CZ20003738A3

CZ20003738A3 - Bicyklické deriváty kyseliny hydroxamové

Info

Publication number: CZ20003738A3
Application number: CZ20003738A
Authority: CZ
Inventors: Ralph Pelton Robinson
Original assignee: Pfizer Products Inc.
Priority date: 1998-04-10
Filing date: 1999-03-24
Publication date: 2001-12-12
Also published as: BG104919A; AU740664B2; DE69909613T2; US6110964A; DZ2758A1; JP4242069B2; YU57600A; CA2327723A1; NZ506805A; UA53786C2; CN1296488A; HRP20000647A2; ES2201677T3; DE69909613D1; AP9901504A0; BR9909565A; AP1047A; ID26089A; EP1070069B1; SA99200090A

Description

Bicyklické deriváty hydroxamové kyseliny obecného vzorce I, kde Z a Q mají specifický význam, farmaceutické kompozice na jejich bázi a způsoby léčení chorob, které je možno léčit inhibicí matričních metalloproteinas nebo inhibicí savčího reprolysinu, u savců, jako člověka.

HOHN

(13) Druh dokumentu: A3 (51) Int. Cl.

C07D 493/08 A61K 31/35 A61P 19/00 A61P 25/00 A61P 35/04 A61P 31/18 //(C 07 D 493/08, C 07 D 311:00, C 07 D 307:00) • · ····· · · · · · • · · · · · ·· · · * · · ·

01-2509-00-Ma

Bicyklické deriváty hydroxamové kyseliny a farmaceutické kompozice a způsoby léčení na jejich bázi

Oblast techniky

Vynález se týká bicyklických derivátů hydroxamové kyseliny a farmaceutických kompozic a způsobů léčení na bázi těchto sloučenin.

Dosavadní stav techniky

Sloučeniny podle vynálezu jsou inhibitory zinkových metaloendopeptidas, zejména metaloendopeptidas, které náleží do podtřídy metzinkinů, matričních metaloproteinas (které jsou také označovány jako MMP nebo matrixiny) a reprolysinů (které jsou také označovány jako adamylsiny) (Rawlings et al., Methods in Enzymology, 248, 183 až 228, 1995 a Stocker et al., Protein Science 4, 823 až 840, 1995). Podtřída enzymů MMP v současné době zahrnuje sedmnáct členů (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19 a MMP-20). MMP jsou známy svou úlohou při regulaci obratu proteinů extracelulární matrice a jako takové hrají důležitou roli při normálních fyziologických pochodech, jako je reprodukce, vývoj a diferenciace. Kromě toho jsou MMP exprimovány při řadě patologických stavů, při nichž dochází k abnormálnímu obratu pojivové tkáně. Například se ukázalo, že MMP-13, enzym s vysokou aktivitou při degradaci kolagenu typu II (základního kolagenu v chrupavce), je nadexprimován v osteoarthritické chrupavce (Mitchell et al., J. Clin. Invest. 97, 761 (1996)). Jiné MMP (MMP-2, MMP-3, MMP-8,

MMP-9 a MMP-12) jsou také nadexprimovány v osteoarthritické chrupavce a o inhibici některých nebo všech těchto MMP se • · • · ·· ·· · ·· · · · předpokládá, že zpomaluje nebo blokuje zrychlený úbytek chrupavky, který je typický pro kloubní choroby, jako je osteoarthritis a rheumatoidní arthritis.

Savčí reprolysiny jsou známy jako ADAM (A Disintegrin And Metaloproteinase) (Wolfbert et al., J. Cell. Biol., 131, 275 až 278, 1995) a kromě domény disintegrinu obsahují doménu podobnou doméně metaloproteinasy. Dosud bylo identifikováno 23 různých ADAM.

Z třídy ADAM, je nejlépe znám ADAM-17, také označovaný jako enzym konvertující faktor nekrosy nádorů-a (TÁCE). ADAM-17 (TÁCE) je odpovědný za štěpení buněčně vázaného faktoru nekrosy nádorů a (TNF-a, který je také označován jako kachektin). 0 TNF-α se zjistilo, že se podílí na mnoha infekčních a autoimunitních chorobách (W. Friers, FEBS Letters, 1991, 285, 199). Kromě toho se ukázalo, že TNF-α je prvotním mediátorem zánětlivé odpovědi pozorované při sepsi a septickém šoku (C. E. Spooner et al., Clinical Immunology and Immunopathology, 1992 62 Sil). Existují dvě formy TNF-α: typ II, membránový protein o relativní molekulové hmotnosti 26 000 (26 kD) a rozpustná 17kD forma, kterou lze z buněčně vázaného proteinu získat specifickým proteolytickým štěpením. Rozpustná 17kD forma TNF-α je uvolňována buňkou a je spojována se zhoubnými účinky TNF-α. TNF-a je také schopen působit na místech vzdálených od místa jeho syntézy. Inhibice TÁCE tedy brání vytvoření rozpustného TNF-α a zabraňuje jeho zhoubným účinkům.

Zvolené sloučeniny podle vynálezu jsou účinnými inhibitory agrekanasy, enzymu, který hraje důležitou roli při degradaci chrupavkového agrekanu. Agrekanasy jsou rovněž považovány za ADAM. Úbytek agrekanu z matrice chrupavky je důležitým faktorem při progresi takových kloubních chorob, jako je osteoarthritis a rheumatoidní arthritis, a předpo• · · · • · • · · · · · · ··· • · · · · · · ·· • ······ ·· · · « kládá se, že agrekanasa při těchto chorobách zpomaluje nebo blokuje úbytek chrupavky.

Jako jiné ADAM, které vykázaly expresi při patologických stavech, je možno uvést ADAM TS-1 (Kuno et al., J. Biol. Chem., 272, 556 až 562, 1997) a ADAM 10, 12 a 15 (Wu et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 235, 437 až 442, 1997). Rostoucí poznatky o expresi, fyziologických substrátech a chorobách spojených s ADAM povedou k pochopení plného významu role inhibice této třídy enzymů.

Jako příklady chorob, při nichž lze dosáhnout terapeutického užitku inhibicí MMP a/nebo ADAM, je možno uvést choroby zvolené ze souboru sestávajícího z arthritis (jako osteoarthritis a rheumatoidní arthritis), zánětlivé choroby střev, Crohnovy choroby, emfyzému, syndromu akutního respiračního distresu, asthma, chronické obstruktivní choroby plic, Alzheimerovy choroby, toxicity transplantovaných orgánů, kachexie, alergických reakcí, alergické kontaktní přecitlivělosti, rakoviny, tkáňové ulcerace, restenosy, choroby parodontu, epidermolysis bulosa, osteoporosy, uvolňování umělých kloubních implantátů, atherosklerosy (jako je ruptura atherosklerotického plátu), aneurysma aorty (jako je aneurysma břišní aorty a aneurysma mozkové aorty), městnavého srdečního selhání, infarktu myokardu, mrtvice, mozkové ischemie, poranění hlavy, poranění míchy, neurodegenerativních chorob (akutních a chronických), autoimunitních chorob, Huntingtonovy choroby, Parkinsonovy choroby, migrény, deprese, periferní neuropathie, bolesti, mozkové amyloidní angiopathie, nootropické nebo kognitivní poruchy, amyotrofické laterální sklerosy, roztroušené sklerosy, okulární angiogenese, poranění rohovky, degenerace makuly, abnormálního hojení ran, popálenin, diabetes, invaze nádoru, růstu nádoru, metastáz nádoru, zjizvení rohovky, • · ····· · · * · · • · · · · · skleritis, AIDS, sepse, septického šoku a jiných chorob charakterizovaných expresí metaloproteinasy nebo ADAM.

Předmětem vynálezu jsou také způsoby použití sloučenin podle vynálezu při léčení výše uvedených chorob u savců, zejména lidí, a farmaceutické kompozice na bázi těchto sloučenin.

Bylo zjištěno, že při různých patologických stavech jsou exprimovány různé kombinace MMP a ADAM. V případě konkrétních chorob se tedy může dávat přednost inhibitorům se specifickou selektivitou pro jednotlivé typy ADAM a/nebo MMP. Například rheumatoidní arthritis je zánětlivou chorobou kloubů, která je charakteristická nadměrně zvýšenou hladinou TNF a úbytkem složek kloubní matrice. V tomto případě se při léčení může dávat přednost sloučenině, která inhibuje TÁCE a agrekanasu, jakož i MMP, jako MMP-13. Oproti tomu, u méně zánětlivých chorob, jako je osteoarthritis, se může dávat přednost sloučeninám, které inhibují MMP degradující matrici, jako MMP-13, ale neinhibují TÁCE.

Vynálezci také zjistili, že je možné zkonstruovat inhibitory s různou účinností na metalloproteinasy. Vynálezci například zkonstruovali molekuly, které přednostně selektivně inhibují matriční metalloproteinasu-13 (MMP-13) oproti MMP-1.

Inhibitory matričních metalloproteinas jsou z literatury dobře známy. PCT publikace WO96/33172, zveřejněná 24. října 1996, se týká cyklických arylsulfonylaminohydroxamových kyseliny, které jsou užitečné jako inhibitory MMP. US patent 5 672 615, PCT publikace W097/20824, PCT publikace WO98/08825, PCT publikace W098/27069 a PCT publikace WO98/34918, zveřejněná 13. srpna 1998, o názvu Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny, se týkají

cyklických hydroxamových kyselin, které jsou užitečné jako inhibitory MMP. PCT publikace W098/03516, zveřejněná 29. ledna 1998, se týká fosfinátů s MMP aktivitou. PCT publikace WO 98/34915, zveřejněná 13. srpna 1998, nazvaná jako Deriváty N-hydroxy-b-sulfonylpropionamidu, se týká propionylhydroxamidů, jako užitečných inhibitorů MMP. PCT publikace WO98/33768, zveřejněná 6. srpna 1998, nazvaná jako Deriváty arylsulfonylaminohydroxamové kyseliny se týká N-nesubstituovaných arylsulfonylaminohydroxamových kyselin. PCT publikace W098/30566, zveřejněná 16. července 1998, nazvaná jako Cyklické sulfonové deriváty se týká cyklických sulfonhydroxamových kyselin, jako inhibitorů MMP. US prozatímní patentová přihláška 60/55208, podaná 8. srpna 1997, se týká biarylhydroxamových kyselin, jako inhibitorů MMP. US prozatímní patentová přihláška č. 60/55207, podaná 8. srpna 1997, nazvaná jako deriváty aryloxyarylsulfonylaminohydroxamových kyselin se týká aryloxyarylsulfonylhydroxamových kyselin, jako inhibitorů MMP. US prozatímní patentová přihláška č. 60/62766, podaná 24. října 1997, nazvaná jako Použití selektivních inhibitorů MMP-13 pro léčení osteoarthritis a jiných poruch zprostředkovaných MMP, se týká použití selektivních inhibitorů MMP-13 pro léčení zánětu a jiných poruch. US prozatímní patentová přihláška č. 60/68261, podaná 19. prosince 1997, se týká použití inhibitorů MMP pro léčení angiogenese a jiných poruch. Všechny výše uvedené publikace a přihlášky jsou zde citovány náhradou za přenesení celého jejich obsahu do tohoto textu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou bicyklické deriváty hydroxamové kyseliny obecného vzorce I φ φ φφφφ φ φ φφφφ φ φ φ φφφφ φ φ φ φ φφφφφφ φφ • φ φ φφφ φφ φφ φφ ·

kde

ΗΟΗΝ

(I)

Z představuje skupinu >CH₂ nebo >NR¹;

R představuje vodík, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, heteroarylalkylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části nebo skupinu vzorce

O

OR² · kde n představuje celé číslo 1 až 6;

o _x

R představuje vodík nebo alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku;

Q představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, heteroarylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku, aryloxyalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, aryloxyarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí, aryloxyheteroarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové ·· ·# ·· 44 části, arylalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, arylarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí, arylheteroarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové části, arylarylalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, arylarylarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v každé arylových částí, arylarylheteroarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových části a se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové části, heteroarylalkylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, heteroarylarylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části, heteroarylheteroarylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v každé z heteroarylových částí, arylalkoxyalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alifatických částí, arylalkoxyarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí a 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části, arylalkoxyheteroarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové, 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové a 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové části, heteroaryloxyalkylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, heteroaryloxyarylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části, heteroaryloxyheteroarylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v každé z heteroarylových části, heteroarylalkoxyalkylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alifatických části, heteroarylalkoxyarylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové, 1 až • · 44 4 4 4444 « «

4 4 4 44 4 · ·

4 4 4 44 4 44

444444 44 «4 4 ♦♦ ·· 44 4 44 ·«« atomy uhlíku v alkoxylové a 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části nebo heteroarylalkoxyheteroarylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v každé z heteroarylových částí a 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části, aryloxyalkylarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, aryloxyalkylheteroarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové, 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové a 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové části, heteroaryloxyalkylarylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové, 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové a 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části nebo heteroaryloxyalkylheteroarylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v každé z heteroarylových částí a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části;

přičemž každá z arylových částí se 6 až 10 atomy uhlíku a heteroarylových částí se 2 až 9 atomy uhlíku uvedené alkylskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, arylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku, heteroarylskupiny se 2 až 9 atomy uhlíku, aryloxyalkylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, aryloxyarylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí, aryloxyheteroarylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové části, arylalkylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, arylarylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí, arylheteroarylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové části, arylarylalkylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, arylarylarylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku v každé arylových částí, arylarylheteroarylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových části a se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové části, heteroarylalkylskupiny se 2 až 9 * · « · · · · ·«· • ♦ · · · · · · · • · ··· · · · « · · · ·· «· ·· · ·· · atomy uhlíku v heteroarylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, heteroarylarylskupiny se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části, heteroarylheteroarylskupiny se 2 až 9 atomy uhlíku v každé z heteroarylových částí, arylalkoxyalkylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alifatických částí, arylalkoxyarylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí a 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části, arylalkoxyheteroarylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové, 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové a 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové části, heteroaryloxyalkylskupiny se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, heteroaryloxyarylskupiny se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části, heteroaryloxyheteroarylskupiny se 2 až 9 atomy uhlíku v každé z heteroarylových části, heteroarylalkoxyalkylskupiny se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alifatických části, heteroarylalkoxyarylskupiny se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové, 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové a 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části nebo heteroarylalkoxyheteroarylskupiny se 2 až 9 atomy uhlíku v každé z heteroarylových částí a 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části, aryloxyalkylarylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových části a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, aryloxyalkylheteroarylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové, 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové a 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové části, heteroaryloxyalkylarylskupiny se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové, 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové a 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části nebo heteroaryloxyalkylheteroarylskupiny se 2 až 9 atomy uhlíku v každé z heteroarylových částí a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části; je popřípadě substituována na kterémkoliv z kruhových atomů uhlíku schopném tvořit přídavnou vazbu jedním substituentem nebo větším počtem substituentů na kruh, které jsou nezávisle • · • Φ φ φ ΦΦΦΦ • φ φ

φ φ zvoleny ze souboru sestávajícího z fluoru, chloru, bromu, alkylskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, perfluoralkylskupiny s 1 až 3 atomy uhlíku, perfluoralkoxyskupiny s 1 až 3 atomy uhlíku a aryloxyskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku;

a jejich farmaceuticky vhodné soli.

