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CN103796670A - 因子viii嵌合和杂合多肽及其使用方法 - Google Patents

因子viii嵌合和杂合多肽及其使用方法 Download PDF

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CN103796670A CN201280043194.2A CN201280043194A CN103796670A CN 103796670 A CN103796670 A CN 103796670A CN 201280043194 A CN201280043194 A CN 201280043194A CN 103796670 A CN103796670 A CN 103796670A
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苏珊·洛
艾伦·J·比通蒂
格伦·皮尔斯
阿尔文·卢克
江海燕
拜伦·麦金尼
马特·奥特默
于尔格·萨默
卡伦·纽金特
李连
罗伯特·彼得斯
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Abstract

本发明提供施用因子VIII(加工过的FVIII、单链FVIII或其组合)的方法；施用包含因子VIII的嵌合和杂合多肽的方法；包含因子VIII的嵌合和杂合多肽；编码所述嵌合和杂合多肽的多核苷酸；包含所述多核苷酸的细胞；以及使用所述细胞制备所述嵌合和杂合多肽的方法。

Description

因子VIII嵌合和杂合多肽及其使用方法
对以电子方式提交的序列表的参考
与本申请一起提交的ASCII文本文件(名称：sequencelisting_ascii.txt；大小：____字节；及创建日期：____)中以电子方式提交的序列表的内容以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本发明总体上涉及用于止血病症的治疗学的领域。
背景技术
血友病A为由因子VIII(FVIII)基因中的突变和/或缺失(从而导致FVIII活性缺乏)引起的X染色体连锁的出血病症(Peyvandi,F.等Haemophilia12:82-89(2006)。所述疾病的特征在于自发性流血及创伤后过量出血。随时间推移，肌肉和关节中的反复出血(其经常始于儿童早期)引起血友病性关节病及不可逆的关节损伤。此损伤为进行性的且可能导致关节活动性严重受限、肌肉萎缩及慢性疼痛(Rodriguez-Merchan,E.C.,Semin.Thromb.Hemost.29:87-96(2003)，其以引用的方式整体并入本文)。
A2结构域为因子VIII分子的促凝血活性所必需的。研究显示，猪因子VIII具有人类因子VIII六倍高的促凝血活性(Lollar,P.和E.T.Parker,J.Biol.Chem.266:12481-12486(1991))，且人类与猪因子VIII之间凝血活性的差异似乎是基于在氨基酸序列中人类与猪A2结构域中一个或多个残基之间的差异(Lollar,P.等,J.Biol.Chem.267:23652-23657(1992))，以引用的方式整体并入本文。
血友病A的治疗是通过目标在于使FVIII活性恢复至正常程度的1至5%以预防自发性出血的替代疗法(Mannucci,P.M.等,N.Engl.J.Med.344:1773-1779(2001)，其以引用的方式整体并入本文)。存在可用于按需治疗出血事件或通过预防性治疗来防止出血事件发生的血浆来源的和重组的FVIII产品。然而，基于这些产品的短半衰期(例如8-12小时)，治疗方案需要频繁施用静脉内注射。所述频繁施用是令人疼痛且不方便的。
降低的死亡率、关节损伤的预防及生活质量的提高因血浆来源的和重组的FVIII的开发已经是重要成果。出血保护延长将代表血友病A患者治疗的另一个关键进展。然而，迄今为止，尚未开发出允许长期止血保护的产品。因此，仍对比现有疗法更耐受、持续时间更长且更有效的治疗因子VIII缺乏所致的血友病的改进方法存在需要。
发明概述
本发明提供施用因子VIII的方法；施用包含因子VIII的嵌合多肽及所述嵌合多肽的杂合体的方法；包含因子VIII的嵌合多肽及所述嵌合多肽的杂合体；编码所述嵌合和杂合多肽的多核苷酸；包含所述多核苷酸的细胞；以及使用所述细胞制造所述嵌合和杂合多肽的方法。
本发明提供向有需要的受试者施用因子VIII的方法，其包括向所述受试者施用治疗剂量的嵌合因子VIII多肽，例如嵌合因子VIII-Fc多肽，给药间隔为相等剂量的无非因子VIII部分(例如无Fc部分)的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)所需要的给药间隔的至少约一倍半长。
