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CN1303289A - 腺苷a3受体调节剂 - Google Patents

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CN1303289A
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Abstract

本发明公开了通式化合物,其中的R、R1、R2、R3和A如说明书定义,它们具有选择性的A3腺苷受体激动活性。这些化合物可用于药物组合物,以治疗由于A3受体的过度活性所引起的疾病,或测定其它化合物和A3受体的结合而用于诊断。本发明化合物可以是被标记的,标记物可用于体外或体内,以确定存在着具有高浓度腺苷A3受体的肿瘤细胞。

Description

腺苷A3受体调节剂
本发明涉及某些吡唑并-三唑并-嘧啶，三唑并-三唑并-嘧啶和咪唑并-三唑并-嘧啶衍生物，以及它们在医药上作为腺苷A3受体调节剂的应用。
发明的背景技术
在药理学上已经鉴别出腺苷受体的三种主要类型，分类为A1、A2和A3。A1受体通过Gi使其偶合以抑制腺苷酸环化酶，并且它还显示出可与其它第二信使系统偶合的性质，包括抑制和激发磷酸肌醇(phosphoinositol)的循环和活化离子通道。A2受体可进一步分成A2A和A2B两个亚型，在其中腺苷激动剂可分别以高和低的亲和力活化腺苷环化酶。A3受体序列首先从大鼠实验的cDNA信息库中鉴定出来，以后此序列被同源物克隆成为与大鼠脑的cDNA信息库中的受体相偶合的其它G蛋白，A3受体显示出其与新的、功能性的腺苷受体相应。
A3受体的发现在毗邻嘌呤领域开创了治疗的前景。具体地说，A3受体介导炎症、低血压和巨细胞脱粒。显然，此受体还具有对中枢神经系统的作用。A3选择性激动剂IB-MECA诱导行为压抑，以及慢性给药可保护大脑不会局部缺血。现还发现，A3选择性激动剂在高浓度时可诱导HL-60人体白细胞中的细胞程序死亡。上述的和其它的发现都使A3受体成为治疗靶。A3受体的选择性拮抗剂被认为可能用于抗感染或可能作为抗大脑局部缺血的药剂。最近，研究表明A3拮抗剂使其用作抗哮喘、抗抑郁、抗心律不齐、肾保护、抗帕金森症和提高认知的药物。
因此，本发明的目的是提供了数种化合物，其制备方法，以及它们作为激动剂、部分激动剂和/或腺苷A3受体的拮抗剂的应用。
发明概述
本发明公开的化合物有可能用作选择性的腺苷A3受体调节剂，其活性是该受体的拮抗剂，本发明还公开了该化合物的制备方法和应用。
下述通式化合物，其放射性标记类似物，荧光标记类似物和其药用盐：
Figure A9980659400071
或
Figure A9980659400072
其中
A是咪唑基、吡唑基或三唑基；
R是-C(X)R1、-C(X)-N(R1)2、-C(X)OR1、-C(X)SR1、-SOnR1、-SOnOR1、-SOnSR1或-SOn-N(R1)2；
R1是氢、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、杂芳基、杂环基、低级链烯基、低级烷酰基，或者，如果该基团连接于氮原子时，与氮原子一起形成氮杂环丁烷，或形成5-6元杂环基所述杂环基含有一个或多个诸如N、O、S的杂原子；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、取代的烷基、取代的链烯基、取代的炔基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳基、取代的杂芳基或芳基；
R3是呋喃基、吡咯基、噻吩基、苯并呋喃基、苯并吡咯基、苯并噻吩基，它们由一个或多个本文所述取代的杂芳环的取代基选择取代；
X是O、S或NR1；
n是1或2。
优选的，R1是氢；C1-C8烷基；C2-C7链烯基；C2-C7炔基；C3-C7环烷基；由一个或多个卤原子、羟基、C1-C4烷氧基、C3-C7环烷基或式-NR1 2、-C(O)NR1 2的基团取代的C1-C5烷基；芳基；取代的芳基，所述的取代基选自下述基团：C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、硝基、氨基、氰基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷氧基、羧基、酰胺基；C7-C10的芳烷基，其中芳基部分可被一个或多个上述芳基基团的取代基所取代；式-(CH2)m-Het基团，其中Het是5-6元芳族或非芳族杂环，其中含有选自N、O和S的杂原子，以及m是1-5的整数。
优选C1-C8烷基是甲基、乙基、丙基、丁基和异戊基。C3-C7环烷基的实例包括环丙基、环戊基和环己基。C3-C7环烷基取代的C1-C5烷基的实例包括环己基甲基、环戊基甲基和2-环戊基乙基。取代的C1-C5烷基的实例包括2-羟基乙基、2-甲氧基乙基、三氟甲基、2-氟乙基、2-氯乙基、3-氨基丙基、2-(4甲基-1-哌嗪基)乙基、2-(4-吗啉基)乙基、2-氨基羰基乙基、2-二甲氨基乙基、3-二甲氨基丙基。优选的芳基是苯基，所述的苯基被Cl、F、甲氧基、硝基、氰基、甲基、三氟甲基、二氟甲氧基基团选择取代。含有N、O和/或S的5-6元杂环基包括哌嗪基、吗啉基、噻唑基、吡唑基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、三唑基、四唑基。C7-C10芳烷基的实例包括被Cl、F、甲氧基、硝基、氰基、甲基、三氟甲基和二氟甲氧基基团选择取代的苄基或苯乙基。优选的，R1是氢、C1-C8烷基、芳基或C7-C10芳烷基，可被选择取代，优选被卤原子取代。优选的X是O，R2是C2-C3烷基或取代的烷基，和R3是呋喃基。
特别优选的化合物是其中为下述定义的化合物：R是苯乙基基团，其中的苯环被一个或多个选自下述的基团选择取代：氯、氟原子、甲氧基、硝基、氰基、甲基、三氟甲基、二氟甲氧基基团。
下述结构式表示了A可能的意义：
Figure A9980659400091
本发明化合物可被用于调节包括人在内的哺乳动物的腺苷A3受体的方法。该方法包括给哺乳动物施用足以能够调节腺苷A3受体的有效量的式Ⅰ化合物，该化合物的用途包括：
●治疗高血压；
●治疗炎性疾病，如类风湿关节炎和牛皮癣；
●治疗变应性疾病如枯草热和过敏性鼻炎；
●巨细胞脱粒；
●抗肿瘤药剂；
●治疗心脏低氧；
●避免大脑缺血；
●诊断应用，例如，测定是否存在一种或多种上述的医学症状，或在筛选试验中测定其它化合物与A3 Ado受体结合的有效性(即通过如在各种结合试验中测定的竞争性抑制)，如下述文献所述：Jacobson和Van Rhee,Purinergic approaches to experimental therapy,Jacobson和Jarvis,Wiley等人，New York,1997,pp.101-128；Mathot等人，Brit.J.Pharmacol.,116:1957-1964(1995)；van der Wenden等人，J.Med.Chem,38:4000-4006(1995)；和van Calenbergh,J.Med.Chem.,40:3765-3772(1997)，上述内容被引用作为参考。
本发明化合物还可用于完全或部分抑制包括人在内的哺乳动物的腺苷酸环化酶(A3)的方法。该方法包括给哺乳动物施用足以能完全或部分抑制哺乳动物的腺苷酸环化酶的有效量的式Ⅰ化合物。该化合物可以被标记，用标记的化合物检测是否存在含有腺苷A3配体的肿瘤细胞，使该化合物与A3受体结合，并测定存在的标记物。
本发明化合物可用于药物制剂，该制剂包括式Ⅰ化合物和一种或多种辅剂。多种化学中间体可用于制备本发明化合物。
附图说明
图1说明了[125I]AB-MECA(fmol/mg蛋白质)与人体A3受体结合的饱和度，以HEK293细胞对[125I]AB-MECA的摩尔浓度表示。
图2说明了[125I]AB-MECA(fmol/mg蛋白质)与人体A3受体结合的饱和度，以JURKAT细胞系对[125I]AB-MECA的摩尔浓度表示。如图所示，用[125I]AB-MECA检测出的A3受体在Jurkat细胞膜中的密度接近于300fmol/mg蛋白质。
图3和4说明了氚标记的类似化合物47-5-[[(4-甲氧基苯基)氨基]羰基]氨基-8-丙基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物102)(fmol/mg蛋白质)与A3受体结合的饱和度，以JURKAT细胞系对化合物102的摩尔浓度表示。由所述图中的数据表明人体的肿瘤细胞中存在着高密度的腺苷A3受体。例如，在Jurkat细胞中检测出大约1300fmol/mg蛋白质，在HL 60细胞中检测出大约650fmol/mg蛋白质。因此，对于检测腺苷A3受体来说，化合物102是比[125I]AB-MECA更灵敏的工具。这些发明有助于测定许多人体肿瘤细胞中的A3受体。
发明的详细描述
本申请公开了有可能用作腺苷受体的选择性调节剂的化合物，其活性是A3的激动剂，在某些情况下，是A3的拮抗剂，以及该化合物的制备方法和和应用。
本发明化合物还可用于调节包括人在内的哺乳动物的腺苷A3受体的方法，该方法包括给哺乳动物施用足以能调节腺苷A3受体有效量的式Ⅰ化合物。
本发明化合物可用于药物制剂，该制剂包括式Ⅰ化合物和一种或多种辅剂。多种化学中间体可用于制备本发明化合物。定义
如本文所用的，如果本发明化合物能够完全抑制腺苷酸环化酶(A3)，并且在竞争结合试验中能够代替[125I]AB-MECA，该化合物是腺苷A1受体激动剂。
如本文所用的，如果本发明化合物能够部分抑制腺苷酸环化酶(A3)，并且在竞争结合试验中能够代替[125I]AB-MECA，该化合物是腺苷A3受体的部分激动剂。
如本文所用的，如果本发明化合物能够防止刺激引起的抑制，并且在竞争结合试验中能够代替[125I]AB-MECA，该化合物是腺苷A3受体的拮抗剂。
如本文所用的，如果A1/A3和A2/A3的活性之比大于约50，优选为50-100，更优选大于大约100，本发明化合物会选择A3受体。
如本文所用的，术语“烷基”是指一价直链或支链或环状烷基基团，优选含有1-20个碳原子，更优选含有1-10个碳原子(“低级烷基”)，最优选1-6个碳原子。此术语的实例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、正丁基等。术语“亚烷基”和“低级亚烷基”是指相应烷基的二价基团。进一步地，如本文所用的，其它部分是从烷基衍生的基团，如烷氧基、烷酰基、链烯基、环烯基等，当加上“低级”的修饰时，低级是指10个或更少的碳链。在下面的情况下，碳的最少数目大于1，例如链烯基(最少两个碳原子)，环烷基(最少三个碳原子)，可以理解的是，“低级”是指至少是最小的数目的碳原子。
如本文所用的，术语“取代的烷基”是指具有1-5个取代基，优选1-3个取代基，并且优选1-10个碳原子(“取代的低级烷基”)的烷基，所述的取代基选自下述基团：烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、取代的环烷基、链烯基、取代的链烯基、酰基、酰胺基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧代酰胺基、氰基、卤素、羟基、酮基、硫代酮基、羧基、羧基烷基、硫醇、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、羟胺基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、-SO2-芳基、-SO2-杂芳基、一或二-芳基氨基、一或二-(取代烷基)氨基、一或二-杂芳基氨基、一或二-杂环基氨基，和具有选白烷基、芳基、杂芳基、和杂环基的不同取代基的不对称的二取代的胺。如本文所用的，其它部分具有的字头“取代的”是指包括一个或多个上文所述的取代基。
如本文所用的，术语“烷芳基”是指具有芳基取代基的烷基，通过烷基键合。术语“芳烷基”是指具有烷基取代基的芳基，通过芳基键合。
如本文所用的，术语“烷氧基”是指基团“烷基-O-”，其中的烷基如上文定义。优选的烷氧基基团包括实例甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基、1,2-二甲基丁氧基等。
如本文所用的，术语“链烯基”是指优选具有2-10个碳原子，更优选具有2-6个碳原子，并且至少、和优选有1-2个烯基不饱和键的烯基基团，优选的烯基基团包括乙烯基(-CH=CH2)、正丙烯基(-CH2CH=CH2)、异丙烯基(-C(CH3)=CH2)等。
如本文所用的，术语“炔基”是指优选具有2-10个碳原子，更优选具有2-6个碳原子，并且至少、和优选有1-2个炔基不饱和键的炔基基团。
如本文所用的，术语“酰基”是指基团烷基-C(O)-、取代的烷基-C(O)-、环烷基-C(O)-、取代的环烷基-C(O)-、芳基-C(O)-、杂芳基-C(O)-和杂环基-C(O)-，其中的烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、杂芳基或杂环基如本文定义。
如本文所用的，术语“酰胺基”是指基团-C(O)NRR，其中的R各自独立地是氢、烷基、取代的烷基、芳基、杂芳基或杂环基，其中的烷基、取代的烷基、芳基、杂芳基或杂环基如本文定义。
如本文所用的，术语“芳基”是指具有6-14个碳原子，和具有单环(如苯基)或多个稠合(condensed,fused)环(如萘基或蒽基)的不饱和芳族碳环基团。优选的芳基包括苯基、萘基等。除非对芳基取代基的定义另有说明，这些芳基基团可选择地被1-5个取代基，优选1-3个取代基所取代，所述的取代基选自下述基团：羟基、酰基、烷基、烷氧基、链烯基、炔基、取代的烷基、取代的烷氧基、取代的链烯基、取代的炔基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、酰氧基、酰胺基、烷芳基、芳基、芳氧基、叠氮基、羧基、羧基烷基、氰基、卤素、硝基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、氨基酰氧基、氧基酰胺基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、-SO2-芳基、-SO2-杂芳基、三卤代甲基。优选的取代基包括烷基、烷氧基、卤素、氰基、硝基、三卤代甲基和硫代烷氧基。
如本文所用的，术语“环烷基”是指具有3-12个碳原子，和具有单环或多个稠合环的环烷基基团。这些环烷基基团的实例包括单环结构如环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等，或者多环结构如金刚烷基等。
如本文所用的，术语“卤”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘，优选氟或氯。
如本文所用的，术语“杂芳基”是指具有1-15个碳原子和至少在一个环上(如果有一个以上的环时)具有1-4个选自氧、氮和硫的杂原子的芳族碳环基团。