Předmětem vynálezu jsou také farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinami, které tvoří sloučeniny obecného vzorce I. Pro přípravu farmaceuticky vhodných adičních solí výše uvedených bázických sloučenin podle vynálezu s kyselinami se používá kyselin, které tvoří netoxické adiční soli, tj. soli, jež obsahují farmakologicky vhodné anionty. Jako příklady takových solí je možno uvést hydrochloridy, hydrobromidy, hydrojodidy, nitráty, sulfáty, hydrogensulfáty, fosfáty, hydrogenfosfáty, acetáty, laktáty, citráty, hydrogencitráty, tartráty, hydrogentartráty, sukcináty, maleáty, fumaráty, glukonáty, sacharáty, benzoáty, methansulfonáty, ethansulfonáty, benzensulfonáty, p-toluensulfonáty a pamoáty (tj. 1,1'-methylenbis(2-hydroxy-3-naftoáty).

Předmětem vynálezu jsou také farmaceuticky vhodné adiční soli s bázemi, které tvoří sloučeniny obecného vzorce I. Pro přípravu farmaceuticky vhodných solí výše uvedených kyselých sloučenin obecného vzorce I podle vynálezu s bázemi se používá chemických bází, které tvoří netoxické soli, tj. soli, jež obsahují farmakologicky vhodné knionty. Jako příklady takových solí je možno uvést soli odvozené od farmakologicky vhodných kationtů, jako jsou kationty alkalických kovů (například draslíku nebo sodíku) a kovů alkalických zemin (například vápníku a hořčíku), amonné soli nebo vodorozpustné aminové adiční soli, jako jsou soli N-methylglukaminové (megluminové), trimethylamoniové nebo diethylamo11 ·· ·« ·» · · · • · · 1 * · ···

·· * niové a nižší alkanolamoniové soli, jako soli tris(hydroxymethyl)methylamonia a jiné soli farmaceuticky vhodných organických aminů.

Pod pojmem alkyl, jak se ho používá v tomto textu, se rozumí, pokud není uvedeno jinak, nasycené jednovazné uhlovodíkové zbytky s řetězcem přímým, rozvětveným nebo cyklickým nebo jejich kombinace.

Pod pojmem alkoxy, jak se ho používá v tomto textu, se rozumí skupiny vzorce O-alkyl, kde alkyl má shora uvedený význam.

Pod pojmem aryl, jak se ho používá v tomto textu, se rozumí, pokud není uvedeno jinak, organické zbytky odvozené od aromatických uhlovodíků odstraněním jednoho atomu vodíku. Jako příklady arylskupin je možno uvést fenylskupinu nebo naftylskupinu.

Pod pojmem heteroaryl, jak se ho používá v tomto textu, pokud není uvedeno jinak, se rozumí organické zbytky odvozené od aromatických heterocyklických sloučenin odstraněním jednoho atomu vodíku. Jako příklady heteroarylskupin je možno uvést pyridyl-, furyl-, pyroyl-, thienyl-, isothiazolyl-, imidazolyl-, benzimidazolyl-, tetrazolyl-, pyrazinyl-, pyrimidinyl-, chinolyl-, isochinolyl-, benzofuryl-, isobenzofuryl-, benzothienyl-, pyrazolyl-, indolyl-, isoindolyl-, purinyl-, karbazolyl-, isoxazolyl-, thiazolyl-, oxazolyl-, benzthiazolyl- nebo benzoxazolylskupinu. Z heteroarylskupin se dává přednost pyridyl-, furyl-, thienyl-, isothiazolyl-, pyrazinyl-, pyrimidinyl-, pyrazolyl-, isoxazolyl-, thiazolyl- nebo oxazolylskupině, přičemž největší přednost se dává pyridyl-, furyl- nebo thienylskupině.

Pod pojmem acyl, jak se ho používá v tomto textu, se rozumí, pokud není uvedeno jinak, zbytky obecného vzorce R-(C=O)-, kde R představuje alkylskupinu, alkoxyskupinu, arylskupinu, arylalkylskupinu nebo arylalkyloxyskupinu, přičemž alkyl a aryl má význam uvedený výše.

Pod pojmem acyloxy se rozumí O-acylskupina, přičemž acyl má výše uvedený význam.

Sloučeniny obecného vzorce I mohou obsahovat centra chirality, a mohou se tedy vyskytovat v různých diastereomerních nebo enantiomerních formách. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají všechny optické isomery, tautomery a stereoisomery sloučenin obecného vzorce I a jejich směsi.

Sloučeniny obecného vzorce I mají přednostně formu exo isomeru obecného vzorce I'

HOHN

SO₂Q

ď)

Přednost se dále dává sloučeninám obecného vzorce I, kde Q představuje arylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, heteroaryloxyarylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části nebo aryloxyarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí, přičemž každá z arylových nebo heteroarylových částí výše uvedené arylskupiny se 6 až 10 atomy uhlíku, heteroaryloxyarylskupiny se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části nebo aryloxyaryl- 13

44 • · 4 9 4 4

4*4 44 • 4 *44 44 4 • 4 4 4 4

44 44 • 4 4444

4

4 4 4·

4 4 4

4 4 4 4 • 4 4 4

44 444 skupiny se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí je popřípadě substituována jedním substituentem nebo více substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z fluoru, chloru, bromu, alkylskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku a perfluoralkylskupiny s 1 až 3 atomy uhlíku.

Větší přednost se dává sloučeninám obecného vzorce I, kde Q představuje fenylskupinu, pyridyloxyfenylskupinu (výhodněji 4-pyridyloxyfenylskupinu) nebo fenoxyfenylskupinu popřípadě substituovanou jedním substituentem nebo více substituenty nezávisle zvolenými ze souboru sestávajícího z fluoru, chloru, bromu, alkylskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku a perfluoralkylskupiny s 1 až 3 atomy uhlíku. Výhodněji jsou substituety zvoleny ze souboru sestávajícího z fluoru, chloru, alkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhíku a alkylskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, přičemž substituent je nejvýhodněji v poloze 4.

Jako konkrétní přednostní sloučeniny obecného vzorce I je možno uvést:

hydroxyamid 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylamino]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylmethyl]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-(4-fenoxybenzensulfonylmethyl)-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-(4'-fluorbifenyl-4-benzensulfonylmethyl)-8-oxabicyklo[3,2,l]oktan-3-karboxylové kyseliny; a • · · · · · • · hydroxyamid 3-exo-[4-(4-chlorfenoxy)benzensulfonylmethyl]-8-oxabicyklot3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny.

Jako příklady jiných sloučenin podle vynálezu obecného vzorce I je možno uvést:

hydroxyamid 3-exo-(4-fenoxybenzensulfonylamino)-8-oxabicyklo[3,2,l]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-[4-(pyridin-4-yloxy)benzensulfonylamino]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-[4-(4-chlorfenoxy)benzensulfonylamino]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

3-[[4-(4-chlorfenoxy)benzensulfonyl]-(3-endo-hydroxykarbamoyl-8-oxabicyklo[3,2,1]okt-3-yl)amino]propionovou kyselinu;

ethylester 3-[[4-(4-chlorfenoxy)benzensulfonyl]-(3-endo-hydroxykarbamoyl-8-oxabicyklo[3,2,1]okt-3-yl)amino Jpropionové kyseliny;

3-[[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfony1]-(3-endo-hydroxykarbamoyl-8-oxabicyklo[3,2,1]okt-3-yl)amino]propionovou kyselinu;

ethylester 3-[[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonyl]-(3-endo-hydroxykarbamoyl-8-oxabicyklo[3,2,l]okt-3-yl)amino]propionové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-{[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonyl]methylamino}-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-endo-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylamino]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

• · • ·

ΦΦΦΦ · · · ··· • φ · · φφ φ φφ φ φφφφφφ φφ φφ φ hydroxyamid 3-exo-{[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonyl]pyridin- 3 -ylmethy lamino }-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-[4-(4-fluorbenzyloxy)benzensulfonylamino]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-(4-benzyloxybenzensulfonylamino)-8-oxabicyklo [ 3 ,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-(4-benzyloxybenzensulfonylmethyl)-8-oxabicyklo [3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-{methyl-[4-(pyridin-4-yloxy)benzensulfonyl]amino}-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-(4-methoxybenzensulfonylamino)-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-(4-methoxybenzensulfonylmethyl)-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-5-pyridin-2-ylthiofen-2-sulfonylamino)-8-oxabicyklo[3,2,l]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-(4-fenoxybenzensulfonylamino)-8-oxabicyklo [ 3 ,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-[4-(pyridin-4-yloxy)benzensulfonylmethyl]-8-oxabicyklo[3,2,l]oktan-3-karboxylové kyseliny;

• · ·· ·· ··· ·· · hydroxyamid 3-exo-[4-(4-chlorfenoxy)benzensulfonylmethyl]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-[4-(4-chlorfenoxy)benzensulfonylamino] -8-oxabicyklo[3,2 ,l]oktan-3-karboxylové kyseliny;

3-[[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonyl]-(3-endo-hydroxykarbamoyl-8-oxabicyklo[3,2,1]okt-3-yl)amino]propionovou kyselinu;

3-[(3-endo-hydroxykarbamoyl-8-oxabicyklo[3,2,1]okt-3-yl) -(4-fenoxybenzensulfonyl)amino]propionovou kyselinu;

hydroxyamid 3-exo-{[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonyl]pyridin-3-ylmethylamino}-8-oxabicyklo[ 3,2,1 ]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-[(4-fenoxybenzensulfonyl)pyridin-3-ylmethylamino]-8-oxabicyklo[ 3,2, l]oktan-3-karboxylové kyseliny;

hydroxyamid 3-exo-{5-isoxazol-3-ylthiofen-2-sulfonylamino)-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny; a hydroxyamid 3-exo-(5-fenylthiofen-2-sulfonylamino)-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny.

Předmětem vynálezu je také farmaceutická kompozice pro léčení stavu zvoleného ze souboru sestávajícího z arthritis (jako osteoarthritis a rheumatoidní arthritis), zánětlivé choroby střev, Crohnovy choroby, emfyzému, chronické obstrukční choroby plic, Alzheimerovy choroby, • · • · ···· ·· · · · • ······ ·· ·· · toxicity transplantovaných orgánů, kachexie, alergických reakcí, alergické kontaktní přecitlivělosti, rakoviny (jako tuhých rakovinných nádorů, jako je rakovina tlustého střeva, rakovina prsu, rakovina plic a rakovina prostaty a hematopoetické malignancie, jako jsou leukémie a lymfomy), tkáňové ulcerace, restenosy, choroby parodontu, epidermolysis bulosa, osteoporosy, uvolňování umělých kloubních implantátů, atherosklerosy (jako je ruptura atherosklerotického plátu), aneurysma aorty (jako je aneurysma břišní aorty a aneurysma mozkové aorty), městnavého srdečního selhání, infarktu myokardu, mrtvice, mozkové ischemie, poranění hlavy, poranění míchy, neurodegenerativních chorob (akutních a chronických), autoimunitních chorob, Huntingtonovy choroby, Parkinsonovy choroby, migrény, deprese, periferní neuropathie, bolesti, mozkové amyloidní angiopathie, nootropické nebo kognitivní poruchy, amyotrofické laterální sklerosy, roztroušené sklerosy, okulární angiogenese, poranění rohovky, degenerace makuly, abnormálního hojení ran, popálenin, diabetes, invaze nádoru, růstu nádoru, metastáz nádoru, zjizvení rohovky, skleritis, AIDS, sepse, septického šoku a jiných chorob charakterizovaných aktivitou metaloproteinasy a jiných chorob charakterizovaných aktivitou savčího reprolysinu, u savce jako člověka, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje sloučeninu obecného vzorce I nebo její farmaceuticky vhodnou sůl v množství, které je účinné při léčení takového stavu, a farmaceuticky vhodný nosič.

Dále je předmětem vynálezu farmaceutická kompozice pro inhibici (a) matričních nebo jiných metalloproteinas, které se účastní degradace matrice nebo (b) savčího reprolysinu (jako je agrekanasa nebo ADAM TS-1, 10, 12, 15 a 17, nejvýhodněji ADAM-17) u savce, jako člověka, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje účinné množství sloučeniny obecného vzorce I nebo její farmaceuticky vhodné soli.

• ·

Předmětem vynálezu je dále způsob léčení stavu zvoleného ze souboru sestávajícího z arthritis (jako osteoarthritis a rheumatoidní arthritis), zánětlivé choroby střev, Crohnovy choroby, emfyzému, chronické obstrukční choroby plic, Alzheimerovy choroby, toxicity transplantovaných orgánů, kachexie, alergických reakcí, alergické kontaktní přecitlivělosti, rakoviny, tkáňové ulcerace, restenosy, choroby parodontu, epidermolysis bulosa, osteoporosy, uvolňování umělých kloubních implantátů, atherosklerosy (jako je ruptura atherosklerotického plátu), aneurysma aorty (jako je aneurysma břišní aorty a aneurysma mozkové aorty), městnavého srdečního selhání, infarktu myokardu, mrtvice, mozkové ischemie, poranění hlavy, poranění míchy, neurodegenerativních chorob (akutních a chronických), autoimunitních chorob, Huntingtonovy choroby, Parkinsonovy choroby, migrény, deprese, periferní neuropathie, bolesti, mozkové amyloidní angiopathie, nootropické nebo kognitivní poruchy, amyotrofické laterální sklerosy, roztroušené sklerosy, okulární angiogenese, poranění rohovky, degenerace makuly, abnormálního hojení ran, popálenin, diabetes, invaze nádoru, růstu nádoru, metastáz nádoru, zjizvení rohovky, skleritis, AIDS, sepse, septického šoku a jiných chorob charakterizovaných aktivitou metaloproteinasy a jiných chorob charakterizovaných aktivitou savčího reprolysinu, u savce jako člověka, jehož podstata spočívá v tom, že se takovému savci podává sloučenina obecného vzorce I nebo její farmaceuticky vhodná sůl v množství, které je účinné při léčení takového stavu.

