CN115703826A - 铁调素改造体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铁调素改造体及其应用，该铁调素改造体的结构式为：cholesteryl‑X‑NH₂；其中，X表示至少包含微铁调素氨基酸序列的多肽。本发明选用核心序列为微铁调素的多肽作为改造基础，与铁调素相比，微铁调素的氨基酸序列较短，易于合成，且保留了大部分铁调素的功能；本发明进一步采用胆固醇修饰多肽N端，由此获得的铁调素改造体不仅在溶液中能够自组装成中性纳米粒，因此结构比铁调素和微铁调素都更为稳定；而且，该铁调素改造体对FPN1的降解活性比铁调素更强，对血清铁的调节能力与铁调素相当；表明该铁调素改造体具有替代铁调素作为铁代谢类疾病外用药的巨大潜力。

Description

铁调素改造体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种铁调素改造体及其应用。

背景技术

膜铁转运蛋白(ferroportin 1，FPN1)是一种跨膜的铁输出蛋白，是目前已知的细胞铁释放的唯一通路。而铁调素(hepcidin)则能够与FPN1结合，促进其内化和降解，从而改变其在细胞膜上的分布，进而控制饮食铁、循环铁和储存铁释放到血浆的量，以维持机体的铁稳态。

铁调素作为铁负性调节激素，本身可成为一种降低机体铁水平的外源性药物以治疗铁过载疾病。国内外均有学者发现，补充外源性铁调素，对遗传性血色病、铁相关神经退行性疾病及伴有铁沉积的慢性肝脏疾病等铁代谢相关疾病，都有不同程度的疗效。

然而，铁调素的氨基酸序列是DTNFPICIFCCKCCNNSQCGICCKT，在其三维构型中，Cys1–Cys8、Cys3–Cys6、Cys2–Cys4和Cys5–Cys7天然配对，共形成四对二硫键，使得无论通过化学合成还是组织提取以获得铁调素都存在成本高、得率低和工序繁琐的问题，使得铁调素在药用时存在较多的局限性。目前的科研工作者们都在积极地寻找hepcidin替代物。

如公告号为CN105451755B的中国发明专利公开了一种铁调素类似物和其用途，该铁调素类似物包含以下结构式I或由以下结构式I组成：

R₁-X-Y-R₂(I)；

或其药学上可接受的盐或溶剂合物；

其中，R₁是氢、C1-C6烷基、C6-C12芳基、C6-C12芳基、C1-C6烷基、C1-C20烷酰基(例如甲基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基、异戊酸、异丁酸、辛酸、十二酸和十六酸、γ-Glu-十六酸)或pGlu，其附接于N端，并且包括聚乙二醇化形式(例如PEG3至PEG11)，单独或作为任何前述各物的间隔基；R2是-NH₂或-OH；而X为多肽序列，Y不存在或者也是多肽序列。

然而，该众多铁调素类似物存在以下不足：(1)在人血清中的稳定性仍较低，大多数铁调素类似物的半衰期均在3h以内，化合物47的半衰期最高，但也仅为40h；(2)经测定，铁调素对于FPN1降解的EC₅₀为169nM，而该化合物47对于FPN1降解的EC₅₀仅为313nM，表明其对FPN1的内在化和降解活性均远远低于铁调素。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种铁调素改造体及其应用，相较于铁调素，该铁调素改造体结构更稳定，且对FPN1的降解活性更强，而且调节血清铁水平的能力与铁调素相当。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种铁调素改造体，该铁调素该载体的结构式如式(Ⅰ)所示：

cholesteryl-X-NH₂ (Ⅰ)；

其中，X表示至少包含微铁调素氨基酸序列的多肽。

本发明选用核心序列为微铁调素的多肽作为改造基础，与铁调素相比，微铁调素的氨基酸序列较短，易于合成，且保留了大部分铁调素的功能；本发明进一步采用胆固醇修饰多肽N端，由此获得的铁调素改造体不仅在溶液中能够自组装成中性纳米粒，因此结构比铁调素和微铁调素都更为稳定；而且，该铁调素改造体对FPN1的降解活性比铁调素更强，对血清铁的调节能力与铁调素相当；表明该铁调素改造体具有替代铁调素作为铁代谢类疾病外用药的巨大潜力。

任意来源的微铁调素序列均适用于本发明，作为具体实施方式的举例，在上述的铁调素改造体中，式(Ⅰ)中X所示多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。其中，SEQ ID No.1所示多肽序列为鼠源微铁调素，而SEQ ID No.2所示多肽序列为人源微铁调素。

