되었고, 동결건조되었고, 그 다음 -25 ℃ ± 5 ℃에서 저장되었다.
혈청형 12F의 협막 다당류에 대하여, 10 % ± 5 % (w/v)의 최종 수크로스 농도에 도달하기 위한 수크로스의 소정량은 활성화된 당류에 첨가되었고, 다당류 및 담체 단백질은 독립적으로 제조되었고, 동결건조되었고, 그 다음 -25 ℃ ± 5 ℃에서 저장되었다.
(2) 접합 공정
수성 접합은 혈청형 1, 3, 4, 5, 8, 9N, 9V, 10A, 14, 15B, 18C, 22F, 및 33F에 대하여 수행되었고, DMSO 접합은 혈청형 6A, 6B, 7F, 11A, 12F, 19A, 19F, 및 23F에 대하여 수행되었다. 협막 다당류의 각각은 담체 단백질에 0.2 내지 2:1의 비율로 접합되었다.
단계 1: 용해
수성 접합
혈청형 1, 3, 4, 5, 8, 9N, 9V, 10A, 14, 15B, 18C, 22F, 및 33F에 대하여, 동결건조된 샘플은 해동되었고 실온에서 평형화되었다. 동결건조된 샘플은 각 혈청형에 대하여 설정된 비율로 23±2℃에서 인산나트륨 완충액 용액을 사용함으로써 반응 농도로 재구성되었다.
디메틸 설폭시드 (DMSO) 접합
혈청형 6A, 6B, 7F, 11A, 12F, 19A, 19F, 및 23F에 대하여, 동결건조된 샘플은 해동되었고, 실온에서 평형화되었고, DMSO에서 재구성되었다.
단계 2: 접합 반응
수성 접합
혈청형 3-TT, 4, 5, 5-TT, 8, 9N, 9V, 10A, 14, 15B, 18C, 22F, 및 33F에 대하여, 접합 반응은 당류의 몰 당 1.0 내지 1.4 몰 소듐 시아노보로하이드라이드로 소듐 시아노보로하이드라이드 용액 (100 mg/mL)을 첨가함으로써 개시되었다. 하지만, 혈청형 1, 1-TT 및 3에 대하여, 반응은 당류의 몰 당 0.5 몰 소듐 시아노보로하이드라이드로 소듐 시아노보로하이드라이드 용액을 첨가함으로써 개시되었다.
반응 혼합물은 23 ℃ 내지 37 ℃에서 44 내지 106 시간 동안 인큐베이션되었다. 반응 온도 및 시간은 혈청형에 의해 조정되었다. 온도는 그 다음 23±2 ℃로 저하되었고 염화나트륨 0.9 %는 반응기에 첨가되었다. 소듐 보로하이드라이드 용액 (100 mg/mL)는 첨가되어 당류의 몰 당 소듐 보로하이드라이드의 1.8 내지 2.2 몰 당량을 달성하였다. 혼합물은 23±2 ℃에서 3 내지 6 시간 동안 인큐베이션되었다. 이 절차는 당류에 존재하는 임의의 미반응된 알데히드를 감소시켰다. 그 다음, 혼합물은 염화나트륨 0.9 %로 희석되었고 희석된 접합 혼합물은 0.8 또는 0.45 μm 사전-필터를 사용하여 여과되었다.
DMSO 접합
혈청형 6A, 6B, 7F, 11A, 12F, 19A, 19F, 및 23F의 협막 다당류에 대하여, 접합 반응은 활성화된 당류의 1 몰 당 소듐 시아노보로하이드라이드의 0.8 내지 1.2 몰 당량의 비율로 소듐 시아노보로하이드라이드 용액 (100 mg/mL)를 첨가함으로써 개시되었다. WFI는 반응 혼합물에 1 % (v/v)의 표적 농도로 첨가되었고, 혼합물은 12 내지 26 시간 동안 23±2 ℃에서 인큐베이션되었다. 100 mg/mL의 소듐 보로하이드라이드 용액 (전형적으로 1.8 내지 2.2 몰 당량 소듐 보로하이드라이드 / 몰 활성화된 당류) 및 WFI (표적 5 % v/v)는 반응에 첨가되었고 혼합물은 3 내지 6 시간 동안 23±2 ℃에서 인큐베이션되었다. 이 절차는 당류에서 존재하는 임의의 미반응된 알데히드를 감소시켰다. 그 다음, 반응 혼합물은 염화나트륨 0.9 %로 희석되었고, 희석된 접합 혼합물은 0.8 또는 0.45 μm 사전-필터를 사용하여 여과되었다.
단계 3: 한외여과
희석된 접합체 혼합물은 농축되었고 0.9 % 염화나트륨 또는 완충액의 최소 15 용적을 가진 100 kDa MWCO 한외여과 필터 또는 300 kDa MWCO 한외여과 필터에서 정용여과되었다. 또한, 공정에서 사용된 완충액의 조성 및 pH는 혈청형의 각각에 따라 다양하였다.
