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CN1934265B - 使用棒状细菌生产l-氨基酸的方法 - Google Patents

使用棒状细菌生产l-氨基酸的方法 Download PDF

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CN1934265B CN2005800083200A CN200580008320A CN1934265B CN 1934265 B CN1934265 B CN 1934265B CN 2005800083200 A CN2005800083200 A CN 2005800083200A CN 200580008320 A CN200580008320 A CN 200580008320A CN 1934265 B CN1934265 B CN 1934265B
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Abstract

本发明涉及一种生产L-氨基酸的方法，其中进行如下步骤：a)发酵生产所需的L-氨基酸的棒状细菌，其中所述细菌中属于转录调节物的至少一或多个基因被弱化，特别是被消除或者在低水平表达，所述基因选自smtB、cgl1、hspR、cg12、cebR、cg13、gatR、glcR、tcmR、smtB2、dtxR、degA、galR、tipA2、malI、cgl4、arsR、merR、hrcA、glpR2、lexA、ccpA3和degA2；b)浓缩培养基或者细菌细胞中所需的L-氨基酸；及c)分离所述L一氨基酸；并任选地使用其中所需的L-氨基酸的生物合成途径的其它基因被另外增强的细菌，或者使用其中降低所需的L-氨基酸形成的代谢途径被至少部分消除的细菌。

Description

使用棒状细菌生产L-氨基酸的方法 
本发明提供了一种使用棒状细菌生产L-氨基酸、特别是L-赖氨酸和L-甲硫氨酸的方法，所述棒状细菌中选自如下一组的至少一或多个基因被弱化，特别是被消除：smtB、cgl1、hspR、cgl2、cebR、cgl3、gatR、glcR、tcmR、smtB2、dtxR、degA、galR、tipA2、malI、cgl4、arsR、merR、hrcA、glpR2、lexA、ccpA3和degA2。所述基因编码属于转录调节物的蛋白质。 
现有技术
化合物，特别是L-氨基酸、维生素、核苷和核苷酸及D-氨基酸用于人类医药、制药工业、化妆品、食品业及动物营养。 
许多这些化合物是通过发酵棒状细菌菌株、特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)而生产的。由于其的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。所述方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成，例如发酵期间的糖浓度，或通过例如离子交换层析对产物形式进行加工的方法，或微生物本身的固有生产性质。 
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变、选择及突变体选择方法。这些方法产生了对抗代谢物例如赖氨酸类似物S-(2-氨甲基)-半胱氨酸或者甲硫氨酸类似物α-甲基-甲硫氨酸、乙硫氨酸、正亮氨酸、N-乙酰正亮氨酸、S-三氟甲基高半胱氨酸、2-amino-5-heprenoiticacid、硒代甲硫氨酸、methionine sulfoximine、methoxine、1-氨基环戊 烷羧酸有抗性的菌株，或者对于调节重要的代谢物是营养缺陷的并产生L-氨基酸的菌株。 
近年来，通过扩增各个氨基酸生物合成基因并研究对L-氨基酸生产的作用，重组DNA技术的方法也已经用于改良生产L-氨基酸的谷氨酸棒杆菌菌株。 
发明目的 
本发明人提供了使用棒状细菌通过发酵生产L-氨基酸、特别是L-赖氨酸和L-甲硫氨酸的改良方法的新基础。 
发明描述 
当下文提及L-氨基酸时，是指选自如下的一或多种蛋白质氨基酸，包括其盐：L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸。特别优选L-赖氨酸和L-甲硫氨酸。 
蛋白质氨基酸是指在天然蛋白质中出现的氨基酸，即在微生物、植物、动物和人的蛋白质中出现的氨基酸。它们作为蛋白质的结构单位，通过肽键连接在一起。 
在下文提及L-赖氨酸或赖氨酸时不仅是指碱，也包括其盐，例如赖氨酸单盐酸盐或者赖氨酸硫酸盐。 
在下文提及L-甲硫氨酸或者甲硫氨酸时不仅是指碱，也包括其盐，例如甲硫氨酸单盐酸盐或者甲硫氨酸硫酸盐。 
本发明提供了一种使用棒状细菌生产L-氨基酸的方法，特别是使用已经产生L-氨基酸并且其中至少一或多个如下基因是被弱化的、特 别是被消除或者在低水平表达的棒状细菌：smtB、cgl1、hspR、cgl2、cebR、cgl3、gatR、glcR、tcmR、smtB2、dtxR、degA、galR、tipA2、malI、cgl4、arsR、merR、hrcA、glpR2、lexA、ccpA3和degA2。 
本发明进一步提供了一种生产L-氨基酸的方法，其中进行如下步骤： 
a)发酵生产L-氨基酸的棒状细菌，其中选自如下一组的至少一或多个基因被弱化、特别是被消除或者在低水平表达：smtB、cgl1、hspR、cgl2、cebR、cgl3、gatR、glcR、tcmR、smtB2、dtxR、degA、galR、tipA2、malI、cgl4、arsR、merR、hrcA、glpR2、lexA、ccpA3和degA2； 
b)浓缩培养基或者细菌细胞中的所述L-氨基酸； 
c)分离所需的L-氨基酸，部分(＞0-100％)或者全部发酵液的组分和/或生物量任选地保留在终产物中。 
使用的棒状细菌优选在如下的一或多个基因被弱化之前已经生产L-氨基酸、特别是L-赖氨酸和L-甲硫氨酸：smtB、cgl1、hspR、cgl2、cebR、cgl3、gatR、glcR、tcmR、smtB2、dtxR、degA、galR、tipA2、malI、cgl4、arsR、merR、hrcA、glpR2、lexA、ccpA3和degA2。 
已经发现棒状细菌在如下的一或多个基因被弱化之后以改进的方式生产L-氨基酸、特别是L-赖氨酸和L-甲硫氨酸：smtB、cgl1、hspR、cgl2、cebR、cgl3、gatR、glcR、tcmR、smtB2、dtxR、degA、galR、tipA2、malI、cgl4、arsR、merR、hrcA、glpR2、lexA、ccpA3和degA2。 
要被弱化的如下基因的基因产物属于转录调节物：smtB、cgl1、hspR、cgl2、cebR、cgl3、gatR、glcR、tcmR、smtB2、dtxR、degA、 galR、tipA2、malI、cgl4、arsR、merR、hrcA、glpR2、lexA、ccpA3和degA2。 
转录调节物是能通过称作螺旋-转角-螺旋基序的特异性蛋白质结构结合DNA并因此增强或者弱化其它基因的转录的那些蛋白质。在相应棒状细菌中一或多个所述转录调节物的弱化改良L-赖氨酸和L-甲硫氨酸的生产。 
谷氨酸棒杆菌的所述基因的核苷酸序列来自现有技术，并且在许多专利申请中及在国立医学图书馆(National Library of Medicine，Bethesda，MD，USA)的国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)的数据库中也可发现。 
SmtB基因： 
名称：转录阻抑物SmtB 
功能：编码金属硫蛋白的smtA基因表达的金属依赖性阻抑 
      物，调节对多种重金属的细胞应答，ArsR家族 
参考文献：来自EP1108790的序列号no.3056和no.7068，来自 
          WO 01/00805的序列号no.559 
登记号：  AX123140、AX127152和AX066977 
cgl1基因： 
名称：转录调节物Cgl1 
功能：GntR家族的转录调节物 
参考文献：来自EP1108790的序列号no.3251和no.7069 
登记号：AX123335和AX127153 
hspR基因： 
名称：     热激调节蛋白HspR 
功能：     结合编码侣伴蛋白的基因dnaK上游的启动子区域 
参考文献： 来自EP1108790的序列号no.3073和no.7068 
登记号：   AX123157和AX127152 
cgl2基因： 
名称：     转录调节物Cgl2 
功能：     TetR家族的转录调节物 
参考文献： 来自EP1108790的序列号no.1700和no.7064 
登记号：   AX121784和AX127148 
cebR基因： 
名称：     转录调节物CebR 
功能：     调节纤维二糖和纤维三糖的摄取 
参考文献： 来自EP1108790的序列号no.2889和no.7068 
登记号：   AX122973和AX127152 
cgl3基因： 
名称：     转录调节物Cgl3 
功能：     TetR家族的转录调节物 
参考文献： 来自EP1108790的序列号no.3379和no.7069 
登记号：   AX123463和AX127153 
gatR基因： 
名称：     转录调节物GatR 
功能：     galacticol的摄取和利用的Gat操纵子的阻抑物 
参考文献：来自EP1108790的序列号no.129和no.1，来自WO 
          01/00844的序列号no.195 
登记号：  AX120213、AX120085和AX065069 
glcR基因： 
名称：    转录调节物GlcR 
功能：    DeoR家族的转录调节物 
参考文献：来自EP1108790的序列号no.123和no.1 
登记号：  AX120207和AX120085 
tcmR基因： 
名称：    转录阻抑物TcmR 
功能：    调节丁省霉素抗性和输出，TetR家族 
参考文献：来自EP1108790的序列号no.424和no.7060；编码 
          区的第506-606位碱基各自包含在WO 01/00804中 
          的247和249序列中 
登记号：  AX120508和AX127144；AX066343和AX066345 
smtB2基因： 
名称：    转录阻抑物SmtB2 
功能：    编码金属硫蛋白的smtA基因表达的金属依赖性阻抑 
          物，调节对多种重金属的细胞应答，ArsR家族 
参考文献：来自EP1108790的序列号no.292和no.1，来自WO 
          01/00804的序列号no.119 
登记号：  AX120376、AX120085和AX066215 
dtxR基因： 
名称：     白喉毒素阻抑物 
功能：     白喉毒素基因表达的铁结合阻抑物 
参考文献： Oguiza et al.，Journal of Bacteriology 177(2)，465- 
