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CN116555135A - 高产苏氨酸基因工程菌的构建方法 - Google Patents

高产苏氨酸基因工程菌的构建方法 Download PDF

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CN116555135A
CN116555135A CN202210112898.6A CN202210112898A CN116555135A CN 116555135 A CN116555135 A CN 116555135A CN 202210112898 A CN202210112898 A CN 202210112898A CN 116555135 A CN116555135 A CN 116555135A
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CN
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threonine
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iolr
enzyme
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CN202210112898.6A
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康培
宫卫波
何君
李岩
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Original Assignee
Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
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Abstract

本发明提供一种高产苏氨酸基因工程菌的构建方法。本发明通过使GntR家族转录调控因子iolR活性降低，来提高菌株生产苏氨酸的能力，其苏氨酸的产量较未改造菌株最高可提高38.8％。并进一步强化苏氨酸合成途径，和/或对苏氨酸合成相关的竞争途径及降解途径敲除或弱化，使苏氨酸的产量有所提升，副产物L‑赖氨酸、L‑异亮氨酸和L‑甲硫氨酸有不同程度的下降。为大规模生产苏氨酸提供了新途径，具有较高的应用价值。

Description

高产苏氨酸基因工程菌的构建方法
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体地说，涉及一种高产苏氨酸基因工程菌的构建方法。
背景技术
L-苏氨酸(L-Threonin)，化学名称为β-羟基-α-氨基丁酸，分子式为C4H9NO3，相对分子质量为119.12。L-苏氨酸为必需氨基酸，苏氨酸主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。
谷氨酸棒杆菌中，由草酰乙酸生成苏氨酸需五步催化反应，分别为天冬氨酸激酶(lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrB)以及苏氨酸合酶(thrC)编码。Hermann Sahm等人一直致力于高产苏氨酸的谷棒菌株的开发，并取得一定突破，获得了抗反馈抑制的hom基因(Reinscheid D J,Eikmanns B J,Sahm H.Analysis of a Corynebacterium glutamicum hom gene coding for afeedback-resistant homoserine dehydrogenase.[J].Journal of Bacteriology,1991,173(10):3228-3230)、lysC基因(Eikmanns B J,Eggeling L,Sahm H.Molecular aspectsof lysine,threonine,and isoleucine biosynthesis in Corynebacteriumglutamicum.[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1993,64(2):145-163)。继Hermann Sahm之后，Lothar Eggling通过弱化苏氨酸利用途径中的编码基因glyA，同时过表达苏氨酸外运蛋白ThrE，使得苏氨酸的产量由49mM提高到67mM(Simic P,Willuhn J,Sahm H,etal.Identification of glyA(Encoding Serine Hydroxymethyltransferase)and ItsUse Together with the Exporter ThrE To Increase l-Threonine Accumulation byCorynebacterium glutamicum[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68(7):3321-3327)。
目前利用谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸的报道主要集中在其合成路径中，关于全局调控和减少副产物等方面的报道较少。且现有报道仅对苏氨酸合成路径做了初步研究，并未形成系统。
发明内容
本发明的目的是通过是GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失，提高菌株生产苏氨酸的能力，从而提供一种高产苏氨酸(L-苏氨酸)的基因工程菌的构建方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种修饰的棒状杆菌属微生物，所述微生物相比于未修饰的微生物，其GntR家族调控因子iolR的活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。优选地，GntR家族调控因子iolR在NCBI上的参考序列编号为WP_003857140.1，或与其相似性为90％的氨基酸序列。
进一步地，所述微生物体内GntR家族调控因子iolR的活性降低或丧失是通过降低编码GntR家族调控因子iolR基因的表达或敲除内源的编码GntR家族调控因子iolR的基因来实现的。
可以采用诱变、定点突变或同源重组等方法来降低编码GntR家族调控因子iolR基因的表达或敲除内源的编码GntR家族调控因子iolR的基因。
进一步地，所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内苏氨酸合成途径相关的酶的活性增强；或，
所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内与苏氨酸合成相关的竞争途径或降解途径的酶活性降低或丧失；或，
所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内苏氨酸合成途径相关的酶的活性增强，同时其体内与苏氨酸合成相关的竞争途径或降解途径的酶活性降低或丧失；