단계 4: 멸균 여과
한외여과 이후 체류물은 멸균 여과되었고 (0.2 μm), 인-프로세스 제어 (외관, 자유 단백질, 자유 당류, 분자 크기 분포, 멸균성, 당류 함량, 단백질 함량, pH, 내독소, 잔류 시아니드, 잔류 DMSO, 당류 정체성, TT 정체성, 및 CRM197 정체성)은 여과된 접합체에서 수행되었다. 최종 농축물은 냉장되었고 2 ℃ 내지 8 ℃에서 저장되었다.
실시예 3. 다가 폐렴구균성 접합체 백신의 제형
실시예 2로부터 수득된 최종 벌크 농축물의 원하는 용적은 배치 용적 및 벌크 당류 농도에 근거하여 계산되었다. 0.85 % 염화나트륨 (생리학적 염수), 폴리소르베이트 80, 및 석시네이트 완충액이 사전-표지된 제형 용기에 첨가된 이후, 벌크 농축물은 첨가되었다. 제조물은 그 다음 철저하게 혼합되었고 0.2 μm 막을 통해 멸균 여과되었다. 제형화된 벌크는 벌크 인산알루미늄의 첨가 동안 그리고 그 이후 부드럽게 혼합되었다. pH는 체크되었고 필요하면 조정되었다. 제형화된 벌크 생산물은 2 내지 8 ℃에서 저장되었다. 하기, 비-제한, 다가 폐렴구균성 접합체 백신 제형은 제조되었고 PCV21(1/5)-TT 및 PCV21(3/5)-TT로 명명되었다:
PCV21(1/5)-TT는 TT에 혈청형 1 및 5의 각 다당류를 그리고 CRM197에 혈청형 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F의 각 다당류를 접합시킴으로써 제조된 다당류-접합체를 포함하였고;
PCV21(3/5)-TT는 TT에 혈청형 3 및 5의 각 다당류를 그리고 CRM197에 혈청형 1, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F의 각 다당류를 접합시킴으로써 제조된 다당류-접합체를 포함하였다.
0.5 ml의 총 용량으로 PCV21(1/5)-TT 조성물은, 4.4 μg에서 혈청형 6B를 제외한, 각 다당류의 2.2 μg; (혈청형 1 및 5에 대하여) TT의 2 μg 내지 25 μg 및 CRM197의 40 μg 내지 75 μg; 원소성 알루미늄 (0.5 mg 인산알루미늄) 아쥬반트의 0.125 mg; 염화나트륨의 4.25 mg; 석시네이트 완충액 용액의 약 295 μg; 및 폴리소르베이트 80의 약 100 μg을 0.5 ml 용량의 총계로 포함하였다. 특정 실험에서, 혈청형 3 다당류의 양은 PCV21(1/5)-TT 조성물에서 4.4 μg 또는 8.8 μg으로 증가되었다. 특정 실험에서, 혈청형 3, 4, 6B, 9V, 19A, 및 19F의 각각에 대하여 다당류의 양은 PCV21(1/5)-TT 조성물에서 4.4 μg으로 증가되었다.
0.5 ml의 총 용량으로 PCV21(3/5)-TT 조성물은 (혈청형 3 및 5에 대하여) TT의 2 μg 내지 25 μg 및 40 μg 내지 75 μg CRM197, 각각을 포함하였고, 다른 성분 및 이의 함량은 PCV21(1/5)-TT의 것들과 동일하였다. 특정 조성물에서, 0.5 ml 용량으로 원소성 알루미늄의 양은 0.250 mg으로 증가되었다.
실시예 4. 다가 폐렴구균성 접합체 백신의 면역원성
실시예 3에서 제조된 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 백신, PCV21(1/5)-TT 및 PCV21(3/5)-TT는 토끼에서 면역원성 반응을 유도하기 위한 능력에 대하여 시험되었다. 면역원성 평가는 혈청 IgG 농도에 대하여 항원-특이적 ELISA로 그리고 항체 기능성에 대하여 오프소노파고시틱(opsonophagocytic) 검정 (OPA)로 수행되었다. 뉴질랜드 화이트 토끼는 제형에서 각 다당류의 계획된 인간 임상 용량 (2.31 μg의 각 다당류, 4.62 μg에서 6B 제외) 또는 인간 용량 (2.2 ug의 각 다당류, 4.4 ug에서 6B 제외)보다 더 높은 5% 의 용량으로 0 주째 및 2 주째에 근육내로 면역화되었다. 혈청은 면역화 후 매 2 주 샘플링되었다. 양쪽 농도는 동일한 결과를 나타냈다.