除非对杂芳基取代基的定义另有说明，这些杂芳基基团可选择地被1-5个取代基，优选1-3个取代基所取代，所述的取代基选自下述基团：羟基、酰基、烷基、烷氧基、链烯基、炔基、取代的烷基、取代的烷氧基、取代的链烯基、取代的炔基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、酰氧基、酰胺基、烷芳基、芳基、芳氧基、叠氮基、羧基、羧基烷基、氰基、卤素、硝基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、氨基酰氧基、氧基酰胺基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、-SO2-芳基、-SO2-杂芳基和三卤代甲基。优选的取代基包括烷基、烷氧基、卤素、氰基、硝基、三卤代甲基和硫代烷氧基。这些杂芳基基团可以是单环(例如吡啶基或呋喃基)，或是多个稠合环(如中氮茚基或苯并噻吩基)。
术语“杂环”或“杂环的”是指具有1-15个碳原子，和在环内具有1-4个选自氮、硫和氧的杂原子的单环或多个稠合环的一价饱和与不饱和基团。
除非对这些杂环取代基的定义另有指示，这些杂环基团可选择地具有1-5个选自下述的取代基：烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、芳氧基、卤素、硝基、杂芳基、硫醇基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、三卤代甲基等。这些杂环基可以是单环或多个稠合环。
当然，可以理解的是，就含有一个或多个取代基的任一上述基团而言，这些基团都不含有在立体结构上是不实际的，和/或在合成上是不可能的取代基或取代基类型。
如本文所用的“羧酸衍生物”和“磺酸衍生物”是指-C(X)R1、-C(X)-N(R1)2、-C(X)OR1、-C(X)SR1、-SOnR1、-SOnOR1、-SOnSR1或-SOn-N(R1)2，式中的X是O、S和NR1，其中R1是氢、烷基、取代的烷基或芳基，及其活性衍生物，例如，酸酐、酯和卤化物，如氯化物、溴化物和碘化物，采用标准的偶合方法，可将它们与羧酸或磺酸的衍生物偶合，成为5′-胺。
“药用盐”是指化合物式ⅠA、ⅠB或ⅠC的药学上可接受的盐，这些盐是由本领域已知的各种有机和无机的平衡离子衍生得到的盐，例如仅作为实例的包括钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；以及当分子中含有碱性官能团时，有机或无机酸的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等都可以作为药学上可接受的盐。
术语“保护基团”或“封闭基团”是指任何下述基团：其中当其键合于本发明化合物(包括其中间体如氨基内酰胺类，氨基内酯类等)的一个或多个羟基、氨基或羧基基团时，能够防止这些基团与发生反应，以及可通过常规的化学方法或酶方法重新恢复成羟基、氨基或羧基。优选的可除去的氨基保护基团例如包括是下述常用的基团：叔丁氧基羰基(t-BOC)、苄氧羰基(CBZ)等，这些基团可用与产品的性质相容的条件除去。
本文使用了下述缩写，缩略语：[125I]AB-MECA,[125I]N6-(4-氨基-3-碘代苄基)腺苷-5′N-甲基糖醛酰胺；(R)-PIA,(R)-N6-(苯基异丙基)腺苷；DMSO，二甲亚砜；I-AB-MECA,[125I]N6-(4-氨基-3-碘代苄基)腺苷-5′N-甲基糖醛酰胺；IB-MECA，[125I]N6-(3-碘代苄基)腺苷-5′N-甲基糖醛酰胺；Ki，抑制平衡常数；NECA,5′N-乙基甲酰胺基腺苷；THF，四氢呋喃；Tris，三(羟甲基)氨基甲烷。化合物的制备
化学领域的熟练技术人员知道，在进行特定的反应或系列反应之前，通常必须把反应活性和片段的官能团保护起来，在最后的反应完成之后，使它们恢复到最初的形式。一般是把它们转化成相对稳定的衍生物。例如，可以把羟基转化成醚，将氨基转化成酰胺或氨基甲酸酯。保护或脱保护的方法，也就是所谓的“封闭”和“解封”的方法在本领域是已知的和广泛应用的，例如参见T.Green,Protective Groupsin Organic Synthesis,John Wiley,New York(1981)或Protective Groupsin Organic Chemistry,Ed.J.F.W.McOmie,Plenum Press,London(1973)。
优选用已知的化学方法使下式Ⅱ化合物与适当的羧酸或磺酸衍生物反应制备本发明化合物，式Ⅱ化合物可按照下述反应流程Ⅰ和Ⅱ制备，其中的R3是呋喃。
Figure A9980659400172
试剂：A)原甲酸三乙酯；B)2-糠酸酰肼，2-甲氧基乙醇；C)PhOPh,260℃；D)10％HCl，回流；E)氨腈，pTsOH,N-甲基吡咯烷酮。流程Ⅱ
Figure A9980659400181
试剂：F)糠酸酰肼，二苯醚；E)氨腈，pTsOH,N-甲基吡咯烷酮。
式Ⅰ化合物可通过反应流程Ⅰ所述的间接方法制备，或者通过反应流程Ⅱ所述的直接方法制备。两种流程的适当原料是式Ⅲ的杂环的邻-氨基腈化物，它们通常可按照E.C.Taylor和A.McKillop(Vol,7Advances in Organic Chemistry,Interscience出版，1970)的书中的文献和报告所描述的已知方法制备。
Figure A9980659400191
通过与过量的原甲酸三乙酯在回流温度下反应8-10小时，将邻-氨基腈化物Ⅲ转化成式Ⅳ的亚氨酸酯。如对反应的粗产物进行IR和1H NMR分析所证明的，在蒸发除原甲酸三乙酯以后，该反应可以高产率得到基本纯的亚氨酸酯Ⅳ。
Figure A9980659400192
然后，使式Ⅳ的亚氨酸酯进行下述两步反应，以高产率得到式Ⅵ的三环结构。
Figure A9980659400193
反应顺序包括：a)在2-甲基乙醇溶液中与2-糠酸酰肼在回流温度下反应8-10小时，得到中间体化合物V；b)后者经过热环合得到相应的式Ⅵ化合物，反应在二苯醚中于260℃进行0.5-1小时。
然后，三环化合物Ⅵ用HCl回流水解1-3小时得到三唑Ⅶ，最后，该化合物在N-甲基吡咯烷酮中和在对甲苯磺酸存在下与氨腈进行环化反应成为所需要的化合物Ⅱ(反应流程Ⅰ)。
Figure A9980659400201
Figure A9980659400202
在某些情况下，在二甲苯中加热邻-氨基腈化物Ⅲ和2-糠酸酰肼可直接得到三唑Ⅶ。然后如反应流程Ⅱ环化三唑Ⅶ。在下面的流程Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ中，更详细地描述了其中A为三唑环的式Ⅱ化合物的合成。
                 流程Ⅲ
5-氨基-7-取代的-2-(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的合成
Figure A9980659400211
               流程Ⅳ
5-氨基-8-取代的-2-(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的合成
试剂：A)糠酸酰肼，PhOPh,260℃；B)NH2CN,pTsOH,N-甲基吡咯烷酮。
                       流程Ⅴ
5-氨基-9-取代的-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶衍生物的合成
Figure A9980659400231
试剂：A)糠酸酰肼，PhOPh,260℃；B)NH2CN,pTsOH,N-甲基吡咯烷酮。
最后，使含有5-氨基的化合物Ⅱ与羧酸、磺酸、活化的羧酸、活化的磺酸、硫代羧酸、活化是硫代羧酸等进行反应，以形成所需的化合物。活化的羧酸包括酰卤、酯、酸酐和其它与胺反应形成酰胺的已知衍生物。活化的磺酸包括磺酰胺如磺酰氯。
在各种情况下，有必要使用活化的羧酸和磺酸衍生物。应用标准的偶合化学方法，酸本身可以与胺偶合，例如，用二环己基二酰亚胺(DCI)和其它常用的偶合剂偶合。形成酰胺键的适当偶合条件是肽合成领域熟练技术人员已知的。
一般来说，在用3-氰基-2-氨基吡唑作为原料时，上述化学方法可用来制备8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶。在非质子极性溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)中，使3-氰基-2-氨基吡唑和烷基卤(RX)反应，可在一个环氮原子上引入R基团。所得到的化合物与原甲酸三乙酯一起回流可得到亚胺乙酯，使其与糠酸酰肼反应，优选用Dean-Stark阱共沸，以除去反应所形成的水，从而得到8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶。该产物用色谱纯化，例如以(EtOAc/己烷1∶1)洗脱，用于后续的化学反应。
所述反应的产物与适当的酸如HCl回流反应，接着在溶剂如N-甲基吡咯烷酮中，以对甲苯磺酸为催化剂，在提高的温度下，使其与氨腈进行反应。得到5-氨基-8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶。
这些氨基取代的化合物可与适当的异氰酸酯反应形成脲化合物，与活化羧酸如酰卤反应得到酰胺，与活化的磺酸如磺酰卤反应形成磺酰胺，或与其它的羧酸或磺酸衍生物反应形成其它所需的化合物。
三唑-三唑-嘧啶化合物可用类似的化学方法制备，但是要用适当的官能化的叠氮化物作原料，使叠氮化物和H2NC(O)CH2CN反应，形成起始的杂环，接着酰胺基与脱水剂如POCl3反应，形成腈化物。所得到的氰基-氨基三唑可以与上面讨论的3-氰基-2-氨基吡唑同样的方式进行反应，制备三唑-三唑-嘧啶。放射性标记类似物的合成
所述化合物可以用任何适当的放射性标记物标记。适当的放射性标记物的实例包括3H和14C，并可使用任何药动学研究中常用的基本无毒的放射性标记物。在有机化合物中引入放射性标记物的方法是本领域熟练技术人员已知的。
当化合物是5-[[(取代的苯基)氨基]羰基]氨基-8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶化合物或5-氨基-8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶化合物时，引入钏标记是相当简单的。
在一个实施方案中，适当的原料是其中8-位的(芳)烷基基团包括有双键。在适当催化剂入钯-碳或其它的氢化催化剂存在下，使该双键与氚进行反应。
例如，通过使5-[[(4-甲氧基苯基)氨基]羰基]氨基-8-(1-丙烯基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物101)的双键和氢进行加成反应可制备5-[[(4-甲氧基苯基)氨基]羰基]氨基-8-(1,2-二(三氚丙基))-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物102)。下文将就化合物102对JURKAT癌细胞的键合亲和力进行讨论。
另外，和5-氨基化合物反应以形成5-位的酰胺、脲或其它基团的化合物之中可存在氚标记。例如，用于制备本文所述5-氨基羰基氨基化合物的异氰酸酯可以有氚标记或其它放射性标记，因此，可以很容易地将它们引入最终产物。
在另一实施方案中，当环系在一起时，可以把放射性标记引入分子之中。如上所述，关于式Ⅱ化合物的合成，将各种式Ⅵ的三环化合物用盐酸水解，可得到式Ⅶ的三唑，如反应流程Ⅰ所述，在对甲苯磺酸存在下，使该化合物和氨腈回流反应，进行环化。使用14C标记的氨腈，在合成的此阶段，很容易引入14C标记。
例如，在和5-氨基基团反应的芳族化合物中引入放射活性的碘可制备碘化的化合物。在芳环上引入碘对本领域技术人员而言是已知的。的芳族化合物上引入碘原子是很简单的，所述的芳族化合物用于和5-氨基基团反应以制备本发明化合物。
相应的，就本领域普通技术人员而言，很容易制备适当的放射性标记类似物。荧光标记类似物的合成
和带有放射性标记化合物一样，荧光标记化合物的合成是相对简单的。虽然荧光基团存在于R3-位置液是可行的，但优选荧光基团存在于R2-位置上。在一个实施方案中，所述的一个或多个荧光基团包括可与呋喃环连接的R3位置。另外，也可利用其它的芳族环。荧光标记是本领域技术人员所熟知的，并且用已知方法很容易将其连接于本文所述的化合物上。应用化合物的方法
本发明化合物可用于A3受体的激动剂和拮抗剂的所有症状，包括：
●治疗高血压；
●治疗炎性疾病，如类风湿关节炎和牛皮癣；
●治疗变应性疾病，如花粉哮喘和过敏性鼻炎；
●巨细胞脱粒；
●抗肿瘤剂；
●治疗心脏低氧；和
●防止大脑缺血；
以及如Jacobson,TIPS,1998年5月，pp.185-191中所述，本文引用该文献的内容作为参考。
这些化合物一种优选的应用是检测和/或治疗癌症。如下文所讨论的，已经指出肿瘤细胞用A3受体表示。在细胞没有得到适当的血液供应时，人们确信A3受体能够保护细胞不受缺血的损害。有几种可买到的药物以及最近新开发的药物适用于抑制VEGF表达，它能够切断肿瘤细胞的血液供应。但是，在细胞没有得到适当的血液供应时，腺苷A3受体的兴奋可产生保护作用，防止肿瘤细胞死亡。通过和抗-VEGF或其它抗血管生成化合物一起施用这些受体的拮抗剂，可以切断肿瘤细胞新的血液供应，并失去A3受体兴奋对缺血损害的保护作用。
本发明化合物可通过任何药物可接受的途径施用于患者，适当的给药途径包括口服、直肠、局部或非肠道(包括皮下、肌内和静脉内)给药，口服和非肠道给药是优选的。
作为腺苷受体调节剂使用时所需化合物的量当然可以随需要治疗的哺乳动物个体而变化，而且基本是由医学或志愿开业医师进行选择。应该考虑的因素包括需要处理的症状，给药的途径，制剂的性质，哺乳动物的体重、表面积、年龄和基本条件，和给药的特定化合物。但是适当的有效剂量是在每天每公斤体重大约0.1μg/kg至大约10μg/kg的范围内，优选在每天每公斤体重大约1mg/kg至大约3mg/kg的范围内。
每天的总剂量可以是一次剂量，也可以是多次的剂量，例如每天给药2-6次，或在选定的时间内通过静脉输注。上文所述剂量范围以上或以下均在本发明的保护范围之内，在需要和必要时可给个别患者施用所述范围以上或以下的剂量。例如，对于一75公斤的哺乳动物，每天的剂量范围可以是大约75mg至大约220mg，典型的剂量可以是每天大约150mg。如果选择的处方是多次剂量，典型的是每天分三次给药50mg化合物进行治疗。
在另一实施方案中，为了进行实验以确定有或没有表达为A3受体的癌性肿瘤细胞，可给患者施用放射性标记的本发明化合物。将本文所述的对A3受体亚型具有相当高亲和力的化合物施用于患者，在该化合物与肿瘤细胞中存在的A3受体结合以后，他测定放射性标记化合物所处的位置即可确定化合物的位置。测定放射性标记化合物的位置和剂量的仪器是本领域熟练技术人员已知的。
在外科手术中应用放射性标记和或荧光标记化合物确定癌组织转移也是有优势的。通常，外科需要确定癌组织确实转移了。可在手术前或手术之中将放射性标记或荧光标记的化合物施用于患者，它们将会和患者的癌细胞结合。给药的时间可以是变化的，在其他因素中它取决于特定肿瘤细胞对使用的特定化合物的吸收，以及肿瘤在体内的位置。手术后只需要进行简单的实验，以便在取出肿瘤后测定残留的癌细胞。应用本领域熟练技术人员已知的分析仪器，通过测定手术部位的荧光或放射性可确定是否存在残留的癌细胞。
癌细胞的离体测定可通过下述方法进行：将化合物施用于处于细胞培养介质的细胞悬浮液中，使化合物与癌细胞的腺苷A3受体结合，并测定标记物。制剂
上述化合物优选以含有活性化合物的制剂形式给药，即将式Ⅰ化合物和用药模式的可接受载体一起给药。适当的药学上可接受的载体是本领域技术人员已知的。
组合物可选择地包括其它治疗用活性组分，如抗抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗菌剂、抗感染剂、镇痛剂和免疫抑制剂。在与其它制剂组分相容的意义上，载体必须是药学上可接受的，并且对其接受者不能有害。