给药间隔可为相等剂量的无非因子VIII部分(例如Fc部分)的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)所需要的给药间隔的至少约一倍半至六倍长、一倍半至五倍长、一倍半至四倍长、一倍半至三倍长或一倍半至两倍长。给药间隔可为相等剂量的无非因子VIII部分(例如Fc部分)的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)所需要的给药间隔的至少约一倍半、两倍、两倍半、三倍、三倍半、四倍、四倍半、五倍、五倍半或六倍长。给药间隔可为约每五天、每六天、每七天、每八天、每九天、每十天、每十一天、每十二天、每十三天或每十四天或更长时间。
给药间隔可为至少约一天半至5天、一天半、2天、3天、4天或5天或更长时间。
本发明还提供向有需要的受试者施用因子VIII的方法，其包括向所述受试者施用治疗剂量的嵌合因子VIII多肽，例如嵌合因子VIII-Fc多肽，以获得由相等剂量的无非因子VIII部分(例如无Fc部分)的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)所获得的血浆浓度对时间曲线下面积(AUC)的至少约一又四分之一倍大的AUC。
本发明还提供向有需要的受试者施用因子VIII的方法，其包括向所述受试者施用治疗剂量的包含因子VIII及Fc的多肽，给药间隔为约每三天、每四天、每五天、每六天、每七天、每八天、每九天、每十天、每十一天、每十二天、每十三天或每十四天或更长时间。
本发明的方法可对需要预防性治疗或按需治疗的受试者实施。
按需治疗包括治疗出血事件、关节积血、肌肉出血、口腔出血、流血、肌肉内流血、口腔流血、创伤、头部创伤(trauma capitis)(头部创伤(head trauma))、胃肠出血、颅内流血、腹内流血、胸内流血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血或髂腰肌鞘出血。受试者可能需要手术预防、围手术期管理或用于手术的治疗(treatment for surgery)。所述手术包括例如小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝气切开术、滑膜切除术、全膝置换、开颅术、骨缝合术、创伤外科手术、颅内手术、腹内手术、胸内手术或关节置换手术。
对于按需治疗，所述嵌合多肽的给药间隔为约每24-36小时、每24-48小时、每24-72小时、每24-96小时、每24-120小时、每24-144小时、每24-168小时、每24小时、每25小时、每26小时、每27小时、每28小时、每29小时、每30小时、每31小时、每32小时、每33小时、每34小时、每35小时、每36小时、每37小时、每38小时、每39小时、每40小时、每41小时、每42小时、每43小时、每44小时、每45小时、每46小时、每47小时、每48小时、每49小时、每50小时、每51小时、每52小时、每53小时、每54小时、每55小时、每56小时、每57小时、每58小时、每59小时、每60小时、每61小时、每62小时、每63小时、每64小时、每65小时、每66小时、每67小时、每68小时、每69小时、每70小时、每71小时或每72小时或更长时间一次。
可用于本发明方法中的治疗剂量为约10至约100IU/kg，更具体地为约10-20IU/kg、20-30IU/kg、30-40IU/kg、40-50IU/kg、50-60IU/kg、60-70IU/kg、70-80IU/kg、80-90IU/kg或90-100IU/kg，且更具体地为约10IU/kg、15IU/kg、20IU/kg、25IU/kg、30IU/kg、35IU/kg、40IU/kg、45IU/kg、50IU/kg、55IU/kg、60IU/kg、65IU/kg、70IU/kg、75IU/kg、80IU/kg、85IU/kg、90IU/kg、95IU/kg或100IU/kg。
可用于本发明方法中的治疗剂量为约10至约150IU/kg，更具体地为约100-110IU/kg、110-120IU/kg、120-130IU/kg、130-140IU/kg、140-150IU/kg，且更具体地为约110IU/kg、115IU/kg、120IU/kg、125IU/kg、130IU/kg、135IU/kg、140IU/kg、145IU/kg或150IU/kg。
本发明方法中的受试者为人类受试者。给药间隔和AUC的确定可在单一受试者中或在受试者群体中进行。
因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)为人类因子VIII。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)的B结构域可完全或部分缺失。