4-1. PCV21(3/5)-TT
혈청형 특이적 IgG 농도 측정
각 혈청형용 협막 다당류 (PnPs)는 0.5 μg/웰 내지 1 μg/웰로 96-웰 플레이트에서 코팅되었다. 혈청의 동등량은 각 대상체로부터 샘플링되었고 그룹으로 풀링되었다. 혈청 풀은 스타텐스 세럼 인스티투트(Statens Serum Institut)로부터 수득된 폐렴구균성 세포-벽 다당류 (CWPS) 및 Tween 20을 포함하는 항체 희석 완충액 (5 μg/mL)으로 2.5 배만큼 연속해서 희석되었고 그 다음 실온에서 30 분 동안 반응되었다. 플레이트는 세정 완충액으로 5회 세정되었고 그 다음 사전-흡착되었고 희석된 혈청 50 μl는 코팅된 웰 플레이트에 첨가되었고, 이어서 실온에서 2 시간 내지 18 시간 동안 인큐베이션되었다. 웰 플레이트는 동일한 방식으로 세정되었고 그 다음 염소 항-토끼 IgG-알칼리성 포스파타제 접합체는 각 웰에 첨가되었고, 이어서 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션되었다. 플레이트는 상기 기재된 바와 같이 세정되었고 1 mg/mL p-니트로페닐아민 완충액은 기질로서 각 웰에 첨가되었고 그 다음 실온에서 2 시간 동안 반응되었다. 반응은 3 M NaOH의 50 μl를 첨가함으로써 켄칭되었고 405 nm 및 690 nm에서 흡광도는 측정되었다. 비교예로서, 상용가능한, 13-가 백신 (PREVNAR13)은 동일한 절차로 처리되었다. 결과는 표 3에서 나타난다.
혈청형 3 및 5의 협막 다당류가 TT에 접합된 경우, 혈청형 특이적 IgG 농도는 이들이 CRM197에 접합된 경우 수득된 것과 비교하여 상당히 증가하였다. PCV21(3/5)-TT로 면역화된 토끼는 또한 PREVNAR13에서 존재하지 않은 추가의 8개 혈청형 (즉, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F, 및 33F)에 대해 IgG 농도에서 유의미한 증가를 증명하였다. 혈청형 9N은 특히, 0.125 mg 및 0.250 mg 알루미늄으로 투여된 경우, PREVNAR13에 비해 혈청 특이적 IgG 농도에서 각각 의외의 40-배 및 50-배 증가를 가졌다. 추가로, PCV21(3/5)-TT에서 혈청형의 다른 협막 다당류의 다수는 PREVNAR13보다 혈청 특이적 IgG 농도의 상당히 더 높은 수준을 나타냈다.
기능 면역원성 시험 (MOPA)
항체 기능은 MOPA 검정에서 혈청을 시험함으로써 평가되었다. -70 ℃ 이하에서 저장된 에스. 뉴모니아 MOPA 균주는 각 균주의 농도가 약 50,000 CFU/mL이도록 상응하는 최종 희석 배수로 희석되었다. 혈청의 동등량은 각 대상체로부터 샘플링되었고, 그룹으로 풀링되었고 2-배 연속해서 희석되어 이로써 20 μl의 혈청은 U-바닥 플레이트에서 남아있었다. 샘플 희석 이후, 각 혈청형에 대하여 제조된 균주의 10 μl는 희석된 샘플과 혼합되었고, 혼합물은 실온에서 30 분 동안 반응하게 되었고 이로써 에스. 뉴모니아 및 항체는 양호하게 혼합되었다. 사전-분화된 HL-60 세포 및 보체의 혼합물은 첨가되었고 CO2 인큐베이터 (37 ℃)에서 45 분 동안 반응되었다. 온도는 저하되어 식세포작용을 중단시켰고 반응 용액의 10 μl는 30 내지 60 분 동안 사전-건조된 한천 플레이트상에 스팟팅되었고, 그 다음 건조까지 20 분 동안 플레이트상에 흡착하게 되었다. 25 mg/mL TTC 스톡 용액은 제조된 중첩 한천에 첨가되었고, 상응하는 균주에 적당한 항체는 거기에 첨가되었다. 혼합물은 철저하게 혼합되었고, 그 다음 혼합물의 약 25 mL는 플레이트에 첨가되었고 약 30 분 동안 경화되었다. 완전히 경화된 플레이트는 CO2 인큐베이터 (37 ℃)에서 12 내지 18 시간 동안 인큐베이션되었고 그 다음 콜로니는 계수되었다. MOPA 역가는 50 % 사멸이 관측된 희석 비율로서 표현되었다. 비교예로서, 상용가능한, 13-가 백신 (PREVNAR13)은 동일한 절차로 처리되었다. 결과는 표 4에서 나타난다.
혈청형 3 및 5가 TT에 접합된 경우, 기능 MOPA 역가는 이들이 CRM197에 접합된 경우 수득된 MOPA 역가에 비교하여 상당히 증가하였다. PCV21(3/5)-TT로 면역화된 토끼는 또한 PREVNAR13에서 존재하지 않는 추가의 8개 혈청형 (즉, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F, 및 33F)의 각각에 대해 기능 MOPA 역가에서 유의미한 증가를 증명하였다.