Dále se vynález týká způsobu inhibice (a) matričních nebo jiných metalloproteinas, které se účastní degradace matrice nebo (b) savčího reprolysinu (jako je agrekanasa nebo ADAM TS-1, 10, 12, 15 a 17, přednostně ADAM-17) u savce, jako člověka, jehož podstata spočívá • · v tom, že se takovému savci podává účinné množství sloučeniny obecného vzorce I nebo její farmaceuticky vhodné soli.

Do rozsahu vynálezu také spadají farmaceutické kompozice, které obsahují proléčiva sloučenin obecného vzorce I. Předmětem vynálezu rovněž jsou způsoby léčení nebo prevence chorob, které lze léčit nebo jimž lze předcházet inhibicí matričních metalloproteinas nebo inhibicí savčího reprolysinu, který zahrnuje podávání proléčiv sloučenin obecného vzorce I. Sloučeniny obecného vzorce I, které obsahují volnou aminoskupinu, amidoskupinu, hydroxyskupinu nebo karboxyskupinu, je možno převést na proléčiva. Jako proléčiva je možno uvést sloučeniny, v nichž k volné aminoskupině, hydroxyskupině nebo karboxyskupině sloučeniny obecného vzorce I je kovalentně, prostřednictvím peptidové vazby připojen zbytek aminokyseliny nebo polypeptidový řetězec dvou nebo více (například dvou, tří nebo čtyř) aminokyselinových zbytků. Aminokyselinové zbytky zahrnují 20 v přírodě se vyskytujících aminokyselin, které se standardně označují třípísmenným kódem. Jako příklady takových aminokyselin lze uvést 4-hydroxyprolin, hydroxylysin, demosin, isodemosin, 3-methylhistidin, norvalin, beta-alanin, gamma-aminomáselnou kyselinu, citrulin, homocystein, homoserin, ornithin a methionin sulfon. Do rozsahu proléčiv také spadají sloučeniny, v nichž k výše uvedeným substituentům sloučeniny obecného vzorce I jsou prostřednictvím karbonylového uhlíku postranního řetězce proléčiva připojeny karbonátové, karbamátové, amidové a alkylesterové skupiny.

Odborníkům v tomto oboru bude zřejmé, že sloučeniny podle vynálezu jsou užitečné při léčení řady různých chorob a že při léčení konkrétních chorob lze sloučeniny podle vynálezu kombinovat s různými již existujícími terapeutickými činidly, které jsou užitečné při jejich léčení.

·· ·· ·· ···· »4 • · · · · · · ··· • 4 4 · ·· · 4 4 • 444444 4 · · 4 4 • 4 · · ·· 4 44 444

Při léčení rheumatoidní arthritis je sloučeniny podle vynálezu možno kombinovat s takovými činidly, jako jsou inhibitory TNF-α, jako anti-TNF monoklonálními protilátkami a molekulami imunoglobulinu receptoru TNF (jako je Enbrel(^R)), nízkou dávkou metotrexatu, lefunimidu, hydroxychlorochinu, d-penicilaminu, auranofinu nebo parenterálním nebo perorálním zlatém.

Sloučenin podle vynálezu lze také použít v kombinaci s existujícími terapeutickými činidly pro léčení osteoarthritis. Jako činidla vhodná pro tuto kombinaci je možno uvést standardní nesteroidní protizánětlivá činidla (NSAID), jako piroxikam, diklofenak, propionové kyseliny, jako naproxen, flubiprofen, fenoprofen, ketoprofen a ibuprofen, fenamáty, jako mefenamovou kyselinu, indomethacin, sulindak, apazon, pyrazolony, jako fenylbutazon, salicyláty, jako aspirin, inhibitory COX-2, jako celekoxib a rofekoxib, analgetika a intraartikulární terapie, jako kortikosteroidy a hyaluronové kyseliny, jako hyalgan a sinvisc.

Sloučenin podle vynálezu je dále možno používat v kombinaci s protirakovinnými činidly, jako je endostatin a angiostatin, nebo cytotoxickými léčivy, jako je adriamycin, daunomycin, cis-platina, etoposid, taxol, taxoter a alkaloidy, jako je vinkristin, a antimetabolity, jako je metotrexat.

Sloučenin podle vynálezu lze rovněž použít v kombinaci s kardiovaskulárními činidly, jako jsou blokátory vápníkového kanálu, činidla snižující lipidy, jako statiny, fibráty, beta-blokátory, inhibitory Ace, antagonisté receptoru angiotensinu-2 a inhibitory agregace krevních destiček.

Sloučeniny podle vynálezu je také možno kombinovat s CNS činidly, jako jsou antidepresiva (jako sertralin), antiparkinsonika (jako deprenyl, L-dopa, requip, miratex, inhibitory MAOB, jako selegin a rasagilin, inhibitory comP, jako je Tasmar, inhibitory A-2, inhibitory zpětného vychytávání dopaminu, antagonisty NMDA, agonisty nikotinu, agonisty dopaminu a inhibitory neuronální oxid dusný synthasy) a antialzheimerovskými léčivy, jako jsou Aricept, takrin, inhibitory COX-2, propentofylin nebo metryfonat.

V úvahu také přicházejí kombinace sloučenin podle vynálezu s činidly proti osteoporose, jako je droloxifen nebo fosomax a imunosupresivy, jako je FK-506 a rapamycin.

Následuje podrobnější popis vynálezu.

Následující reakční schémata ilustrují přípravu sloučenin podle vynálezu. Pokud není uvedeno jinak, n, R¹, R², Q a Z mají v těchto schématech a navazující diskusi výše uvedený význam.

·· 44 44 4444 ·· · ••44 44 4 44 44 *444 44 4 44 4

444444 44 44 4 4

4· 4 444 444

44 4 4 4 · 4 444

IV • φ φφ ΦΦΦΦ φφ φ • φφφ φφ φ φ φ φφ — 23 — · · ··· φφφφ φφφ φ «φφφφφ φφφ φ· ·· φφφ φφφφφ

Schéma 1 - pokračování

- 24 •4 4444 ·· 44 44 444 4 44 • 4 4 4 4 4 4 444 ♦ 4 4 4 44 4 44

444444 44 44 4 •4 4444 44

44 44 4 44 4

Schéma 2

IX pg²o

XIV

XII

Schéma

44 • 4 4 · · ·

- pokračování

♦ 4 4444 • 4 · · » 4 • 4 »

4 44

4 4 4

4 4

44 ·

- 26 4* ····

4* ···· 44 ř 4 4 4 « · « 4 « • 444444 ·· «· 4

4 4 4 44 4 44 4

Schéma 3

N—SO₂Q

SO₂Q

XII

XVII

XVI

XV

I * * ·« «« » ·

XVIII

HO

I ·· ·« «··* ·· • t · · » * · · · — 28 — · · ··· · · · » · > « • · *»·«»· ·· ♦ · ·· ·· · ··

Schéma 1 se týká přípravy sloučenin obecného vzorce I, kde Z představuje skupinu CH₂. Při postupu podle tohoto schématu se sloučenina obecného vzorce I připraví ze sloučeniny obecného vzorce II hydrogenolýzou pod atmosférou vodíku za přítomnosti katalyzátoru v rozpouštědle inertním vůči reakci. Jako vhodné katalyzátory je možno uvést 5% palladium na síranu barnatém nebo 5% palladium na uhlíku, přednostně 5% palladium na síranu barnatém. Vhodnými rozpouštědly jsou například alkoholy, jako ethanol, methanol nebo isopropylalkohol, přednostně methanol. Výše popsanou reakci je možno provádět za tlaku asi 0,1 až asi 0,5 MPa, přednostně za tlaku 0,3 MPa. Vhodná reakční teplota leží v rozmezí od asi 20°C (teploty místnosti) do asi 60°C, přednostně od asi 20 do asi 25°C (tj. teplota místnosti). Reakce je dokončena v průběhu asi 0,5 hodiny až asi 5 hodin, přednostně během asi 3 hodin.

Sloučeniny obecného vzorce II je možno připravovat ze sloučenin obecného vzorce III reakcí s oxidačním činidlem v rozpouštědle inertním vůči reakci. Jako vhodná oxidační činidla je možno uvést metachlorperbenzoovou kyselinu, peroxid vodíku nebo peroxoboritan sodný, přednostně metachlorperbenzoovou kyselinu. Vhodnými rozpouštědly jsou například halogenovaná rozpouštědla, jako methylenchlorid nebo chloroform, přednostně methylenchlorid. Vhodná reakční teplota leží v rozmezí od asi 0°C do asi 60°C, přednostně od asi 20 do asi 25°C (tj. teplota místnosti). Reakce je dokončena v průběhu asi 0,5 hodiny až asi 24 hodin, přednostně během asi 16 hodin.

Sloučenina obecného vzorce III se připravují ze sloučeniny obecného vzorce IV reakcí s hydrochloridem 0-benzylhydroxyaminu, aktivačním činidlem a bází v rozpouštědle inertním vůči reakci. Jako vhodná aktivační činidla je možno uvést (benzotriazol-l-yloxy)tris(dimethylamino)fosfonium• ·

ΦΦΦ φ · · ··· • · · · · · φφ φ φφφ φ φ · φ · · · • φ φ · · · · φφ φφ φφ · φφ · hexafluorfosfát nebo hydrochlorid l-(3-(dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu, přednostně (benzotriazol-l-yloxy)tris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát. Vhodnými bázemi jsou například terciární aminy, jako triethylamin, diisopropylethylamin nebo 4-N,N-dimethylaminopyridin, přednostně diisopropylethylamin. Reakce se provádí při teplotě v rozmezí od asi 0 do asi 60°C, přednostně při asi 50°C. Vhodnými rozpouštědly jsou například N,N-dimethylformamid, halogenovaná rozpouštědla, jako methylenchlorid a chloroform, nebo ethery, jako tetrahydrofuran nebo diethylether, přičemž přednost se dává Ν,Ν-dimethylformamidu. Reakce je dokončena v průběhu asi 4 až asi 48 hodin, přednostně během 16 hodin.

Sloučeniny obecného vzorce IV je možno připravovat ze sloučenin obecného vzorce V reakcí se sloučeninou obecného vzorce QSH, kde Q má výše uvedený význam, za přítomnosti silné báze v aprotickém polárním rozpouštědle. Jako vhodé báze je možno uvést hydrid sodný, diisopropylamid lithný, terc.butoxid draselný, amid sodný nebo hydrid sodný, přednostně hydrid sodný. Vhodnými rozpouštědly jsou ethery (jako tetrahydrofuran, diethylether nebo 1,2-dimethoxyethan) nebo Ν,Ν-dimethylformamid, přičemž přednost se dává tetrahydrofuranu. Výše uvedená reakce se provádí při teplotě od asi -78 do asi 0°C, přednostně při asi 22°C (tj. teplotě místnosti) po dobu 30 minut až asi 24 hodin, přednostně 2 hodin.

Sloučeniny obecného vzorce V je možno připravovat ze sloučenin obecného vzorce VI dehydratací za přítomnosti terciární aminové báze, přednostně triethylaminu, popřípadě za přítomnosti 4-dimethylaminopyridinu, a dehydratačního činidla v inertním rozpouštědle. Jako vhodná dehydratační činidla je možno uvést anhydrid trifluormethansulfonové kyseliny, anhydrid methansulfonové kyseliny, methansulfonyl30

chlorid, p-toluensulfonylchlorid nebo benzensulfonylchlorid, přednostně benzensulfonylchlorid. Vhodnými rozpouštědly jsou například diethylether nebo dichlormethan. Reakce se provádí při teplotě od asi -80 do asi 0°C, přednostně při asi 0C, po dobu asi 10 minut až asi 4 hodin, přednostně asi 1 hodiny.

Sloučeniny obecného vzorce VI se připravují ze sloučenin obecného vzorce VII, kde PG¹ představuje methylskupinu nebo ethylskupinu, zmýdelněním bází, jako hydroxidem lithným, v rozpouštědlové směsi. Rozpouštědlová směs obsahuje vodu a methanol nebo vodu, methanol a tetrahydrofuran. Reakce se provádí při teplotě od asi 60 do asi 120°C, přednostně při teplotě zpětného toku použité rozpouštědlové směsi, po dobu asi 30 minut až asi 24 hodin, přednostně po dobu 16 hodin.

Exo-hydroxymethylový isomer sloučeniny obecného vzorce VII se připraví ze sloučeniny obecného vzorce VIII, obvykle tak, že se roztok sloučeniny obecného vzorce VIII v inertním aromatickém rozpouštědle, přednostně benzenu nebo toluenu, ochladí na asi -40 až -20°C, přednostně -40°C a přidá k němu vhodné bráněné redukční činidlo, přednostně diisobutylaluminiumhydrid, v inertním aromatickém rozpouštědle, přičemž se teplota udržuje pod -25°C. Po dokončení přídavku se teplota reakční směsi asi 3 hodiny udržuje pod 0“C a při asi -15°C se k ní přidá protické rozpouštědlo, přednostně ethanol. Výsledná směs se při asi -15°C asi 1 hodinu míchá, načež se k ní přidá tetrahydroboritan sodný. Reakční směs se během 2 až 24 hodin, přednostně asi 16 hodin, za míchání nechá zahřát na teplotu místnosti.

Endo-hydroxymethylový isomer sloučeniny obecného vzorce VII je možno připravit z exo-hydroxymethylové sloučeniny obecného vzorce VI řadou stupňů, které umožňují • · • · · · «·

převést stereochemii atomu uhlíku nesoucího hydroxymethylskupinu a karboxyskupinu. Exo-hydroxymethylový isomer sloučeniny obecného vzorce VI se nejprve převede na odpovídající benzylester. Následnou Jonesovou oxidací alkoholu na karboxylovou kyselinu a vytvořením alkylesteru (methylnebo ethylesteru) se získá intermediární směsný benzylalkylester (tj. exo-ester je methyl- nebo ethylester a endo-ester je benzylester). Skupina benzylesteru se poté odstraní hydrogenolýzou a výsledná karboxylová kyselina se redukuje na alkohol redukcí diboranem, čímž se získá endo-hydroxymethylový isomer sloučeniny obecného vzorce VII.

Sloučeniny obecného vzorce VIII, kde PG¹ představuje ethylskupinu nebo methylskupinu, se připravují ze sloučenin obecného vzorce IX, kde L představuje methansulfonylskupinu, benzensulfonylskupinu nebo p-toluensulfonylskupinu, reakcí s dimethyl- nebo diethylmalonátem za přítomnosti silné báze, jako hydridu sodného, v polárním rozpouštědle, jako Ν,Ν-dimethylformamidu, po dobu asi 4 až asi 24 hodin, přednostně asi 16 hodin. Výše uvedená reakce se provádí při teplotě od asi 70 do asi 150°C, přednostně při asi 140°C.