因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可与表2中所示无信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸20至1457或SEQID NO:6的氨基酸4至2351)至少90%或95%同一。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可与表2中所示无信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸20至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸20至2351)同一。
因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可与表2中所示有信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1457或SEQ IDNO:6的氨基酸1至2351)至少90%或95%同一。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可与表2中所示有信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2351)同一。
Fc部分(或嵌合多肽的Fc部分)可与表2中所示的Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1458至1684或SEQ ID NO:6的氨基酸2352至2578)至少90%或95%同一。Fc部分(或嵌合多肽的Fc部分)可与表2中所示的Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1458至1684或SEQ ID NO:6的氨基酸2352至2578)同一。
嵌合多肽可包含与表2A(i)中所示无信号序列的因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸20至1684)至少90%或95%同一或与表2A(i)中所示有信号序列的因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸1至1684)至少90%或95%同一的序列。嵌合多肽可包含与表2A(i)中所示无信号序列的因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQID NO:2的氨基酸20至1684)同一或与表2A(i)中所示有信号序列的因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1684)同一的序列。
嵌合多肽可呈包含与所述嵌合多肽缔合的第二多肽的杂合体形式，其中所述第二多肽包含Fc或基本上由Fc组成。
第二多肽可包含以下或基本上由以下组成：与表2A(ii)中所示无信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸21至247)至少90%或95%同一或与表2A(ii)中所示有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至247)至少90%或95%同一的序列。第二多肽可包含以下或基本上由以下组成：与表2A(ii)中所示无信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸21至247)同一或与表2A(ii)中所示有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至247)同一的序列。
嵌合多肽或杂合体可作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的一部分施用。
本发明还提供上述嵌合和杂合多肽本身、编码其的多核苷酸、包含所述多核苷酸的培养的人类胚胎细胞及产生所述嵌合和杂合多肽的方法，及由所述方法产生的多肽。
本发明还提供包含因子VIII部分及第二部分的具有因子VIII活性的嵌合多肽，其中所述因子VIII部分为包含两条链的加工过的因子VIII，第一链包含重链且第二链包含轻链，其中所述第一链与所述第二链由金属键缔合。举例来说，嵌合多肽的因子VIII部分的至少约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约99%为加工过的因子VIII。
此外，本发明包括具有因子VIII活性的嵌合多肽，其中所述因子VIII部分为单链因子VIII。一方面，单链因子VIII可含有完整的细胞内加工位点。在一个实施方案中，嵌合多肽的因子VIII部分的至少约1%、约5%、约10%、约15%、约20%或约25%为单链因子VIII。在另一实施方案中，嵌合多肽的因子VIII部分的至少约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%或约99%为单链因子VIII。另一方面，单链FVIII不含细胞内加工位点。举例来说，SCFVIII包含对应于精氨酸1645的氨基酸位置处的取代或突变、对应于精氨酸1648的氨基酸位置处的取代或突变或对应于全长因子VIII中精氨酸1645和精氨酸1648的氨基酸位置处的取代或突变。在对应于精氨酸1645的氨基酸位置处取代的氨基酸为与在对应于精氨酸1648的氨基酸位置处取代的氨基酸不同的氨基酸。在某些实施方案中，取代或突变为除精氨酸以外的氨基酸，例如丙氨酸。