4-2. PCV21(1/5)-TT
혈청형 특이적 IgG 농도 및 기능 면역원성 역가는 4-1에서와 동일한 방식으로 측정되었고, 결과는 하기와 같이 나타난다. 3개의 상이한 PCV21(1/5)-TT 구현예는 시험되었다: 혈청형 3으로부터 협막 다당류의 2.2 μg을 가진 하나 ("3-CRM197 2.2"), 혈청형 3으로부터 협막 다당류의 4.4 μg을 가진 하나 ("3-CRM197 4.4") 및 혈청형 3으로부터 협막 다당류의 8.8 μg을 가진 하나 ("3-CRM197 8.8").
혈청형 특이적 IgG 농도 측정
혈청형 1 및 5의 협막 다당류가 TT에 접합된 경우, 혈청형 특이적 IgG 농도는 이들이 CRM197에 접합된 경우 수득된 것과 비교하여 상당히 증가하였다. PCV21(1/5)-TT로 면역화된 토끼는 또한 PREVNAR13에서 존재하지 않은 추가의 8개 혈청형 (즉, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F, 및 33F)에 대해 IgG 농도에서 유의미한 증가를 증명하였다. 재차, 혈청형 9N은 의외로 PRENAR13에 비해 유의미한 증가 (약 32- 내지 46-배 증가)를 나타냈다. 추가로, PCV21(1/5)-TT에서 혈청형의 다른 협막 다당류의 다수는 PREVNAR13에서보다 혈청 특이적 IgG 농도의 상당히 더 높은 수준을 나타냈다. 2.2 μg에서 4.4 μg으로 혈청형 3 항원의 양 배가가 의외로, 혈청형 1 및 7F에 대하여 2-배 증가보다 더 많이, 혈청형 1, 3, 5, 6A, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 22F, 및 23F에 대하여 혈청 특이적 IgG 농도를 증가시켰다는 것이 또한 관찰되었다.
기능 면역원성 시험 (MOPA)
혈청형 1 및 5가 TT에 접합된 경우, 기능 MOPA 역가는 이들이 CRM197에 접합된 경우 수득된 MOPA 역가와 비교하여 상당히 증가하였다. PCV21(1/5)-TT로 면역화된 토끼는 또한 PREVNAR13에서 존재하지 않는 추가의 8개 혈청형 (즉, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F, 및 33F)의 각각에 대해 기능 MOPA 역가에서 유의미한 증가를 증명하였다. 추가로, 몇몇 다른 혈청형은 PREVNAR13에서보다 기능 MOPA 역가의 상당히 더 높은 수준을 나타냈다. 2.2 μg에서 4.4 μg으로 혈청형 3 항원의 양의 배가(doubling)가 의외로, 혈청형 1에 대하여 4.5-배 증가보다 더 많이, 4, 15B, 및 19F 제외한 각 혈청형에 대하여 혈청 특이적 IgG 농도를 증가시켰다는 것이 또한 관찰되었다.
4-3. PCV21(1/5)-TT
4-2의 실험은 혈청형 3으로부터 협막 다당류의 2.2 μg을 갖는 PCV21(1/5)-TT 구현예 ("3-CRM197 2.2"), 혈청형 3으로부터 협막 다당류의 4.4 μg을 갖는 PCV21(1/5)-TT 구현예 ("3-CRM197 4.4"), 및 혈청형 3, 4, 6B, 9V, 19A, 및 19F로부터 협막 다당류의 4.4 μg을 갖는 PCV21(1/5)-TT 구현예 ("다중-CRM197 4.4")로 반복되었다. 혈청형 특이적 IgG 농도 및 기능 면역원성 역가는 4-1에서와 동일한 방식으로 측정되었고, 결과는 하기와 같이 나타난다.
혈청형 특이적 IgG 농도 측정
4-2에서와 같이, 혈청형 1 및 5의 협막 다당류가 TT에 접합된 경우, 혈청형 특이적 IgG 농도는 이들이 CRM197에 접합된 경우 수득된 것과 비교하여 상당히 증가하였다. PCV21(1/5)-TT로 면역화된 토끼는 또한 PREVNAR13에서 존재하지 않은 추가의 8개 혈청형 (즉, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F, 및 33F)에 대해 IgG 농도에서 유의미한 증가를 증명하였고, 혈청형 4의 협막 다당류는 PREVNAR13에서보다 혈청 특이적 IgG 농도의 상당히 더 높은 수준을 나타냈다. 2.2 μg에서 4.4 μg으로 혈청형 3 항원의 양 배가가 의외로 3개 혈청형을 제외한 모두에 대하여 혈청 특이적 IgG 농도를 증가시켰다는 것이 또한 관찰되었다. 혈청형 3, 4, 6B, 9V, 19A, 및 19F의 양이 2.2 μg에서 4.4 μg으로 증가된 PCV21(1/5)-TT 구현예 ("다중-CRM197 4.4")에 의해 증명된 바와 같이, 다중 혈청형의 더 많은 용량을 사용하는 것이 또한 가능하였다.