其中，所述与苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶中的至少一种；优选地，它们在NCBI上的参考序列编号分别为WP_003855724.1、WP_011013506.1、WP_003854900.1、WP_011014183.1、WP_011014964.1，或与上述参考序列相似度为90％的氨基酸序列。
所述与苏氨酸合成相关的竞争途径的酶选自二氨基庚二酸脱氢酶、苏氨酸脱水酶、4-羟基-四氢二吡啶羧酸合酶、高丝氨酸乙酰转移酶中的至少一种；优选地，它们在NCBI上的参考序列编号分别为WP_011015254.1、WP_003862033.1、WP_011014792.1、WP_011013793.1，或与上述参考序列相似度为90％的氨基酸序列。
优选地，所述微生物为如下①～⑦中的任一种：
①GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸半醛脱氢酶活性增强的微生物；
②GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶活性增强的微生物；
③GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶活性增强的微生物；
④GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶活性增强，同时二氨基庚二酸脱氢酶活性性降低或丧失的微生物；
⑤GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶酶活性增强，同时苏氨酸脱水酶活性降低或丧失的微生物；
⑥GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶酶活性增强，同时4-羟基-四氢二吡啶羧酸合酶活性降低或丧失的微生物；
优选地，4-羟基-四氢二吡啶羧酸合酶活性降低是指编码4-羟基-四氢二吡啶酸合酶的核苷酸序列起始密码子ATG中的A突变为G；
⑦GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶酶活性增强，同时高丝氨酸乙酰转移酶活性降低或丧失的微生物；
优选地，高丝氨酸乙酰转移酶活性降低是指编码高丝氨酸乙酰转移酶的核苷酸序列的起始密码子ATG中的A突变为G。
所述微生物体内苏氨酸合成途径相关的酶的活性的增强是由选自以下1)～5)，或任选的组合实现的：
1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；
5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强。
所述弱化包括敲除或降低基因的转录或表达或改变编码相应酶的氨基酸、核苷酸序。优选地，本发明所述棒杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，谷氨酸棒状杆菌包括ATCC13032、ATCC13870、ATCC13869、ATCC21799、ATCC21831、ATCC14067、ATCC13287等(参见NCBI Corunebacterium glutamicum进化树https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/469)，更优选谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。
第二方面，本发明提供高产苏氨酸基因工程菌的构建方法，所述方法选自方案i～iv中的任一种：
方案i：使具有氨基酸生产能力的棒杆菌中编码GntR家族调控因子iolR的活性降低或丧失，获得的菌株；
方案ii：
A、使具有氨基酸生产能力的棒杆菌中编码GntR家族调控因子iolR的活性降低或丧失，获得相应菌株；以及
B、增强步骤A菌株中与苏氨酸合成途径相关的酶，获得酶活增强的菌株；
方案iii：
a、使具有氨基酸生产能力的棒杆菌中编码GntR家族调控因子iolR的活性降低或丧失，获得相应菌株；以及
b、进一步弱化步骤a菌株中与苏氨酸合成相关的竞争途径及降解途径蛋白活性；
所述弱化包括敲除或降低基因转录或表达或改变编码相应酶的氨基酸、核苷酸序列；
方案iv：
1)弱化具有氨基酸生产能力的棒杆菌中编码GntR家族调控因子iolR的基因，获得基因弱化菌株；
2)增强步骤1)基因弱化菌株中与苏氨酸合成途径相关的酶，获得酶活增强菌株；以及
3)进一步弱化步骤2)增强菌株中与苏氨酸合成相关的竞争途径基因；
所述弱化包括敲除或降低基因的转录或表达或改变编码相应酶的氨基酸、核苷酸序列；
所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；
5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；
6)通过对编码酶的核苷酸序列进行改变而增强；
其中，所述与苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、高丝氨酸激酶中的至少一种；
所述与苏氨酸合成相关的竞争途径蛋白选自二氨基庚二酸脱氢酶、4-羟基-四氢二吡啶羧酸合酶、高丝氨酸乙酰转移酶、苏氨酸脱水酶中的至少一种。
第三方面，本发明提供一种生产苏氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：
a)培养所述修饰的棒状杆菌属微生物，以获得所述微生物的培养物；
b)从步骤a)中获得的所述培养物中收集所产生的苏氨酸。
第四方面，本发明提供使GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失的菌株在苏氨酸发酵生产或提高苏氨酸发酵产量中的应用。
进一步地，通过使具有氨基酸生产能力的棒杆菌(Corynebacterium)中的GntR家族调控因子iolR的活性降低或丧失来提高苏氨酸的发酵产量。
优选地，本发明所述棒杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，谷氨酸棒状杆菌包括ATCC13032、ATCC13870、ATCC13869、ATCC21799、ATCC21831、ATCC14067、ATCC13287等(参见NCBI Corunebacterium glutamicum进化树https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/469)，更优选谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。
第五方面，本发明提供所述修饰的棒状杆菌属微生物或按照上述方法构建得到的高产苏氨酸基因工程菌在苏氨酸发酵生产或提高苏氨酸发酵产量中的应用。
上述有关菌株的改造方法包括基因的强化和弱化等均为本领域技术人员可知的改造方式，参见满在伟.高产L-精氨酸钝齿棒杆菌的系统途径工程改造[D].江南大学,2016；崔毅.代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产L--亮氨酸[D].天津科技大学.；徐国栋.L-异亮氨酸生产菌株的构建及发酵条件优化.天津科技大学,2015.