在一些实施方案中，当在体外通过显色测定测量因子VIII活性时，包含单链因子VIII的嵌合多肽具有程度与由两个Fc部分及融合于所述两个Fc部分中的一个的加工过的因子VIII组成的嵌合多肽相当的因子VIII活性。在其它实施方案中，包含单链因子VIII的嵌合多肽在体内具有与由两个Fc部分及融合于所述两个Fc部分中的一个的加工过的因子VIII组成的嵌合多肽相当的因子VIII活性。在其它实施方案中，包含单链因子VIII的嵌合多肽具有与由两个Fc部分及融合于所述两个Fc部分中的一个的加工过的因子VIII组成的嵌合多肽相当的因子Xa产生速率。在某些实施方案中，嵌合多肽中的单链因子VIII由活化的蛋白C灭活的程度与由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽中的加工过的因子VIII相当。在其它实施方案中，嵌合多肽中的单链因子VIII具有与由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽中的加工过的因子VIII相当的因子IXa相互作用速率。在其它实施方案中，嵌合多肽中的单链因子VIII以与由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽中的加工过的因子VIII相当的程度结合冯·维勒布兰德因子(von Willebrand Factor)。
本发明进一步包括包含具有因子VIII活性的嵌合多肽的组合物，其中所述多肽的至少约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%包含为单链因子VIII的因子VIII部分及第二部分，其中所述单链因子VIII与表2中所示无信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸20至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸20至2351)至少90%或95%同一。在一个实施方案中，第二部分可为Fc。在另一实施方案中，多肽呈包含第二多肽的杂合体形式，其中所述第二多肽基本上由Fc组成。在其它实施方案中，所述多肽具有由所述因子VIII组成的多肽的至少一倍半至六倍长、一倍半至五倍长、一倍半至四倍长、一倍半至三倍长或一倍半至两倍长的半衰期。
还提供治疗出血病状的方法，其包括施用治疗有效量的组合物。所述治疗可为预防性治疗或按需治疗或围手术期治疗。出血凝血病症可为血友病。在一个实施方案中，所治疗的受试者为小儿科受试者。
本发明还针对预防、减少或治疗受试者的出血事件的方法，其包括向所述受试者施用有效量的长效因子VIII(FVIII)蛋白，其中所述受试者在血浆中表达高水平的冯·维勒布兰德因子(VWF)。在一个实施方案中，受试者已鉴别为在血浆中表达高水平的VWF。本发明还针对预防、减少或治疗受试者的出血事件的方法，其包括：(a)通过测量受试者血浆中VWF的水平来鉴别具有高VWF水平的所述受试者，其中至少约100IU/dL的VWF水平将所述受试者鉴别为具有高VWF水平；及(b)向所述受试者施用有效量的长效FVIII蛋白。
在一个实施方案中，受试者为人类。在另一实施方案中，受试者为小儿科受试者。在另一实施方案中，受试者患有血友病A。
在一个实施方案中，VWF的高水平为至少约100IU/dL。在另一实施方案中，VWF的高水平在约100IU/dL与约200IU/dL之间。在另一实施方案中，VWF的高水平为约110IU/dL、约120IU/dL、约130IU/dL、约140IU/dL、约150IU/dL、约160IU/dL、约170IU/dL、约180IU/dL、约190IU/dL或约200IU/dL。
在一个实施方案中，受试者具有血液血清型A、B或AB。
在一个实施方案中，长效FVIII蛋白在所述受试者体内具有约20小时与约40小时之间的半衰期。在另一实施方案中，长效FVIII蛋白具有约21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时或40小时的半衰期。在另一实施方案中，长效FVIII蛋白具有约20小时与27小时之间的半衰期。在另一实施方案中，长效FVIII蛋白具有为所述所述长效FVIII蛋白施用于具有平均水平VWF的个体时的半衰期的至少约1.2倍大的半衰期。在另一实施方案中，长效FVIII蛋白具有为所述所述长效FVIII蛋白施用于具有平均水平VWF的个体时的半衰期的至少约约1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍或2.5倍大的半衰期。