           467(1995) 
登记号：   L35906 
degA基因： 
名称：     降解调节物DegA 
功能：     参与控制酶的失活和降解，LacI家族 
参考文献： 来自EP1108790的序列号no.2240和no.7966，来自 
           WO 01/00844的序列号no.337 
登记号：   AX122324、AX127150和AX065211 
galR基因： 
名称：     半乳糖操纵子阻抑物 
功能：     半乳糖操纵子的半乳糖诱导型阻抑物 
参考文献： 来自EP1108790的序列号no.2309和no.7066，来自 
           WO 01/00844的序列号no.383 
登记号：   AX122393、AX127150和AX065257 
tipA2基因： 
名称：     转录调节物TipA2 
功能：     MerR家族的转录调节物 
参考文献： 来自EP1108790的序列号no.2349和no.7066 
登记号：   AX122433和AX127150 
malI基因： 
名称：        麦芽糖调节子阻抑物 
功能：        麦芽糖诱导型，LacI家族 
参考文献：    来自EP1108790：序列号no.2724第149-601位核 
              苷酸，序列号no.2725第1-346位核苷酸，序列号 
              no.2727第539-1080位核苷酸，和序列号no.7067 
              的全部编码区 
登记号：      AX122808、AX122809、AX122811和AX127151 
cgl4基因： 
名称：        转录调节物Cgl4 
参考文献：    来自EP1108790的序列号no.972、no.7061和 
              no.7062，来自WO 01/00805的序列号no.617的第 
              205-309位核苷酸 
登记号：      AX121056、AX127145、AX127146和AX067035 
arsR基因： 
名称：        转录调节物ArsR 
功能：        调节和表达砷抗性操纵子 
参考文献：    来自EP1108790的序列号no.500和no.7060 
登记号：      AX120584和AX127144 
merR基因： 
名称：        汞抗性操纵子调节物 
功能：        介导汞抗性操纵子的汞依赖性诱导，MerR家族 
参考文献： 来自EP1108790的序列号no.1009和no.7062 
登记号：   AX127146和AX121093 
           hrcA基因： 
名称：     转录阻抑物HrcA 
功能：     热激蛋白的热诱导型转录阻抑物，HrcA家族 
参考文献： 来自EP1108790的序列号no.2513、no.7066和 
           no.7067 
登记号：   AX127150、AX127150和AX127151 
glpR2基因： 
名称：     甘油-3-磷酸调节子阻抑物 
功能：     调节甘油代谢基因，DeoR家族 
参考文献： 来自EP1108790的序列号no.2123和no.7065，来自 
           WO 01/00845的序列号no.57的第881-981位核苷 
           酸 
登记号：   AX122207、AX127149和AX064931 
lexA： 
名称：     SOS调节子阻抑物LexA(EC No.3.4.21.88) 
功能：     介导SOS-诱导的DNA修复蛋白的表达，肽酶家族 
           S24 
参考文献： 来自EP1108790的序列号no.2119和no.7065 
登记号：   AX122203和AX127149 
ccpA3： 
名称：      分解代谢物控制蛋白CcpA3 
功能：      参与碳水化合物降解基因的阻抑及参与过量碳分泌 
            的基因的阳性调节，LacI家族 
参考文献：  来自EP1108790的序列号no.200和no.1 
登记号：    AX120284和AX120085 
degA2： 
名称：      降解调节物DegA2 
功能：      参与控制酶的失活和降解，LacI家族 
参考文献：  来自EP1108790的序列号no.191和no.1 
登记号：    AX120275和AX120085 
根据本发明可以使用指定参考文献中所述的及编码如下基因的序列：smtB、cgl1、hspR、cgl2、cebR、cgl3、gatR、glcR、tcmR、smtB2、dtxR、degA、galR、tipA2、malI、cgl4、arsR、merR、hrcA、glpR2、lexA、ccpA3和degA2。也可以使用所述基因的得自遗传密码简并或者中性功能有义突变的等位基因。 
优选的实施方案在权利要求书中描述。 
文中所用术语“弱化”描述了降低或消除微生物中由相应DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性，通过例如使用弱启动子或使用编码具有低活性的相应酶的基因或等位基因，或失活相应基因或酶或蛋白质，及任选地组合这些措施。 
通过弱化措施，相应蛋白质的活性或浓度一般降低至野生型蛋白质或起始微生物中蛋白质活性或浓度的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或者0-5％。 
蛋白质浓度的降低可以通过1-和2-维蛋白质凝胶分离及随后使用相应的评价软件光学鉴别凝胶中蛋白质浓度而证明。在棒状细菌的情况中制备蛋白质凝胶及鉴别蛋白质的一般方法是Hermann等(Electrophoresis，22：1712-23(2001))所描述的方法。蛋白质浓度也可以使用要被证实的蛋白质的特异性抗体通过Western印迹杂交(Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)及随后使用用于确定浓度的合适软件进行光学评价(Lohaus and Meyer(1998)Biospektrum 5：32-39；Lottspeich，Angewandte Chemie 111：2630-2647(1999))而进行分析。DNA结合蛋白的活性可以利用例如在Bioanalytik(Lottspeich/Zorbas，Spektrum Akademischer Verlag GmbH，Heidelberg，Germany，1998)的教科书中描述及由Wilson等(J.Bacteriol.183：2151-2155(2001))使用的DNA条带迁移分析(DNAband shift assay)(也称作凝胶滞留(gel retardation))测定。DNA结合蛋白对于其它基因表达的作用可以通过多种充分描述的报道基因分析方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)证实。 
本发明提供的微生物能从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉，纤维素或从甘油和乙醇中生产氨基酸。所述微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属(Corynebacterium)。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。 
合适的棒杆菌属、尤其是谷氨酸棒杆菌菌种特别是已知的野生型菌株： 
谷氨酸棒杆菌ATCC 13032 
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870Corynebacterium melassecola ATCC17965Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869和叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020及从中获得的生产L-氨基酸的突变体或菌株，如生产L-赖氨酸的菌株： 
谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709 
黄色短杆菌FERM-P 1708 
乳糖发酵短杆菌FERM-P 1712 
谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463 
谷氨酸棒杆菌FERM-P 6464和 
谷氨酸棒杆菌DSM 5715 
或者例如生产L-甲硫氨酸的菌株： 
谷氨酸棒杆菌ATCC21608。 
标明“ATCC”的菌株可以得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA)。标明“FERM”的菌株可以得自National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology(AIST Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba Ibaraki，Japan)。所述Corynebacterium thermoaminogenes(FERM BP-1539)菌株在US-A-5,250,434中描述。 
为了实现弱化，可以降低或消除基因的表达或者基因产物的调节性质。可任选组合这两种措施。 
基因表达可通过以合适方式培养或者通过遗传改变(突变)基因表达的信号结构而降低。基因表达的信号结构例如是阻抑物基因、激活物基因、操纵基因、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。本领域技术人员可在例如专利申请WO 96/15246、Boyd和Murphy(Journal of Bacteriology 170：5949-5952(1988))、Voskuil和Chambliss(Nucleic Acids Research 26：3584-3590(1998)、Pátek等(Microbiology 142：1297-309(1996)和Journal of Biotechnology 104：311-323(2003))及已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Knippers(″Molekulare Genetik″，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)或者Winnacker(″Gene und Klone″，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)的教科书中发现这些信息。 