制剂中可包括适合于口服、直肠、局部或或非肠道(包括皮下、肌内和静脉内)给药的载体，优选的载体是适合于口或非肠道给药的载体。
适于非肠道给药的制剂通常包括活性化合物的无菌含水制剂，优选与接受者等渗的制剂。这些制剂通常含有蒸馏水，在蒸馏水或盐水中含有5％葡萄糖。有用的制剂也可以包括含有式(Ⅰ)化合物的浓溶液或固体，然后用适当的溶剂稀释得到上述适于非肠道给药的溶液。
对于肠道给药，可将本发明化合物掺入惰性载体使之成为不连续的单元，例如胶囊、小袋、片剂或锭剂，各种制剂都含有预订量的活性化合物；如粉剂或颗粒剂；或是在含水或非水悬浮液或溶液中的制剂，如糖浆、酏剂、乳剂或饮剂。适当的载体可以是淀粉或糖，并可包括润滑剂、芳香剂、粘合剂和其它相同性质的材料。
片剂可采用压制或模具成型的方法制备，可选择的有一种或多种附加成分。压制的片剂可采用适当的机器，将自由流动形式的活性化合物如粉末或颗粒进行压制，其中所述的活性化合物中还可选择的有一种或多种附加成分，如粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂。压模制备的片剂可用适当的机器，将含有任何适当载体的活性化合物进行模具成型来制备。
糖浆或悬浮液的制备是将活性化合物加入浓的、糖如蔗糖的水溶液，其中还可以加入任何附加成分。这些附加成分可包括芳香剂、能延缓糖结晶的试剂或能增加任何其它成分溶解度的试剂，例如多元醇，如甘油或山梨醇。
本发明化合物也可以局部应用的溶液、软膏、霜剂、胶状物、洗剂或聚合物(例如PluronicTM，BASF)的形式局部给药，它们可用药学领域的常规方法制备。除了溶液、软膏、霜剂、胶状物、洗剂或聚合物基制剂和活性成分以外，这些局部给药制剂还可以含有防腐剂、香味剂和其它活性药剂。
直肠给药的制剂可以为含有常规载体如作为栓剂基质的可可脂或Witepsol S55(Dynamite Nobel Chemical，Germany的注册商标)。
另外，本发明化合物还可以脂质体和微球(或微粒)的形式给药。给患者使用的脂质体和微球可用本领域技术人员已知的方法制备。这里引用US专利4,789,743的内容作为参考，其中描述了使脂质体成胶囊的生物材料。所述的材料基本上可溶解于水溶液，必要时，加入表面活性剂的同时可加入磷脂和类脂物，以及在需要时加入钭析或超声处理的材料。关于已知方法的综述见G.Gregoriadis，第十四章，“Liposomes”,Drug Carries in Biology and Medicine，pp.287-341(Academic Press,1979)。聚合物和蛋白质形成的微球是本领域熟练技术人员已知的，并可制备用来经过胃肠道直接进入血流。另外，也可把本发明化合物掺入从数天至数月的一定时间范围内缓慢释放的微球、微球的组合体。例如。参见US专利4,906,474、4,925,673和3,625,214，本文引用所述的的内容作为参考。
优选的微粒是用生物可降解的聚合物如聚乙醇酸交酯、聚交酯和它们的共聚物。根据各种因素，包括所需的药物释放速度和所需的剂量，本领域熟练技术人员很容易确定适当的载体系统。
制剂通常以单位剂量的形式存在，并可以药学领域已知的方法制备。所有的方法都包括引入活性化合物，使其与载体结合的阶段，所述的载体由一种或多种附加成分构成。一般来说，制剂的制备是把活性化合物均匀地和直接地与液体载体或精细分散的固体载体结合，然后，将产品加工成形为所需的单位剂量形式。
除了上述的成分以外，制剂中还可进一步包括一种或多种其它药学制剂领域常用的选择性的附加成分，如稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、增稠剂、润滑剂、悬浮剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等。化合物活性程度的测定
仅用下述实验中的任一常规实验就可容易地测定本发明化合物的活性。大鼠的A1和A2A腺苷受体结合实验膜的制备：
将雄性Wistar大鼠(200-250g)去头，在冰中解剖全脑(微脑干、纹状体和小脑)。在Polytron(第5档)于20体积的50mM Tris-HCl,pH7.4破碎脑组织。然后匀浆在48,000g离心10分钟，小球悬浮于Tris-HCl，其中含有2IU/ml腺苷脱氨酶，Ⅵ型(Sigma Chemical Company,St.Louis,Mo.,USA)。于37℃孵化30分钟后，离心膜，将小球储存在-70℃。纹状体组织在Polytron于25体积的50mM Tris-HCl缓冲溶液中匀浆，所述的缓冲溶液中含有10mM MgCl2,pH7.4。然后匀浆于4℃在48,000g离心10分钟，并悬浮于含有2IU/ml腺苷脱氨酶的Tris-HCl缓冲溶液中。于37℃孵化30分钟后，离心膜，并将小球储存在-70℃。放射性配体结合实验：
[3H]-DPCPX(1,3-二丙基-8-环戊基黄嘌呤)和大鼠脑膜的结合基本上可按照Bruns等人，Proc.NatlAcad.Sci.77,5547-5551,1980所述的方法进行。替代实验可在0.25ml含有1nM[3H]-DPCPX、100μl大鼠脑的稀释膜(每次实验100μg蛋白质)，以及至少6-8个不同浓度的试验化合物。在有10μM CHA(N6环己基腺苷)存在的情况下可测定非特异性结合，它常常≤总结合量的10％。在25℃典型的孵化时间是120分钟。
[3H]-SCH 58261(5-氨基-7-(2-苯基乙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶)和大鼠纹状体膜(每次实验100μg蛋白质)的结合可按照Zocchi等人，J.Pharm.and Exper.Ther.276:398-404(1996)所述的方法进行。在竞争研究中，至少使用6-8个不同浓度的试验化合物。在有50μM的NECA(5′-(N-乙基羧酰胺基)腺苷)存在的情况下测定非特异性结合。在25℃孵化时间是60分钟。
用Brandel细胞收集器(Gaithesburg,MD,USA)，通过GF/B玻璃过滤器过滤试验混合物可分离结合的和游离的放射性。培养的混合物可用3ml冰冷却的孵化缓冲溶液稀释，快速真空过滤，过滤器用3ml孵化用缓冲溶液洗涤3次。测定过滤器上的结合的放射性，例如用液体闪烁计数器测定。可以测定蛋白质浓度，例如，按照Bio-Rad方法(Bradford,Anal.Biochem.72:248(1976))，以牛清蛋白为参考标准测定蛋白质浓度。人体克隆A3腺苷受体结合实验
受体结合实验：按照Salvatore等人，Proc.Natl.Acad.Sci.90:10365-10369(1993)所述的方法进行结合实验。在饱和度研究中，由HEK-293细胞，经人体A3腺苷受体的重组体(Research BiochemicalInternational,Natick,MA,USA)转染的一份膜(8mg蛋白质/ml)，用10-12种不同浓度的，在0.1-5nM范围内的[125I]AB-MECA孵化。竞争实验可进行重复试验，在含有0.3nM  [125I]AB-MECA、50mM Tris-HCl缓冲溶液、10mM MgCl2,pH7.4和20μl稀释膜(12.4mg蛋白质/ml)的试管中进行，最终体积为100μl，并且至少有6-8个不同浓度的测定配体。
按照前时程(previous time-course)实验，在37℃孵化时间是60分钟。用Brandel细胞收集器，通过Whatman GF/B玻璃过滤器过滤试验混合物可分离结合的和游离的放射性。在有50μM R-PIA存在的情况下可测定非特异性结合，并且大约是总结合量的30％。培养的混合物可用3ml冰冷却的孵化缓冲溶液稀释，快速真空过滤，过滤器用3ml孵化用缓冲溶液洗涤3次。用Beckman gamma 5500B γ计数器测定过滤器上结合的放射性。按照Bio-Rad方法(3)可测定蛋白质浓度，以牛清蛋白为参考标准。数据分析
按照Cheng & Prusoff公式(Cheng和Prusoff，Biochem.Pharmacol.22:3099-3018(1973))，由IC50可计算出抑制结合常数Ki,Ki=IC50/(1+[C*]/KD *)，其中[C*]是放射性配体的浓度，KD *是解离常数。
加权非线形最小二乘方曲线结合程序LIGAND(Munson和Rodbard，Anal.Biochem.107:220-239(1990))可用于饱和度和抑制率实验的计算机分析。数据以几何平均值表示，括号内的置信度在95％或99％。
实施例
下面的实施例说明了本发明的各个方面，但不应该限制本发明。在这些实施例中常用的符号是目前国际上的化学文学，例如Journal ofthe American Chemical Society(“J.Am.Chem.Soc.”)和Tetrahedron中通常所使用的。实施例1：8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物18-25)的制备
按照下述流程Ⅵ所述的合成路线制备8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶。
反应流程Ⅵ：制备8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物18-25)的一般方法
试剂：a)NaH,DMF,RX；b)HC(OEt)3，回流；c)2-糠酸酰肼，MeO(CH2)2OH；d)Ph2O,260℃，快速色谱
在制备化合物18-25时，将1(10mmol)的40ml冷却至0℃的DMF溶液用氢化钠处理，反应是在10分钟内将氢化钠分批加入。45分钟后，加入适当的(芳)烷基卤化物(12mmol)，将反应混合物加热至25℃，并搅拌3-5小时(TLC:EtOAc 1∶1)。加水(80ml)使反应停止，水层用乙酸乙酯(5×25ml)萃取，合并有机层，硫酸钠干燥，过滤和减压浓缩，得到烷基化的吡唑(2-9)，是N1和N2异构体(比例大约是1∶4)未分离的混合物。然后将此未分离的N1和N2-取代的-4-氰基-5-氨基吡唑(2-9)溶于原甲酸三乙酯(60ml)，该溶液在氮气中回流8小时。真空除去溶剂，由油状残余物由亚胺酸酯(10-17)构成，将其溶于2-甲氧基乙醇(50ml)，加入2-糠酸酰肼(13mmol)。回流混合物5-10小时，然后冷却，减压除去溶剂，环化得到的黑色油状残余物，在二苯醚(50ml)中，于260℃进一步进行其它纯化步骤，用Dean-Stark蒸馏器进行共沸蒸馏以除去反应所产生的水。1.5小时后，将混合物倾入己烷(300ml)中，冷却。过滤出沉淀，用色谱纯化(乙酸乙酯/己烷1∶1)。按照此方法，以好的总产率得到主要产物(N8烷基化)(18-25)。
按照上述的一般方法制备了下述化合物：
8-甲基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物18)
产率45％；黄色固体，M.P.155-156℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):1615,1510cm-1；1H NMR(DMSO d6)δ:4.1(s,1H)；6.32(m,1H)；7.25(m,1H)；8.06(m,1H)；8.86(s,1H)；9.38(s,1H)。
8-乙基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物19)
产率50％；浅黄色固体，M.P.188-189℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):1620,1500cm-1；1H NMR(DMSO d6)δ:1.67(t,2H,J=7)；4.53(q,2H,J=7)；6.59(m,1H)；7.23(m,1H)；7.64(s,1H)；8.34(s,1H)；9.10(s,1H)。
8-丙基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物20)
产率60％；黄色固体，M.P.189-190℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):1600,1505cm-1；1H NMR(DMSO d6)δ:0.98(t,2H,J=7)；2.03-2.10(m,2H)；4.41(q,2H,J=7)；6.60(m,1H)；7.24(m,1H)；7.64(s,1H)；8.32(s,1H)；9.10(s,1H)。
8-丁基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物21)
产率50％；浅黄色固体，M.P.245-247℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):1610,1500cm-1；1H NMR(DMSO d6)δ:0.9(m,3H)；1.3(m,2H)；1.9(m,2H)；4.5(t,2H,J=7.2)；6.2(m,1H)；7.3(m,1H)；8.0(m,1H)；8.9(s,1H)；9.4(s,1H)。
8-异戊基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物22)
产率54％；浅黄色固体，M.P.235-237℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):1635,1510,1450cm-1；1H NMR(DMSO d6)δ:1.0(d,6H,J=6.2)；1.5-1.9(m,3H)；4.6(t,2H,J=7.4)；6.6(m,1H)；7.3(m,1H)；7.7(m,1H)；8.8(s,1H)；9.1(s,1H)。
8-(2-异戊烯基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物23)
产率48％；黄色固体，M.P.210-212℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):1625,1500,1430cm-1；1H NMR(DMSO d6)δ:1.79(s,3H)；1.87(s,3H)；5.05(d,2H,J=6)；5.55-5.63(m,1H)；6.60(m,1H)；7.24(m,1H)；7.64(s,1H)；8.34(s,1H)；9.10(s,1H)。
8-(2-苯乙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物24)
产率56％；M.P.268-270℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):1660,1510,1450cm-1；1H NMR(DMSO d6)δ:3.32(t,2H,J=6.7)；4.72(t,2H,J=6.7)；6.73(s,1H)；7.23(m,5H)；7.95(s,1H)；8.8(s,1H)；9.41(s,1H)。Anal.(C18H14N6O)C,H,N.
8-(3-苯丙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物25)