在一个实施方案中，所施用的长效FVIII蛋白的有效量为至少约20IU/kg、至少约25IU/kg、至少约30IU/kg、至少约35IU/kg、至少约40IU/kg、至少约45IU/kg、至少约50IU/kg、至少约55IU/kg、至少约60IU/kg、至少约65IU/kg、至少约70IU/kg、至少约75IU/kg、至少约80IU/kg、至少约85IU/kg或至少约90IU/kg。在另一实施方案中，有效量为至少约65IU/kg至至少约90IU/kg。在另一实施方案中，有效量为80IU/kg。
在一个实施方案中，长效FVIII蛋白每72小时或更长时间施用一次。在另一实施方案中，长效FVIII蛋白约一周或更长时间施用一次。在另一实施方案中，长效FVIII蛋白约每10天施用一次、约每两周施用一次、约每15天施用一次、约每20天施用一次、约每三周施用一次、约每25天施用一次、约每四周施用一次或约每一个月施用一次。
在一个实施方案中，长效FVIII以80IU/kg的剂量每72小时施用一次。在另一实施方案中，长效FVIII向小儿科受试者以80IU/kg的剂量每72小时施用一次。
在一个实施方案中，施用长效FVIII蛋白消退多于5-20%、多于5-15%、多于5-10%、多于10-20%或多于10-15%的出血事件。在一个实施方案中，受试者体内血浆因子VIII:C的谷水平维持高于1-3IU/dl或3-5IU/dl。在一个实施方案中，所述施用预防受试者的出血事件。在另一实施方案中，出血事件为自发性的。在另一实施方案中，所述施用消退多于80-100%、多于80-90%、多于85-90%、多于90-100%、多于90-95%或多于95-100%的出血事件。
在一个实施方案中，所述施用在需要手术的受试者的群体中维持稳态。在另一实施方案中，长效FVIII蛋白在手术之前、期间或之后施用。在另一实施方案中，手术为小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝气切开术、滑膜切除术、全膝置换、开颅术、骨缝合术、创伤外科手术、颅内手术、腹内手术、胸内手术或关节置换手术。在另一实施方案中，手术为急救外科手术。
在一个实施方案中，长效FVIII蛋白具有长于由FVIII组成的多肽的半衰期。在另一实施方案中，长效FVIII蛋白被聚乙二醇化、羟乙基淀粉化或聚唾液酸化。
在一个实施方案中，长效FVIII蛋白为包含FVIII部分及第二部分的嵌合蛋白。在另一实施方案中，第二部分为Fc区、白蛋白、PAS序列、转铁蛋白、CTP(具有4个O-聚糖的hCG的28个氨基酸的C端肽(CTP))、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合多肽、白蛋白结合小分子或其两个或更多个组合。在另一实施方案中，第二部分融合于FVIII部分的氨基端或羧基端。在另一实施方案中，第二部分插入于FVIII部分中的两个氨基酸之间。在另一实施方案中，嵌合蛋白为FVIIIFc单体二聚体杂合体。在另一实施方案中，FVIII部分为单链。在另一实施方案中，FVIII部分包含重链和轻链。在另一实施方案中，FVIII部分包含全长因子VIII、成熟因子VIII或B结构域完全或部分缺失的因子VIII。在另一实施方案中，FVIII部分包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至1438或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2332至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列。在另一实施方案中，FVIII部分包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至1438或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2332。在另一实施方案中，嵌合多肽包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1439至1665或SEQID NO:6的氨基酸2333至2559至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的Fc区。在另一实施方案中，第二部分包含SEQ ID NO:2的氨基酸1439至1665或SEQ ID NO:6的氨基酸2333至2559。在另一实施方案中，长效FVIII多肽作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的一部分施用。
本发明还提供治疗诊断患有出血病症的受试者的方法，其包括测量所述受试者体内FVIII-Fc的半衰期，其中为正常受试者体内FVIII-Fc半衰期的至少约1.2倍大的半衰期指示所述受试者为长间隔给药的候选者，及以有效量及至少3天的给药间隔施用FVIII-Fc多肽。
本发明还提供治疗诊断患有出血病症的受试者的方法，其包括以有效量及至少3天的给药间隔向受试者施用FVIII-Fc多肽，其中所述受试者体内FVIII-Fc的半衰期为FVIII-Fc施用于具有平均水平VWF的受试者时的半衰期的至少约1.2倍大。