由于胆固醇基团较大，为了避免胆固醇基团影响多肽与受体的结合，在上述的铁调素改造体中，所述的胆固醇基团通过连接片段与微铁调素相连。

作为优选，在上述的铁调素改造体中，所述的连接片段为甘氨酸。

作为优选，在上述的铁调素改造体中，所述的连接片段为Gly-{β-Ala}。与传统的甘氨酸相比，Gly-{β-Ala}(即甘氨酸-β丙氨酸)能够赋予多肽片段更强的灵活性，从而能够更有效地避免胆固醇基团影响多肽片段与受体的结合。

作为优选，上述的铁调素改造体的结构式如式(Ⅱ)所示：

cholesteryl-G{β-Ala}DTNFPICIF-NH₂ (Ⅱ)。

基于铁调素改造体的优异性能，本发明还提供了上述铁调素改造体在制备铁过载疾病治疗药物中的应用；该铁过载疾病治疗药物含有上述的铁调素改造体，以及药学上可接受的辅料。

本发明还提供了含有上述的铁调素改造体的药物制剂，该药物制剂优选为液体剂型，如注射剂型；在液体剂型下，本发明的铁调素改造体能够形成稳定的纳米粒结构，从而延长药物的半衰期。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明选用核心序列为微铁调素的多肽作为改造基础，与铁调素相比，微铁调素的氨基酸序列较短，易于合成，且保留了大部分铁调素的功能；本发明进一步采用胆固醇修饰多肽N端，由此获得的铁调素改造体不仅在溶液中能够自组装成中性纳米粒，因此结构比铁调素和微铁调素都更为稳定；而且，该铁调素改造体对FPN1的降解活性比铁调素更强，对血清铁的调节能力与铁调素相当；表明该铁调素改造体具有替代铁调素作为铁代谢类疾病外用药的巨大潜力。

附图说明

图1为本发明铁调素改造体的质谱分析结果；

图2为本发明铁调素改造体的色谱分析结果；

图3为铁调素的透射电镜观察图；

图4为微铁调素的透射电镜观察图；

图5为本发明铁调素改造体的透射电镜观察图；

图6为本发明铁调素改造体纳米粒的粒度分析结果图；

其中，d_h(nm)表示水动力半径(纳米)，Number(％)表示数量(百分比)；

图7为本发明铁调素改造体纳米粒的zeta点位分析结果图；

其中，Zeta potential(mV)表示zeta电位(毫伏)，Relative frequency(％)表示相对频数(百分比)；

图8为本发明铁调素改造体与铁调素对膜铁转运蛋白的降解能力比对图；

其中，Hepcidin表示铁调素，Hepcholicin表示本发明的铁调素改造体，FPN1表示膜铁转运蛋白，min.表示降解时间(分钟)；

图9为本发明铁调素改造体、铁调素和微铁调素对血清铁的调节能力比对图；

其中，Vehicle表示阴性对照，Mini-Hep表示微铁调素，Hepcidin表示铁调素，Hepcholicin表示本发明的铁调素改造体，Serum iron(μM)表示血清铁(微摩尔每升)，ns表示无显著差异，****表示存在极显著差异。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。

实施例1

采用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相合成法合成该铁调素改造体hepcholicin，该合成方法包括以下步骤：

(1)将2-氯三苯甲基氯树脂投料于固相合成反应管中，加入二氯甲烷(DCM)，振荡30分钟溶胀树脂；

(2)抽去固相合成反应管中的二氯甲烷，而后加入过量的Fmoc保护的苯丙氨酸，随后加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解，接着加入过量的二异丙基乙胺(DIEA)，振荡1h，最后用甲醇封闭，抽去DMF；

(3)向固相合成反应管中加入20％piperidine-DMF脱保护液，充分振荡后去掉反应液，并再次加入脱保护液，充分振荡，而后抽去脱保护液，取少量树脂，采用印三酮法检测反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；

(4)向固相合成反应管中加入过量的Fmoc保护的异亮氨酸和HBTU，同时加入少量DMF溶解，并立即加入过量的DIEA，反应0.5小时，而后取少量树脂用印三酮法检测缩合反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；

(5)重复步骤(3)和(4)，依次将过量的Fmoc保护的半胱氨酸、Fmoc保护的异亮氨酸、Fmoc保护的脯氨酸、Fmoc保护的苯丙氨酸、Fmoc保护的天冬酰胺、Fmoc保护的苏氨酸、Fmoc保护的天冬氨酸、Fmoc保护的β-丙氨酸以及Fmoc保护的甘氨酸加入到固相合成反应管中，直至所有氨基酸脱水缩合完毕；