产率63％；黄色固体，M.P.165-166℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):1630,1500,1440cm-1；1H NMR(DMSO d6)δ:2.34-2.48(m,2H)；2.67(t,3H,J=7.5)；4.43(t,2H,J=7.5)；6.61(m,1H)；7.16-7.32(m,6H)；7.64(d,1H,J=2)；8.29(s,1H)；9.02(s,1H)。实施例2：5-氨基-8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物33-40)的制备
按照下述流程Ⅶ所述的合成路线制备5-氨基-8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶。
Figure A9980659400371
反应流程Ⅶ：制备5-氨基-8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物33-40)的一般方法
试剂：a)HCl，回流；b)NH2CN,1-甲基-2-吡咯烷酮，pTsOH,140℃
在制备化合物33-40时，将三唑-嘧啶(18-25)(10mmol)的10％盐酸水溶液(50ml)回流3小时。然后冷却溶液，于0℃用饱和碳酸氢钠水溶液中和。化合物(26-33)用乙酸乙酯(3×20ml)萃取，有机层用硫酸钠干燥，真空浓缩。把得到粗产物胺(26-33)溶于N-甲基吡咯烷酮(40ml)，加入氨腈(60mmol)和对甲苯磺酸(15mmol)，混合物于160℃加热4小时。然后再加入氨腈(60mmol)，溶液加热过夜。然后将溶液用乙酸乙酯(80ml)稀释，过滤沉淀(过量的氨腈)；减压浓缩滤液，用水洗涤(3×30ml)。有机层用硫酸钠干燥，真空蒸发，残余物用色谱纯化(乙酸乙酯/轻石油醚2∶1)，得到所需产物(34-41)固体。
按照上述的一般方法制备了下述化合物：
5-氨基-8-甲基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物34)
产率53％；黄色固体，M.P.167-168℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):3500-2950,1680,1645,1610,1560,1455cm-1；1H NMR(DMSO d6)δ:4.12(s,3H)；6.70(m,1H)；6.99(bs,2H)；7.18(m,1H)；7.81(s,1H)；8.42(s,1H)。
5-氨基-8-乙基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物35)
产率65％；黄色固体，M.P.249-250℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):3430-2950,1680,1655,1620,1550,1450cm-1；1H NMR(DMSO d6)δ:1.46(t,2H,J=7)；4.30(d,2H,J=7)；6.72(m,1H)；7.18(m,1H)；7.93(bs,2H)；7.93(s,1H)；8.62(s,1H)。
5-氨基-8-丙基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物36)
产率57％；浅黄色固体，M.P.209-210℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):3400-2900,1660,1645,1610,1545,1430cm-1；1H NMR(DMSO d6)δ:0.83(t,2H,J=7)；1.81-1.91(m,2H)；4.22(d,2H,J=7)；6.71(m,1H)；7.19(m,1H)；7.63(bs,2H)；7.93(s,1H)；8.61(5,1H)。
5-氨基-8-丁基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物37)
产率47％；白色固体，M.P.200-203℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):3500-2900,1685,1640,1620,1550,1450cm-1；1H NMR(DMSO d6)δ:0.9(t,3H)；1.2(m,2H)；1.8(m,2H)；4.2(t,2H)；6.7(m,1H)；7.2(m,2H)；7.6(s,1H)；8.0(s,1H)；8.6(s,1H)。
5-氨基-8-异戊基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物38)
产率60％；灰白色固体，M.P.212-213℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):3500-2850,1670,1650,1615,1560,1455cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:0.96(d,6H,J=6.4)；1.59(m,1H)；1.86(m,2H)；4.32(t,2H,J=6.4)；6.58(m,1H)；6.72(bs,2H)；7.21(d,1H,J=4.2)；7.63(d,1H,J=1.2)；8.10(s,1H)。
5-氨基-8-(2-异戊烯基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物39)
产率58％；浅黄色固体，M.P.178-179℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):3520-2950,1665,1640,1610,1555,1450cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:1.74(s,3H)；1.77(s,3H)；4.87(d,2H,J=7)；5.43-5.46(m,1H)；6.72(m,1H)；7.18(m,1H)；7.62(bs,2H)；7.93(s,1H)；8.55(s,1H)。
5-氨基-8-(2-苯乙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物40)
产率45％；白色固体，M.P.183-185℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):3500-2900,1670,1645,1620,1530,1455cm-1；1H NMR(DMSO d6)δ:3.21(t,2H,J=6.4)；4.53(t,2H,J=6.4)；6.7(s,1H)；7.1-7.4(m,6H),7.65(bs,2H)；7.93(s,1H)；8.45(s,1H)。
5-氨基-8-(3-苯丙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物41)
产率57％；黄色固体，M.P.168-170℃(乙酸乙酯-轻石油醚)；IR(KBr):3510-2950,1665,1640,1615,1520,1455cm-1；1H NMR(DMSO d6)δ:2.14-2.21(m,2H)；2.54(t,2H,J=7)；4.29(t,2H,J=6.4)；6.71(s,1H)；7.14-7.32(m,6H)；7.64(bs,2H)；7.93(s,1H)；8.64(s,1H)。实施例3：5-[[(取代的苯基)氨基]羰基]氨基-8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物42-57)的制备
按照下述流程Ⅷ所述的合成路线制备5-[[(取代的苯基)羰基]氨基-8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶。
Figure A9980659400391
反应流程Ⅷ：制备5-[[(取代的苯基)氨基]羰基]氨基-8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物42-57)的一般方法
在制备化合物42-57时，将适当的胺化合物(34-41)(10mmol)溶于新蒸馏的THF(15ml)，加入适当的异氰酸酯(13mmol)，混合物在氩气中回流18小时。然后减压除去溶剂，残余物用快速色谱纯化(乙酸乙酯-轻石油醚4-6)，得到所需化合物42-57。
按照上述的一般方法制备了下述化合物：
5-[[(3-氯苯基)氨基]羰基]氨基-8-甲基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物42)
产率98％；浅黄色固体，M.P.142-145℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3210-2930,1660,1630,1610,1500cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:4.21(s,3H)；6.60(m,1H)；7.11(d,1H,J=8)；7.13-7.28(m,2H)；7.55(d,1H,J=8)；7.65(s,1H)；7.78(d,1H,J=2)；8.22(s,1H)；8.61(bs,1H)；11.24(bs,1H)。
5-[[(4-甲氧基苯基)氨基]羰基]氨基-8-甲基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物43)
产率99％；黄色固体，M.P.193-195℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3200-2900,1664,1625,1600,1500cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:3.81(s,3H)；4.20(s,3H)；6.61(m,1H)；6.85(d,2H,J=9)；7.26(m,1H)；7.55(d,2H,J=9)；7.65(s,1H)；8.21(s,1H)；8.59(bs,1H)；10.96(bs,1H)。
5-[[(3-氯苯基)氨基]羰基]氨基-8-乙基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物44)
产率98％；浅黄色固体，M.P.204-205℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3220-2930,1660,1620,1600,1500cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:1.71(t,3H,J=7)；4.50(q,2H,J=7)；6.67(m,1H)；7.20(d,1H,J=8)；7.31(m,1H)；7.61(d,1H,J=8)；7.70(s,1H)；7.84(s,1H)；8.30(s,1H),8.67(bs,1H)；11.30(bs,1H)。
5-[[(4-甲氧基苯基)氨基]羰基]氨基-8-乙基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物45)
产率99％；浅黄色固体，M.P.200-201℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3250-2950,1665,1620,1610,1520cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:1.71(t,3H,J=7)；3.85(s,3H)；4.49(s,3H)；6.65(m,1H)；6.88(d,2H,J=9)；7.26(m,1H)；7.58(d,2H,J=9)；7.69(s,1H)；8.28(s,1H)；8.63(bs,1H)；10.99(bs,1H)。
5-[[(3-氯苯基)氨基]羰基]氨基-8-丙基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物46)
产率95％；白色固体，M.P.138-139℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3210-2920,1655,161 5,1600,1510cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:1.71(t,3H,J=7)；2.04(m,2H)；4.36(q,2H,J=7)；6.62(m,1H)；7.12(d,1H,J=8)；7.27(m,1H)；7.56(d,1H,J=8)；7.66(s,1H)；7.80(s,1H)；8.24(s,1H)；8.62(bs,1H)；11.08(bs,1H)。
5-[[(4-甲氧基苯基)氨基]羰基]氨基-8-丙基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物47)
产率98％；浅黄色固体，M.P.146-148℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3230-2950,1660,1620,1600,1530cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:0.98(t,3H,J=7)；2.04-2.08(m,2H)；3.82(s,3H)；4.35(t,2H,J=7)；6.61(m,1H)；6.89(d,2H,J=9)；7.25(m,1H)；7.56(d,2H,J=9)；7.65(s,1H)；8.23(s,1H)；8.59(bs,1H)；10.95(bs,1H)。
5-[[(3-氯苯基)氨基]羰基]氨基-8-丁基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物48)
产率97％；白色固体，M.P.210-212℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3240-2970,1650,1610,1510cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:1.00(t,3H,J=7)；1.39-1.41(m,2H)；1.99-2.03(m,2H)；4.41(q,2H,J=7)；6.63(m,1H)；7.14(d,1H,J=8)；7.29(m,1H)；7.56(d,1H,J=8)；7.67(s,1H)；7.80(s,1H)；8.25(s,1H)；8.63(bs,1H)；11.26(bs,1H)。
5-[[(4-甲氧基苯基)氨基]羰基]氨基-8-丁基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物49)
产率96％；白色固体，M.P.197-198℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3250-2960,1665,1610,1600,1520cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:0.98(t,3H,J=7)；1.38-1.42(m,2H),2.02-2.05(m,2H)；3.82(s,3H)；4.39(t,2H,J=7)；6.63(m,1H)；6.92(d,2H,J=9)；7.25(m,1H)；7.57(d,2H,J=9)；7.67(s,1H)；8.23(s,1H)；8.60(bs,1H)；10.95(bs,1H)。