기능 면역원성 시험 (MOPA)
4-2에서와 같이, 혈청형 1 및 5가 TT에 접합된 경우, 기능 면역원성은 이들이 CRM197에 접합된 경우 수득된 것과 비교될 때 개선되었다. PCV21(1/5)-TT로 면역화된 토끼는 또한 PREVNAR13에서 존재하지 않는 CRM197에 접합된 추가의 8개 혈청형 (즉, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F, 및 33F)의 각각에 대해 기능 MOPA 역가에서 유의미한 증가를 증명하였다. 혈청형 3, 4, 6B, 9V, 19A, 및 19F의 양이 2.2 μg에서 4.4 μg으로 증가된, PCV21(1/5)-TT 다중-CRM197 4.4에 의해 증명된 바와 같이, 다중 혈청형의 더 많은 용량을 사용하는 것이 또한 가능하였다.
4-4. PCV21(1/5)-TT
4-2의 실험은 혈청형 3 및 4로부터 협막 다당류의 4.4 μg을 갖는 PCV21(1/5)-TT 구현예 ("3,4-CRM197 4.4")로 반복되었다. 혈청형 특이적 IgG 농도 및 기능 면역원성 역가는 4-1에서와 동일한 방식으로 측정되었고, 결과는 하기와 같이 나타난다.
혈청형 특이적 IgG 농도 측정
혈청형 1 및 5의 협막 다당류가 TT에 접합된 경우, 혈청형 특이적 IgG 농도는 이들이 CRM197에 접합된 경우 수득된 것과 비교할 때 상당히 증가하였다. PCV21(1/5)-TT로 면역화된 토끼는 또한 PREVNAR13에서 존재하지 않은 추가의 8개 혈청형 (즉, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F, 및 33F)에 대해 IgG 농도에서 유의미한 증가를 증명하였다. 2.2 μg에서 4.4 μg으로 혈청형 3 및 혈청형 4 항원의 양 배가가 PREVNAR13에서보다 혈청 특이적 IgG 농도의 상당히 더 높은 수준의 나타냈다는 것이 또한 관찰되었다. 혈청형 3 및 4의 양이 2.2 μg에서 4.4 μg으로 증가된 PCV21(1/5)-TT 구현예 ("3,4-CRM197 4.4")에 의해 증명된 바와 같이, 다중 혈청형의 더 많은 용량을 사용하는 것이 또한 가능하였다.
기능 면역원성 시험 (MOPA)
혈청형 1 및 5가 TT에 접합된 경우, 기능 면역원성은 이들이 CRM197에 접합된 경우 수득된 것과 비교하여 개선하였다. PCV21(1/5)-TT로 면역화된 토끼는 또한 PREVNAR13에서 존재하지 않은 CRM197에 접합된 추가의 8개 혈청형 (즉, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F, 및 33F)의 각각에 대해 기능 MOPA 역가에서 유의미한 증가를 증명하였다. 혈청형 3 및 4의 양이 2.2 μg에서 4.4 μg으로 증가된, PCV21(1/5)-TT 3,4-CRM197 4.4에 의해 증명된 바와 같이, 다중 혈청형의 더 많은 용량을 사용하는 것이 또한 가능하였다.
실시예 5. 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N으로부터 당류-단백질 접합체의 제조에 관한 추가 상세
세포 은행의 제조
스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N (ATCC 6309)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)로부터 획득되었다. 균주의 증식 및 동물 기원의 구성물질의 제거를 위하여, 시드 스톡은 몇몇 세대 동안 배양되었다. 스톡 바이알은 동결보호제로서 합성 글리세롤과 함께 냉장고 (< -70 ℃)에서 유지되었다. 세포 은행의 제조를 위하여, 세포 배양물은 대두계 배지에서 증식되었다. 냉동에 앞서, 세포는 원심분리로 농축되었고, 사용된 배지 제거 이후, 세포 펠렛은 동결보호제 (예를 들면, 합성 글리세롤)를 함유하는 신선 배지에서 재현탁되었다.
발효
세포 은행으로부터 배양물은 대두계 배지를 함유하는 시드 병에 주입되었다. 성장 조건이 만족된 때까지, 배양물은 교반 없이 항온에서 인큐베이션되었다. 배양물은 대두계 배지를 함유하는 시드 발효기에 주입되었고, 시드 병을 사용하여, 온도, pH 및 교반 속도는 제어되었다. 성장이 중단되거나 발효기의 작업 용량이 달성된 후 발효는 종료되었다. 불활성화제 첨가에 의한 발효의 종료 이후, 세포 잔해는 연속 유동 원심분리 및 여과의 조합을 사용하여 제거되었다.
정제
폐렴구균성 다당류 정제 공정은 다층 여과, 반복된 농축/정용여과 및 여과/용출로 이루어졌다.