基因表达的定向调节的一个实例是将需弱化的基因克隆在可以通过加入一定量的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)而诱导的启动子的控制下，所述启动子例如trc启动子或者tac启动子。适于这个目的的载体例如是大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pXK99E(WO0226787；根据布达佩斯条约于2001年7月31日作为DH5alpha/pXK99E保藏在德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlungfür Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ，Braunschweig，Germany)，保藏号DSM14440)或者pVWEx2(Wendisch，Ph.D.论文，Berichte des Forschungszentrums Jülich，Jül-3397，ISSN 0994-2952，Jülich，Germany(1997))，这些载体使得克隆的基因在谷氨酸棒杆菌中IPTG依赖性表达。 
这种方法例如已经在专利申请说明书WO0226787中用于通过将载体pXK99EdeaD整合进谷氨酸棒杆菌的基因组中调节deaD基因的表达，及Simic等(Applied and Environmental Microbiology 68：3321- 3327(2002))用于通过将载体pK18mobglyA′整合进谷氨酸棒杆菌中调节glyA基因的表达。 
特异性降低基因表达的另一种方法是反义技术，其中将短的寡脱氧核糖核苷酸或者载体导入靶细胞中以合成较长的反义RNA。所述反义RNA能结合特异mRNA的互补节段并降低其稳定性或者阻断其可翻译性。本领域技术人员在Srivastava等(Applied EnvironmentalMicrobiology 2000Oct；66(10)：4366-4371)中可发现这方面的实例。 
本领域已知导致酶蛋白催化性质改变或降低的突变。可以提及的例子包括Qiu和Goodman(Journal of Biological Chemistry 272：8611-8617(1997))、Sugimoto等(Bioscience Biotechnology andBiochemistry 61：1760-1762(1997))和 
Figure S05808320020060920D000141
(″Die Threonindehydrataseaus  Corynebacterium glutamicum：Aufhebung der allosterischenRegulation und Struktur des Enzyms″，Berichte des ForschungszentrumsJülich，Jül-2906，ISSN09442952，Jülich，Germany，1994)所进行的研究。摘要可见于已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Hagemann(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)的教科书。 
可以考虑的突变是转换、颠换、插入和缺失。根据氨基酸取代对酶活性的作用，使用术语“错义突变”或“无义突变”。在基因中插入或者缺失至少一个碱基对导致移码突变，结果掺入不正确的氨基酸或者导致翻译过早中断。缺失几个密码子典型地导致酶活性的完全丧失。关于产生这种突变的指导为本领域所已知，可见于已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Knippers(″Molekulare Genetik″，6thedition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker(″Gene und Klone″，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim， Germany，1990)或者Hagemann(″Allgemeine Genetik″，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1986)的教科书。 
突变谷氨酸棒杆菌基因的常用方法是Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9，84-87(1991))所描述的基因破坏(genedisruption)和基因置换(gene replacement)方法。 
在基因破坏方法中，例如将所述基因的编码区的主要部分克隆进能在宿主(典型为大肠杆菌)中复制但在谷氨酸棒杆菌中不能复制的质粒载体中。合适的载体是例如pSUP301(Simon et al.，Bio/Technology1，784-791(1983))、pK18mob、pK19mob、pK18mobsacB或者pK 19mobsacB( et al.，Gene 145，69-73(1994))、pGEM-T(Promega Corporation，Madison，WI，USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，Journal of Biological Chemistry 269：32678-84；美国专利5,487,993)、 
Figure S05808320020060920D000152
(Invitrogen，Groningen，Netherlands；Bernardet al.，Journal of Molecular Biology，234：534-541(1993))或者pEM1(Schrumpf et al.，1991，Journal of Bacteriology 173：4510-4516)。然后将含有所述基因编码区的主要部分的质粒载体通过接合或者转化转移至所需的谷氨酸棒杆菌菌株中。所述接合方法例如 et al.(Journal of Bacteriology 172：1663-1666(1990)和Applied andEnvironmental Microbiology 60，756-759(1994))所描述。转化方法例如Thierbach等(Applied Microbiology and Biotechnology 29，356-362(1988))、Dunican和Shivnan(Bio/Technology 7，1067-1070(1989))及Tauch等(FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))所描述。在通过交换同源重组后，所述要研究的基因的编码区被载体序列中断，获得分别缺少3’和5’末端的两个不完整的等位基因。这种方法已经例如由Fitzpatrick等(Applied Microbiology and Biotechnology 42，575-580(1994))用于消除谷氨酸棒杆菌的recA基因。 
在基因置换方法中，突变例如缺失、插入或者碱基取代是在体外在所述要研究的基因中产生的。产生的等位基因然后克隆进在谷氨酸棒杆菌中不复制的载体中，然后将该载体通过转化或者接合转移至所需的谷氨酸棒杆菌宿主中。在通过实现整合的首次交换及实现靶基因或者靶序列切除的二次交换的同源重组后，掺入突变或者等位基因。这种方法在Scharzer和Pühler(Bio/Technology 9：84-87(1991)中描述，并且已经由例如Peters-Wendisch等(Microbiology 144，915-927(1998))用于通过缺失而消除谷氨酸棒杆菌的pyc基因或者由Wehmeier等(Microbiology 144：1853-1862(1988))用于在谷氨酸棒杆菌的rel基因中插入缺失。 
在谷氨酸棒杆菌中进行遗传工程的多种方法的综述见Kirchner和Tauch(Journal ofBiotechnology 104：287-299(2003)所述。 
以此方式可以在选自如下的一或多个基因中掺入缺失、插入或者碱基取代：smtB、cgl1、hspR、cgl2、cebR、cgl3、gatR、glcR、tcmR、smtB2、dtxR、degA、galR、tipA2、malI、cgl4、arsR、merR、hrcA、glpR2、lexA、ccpA3和degA2。 
除了弱化选自smtB、cgl1、hspR、cgl2、cebR、cgl3、gatR、glcR、tcmR、smtB2、dtxR、degA、galR、tipA2、malI、cgl4、arsR、merR、hrcA、glpR2、lexA、ccpA3和degA2的一或多个基因之外，增强特别是过表达、或者弱化特别是消除或降低研究中的生物合成途径、糖酵解、添补反应途径、柠檬酸循环、磷酸戊糖循环、氨基酸输出的一或多种酶及任选调节蛋白的表达，对于L-氨基酸的生产也是有益的。 
文中所用术语“增强”描述了微生物中由相应DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性或浓度增加，通过例如增加基因的拷贝 数、使用强启动子或者使用编码具有高水平活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因进行，任选组合这些措施。 
通过增强措施，特别是过表达，相应蛋白质的活性或浓度相对于野生型蛋白质或者起始微生物中所述蛋白质的活性或浓度一般增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，直至最大1000％或2000％。 
通常优选使用内源基因。术语“内源基因”或者“内源核苷酸序列”是指在一个种群中存在的基因或者核苷酸序列。 
因此，对于L-赖氨酸的生产而言，除了弱化选自smtB、cgl1、hspR、cgl2、cebR、cgl3、gatR、glcR、tcmR、smtB2、dtxR、degA、galR、tipA2、malI、cgl4、arsR、merR、hrcA、glpR2、lexA、ccpA3和degA2的一或多个基因之外，也可以增强特别是过表达生产赖氨酸的基因或者等位基因组中的一或多个基因。“生产赖氨酸的基因或等位基因”是指其增强/过表达能使得赖氨酸生产得以改良的那些基因或等位基因，优选内源开放读框、基因或等位基因。 
这些基因包括如下开放读框、基因或等位基因：accBC、accDA、cstA、cysD、cysE、cysH、cysK、cysN、cysQ、dapA、dapB、dapC、dapD、dapE、dapF、ddh、dps、eno、gap、gap2、gdh、gnd、lysC、lysCFBR、lysE、msiK、opcA、oxyR、ppc、ppcFBR、pgk、pknA、pknB、pknD、pknG、ppsA、ptsH、ptsI、ptsM、pyc、pyc P458S、sigC、sigD、sigE、sigH、sigM、tal、thyA、tkt、tpi、zwa1、zwf和zwfA243T，在表1中汇编并解释。 
表1
生产赖氨酸的基因和等位基因
Figure S05808320020060920D000181