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明通过失活GntR家族调控因子iolR提高了菌株(棒杆菌，如谷氨酸棒状杆菌)生产苏氨酸的产量。其苏氨酸的产量较未改造菌株最高可提高38.8％。并进一步强化苏氨酸合成途径相关基因，和/或对苏氨酸合成相关的竞争途径基因进行敲除或弱化，使苏氨酸的产量有所提升，副产物L-赖氨酸、L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸有不同程度的下降。最终构建的菌株中SMCT195苏氨酸的产量最高，达到6.5g/L，较苏氨酸底盘菌提高了1.6倍。为大规模生产苏氨酸提供了新途径，具有较高的应用价值。
具体实施方式
基于此前研究可知，目前利用谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸的重点主要集中在末端路径中，而关于调控因子与菌株生产苏氨酸之间关系的研究尚未有报道。本发明首先在谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基础上分别弱化或失活iolR基因验证对苏氨酸的影响，得到菌株SMCT181和SMCT182，以初步验证iolR对苏氨酸的产量的影响，SMCT181和SMCT182苏氨酸分别为0.4g/L、0.2g/L。因此，弱化或失活iolR有效，但与预期相差较大。为进一步验证iolR对苏氨酸产量的影响，需构建苏氨酸底盘菌。若改造菌株生产苏氨酸，首先要打通其合成路径，主要包括天冬氨酸激酶-天冬氨酸半醛脱氢酶操纵子(lysCfbr-asd)、高丝氨酸脱氢酶-高丝氨酸激酶操纵子(homfbr-thrB)的解调控及表达强化、苏氨酸合酶(thrC)的表达强化，为此在出发菌株ATCC13032基础上改造lysCfbr-asd获得改造菌SMCT183，在此基础上改造homfbr-thrB获得改造菌SMCT184，在SMCT184基础上强化thrC获得改造菌SMCT185，使得菌株具备初步的苏氨酸合成能力，其苏氨酸产量4.1g/L。
在此基础上，失活或弱化GntR家族调控因子iolR，得到菌株SMCT186和SMCT187，其生产苏氨酸的能力分别提高26.8％和17.1％。
为了进一步验证失活iolR可提高苏氨酸的产量，先在SMCT185菌株进一步改造二氨基庚二酸脱氢酶、苏氨酸脱水酶、4-羟基-四氢二吡啶羧酸合酶和高丝氨酸中至少1个，得到一系列的菌株SMCT188、SMCT189、SMCT190、SMCT192、SMCT191，苏氨酸的产量进一步提高，并且相应的副产物具有不同程度的下降。以上述5株菌株为出发菌进一步失活iolR基因，得到菌株SMCT193、SMCT194、SMCT195、SMCT196和SMCT197，苏氨酸的产量分别提高27.4％、26.0％、35.4％、38.8％和29.4％。
改造过程中的失活或弱化包括启动子的替换，核糖体结合位点的改变、点突变、序列的缺失等手段，改造过程中的表达强化包括启动子的替换，核糖体结合位点的改变、拷贝数的增加、质粒过表达等手段，且以上手段均为本领域技术人员公知手段。以上手段无法通过举例而穷尽，具体实施例中仅以启动子强化作为代表进行说明。
本发明采用如下技术方案：
本发明的技术方案之一，提供一种GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失的微生物。
本发明的技术方案之二，提供一种GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失和天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶活性增强少一个强化表达的微生物。
本发明的技术方案之三，提供一种GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶活性增强，同时二氨基庚二酸脱氢酶活性性降低或丧失的微生物。
本发明的技术方案之四，提供一种GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶酶活性增强，同时苏氨酸脱水酶活性降低或丧失的微生物。
本发明的技术方案之五，提供一种GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶酶活性增强，同时4-羟基-四氢二吡啶羧酸合酶活性降低或丧失的微生物。
本发明的技术方案之六，提供一种GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶酶活性增强，同时高丝氨酸乙酰转移酶活性降低或丧失的微生物。上述菌株为棒杆菌，优选为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，谷氨酸棒状杆菌包括ATCC13032、ATCC13870、ATCC13869、ATCC21799、ATCC21831、ATCC14067、ATCC13287等(参见NCBI Corunebacteriumglutamicum进化树https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/469)，更优选谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。
本发明涉及的蛋白及其编码基因如下：
GntR家族调控因子iolR，编码基因iolR，NCBI编号：cg0196、cgl0157、NCgl0154。
天冬氨酸激酶，编码基因名称lysC，NCBI编号：cg0306、Cgl0251、NCgl0247。
天冬氨酸半醛脱氢酶，编码基因名称asd，NCBI编号：Cgl0252，Cg0307、NCgl0248。
高丝氨酸脱氢酶，编码基因名称hom，NCBI编号：Cg1337、Cgl1183、NCgl1136。
苏氨酸合酶，编码基因名称thrC，NCBI编号：cg2437、Cgl2220、NCgl2139。
高丝氨酸激酶，编码基因thrB，NCBI编号：Cgl1184，Cg1338、NCgl1137。
二氨基庚二酸脱氢酶，编码基因ddh，NCBI编号：Cg2900、Cgl2617、NCgl2528。
苏氨酸脱水酶，编码基因ilvA，NCBI编号：Cgl2127，Cg2334、Ncgl2046。
4-羟基-四氢二吡啶羧酸合酶，编码基因dapA，NCBI编号：Cgl1971，Cg2161、NCgl1896。
高丝氨酸乙酰转移酶(高丝氨酸-O-乙酰转移酶)，编码基因metX，NCBI编号：Cgl0652，Cg0754、NCgl0624。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的实验材料如下：
以下实施例中涉及的实验方法如下：
PCR扩增体系如下：
成分 体积(微升)
灭菌的去离子水 29
5×pfu buffer 10
2.5mM dNTP 5
10μM上游引物 2
10μM下游引物 2
Pfu 1
模板 1(融合PCR模板最大加到2微升)
共计 50
PCR扩增程序如下：
菌株改造方法：
1、无缝组装反应程序：参照ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit说明书。
2、转化方法：参照Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell说明书。
3、感受态细胞的制备：参照C.glutamicum Handbook,Charpter 23。
实施例1菌株基因组改造质粒的构建
1、天冬氨酸激酶-天冬氨酸半醛脱氢酶操纵子表达强化方案重组质粒pK18mobsacB-Psod-lysCg1a-T311I-asd的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P21/P22引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以P23/P24引物对进行PCR扩增得到启动子片段Psod，以P25/P26引物对进行PCR扩增得到lysCg1a-T311I，以P27/P28引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dn。以P21/P24引物对以up、Psod为模版进行融合PCR，获得片段up-Psod。以P21/P28引物对以up-Psod、lysCg1a-T311I、dn为模板进行融合PCR获得全长片段up-Psod-lysCg1a-T311I-dn。pK18mobsacB用BamHI/HindIII酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Psod-lysCg1a-T311I-asd。