활성화
최종 다당류 농도는 계산된 양의 WFI를 후속적으로 첨가함으로써 약 2.0 g/L로 조정되었다. 필요하면, 반응 pH는 대략 6.0으로 조정되었다. pH 조정 이후, 반응 온도는 21-25 ℃로 조정되었다. 과요오드산나트륨의 대략 0.024-0.189 mg은 당 1 mg 당 첨가되어 산화를 개시하였다. 산화 반응은 16-20 시간 동안 21-25 ℃에서 수행되었다.
활성화된 다당류는 농축되었고 100-kDa MWCO 한외여과 막을 사용하여 정용여과되었다. 정용여과는 정용여과 용적의 용적 10 배의 WFI로 수행되었다. 그 다음, 정제 활성화된 다당류는 2-8 ℃에서 저장되었다. 정제 활성화된 당류는 (i) 비색 검정으로 결정된 당류 농도, (ii) 비색 검정으로 결정된 알데히드 농도, (iii) 산화도 및 (iv) SEC-MALLS에 의해 측정된 분자량을 특징으로 하였다.
SEC-MALLS는 다당류 및 다당류-단백질 접합체의 분자량을 결정하는데 사용된다. SEC는 유체역학 용적에 근거하여 다당류를 분리시키는데 사용된다. 굴절률 (RI) 검출기 및 다각도 레이저 광산란 (MALLS) 검출기는 분자량을 결정하는데 사용된다. 광이 재료와 반응하는 경우, 광은 산란된다. 산란된 광의 양은 재료의 농도, dn/dc의 제곱 (특이적 굴절률 증분) 및 몰 질량에 관련된다. 분자량은 MALLS 검출기로부터 산란된 광의 신호 그리고 RI 검출기로부터 농도 신호에 근거하여 계산된다.
활성화된 다당류의 산화도 (DO)는 알데히드의 몰에 의해 분할된 당 반복 단위의 몰로서 결정된다. 당 반복 단위의 몰은, 다양한 비색 기술로, 예를 들면, 안트론 검정을 사용하여, 결정된다. 그리고, 알데히드의 몰은 팍-존슨(Park-Johnson) 비색 검정으로 결정된다.
상기 기재된 이들 기술을 사용하여, 상기 기재된 방법으로 수득된 활성화된 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N 협막 다당류가 2-19, 더욱 전형적으로 5-10의 산화도, 및 약 200-700 kDa의 분자량을 갖는 것이 결정되었다.
접합
활성화된 다당류는 활성화된 다당류의 1 g 당 CRM197의 0.5-2 g의 비율로 담체 단백질 CRM197과 블렌딩되었다. 그 다음, 블렌딩된 혼합물은 동결건조되었다. 활성화된 다당류 및 CRM197의 동결건조된 혼합물은 -20 ℃에서 저장되었다.
활성화된 다당류 및 CRM197의 동결건조된 혼합물은 0.1 M 인산나트륨 용액에서 재구성되었고 그 다음 충분히 혼합되었다. 반응 용액에서 최종 다당류 농도는 약 10-20 g/L이었다. 반응 혼합물에 소듐 시아노보로하이드라이드 (NaBH3CN)의 1.0-1.2 몰 당량 첨가에 의한 접합 개시 이후, 반응은 35-39 ℃에서 44-52 시간 동안 수행되었다. 접합 반응은 접합 반응 용액과 동일한 용적의 0.9% 염화나트륨 용액 첨가 그리고 그 다음 소듐 보로하이드라이드 (NaBH4)의 1.8-2.2 몰 당량 첨가에 의해 종료되어 미반응된 알데히드를 캡핑하였다. 캡핑 반응은 21-25 ℃에서 3-6 시간 동안 수행되었다.
접합체 용액은 100-kDa MWCO 막을 사용하여 농축 및 정용여과를 위한 0.9% 염화나트륨 용액으로 희석되었다. 희석된 접합체 용액은 0.8-0.45 μm 필터를 통해 여과되었고 농축 및 정용여과로 정제되었다. 100-kDa MWCO 막을 사용하는 정용여과는 정용여과 용적 15-40 배의 0.9% 염화나트륨 용액을 사용하여 수행되었다. 정용여과가 완료된 이후, 잔여 용액은 0.2 μm 필터를 통해 여과되었다. 접합체 용액은 대략 0.55 mg/mL 미만 농도로 희석되었고, 멸균-여과되었고 그 다음 2-8 ℃에서 저장되었다.
정제된 혈청형 9N 접합체는, 특히, (i) 비색 (라우리(Lowry)) 검정으로 결정된 단백질 농도, (ii) 비색 검정으로 결정된 알데히드 농도, (iii) 당류-대-단백질 비율, (iv) 크기 배제 크로마토그래피 (CL-4B)로 결정된 분자 크기 분포 및 (v) SEC-MALLS로 측정된 분자량을 특징으로 하였다.