  EC 2.6.1.17  (N-琥珀酰-二氨基庚二酸转氨酶)   EP1136559
  dapD   四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶  (tetrahydrodipicolinate succinylase)  EC 2.3.1.117   EP1108790  WO0100843  Wehrmann et al.Journal of  Bacteriology    180：3159-  3165(1998)   AX127146  AX063757  AJ004934
  dapE   N-琥珀酰-二氨基庚二酸去琥珀酰酶  EC 3.5.1.18   EP1108790  WO0100843  Wehrmann et al.Microbiology  140：3349-3356(1994)   AX127146  AX063749  X81379
  dapF   二氨基庚二酸差向异构酶  EC 5.1.1.7   EP1108790  WO0100843  EP1085094   AX127149  AX063719  AX137620
  ddh   二氨基庚二酸脱氢酶  EC 1.4.1.16   EP1108790  WO0100843  Ishino et al.，Nucleic Acids  Research 15：3917-3917(1987)  JP1997322774  JP1993284970  Kim et  al.，Journal  of  Microbiology    and  Biotechnology    5：250-  256(1995)   AX127152  AX063759  Y00151     E14511  E05776  D87976
  dps   DNA保护蛋白  (在蛋白质饥饿期间起保护作用)   EP1108790   AX127153
  eno   烯醇化酶  EC 4.2.1.11   EP1108790  WO0100844  EP1090998  Hermann    et    al.，  Electrophoresis 19：3217-3221  (1998)   AX127146  AX064945  AX136862
  gap   甘油醛-3-磷酸脱氢酶  EC 1.2.1.12   EP1108790  WO0100844  Eikmanns et al.，Journal of  Bacteriology    174：6076-  6086(1992)   AX127148  AX064941  X59403
  gap2   甘油醛-3-磷酸脱氢酶  EC 1.2.1.12  (甘油醛-3-磷酸脱氢酶2)   EP1108790  WO0100844   AX127146  AX064939
  gdh   谷氨酸脱氢酶  EC 1.4.1.4   EP1108790  WO0100844  Boermann et al.，Molecular  Microbiology 6：317-326(1992)   AX127150  AX063811  X59404  X72855
  gnd   6-磷酸葡糖酸脱氢酶  EC 1.1.1.44   EP1108790     WO0100844   AX127147  AX121689  AX065125
  pyc   丙酮酸羧化酶  EC 6.4.1.1   WO9918228  Peters-Wendisch  et  al.，  Microbiology  144：915-927  (1998)   A97276  Y09548
  pyc  P458S   丙酮酸羧化酶  EC 6.4.1.1  氨基酸取代P458S   EP1108790
  sigC   Sigma因子C  EC 2.7.7.6  (胞质外功能替代sigma因子C)  (extracytoplasmic function alternative  sigma factor C)   EP1108790   AX120368  AX120085
  sigD   RNA聚合酶sigma因子D  EC 2.7.7.6  (RNA聚合酶sigma因子)   EP1108790   AX120753  AX127144
  sigE   Sigma因子E  EC 2.7.7.6  (胞质外功能替代sigma因子E)   EP1108790   AX127146  AX121325
  sigH   Sigma因子H  EC 2.7.7.6  (sigma因子SigH)   EP1108790   AX127145  AX120939
  sigM   Sigma因子M  EC 2.7.7.6  (sigma因子SigM)   EP1108790   AX 123500  AX127153
  tal   转醛醇酶  EC 2.2.1.2   WO0104325   AX076272
  thyA   胸苷酸合酶  EC 2.1.1.45   EP1108790   AX121026  AX127145
  tkt   转酮醇酶  EC 2.2.1.1   Ikeda et al.，NCBI   AB023377
  tpi   丙糖-磷酸异构酶  EC 5.3.1.1   Eikmanns  ，Journal  of  Bacteriology 174：6076-6086  (1992)   X59403
  zwa1   细胞生长因子1  (生长因子1)   EP1111062   AX133781
  zwf   葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶  EC 1.1.1.49   EP1108790     WO0104325   AX127148  AX121827  AX076272
  zwf  A213T   葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶  EC 1.1.1.49  氨基酸取代A213T   EP1108790
除了弱化选自smtB、cgl1、hspR、cgl2、cebR、cgl3、gatR、glcR、tcmR、SmtB2、dtxR、degA、galR、tipA2、malI、cgl4、arsR、merR、hrcA、glpR2、lexA、ccpA3和degA2的一或多个基因之外，同时弱化特别是降低选自对于生长或者赖氨酸生产非必需的基因或等 位基因组中的一或多个基因的表达，对于L-赖氨酸的生产也是有益的。 
这些基因包括在表2中汇总并解释的如下开放读框、基因或等位基因：aecD、ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、fda、gluA、gluB、gluC、gluD、luxR、luxS、lysR1、lysR2、lysR3、menE、mqo、pck、pgi、poxB和zwa2。 
表2
对于赖氨酸生产非必需的基因和等位基因
  基因名称   编码的酶或蛋白质的名称   参考文献   登记号
  aecD   betaC-S裂合酶  EC 2.6.1.1   Rossol  et  al.，Journal  of  Bacteriology  174(9)：2968-77  (1992)   M89931
  ccpA1   分解代谢物控制蛋白  (分解代谢物控制蛋白A1)   WO0100844  EP1108790  WO02/18419   AX065267  AX127147
  ccpA2   分解代谢物控制蛋白  (分解代谢物控制蛋白A2)   WO0100844  EP1108790   AX065267  AX121594
  citA   传感蛋白激酶CitA   EP1108790   AX120161
  citB   转录调节物CitB   EP1108790   AX120163
  citE   柠檬酸裂合酶  EC 4.1.3.6   WO0100844  EP1108790   AX065421  AX127146
  fda   果糖二磷酸醛缩酶  EC 4.1.2.13  (果糖1，6-二磷酸醛缩酶)   von der Osten et al.，Molecular  Microbiology 3(11)：1625-37  (1989)   X17313
  gluA   谷氨酸转运ATP结合蛋白   Kronemeyer et al.，Journal of  Bacteriology  177(5)：1152-8  (1995)   X81191
  gluB   谷氨酸结合蛋白   Kronemeyer et al.，Journal of  Bacteriology  177(5)：1152-8  (1995)   X81191
  gluC   谷氨酸转运通透酶  (谷氨酸转运系统通透酶)   Kronemeyer et al.，Journal of  Bacteriology  177(5)：1152-8  (1995)   X81191
  gluD   谷氨酸转运通透酶  (谷氨酸转运系统通透酶)   Kronemeyer et al.，Journal of  Bacteriology  177(5)：1152-8  (1995)   X81191
  luxR   转录调节物LuxR   WO0100842  EP1108790   AX065953  AX123320
  luxS   组氨酸激酶LuxS   EP1108790   AX123323  AX127153
  lysR1   转录调节物LysR1   EP1108790   AX064673  AX127144
  lysR2   转录激活物LysR2  (转录调节物LysR2)   EP1108790   AX123312
  lysR3   转录调节物LysR3   WO0100842  EP1108790   AX065957  AX127150
  menE   O-琥珀酰苯甲酸CoA连接酶  EC 6.2.1.26  (O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶)   WO0100843  EP1108790   AX064599  AX064193  AX127144
  mqo   苹果酸-醌-氧化还原酶   Molenaar et al.，Eur.Journal of  Biochemistry  1；254(2)：395-  403(1998)   AJ224946
  pck   磷酸烯醇丙酮酸羧激酶   WO0100844  EP-A-1094111   AJ269506  AX065053
  pgi   葡萄糖-6-磷酸异构酶  EC 5.3.1.9   EP1087015  EP1108790  WO01/07626   AX136015  AX127146