Sloučeniny obecného vzorce IX jsou známé nebo je možno je připravit způsoby dobře známými odborníkům v tomto oboru.

Sloučeniny obecného vzorce QSH je možno připravovat reakcí alkyl- nebo arylhalogenidu s hydrogensulfidem sodným způsobem popsaným v Jerry March, Advanced Organic Chemistry, 360 a 589 (3. vydání, 1985). Alternativně je sloučeniny obecného vzorce QSH také možno připravovat reakcí aryldiazoniové soli s hydrogensulfidem sodným způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci March, str. 601. Alternativně je sloučeniny obecného vzorce QSH také možno připravit reakcí Grignardova činidla se sírou způsobem popsaným ve výše • · • ·

uvedené publikaci March, str. 550. Sloučeniny obecného vzorce QSH lze také připravit redukcí sulfonylchloridu, sulfonové kyseliny nebo disulfidu způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci March, str. 1107 a 1110.

Schéma 2 se týká výroby sloučenin obecného vzorce I, kde Z představuje skupinu >NR¹ a R¹ představuje vodík. Při postupu podle tohoto schématu je sloučeninu obecného vzorce I možno připravit ze sloučeniny obecného vzorce X hydrogenolýzou pod atmosférou vodíku za přítomnosti katalyzátoru v rozpouštědle inertním vůči reakci. Jako vhodné katalyzátory je možno uvést 5% palladium na síranu barnatém nebo 5% palladium na uhlíku, přednostně 5% palladium na síranu barnatém. Vhodnými rozpouštědly jsou například alkoholy, jako ethanol, methanol nebo isopropylalkohol, přednostně methanol. Výše uvedenou reakci je možno provádět za tlaku 0,1 až 0,5 MPa, přednostně asi 0,3 MPa. Vhodná teplota pro výše uvedenou reakcí leží v rozmezí od asi 20°C (teploty místnosti) do asi 60°C, přednostně od asi 20°C do asi 25°C (tj. teplota místnosti). Reakce je dokončena během asi 0,5 hodiny až asi 5 hodin, přednostně asi 3 hodin.

Sloučenina obecného vzorce X se připraví ze sloučeniny obecného vzorce XI reakcí s hydrochloridem O-benzylhydroxylaminu za přítomnosti katalyzátoru a báze v rozpouštědle inertním vůči reakci. Jako vhodné katalyzátory je možno uvést (benzotriazol-l-yloxy) tris (dimethylamino) fosfoniumhexaf luorfosfát nebo hydrochlorid l-(3-(dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu, přednostně (benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát. Vhodnými bázemi jsou například terciární aminy, jako triethylamin, diisopropylethylamin nebo 4-N,N-dimethylaminopyridin, přednostně diisopropylethylamin. Reakce se provádí při teplotě v rozmezí od asi 0 do asi 60°C, přednostně při asi 50°C. Vhodnými rozpouštědly jsou například N,N-dimethyl«· · · ·· ···· · · • · · · · · · · · · ···· · 9 9 9 9 • ······ ·· « « « • · «· · · · formamid nebo halogenovaná rozpouštědla, jako methylenchlorid a chloroform, přičemž přednost se dává Ν,Ν-dimethylformamidu. Reakce je dokončena v průběhu asi 4 až asi 48 hodin, přednostně během 16 hodin.

Sloučeniny obecného vzorce XI se připravují ze sloučenin obecného vzorce XII, kde PG² představuje methylskupinu nebo ethylskupinu, zmýdelněním bází, jako hydroxidem sodným, v rozpouštědlové směsi, jako směsi vody a ethanolu. Reakce se provádí při teplotě od asi 60 do asi 100°C, přednostně přibližně při teplotě zpětného toku použité rozpouštědlové směsi, po dobu asi 1 dne až 10 dní, přednostně asi 6 dní.

Sloučeniny obecného vzorce XII, kde PG² představuje methylskupinu nebo ethylskupinu, se připravují ze sloučenin obecného vzorce XIII, kde PG představuje methylskupinu nebo ethylskupinu, reakcí se sloučeninou obecného vzorce QSO₂C1 za přítomnosti báze, jako triethylaminu, a polárního rozpouštědla. Jako vhodná rozpouštědla je možno uvést N,N-dimethylformamid, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethan, dioxan, vodu nebo acetonitril, přednostně Ν,Ν-dimethylformamid. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti po dobu asi 1 hodiny až asi 24 hodin, přednostně po dobu asi 16 hodin.

Sloučeniny obecného vzorce XIII, kde PG² představuje methylskupinu nebo ethylskupinu se připravují ze sloučenin obecného vzorce XIV, kde PG² představuje methylskupinu nebo ethylskupinu, hydrolýzou za přítomnosti vodné minerální kyseliny a rozpouštědla, jako diethyletheru. Jako vhodné minerální kyseliny je možno uvést kyselinu chlorovodíkovou a kyselinu sírovou, přednostně kyselinu chlorovodíkovou. Reakce se přovádí při teplotě v rozmezí od asi 0 do asi 50°C, přednostně od asi 20 do asi 25°C (tj. při teplotě • · • · · · ·· · · ♦ · · · · • · · · · · • · ····· · • · · · · • · · · · · místnosti) po dobu asi 2 až asi 48 hodin, přednostně asi 16 hodin.

Sloučeniny obecného vzorce XIV, kde PG² představuje methylskupinu, ethylskupinu nebo benzylskupinu se připravují ze sloučenin obecného vzorce IX, kde L představuje methansulfonylskupinu, benzensulfonylskupinu nebo p-toluensulfonylskupinu, reakcí s methyl-, ethyl- nebo benzylesterem N-difenylmethylenglycinu za přítomnosti silné báze, jako hydridu sodného, v polárním rozpouštědle, jako N,N-dimethylformamidu, po dobu asi 4 až asi 24 hodin, přednostně asi 16 hodin. Výše uvedená reakce se provádí při asi 70 až asi 140°C, přednostně při asi 100°C. Sloučeniny obecného vzorce o

XIV, kde PG představuje methylskupinu, ethylskupinu nebo benzylskupinu, se získají ve formě směsi diastereomerů, kterou je možno rozdělit za použití chromatografických postupů.

Sloučeniny obecného vzorce QSO₂C1 a sloučeniny obecného vzroce IX jsou známé nebo dostupné na trhu nebo je lze připravit způsoby dobře známými odborníkům v tomto oboru.

Schéma 3 se týká výroby sloučenin obecného vzorce I, kde Z představuje skupinu NR¹ a R¹ představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, heteroarylalkylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části nebo skupinu vzorce -(CH₂)_nCO₂R², kde n představuje číslo 1, 3, 4, 5 nebo 6 a R² představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku.

Při postupu podle schématu 3 se sloučeniny obecného vzorce I, kde Z představuje skupinu NR¹ a R¹ předsta« · • · · · vuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v ary lové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, heteroarylalkylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části nebo skupinu vzorce -(CH₂)_nCO₂R², kde n představuje číslo 1, 3, 4, 5 nebo 6 a R² představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, připravují ze sloučenin obecného vzorce XV hydrogenolýzou pod atmosférou vodíku za přítomnosti katalyzátoru v rozpouštědle inertním vůči reakci. Jako vhodné katalyzátory je možno uvést 5% palladium na síranu barnatém nebo 5% palladium na uhlíku, přednostně 5% palladium na síranu barnatém. Vhodnými rozpouštědly jsou například alkoholy, jako ethanol, methanol nebo isopropylalkohol, přednostně methanol. Výše popsanou reakci je možno provádět za tlaku asi 0,1 až asi 0,5 MPa, přednostně za tlaku 0,3 MPa. Vhodná reakční teplota leží v rozmezí od asi 20°C (teploty místnosti) do asi 60°C, přednostně od asi 20 do asi 25°C (tj. teplota místnosti). Reakce je dokončena v průběhu asi 0,5 hodiny až asi 5 hodin, přednostně během asi 3 hodin.

Sloučenina obecného vzorce XV se připraví ze sloučeniny obecného vzorce XVI reakcí s hydrochloridem O-benzylhydroxylaminu za přítomnosti katalyzátoru a báze v rozpouštědle inertním vůči reakci. Jako vhodné katalyzátory je možno uvést (benzotriazol-l-yloxy)tris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát nebo hydrochlorid l-(3-(dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu, přednostně (benzotriazol-l-yloxy)tris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát. Vhodnými bázemi jsou například terciární aminy, jako triethylamin, diisopropylethylamin nebo 4-N,N-dimethylaminopyridin, přednostně diisopropylethylamin. Reakce se provádí při teplotě v rozmezí od asi 0 do asi 60°C, přednostně při asi 50°C. Vhodnými rozpouštědly jsou například N,N-dimethylformamid, halogenovaná rozpouštědla, jako methylenchlorid nebo chloroform, přičemž přednost se dává N,N-dimethylformamidu.

• · • ·

Reakce je dokončena v průběhu asi 4 až asi 48 hodin, přednostně během 16 hodin.

Sloučenina obecného vzorce XVI se připraví ze sloučeniny obecného vzorce XVII odstraněním benzylové chránící skupiny. Konkrétně se benzylová chrániči skupina odstraňuje hydrogenolýzou za použití palladia nebo palladia na hlíku v rozpouštědle, jako methanolu nebo ethanolu, po dobu asi 30 minut až asi 48 hodin, přednostně 16 hodin, při teplotě asi 20 až asi 25°C (tj. teplotě místnosti).

Sloučenina obecného vzorce XVII se připraví ze sloučeniny obecného vzorce XII, kde PG² představuje benzylskupinu, reakcí s reaktivním derivátem alkoholu obecného vzorce R^XOH, jako methansulfonatovým, p-toluensulfonátovým, chlorovým, bromovým nebo jodovým derivátem, přednostně jodovým derivátem, za přítomnosti báze, jako uhličitanu draselného nebo hydridu sodného, přednostně hydridu sodného, a polárního rozpouštědla, jako Ν,Ν-dimethylformamidu. Reakční směs se míchá asi 60 minut až asi 48 hodin, přednostně asi 16 hodin, při teplotě místnosti.

Sloučeniny obecného vzorce XII, kde PG² představuje benzylskupinu, se připraví způsobem popsaným v souvislosti se schématem 2.

Schéma 4 se týká přípravy sloučenin obecného vzorce I, kde Z představuje skupinu >NR¹, kde R¹ představuje skupinu -(CH₂)₂CO₂R² (tj. n = 2) a R² představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku.

Při postupu podle schématu 4 se taková sloučenina obecného vzorce I připraví ze sloučeniny obecného vzorce XVIII, kde R² představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, reakcí s oxalylchloridem nebo thionylchloridem, před* * · · · · • * · » ·· 9 · · • ······ » « « · · ·· ·· · » · 9 9 · nostně oxalylchloridem, a katalyzátorem, přednostně asi 2 % Ν,Ν-dimethylformamidu, v inertním rozpouštědle, jako methylenchloridu, za vzniku chloridu kyseliny in šitu, který se nechá následně reagovat s O-trimethylsilylhydroxylaminem za přítomnosti báze, jako pyridinu, 4-N,N-dimethylaminopyridinu nebo triethylaminu, přednostně pyridinu. Reakce se provádí při teplotě asi 22°C (tj. teplotě místnosti) po dobu asi 1 hodiny až asi 12 hodin, přednostně asi 1 hodiny.

Sloučeniny obecného vzorce XVIII, kde R² představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, je možno připravovat ze sloučenin obecného vzorce XIX, kde R² představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, redukcí v polárním rozpouštědle. Jako vhodná redukční činidla je možno uvést vodík za přítomnosti palladia a vodík za přítomnosti palladia na uhlíku, přednostně vodík za přítomnosti palladia na uhlíku. Vhodnými rozpouštědly jsou například methanol, ethanol a isopropylalkohol, přednostně ethanol. Výše uvedená reakce se provádí při teplotě asi 22°C (tj. při teplotě místnosti) po dobu 1 dne až 7 dnů, přednostně asi 2 dnů.

Sloučeniny obecného vzorce XIX, kde R² představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, je možno připravit ze sloučenin obecného vzorce XII, kde PG² představuje benzylskupinu, Michaelovou adicí propiolátového esteru a báze v polárním rozpouštědle. Vhodnými propioláty jsou sloučeniny obecného vzorce H-C=C-CO₂R², kde R² představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku. Jako vhodné báze lze uvést tetrabutylamoniumfluorid, uhličitan draselný a uhličitan česný, přednostně tetrabutylamoniumfluorid. Vhodnými rozpouštědly jsou například tetrahydrofuran, acetonitril, terč.butanol a Ν,Ν-dimethylformamid, přednostně tetrahydrofuran. Výše uvedená reakce se provádí při teplotě od asi -10 do asi 60°C, přednostně od 0°C do asi 22°C (tj. teploty místnosti). Sloučenina obecného vzorce XIX se získá ve formě směsi • · · ·

- 38 • 4· · geometrických isomerů okolo olefinické dvojné vazby; oddělování těchto isomerů není nutné.

Sloučeniny obecného vzorce XII, kde PG² představuje benzylskupinu, je možno připravovat způsobem znázorněným ve schématu 2.

Sloučeniny obecného vzorce I, kde Z představuje skupinu >NR¹, kde R¹ představuje skupinu vzorce -(CH₂)_nCO₂R², „ o kde n představuje číslo 1 až 6 a R představuje vodík, je možno připravovat ze sloučenin obecného vzorce I, kde Z představuje skupinu >NR¹, kde R¹ představuje skupinu vzorce -(CH₂)_nCO₂R², kde n představuje číslo 1 až 6 a R² představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, zmýdelněním za použití báze, jako hydroxidu sodného v protickém rozpouštědle, jako ethanolu, methanolu nebo vodě nebo rozpouštědlové směsi, jako je směs vody a ethanolu, vody a toluenu nebo vody a tetrahydrofuranu. Přednostním rozpouštědlovým systémem je voda a ethanol. Reakce se provádí po dobu 30 minut až 24 hodin, přednostně asi 2 hodin.

Sloučeniny obecného vzorce I, které mají bázickou povahu, jsou schopné tvořit různé soli s různými anorganickými a organickými kyselinami. Přestože takové soli musí být pro podávání savcům farmaceuticky vhodné, v praxi je často žádoucí sloučeninu obecného vzorce I z reakční směsi izolovat nejprve ve formě farmaceuticky nevhodné soli, která se poté reakcí s alkalickým činidlem snadno převede zpět na volnou bázi. Volná báze se následně převede na farmaceuticky vhodnou adiční sůl s kyselinou. Adiční soli bázických sloučenin podle vynálezu s kyselinami je možno snadno připravovat tak, že se bázická sloučenina nechá reagovat s v podstatě ekvivalentním množstvím zvolené minerální nebo organické kyseliny ve vodném rozpouštědlovém médiu nebo vhodném orga• 9 • ♦ « * ♦ 9 9 ·

9 9 f

9 9 9 9 «9 99

9 nickém rozpouštědle, jako methanolu nebo ethanolu. Po opatrném odpaření rozpouštědla se získá požadovaná pevná sůl.