其中，g1a表示lysC基因(lysC野生型基因序列见SEQ ID NO:1)起始密码子的第1位碱基由g突变为a，T311I表示lysC基因编码的天冬氨酸激酶的第311为氨基酸由T突变为I。
2、高丝氨酸脱氢酶-高丝氨酸激酶操纵子表达强化方案重组质粒pK18mobsacB-PcspB-homG378E-thrB的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P29/P30引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以ATCC14067基因组为模板以P31/P32引物对进行PCR扩增得到启动子片段PcspB，以ATCC13032基因组为模板以P33/P34引物对进行PCR扩增得到homG378E，以P35/P36引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dn。以P29/P32引物对以up、PcspB为模版进行融合PCR，获得片段up-PcspB。以P29/P36引物对以up-PcspB、homG378E、dn为模板进行融合PCR获得全长片段up-Psod-homG378E-dn。pK18mobsacB用BamHI/HindIII酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-PcspB-homG378E-thrB。
3、苏氨酸合酶表达强化质粒pK18mobsacB-Psod-thrCg1a的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P37/P38引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以P39/P40引物对进行PCR扩增得到启动子片段Psod-thrCg1a，以P41/P42引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dn。以P37/P42引物对以up、Psod-thrCg1a、dn为模板进行融合PCR获得全长片段up-Psod-thrCg1a-dn。pK18mobsacB用BamHI/HindIII酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-Psod-thrCg1a。
其中，g1a表示thrC基因(thrC野生型基因序列见SEQ ID NO:2)起始密码子的第1位碱基由g突变为a。
4、GntR家族转录调控因子iolR失活方案重组质粒pK18mobsacB-△iolR的构建
以ATCC13032基因组为模板，以iolR-1/iolR-2引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以iolR-3/iolR-4引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dn。以iolR-1/iolR-4引物对以up、dn为模板进行融合PCR获得全长片段up-dn。pK18mobsacB用BamHI/HindIII酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-△iolR。
5、GntR家族转录调控因子iolR弱化方案重组质粒pK18mobsacB-iolRa1g的构建
以ATCC13032基因组为模板，以iolR-5/iolR-6引物对进行PCR扩增得到上游同源臂iolRa1g-up，以iolR-7/iolR-8引物对进行PCR扩增得到下游同源臂iolRa1g-dn。以iolR-5/iolR-8引物对以iolRa1g-up、iolRa1g-dn为模板进行融合PCR获得全长片段iolRa1g-up-dn。pK18mobsacB用BamHI/HindIII酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-iolRa1g。
其中，a1g表示iolR基因(iolR野生型基因序列见SEQ ID NO:3)起始密码子的第1位碱基由a突变为g。
6、4-羟基-四氢二吡啶羧酸合酶弱化方案重组质粒pK18mobsacB-dapAa1g的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P75/P76引物对进行PCR扩增得到上游同源臂dapAa1g-up，以P77/P78引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dapAa1g-dn。以P75/P78引物对以dapAa1g-up、dapAa1g-dn为模板进行融合PCR获得全长片段dapAa1g-up-dn。pK18mobsacB用BamHI/HindIII酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-dapAa1g。
其中，a1g表示dapA基因(dapA野生型基因序列见SEQ ID NO:4)起始密码子的第1位碱基由a突变为g。
7、苏氨酸脱水酶弱化方案重组质粒pK18mobsacB-ilvAa1g的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P83/P84引物对进行PCR扩增得到上游同源臂ilvAa1g-up，以P85/P86引物对进行PCR扩增得到下游同源臂ilvAa1g-dn。以P83/P86引物对以ilvAa1g-up、ilvAa1g-dn为模板进行融合PCR获得全长片段ilvAa1g-up-dn。pK18mobsacB用BamHI/HindIII酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-ilvAa1g。
其中，a1g表示ilvA基因(ilvA野生型基因序列见SEQ ID NO:5)起始密码子的第1位碱基由a突变为g。
8、高丝氨酸乙酰转移酶弱化方案重组质粒pK18mobsacB-metXa1g的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P91/P92引物对进行PCR扩增得到上游同源臂metXa1g-up，以P93/P94引物对进行PCR扩增得到下游同源臂metXa1g-dn。以P91/P94引物对以metXa1g-up、metXa1g-dn为模板进行融合PCR获得全长片段metXa1g-up-dn。pK18mobsacB用BamHI/HindIII酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-metXa1g。
其中，a1g表示metX基因(metX野生型基因序列见SEQ ID NO:6)起始密码子的第1位碱基由a突变为g。
9、高丝氨酸乙酰转移酶失活方案重组质粒pK18mobsacB-△metX的构建以ATCC13032基因组为模板，以P95/P96引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以P97/P98引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dn。以P95/P98引物对以up、dn为模板进行融合PCR获得全长片段up-dn。pK18mobsacB用BamHI/HindIII酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-△metX。
10、二氨基庚二酸脱氢酶失活方案重组质粒pK18mobsacB-△ddh的构建