혈청형 9N 접합체의 특징에서의 변화는 산화도 (DO)를 변화시키면서 관찰되었다. 결과는 표 11에서 요약된다.
혈청형 9N 접합체의 특징에서의 변화는 동결건조 동안 활성화된 다당류 및 CRM197의 블렌딩 비율을 변화시키면서 관찰되었다. 결과는 표 12에서 요약된다.
혈청형 9N 접합체의 특징에서의 변화는 접합 반응 용액에서 다당류 농도를 변화시키면서 관찰되었다. 결과는 표 13에서 요약된다.
실시예 6. 면역원성의 분석
CRM197에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형 9N 당류-단백질 접합체를 함유하는 1가 접합체 조성물은 제형화되었다.
표 11-13의 1가 면역원성 조성물의 면역원성은 ELISA로 분석되었다. 혈청형-특이적 IgG의 혈청 농도는 결정되었다.
2.5-3.5 kg 체중의 5마리 암컷 뉴질랜드 화이트 토끼는 근육내 경로를 통해 0 주에 제안된 인간 임상 용량 (접합체 2.2 μg; AlPO4로서 + 0.25 mg/mL 알루미늄)으로 면역화되었다. 토끼는 동일한 용량의 접합체 백신으로 2 주째에 재차 면역화되었고 혈액 샘플은 4 주째에 채집되었다. 혈청형-특이적 ELISA는 0 주째 및 4 주째에 혈청 샘플에 대하여 수행되었다.
분석 결과는 표 14에서 나타난다. 1가 접합체 조성물 (접합체 번호 8)로 면역화된 토끼는 혈청형 9N에 대하여 총 IgG 역가로 유의미한 증가를 나타냈다. 다른 접합체로 면역화된 토끼는 또한 총 IgG 역가에서 유의미한 증가를 나타냈다.
표 14는 표 12의 접합체 번호 8로 토끼를 면역화시킨 이후 IgG 농도 측정의 결과를 나타낸다.
하나 이상의 예시적 구현예가 명세서에서 기재된 동안, 형태 및 상세에서 다양한 변화가 하기 청구항들에 의해 한정된 바와 같이 본 발명 개념의 사상 및 범위에서 이탈 없이 실시될 수 있음이 종래 기술의 숙련가에 의해 이해될 것이다.
참고문헌
하기 참고문헌은 본원에서 인용되고 기술 분야에 관한 일반 정보를 제공하고 본원에서 논의된 검정 및 다른 상세를 제공한다. 하기 참고문헌은 전체가 참고로 본원에서 편입된다.
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Claims (30)

  1. 21개의 상이한 폐렴구균성 협막 다당류-단백질 접합체를 포함하는, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물로서, 각 폐렴구균성 협막 다당류-단백질 접합체가 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)의 상이한 혈청형으로부터의 협막 다당류에 접합된 단백질 담체를 포함하고, 상기 스트렙토코쿠스 뉴모니아 혈청형이 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F로부터 선택되고,
    상기 단백질 담체가 CRM197 또는 파상풍 톡소이드이고,
    상기 협막 다당류들 중 2개가 파상풍 톡소이드에 접합되고 상기 잔여 협막 다당류가 CRM197에 접합되고, 파상풍 톡소이드에 접합되는 상기 2개의 협막 다당류가 혈청형 1, 3, 및 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 혈청형 1 및 5로부터의 상기 협막 다당류가 상기 파상풍 톡소이드에 접합되고, 혈청형 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F로부터의 상기 협막 다당류가 CRM197에 접합되는, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 혈청형 1 및 3으로부터의 상기 협막 다당류가 상기 파상풍 톡소이드에 접합되고, 혈청형 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F로부터의 상기 협막 다당류가 CRM197에 접합되는, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 혈청형 3 및 5로부터의 상기 협막 다당류가 상기 파상풍 톡소이드에 접합되고, 혈청형 1, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F로부터의 상기 협막 다당류가 CRM197에 접합되는, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 아쥬반트를 추가로 포함하는, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 아쥬반트가 알루미늄계 아쥬반트인, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 아쥬반트가 인산알루미늄, 황산알루미늄, 및 수산화알루미늄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 아쥬반트가 인산알루미늄인, 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 하기의 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물:
    혈청형 9N으로부터의 상기 협막 다당류가 2-19 또는 5-10의 산화도 및 200-700 kDa의 분자량을 갖도록 활성화되는 상태에서 혈청형 9N으로부터의 상기 협막 다당류가 CRM197에 접합됨;
    혈청형 9N으로부터의 상기 협막 다당류와 CRM197 사이에 형성된 상기 접합체가 500-4,000 kDa의 분자량을 가짐;
    혈청형 9N으로부터의 상기 협막 다당류와 CRM197 사이에 형성된 상기 접합체에서, 혈청형 9N으로부터의 상기 협막 다당류 대 CRM197의 비율 (W/W)이 0.5-2.5임; 및/또는
    혈청형 9N으로부터의 상기 협막 다당류와 CRM197 사이에 형성된 상기 접합체의 15-60%가 CL-4B 컬럼에서 0.3 이하의 Kd를 가짐.