  poxB   丙酮酸氧化酶  EC 1.2.3.3   WO0100844  EP1096013   AX064959  AX137665
  zwa2   细胞生长因子2  (生长因子2)   EP1106693  EP1108790   AX113822  AX127146
除了例如通过弱化选自yaeC、abc和yaeE组的一或多个基因而弱化从周围介质中输入甲硫氨酸之外，增强特别是过表达选自生产甲硫氨酸的基因或等位基因组中的一或多个基因对于例如L-甲硫氨酸的生产是有益的。“生产甲硫氨酸的基因或等位基因”是指其增强/过表达能改良甲硫氨酸生产的所有的基因或等位基因，优选内源开放读框、基因或等位基因。 
这些基因包括如下开放读框、基因或等位基因：accBC、accDA、aecD、cstA、cysD、cysE、cysH、cysK、cysN、cysQ、dps、eno、fda、gap、gap2、gdh、gnd、glyA、hom、homFBR、lysC、lysCFBR、metA、metB、metE、metH、metY、msiK、opcA、oxyR、ppc、ppcFBR、pgk、pknA、pknB、pknD、pknG、ppsA、ptsH、ptsI、ptsM、pyc、pyc P458S、sigC、sigD、sigE、sigH、sigM、tal、thyA、tkt、tpi、zwa1、zwf和zwfA213T，这些在表3中汇总并解释。 
表3
生产甲硫氨酸的基因和等位基因
  EC 1.2.1.12  (甘油醛-3-磷酸脱氢酶2)   WO0100844   AX064939
  gdh   谷氨酸脱氢酶  EC 1.4.1.4   EP1108790  WO0100844  Boermann et al.，Molecular  Microbiology  6：317-326  (1992)   AX127150  AX063811  X59404     X72855
  glyA   甘氨酸/丝氨酸羟甲基转移酶  EC 2.1.2.1   EP1108790   AX127146  AX121194
  gnd   6-磷酸葡糖酸脱氢酶  EC 1.1.1.44   EP1108790     WO0100844   AX127147  AX121689  AX065125
  hom   高丝氨酸脱氢酶  EC 1.1.1.3   Peoples  et  al.，Molecular  Microbiology 2：63-72(1988)   Y00546
  homFBR   反馈抗性(fbr)高丝氨酸脱氢酶  EC 1.1.1.3  (高丝氨酸脱氢酶fbr)   Reinscheid et al.，Journal of  Bacteriology  173：3228-30  (1991)
  lysC   天冬氨酸激酶  EC 2.7.2.4   EP1108790  WO0100844  Kalinowski et al.，Molecular  Microbiology 5：1197-204  (1991)   AX120365  AX063743  X57226
  lysCFBR   反馈抗性(fbr)天冬氨酸激酶  EC 2.7.2.4  (天冬氨酸激酶fbr)   见表2
  metA   高丝氨酸乙酰转移酶  EC 2.3.1.31   Park et al.，Molecular Cells  8：286-94(1998)   AF052652
  metB   胱硫醚γ-裂合酶  EC 4.4.1.1  (胱硫醚γ-合酶)   Hwang  et  al.，Molecular  Cells 9：300-308(1999)   AF126953
  metE   高半胱氨酸甲基转移酶  EC 2.1.1.14   EP1108790   AX127146  AX121345
  metH   高半胱氨酸甲基转移酶(维生素B12-依  赖性)  EC 2.1.1.14   EP1108790   AX127148  AX121747
  metY   乙酰高丝氨酸硫水解酶  (acetylhomoserine sulfhydrolase)   EP1108790   AX120810  AX127145
  msiK   糖输入蛋白  (多种糖输入蛋白)   EP1108790   AX120892
  opcA   葡萄糖-6-磷酸脱氢酶  (葡萄糖-6-磷酸脱氢酶亚基)   WO0104325   AX076272
  oxyR   转录调节物  (转录调节物)   EP1108790   AX122198  AX127149
  ppcFBR   反馈抗性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶  EC 4.1.1.31   EP0723011  WO0100852
  ppc   磷酸烯醇丙酮酸羧化酶  EC 4.1.1.31   EP1108790     O′Reagan  et  al.，Gene  77(2)：237-251(1989)   AX127148  AX123554  M25819
  pgk   磷酸甘油酸激酶   EP1108790   AX121838
  EC 2.7.2.3    WO0100844  Eikmanns  ，Journal    of  Bacteriology  174：6076-6086  (1992)   AX127148  AX064943  X59403
  pknA   蛋白激酶A   EP1108790   AX120131  AX120085
  pknB   蛋白激酶B   EP1108790   AX120130  AX120085
  pknD   蛋白激酶D   EP1108790   AX127150  AX122469  AX122468
  pknG   蛋白激酶G   EP1108790   AX127152  AX123109
  ppsA   磷酸烯醇丙酮酸合酶  EC 2.7.9.2   EP1108790   AX127144  AX120700  AX122469
  ptsH   磷酸转移酶系统蛋白H  EC 2.7.1.69  (磷酸转移酶系统成分H)   EP1108790     WO0100844   AX122210  AX127149  AX069154
  ptsI   磷酸转移酶系统酶I  EC 2.7.3.9   EP1108790   AX122206  AX127149
  ptsM   葡萄糖-特异性磷酸转移酶系统酶II  EC 2.7.1.69  (葡萄糖-磷酸转移酶系统酶II)   Lee  et  al.，FEMS  Microbiology Letters 119(1-  2)：137-145(1994)   L18874
  pyc   丙酮酸羧化酶  EC 6.4.1.1   WO9918228  Peters-Wendisch  et al.，  Microbiology  144：915-927  (1998)   A97276  Y09548
  pyc  P458S   丙酮酸羧化酶  EC 6.4.1.1  氨基酸取代P458S   EP1108790
  sigC   Sigma因子C  EC 2.7.7.6  (胞质外功能替代sigma因子C)   EP1108790   AX120368  AX120085
  sigD   RNA聚合酶sigma因子D  EC 2.7.7.6  (RNA聚合酶sigma因子)   EP1108790   AX120753  AX127144
  sigE   Sigma因子E  EC 2.7.7.6  (胞质外功能替代sigma因子E)   EP1108790   AX127146  AX121325
  sigH   Sigma因子H  EC 2.7.7.6  (sigma因子SigH)   EP1108790   AX127145  AX120939
  sigM   Sigma因子M  EC 2.7.7.6  (sigma因子SigM)   EP1108790   AX123500  AX127153
  tal   转醛醇酶  EC 2.2.1.2   WO0104325   AX076272
  thyA   胸苷酸合酶  EC 2.1.1.45   EP1108790   AX121026  AX127145
  tkt   转酮醇酶  EC 2.2.1.1   Ikeda et al.，NCBI   AB023377
  tpi   丙糖-磷酸异构酶  EC 5.3.1.1   Eikmanns  ，Journal  of  Bacteriology 174：6076-6086  (1992)   X59403
  zwa1   细胞生长因子1  (生长因子1)   EP1111062   AX133781
  zwf   葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶  EC 1.1.1.49   EP1108790     WO0104325   AX127148  AX121827  AX076272
  zwf  A213T   葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶  EC 1.1.1.49  氨基酸取代A213T   EP1108790
除了例如通过弱化选自yaeC、abc和yaeE组的一或多个基因而弱化从周围介质中输入甲硫氨酸之外，同时弱化特别是消除或者降低选自对于生长或者甲硫氨酸生产非必需的基因或者等位基因组中的一或多个基因的表达，对于L-甲硫氨酸的生产是有益的。 
这些基因包括如下开放读框、基因或等位基因：brnQ、ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、ddh、gluA、gluB、gluC、gluD、luxR、luxS、lysR1、lysR2、lysR3、menE、metD、metK、pck、pgi、poxB和zwa2，在表4中汇总并解释。 
表4
对于甲硫氨酸生产非必需的基因和等位基因
  基因名称   编码的酶或蛋白质的名称   参考文献   登记号
  brnQ   支链氨基酸载体蛋白  (支链氨基酸转运系统载体蛋白)   Tauch et al.，Archives of  Microbiology 169(4)：303-12  (1998)  WO0100805  EP1108790   M89931  AX066841  AX127150
  ccpA1   分解代谢物控制蛋白  (分解代谢物控制蛋白A1)   WO0100844  EP1108790   AX065267  AX127147
  ccpA2   分解代谢物控制蛋白  (分解代谢物控制蛋白A2)   WO0100844  EP1108790   AX065267  AX121594
  citA   传感蛋白激酶CitA   EP1108790   AX120161
  citB   转录调节物CitB   EP1108790   AX120163