以ATCC13032基因组为模板，以P99/P100引物对进行PCR扩增得到上游同源臂up，以P101/P102引物对进行PCR扩增得到下游同源臂dn。以P99/P102引物对以up、dn为模板进行融合PCR获得全长片段up-dn。pK18mobsacB用BamHI/HindIII酶切。两者用无缝克隆试剂盒进行组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-△ddh。
构建过程中所用引物如表1所示：
表1
注：加粗字体及下划线为引入相应点突变的引物。
实施例2基因组改造菌株的构建
1、GntR家族调控因子iolR失活或弱化菌株的构建
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备ATCC13032感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-△iolR和pK18mobsacB-iolRa1g以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为SMCT181和SMCT182。
2、天冬氨酸激酶-天冬氨酸半醛脱氢酶操纵子强化表达菌株的构建
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备ATCC13032感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Psod-lysCg1a-T311I-asd以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为SMCT183。
3、高丝氨酸脱氢酶-高丝氨酸激酶操纵子表达强化菌株的构建
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备SMCT183感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-PcspB-homG378E-thrB以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为SMCT184。
4、苏氨酸合酶表达强化菌株的构建
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备SMCT184感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-Psod-thrCg1a以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为SMCT185。
5、SMCT185GntR家族调控因子iolR失活或弱化菌株的构建
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备SMCT185感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-△iolR和pK18mobsacB-iolRa1g以电穿孔方法分别转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为SMCT186和SMCT187。
6、二氨基庚二酸脱氢酶失活菌株的构建
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备SMCT185感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-△ddh以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为SMCT188。
7、4-羟基-四氢二吡啶羧酸合酶弱化菌株的构建
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备SMCT185感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-dapAa1g以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为SMCT189。
8、苏氨酸脱水酶弱化菌株的构建
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备SMCT185感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-ilvAa1g以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为SMCT190。
9、高丝氨酸乙酰转移酶弱化菌株的构建
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备SMCT185感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-metXa1g以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为SMCT191菌株构建方法同上，以SMCT185为出发菌，弱化metX基因，构建的菌株命名为SMCT191。
10、高丝氨酸乙酰转移酶失活菌株的构建
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备SMCT185感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-△metX以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为SMCT192菌株构建方法同上，以SMCT185为出发菌，失活metX基因，构建的菌株命名为SMCT192。
11、iolR失活菌株的构建
按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备SMCT188、SMCT189、SMCT190、SMCT191和SMCT192感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-△iolR以电穿孔方法分别转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为30℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，核苷酸测序分析，获得目的突变菌株分别命名为SMCT193、SMCT194、SMCT195、SMCT196、SMCT197。
获得的菌株如表2所示：
表2
菌株 基因型
SMCT181 ATCC13032,ΔiolR
SMCT182 ATCC13032,iolRa1g
SMCT183 ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I-asd
SMCT184 ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I-asd,PcspB-homG378E-thrB
SMCT185 ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I-asd,PcspB-homG378E-thrB,Psod-thrCg1a
SMCT187 ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I-asd,PcspB-homG378E-thrB,Psod-thrCg1a,iolRa1g
SMCT186 ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I-asd,PcspB-homG378E-thrB,Psod-thrCg1a,ΔiolR
SMCT188 ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I-asd,PcspB-homG378E-thrB,Psod-thrCg1a,Δddh
SMCT189 ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I-asd,PcspB-homG378E-thrB,Psod-thrCg1a,dapAa1g
SMCT190 ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I-asd,PcspB-homG378E-thrB,Psod-thrCg1a,ilvAa1g