  10. 대상체에서 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염 또는 질환에 대한 예방용인, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 상기 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 백신.
  12. 제11항에 있어서, 여기서 21가지의 서로 다른 폐렴구균 협막 다당류-단백질 접합체는 각각 파상풍 톡소이드에 접합된 혈청형 1 및 5로부터의 협막 다당류, 및 각각 CRM197에 접합된 혈청형 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F로부터의 협막 다당류로 이루어진 백신.
  13. 제12항에 있어서, 여기서 백신은 혈청형 6B의 협막 다당류를 제외한 각 협막 다당류를 약 2μg 내지 약 2.5μg과 혈청형 6B의 협막 다당류를 4μg 내지 5μg 포함하는 단일 0.5ml 용량으로 제형화되는 백신.
  14. 제13항에 있어서, 여기서 백신은 혈청형 6B의 협막 다당류를 제외한 각 협막 다당류를 약 2.2μg과 혈청형 6B의 협막 다당류를 4.4μg 포함하는 단일 0.5ml 용량으로 제형화되는 백신.
  15. 제12항에 있어서, 여기서 백신은 혈청형 1, 5, 6A, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 22F, 23F 및 33F의 각 협막 다당류 2μg 내지 2.5μg과 혈청형 3, 4, 6B, 9V, 19A 및 19F의 각 협막 다당류 4μg 내지 5μg을 포함하는 단일 0.5ml 용량으로 제형화되는 백신.
  16. 제15항에 있어서, 여기서 백신은 혈청형 1, 5, 6A, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 22F, 23F 및 33F의 각 협막 다당류 2.2μg과 혈청형 3, 4, 6B, 9V, 19A 및 19F의 각 협막 다당류 4.4μg을 포함하는 단일 0.5ml 용량으로 제형화되는 백신.
  17. 제12항에 있어서, 여기서 백신은 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 9V, 19A 및 19F로 이루어진 그룹에서 선택된 최대 6가지 혈청형을 제외한 각 협막 다당류의 2.2μg, 및 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 9V, 19A 및 19F로 이루어진 그룹에서 선택된 최대 6가지 혈청형의 각 협막 다당류를 4.4μg 포함하는 단일 0.5ml 용량으로 제형화되는 백신.
  18. 제12항에 있어서, 여기서 백신은
    혈청형 6B를 제외한 각 협막 다당류 2.2μg,
    혈청형 6B의 캡슐 폴리사카라이드 4.4μg,
    파상풍 톡소이드 2μg 내지 25μg,
    CRM197 40μg 내지 75μg,
    원소성 알루미늄 아쥬반트 0.125 내지 0.250mg,
    염화나트륨; 및
    석시네이트 완충액을 포함하는 단일 0.5ml 용량으로 제형화되는 백신.
  19. 제18항에 있어서, 폴리소르베이트 80을 더 포함하는 백신.
  20. 제19항에 있어서, 여기서 원소성 알루미늄 아쥬반트는 인산알루미늄을 포함하는 백신.
  21. 제18항에 있어서, 혈청형 6B를 제외한 각각의 협막 다당류 2.2μg과 혈청형 6B 협막 다당류 4.4μg을 포함하는 백신.
  22. 대상체에서 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염 또는 질환에 대한 예방용인, 제12항에 따른 백신.
  23. 제22항에 있어서, 상기 대상체가 적어도 50 세인 인간이고 상기 질환이 폐렴 또는 침습성 폐렴구균성 질환 (IPD)인, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염 또는 질환에 대한 예방용인 백신.
  24. 제22항에 있어서, 상기 대상체가 적어도 생후 6 주인 인간이고 상기 질환이 폐렴, 침습성 폐렴구균성 질환 (IPD), 또는 급성 중이염 (AOM)인, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염 또는 질환에 대한 예방용인 백신.
  25. 제24항에 있어서, 상기 대상체가 생후 6 주 내지 5 세, 생후 2 내지 15 개월, 또는 6 내지 17 세인, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염 또는 질환에 대한 예방용인 백신.
  26. 제22항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염 또는 질환에 대한 예방용인 백신.
  27. 제22항에 있어서, 상기 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물 또는 상기 백신이 근육내 주사로 투여되는, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염 또는 질환에 대한 예방용인 백신.
  28. 제22항에 있어서, 상기 혼합 담체, 다가 폐렴구균성 접합체 조성물 또는 상기 백신이 면역화 시리즈의 일부로서 투여되는, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염 또는 질환에 대한 예방용인 백신.
  29. 대상체에서 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염 또는 질환에 대한 예방용인, 제21항에 따른 백신.
  30. 대상체에서 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염 또는 질환에 대한 예방용인, 제11항에 따른 백신.
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