在一个实施方案中，所述受试者体内FVIII-Fc的血浆半衰期为FVIII-Fc施用于具有平均水平VWF的受试者时的血浆半衰期的至少约1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍或2.5倍大。在另一实施方案中，FVIII-Fc血浆半衰期在20-40小时之间。在另一实施方案中，长效FVIII蛋白具有约21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时或40小时的半衰期。在另一实施方案中，长效FVIII蛋白具有约20小时与27小时之间的半衰期。
本发明还提供治疗诊断患有出血病症的受试者的方法，其包括测量施用于所述受试者的短效FVIII的半衰期，其中为所述短效FVIII在具有平均VWF水平的受试者体内的半衰期的至少约1.2倍大的半衰期指示所述受试者为长间隔给药的候选者，及以有效量及至少3天的给药间隔施用长效FVIII-Fc多肽。在一个实施方案中，所述受试者体内短效FVIII的半衰期为短效FVIII施用于具有平均水平VWF的受试者时的半衰期的至少约1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍或2.5倍大。
在一个实施方案中，受试者为人类。在另一实施方案中，受试者为小儿科受试者。在另一实施方案中，受试者患有血友病A。在另一实施方案中，受试者具有血液血清型A、B或AB。
在一个实施方案中，长效FVIII-Fc以以下有效量施用：至少约20IU/kg、至少约25IU/kg、至少约30IU/kg、至少约35IU/kg、至少约40IU/kg、至少约45IU/kg、至少约50IU/kg、至少约55IU/kg、至少约60IU/kg、至少约65IU/kg、至少约70IU/kg、至少约75IU/kg、至少约80IU/kg、至少约85IU/kg或至少约90IU/kg。在另一实施方案中，有效量为至少约65IU/kg至至少约90IU/kg。
在一个实施方案中，有效量的FVIII-Fc蛋白约每周施用一次、约每10天施用一次、约每两周施用一次、约每15天施用一次、约每20天施用一次、约每三周施用一次、约每25天施用一次、约每四周施用一次或约每一个月施用一次。
在一个实施方案中，所述施用消退多于5-20%、多于5-15%、多于5-10%、多于10-20%或多于10-15%的出血事件。在一个实施方案中，受试者体内血浆因子VIII:C的谷水平维持高于1-3IU/dl或3-5IU/dl。
在一个实施方案中，所述施用预防受试者的出血事件。在一个实施方案中，出血事件为自发性的。在一个实施方案中，所述施用消退多于80-100%、多于80-90%、多于85-90%、多于90-100%、多于90-95%或多于95-100%的出血事件。在一个实施方案中，所述施用在需要手术的受试者的群体中维持稳态。在一个实施方案中，FVIII-Fc蛋白在手术之前、期间或之后施用。在一个实施方案中，手术为小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝气切开术、滑膜切除术、全膝置换、开颅术、骨缝合术、创伤外科手术、颅内手术、腹内手术、胸内手术或关节置换手术。在一个实施方案中，手术为急救外科手术。
在一个实施方案中，FVIII-Fc蛋白具有长于由FVIII组成的多肽的半衰期。在一个实施方案中，FVIII-Fc蛋白被聚乙二醇化、羟乙基淀粉化或聚唾液酸化。在一个实施方案中，FVIII-Fc蛋白为FVIIIFc单体二聚体杂合体。在一个实施方案中，FVIII部分为单链。在一个实施方案中，FVIII部分包含重链和轻链。在一个实施方案中，FVIII部分包含全长因子VIII、成熟因子VIII或B结构域完全或部分缺失的因子VIII。在一个实施方案中，FVIII部分包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至1438或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2332至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列。在一个实施方案中，FVIII部分包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至1438或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2332。在一个实施方案中，嵌合多肽的第二部分包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1439至1665或SEQ IDNO:6的氨基酸2333至2559至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的Fc区。在一个实施方案中，第二部分包含SEQ ID NO:2的氨基酸1439至1665或SEQ ID NO:6的氨基酸2333至2559。