SMCT191 ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I-asd,PcspB-homG378E-thrB,Psod-thrCg1a,metXa1g
SMCT192 ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I-asd,PcspB-homG378E-thrB,Psod-thrCg1a,ΔmetX
SMCT193 ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I-asd,PcspB-homG378E-thrB,Psod-thrCg1a,Δddh,ΔiolR
SMCT194 ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I-asd,PcspB-homG378E-thrB,Psod-thrCg1a,dapAa1g,ΔiolR
SMCT195 ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I-asd,PcspB-homG378E-thrB,Psod-thrCg1a,ilvAa1g,ΔiolR
SMCT196 ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I-asd,PcspB-homG378E-thrB,Psod-thrCg1a,metXa1g,ΔiolR
SMCT197 ATCC13032,Psod-lysCg1a-T311I-asd,PcspB-homG378E-thrB,Psod-thrCg1a,ΔmetX,ΔiolR
实施例3构建菌株摇瓶验证
1.培养基
种子活化培养基：BHI 3.7％，琼脂2％，pH7。
种子培养基：蛋白胨5/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，硫酸铵16g/L，尿素8g/L，磷酸二氢钾10.4g/L，磷酸氢二钾21.4g/L，生物素5mg/L，硫酸镁3g/L。葡萄糖50g/L，pH7.2。
发酵培养基：玉米浆50mL/L，葡萄糖30g/L，硫酸铵4g/L，MOPS 30g/L，磷酸二氢钾10g/L，尿素20g/L，生物素10mg/L，硫酸镁6g/L，硫酸亚铁1g/L，VB1·HCl 40mg/L，泛酸钙50mg/L，烟酰胺40mg/L，硫酸锰1g/L，硫酸锌20mg/L，硫酸铜20mg/L，pH 7.2。
2.工程菌摇瓶发酵生产L-苏氨酸
(1)种子培养：挑取SMCT181、SMCT182、SMCT183、SMCT184、SMCT185、SMCT186、SMCT187、SMCT188、SMCT189、SMCT190、SMCT191、SMCT192、SMCT193、SMCT194、SMCT195、SMCT196和SMCT197斜面种子1环接至装有20mL种子培养基的500mL三角瓶中，30℃、220r/min振荡培养16h。
(2)发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养24h。
(3)取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测工程菌与对照菌发酵液中的L-苏氨酸，其浓度如下所示。
苏氨酸摇瓶发酵结果如表3所示：
表3
由表3可以看出，在产苏氨酸底盘菌SMCT185的基础上敲除或失活iolR，苏氨酸的产量分别提高26.8％和17.1％，表明改造iolR对提高苏氨酸产量具有正向效果，且失活iolR效果更好。在SMCT185的基础上对副产物途经关键基因失活或弱化，构建了一系列的底盘菌株(SMCT188、SMCT189、SMCT190、SMCT191、SMCT192)，苏氨酸产量进一步提高。在此基础上失活iolR，构建一系列iolR失活菌株(SMCT193、SMCT194、SMCT195、SMCT196和SMCT197)，相较对照菌苏氨酸的产量具有不同程度的提高，分别提高27.4％、26.0％、35.4％、38.8％和29.4％。再次表明改造iolR对提高苏氨酸产量来说是有效位点。此外，在iolR改造与其他位点相结合，其苏氨酸氨酸的产量与单独改造iolR有所提升，表明iolR与其他位点(如天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶的表达强化及解调控以及二氨基庚二酸脱氢酶、4-羟基-四氢二吡啶羧酸合酶、苏氨酸脱水酶、高丝氨酸乙酰转移酶的表达下调)相结合可有效提高苏氨酸的产量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司
<120> 高产苏氨酸基因工程菌的构建方法
<130> KHP211124125.9
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1266
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 1
gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
<210> 2
<211> 1446
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 2
gtggactaca tttcgacgcg tgatgccagc cgtacccctg cccgcttcag tgatattttg 60
ctgggcggtc tagcaccaga cggcggcctg tacctgcctg caacctaccc tcaactagat 120
gatgcccagc tgagtaaatg gcgtgaggta ttagccaacg aaggatacgc agctttggct 180
gctgaagtta tctccctgtt tgttgatgac atcccagtag aagacatcaa ggcgatcacc 240
gcacgcgcct acacctaccc gaagttcaac agcgaagaca tcgttcctgt caccgaactc 300
gaggacaaca tttacctggg ccacctttcc gaaggcccaa ccgctgcatt caaagacatg 360
gccatgcagc tgctcggcga acttttcgaa tacgagcttc gccgccgcaa cgaaaccatc 420
aacatcctgg gcgctacctc tggcgatacc ggctcctctg cggaatacgc catgcgcggc 480
cgcgagggaa tccgcgtatt catgctgacc ccagctggcc gcatgacccc attccagcaa 540
gcacagatgt ttggccttga cgatccaaac atcttcaaca tcgccctcga cggcgttttc 600
gacgattgcc aagacgtagt caaggctgtc tccgccgacg cagaattcaa aaaagacaac 660
cgcatcggtg ccgtgaactc catcaactgg gcacgcctta tggcacaggt tgtgtactac 720
gtttcctcat ggatccgcac cacaaccagc aatgaccaaa aggtcagctt ctccgtacca 780
accggcaact tcggtgacat ttgcgcaggc cacatcgccc gccaaatggg acttcccatc 840
gatcgcctca tcgtggccac caacgaaaac gatgtgctcg acgagttctt ccgtaccggc 900
gactaccgag tccgcagctc cgcagacacc cacgagacct cctcaccttc gatggatatc 960
tcccgcgcct ccaacttcga gcgtttcatc ttcgacctgc tcggccgcga cgccacccgc 1020
gtcaacgatc tatttggtac ccaggttcgc caaggcggat tctcactggc tgatgacgcc 1080