Pro přípravu farmaceuticky vhodných adičních solí výše uvedených bázických sloučenin podle vynálezu s kyselinami se používá kyselin, které tvoří netoxické adiční soli, tj. soli, jež obsahují farmakologicky vhodné anionty. Jako příklady takových solí je možno uvést hydrochloridy, hydrobromidy, hydrojodidy, nitráty, sulfáty, hydrogensulfáty, fosfáty, hydrogenfosfáty, acetáty, laktáty, citráty, hydrogencitráty, tartráty, hydrogentartráty, sukcináty, maleáty, fumaráty, glukonáty, sacharáty, benzoáty, methansulfonáty, ethansulfonáty, benzensulfonáty, p-toluensulfonáty a pamoáty (tj. 1,1'-methylenbis(2-hydroxy-3-naftoáty).

Sloučeniny obecného vzorce I, které mají kyselou povahu, jsou schopné tvořit soli s bázemi obsahujícími různé farmaceuticky vhodné kationty. Jako příklady solí s bázemi je možno uvést soli alkalických kovů a kovů alkalických zemin, zejména soli sodné a soli draselné. Všechny tyto soli se připravují obvyklými postupy. Chemické báze, kterých se používá jako činidel při přípravě farmaceuticky vhodných solí sloučenin podle vynálezu jsou báze, s nimiž kyselé sloučeniny obecného vzorce I tvoří netoxické soli. Jako příklady netoxických solí s bázemi je možno uvést soli s farmakologicky vhodnými kationty, jako kationty sodíku, draslíku, vápníku a hořčíku. Soli kyselých sloučenin podle vynálezu s bázemi je možno snadno připravovat tak, že se kyselá sloučenina nechá reagovat s vodným roztokem obsahujícím požadované farmakologicky vhodné kationty, načež se vzniklý roztok odpaří do sucha, přednostně za sníženého tlaku. Alternativně je takové soli také možno připravovat tak, že se smísí roztok kyselé sloučeniny v nižším alkanolu s roztokem požadovaného alkoxidu alkalického kovu a výsledný roztok se výše popsaným způsobem odpaří do sucha. V obou ♦ » » · • · · · · 9 * · « * * · ♦ * r · » · · · » # ·> · «· «· · případech se reakčních činidel přednostně používá ve stechiometrických množstvích, aby se zajistila úplnost reakce a maximalizace výtěžků požadovaného konečného produktu.

Schopnost sloučenin obecného vzorce I nebo jejich farmaceuticky vhodných solí (tyto látky jsou v tomto popisu souhrnně označovány názvem sloučeniny podle vynálezu) inhibovat metalloproteinasy nebo savčí reprolysin, a tedy účinnost sloučenin podle vynálezu při léčení chorob, které jsou charakteristické uplatňováním metalloproteinasy nebo produkcí faktoru nekrosy nádorů, je demonstrována v následujících in vitro zkušebních postupech.

Biologické zkoušky

Inhibice humánní kolagenasy (MMP-1)

Humánní rekombinantní kolagenasa se aktivuje trypsinem. Množství trypsinu se pro každou várku kolagenasy I optimalizuje, ale při typické reakci se používá poměru 5 μg trypsinu na 100 μg kolagenasy. Trypsin a kolagenasa se inkubují při teplotě místnosti po dobu 10 minut a potom se k inkubační směsi přidá pětinásobný nadbytek (50 mg/10 mg trypsinu) sojového inhibitoru trypsinu.

Za použití dimethylsulfoxidu se vyrobí zásobní roztoky inhibitorů o lOmM koncentraci a potom se provede jejich ředění podle následujícího schématu:

lOmM -> 120μΜ -> 12μΜ -> 1,2μΜ -> 0,12μΜ

Vždy 25 μΐ roztoku ο každé koncentraci se potom přidá (3 replikace) do příslušných jamek 96-jamkové misky microfluor. Konečná koncentrace inhibitoru po přidání enzymu

44·· • · 4 • 4 · • 4 4 • 4 • · ♦ · ♦· • 4 4 · 4

4 4 4 4

4 · · 4 4 4 •♦ 4 4 4 4

4· · 44 *44 a substrátu je snížena v poměru 1 : 4. V jamkách D7 až D12 jsou umístněny pozitivní kontrolní vzorky (enzym, ale žádný inhibitor) a v jamkách Dl až D6 jsou umístěny slepé pokusy (žádný enzym, žádný inhibitor).

Kolagenasa I se zředí na koncentraci 240 ng/ml a do příslušných jamek misky microfluor se přidá vždy 25 ml zředěného přípravku. Konečná koncentrace kolagenasy při této zkoušce je 60 ng/ml.

Substrát (DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA) NH₂) se vyrobí jako 5mM zásobní roztok dimethylsulfoxidu a potom zředí zkouškovým pufrem na 20μΜ koncentraci. Zkouška se zahájí přídavkem 50 ml substrátu do jamky misky microfluor, čímž se dosáhne lOmM koncové koncentrace.

V čase 0 a potom ve 20-minutových intervalech se odečítají hodnoty fluorescence (excitace 360 nm a emise 460 nm). Zkouška se provádí při teplotě místnosti, přičemž její obvyklé trvání je 3 hodiny.

Jak pro slepé pokusy, tak pro pokusy zahrnující vzorky s kolagenasou se potom vynese do grafu závislost fluorescence na čase (data z třech replikací se zprůměrují). Pro stanovení hodnot IC₅₀ se zvolí časový bod, který poskytuje dobrý signál (alespoň pětinásobek ve srovnání se slepým pokusem) a který se nalézá v lineární části křivky (obvykle okolo asi 120 minut). Hodnoty v čase 0 se používá v případě všech koncentrací všech sloučenin jako referenční hodnoty, která se odečítá od dat v čase 120 minut. Data se vynášejí do grafu jako koncentrace inhibitoru proti procentickému potlačení (podíl fluorescence inhibitoru a fluorescence samotné kolagenasy vynásobený číslem 100). Hodnoty IC₅₀ se určí z koncentrace inhibitoru, která poskytuje signál představující 50% potlačení.

·· 9999

9

Pokud jsou uvedené hodnoty IC_5Q nižší než 0,03mM, potom se inhibitory zkoušejí v koncentracích 0,3mM, 0,03mM a 0,003mM.

Inhibice želatinasy (MMP-2)

Humánní rekombinantní 72kD želatinasa (MMP-2, želatinasa A) se aktivuje během 16 až 18 hodin lmM p-aminofenylmerkuryacetátem (z čerstvě připraveného lOOmM zásobního roztoku v 0,2M hydroxidu sodném) při 4°C za mírného kývání.

Za použití dimethylsulfoxidu se vyrobí zásobní roztoky inhibitorů o lOmM koncentraci a potom se provede jejich sériové ředění zkouškovým pufrem (50mM Tris, pH 7,5, 200mM chlorid sodný, 5mM chlorid vápenatý, 20μΜ chlorid zinečnatý a 0,02% (objemově) Brij-35) podle následujícího schématu:

lOmM -> 120μΜ -> 12μΜ -> 1,2μΜ -> 0,12μΜ

Pokud je to nutné, další ředění se provedou podle stejného schématu. Každá zkouška se provádí minimálně se čtyřmi koncentracemi inhibitoru pro každou sloučeninu. Vždy 25 μΐ roztoku o každé koncentraci se potom přidá (trojmo) do příslušných jamek s kulatým dnem 96-jamkové černé misky microfluor. Zkouška se provádí při konečném objemu 100 μΐ a konečné koncentrace inhibitoru jsou výsledkem dalšího ředění v poměru 1 : 4 (tj. 30μΜ, 3μΜ, 0,3μΜ a 0,03μΜ atd.). Ve trojím provedení se také připraví slepé pokusy (žádný enzym, žádný inhibitor) a pozitivní kontrolní vzorky (enzym, ale žádný inhibitor).

Aktivovaný enzym se zkouškovým pufrem zředí na koncentraci 100 ng/ml a do příslušných jamek misky se přidá • 4

44·· «4 4 4 <444 44 4 4

4444 4 4 4 44

4 444 4444 444

4444 44 ·♦ ·♦ 44 4 »44 vždy 25 μΐ zředěného přípravku. Konečná koncentrace enzymu při této zkoušce je 25 ng/ml (0,34nM).

Substrát (Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH₂) se vyrobí jako 5mM zásobní roztok v dimethylsulfoxidu a potom zředí zkouškovým pufrem na 20μΜ koncentraci. Zkouška se zahájí přídavkem 50 μΐ zředěného substrátu, čímž se dosáhne ΙΟμΜ koncové koncentrace substrátu. V čase 0 a potom v 15-minutových intervalech se odečítají hodnoty fluorescence (excitace 320 nm a emise 390 nm). Zkouška se provádí při teplotě místnosti za použití zařízení PerSeptive Biosystems CytoFluor Multi-Well Plate Reader s přírůstkem 90 jednotek.

Jak pro slepé pokusy, tak pro pokusy zahrnující vzorky s enzymem se potom vynese do grafu závislost průměrné fluorescence na čase. Pro stanovení hodnot IC₅₀ se zvolí časný časový bod, který se nalézá v lineární části křivky. Hodnota v čase 0 v případě všech koncentrací všech sloučenin se odečte od dat v pozdější dobu. Získaná data se poté vyjádří jako procento enzymatické kontroly (podíl fluorescence inhibitoru a fluorescence pozitivní enzymatické kontroly vynásobený číslem 100). Data se vynesou do grafu jako koncentrace inhibitoru proti procentu enzymatické kontroly. Hodnoty IC₅₀ jsou definovány jako koncentrace inhibitoru, která poskytuje signál představující 50 % pozitivní enzymatické kontroly.

Inhibice aktivity stromelysinu (MMP-3)

Lidský rekombinantní stromelysin (MMP-3, stromelysin-l) se aktivuje 2mM ΑΡΜΑ (p-aminofenylmerkuriacetátem) (z čerstvě připraveného lOOmM zásobního roztoku v 0,2M hydroxidu sodném) po dobu 20 až 22 hodin při 30°C.

·· ·» • ♦ ♦ · · · • · · · · β • · · · · φ · · • · · « · ♦ ♦ ♦* ·♦ ···· *·

Za použití dimethylsulfoxidu se vyrobí zásobní roztoky inhibitorů o lOmM koncentraci a potom se provede jejich sériové ředění zkouškovým pufrem (50mM Tris, pH 7,5, 150mM chlorid sodný, lOmM chlorid vápenatý a 0,05% (objemově) Brij-35) podle následujícího schématu:

lOmM -> 120μΜ ->

12μΜ -> 1,2μΜ -> 0,12μΜ

Pokud je to nutné, další ředění se provedou podle stejného schématu. Každá zkouška se provádí minimálně se čtyřmi koncentracemi inhibitoru pro každou sloučeninu.

Vždy 25 μΐ roztoku o každé koncentraci se potom přidá (trojmo) do příslušných jamek s kulatým dnem 96-jamkové černé misky microfluor. Zkouška se provádí při konečném objemu 100 μΐ a konečné koncentrace inhibitoru jsou výsledkem dalšího ředění v poměru 1 : 4 (tj. 30μΜ, 3μΜ, 0,3μΜ a 0,03μΜ atd.). Ve trojím provedení se také připraví slepé pokusy (žádný enzym, žádný inhibitor) a pozitivní kontrolní vzorky (enzym, ale žádný inhibitor).

Aktivovaný enzym se zkouškovým pufrem naředí na koncentraci 200 ng/ml a do příslušných jamek misky se přidá vždy 25 μΐ zředěného přípravku. Konečná koncentrace enzymu při této zkoušce je 50 ng/ml (0,875nM).

Substrát (Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-ArgLys(Dnp)-NH₂) se vyrobí jako lOmM zásobní roztok v dimethylsulfoxidu a potom zředí zkouškovým pufrem na 6μΜ koncentraci. Zkouška se zahájí přídavkem 50 μΐ zředěného substrátu, čímž se dosáhne 3μΜ konečné koncentrace substrátu. V čase 0 a potom v 15-minutových intervalech se odečítají hodnoty fluorescence (excitace 320 nm a emise 390 nm). Zkouška se provádí při teplotě místnosti za použití zařízení PerSeptive Biosystems CytoFluor Multi-Well Plate Reader s přírůstkem 90 jednotek.

• 4 ··♦» • *

4 4 4 »4

4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4

44 «4

4 4 44

4 4 4

4 4 4 4

4 4 4

44 444

Jak pro slepé pokusy, tak pro pokusy zahrnující vzorky s enzymem se potom vynese do grafu závislost průměrné fluorescence na čase. Pro stanovení hodnot IC_5Q se zvolí časný časový bod, který se nalézá v lineární části křivky. Hodnota v čase 0 v případě všech koncentrací všech sloučenin se odečte od dat v pozdější dobu. Získaná data se poté vyjádří jako procento enzymatické kontroly (podíl fluorescence inhibitoru a fluorescence pozitivní enzymatické kontroly vynásobený číslem 100). Data se vynesou do grafu jako koncentrace inhibitoru proti procentu enzymatické kontroly. Hodnoty IC_5Q jsou definovány jako koncentrace inhibitoru, která poskytuje signál představující 50 % pozitivní enzymatické kontroly.

Inhibici aktivity stromelysinu je také možno zkoušet za použití Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Lys(Dnp)-NH₂ (3μΜ) za podobných podmínek, za kterých se provádí zkouška inhibice lidské kolagenasy (MMP-1).

Lidský stromelysin se aktivuje 2mM ΑΡΜΑ (p-aminofenylmerkuriacetátem) a zředí na konečnou koncentraci 50 ng/ml. Inhibitory se zředí jako při zkoušce inhibice lidské kolagenasy (MMP-1) na konečné koncentrace 30μΜ, 3μΜ, 0,3μΜ a 0,03μΜ, ve trojím provedení pro každou koncentraci.

V čase 0 a potom v 15-minutových intervalech po dobu 3 hodin se odečítají hodnoty fluorescence (excitace 320 nm a emise 390 nm).

Hodnoty IC₅₀ se stanoví jako při inhibici lidské kolagenasy (MMP-1). Pokud jsou uvedené hodnoty IC₅₀ nižší než 0,03mM, potom se inhibitory zkoušejí v koncentracích 0,03μΜ, 0,003μΜ 0,0003μΜ a 0,00003μΜ.