在一个实施方案中，FVIII-Fc多肽作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的一部分施用。
本发明还提供用于确定诊断患有出血病症的受试者是否为用于长间隔给予长效FVIII多肽的候选者的方法，其包括测量血浆VWF的表达水平，其中至少100IU/dL的VWF表达水平指示所述受试者为使用长效FVIII多肽进行长间隔给药的候选者。在一个实施方案中，VWF表达水平为至少约110IU/dL、约120IU/dL、约130IU/dL、约140IU/dL、约150IU/dL、约160IU/dL、约170IU/dL、约180IU/dL、约190IU/dL或约200IU/dL。
本发明还提供用于确定诊断患有出血病症的受试者是否为用于长间隔给予长效FVIII多肽的候选者的方法，其包括测量所述受试者体内FVIII-Fc的半衰期，其中为FVIII-Fc施用于具有平均VWF水平的受试者时的半衰期的至少约1.2倍大的半衰期指示所述受试者为长间隔给药的候选者。在一个实施方案中，FVIII-Fc的半衰期为FVIII-Fc施用于具有平均水平VWF的受试者时的半衰期的至少约1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍或2.5倍大。
本发明还提供用于确定诊断患有出血病症的受试者是否为用于长间隔给予长效FVIII多肽的候选者的方法，其包括测量所述受试者体内短效FVIII的半衰期，其中为短效FVIII施用于具有平均VWF水平的受试者时的半衰期的至少约1.2倍大的半衰期指示所述受试者为长间隔给药的候选者。在一个实施方案中，半衰期为FVIII-Fc施用于具有平均水平VWF的受试者时的半衰期的至少约1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍或2.5倍大。
附图简述
图1：rFVIIIFc单体的示意图。
图2A-图2E：A-B.rFVIIIFc(加工过的或单链)的非还原性及还原性SDS-PAGE分析。C.通过LC/UV和LC/MS分析的rFVIIIFc结构。D.凝血酶裂解后rFVIIIFc的总离子流(TIC)色谱图(LC/MS图)。指示主要消化产物。E.rFVIIIFc和rBDDFVIII的A2结构域的去卷积质谱。指示对应于凝血酶裂解的A2结构域(S373至R740)及两个截短产物S373至Y729及S373至E720的主要产物及其同源质量。
图3A-图3C：rFVIII-Fc的生物化学表征：A.作为磷脂囊泡浓度的函数的因子X的活化；B.作为FX浓度的函数的因子X的活化。C.作为因子IXa浓度的函数的因子X的活化。
图4：因子X由活化的蛋白C裂解后的活化。
图5A-图5D：根据剂量水平分选、根据化合物分组(单级测定，25IU/kg(A)或65IU/kg(B)；及显色测定，25IU/kg(C)或65IU/kg(D))的相对于时间的观测到的组平均FVIII活性(±SE)对时间曲线。
图6A-图6B：根据剂量水平和化合物分组(单级测定(A)或显色测定(B))的相对于时间的观测到的组平均FVIII活性(±SE)对时间曲线。
图7(A)-图7(C)：单链FVIII:Fc在HemA小鼠尾静脉横断模型中的体内功效。(A)单链rFVIII:Fc剂量展示为方块，且加工过的rFVIII:Fc剂量展示为圆形。(B)尾静脉横断后4.6μg/kg、1.38μg/kg及0.46μg/kg的rFVIIIFc或SC rFVIIIFc的存活百分比。(C)尾静脉横断后4.6μg/kg(黑色圆形或倒三角形)、1.38μg/kg(三角形或菱形)及0.46μg/kg(方块和灰色圆形)的rFVIIIFc或SC rFVIIIFc分别的非出血者百分比。
图8：研究设计。图8描绘1/2a期研究的研究设计，所述研究为剂量递增依序设计，以评估25IU/kg(低剂量组A)或65IU/kg(高剂量组B)的单次静脉内剂量后rFVIIIFc与
Figure BDA0000473150590000151
的安全性和PK的比较。
图9：单级(aPTT)及显色测定所测定的rFVIII活性的相关性。注射
Figure BDA0000473150590000152
和rFVIIIFc(□)后测量FVIII活性(IU/mL)的单级凝血(aPTT)与显色测定结果之间的相关性。
图10(A)-图10(B)：低剂量组和高剂量组的组平均血浆FVIII活性药物代谢动力学概况。展示(A)25IU/kg(低剂量组，n=6)；及(B)65IU/kg(高剂量组，
Figure BDA0000473150590000153
n=9[rFVIIIFc])的单次静脉内注射rFVIIIFc或
Figure BDA0000473150590000154
后的血浆FVIII活性(单级aPTT测定)对时间曲线。所示结果为组平均值±平均值的标准误差(SEM)。
图11(A)-图11(B)：VWF抗原水平对注射