aactttgaga aggctgcagc agaatacggt ttcgcctccg gacgatccac ccatgctgac 1140
cgtgtggcaa ccatcgctga cgtgcattcc cgcctcgacg tactaatcga tccccacacc 1200
gccgacggcg ttcacgtggc acgccagtgg agggacgagg tcaacacccc aatcatcgtc 1260
ctagaaactg cactcccagt gaaatttgcc gacaccatcg tcgaagcaat tggtgaagca 1320
cctcaaactc cagagcgttt cgccgcgatc atggatgctc cattcaaggt ttccgaccta 1380
ccaaacgaca ccgatgcagt taagcagtac atagtcgatg cgattgcaaa cacttccgtg 1440
aagtaa 1446
<210> 3
<211> 762
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 3
atgaccaccg aagctcccat ttggccagcc gaactcttcg aagacctcga ccgcaacgga 60
ccaatccccc tctacttcca agtagcccaa cgcctcgaag acggcatccg cagcggagtc 120
ctcccacccg gagcacgcct agaaaacgag atctccgtgg cgaaacacct caacgtatcc 180
cgccccaccg tccgacgcgc catccaagaa gtcgtagaca aaggcctctt agttcgccgc 240
cgcggtgttg gcacccaggt cgtccaaagc cacgtcaccc gcccagtcga actgaccagt 300
ttcttcaacg acctcaaaaa cgccaacctg gaccccaaaa cccgagtcct cgagcaccgc 360
ctccttgcag caagttccgc catcgcagaa aaactcggag tttccgcagg tgacgaagtc 420
ctcctcatcc gccgcctccg ctccaccgga gacatccccg tagcgatcct ggaaaactac 480
ctccccccag cgttcaacga cgtctccctc gacgaactag aaaagggtgg actctacgat 540
gcgctgcgca gccgaggtgt tgtcttaaaa atcgccaacc agaaaatcgg tgcgcgccga 600
gcagtcggtg aagaaagcac cctcctcgac atcgaagacg gcggaccact tctcaccgtc 660
gaacgcgttg cattggataa ttccggccaa gtaatcgagt tgggaagcca ctgctaccgc 720
ccagatatgt acaactttga aaccactctg gtggccaggt aa 762
<210> 4
<211> 906
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 4
atgagcacag gtttaacagc taagaccgga gtagagcact tcggcaccgt tggagtagca 60
atggttactc cattcacgga atccggagac atcgatatcg ctgctggccg cgaagtcgcg 120
gcttatttgg ttgataaggg cttggattct ttggttctcg cgggcaccac tggtgaatcc 180
ccaacgacaa ccgccgctga aaaactagaa ctgctcaagg ccgttcgtga ggaagttggg 240
gatcgggcga agctcatcgc cggtgtcgga accaacaaca cgcggacatc tgtggaactt 300
gcggaagctg ctgcttctgc tggcgcagac ggccttttag ttgtaactcc ttattactcc 360
aagccgagcc aagagggatt gctggcgcac ttcggtgcaa ttgctgcagc aacagaggtt 420
ccaatttgtc tctatgacat tcctggtcgg tcaggtattc caattgagtc tgataccatg 480
agacgcctga gtgaattacc tacgattttg gcggtcaagg acgccaaggg tgacctcgtt 540
gcagccacgt cattgatcaa agaaacggga cttgcctggt attcaggcga tgacccacta 600
aaccttgttt ggcttgcttt gggcggatca ggtttcattt ccgtaattgg acatgcagcc 660
cccacagcat tacgtgagtt gtacacaagc ttcgaggaag gcgacctcgt ccgtgcgcgg 720
gaaatcaacg ccaaactatc accgctggta gctgcccaag gtcgcttggg tggagtcagc 780
ttggcaaaag ctgctctgcg tctgcagggc atcaacgtag gagatcctcg acttccaatt 840
atggctccaa atgagcagga acttgaggct ctccgagaag acatgaaaaa agctggagtt 900
ctataa 906
<210> 5
<211> 1311
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 5
atgagtgaaa catacgtgtc tgagaaaagt ccaggagtga tggctagcgg agcggagctg 60
attcgtgccg ccgacattca aacggcgcag gcacgaattt cctccgtcat tgcaccaact 120
ccattgcagt attgccctcg tctttctgag gaaaccggag cggaaatcta ccttaagcgt 180
gaggatctgc aggatgttcg ttcctacaag atccgcggtg cgctgaactc tggagcgcag 240
ctcacccaag agcagcgcga tgcaggtatc gttgccgcat ctgcaggtaa ccatgcccag 300
ggcgtggcct atgtgtgcaa gtccttgggc gttcagggac gcatctatgt tcctgtgcag 360
actccaaagc aaaagcgtga ccgcatcatg gttcacggcg gagagtttgt ctccttggtg 420
gtcactggca ataacttcga cgaagcatcg gctgcagcgc atgaagatgc agagcgcacc 480
ggcgcaacgc tgatcgagcc tttcgatgct cgcaacaccg tcatcggtca gggcaccgtg 540
gctgctgaga tcttgtcgca gctgacttcc atgggcaaga gtgcagatca cgtgatggtt 600
ccagtcggcg gtggcggact tcttgcaggt gtggtcagct acatggctga tatggcacct 660
cgcactgcga tcgttggtat cgaaccagcg ggagcagcat ccatgcaggc tgcattgcac 720
aatggtggac caatcacttt ggagactgtt gatccctttg tggacggcgc agcagtcaaa 780
cgtgtcggag atctcaacta caccatcgtg gagaagaacc agggtcgcgt gcacatgatg 840