*· »· ···· »* • · · « * · · • ·♦··♦· * · · · · • * · · * ♦ · * »· ·· ·· » ·· ·

Hodnoty IC₅₀ se stanoví stejnými způsobem jako pro kolagenasu.

Inhibice MMP-13

Lidský rekombinantní MMP-13 se aktivuje 2mM ΑΡΜΑ (p-aminofenylmerkuriacetátem) po dobu 2 hodin při 37°C a potom se zředí zkouškovým pufrem (50mM Tris, pH 7,5,

200mM chlorid sodný, 5mM chlorid vápenatý, 20μΜ chlorid zinečnatý, 0,02% (objemově) Brij-35) na koncentraci 240 ng/ml. Do každé jamky v 96-jamkové misce microfluor se přidá 25 μΐ zředěného enzymu. V jamce se při zkoušce enzym ještě zředí v poměru 1 : 4 přídavkem inhibitoru a substrátu, takže jeho konečná koncentrace při zkoušce je 60 ng/ml.

Vyrobí se dimethylsulfoxidové zásobní roztoky inhibitorů o koncentraci lOmM, které se pak zředí zkouškovým pufrem za použití systému ředění inhibitoru, který je uveden v popisu zkoušky inhibice lidské kolagenasy 1 (MMP-1). Do jamek misky microfluor se přidá vždy 25 μΐ roztoku o každé koncentraci (trojmo). Konečná koncentrace při zkoušce je 30mM, 3mmM, 0,3mmM a 0,03mmM.

Substrát (Dnp-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)NH₂) se zpracuje tak, jako při zkoušce inhibice lidské kolagenasy 1 (MMP-1) a do každé jamky se přidá vždy 50 μΐ vzniklého roztoku, čímž se dosáhne koncové zkouškové koncentrace 10μΜ. Fluorescence (excitace 360 nm, emise 450 nm) se odečítá v čase 0 a potom každých 5 minut po dobu 1 hodiny.

Pozitivní kontrolní vzorky obsahují enzym a substrát bez inhibitoru, zatímco slepé vzorky obsahují samotný substrát.

4« ··«· • 4

44 • 4 4 4 4 4 • ♦ * · 4 4

4 44444 4

4 4 4 4

Hodnoty IC₅₀ se stanoví stejným způsobem jako při zkoušce inhibice lidské kolagenasy 1 (MMP-1). Pokud jsou uvedené hodnoty IC₅₀ nižší než 0,03mM, potom se inhibitory zkoušejí v konečných koncentracích 0,3mM, 0,03mmM, 0,003mmM a 0,0003mM.

Inhibice produkce TNF

Schopnost sloučenin podle vynálezu a jejich farmaceuticky vhodných solí inhibovat produkci TNF, a tedy jejich použitelnost pro léčbu chorob, při nichž dochází k produkci TNF, je demonstrována následující zkouškou in vitro.

Z anti-koagulované lidské krve se izolují lidské jednojaderné buňky za použití jednostupňového separačního postupu Ficoll-hypaque. Jednojaderné buňky se třikrát promyjí v Hanksově vyváženém solném roztoku (HBSS) s dvojmocnými kationty a resuspendují na hustotu 2 x 10⁶/ml v HBSS s obsahem 1 % BSA. Diferenciální počty stanovené za použití analyzátoru Abbott Cell Dyn 3500 ukazují, že v těchto přípravcích monocyty tvoří 17 až 24 % celkového počtu buněk.

Do 96-jamkových misek s plochým dnem (Costar) se umístí vždy 180 μΐ vzniklé suspenze buněk. Přídavkem zkoušené sloučeniny a LPS (koncová koncentrace 100 ng/ml) se objem v každé jamce upraví na hodnotu 200 μΐ. Zkoušky se za všech podmínek provádějí se třemi replikacemi. Po čtyřhodinové inkubaci při 37°C v inkubátoru se zvlhčenou atmosférou obsahující oxid uhličitý se misky vyjmou a provede se centrifugace (10 minut při asi 250 x g). Supernatanty se oddělí a analyzují na TNF-α za použití soupravy R&D ELISA.

Inhibice produkce rozpustného TNF-a

Schopnost sloučenin nebo jejich farmaceuticky vhodných solí inhibovat celulární uvolňování TNF-α, a tedy *· 444· jejich použitelnost pro léčení chorob, na nichž se podílí disregulace rozpustného TNF-α, je demonstrována následující zkouškou in vitro.

Způsob hodnocení aktivity rekombinantního enzymu konvertujícího TNF-a

Exprese rekombinantního TÁCE

DNA fragment kódující signální sekvenci, preprodoménu, prodoménu a katalytickou doménu TÁCE (aminokyseliny 1 až 473) je možno amplifikovat polymerasou katalyzovatnou řetězovou reakcí za použití knihovny cDNA lidských plic jako templátu. Amplifikovaný fragment se poté klonuje do vektoru pFastBac. DNA sekvence insertu se potvrdí pro oba řetězce. Bacmid připravený za použití pFastBac v E. coli DHlOBac se transfekuje do hmyzích buněk SF9. Virové částice se poté amplifikuji do stádia Pl, P2, P3. P3 virem se infikují jak buňky Sf9, tak hmyzí buňky High Five. Infikované buňky se nechají růst 48 hodin při 27°C. Médium se shromáždí a použije se ho pro zkoušky a další purifikaci.

Příprava substrátu se zhašenou fluorescencí

Připraví se model peptidového substrátu TNF-a (Ly-LeucinAlaninGlutaminAlaninValinArgininSerin-SerinLysin(CTMR)-Arginin, kde Ly = žluč Lucifer a CTMR = = karboxytetramethylrhodamin, a koncentrace se stanoví podle absorbance při 560 nm (E₅₆₀, 60 000 M-1CM-1) způsobem popsaným v Geoghegan, KF, Improved method for converting an unmodified peptid to an energy-transfer substráte for a proteinase, Bioconjugate Chem. 7, 385 až 391 (1995). Tento peptid obsahuje štěpné místo na pro-TNF, které se in vivo štěpí enzymem TÁCE.

·· ····

4« ·· • ♦ 4 · «4

O · 4«

4 4·· « · * « · · * ·· · * 4 4 4 4 • » 44 · · * ·» «

Exprese rekombinantního TÁCE

DNA fragment kódující signální sekvenci, preprodoménu, prodoménu a katalytickou doménu TÁCE (aminokyseliny 1 až 473) se amplifikuje polymerasou katalyzovanou řetězovou reakcí za použití cDNA knihovny lidských plic jako templátu. Amplifikovaný fragment se klonuje do vektoru pFastBac. DNA sekvence insertu se potvrdí pro oba řetězce. Bacmid připravený za použití pFastBac v E. coli DHlOBac se transfekuje do hmyzích buněk SF9. Virové částice se poté amplifikují do stádia Pl, P2, P3. P3 virem se infikují jak buňky Sf9, tak hmyzí buňky High Five. Infikované buňky se nechají růst 48 hodin při 27°C. Médium se shromáždí a použije se ho pro zkoušky a další purifikaci.

Enzymatická reakce

Reakce se provádí na 96jamkových miskách (Dynatech), z nichž každá obsahuje 70 μΐ pufrovacího roztoku (25mM Hepes-HCl, pH 7,5 a 20μΜ chlorid zinečnatý), 10 μΐ ΙΟΟμΜ substrátu se ze zhašenou fluorescencí, 10 μΐ 5% roztoku zkoušené sloučeniny v dimethylsulfoxidu a enzym r-TACE v množství, které vyvolá 50% štěpení během 60 minut, při celkovém objemu 100 μΐ. Specificita enzymového štěpení v místě amidové vazby mezi alaninem a valinem se potvrdí pomocí HPLC a hmotnostní spektrometrie. Počáteční hodnota štěpení se monitoruje měřením zvýšení fluorescence při 530 nm (excitace při 409 nm) během 30 minut. Při zkoušce se sleduje 1) pozadí fluorescence substrátu, 2) fluorescence plně rozštěpeného substrátu a 3) zhášení nebo narůstání fluorescence roztoku obsahujícího zkoušenou sloučeninu.

Údaje se analyzují následujícím postupem. Hodnoty kontrolních reakčních směsí, které neobsahují zkoušenou sloučeninu, se zprůměrují, čímž se stanoví 100% hodnota.

·« ·· • » · · · · • · · · · · • · ·»· · · · • · « · · ·* ·* ·· ·· «··· «« ··

Hodnota reakce za přítomnosti zkoušené sloučeniny se porovná s hodnotou bez přítomnosti sloučeniny a tento podíl se zaznamená do tabulky jako procento kontroly bez zkoušené sloučeniny. Výsledky se vynesou do grafu jako % kontroly proti logaritmu koncentrace sloučeniny a stanoví se polovina maxima nebo hodnota IC₅₀.

Všechny sloučeniny podle vynálezu vykazují hodnotu IC_5Q méně než ΙμΜ, přednostně méně než 50nM. Nejvýhodnější sloučeniny podle vynálezu jsou alespoň stokrát méně účinné proti r-MMP-1 než při výše uvedeném TÁCE stanovení.

Zkouška na lidských monocytech

• · · · • · · · • · ··· · • · · ·· ·· ·· ···· • c ·

·· • · · • · • · • · ·· 9

Agrekanasová zkouška

Primární chondrocyty vepře se izolují z chrupavky kloubu postupným štěpením trypsinem a kolagenasou a dále štěpí kolagenasou přes noc. 2 x 10⁵ buněk se navzorkuje do každé jamky 48jamkové misky s 5 μΌϊ/ιηΙ ³⁵S (1000 Ci/mmol) síry v typu I kolagenem potažených misek. Buňky se udržují asi 1 týden při 37 °C pod atmosférou 5% oxidu uhličitého, aby došlo k začlenění značky do proteoglykanové matrice.

V noci před zahájením zkoušky se monovrstvy chondrocytů promyjí dvakrát v DMEM/1% PSF/G a přes noc inkubují v čerstvém DMEM/1% FBS.

Následující ráno se chondrocyty promyjí jednou DMEM/1% PSF/G, poslední promývací lázeň se ponechá na miskách v inkubátoru a mezitím se připraví zředěné roztoky zkoušeného léčiva.

Média a zředěné roztoky se připraví způsobem uvedeným v následující tabulce:

Kontrolní médium	samotné DMEM (kontrolní médium)
IL-1 médium	DMEM+IL-l (5 ng/ml)
Zředěné roztoky	Připraví se zásobní roztok každé
léčiva	sloučeniny v DMSO o koncetraci lOmM.

Připraví se ΙΟΟμΜ zásobní roztok každé sloučeniny v DMEM na 96jamkové misce.

Roztoky se přes noc skladují v mrazáku.

• ·

Následující den se provedou sériová ředění v DMEM s IL-1 na koncentraci 5μΜ, 500nM a 50nM.

Poslední lázeň se z jamek odsaje a 50 μΐ zředěného roztoku sloučeniny připraveného výše popsaným způsobem se přidá ke 450 μΐ IL-1 média v příslušných jamkách 48jamkové misky. Konečné koncentrace sloučeniny jsou 500nM, 50nM a 5nM.

Všechny vzorky se připravují trojmo s jediným kontrolním vzorkem a IL-1 vzorkem na každé misce.

Misky se označí a použije se pouze 24 vnitřních jamek. Na jedné z misek se několik sloupců připraví jako IL-1 (bez léčiva) a kontrolní (žádný IL-1, žádné léčivo). U těchto kontrolních sloupců se periodicky sleduje počet impulzů, aby se monitorovalo uvolňování 35S-proteoglykanu.

Do jamek se přidá kontrolní médium a IL-1 médium (450 μΐ) a poté sloučenina (50 μΐ), čímž se zahájí zkouška. Misky se inkubují při 37“C v atmosféře 5% oxidu uhličitého.

Při asi 40 až 50% uvolnění (když počet impulzů za minutu IL-1 média představuje 4 až 5x násobek kontrolního média), podle kapalinové scintilace (LSC) vzorků média, se zkouška ukončí (9 až 12 hodin). Ze všech jamek se odstraní médium a umístí se do scintilačních trubic. Po přidání scintilátu se získají hodnoty radioaktivních impulzů (LSC).

Do každé misky se přidá 500 μΐ papainového štěpicího pufru (0,2M Tris, pH 7,0, 5mM EDTA, 5mM DDT a 1 mg/ml papainu, aby se solubilizovaly buněčné vrstvy. Misky se štěpícím roztokem se inkubují přes noc při 60°C. Následující den se z misek odstraní buněčná vrstva a buňky se umístí do scintilačních • · • · · · ··· ·· · · · · • ··· · · · · · · · trubic. Přidá se scintilát a stanoví se počet impulzů vzorků (LSC).

Stanoví se procentní podíl uvolněného isotopu z celkového množství přítomného v každé jamce. Vypočítají se průměrné hodnoty pro trojice vzorků a odečte se kontrolní pozadí. Stanoví se procento inhibice u sloučeniny, přičemž se za základ považují vzorky IL-1 jako 0% inhibice (100% celkově naměřené hodnoty).

Pro podávání člověku za účelem inhibice matričních metalloproteinas nebo produkce faktoru nekrosy nádorů (TNF) se může použít různých konvenčních cest, jako například orálního, parenterálního a topického podávání. Obvykle se bude účinná sloučenina podávat orálně nebo parenterálně v dávce v rozmezí od asi 0,1 do asi 25 mg/kg tělesné hmotnosti léčebného subjektu za den, přičemž přednostní denní dávka bude ležet přibližně v rozmezí od 0,3 do 5 mg/kg. V závislosti na stavu léčeného subjektu bude nutně docházet k určitým variacím dávkování. Vhodnou dávku pro individuálního pacienta stanoví v každém případě ošetřující lékař.

Sloučeniny podle vynálezu je možno podávat v podobě široké palety různých dávkovačích forem, v nichž budou terapeuticky účinné sloučeniny podle vynálezu přítomny v koncentraci v rozmezí od asi 5,0 do asi 70 % hmotnostních.