  citE   柠檬酸裂合酶  EC 4.1.3.6   WO0100844  EP1108790   AX065421  AX127146
  ddh   二氨基庚二酸脱氢酶  EC 1.4.1.16   Ishino et al.，Nucleic Acids  Research 15：3917(1987)  EP1108790   S07384  AX127152
  gluA   谷氨酸转运ATP-结合蛋白   Kronemeyer et al.，Journal  of Bacteriology 177(5)：1152-  8(1995)   X81191
  gluB   谷氨酸结合蛋白   Kronemeyer et al.，Journal  of Bacteriology 177(5)：1152-  8(1995)   X81191
  gluC   谷氨酸转运通透酶  (谷氨酸转运系统通透酶)   Kronemeyer et al.，Journal  of Bacteriology 177(5)：1152-  8(1995)   X81191
  gluD   谷氨酸转运通透酶  (谷氨酸转运系统通透酶)   Kronemeyer et al.，Journal  of Bacteriology 177(5)：1152-  8(1995)   X81191
  luxR   转录调节物LuxR   WO0100842  EP1108790   AX065953  AX123320
  luxS   组氨酸激酶LuxS   EP1108790   AX123323  AX127153
  lysR1   转录调节物LysR1   EP1108790   AX064673  AX127144
  lysR2   转录激活物LysR2  (转录调节物LysR2)   EP1108790   AX123312
  lysR3   转录调节物LysR3   WO0100842  EP1108790   AX065957  AX127150
  menE   O-琥珀酰苯甲酸CoA连接酶  EC 6.2.1.26  (O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶)   WO0100843  EP1108790   AX064599  AX064193  AX127144
  metD   转录调节物MetD   EP1108790   AX123327  AX127153
  metK   甲硫氨酸-腺苷转移酶  EC 2.5.1.6  (S-腺苷甲硫氨酸合成酶)   WO0100843  EP1108790   AX063959  AX127148
  pck   磷酸烯醇丙酮酸羧激酶   WO0100844   AJ269506  AX065053
  pgi   葡萄糖-6-磷酸异构酶     EC 5.3.1.9   EP1087015     EP1108790   AX136015     AX127146
  poxB   丙酮酸氧化酶  EC 1.2.3.3   WO0100844  EP1096013   AX064959  AX137665
  zwa2   细胞生长因子2  (生长因子2)   EP1106693  EP1108790   AX113822  AX127146
最后，除了弱化选自smtB、cgl1、hspR、cgl2、cebR、cgl3、gatR、glcR、tcmR、smtB2、dtxR、degA、galR、tipA2、malI、cgl4、arsR、merR、hrcA、glpR2、lexA、ccpA3和degA2的一或多个基因之外，消除非所需的二级反应对于氨基酸的生产是有益的 (Nakayama：″Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms″，in：Overproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，London，UK，1982)。 
本发明还提供了根据本发明生产的微生物，其可以根据L-氨基酸生产目的而连续生产或者通过分批方法或者通过补料分批方法或者重复补料分批方法不连续地生产。已知的培养方法在Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die B ioverfahrenstechnik(GustavFischer Verlag，Stuttgart，1991))或者Storhas(Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))的教科书中描述。 
所用培养基必须以适当方式符合所述研究菌株的需求。关于多种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会(American Society forBacteriology)的“Manual of Methods for General Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)。 
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油、葵花油、落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或以混合形式使用。 
可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或以混合形式使用。 
可使用的磷源包括磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。可将适当前体加入培养基中。所述物质可以单批形式或在培养期间适当补加。 
为了控制培养物的pH值，可以适当使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸。为了控制泡沫产生，可以使用抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了保持质粒的稳定性，具有选择性作用的适当物质例如抗生素可加入培养基中。为维持有氧条件，氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中。培养温度通常在20℃-45℃，优选25℃-40℃。持续培养直至所需的产物形成最大量。此目的通常在10-160小时范围内达到。 
使用本发明的方法可以使得细菌或者发酵方法在产物浓度(每单位体积的产物)、产物产量(每单位消耗的碳形成的产物)、产物形成(每单位体积和时间形成的产物)或者其它方法参数及这些参数组合的方面的性能得以改良至少0.5％、至少1％或者至少2％。 
确定L-氨基酸的方法为本领域所已知。所述分析可以如Spackman等(Analytical Chemistry，30，(1958)，1190)所述通过阴离子交换层析及随后的茚三酮衍生化进行，或者可以通过反相HPLC进行，如Lindroth等(Analytical Chemistry(1979)51：1167-1174)所述。本领域技术人员在Ashman等(in：Tschesche(ed.)，Modern Methods inProtein Chemistry.155-172，de Gruyter，Berlin 1985)中也可发现相关信息。 
本发明的方法用于通过发酵生产L-赖氨酸或者L-甲硫氨酸。 
终产物中L-赖氨酸或者L-甲硫氨酸的浓度可以任选通过加入L-赖氨酸或者L-甲硫氨酸而调节至所需的数值。 
本发明在下文通过实施例进行解释。 
实施例1：
制备malI基因整合诱变的整合载体 
通过Eikmanns等(Microbiology 140：1817-1828(1994))的方法，从菌株ATCC 13032中分离染色体DNA。 
基于谷氨酸棒杆菌malI基因的已知序列，选择如下寡核苷酸进行聚合酶链反应： 
malI-int1： 
5`TCG AAT CCC TTC TTC TTG G 3` 
malI-int2： 
5`TTA GGA CCG GCG ATA TAG G 3` 
示出的引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，PCR反应使用来自Boehringer Mannheim的Taq聚合酶(德国，产品描述TaqDNA聚合酶，产品No.1146165)根据Innis等所述的标准PCR方法进行(PCR protocols.A guide to methods and applications，1990，Academic Press)。借助于聚合酶链反应，引物使得malI基因的一个大小为338bp的内部片段得以扩增。由此扩增的产物通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳而检测。 
使用Invitrogen公司的TOPO TA克隆试剂盒(Carlsbad，CA，USA；Catalog Number K4500-01)，将扩增的DNA片段连接入载体pCR2.1-TOPO(Mead et al.(1991)，Bio/Technology 9：657-663)。 
然后用所述连接批次物电穿孔大肠杆菌菌株TOP10(Hanahan，in：DNA Cloning.A Practical Approach，Vol.I，IRL-Press，Oxford，Washington DC，USA，1985)。将转化批次物铺板于补加了50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular Cloning：a LaboratoryManual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989)上，选择携带质粒的细胞。借助于Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过用限 制酶EcoRI限制及随后的琼脂糖凝胶(0.8％)电泳进行检测。该质粒称作pCR2.1malIint，示于图1。 
实施例2：
整合诱变菌株DSM 16835的malI基因 
通过Tauch等(FEMS Microbiological Letters，123：343-347(1994))所述电穿孔方法将实施例1中所述的载体pCR2.1malIint电穿孔进谷氨酸棒杆菌DSM 16835中。菌株DSM 16835是一种AEC-抗性赖氨酸生产菌株，该菌株在Menkel等(Applied and EnvironmentalMicrobiology 55(3)：684-688(1989)中以名称MH20-22B加以描述。载体pCR2.1malIint在DSM 16835中不能独立复制，只有整合进DSM16835的染色体中时才保留在细胞中。将电穿孔批次物铺板于补加了15mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)上，选择pCR2.1malIint整合进染色体中的克隆。 