(6)肽链组装完毕之后，重复步骤(3)脱去多肽链N端的Fmoc保护基团；

(7)向固相合成反应管中加入含95％TFA，1％水，2％乙二硫醇和2％三异丙基硅烷的切割剂，切割1.5-2.5h后，将多肽C端的羧基酰胺化，即获得目标多肽链粗品；采用反相高效液相色谱对目标粗品进行纯化，最终获得本实施例的hepcholicin的多肽主链部分；

(8)称取300mg胆固醇甲酰氯溶解于15ml DMF中，随后将此溶液于0℃搅拌下缓慢加入到含有70ul三乙胺和180mg步骤(7)中所得多肽主链纯品；反应24h后，使用氮气干燥法将混合液中的DMF除去；随后将该混合液加入到冷乙醚中沉淀三次去除未反应的胆固醇甲酰氯；所得粗品在DMF中透析7天，随后在水中透析3天；采用反相高效液相色谱对粗品进行纯化，并用质谱进行分子量验证。

Hepcholicin的质谱分析结果见图1，液相色谱分析结果见图2，其氨基酸序列如SEQ ID.No.3所示。

在透射电镜下分别观察铁调素(Hepcidin)、微铁调素(Mini-Hep)、Hepcholicin的形态，观察结果分别见图3、图4和图5。

由图3、图4和图5可见，透射电镜下观察到Hepcholicin可自主装形成纳米粒结构，而Hepcidin和Mini-Hep则未能组装成纳米粒。

进一步采用zeta电位及粒度分析仪对Hepcholicin的粒径和zeta电位进行检测，检测结果见图6和图7。

由图6可见，Hepcholicin纳米粒的粒径在34.12±2.42nm左右；由图7可见，Hepcholicin纳米粒的zeta电位约为-0.388mV，表明其几乎为电中性，且具有较高的生物稳定性和生物相容性。

进一步对Hepcholicin降解FPN1的性能进行分析，分析方法如下：

分别在hepcidin或Hepcholicin刺激后的第0、20、40、60、120和180min使用细胞组织快速裂解液裂解巨噬细胞并抽提其蛋白，通过Western blot检测不同药物和不同时间点的FPN1的蛋白水平变化。

分析结果见图8。

由图8可见，与Hepcidin相比，Hepcholicin不仅能够更加快速地降解FPN1，而且在经过180min的降解后，Hepcholicin对FPN1的降解也更加彻底。

进一步对Hepcholicin的血清铁调节能力进行分析，分析方法为：

对小鼠腹腔注射5mg/kg的Mini-Hep、hepcidin或Hepcholicin以及等体积的溶剂(Vehicle)后4h采集小鼠血清，通过铁含量检测试剂盒检测不同组别的小鼠血清水平的变化。

分析结果见图9。

由图9可见，Hepcidin的核心序列Mini-Hep对血清铁的调节能力较弱，而Hepcholicin却表现出优异的血清铁调节能力，且其对血清铁的调节能力与Hepcidin相当，甚至略强于Hepcidin。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 铁调素改造体及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 鼠(Mouse)

<400> 1

Asp Thr Asn Phe Pro Ile Cys Ile Phe

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 2

Asp His Asn Phe Pro Ile Cys Ile Phe

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 4

Gly Ala Asp Thr Asn Phe Pro Ile Cys Ile Phe

1 5 10

Claims (10)

1.一种铁调素改造体，其特征在于，结构式如式(Ⅰ)所示：

cholesteryl-X-NH₂ (Ⅰ)；

其中，X表示至少包含微铁调素氨基酸序列的多肽。

2.如权利要求1所述的铁调素改造体，其特征在于，式(Ⅰ)中，X所示多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。

3.如权利要求1所述的铁调素改造体，其特征在于，所述的胆固醇基团通过连接片段与微铁调素相连。

4.如权利要求3所述的铁调素改造体，其特征在于，所述的连接片段为甘氨酸。

5.如权利要求3所述的铁调素改造体，其特征在于，所述的连接片段为Gly-{β-Ala}。

6.如权利要求1-5中任意一项所述的铁调素改造体，其特征在于，结构式如式(Ⅱ)所示：

cholesteryl-G{β-Ala}DTNFPICIF-NH₂ (Ⅱ)。

7.如权利要求1-6中任意一项所述的铁调素改造体在制备铁过载疾病治疗药物中的应用。

8.一种铁过载疾病治疗药物，其特征在于，含有如权利要求1-6中任意一项所述的铁调素改造体，以及药学上可接受的辅料。

9.含有如权利要求1-6中任意一项所述的铁调素改造体的药物制剂。

10.如权利要求9所述的含有铁调素改造体的药物制剂，其特征在于，为液体剂型。

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