Pro orální podávání je možno použít tablet obsahujících různé excipienty, jako je mikrokrystalická celulosa, citrát sodný, uhličitan vápenatý, dikalciumfosfát a glycin spolu s různými bubřidly, jako je škrob (přednostně kukuřičný, bramborový nebo tapiokový škrob), kyselina alginová a určité komplexní křemičitany a také granulačními pojivý, jako je polyvinylpyrrolidon, sacharosa, želatina a klovatina. Často jsou pro tabletování také velmi užitečná • · lubrikační činidla, jako je stearan horečnatý, laurylsulfát sodný a mastek. Pevných směsí podobného typu je také možno použít jako náplně pro želatinové kapsle; jako přednostní látky je v této souvislosti možno uvést také laktosu a vysokomolekulární polyethylenglykoly. Když se má pro orální podávání použít vodných suspenzí a/nebo elixírů, mísí se účinná přísada s různými sladidly nebo ochucovadly, pigmenty nebo barvivý a je-li to zapotřebí, emulgátory a/nebo suspenzními činidly, jakož i s takovými ředidly, jako je voda, ethanol, propylenglykol, glycerol a jejich různé směsi. V případě podávání zvířatům jsou tyto látky s výhodou zahrnuty do krmiv pro zvířata nebo picí vody v koncentraci 5 až 5000 ppm, přednostně 25 až 500 ppm.

Pro parenterální podávání, např. intramuskulární, intraperitoneální, subkutánní a intravenosní podávání, se obvykle používá sterilních injekčních roztoků účinných přísad. Při tom se může použít roztoků terapeuticky účinné sloučeniny podle vynálezu buď v sezamovém nebo arašídovém oleji nebo také ve vodném propylenglykolu. Hodnota pH vodných roztoků by měla být, pokud je to zapotřebí, vhodným způsobem nastavena a pufrována, přednostně na hodnotu vyšší než 8 a kapalné ředidlo by mělo být nejprve isotonizováno. Takové vodné roztoky se hodí pro podávání ve formě intravenosních injekcí. Olejové roztoky se hodí pro intraartikulární, intramuskulární a subkutánní injekční podávání. Všechny tyto roztoky se vyrábějí za sterilních podmínek v souladu se standardními farmaceutickými technologiemi, které jsou odborníkům v tomto oboru dobře známé. V případě podávání zvířatům, mohou být tyto sloučeniny podávány intramuskulárně nebo subkutánně, přičemž úroveň denní dávky leží v rozmezí od asi 0,1 do asi 50 mg/kg, výhodně od 0,2 do 10 mg/kg, a je možno ji podávat ve formě jediné nebo až tří dílčích dávek.

• · · · ·

Pro topické okulární podávání, přímou aplikaci do postiženého oka, je možno používat takových formulací, jako jsou oční kapky, aerosoly, gely nebo masti. Účinnou sloučeninu je také možno začlenit do kolagenu nebo do polymerů nebo kopolymerů 2-hydroxyethylmethakrylátu nebo jiných hydrofilních polymerních látek. Tyto látky je také možno aplikovat jako kontaktní čočky nebo za použití očních insertů nebo formulací určených pro podávání do spojivkového vaku.

Pro intraorbitální podávání se obvykle používá sterilních injekčních roztoků účinných přísad. Při tom se může použít roztoků terapeuticky účinné sloučeniny podle vynálezu ve vodném roztoku nebo suspenzi (o velikosti částic méně než 10 μπι). Hodnota pH vodných roztoků by měla být, pokud je to zapotřebí, vhodným způsobem nastavena a pufrována, přednostně na hodnotu pH 5 až 8 a kapalné ředidlo by mělo být nejprve isotonizováno. Pro zvýšení viskosity nebo pro dosažení trvalého uvolňování je možno přidat malá množství polymerů (jako jsou polymery celulosy, Dextran, polyethylenglykol nebo kyselina alginová). Tyto roztoky jsou vhodné pro intraorbitální injekční podávání. Všechny tyto roztoky se vyrábějí za sterilních podmínek v souladu se standardními farmaceutickými technologiemi, které jsou odborníkům v tomto oboru dobře známé. V případě podávání zvířatům, mohou být tyto sloučeniny podávány intraorbitálně, přičemž úroveň denní dávky leží v rozmezí od asi 0,1 do asi 50 mg/kg, výhodně od 0,2 do 10 mg/kg, a je možno ji podávat ve formě jediné nebo až tří dílčích dávek.

Účinné sloučeniny podle vynálezu je také možno zpracovávat do formy rektálních kompozic, jako čípků nebo retenčních střevních nálevů. Čípky obsahují obvykle báze, jako je kakaové máslo nebo jiné glyceridy.

• ·

V případě intranasálního nebo inhalačního podávání se účinné sloučeniny podle vynálezu účelně dodávají ve formě roztoku nebo suspenze, která se uvolňuje z nádobky s rozprašovací pumpičkou ovládanou pacientem, nebo ve formě aerosolu, který se uvolňuje z tlakovky nebo rozmlžovače, za použití vhodných hnacích plyná, například dichlordifluormethanu, trichlorfluormethanu, dichlortetrafluorethanu, oxidu uhličitého nebo jiného vhodného plynu. U tlakovaného aerosolu lze dávkovači jednotku stanovit předem za použití ventilu, který uvolňuje odměřené množství. Tlakovky nebo rozmlžovače mohou obsahovat roztok nebo suspenzi účinné sloučeniny. Také je možno připravovat tobolky nebo patrony (vyrobené například z želatiny) pro ihalátory a insuflátory, které obsahují práškovou směs sloučeniny podle vynálezu a vhodné práškové báze, jako je laktosa nebo škrob.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují. Teploty tání uváděné v těchto příkladech jsou nekorigovány. NMR data jsou uvedena v dílech na milion dílů (ppm) a vztahují se k deuteriovému zaklíčovanému signálu ze vzorku rozpouštědla (deuteriochooformu, pokud není uvedeno jinak). Látek dostupných na trhu se používá bez dalšího přečištění. Pod pojmem chromátografie se rozumí chromatografie na sloupsi silikagelu (32 až 63 mm) pod tlakem dusíku (mžiková chromatografie). Pod pojmem teplota místnosti se rozumí teplota 20 až 25°C. Reakce v nevodném prostředí se pro účelnost a maximalizaci výtěžků provádějí pod atmosférou dusíku. Pod pojmem zkoncentruje za sníženého tlaku se rozumí, že se použije rotačního odpařováku.

<k · ···· · · · · · · • · · · « · · · · • ···»·· · · · · · •· ·· ·· · ·· ·

Příklady provední vynálezu

Preparativní postup 1

4-(4-Fluorfenoxy)thiofenol

Lithiumaluminiumhydrid (9,95 g, 0,26 mol) se po částech přidá k míchanému roztoku 4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylchloridu (30 g, 0,105 mol) v tetrahydrofuranu (700 ml). Výsledná směs se 1,5 hodiny zahřívá ke zpětnému toku, ochladí v ledové lázni a rozloží přídavkem 10% vodného roztoku kyseliny sírové (100 ml). Vzniklá směs se 30 minut míchá a přefiltruje přes celit. Z filtrátu se za sníženého tlaku odstraní tetrahydrofuran. Zbytek se zředí vodou a vodná směs se extrahuje diethyletherem. Organická vrstva se promyje vodou a vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a zkoncentruje za sníženého tlaku. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pevné látky (23 g, 100 %).

Preparativní postup 2

4'-Fluorbifenyl-4-thiol

Lihitumaluminiumhydrid (0,95 g, 25 mmol) se po částech přidá k míchanému roztoku 4'-fluorbifenyl-4-sulfonylchloridu (2,7 g, 10 mmol) v tetrahydrofuranu (75 ml). Výsledná směs se 4 hodiny zahřívá ke zpětnému toku, ochladí v ledové lázni a rozloží přídavkem 10% vodného roztoku kyseliny sírové (100 ml). Vzniklá směs se 30 minut míchá a přefiltruje přes celit. Z filtrátu se za sníženého tlaku odstraní tetrahydrofuran. Zbytek se zředí vodou a vodná směs se extrahuje diethyletherem. Organická vrstva se promyje vodou a vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a zkoncentruje za sníženého tlaku. Pevný zbytek • · · · · · · · · • · · · · · · ·· • ······ ·· · · 9 se trituruje s diethyletherem. Nerozpustná látka se odfiltruje a filtrát se zkoncentruje. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě žluté pevné látky (1,4 g, 69 %).

Preparativní postup 3

4-(4-Chlorfenoxy)thiofenol

Lithiumaluminiumhydrid (6,5 g, 0,17 mol) se po částech přidá k míchanému roztoku 4-(4-chlorfenoxy)benzensulf onylchloridu (20,5 g, 68 mmol) v tetrahydrofuranu (400 ml), přičemž se udržuje mírný zpětný tok. Výsledná směs se 2 hodiny míchá při teplotě místnosti, ochladí v ledové lázni a rozloží přídavkem 10% vodného roztoku kyseliny sírové (100 ml). Vzniklá směs se 30 minut míchá a zředí vodou.

Vodná směs se extrahuje diethyletherem. Organická vrstva se promyje vodou a vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a zkoncentruje za sníženého tlaku. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pevné látky (15,9 g, 99 %).

Příklad 1

Hydroxyamid 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylamino]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny

A) Ethylester 3-(benzhydrylidenamino)-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny

K suspenzi hydridu sodného (0,41 g, 17,1 mmol) v N,N-dimethylformamidu (50 ml) se při 0°C přikape roztok ethylesteru N-difenylmethylenglycinu (2,07 g, 7,8 mmol) v N,N-dimethylformamidu (50 ml). Výsledná směs se 30 minut míchá při teplotě místnosti, načež se k ní přikape roztok di-p-toluensulfonátu cis-2,5-bis(hydroxymethy1)tetrahydro• · · · • · · · · · • · · · · · · · · « furanu (4,1 g, 9,3 mmol) v N,N-dimethylformamidu (50 ml). Reakční směs se v olejové lázni postupně zahřeje na 100°C a při této teplotě přes noc míchá. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a zbytek se vyjme do vody a extrahuje dvakrát diethyletherem. Spojené organické extrakty se promyjí vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a zkoncentrují na hnědý olej. Z tohoto oleje se chromatografii na silikagelu za použití 20% ethylacetátu v hexanu jako elučního činidla izoluje sloučenina uvedená v nadpisu (1,42 g, 51 %, směs exo/endo diastereomerů v poměru 3 : 1).

B) Hydrochlorid ethylesteru 3-amino-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny

Dvoufázová směs ethylesteru 3-(benzhydrylidenamino)-8-oxabicyklo[3,2,1]-oktan-3-karboxylové kyseliny (1,4 g,

3,9 mmol) v 1M vodném roztoku kyseliny chlorovodíkové (100 ml) a diethyletheru (100 ml) se míchá přes noc při teplotě místnosti. Vodná vrstva se zkoncentruje, čímž se získá sloučenina uvedená v nadpisu (0,70 g, 78 %, směs exo/endo diastereomerů v poměru 3 : 1) ve formě světle žluté pevné látky.

C) Ethylester 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylamino]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny

Roztok hydrochloridu ethylesteru 3-amino-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny (690 mg, 2,9 mmol), 4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylchloridu (923 mg, 3,2 mmol) a triethylaminu (0,9 ml, 6,5 mmol) v N,N-dimethylformamidu (45 ml) se přes noc míchá při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku a zbytek se vyjme do nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Po extrakci methylenchloridem (2x) se spojené organické vrstvy promyjí • · • ♦ · · · · • · · · • · · · • · · · » • · · • · · ·

vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem horečnatým a zkoncentrují na hnědý olej. Chromatografií na silikagelu za použití 1% methanolu v methylenchloridu jako elučního činidla se izoluje sloučenina uvedená v nadpisu (492 mg, 38 %).

D) 3-Exo-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylamino]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylová kyselina

Hydroxid sodný (1,5 g, 38 mmol) se přidá k roztoku ethylesteru 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylamino]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny (492 mg, 1,09 mmol) ve směsi ethanolu (10 ml) a vody (10 ml). Výsledná směs se 6 dní zahřívá ke zpětnému toku, ochladí a okyselí 1M vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové. Vzniklá směs se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a zkoncentruje. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu (411 mg,

%) ve formě zlatohnědé pěny.

E) Benzyloxyamid 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylamino]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny

K roztoku 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylamino]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny (411 mg, 0,98 mmol) a triethylaminu (0,19 ml, 1,36 mmol) v Ν,Ν-dimethylformamidu (30 ml) se přidá (benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorborát (474 mg,

1,07 mmol). Vzniklá směs se 1 hodinu míchá při teplotě místnosti a přidá se k ní další další triethylamin (0,22 ml, 1,58 mmol) a hydrochlorid O-benzylhydroxylaminu (187 mg,

1,17 mmol). Reakční směs se 1 den míchá při teplotě místnosti, poté 1 den při 50°C a zkoncentruje za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí v ethylacetátu a ethylacetátový roztok se promyje postupně 1M vodným roztokem kyseliny • · ·* · · · · » · · · • · · · · » · 9 9 9

chlorovodíkové, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem horečnatým a zkoncentruje na olejovitý zbytek. Z tohoto zbytku se chromatografií za použití 50% ethylacetátu v hexanu jako elučního činidla izoluje sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pevné látky (237 mg, 46 %).

F) Hydroxyamid 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylamino]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny

Roztok benzyloxyamidu 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylamino]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny (237 mg, 0,45 mmol) v methanolu (25 ml) se smísí s 5% palladiem na síranu barnatém (150 mg). Výsledná směs se 4 hodiny v Parrově třepaném zařízení hydrogenuje za tlaku 0,3 MPa. Katalyzátor se odstraní filtrací přes nylonový filtr (0,45 μκι) . Filtrát se zkoncentruje na bílou pěnu. Krystalizací z methylenchloridu se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pevné látky (62 mg, 32 %). Druhá frakce se získá krystalizací ze směsi ethylacetátu a hexanu. Teplota tání: 138 až 141°C. ^ΤΗ NMR (DMSO-dg): δ 10,50 (brs, 1H), 8,56 (brs, 1H), 7,67 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,66 (brs,

1H, překrývání), 7,26 - 7,22 (m, 2H), 7,16 - 7,12 (m, 2H), 7,01 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 4,09 (brs, 2H), 2,32 (d, J = 14,1 Hz, 2H), 1,68 - 1,63 (m, 4H), 1,51 - 1,48 (m, 2H). MS: 435 m/e (M-H). Struktura a stereochemie se dále potvrdí rentgenovou krystalografií jediného krystalu.