5-[[(3-氯苯基)氨基]羰基]氨基-8-异戊基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物50)
产率97％；灰白色固体，M.P.199-200℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3230-2950,1655,1600,1510cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:1.01(d,6H,J=7.5)；1.49-1.51(m,1H)；1.88-2.03(m,2H),4.42(t,2H,J=7)；6.62(m,1H)；7.13(d,1H,J=8)；7.34(m,1H)；7.57(d,1H,J=8)；7.67(s,1H)；7.80(s,1H)；8.24(s,1H)；8.63(bs,1H)；11.25(bs,1H)。
5-[[(4-甲氧基苯基)氨基]羰基]氨基-8-异戊基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物51)
产率98％；白色固体,M.P.192-193℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3230-2970,1660,1615,1600,1500cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:0.99(d,6H,J=7.5)；1.58-1.22(m,1H)；1.87-1.97(m,2H)；3.82(s,3H)；4.40(t,2H,J=7)；6.62(m,1H)；6.91(d,2H,J=9)；7.23(m,1H)；7.58(d,2H,J=9)；7.66(s,1H)；8.23(s,1H)；8.59(bs,1H)；10.94(bs,1H)。
5-[[(3-氯苯基)氨基]羰基]氨基-8-(2-异戊烯基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物52)
产率99％；白色固体，M.P.204-205℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3245-2960,1650,1600,1510cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:1.84(s,3H)；1.88(s,3H)；5.01(d,2H,J=8)；5.57(m,1H)；6.62(m,1H)；7.12(d,1H,J=8)；7.29(m,1H)；7.56(d,1H,J=8)；7.66(s,1H)；7.80(s,1H)；8.26(s,1H)；8.60(bs,1H)；11.26(bs,1H)。
5-[[(4-甲氧基苯基)氨基]羰基]氨基-8-(2-异戊烯基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物53)
产率96％；浅黄色固体，M.P.198-199℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3235-2950,1665,1620,1600,1510cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:1.83(s,3H)；1.87(s,3H)；3.81(s,3H)；4.97(d,2H,J=7)；5.57(m,1H)；6.61(m,1H)；6.93(d,2H,J=9)；7.24(m,1H)；7.54(d,2H,J=9)；7.66(s,1H)；8.25(s,1H)；8.58(bs,1H)；10.96(bs,1H)。
5-[[(3-氯苯基)氨基]羰基]氨基-8-(2-苯乙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物54)
产率98％；白色固体，M.P.1 86-187℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3250-2970,1660,1610,1515cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:3.33(t,2H,J=7)；4.62(t,2H,J=7)；6.60(m,1H)；7.19-7.35(m,7H)；7.57(d,1H,J=8)；7.61(s,1H)；7.81(s,1H)；7.89(s,1H)；8.63(bs,1H)；11.27(bs,1H)。
5-[[(4-甲氧基苯基)氨基]羰基]氨基-8-(2-苯乙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物55)
产率99％；白色固体，M.P.180-181℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3245-2960,1660,1615,1600,1500cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:3.42(t,2H,J=7)；3.82(s,3H)；4.60(t,2H,J=7)；6.60(m,1H)；6.93(d,2H,J=9)；7.09(m,2H)；7.20-7.28(m,4H)；7.56(d,2H,J=8)；7.60(s,1H)；7.89(s,1H)；8.59(bs,1H)；10.96(bs,1H)。
5-[[(3-氯苯基)氨基]羰基]氨基-8-(3-苯丙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物56)
产率99％；浅黄色固体，M.P.183-184℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3245-2960,1665,1610,1515cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:2.46(m,2H)；2.73(t,2H,J=7)；4.43(t,2H,J=7)；6.66(m,1H)；7.19-7.40(m,8H)；7.59(d,1H,J=8)；7.64(s,1H)；7.85(m,1H)；8.25(s,1H)；8.67(bs,1H)；11.30(bs,1H)。
5-[[(4-甲氧基苯基)氨基]羰基]氨基-8-(3-苯丙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物57)
产率98％；白色固体，M.P.174-175℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3240-2950,1665,1615,1600,1510cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:2.46(m,2H)；2.73(t,2H,J=7)；4.42(t,2H,J=7)；6.67(m,1H)；6.96(d,2H,J=9)；7.22-7.41(m,6H)；7.60(d,2H,J=8)；7.64(s,1H)；8.25(s,1H),8.65(bs,1H)；11.16(bs,1H)。实施例4：5-[(苄基)羰基]氨基-8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物58-59)的制备
按照下述流程Ⅸ所述的合成路线制备5-[(苄基)羰基]氨基-8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶。
流程Ⅸ：制备5-[(苄基)羰基]氨基-8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物58-59)的一般方法
Figure A9980659400441
在制备化合物58-59时，将适当的胺化合物(38或41)(10mmol)溶于新蒸馏的THF(15ml)，加入适当的羧酰卤(13mmol)和三乙胺(13mmol)。混合物在氩气中回流18小时。然后减压除去溶剂，残余物溶于乙酸乙酯(30ml)，用水(15ml)洗涤二次。有机层用硫酸钠干燥，减压浓缩。残余物用快速色谱纯化(乙酸乙酯-轻石油醚4∶6)，得到所需化合物58和59。
按照上述的一般方法制备了下述化合物：
5-[(苄基)羰基]氨基-8-异戊基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c1嘧啶(化合物58)
产率85％；浅黄色固体，M.P.144-145℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3255-2930,1673,1620,1610,1520cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:0.98(d,6H,J=7.5)；1.60(m,1H)；1.91(m,1H)；4.40(t,2H,J=7)；4.53(s,2H)；6.60(m,IH)；7.18(m,1H)；7.26-7.39(m,5H)；7.64(s,1H)；8.22(s,1H)；9.11(bs,1H)。
5-[(苄基)羰基]氨基-8-(3-苯丙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶(化合物59)
产率95％；浅黄色固体，M.P.116-117℃(乙醚-轻石油醚)；IR(KBr):3250-2900,1675,1625,1600,1500cm-1；1H NMR(CDCl3)δ:2.39(m,2H)；2.67(t,2H,J=7)；4.37(t,2H,J=7)；4.53(s,2H)；6.61(m,1H)；7.16-7.43(m,11H)；7.65(s,1H)；7.64(s,1H)；8.19(s,1H)；9.12(bs,1H)。实施例5：1-取代-4-氰基-5-氨基吡唑的制备
按照本文引用作为参考的J.Org.Chem.1956,21,1240；J.Am.Chem.Soc.1956,78,784所述的方法制备下面的化合物，原料是可以买到的乙氧基-亚甲基丙二腈和N1-取代的肼，主要也可以是能够买到的下述化合物：
1-甲基-4-氰基-5-氨基吡唑；
1-正丁基-4-氰基-5-氨基吡唑；
1-异戊基-4-氰基-5-氨基吡唑；
1-(2-环戊基)乙基-4-氰基-5-氨基吡唑；
1-羟基乙基-4-氰基-5-氨基吡唑；
1-苯基-4-氰基-5-氨基吡唑；
1-叔丁基-4-氰基-5-氨基吡唑；
1-苯乙基-4-氰基-5-氨基吡唑；
1-(2-氯苯基)-4-氰基-5-氨基吡唑；
这些化合物可用作制备本申请吡唑并-三唑并-嘧啶化合物的中间体。实施例6：1-取代-4-氰基-3-氨基吡唑的制备
按照Chem.Pharm.Bull.1970,18,2353或J.Heterocyclic Chem.,1979,16,1113所述的方法，以4-氰基-5-氨基吡唑为原料直接烷基化可制备1-取代的4-氰基-3-氨基吡唑，所述的烷基化在无水碳酸钾存在下，于二甲基甲酰胺中，在80℃与烷基卤化物反应1-2小时进行的。在反应混合物中有N1和N2两个烷基化位置的异构体，比例大约是1∶2,N2异构体可用简单的结晶方法分离，或用硅胶柱色谱方法，以乙酸乙酯或石油醚混合物洗脱分离。用这些方法可制备下述化合物
1-甲基-4-氰基-3-氨基吡唑
1-丁基-4-氰基-3-氨基吡唑
1-苄基-4-氰基-3-氨基吡唑
1-异戊基-4-氰基-3-氨基吡唑
1-苯乙基-4-氰基-3-氨基吡唑
这些化合物可用作制备本申请吡唑并-三唑并-嘧啶化合物的中间体。实施例7：苯基乙基-4-氰基-3-氨基吡唑的制备
a)将3-氨基-4-氰基吡唑(20mmol)加入无水碳酸钾(30mmol)的DMF(50ml)悬浮液，在80℃加热30分钟。在悬浮液中加入苯乙基溴(25mmol)，在80℃加热2小时。冷却至室温后，将混合物蒸发至干，得到的残余物溶于蒸馏水(100ml)，用乙酸乙酯萃取(3×50ml)。合并的有机层用无水硫酸钠干燥，真空蒸发至干。得到的残余物由1∶3的1-苯基乙基-4-氰基-5-氨基吡唑(20％)和1-苯基乙基-4-氰基-3-氨基吡唑(60％)组成，它们可如此直接用于实施例9。或者用硅胶柱色谱纯化，以乙酸乙酯/己烷混合物洗脱，得到：1-苯基乙基-4-氰基-5-氨基吡唑，M.P.172-173℃；(20％)；1H NMR(DMSO-d6):3.04(t,2H)；4.12(t,2H)；5.85(sb,2H)；7.21-7.30(m,5H)；7.41(s,1H)；1-β-苯基乙基-4-氰基-3-氨基吡唑，M.P.98-100℃(60％)；1H NMR(CDCl3):3.07(t,2H)；4.10(t,2H)；4.23(sb,2H)；7.17(s,1H)；7.00-7.28(m,5H)。
b)将1-β-苯基乙基-4-氰基-5-氨基吡唑(20mmol)的原甲酸三乙酯(40ml)溶液在氮气中回流8小时。将过量的原甲酸酯真空蒸发至干，把残余的黄色油溶于乙醚，通过硅胶渗滤，得到相应的亚氨醚(产率87％)。将原甲酸酯蒸发后得到的残余物纯化，和直接用于下一步反应。将亚氨醚(20mmol)和2-糠酸酰肼(2.5g,22mmol)的2-甲氧基乙醇(50ml)溶液回流5-10小时。冷却后，溶液蒸发至干，得到油状残余物，在二苯醚(50ml)中使其热环化，用Dean-Stark仪使其共沸以除去反应中形成的水。1.5小时后，用TLC检测反应(乙酸乙酯∶石油醚2∶1)，当完全没有反应原料时，冷却反应混合物，加己烷。过滤得到的沉淀，结晶后得到7-(β-苯基乙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶，M.P.174-175℃(20％)；1H NMR(DMSO-d6):3.23(t,2H)；4.74(t,2H)；6.75(s,1H)；7.14-7.17(m,5H)；7.28(s,1H)；7.98(s,1H)；8.53(s,1E)；9.56(s,1H)。
按照类似的方法,以1-β-苯基乙基-4-氰基-3氨基吡唑为原料,制备8-(β-苯基乙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶,M.P.268-270℃(600A)；1H NMR(DMSO-d6):3.32(t,2H)；4.72(t,2H)；6.73(s,1H)；7.23(m,5H)；7.95(s,1H)；8.8(s,1H)；9.41(s,1H)。
c)将b)阶段的产物(10mmol)于10％盐酸(5.0ml)中的悬浮液回流搅拌3小时。冷却后，在0℃用浓氢氧化铵碱化溶液，过滤得到的沉淀，或用乙酸乙酯萃取(3×100ml)，干燥和真空蒸发至干，得到相应的1-(β-苯基乙基)-4-[3(2-呋喃基)1,2,4-三唑-5-基]-5-吡唑,M.P.175-176℃；1HNMR(DMSO-d6):3.15(t,2H)；4.48(t,2H)；5.78(s,1H)；6.37(s,1H)；6.68(s,1H)；7.1(s,1H)；7.27-7.28(m,5H)；7.82(s,1H)；14.51(sb,2H)。按照类似的方法制备1-(β-苯基乙基)-4-[3(2-呋喃基)1,2,4-三唑-5-基]-5-吡唑,(M.P.205-206℃)；1H NMR(DMSO-d6):3.12(t,2H)；4.46(t,2H)；5.75(s,1H)；14.41(sb,2H)。