将选择的具有质粒pCR2.1malIint插入DSM 16835的染色体malI基因中的卡那霉素抗性克隆称作DSM16835::pCR2.1malIint。 
实施例3：
生产赖氨酸 
将在实施例2中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM16835::pCR2.1malIint在适于赖氨酸生产的营养培养基中培养，测定培养上清中赖氨酸含量。 
为此，将菌株首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂(具有卡那霉素(25mg/l)的脑心琼脂)平板上保温24小时。从这个琼脂平板培养物开 始，接种预培养物(10ml培养基于100ml Erlenmeyer培养瓶中)。CgIII完全培养基用作预培养的培养基。 
Cg III培养基 
NaCl                    2.5g/l 
Bacto-胨                10g/l 
Bacto-酵母提取物        10g/l 
葡萄糖(单独高压灭菌)    2％(w/v) 
pH调节为pH 7.4 
向其中加入卡那霉素(25mg/l)。在摇床上在33℃以240rpm保温预培养物16小时。以此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(660nm)是0.1OD。培养基MM用作主培养基。 
MM培养基 
CSL(玉米浆)                5g/l 
MOPS(吗啉代丙烷磺酸)       20g/l 
葡萄糖(单独高压灭菌)       50g/l 
盐： 
(NH4)2SO4                  25g/l 
KH2PO4                     0.1g/l 
MgSO4*7H2O                 1.0g/l 
CaCl2*2H2O                 10mg/l 
FeSO4*7H2O                 10mg/l 
MnSO4*H2O                  5.0mg/l 
生物素(过滤灭菌)           0.3mg/l 
硫胺素*HCl(过滤灭菌)       0.2mg/l 
亮氨酸(过滤灭菌)           0.1g/l 
CaCO3                      25g/l 
用氨水将CSL、MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液，以及干燥的高压灭菌的CaCO3。 
在具有档板的100ml Erlenmeyer培养瓶中的10ml体积进行培养。加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％湿度下进行培养。 
72小时后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)确定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(Hamburg，Germany)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸的量。 
结果示于表1。 
表1 
  菌株   OD(660nm)   赖氨酸HCl(g/l)
  DSM16835   7.4   12.84
  DSM16835::pCR2.1malIint   7.7   14.1
实施例4：
制备用于gatR基因整合诱变的整合载体
通过Eikmanns等(Microbiology 140：1817-1828(1994))的方法从菌株ATCC 13032中分离染色体DNA。 
基于谷氨酸棒杆菌gatR基因的已知序列，选择如下寡核苷酸进行聚合酶链反应： 
gatR-int1： 
5`AAG AGG CGT TGT GTA CTG C 3` 
gatR-int2： 
5`TGG TCA AAC TCC TCA ATC G 3` 
示出的引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，PCR反应使用来自Boehringer Mannheim的Taq聚合酶(德国，产品描述TaqDNA聚合酶，产品No.1146165)根据Innis等所述的标准PCR方法进行(PCR protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)。借助于聚合酶链反应，引物使得gatR基因的一个大小为466bp的内部片段得以扩增。由此扩增的产物通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳而检测。 
使用Invitrogen公司的TOPO TA克隆试剂盒(Carlsbad，CA，USA；Catalog Number K4500-01)将扩增的DNA片段连接入载体pCR2.1-TOPO(Mead et al.(1991)，Bio/Technology 9：657-663)。 
然后用所述连接批次物电穿孔进大肠杆菌菌株TOP10(Hanahan，in：DNA Cloning.A Practical Approach，Vol.I，IRL-Press，Oxford，Washington DC，USA，1985)。将转化批次物铺板于补加了50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular Cloning：a LaboratoryManual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989)上，选择携带质粒的细胞。借助于Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过用限制酶EcoRI限制及随后的琼脂糖凝胶(0.8％)电泳进行检测。该质粒称作pCR2.1gatRint，示于图2。 
实施例5：
整合诱变菌株DSM 16835的gatR基因
通过Tauch等(FEMS Microbiological Letters，123：343-347(1994))所述电穿孔方法将实施例4中所述的载体pCR2.1gatRint电穿孔进谷氨酸棒杆菌DSM 16835中。菌株DSM 16835是一种AEC-抗性赖氨酸生产菌株，该菌株在Menkel等(Applied and Environmental Microbiology 55(3)：684-688(1989)中以名称MH20-22B加以描述。载体pCR2.1gatRint在DSM 16835中不能独立复制，只有整合进DSM16835的染色体中时才保留在细胞中。将电穿孔批次物铺板于补加了15mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)上，选择pCR2.1gatRint整合进染色体中的克隆。 
将选择的具有实施例4所述质粒pCR2.1gatRint插入DSM 16835的染色体gatR基因中的卡那霉素抗性克隆称作DSM16835::pCR2.1gatRint。 
实施例6：
生产赖氨酸 
将在实施例5中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM16835::pCR2.1gatRint在适于赖氨酸生产的营养培养基中培养，测定培养上清中赖氨酸含量。 
为此，将菌株首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂(具有卡那霉素(25mg/l)的脑心琼脂)平板上保温24小时。从这个琼脂平板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml Erlenmeyer培养瓶中)。CgIII完全培养基用作预培养的培养基。 
Cg III培养基 
NaCl                    2.5g/l 
Bacto-胨                10g/l 
Bacto-酵母提取物        10g/l 
葡萄糖(单独高压灭菌)    2％(w/v) 
将pH值调节为pH7.4 
向其中加入卡那霉素(25mg/l)。在摇床上在33℃以240rpm保温预培养物16小时。以此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(660nm)是0.1OD。培养基MM用作主培养基。 
MM培养基 
CSL(玉米浆)                 5g/l 
MOPS(吗啉代丙烷磺酸)        20g/l 
葡萄糖(单独高压灭菌)        50g/l 
盐： 
(NH4)2SO4                   25g/l 
KH2PO4                      0.1g/l 
MgSO4*7H2O                  1.0g/l 
CaCl2*2H2O                  10mg/l 
FeSO4*7H2O                  10mg/l 
MnSO4*H2O                   5.0mg/l 
生物素(过滤灭菌)            0.3mg/l 
硫胺素*HCl(过滤灭菌)        0.2mg/l 
亮氨酸(过滤灭菌)            0.1g/l 
CaCO3                       25g/l 
用氨水将CSL、MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液，以及干燥的高压灭菌的CaCO3。 
在具有档板的100ml Erlenmeyer培养瓶中的10ml体积中进行培养。加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％湿度下进行培养。 
72小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)测定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(Hamburg，Germany)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸的量。 
结果示于表2。 
表2 
  菌株   OD(660nm)   赖氨酸HCl(g/l)
  DSM16835   7.6   13.57
  DSM16835::pCR2.1gatRint   7.8   14.92
实施例7：
制备进行glpR2基因整合诱变的整合载体 
通过Eikmanns等(Microbiology 140：1817-1828(1994))的方法，从菌株ATCC 13032中分离染色体DNA。 
基于谷氨酸棒杆菌glpR2基因的已知序列，选择如下寡核苷酸进行聚合酶链反应： 
glpR2-int1： 