agcgcgaccg agggcgctgt gtgtactgag atgctcgatc tttaccaaaa cgaaggcatc 900
atcgcggagc ctgctggcgc gctgtctatc gctgggttga aggaaatgtc ctttgcacct 960
ggttctgtcg tggtgtgcat catctctggt ggcaacaacg atgtgctgcg ttatgcggaa 1020
atcgctgagc gctccttggt gcaccgcggt ttgaagcact acttcttggt gaacttcccg 1080
caaaagcctg gtcagttgcg tcacttcctg gaagatatcc tgggaccgga tgatgacatc 1140
acgctgtttg agtacctcaa gcgcaacaac cgtgagaccg gtactgcgtt ggtgggtatt 1200
cacttgagtg aagcatcagg attggattct ttgctggaac gtatggagga atcggcaatt 1260
gattcccgtc gcctcgagcc gggcacccct gagtacgaat acttgaccta a 1311
<210> 6
<211> 1134
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 6
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattttgt acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134

Claims (9)

1.一种修饰的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修饰的微生物，其GntR家族调控因子iolR的活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。
2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物体内GntR家族调控因子iolR的活性降低或丧失是通过降低编码GntR家族调控因子iolR基因的表达或敲除内源的编码GntR家族调控因子iolR的基因来实现的。
3.根据权利要求2所述的微生物，其特征在于，采用诱变、定点突变或同源重组的方法来降低编码GntR家族调控因子iolR基因的表达或敲除内源的编码GntR家族调控因子iolR的基因。
4.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内苏氨酸合成途径相关的酶的活性增强；或，
所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内与苏氨酸合成相关的竞争途径的酶活性降低或丧失；或，
所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内苏氨酸合成途径相关的酶的活性增强，同时其体内与苏氨酸合成相关的竞争途径及降解途径的酶活性降低或丧失；
其中，所述与苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、高丝氨酸激酶中的至少一种；
所述与苏氨酸合成相关的竞争途径的酶选自二氨基庚二酸脱氢酶、4-羟基-四氢二吡啶羧酸合酶、高丝氨酸乙酰转移酶、苏氨酸脱水酶中的至少一种；
所述与苏氨酸降解途径相关的酶包括苏氨酸脱水酶。
5.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物为如下①～⑦中的任一种：
①GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸半醛脱氢酶活性增强的微生物；
②GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶活性增强的微生物；
③GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶活性增强的微生物；
④GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶活性增强，同时二氨基庚二酸脱氢酶活性性降低或丧失的微生物；
⑤GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶酶活性增强，同时苏氨酸脱水酶活性降低或丧失的微生物；
⑥GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶酶活性增强，同时4-羟基-四氢二吡啶羧酸合酶活性降低或丧失的微生物；
优选地，4-羟基-四氢二吡啶羧酸合酶活性降低是指编码4-羟基-四氢二吡啶酸合酶的核苷酸序列起始密码子ATG中的A突变为G；
⑦GntR家族调控因子iolR活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶酶活性增强，同时高丝氨酸乙酰转移酶活性降低或丧失的微生物；
优选地，高丝氨酸乙酰转移酶活性降低是指编码高丝氨酸乙酰转移酶的核苷酸序列的起始密码子ATG中的A突变为G。
6.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物体内苏氨酸合成途径相关的酶的活性的增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：
1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；
5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；
6)通过对编码酶的核苷酸序列进行改变而增强；
所述弱化包括敲除或降低基因的转录或表达或改变编码相应酶的氨基酸、核苷酸序列。
7.根据权利要求1-5任一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
8.高产苏氨酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法选自方案i～iv中的任一种：
方案i：使具有氨基酸生产能力的棒杆菌中编码GntR家族调控因子iolR的活性降低或丧失，获得的菌株；
方案ii：
A、使具有氨基酸生产能力的棒杆菌中编码GntR家族调控因子iolR的活性降低或丧失，获得相应菌株；以及
B、增强步骤A菌株中与苏氨酸合成途径相关的酶，获得酶活增强的菌株；
方案iii：
a、使具有氨基酸生产能力的棒杆菌中编码GntR家族调控因子iolR的活性降低或丧失，获得相应菌株；以及
b、进一步弱化步骤a菌株中与苏氨酸合成相关的竞争途径及降解途径蛋白活性；
所述弱化包括敲除或降低基因转录或表达或改变编码相应酶的氨基酸、核苷酸序列；
方案iv：
1)弱化具有氨基酸生产能力的棒杆菌中编码GntR家族调控因子iolR的基因，获得基因弱化菌株；
2)增强步骤1)基因弱化菌株中与苏氨酸合成途径相关的酶，获得酶活增强菌株；以及
3)进一步弱化步骤2)增强菌株中与苏氨酸合成相关的竞争途径基因；
所述弱化包括敲除或降低基因的转录或表达或改变编码相应酶的氨基酸、核苷酸序列；
所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；
5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；
6)通过对编码酶的核苷酸序列进行改变而增强；
其中，所述与苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、高丝氨酸激酶中的至少一种；
所述与苏氨酸合成相关的竞争途径蛋白选自二氨基庚二酸脱氢酶、4-羟基-四氢二吡啶羧酸合酶、高丝氨酸乙酰转移酶、苏氨酸脱水酶中的至少一种。
9.一种生产苏氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a)培养权利要求1-7任一项所述的微生物，以获得所述微生物的培养物；
b)从步骤a)中获得的所述培养物中收集所产生的苏氨酸。
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