d)将氨腈(60mmol)加入c)阶段的胺(10mol)于N-甲基吡咯烷酮(40ml)中的悬浮液，接着加入对甲苯磺酸(15mmol)。混合物在160℃回流搅拌，4小时后加入第二批氨腈(60mmol)，加热过夜。然后混合物用热水(200ml)处理，过滤沉淀，用水洗涤，用乙醇结晶，得到相应的5-氨基-7-(β-苯基乙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶，M.P.225-226℃.1H NMR(DMSO-d6):3.21(t,2H)；4.51(t,2H)；6.65(s,1H)；7.1-7.44(m,5H，原子和1H)；7.78(s,1H)；7.89(sb,2H)；8.07(s,1H)。
按照类似的方法制备5-氨基-8-(β-苯基乙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶，M.P.212-213℃.1H NMR(DMSO-d6):3.21(t,2H)；4.53(t,2H)；6.7(s,1H)；7.1-7.4(m,5H，原子和1H)；7.65(sb,2H)；7.93(s,1H)；8.45(s,1H)。实施例8：4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑的制备
将氰基乙酰胺(70mmol)和对氟代苄基叠氮化物(54.5mmol)依次加入无水碳酸钾(0.23mol)的DMSO(70ml)悬浮液，得到的溶液于室温搅拌1小时，然后倾入大体积的水中(1.5L)。过滤分离除固体，用水洗涤和在70℃的烘箱中干燥，得到1-(对氟代苄基)-4-酰胺基-5-氨基-1,2,3-三唑(产率96％)。M.P.198-199℃；1H NMR(DMSO-d6):7.5-7.1(m,6H)；6.4(s,2H)；5.4(s,2H)。搅拌DMF(5ml)中的胺(0.005mol)悬浮液，冷却至0℃，加入氯氧化磷(0.01mol)。得到的溶液在0℃搅拌5分钟，在25℃搅拌10分钟，在80℃搅拌15分钟。冷却至室温后，加入5ml的N盐酸，回流混合物5分钟，由冷却的溶液中分离出1-(对氟代苄基)-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑(产率90％)。M.P.185-186℃；1H NMR(DMSO-d6):7.3-7.0(m,6H)；5.5(s,2H)；IR(KBr):3400,3220,2220,1655cm-1.
类似地，制备下述化合物：
1-或2-苄基-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑
1-或2-(邻氟代苄基)-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑
1-或2-(对氟代苄基)-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑
1-或2-丁基-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑
1-或2-异戊基-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑
1-或2-(2-甲氧基乙基)-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑
1-或2-庚基-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑
1-或2-辛基-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑
这些化合物可用于制备本发明的三唑并-三唑并-嘧啶化合物的中间体。实施例9：乙氧基亚甲基氨基杂环化合物的制备
式Ⅳ的乙氧基亚甲基杂环化合物是按照下述方法制备的：将邻氨基乙腈和原甲酸乙酯回流。按照实施例所述的方法制备4-氰基-5-(乙氧基亚甲基氨基)-1-丁基吡唑。于氮气氛中，将4-氰基-5-氨基-1-丁基吡唑(20mmol)在原甲酸三乙酯(40ml)溶液在回流温度下加热8小时。真空蒸发除去过量的原甲酸酯至干，把得到的黄色油溶于乙醚，通过硅胶柱洗脱，得到纯的化合物(产率87％)。在许多情况下，蒸发得到的残余物基本上是纯的，并且可直接用于下一步反应。IR(nujol):3140,2240,1640cm-1；1H NMR(CDCl3):8.4(s,1H)；7.9(s,1H)；4.5(t,2H)；4.3(q,2H)；1.8(m,2H)；1.5(m,2H)；1.4(t,3H)；0.9(t,M)。实施例10：乙氧基亚甲基氨基杂环化合物的环化
将乙氧基亚甲基杂环化合物(20mmol)和2-糠酸酰肼(2.5g,22mmol)的2-甲氧基乙醇(50ml)溶液回流5-10小时。冷却后，溶液蒸发至干，用配备有Dean-Stark仪的圆底烧瓶将得到油状残余物在二苯醚(50ml)中热环化，使其共沸以除去反应中形成的水。在反应的各个时间时(3-5小时)，用TLC检测反应(2∶1乙酸乙酯∶石油醚)，当完全没有反应原料时，冷却反应混合物，加己烷。过滤得到的沉淀，用适当的溶剂结晶。在某些情况下，从溶液中可分离出粘稠的油，然后滗析和萃取，油状残余物用硅胶色谱纯化，以乙酸乙酯/石油醚混合物洗脱，得到三环化合物Ⅵ。
按照实施例所述的方法，列出了用这些方法制备的一些化合物的分析和光谱学特征：
7-丁基-2(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶1H NMR(DMSO-d6):9.4(s,1H)；8.6(s,1H)；8.0(m,1H)；7.4(m,1H)；6.7(m,1H)；4.5(t,2H)；1.9(m,2H)；1.3(m,2H)；0.9(t,3H)。
8-丁基-2(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶1H NMR(DMSO-d6):9.4(s,1H)；8.9(s,1H)；8.0(m,1H)；7.3(m,1H)；6.2(m,1H)；4.5(t,2H)；1.9(m,2H)；1(m,2H)；0.9(m,3H)。在2D-NMR(NOESY)光谱中，N-CH2的特征共振4.5说明C9-H特征共振8.9的宽峰。
7-异戊基-2(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶1H NMR(CDCl3):9.1(s,1H)；8.8(s,1H)；7.7(m,1H)；7.3(m,1H)；6.6(m,1H)；4.6(t,2H)；1.18-1.7(m,3H)；1.0(d,6H)。
8-异戊基-2(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
9.1(s,1H)；8.8(s,1H)；7.7(m,1H)；7.3(m,1H)；6.6(m,1H)；4.6(t,2H)；1.9-1.5(m,3H)；1.0(d,6H)。
按照此方法制备下述化合物:
7-甲基-2(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
8-甲基-2(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
7-(2-氯苯基)-2(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
7-苯乙基-2(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
7-叔丁基-2(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
7-(2-环戊基)-2(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
8-苄基-2(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
7-苄基-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
7-(2-氟苯基)-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
7-(4-氟苯基)-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
7-丁基-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
7-异戊基-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
7-(2-甲氧基)乙基-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
7-庚基-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
7-辛基-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
8-苄基-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
8-(2-氟苄基)-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
8-(4-氟苄基)-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
8-丁基-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
8-异戊基-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
8-己基-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
8-庚基-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
8-辛基-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
9-苄基-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
9-(2-氟苄基)-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[4,5-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
9-(4-氟苄基)-2(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[4,5-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶
这些化合物可用于制备本发明的三唑并-三唑并-嘧啶和吡唑并-三唑并-嘧啶化合物的中间体。实施例11：5-氨基-7-[芳(烷基)]-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶的制备
在式Ⅶ的胺(10mmol)于N-甲基吡咯烷酮(40ml)的悬浮液中加入氨腈(60mmol)，接着加入对甲苯磺酸(15mmol)。混合物于160℃加热，同时用磁力搅拌器搅拌。4小时后，加入第二份氨腈(60mmol)，继续加热过夜。然后，混合物用热水(200ml)处理，过滤沉淀的固体，用水洗涤，和在甲醇中结晶。如果没有沉淀，将溶液用乙酸乙酯(4×100ml)萃取，萃取液用盐水(2×50ml)洗涤，干燥和真空蒸发至干。残余物用硅胶柱色谱纯化，以乙酸乙酯洗脱。
下面给出用此方法制备的部分混合物的分析和光谱数据：
5-氨基-7-丁基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶M.P.157-158℃；1H NMR(DMSO-d6):8.1(s,1H)；8.0(s,2H)；7.9(m,1H)；7.2(m,1H)；6.7(m,1H)；4.2(t,2H)；1.9(m,2H)；1.5(m,2H)；0.9(t,3H)。5-氨基-8-丁基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶,M.P.183-185℃；1H NMR(DMSO-d6):8.6(s,1H)；8.0(s,1H)；7.6(s,2H)；7.2(m,1H)；6.7(m,1H)；4.2(t,2H)；1.8(m,2H)；1.2(m,2H)；0.9(t,3H)。
5-氨基-7-苄基-2-(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶，M.p.295-297℃；1H NMR(DMSO-d6):8.5(s,2H)；8.0(s,1H)；7.3(m,6H)；6.7(m,1H)；5.7(s,2H)。
5-氨基-7-邻氟代苄基-2-(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶，M.p.310-312℃；1H NMR(DMSO-d6):8.5(s,2H)；8.0(s,1H)；7.3(m,5H)；6.8(s,1H)；5.75(s,2H)。
5-氨基-7-甲基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶，M.P.210-213℃
5-氨基-7-叔丁基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶，M.P.238-240℃
5-氨基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶，M.P.248-250℃
5-氨基-7-(2-羟基乙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶，M.P.258-260℃
5-氨基-7-苯基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶，M.P.295-297℃
5-氨基-7-异戊基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶，M.P.208-210℃
5-氨基-8-异戊基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶，M.P.200-203℃
5-氨基-7-苯乙基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶，M.P.225℃
5-氨基-7-苄氧乙基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶；
5-氨基-7-[β-(4-异丁基苯乙基)]-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶；M.P.207-210℃。
使这些化合物与适当的酸或磺酸衍生物反应,可得到本发明的式Ⅰ化合物。实施例12：取代的-4-羧酰胺基-5-氨基-1,2,3-三唑的制备