5`AAC CTG CCT TGG TTA AAG G 3` 
glpR2-int2： 
5`ATC TAG CGT GTG GTC ATC G 3` 
示出的引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，PCR反应使用来自Boehringer Mannheim的Taq聚合酶(德国，产品描述TaqDNA聚合酶，产品No.1146165)根据Innis等所述的标准PCR方法进行(PCR protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)。借助于聚合酶链反应，引物使得glpR2基因的一个大小为539bp的内部片段得以扩增。由此扩增的产物通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳而检测。 
使用Invitrogen公司的TOPO TA克隆试剂盒(Carlsbad，CA，USA；Catalog Number K4500-01)将扩增的DNA片段连接入载体pCR2.1-TOPO(Mead et al.(1991)，Bio/Technology 9：657-663)。 
然后将所述连接批次物电穿孔进大肠杆菌菌株TOP10(Hanahan，in：DNA Cloning.A Practical Approach，Vol.I，IRL-Press，Oxford，Washington DC，USA，1985)。将转化批次物铺板于补加了50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular Cloning：a LaboratoryManual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989)上，选择携带质粒的细胞。借助于Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过用限制酶EcoRI限制及随后的琼脂糖凝胶(0.8％)电泳进行检测。该质粒称作pCR2.1glpR2int，示于图3。 
实施例8：
整合诱变菌株DSM 16835的glpR2基因 
通过Tauch等(FEMS Microbiological Letters，123：343-347(1994))所述电穿孔方法将实施例7中所述的载体pCR2.1glpR2int电穿孔进谷氨酸棒杆菌DSM 16835中。菌株DSM 16835是一种AEC-抗性赖氨酸生产菌株，该菌株在Menkel等(Applied and EnvironmentalMicrobiology 55(3)：684-688(1989)中以名称MH20-22B加以描述。载体pCR2.1glpR2int在DSM 16835中不能独立复制，只有整合进DSM16835的染色体中时才保留在细胞中。将电穿孔批次物铺板于补加了15mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)上，选择pCR2.1glpR2int整合进染色体中的克隆。 
将选择的具有实施例7所述质粒pCR2.1glpR2int插入DSM 16835的染色体glpR2基因中的卡那霉素抗性克隆称作DSM16835::pCR2.1glpR2int。 
实施例9：
生产赖氨酸 
将在实施例8中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM16835::pCR2.1glpR2int在适于赖氨酸生产的营养培养基中培养，测定培养上清中赖氨酸含量。 
为此，将菌株首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂(具有卡那霉素(25mg/l)的脑心琼脂)平板上保温24小时。从这个琼脂平板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml Erlenmeyer培养瓶中)。CgIII完全培养基用作预培养的培养基。 
Cg III培养基 
NaCl                   2.5g/l 
Bacto-胨               10g/l 
Bacto-酵母提取物       10g/l 
葡萄糖(单独高压灭菌)   2％(w/v) 
pH值调节为pH7.4 
向其中加入卡那霉素(25mg/l)。在摇床上在33℃以240rpm保温预培养物16小时。以此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(660nm)是0.1OD。培养基MM用作主培养基。 
MM培养基 
CSL(玉米浆)               5g/l 
MOPS(吗啉代丙烷磺酸)      20g/l 
葡萄糖(单独高压灭菌)      50g/l 
盐： 
(NH4)2SO4                  25g/l 
KH2PO4                     0.1g/l 
MgSO4*7H2O                 1.0g/l 
CaCl2*2H2O                 10mg/l 
FeSO4*7H2O                 10mg/l 
MnSO4*H2O                  5.0mg/l 
生物素(过滤灭菌)           0.3mg/l 
硫胺素*HCl(过滤灭菌)       0.2mg/l 
亮氨酸(过滤灭菌)           0.1g/l 
CaCO3                      25g/l 
用氨水将CSL、MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液，并加入干燥的高压灭菌的CaCO3。 
在具有档板的100ml Erlenmeyer培养瓶中的10ml体积中进行培养。加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％湿度下进行培养。 
72小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)测定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(Hamburg，Germany)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸的量。 
结果示于表3。 
表3 
  菌株   OD(660nm)   赖氨酸HCl(g/l)
  DSM16835   7.6   13.57
  DSM16835::pCR2.1glpR2int   8.4   13.97
附图简述 
图1：质粒pCR2.1malIint图 
图2：质粒pCR2.1gatRint图 
图3：质粒pCR2.1glpR2int图 
当表示碱基对数目时，所述数值是在测定方法可再现性范围内获得的近似值。 
文中所用缩写和名称具有如下含义： 
KmR：卡那霉素抗性基因 
EcoRI：限制酶EcoRI的切割位点 
malIint：malI基因的内部片段 
gatRint：gatR基因的内部片段 
glpR2int：glpR2基因的内部片段 
ColE1：质粒ColE1的复制起点 

Claims (14)

1.通过发酵棒状细菌生产L-赖氨酸的方法，其特征在于使用的细菌中转录调节物glpR2是被弱化的，其中所述棒状细菌是谷氨酸棒杆菌。
2.权利要求1的方法，其中转录调节物glpR2被消除或者以低水平表达。
3.生产L-赖氨酸的方法，其特征在于进行如下步骤：
a)发酵生产所需的L-赖氨酸的棒状细菌，在所述细菌中基因glpR2是弱化的，其中所述棒状细菌是谷氨酸棒杆菌；
b)浓缩培养基或者细菌细胞中的产物；及
c)分离所需的L-赖氨酸，部分或全部发酵液组分和/或生物量任选保留在终产物中。
4.权利要求3的方法，其中基因glpR2被消除或者以低水平表达。
5.权利要求1或3的方法，其特征在于使用的细菌中所需的L-赖氨酸的生物合成途径的其它基因是被另外增强的。
6.权利要求1或3的方法，其特征在于使用的细菌中降低所需的L-赖氨酸形成的代谢途径被至少部分消除。
7.权利要求1或3的方法，其特征在于编码glpR2的多核苷酸的表达被降低。
8.权利要求1或3的方法，其特征在于由多核苷酸glpR2编码的多肽的调节和/或催化性质被降低。
9.权利要求1或3的方法，其特征在于为了生产L-赖氨酸，发酵的棒状微生物中选自如下的一或多个基因同时被增强：
9.1编码反馈抗性天冬氨酸激酶的基因lysC，
9.2编码赖氨酸输出蛋白的基因lysE，
9.3编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因gap，
9.4编码丙酮酸羧化酶的基因pyc，
9.5编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因zwf，
9.6编码苹果酸：醌氧化还原酶的基因mqo，
9.7编码Zwa1蛋白的基因zwa1，
9.8编码丙糖磷酸异构酶的基因tpi，
9.9编码3-磷酸甘油酸激酶的基因pgk，
9.10编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因dapA，或者
9.11编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的基因metA，或者
9.12编码胱硫醚γ合酶的基因metB，或者
9.13编码胱硫醚γ裂合酶的基因aecD，或者
9.14编码丝氨酸羟甲基转移酶的基因glyA，或者
9.15编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的基因metY。
10.权利要求9的方法，其中所述一或多个基因过表达。
11.权利要求1或3的方法，其特征在于为了生产L-赖氨酸，发酵的棒状微生物中选自如下的一或多个基因同时被弱化：
11.1编码分解代谢物控制蛋白A的基因ccpA1，
11.2编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因，
11.3编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因，
11.4编码丙酮酸氧化酶的基因poxB，
11.5编码果糖二磷酸醛缩酶的基因fda，或者
11.6编码Zwa2蛋白的基因zwa2，或者
11.7编码高丝氨酸激酶的基因thrB，或者
11.8编码苏氨酸脱水酶的基因ilvA，或者
11.9编码苏氨酸合酶的基因thrC，或者
11.10编码间二氨基庚二酸D-脱氢酶的基因ddh。
12.权利要求11的方法，其中所述一或多个基因被消除或者其表达被降低。
13.棒状细菌，其中基因glpR2是以弱化形式存在，其中所述棒状细菌是谷氨酸棒杆菌。
14.权利要求13的棒状细菌，其中基因glpR2被消除或者以低水平表达的形式存在。
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