Příklad 2

Hydroxyamid 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylmethyl]-8-oxabicyklo[3,2,l]oktan-3-karboxylové kyseliny

A) Diethylethylester 8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3,3-dikarboxylové kyseliny * · • · ♦ · • · · · · · • · · · · · • · ♦ · · · · · • · · · · • · · · · ·

Hydrid sodný (2,28 g, 95 mmol) se po částech přidá k míchané směsi roztoku diethylmalonátu (15 ml, 99 mmol) v Ν,Ν-dimethylformamidu (400 ml). Výsledná směs se 45 minut míchá, kdy dojde k dokončení vývoje vodíku, a přikape se k ní roztok di-p-toluensulfonátu cis-2,5-bis(hydroxymethyl)tetrahydrofuranu (19,0 g, 43 mmol) v Ν,Ν-dimethylformamidu (400 ml). Vzniklá směs se přes noc zahřívá v olejové lázni na 140°C, poté ochladí na tepotu místnosti, rozloží přídavkem nasyceného vodného roztoku chloridu amonného a zkoncentruje za sníženého tlaku. Olejovitý zbytek se vyjme do vody a extrahuje diethyletherem. Organický extrakt se promyje vodou a vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a zkoncentruje na olejovitý zbytek. Destilací za sníženého tlaku se získá sloučenina uvedená v nadpisu (7,8 g, 71 %) ve formě čirého oleje.

B) Ethylester 3-exo-hydroxymethyl-8-oxabicyklo[3,2,1Joktan-3-karboxylové kyseliny

1,2M roztok diisobutylaluminiumhydridu v toluenu (62,5 ml, 75 mmol) se při -40°C přikape k roztoku diethylesteru 8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3,3-dikarboxylové kyseliny (7,8 g, 30 mmol) v toluenu (80 ml). Výsledná směs se za míchání během 3 hodin nechá zahřát na 0’C, poté ochladí na -15°C a pomalu za udržování této teploty se k ní přidá ethanol (8 ml). Vzniklá směs se 1 hodinu míchá při -15°C, načež se k ní přidá tetrahydroboritan sodný (1,1 g, mmol). Reakční směs se přes noc míchá při teplotě místnosti, rozloží přikapáním nasyceného vodného roztoku síranu sodného a přidá se k ní ethylacetát. Výsledná směs se 20 minut míchá, načež se z ní filtrací přes celit odstraní nerozpustná látka. Filtrát se promyje vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a zkoncentruje. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu (5,1 g, 80 %) ve formě čirého oleje.

• · · • · ·

* » • ·· • ·

C) 3-exo-Hydroxymethyl-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylová kyselina

Hydrát hydroxidu lithného (2,5 g, 59,5 mmol) se přidá k roztoku ethylesteru 3-exo-hydroxymethyl-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny (5,1 g, 23,8 mmol) ve směsi methanolu (25 ml), tetrahydrofuranu (25 ml) a vody (2,5 ml). Reakční směs se přes noc zahřívá ke zpětnému toku, ochladí a rozloží přídavkem ionexové pryskyřice Amberlite IR-12o(^r). Vzniklá suspenze se 20 minut míchá, načež se z ní filtrací za promývání tetrahydrofuranem odstraní pryskyřice. Rozpouštědla se odpaří a zbytek se trituruje s diethyletherem. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu (2,35 g, 53 %) ve formě bílé pevné látky.

D) 3',8-Dioxaspiro[bicyklo[3,2,l]oktan-3,1'-cyklobutan]-2'-on

Benzensulfonylchlorid (1,7 ml, 13,5 mmol) se při 0°C přikape k roztoku 3-exo-hydroxymethyl-8-oxabicyklot3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny (2,3 g, 12,3 mmol), triethylaminu (3,4 ml, 24,7 mmol) a 4-dimethylaminopyridinu (300 mg, 2,5 mmol) v methylenchloridu (50 ml). Reakční směs se 1 hodinu míchá při 0°C, zředí methylenchloridem a promyje vodným 1M roztokem kyseliny chlorovodíkové, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a odpaří se z ní rozpouštědlo. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pevné látky (1,8 g, 90 %).

E) 3-exo-[4-(4-Fluorfenoxy)fenylsulfanylmethyl]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylová kyselina

Roztok 4-(4-fluorfenoxy)thiofenolu (2,2 g, 10 mmol) v tetrahydrofuranu (10 ml) se při -10°C přikape k suspenzi hydridu sodného (270 mg, 11,3 mmol) v tetrahydrofuranu (20 ·· ···· ·· • · · 9 · · • · · » · » » ·· • » ··· * · · · · · · ml). Výsledná směs se během 30 minut za míchání nechá zahřát na teplotu místnosti, znovu ochladí na -10°C a přikape se k ní roztok 3',8-dioxaspiro[bicyklo[3,2,1]oktan-3,1'-cyklobutan]-2'-onu (1,8 g, 10 mmol) v tetrahydrofuranu (20 ml). Chladicí lázeň se odstaví a v míchání se pokračuje 2 hodiny při teplotě místnosti. Poté se směs rozloží 1M vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a extrahuje dvakrát methylenchloridem. Spojené organické extrakty se promyjí vodou a vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a zkoncentrují. Pevný zbytek se překrystaluje ze směsi diethyletheru a hexanu. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu (1,8 g, 47 %) ve formě bílé pevné látky. Matečný louh se zkoncentruje a zbytek se chromátografuje na silikagelu za použití 2% methanolu v chloroformu jako elučního činidla, čímž se získá další dávka titulní sloučeniny (500 mg, 13 %).

F) Benzyloxyamid 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy)fenylsulfanylmethyl]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny

K roztoku 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy)fenylsulfanylmethyl]-8-oxabicyklo[3,2,l]oktan-3-karboxylové kyseliny (1,0 g, 2,6 mmol) a diisopropylethylaminu (0,5 ml, 2,9 mmol) v N,N-dimethylformamidu (20 ml) se přidá (benzotriazol-l-yloxy)tris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorborát (1,2 g, 2,7 mmol). Výsledná směs se 2,5 hodiny míchá při teplotě místnosti, přidá se k ní další diisopropylethylamin (0,86 ml, 4,9 mmol) a hydrochlorid O-benzylhydroxylaminu (525 mg,

3,3 mmol). Reakční směs se 16 hodin míchá při 50°C, zkoncentruje za sníženého tlaku a zbytek se rozpustí v ethylacetátu. Ethylacetátový roztok se promyje postupně 1M vodnou kyselinou chlorovodíkovou, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a zkoncentruje. Z olejovitého zbytku se chromatografií za použití 30% ethylacetátu ··· · ·· 44 • 444 44 4 444 • 444 4 4 4 44

444444 4 4 44 4

4444 44 v hexanu jako elučního činidla izoluje sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pěny (405 mg, 32 %).

G) Benzyloxyamid 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy)fenylsulfonylmethyl]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny

Pevná 57 až 85% meta-chlorperbenzoová kyselina (283 mg) se přidá k roztoku benzyloxyamidu 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy )fenylsulfanylmethyl]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny v methylenchloridu (15 ml). Výsledná směs se přes noc míchá při teplotě místnosti a poté rozloží přídavkem nasyceného vodného roztoku hydrogensiřičitanu sodného. Vzniklá směs se zředí methylenchloridem. Organická vrstva se oddělí a promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a zkoncentruje. Získá se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pěny (390 mg, 90 %).

H) Hydroxyamid 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonylmethyl]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny

Roztok benzyloxyamidu 3-exo-[4-(4-fluorfenoxy)fenylsulfonylmethyl]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny (390 mg, 0,74 mmol) v methanolu (20 ml) se smísí s 5% palladiem na síranu barnatém (195 mg). Vzniklá směs se 3,5 hodiny hydrogenuje v Parrově třepaném zařízení za tlaku 0,3 MPa, načež se z ní filtrací přes nylonový filtr (0,45 μιη) odstraní katalyzátor. Filtrát se zkoncentruje na bílou pěnu. Krystalizací ze směsi ethylacetátu a hexanu se získá sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pevné látky (230 mg, 71 %).

Teplota tání: 134 až 139°C. ’ή NMR (DMSO-d₆): δ 8,55 (brs,

1H), 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,30 - 7,26 (m, 2H), 7,20 7,16 (m, 2H), 7,09 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 4,13 (brs, 2H), 3,40 (S, 2H), 2,24 (d, J = 14,3 Hz, 2H), 1,78 - 1,73 (m, 4H) , ·> · 44 • · 4 · · · 4 · 4 4

4«·· 4 » 4 44

44444« 44 44 4

4444 »4

1,57 - 1,55 (m, 2Η). MS m/e 434 (M-H). Struktura a stereochemie se dále potvrdí rentgenovou krystalografií jediného krystalu.

Příklad 3

Hydroxyamid 3-(4-fenoxybenzensulfonylmethyl) -8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny

Sloučenina uvedená v nadpisu se vyrobí způsobem popsaným v příkladu 2 za použití 4-fenoxyfenylthiofenolu ve stupni E. l-H NMR (DMSO-dg): δ 8,54 (brs, 1H) , 7,75 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,44 - 7,40 (m, 2H), 7,23 - 7,21 (m, 1H), 7,11 - 7,07 (m, 4H), 4,11 (brs, 2H), 3,38 (s, 2H), 2,22 (d, J = 14,3 Hz, 2H), 1,80 - 1,70 (m, 4H), 1,60 - 1,50 (m, 2H). MS m/e 416 (M-H)

Příklad 4

Hydroxyamid 3-exo-(4'-fluorbifenyl-4-sulfonylmethyl)-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny

Sloučenina uvedená v nadpisu se vyrobí způsobem popsaným v příkladu 2 za použití 4'-fluorbifenyl-4-thiolu ve stupni E. ^-H NMR (DMSO-dg): δ 10,60 (brs, 1H) , 8,58 (brs, 1H), 7,88 - 7,85 (m, 4H), 7,81 - 7,78 (m, 2H), 7,36 - 7,31 (m, 2H), 4,13 (brs, 2H), 3,47 (s, 2H), 2,25 (d, J = 14,5 Hz, 2H), 1,80 - 1,76 (m, 4H), 1,60 - 1,55 (m, 2H). MS m/e 418 (M-H)

Příklad 5

Hydroxyamid 3-exo-[4-(4-chlorfenoxy)benzensulfonylmethyl]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny ·«··

99 « r · » · v « 9 » • 9 · i 9 · « »9 • 9«·«·· 9 · «9 9 » 9 9 9 9 99 «9 99 «9 9 99

A) 3-exo-[4-(4-Chlorfenoxy)fenylsulfanylmethyl]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylová kyselina

4-(4-Chlorfenoxy)thiofenol (2,07 g, 6,8 mmol) se při teplotě místnosti přidá k suspenzi hydridu sodného (180 mg, 7,5 mmol) v tetrahydrofuranu (50 ml). Výsledná směs se 45 minut míchá při teplotě místnosti a přidá se k ní pevný 3',8-dioxaspiro[bicyklo[3,2,1]oktan-3,1'-cyklobutan]-2'-on (1,04 g, 6,2 mmol). Reakční směs se přes noc míchá při teplotě místnosti a poté rozloží 1M vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové. Výsledná směs se extrahuje dvakrát methylenchloridem. Spojené organické extrakty se promyjí vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a zkoncentruji. Pevný zbytek se trituruje s diethyletherem. Odfiltruje se sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pevné látky (1,47 g, 59 %).

B) Hydroxyamid 3-exo-[4-(4-chlorfenoxy)fenylsulfanylmethyl]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny

K suspenzi 3-exo-[4-(4-chlorfenoxy)fenylsulfanylmethyl ]-8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny (1,47 g, 3,63 mmol) v methylenchloridu (20 ml) se při teplotě místnosti přikape oxalylchlorid (0,8 ml, 9,2 mmol) a Ν,Ν-dimethylformamid (1 kapka). Výsledná směs se míchá přes noc při teplotě místnosti a za sníženého tlaku se z ní odpaří těkavé látky. Zbytek se rozpustí v methylenchloridu (20 ml). Vzniklý roztok se ochladí na 0°C a po kapkách smísí s O-trimethylsilylhydroxylaminem (1,35 ml, 11,0 mmol). Vzniklá směs se 3,5 hodiny míchá při teplotě místnosti, ochladí v ledové lázni a rozloží přídavkem 1M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, přičemž se míchá při 0°C po dobu dalších 30 minut a dále zředí ethylacetátem. Organická vrstva se oddělí, promyje vodou a vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a zkoncentruje. Získá se ·· ·« ·· • · & · t • · · · · • · ··· · · · j • · · · · · ·· <9· ·· · ···· * · • · ·· • · ·« sloučenina uvedená v nadpisu ve formě bílé pěny (1,52 g, 100 %).

C) Hydroxyamid 3-exo-[4-(4-chlorfenoxy)benzensulfonylmethyl] -8-oxabicyklo[3,2,l]oktan-3-karboxylové kyseliny

Oxone(^R) (4,2 g, 8,63 mmol) se přidá k roztoku hydroxyamidu 3-exo-[4-(4-chlorfenoxy)fenylsulfanylmethyl ] -8-oxabicyklo[3,2,1]oktan-3-karboxylové kyseliny (1,52 g, 3,63 mmol) ve směsi vody (30 ml), methanolu (40 ml) a tetrahydrofuranu (12 ml). Výsledná směs se přes noc míchá při teplotě místnosti a zředí vodou. Vodná směs se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Spojené organické extrakty se promyjí vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a zkoncentrují na pěnovítý zbytek. Z tohoto zbytku se chromátografií na silikagelu za použití 4% methanolu v chloroformu jako elučního činidla izoluje sloučenina uvedená v nadpisu (846 mg, 52 %). -^H NMR (DMSO-dg): δ 10,58 (brs, 1H), 8,53 (brs, 1H), 7,76 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,46 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,15 - 7,11 (m, 4H), 4,11 (brs, 2H), 3,40 (s, 2H), 2,22 (d, J = 14,3 Hz, 2H), 1,76 - 1,71 (m, 4H), 1,57 1,55 (m, 2H). MS m/e 450 (M-H)

I

PATENTOVÉ

NÁROKY

Claims

'Lf&o

1. Bicyklické deriváty hydroxamové kyseliny obecného vzorce I (I) kde

Z představuje skupinu >CH₂ nebo >NR¹;

R¹ představuje vodík, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, heteroarylalkylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části nebo skupinu vzorce

O ý- (CH^C-OR² .

kde n představuje celé číslo 1 až 6;

o ,

R představuje vodík nebo alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku;

Q představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, heteroarylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku, aryloxyalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, aryloxyarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí, aryloxyheteroarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové části, arylalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, arylarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí, arylheteroarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové části, arylarylalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, arylarylarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v každé arylových částí, arylarylheteroarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových části a se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové části, heteroarylalkylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, heteroarylarylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části, heteroarylheteroarylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v každé z heteroarylových částí, arylalkoxyalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části a 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alifatických částí, arylalkoxyarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí a 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové části, arylalkoxyheteroarylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové, 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxylové a 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové části, heteroaryloxyalkylskupinu se 2 až 9 atomy uhlíku v heteroarylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, heteroaryloxyarylskupinu se 2 až 9 atomy