依次将对氟苄基叠氮化物(15.1g,0.1mmol)和氰基乙酰胺(10.8g,0.13mol)加入碳酸钾(57.5g,0.42mol)于二甲亚砜(150ml)的悬浮液中，混合物于室温搅拌1小时。把混合物倾入3L水，过滤分离固体，用水充分洗涤后得到22.47g(96％)的1-对氟苄基-4-羧酰胺基-5-氨基-1,2,3-三唑。M.P.198-199℃；1H NMR(DMSO-d6):7.5-7.1(m,6H)；6.4(s,2H)；5.4(s,2H)。
类似地，制备得到2-氟-6-氯苄基-4-羧酰胺基-5-氨基-1,2,3-三唑；M.P.230-231℃；1H NMR(DMSO-d6):5.40(s,2H)；6.52(sb,2H)；7.12-7.45(m,5H)。
3-氟苄基-4-羧酰胺基-5-氨基-1,2,3-三唑；
M.P.211-211℃；1H NMR(DMSO-d6):5.46(s,2H)；6.47(sb,2H)；7.00-7.52(m,6H)。
2-氟苄基-4-羧酰胺基-5-氨基-1,2,3-三唑，M.P.195-197℃
制备得到1-(β-苯乙基)-4-羧酰胺基-5-氨基-1,2,3-三唑。
M.P.181-183℃；1H NMR(DMSO-d6):3.04(t,2H)；4.35(t,2H)；6.30(sb,2H)；7.20-7.47(m,7H)。实施例13：取代的-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑的制备
于0℃，在1-对氟苄基-4-羧酰胺基-5-氨基-1,2,3-三唑(23.4g,0.1mol)的DMF(100ml)悬浮液中加入20.8ml(0.2mo1)POCl3，用磁力搅拌器搅拌。溶液在0℃搅拌5小时，在室温搅拌10小时，最后在80℃搅拌15小时。冷却后，将1N HCl(100ml)加入溶液，把得到的溶液回流5小时；在冷却的情况下沉淀出1-对氟苄基-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑(18.54g,90％)沉淀物。M.P.185-186℃；1H NMR(DMSO-d6):7.3-7.0(m,6H)；5.5(s,2H)；IR(KBr):3400,3220,2220,1655cm-1。
类似地，制备得到下述化合物：
2-氟-6-氯苄基-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑；
M.P.181-185℃；1H NMR(DMSO-d6):5.40(s,2H)；7.26-7.50(m,5H)。
3-氟苄基-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑；M.P.195-197℃；1H NMR(DMSO-d6):5.44(s,2H)；7.00-7.43(m,6H)。
2-氟苄基-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑，M.P.295-197℃。
1-(β-苯乙基)-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑。M.P.149-150℃；1H NMR(DMSO-d6):3.04(t,2H),4.36(t,2H)；7.03(sb,2H)；7.23-7.28(m,5H)。实施例14：取代的-4[3-(2-呋喃基)1,2,4-三唑-5-基]-5-氨基-1,2,3-三唑的制备
用Dean-Stark仪，将1-对氟苄基-4-氰基-5-氨基-1,2,3-三唑(20mmol)和2-糠酸酰肼(22mmol)的于二苯醚(30ml)中的悬浮液搅拌和加热回流(260℃)，直到原料完全消失(TLC,1-2小时)。冷却后，混合物用石油醚稀释，得到的沉淀或者过滤分离，或者滗析出来，并且进行硅胶柱色谱纯化，以2∶1乙酸乙酯∶石油醚洗脱。
1-对氟苄基-4[3-(2-呋喃基)1,2,4-三唑-5-基]-5-氨基-1,2,3-三唑；
M.P.266-268℃；1H NMR(DMSO-d6):14.5(s,1H)；7.8(s,1H)；7.4-7.1(m,5H)；6.6(s,1H)；6.5(s,2H)；5.5(s,2H)。
类似地，制备得到1-(β-苯乙基)-4-[3-(2-呋喃基)1,2,4-三唑-5-基]-5-氨基-1,2,3-三唑(50％)；M.P.200-202℃.1H NMR(DMSO-d6):3.07(t,2H)；4.16(t,2H)；5.50(sb,2H)；6.61(s,1H)；6.95(s,1H)；7.2-7.4(m,5H)；7.78(s,1H)；13.8(sb,1H)。实施例15：5-氨基-7-取代的-2-(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5,-c]嘧啶的制备
在1-对氟苄基-4[3-(2-呋喃基)1,2,4-三唑-5-基]-5-氨基-1,2,3-三唑(0.325g,1mmol)于N-甲基吡咯烷酮(4ml)的悬浮液中加入氨腈(6mmol)，接着加入对甲苯磺酸(1.5mmol)。混合物于160℃加热，同时用磁力搅拌器搅拌。4小时后，加入第二份氨腈(6mmol)，继续加热过夜。然后，混合物用热水(20ml)处理，过滤沉淀的固体，用水洗涤，和在甲醇中结晶。如果没有沉淀，将溶液用乙酸乙酯(4×10ml)萃取，萃取液用盐水(2×5ml)洗涤，干燥和真空蒸发至干。残余物用硅胶柱色谱纯化，以乙酸乙酯洗脱，得到105mg(产率30％)5-氨基-7-对氟苄基-2-(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5,-c]嘧啶。M.P.266-268℃；1H NMR(DMSO-d6):8.5(sb,2H)；7.95(s,1H)；7.4-7.1(m,6H)；6.7(s,1H)；5.7(s,2H)。
类似地,制备得到5-氨基-7-邻氟苄基-2-(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5,-c]嘧啶，M.P.310℃。
5-氨基-7-苄基-2-(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5,-c]嘧啶，M.P.295-297℃。
5-氨基-7-(2-氟-6-氯苄基)-2-(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5,-c]嘧啶；M.P.218-220℃；1H NMR(DMSO-d6):8.51(sb,2H)；7.98(s,1H)；7.55-7.28(m,4H)；6.77(m,1H)；5.73(s,2H)。
5-氨基-7-(间氟苄基)-2-(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5,-c]嘧啶；M.P.280-283℃；1H NMR(DMSO-d6):8.45(bs,2H)；7.98(s,1H)；7.4-7.1(m,5H)；6.76(s,1H)；5.75(s,2H)。
5-氨基-7-(β-苯乙基)-2-(2-呋喃基)-1,2,3-三唑并[5,4-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶；M.P.269-271℃；1H NMR(DMSO-d6):8.4(sb,2H)；7.98(s,1H)；7.3-7.15(m,6H)；6.8(s,1H)；4.71(t,2H)；3.31(t,2H)。
实施例16：其它化合物
用上述化学方法，制备下述其它的化合物：
Figure A9980659400561
化合物编号 R  R1
 60  H  H
 61  H 4-MeO-Ph-NHCO
 62  H  3-Cl-Ph-NHCO
 63  t-C4H9  H
 64  t-C4H9  4-MeO-Ph-NHCO
 65  t-C4H9  3-Cl-Ph-NHCO
 66  CH3 Ph-NHCO
 67  CH3  4-SO3H-Ph-NHCO
 68  CH3  3,4-Cl2-Ph-NHCO
 69  CH3  3,4-(OCH2-O)-Ph-NHCO
 70  CH3  4-(NO2)-Ph-NHCO
 71  CH3  4-(CH3)-Ph-NHCO
 72  CH3  Ph-(CH2)-CO
 73  C2H5  Ph-NHCO
 74  C2H5  4-SO3H-Ph-NHCO
 75  C2H5  3,4-Cl2-Ph-NHCO
 76  C2H5  3,4-(OCH2-O)-Ph-NHCO
 77  C2H5  4-(NO2)-Ph-NHCO
 78  C2H5  4-(CH3)-Ph-NHCO
 79  C2H5  Ph-(CH2)-CO
 80  n-C3H7  Ph-NHCO
 81  n-C3H7  4-SO3H-Ph-NHCO
 82 n-C3H7  3,4-Cl2-Ph-NHCO
  83   n-C3H7   3,4-(OCH2-O)-Ph-NHCO
  84   n-C3H7   4-(NO2)-Ph-NHCO
  85   n-C3H7   4-(CH3)-Ph-NHCO
  86   n-C3H7   Ph-(CH2)-CO
  87   n-C4H9   Ph-NHCO
  88   n-C4H9   4-SO3H-Ph-NHCO
  89   n-C4H9   3,4-Cl2-Ph-NHCO
  90   n-C4H9   3,4-(OCH2-O)-Ph-NHCO
  91   n-C4H9   4-(NO2)-Ph-NHCO
  92   n-C4H9   4-(CH3)-Ph-NHCO
  93   2-(α-萘基)乙基   Ph-(CH2)-CO
  94   2-(α-萘基)乙基   H
  95   2-(α-萘基)乙基   4-MeO-Ph-NHCO
  96   2-(α-萘基)乙基   3-Cl-Ph-NHCO
  97 2-(2,4,5-三溴苯基)乙基 H
 98 2-(2,4,5-三溴苯基)乙基 4-MeO-Ph-NHCO
 99 2-(2,4,5-三溴苯基)乙基 3-Cl-Ph-NHCO
 100   2-丙烯-1-基 4-MeO-Ph-NHCO
实施例17：化合物的生物活性评价
按照下述方法进行了上述的几种化合物与大鼠的A1和A2A和人体A3腺苷受体的亲和力实验。大鼠的A1和A2A腺苷受体结合实验
将雄性 Wistar大鼠(200-250g)去头，在冰中解剖全脑和纹状体。在Polytron匀浆机的第5档，于25体积的50mM Tris-HCl，pH7.4(其中含有10mM MgCl2)之中粉碎组织30秒。匀浆在48,000离心10分钟，小球悬浮于同样的缓冲溶液中，其中含有2IU/ml腺苷脱氨酶。于37℃孵化30分钟后，离心膜，将小球储存在-80℃。在冷冻之前，取一份浆液进行蛋白质实验，以牛清蛋白为参考标准物。对大鼠的脑和纹状体膜分别进行实验，实验在有10mM MgCl2存在下，于25℃进行。将所有的缓冲溶液调节，并保持在pH7.4。
替代实验可在500μl Tris-HCl缓冲溶液中进行，其中含有1nM选择的腺苷A1受体的配体[3H]CHA(N6环己基腺苷)和大鼠的脑膜(每次实验150-200μg蛋白质)。
替代实验可在500μl Tris-HCl缓冲溶液中进行，其中含有10mMMgCl2和0.2nM选择的腺苷A2A受体的配体[3H]SCH 58261(5-氨基-7-(2-苯基乙基)-2(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶)和大鼠纹状体膜(每次实验80-100μg蛋白质)。为了测定IC50(IC50是替代50％的标记配体时的抑制剂浓度)，加入结合实验样品的试验化合物进行三次重复实验，实验至少有6个不同的浓度。应用Whatman GF/B玻璃过滤器快速过滤可分离结合的和游离的放射性，所述的过滤器用冰冷却的缓冲溶液洗涤3次。在加入Aquassure之后，用闪烁计数器测定过滤器上的结合的放射性。在有10μM R-PIA(N6-(苯基异丙基)腺苷)和10μM NECA(5′-(N-乙基羧酰胺基)腺苷)存在的情况下测定非特异性结合，并且通常是总结合量的10％。按照前时-程实验的结果，孵化的时间范围是在0℃孵化150分钟至在30℃孵化75分钟。Ki值由Cheng＆ Prusoff公式计算。用非线形回归曲线-结合的计算机程序LIGAND分析所有的结合数据。人体克隆A3腺苷受体结合实验
由HEK-293细胞，经人体A3腺苷受体的重组体转染的一份膜(8mg蛋白质/ml)用于结合实验。图1说明了[125I]AB-MECA(N6-(4-氨基-3-碘代苄基)-5′-(N-甲基氨基甲酰基)腺苷)对HEK-293细胞的饱和。抑制实验进行二次重复试验，试管中的最终体积为100μl，其中含有0.3nM[125I]AB-MECA、50nM Tris-HCl缓冲溶液、10mM MgCl2，pH7.4和20μl稀释膜(12.4mg蛋白质/ml)，典型的腺苷受体拮抗剂至少有6-8个不同浓度。在有50μM R-PlA存在的情况下测定非特异性结合，大约是总结合量的30％。按照前时-程实验的结果，在37℃的孵化时间是60分钟。用Brandel细胞收集器，通过Whatman GF/B玻璃过滤器过滤试验混合物可分离结合的和游离的放射性。结果和讨论
对化合物34-59进行了与大鼠的A1和A2A以及人体A3腺苷受体的放射性配体的结合实验，结果综合列于表1。
数据表明在N5位置没有大体积基团的化合物(化合物38、40和41)对A1显示出较低的选择性，对A2A腺苷受体显示出较大的亲和力，对人体A3腺苷受体亚型显示出低亲和力，而在N5位置有苯基氨基甲酰基链的化合物对纳摩尔级的hA3腺苷受体亚型显示出亲和力，并且对A1和A2A受体亚型有不同程度的选择性。具体地说，4-甲氧基苯基氨基甲酰基部分(化合物51、55和57)带来了较高的亲和力，比3-氯苯基氨基甲酰基部分(化合物50、54和56)要高出大约3个数量级。
在N8位置引入不同立体性质的链可使衍生物对人体A3腺苷受体的亲和力有提高的趋势，以及对A1和A2A受体亚型有更好的选择性。
图1给出了[125I]AB-MECA对腺苷A3受体的饱和曲线，在插图中指出了斯卡查德图(Scatchard plot)的线形关系，在我们的实验条件下，存在有KD为0.9+0.01nM和Bmax为62+1fmol/mg蛋白质(n=3)结合位点的单一类型。
表1.化合物35,36,38,40,41,44-47,50,51和54-47对rA1,rA2A和hA3腺苷受体的结合亲和力
  化合物     R     R1   rA1(K1,nM) rA2A(Ki,nM) hA3(Ki,nM)   rA1/hA3 rA2A/hA3
 MRS 1220*     305±51     52±8.8   0.65±0.25     470     80
    34   CH3     H        313(286-342)   30.65(28.62-32.82)     557(489-636)     0.56     0.05
    43   CH3     4-MeO-Ph-NHCO     ＜10,000     ＞10,000     0.10(0.09-0.11)   ＞100,000   ＞100,000
    42   CH3     3-Cl-Ph-NHCO     5,045(4,566-5,579)     ＞10,000     0.22(0.20-0.25)   22,931   ＞45,454
    35   CH3CH2     H     95,09(86.76-104.22)     11.15(9.84-12.63)     3,579(3,376-3,793)     0.03     0.003
    45   CH3CH2     4-MeO-Ph-NHCO     ＞10.000     ＞10,000      0.28(0.25-0.32)   ＞35,714   ＞35,714
    44   CH3CH2     3-Cl-Ph-NHCO     2,699(2,521-2,889)     2,799(2,621-2,989)      2.09(1.9-2.31)     1,291     1,339
    36   CH3CH2CH2     H     139(107-181)     20.23(16.14-25.36)       613(582-646)     0.22     0.03
    47   CH3CH2-CH2     4-MeO-Ph-NHCO     ＞10,000     1,993(1,658-2,397      0.29(0.27-0.32)   ＞34,482     6,872
    46   CH3CH2-CH2     3-Cl-Ph-NHCO     1,582(1,447-1,730)     ＜10,000      0.49(0.47-0.52)     3,228   ＞20,408
    37   CH3CH2CH2-CH2     H   26.30(23.66-29.24)     4.20(3.84-4.58)      1,109(981-1,254)     0.02     0.003
    49   CH3CH2CH2-CH2   4-Me0-Ph-NHCO     2,098(1,923-2,290)   649(563-747)      0.30(0.26-0.34)     6,993     2,163
    48   CH3CH2CH2-CH2     3-Cl-Ph-NHCO     1,515(1,382-1,661)   498(414-599)      0.75(0.65-0.86)     2,020     664
    38   (CH2)2CH-CH2-CH2-   H     8.09(7.46-8.78)     1.20(1.03-1.40)     1,163(1,024-1,320)     0.007     0.001
    51   (CH3)2CH-CH2-CH2-   4-MeO-Ph-NHCO     476(432-525)     376(332-426)     29.57(26.94-32.46)     16     13
    50   (CH3)2CH-CH2-CH2-   3-Cl-Ph-NHCO     1,650(1,560-1,744)     1,197(1,027-1,396)     81.10(68.45-96.09)     20     15
    58   (CH3)2CH-CH2-CH2-   Ph-CH2CO     373(330-422)     323(280-372)     81.10(68.45-96.09)     4.6     4
    39   (CH3)2C=CH-CH2-   H     10.08(8.63-11.76)     1.45(1.36-1.54)     887(761-1034)   0.01   0.001
    53   (CH3)2C=CH-CH2-   4-MeO-Ph-NHCO     5,296(4,826-5,811)     ＞10,000     29.57(26.94-32.46)     179     ＞338
    52   (CH3)2C=CH-CH2-   3-Cl-Ph-NHCO     3,744(3,312-4,233)     1,453(1,363-1,549)     147(122-178)     25.4     9.8
    40   Ph-CH2-CH2  H     2.16(1.9-2.47)     0.70(0.53-0.91)     2,785(2,463-3,149)   0.0007   0.0002
    55   Ph-CH2-CH2  4-MeO-Ph-NHCO     1,282(1,148-1,432)     1,398(1,225-1,594)     1.47(1.22-1.78)     872     951
    54   Ph-CH2-CH2   3-Cl-Ph-NHCO     1,049(961-1,145)     1,698(1,524-1,892)     13.28(10.87-16.23)     79     128
    41   Ph-CH2-CH2-CH2   H     11.13(9.34-13.27)     0.59(0.44-0.81)     2,666(2,533-2,805)     0.004     0.0002
    57   Ph-CH2-CH2-CH2  4-MeO-Ph-NHCO     1,514(1,332-1,721)     ＞10,OOO     19.81(17.61-22.27)     76.4     ＞504
    56  Ph-CH2-CH2-CH2  3-Cl-Ph-NHCO     ＞10,000     3,200(3,025-3,385)     42.65(39.92-45.57)     ＞234     75
    59  Ph-CH2-CH2-CH2  Ph-CH2CO   345(313-379)   400(365-438)    121(102-143)     2.8     3.3
*数值取自Kim等J.Med.Chem,39:4142-4148(1996)。
数据表明本文所述5-[[(取代苯基)氨基]羰基]氨基-8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶化合物的8-位上有短链(C1-3)取代基时，具体地说，有甲基、乙基和丙基基团时，优于有更长链如戊基和己基基团的情况。具体地，化合物45和47,8-甲基、8-乙基和8-丙基、5-(4-甲氧基苯基)取代的化合物显示出最高的亲和力和选择性，并且可以确信其确实在已经合成的任一化合物中它们对人体腺苷A3受体亚型(hA3)具有最高的亲和力和选择性。
甲基、乙基和丙基链可取代在苯基或取代的苯基上，并且对A3受体亚型显示出高亲和力和选择性，但亲和力减少的系数在10-100之间。就亲和力和选择性而言，在N8位上有β-苯基乙基链和在N5位上有4-MeO-苯基氨基甲酰基链的化合物(化合物55)显示出相当好的数值(KihA3=1.47nM,rA1/hA3=872,rA2A/hA3=951)。
即使在化合物50和51上有较大的戊基基团，它们对A3受体亚型也显示出相当高的亲和力(分别为81.10和29.57nm)，虽然选择性下降的系数大约为10-100。
以前研究表明5-氨基-8-(芳)烷基-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-e]1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶化合物对腺苷A2受体亚型的亲和力有随8-位基团大小增加的趋势。很显然，本发明化合物对A3受体亚型的亲和力有相反的趋势。就和A3受体亚型相互作用而言，C1-3取代基显然代表了理想的立体和亲脂性能。实施例18：与放射性标记化合物的结合实验
用0.5nM  [125I]AB-MECA，对多种肿瘤细胞系进行了一系列的结合实验，非特异性结合的测定在有50μM R-PIA或200μM NECA存在的情况下对所述细胞系的细胞膜进行。从总的结合中减去非特异性结合，可确定特异性结合。所述的细胞系是HL60、NB4、SKN-MC、SKN-Be2C、SKN-SH和JURKAT细胞系。结合实验的结果列于表2。
                            表2
  细胞系   总结合 非特异性结合 特异性结合(cpm) 特异性结合百分数
  HL 60     3484     2791     693     20
    NB4     3377     2740     637     19
 SKN-MC     7528     6220     1308     17
 SKN-Be2C     6000     4585     1415     24
  SKN-SH     2671     2580     91     3
 JURKAT     7599     4753     2846     38
以图的形式显示的结果见图2。
在细胞系的实验中Jurkat显示出最好的结果。在37℃，用[125I]-ABMECA(0.125-1.5nM)，进行Jurkat的饱和实验，孵化时间1小时，非特异性结合的测定用50μM R-PIA进行。Kd(nM)值是4,Bmax(fmol/mg蛋白质)是290。结果见图3。
接着其它实验以测定A1受体是否存在。替代实验是对Jurkat细胞系，用[3H]DPCPX，一种特异性的A1拮抗体(0.5nM)在0℃进行150分钟，用50μM R-PIA进行非特异性结合的测定。总的结合为13208，非特异性结合是2997，和特异性结合是10211(77％)。相应的，观察到显著数量的A1结合。
下面的实验第一次描述了应用本文所述的新的选择性拮抗剂(化合物102)在人体肿瘤细胞系，如HL60、早幼粒细胞的人体白细胞和Jurkat、人体T-细胞的白细胞中A3受体的特性。在此研究中，Jurkat和HL60细胞的膜(0.5mg蛋白质/ml)与10-12个不同浓度的化合物102一起孵化，Jurkat和HL60细胞的浓度范围分别是0.2-15nM和0.1-10nM。图3是化合物102与Jurkat和HL60细胞膜的腺苷A3受体结合的饱和曲线，在插图中指出了斯卡查德图的线形关系，其中存在有Kd为1.9+0.2nM和Bmax为1.30+0.03pmol/mg蛋白质(n=3)结合位点的单一类型。图4是化合物102与HL60细胞膜的腺苷A3受体结合的饱和曲线，在插图中指出了斯卡查德图的线形关系，其中存在有Kd为1.2±0.1nM和Bmax为626+42fmol/mg蛋白质(n=3)结合位点的单一类型。
这些结果说明许多细胞系含有相当大量的腺苷受体，因为已知化合物102与A3受体结合具有高亲和力和选择性，在肿瘤细胞中很可能存在大量的A3受体。
实施例19：药物组合物
(A)经皮的系统-1000小片
    组分     含量
  活性化合物硅氧烷液体胶体二氧化硅     100g450g2g
(B)口服片剂-1000片
    组分     含量
  活性化合物淀粉硬脂酸镁     50g50g5g
将活性化合物与淀粉和水一起造粒和干燥，在干燥的颗粒上加硬脂酸镁，把混合物充分混合，将混合后的混合物压制成片。
(C)注射剂-1000个1ml的安瓿
    组分     含量
  活性化合物缓冲剂丙二醇注射用水     10g适量400mg适量，加至1000ml
于50℃将活性化合物和缓冲剂溶解于丙二醇，然后一边搅拌一边加水，过滤得到的溶液，充入安瓿，密封和用高压锅消毒。
(D)连续输注剂-1000ml
    组分     含量
  活性化合物缓冲剂注射用水     10g适量适量，加至1000ml
本领域数量技术人员知道，或者仅用常规的试验就可以确定，本发明所述的具体实施方案有许多等同物，这些等同物也包括在下面的权利要求书之中。

Claims (19)

1．下式化合物和其药用盐：
Figure A9980659400021
或
Figure A9980659400022
其中
A是咪唑基、吡唑基或三唑基；
R是-C(X)R1、-C(X)-N(R1)2、-C(X)OR1、-C(X)SR1、-SOnR1、-SOnOR1、-SOnSR1或-SOn-N(R1)2；
R1是氢、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、杂芳基、杂环基、低级链烯基、低级烷酰基，或者，如果该基团连接于氮原子时，与氮原子一起形成氮杂环丁烷，或形成5-6元杂环基所述杂环基含有一个或多个诸如N、O、S的杂原子；
R2是氢、烷基、链烯基、炔基、取代的烷基、取代的链烯基、取代的炔基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳基、取代的杂芳基或芳基；
R3是呋喃基、吡咯基、噻吩基、苯并呋喃基、苯并吡咯基、苯并噻吩基，它们由一个或多个选自下述的取代基所取代：羟基、酰基、烷基、烷氧基、链烯基、炔基、取代的烷基、取代的烷氧基、取代的链烯基、取代的炔基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、酰氧基、酰胺基、烷芳基、芳基、芳氧基、叠氮基、羧基、羧基烷基、氰基、卤素、硝基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、氨基酰氧基、氧基酰胺基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、-SO2-芳基、-SO2-杂芳基和三卤代甲基；
X是O、S或NR1；
n是1或2。
2．权利要求1的化合物，其中R选自脲、酰胺、硫脲、硫代酰胺和磺酰胺。
3．权利要求1的化合物，其中R1选自氢、烷基、链烯基和芳基。
4．权利要求1的化合物，其中R2选自氢、烷基、链烯基和芳基。
5．权利要求1的化合物，其中R3选自呋喃。
6．权利要求1的化合物，其中X是O。
7．权利要求1的化合物，其中A是三唑环。
8．权利要求1的化合物，其中A是吡唑环。
9．治疗高血压、炎症、变应性反应、巨细胞脱粒、肿瘤和心脏低氧，以及避免大脑缺血的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用有效量的权利要求1化合物。
10．权利要求9的方法，其中R选自脲、酰胺、硫脲、硫代酰胺和磺酰胺。
11．权利要求9的方法，其中R1选自氢、烷基、链烯基和芳基。
12．权利要求9的方法，其中R2选自氢、烷基、链烯基和芳基。
13．权利要求9的方法，其中X是O。
14．权利要求9的方法，其中A是吡唑环。
15．权利要求9的方法，其中A是三唑环。
16．权利要求9的方法，其中需要治疗的疾病选自心脏低氧和大脑缺血。
17．测定患者存在肿瘤细胞的方法，所述的肿瘤细胞中有高浓度的腺苷A3受体，该方法包括：
a)给患者施用被标记的权利要求1化合物，该标记化合物和肿瘤细胞结合后能够被检测出来；
b)使该化合物和肿瘤细胞结合；
c)测定标记物。
18．测定细胞样品中存在肿瘤细胞的方法，所述的肿瘤细胞中有高浓度的腺苷A3受体，该方法包括：
a)在细胞朋友介质中指标细胞悬浮液；
b)给细胞施用被标记的权利要求1化合物，该标记化合物和肿瘤细胞结合后能够被检测出来；
c)使该化合物和肿瘤细胞结合；
d)测定标记物。
19．在手术摘除肿瘤后，测定是否存在残留肿瘤细胞的方法，该方法包括：
a)在手术摘除肿瘤之前、之后和手术期间给患者施用被标记的权利要求1化合物，该标记化合物和残留的肿瘤细胞结合后能够被检测出来；
b)使该化合物和残留的肿瘤细胞结合；
c)测定标记物。
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