Figure BDA0000473150590000155
或rFVIIIFc后FVIII活性的Cl和t1/2的影响。VWF抗原水平与
Figure BDA0000473150590000161
(R2=0.5415且p=0.0012)及rFVIIIFc(R2=0.5492且p=0.0016)的权重调整的Cl；及
Figure BDA0000473150590000162
(R2=0.7923且p<0.0001)及rFVIIIFc(R2=0.6403且p=0.0003)的t1/2之间的相关性。各点表示单个受试者。
图12(A)-图12(B)：单个受试者在注射
Figure BDA0000473150590000163
或rFVIIIFc后的离体全血
Figure BDA0000473150590000164
结果。在指定时间点在以(A)25IU/kg
Figure BDA0000473150590000165
和rFVIIIFc；及(B)65IU/kg
Figure BDA0000473150590000166
和rFVIIIFc的剂量治疗之前及之后从受试者采集血液样品。在
Figure BDA0000473150590000167
仪器上通过以Ca++起始的NATEM测定凝结时间。所示结果为来自各单个样品的三重复通道读数的平均值±平均值的标准误差(SEM)。
图13(A)-图13(B)：凝血酶产生测定(TGA)中的活性比较。(A)SCrFVIIIFc展示内源性凝血酶潜能(ETP)降低，及(B)与rFVIIIFc相比峰值凝血酶降低。
图14(A)-图14(C)：体外ROTEM数据。掺加于从未处理的HemA小鼠获得的汇集全血中的不同浓度的XYNTHA、ADVATE<及rFVIIIFc的ROTEM(NATEM)结果(平均值±SD)。(A)平均凝结时间(CT)(图14A)，(B)凝块形成时间(CFT)，及(C)α角。
图15(A)-图15(C)：离体ROTEM数据。在单次静脉内施用50IU/kg的XYNTHA、ADVATE或rFVIIIFc后在给药后5分钟、24小时、48小时、72小时及96小时从HemA小鼠获得的ROTEM(NATEM)结果(平均值±SD)。(A)平均凝结时间(CT)，(B)凝块形成时间(CFT)，及(C)α角。
图16(A)-图16(E)：rFVIIIFc及单链(SC)rFVIIIFc与vWF的相互作用的实时评估，及凝血酶介导的rFVIIIFc及SC rFVIIIFc从vWF释放的实时评估。(A).rFVIIIFc及SC rFVIIIFc对vWF的亲和力的表面等离子体共振(SPR)分析。描绘结合曲线及1:1拟合相互作用模型。x轴展示时间(秒)且y轴展示反应(反应单位(RU))。(B).在25℃(上图)及37℃(下图)下活化的rFVIIIFc、SC rFVIIIFc及缺乏Fc部分的B结构域缺失的rFVIII(rBDD FVIII)的凝血酶介导释放的参考扣除传感器图。x轴展示时间(秒)且y轴展示反应(反应单位(RU))。单条线指示在不同α-凝血酶浓度下的反应。最上方的线为在0U/mLα-凝血酶下的反应，且后续各线依序针对0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.31、0.63、1.3、2.5、5、10及20U/mL的α-凝血酶浓度。(C).在25℃(上图)及37℃(下图)下rFVIIIFc、SC rFVIIIFc及rBDD FVIII的凝血酶介导的释放相的双重参考扣除传感器图。x轴展示时间(秒)且y轴展示反应(反应单位(RU))。单条线指示在不同α-凝血酶浓度下的反应。最上方的线为在0U/mLα-凝血酶下的反应，且后续各线依序针对0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.31、0.63、1.3、2.5、5.0、10及20U/mL的α-凝血酶浓度。(D).在25℃(上图)及37℃(下图)下rFVIIIFc、SC rFVIIIFc及rBDD FVIII的作为时间的函数的凝血酶介导的释放速率。x轴展示时间(秒)且y轴展示反应(反应单位(RU))。单条线指示在不同α-凝血酶浓度下的反应。最上方的线为在20U/mLα-凝血酶下的反应，且后续各线依序针对10、5、2.5、1.3、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01及0.005U/mL的α-凝血酶浓度。(E).在25℃(上图)及37℃(下图)下rFVIIIFc、SC rFVIIIFc及rBDD FVIII的作为凝血酶浓度的函数的峰值凝血酶介导的释放速率。EC50为半最大有效浓度。x轴为α-凝血酶浓度(U/mL)且y轴为最大释放速率(RU/秒)。
发明详述
本发明提供利用因子VIII(加工过的、单链或其组合)使用比用当前已知的因子VIII产品所可能的更长的给药间隔和/或更大的AUC治疗血友病A的方法。本发明还提供改进的因子VIII嵌合多肽及制造方法。
治疗血友病A是通过目标在于使FVIII活性恢复至正常水平的1至5%以预防自发性出血的替代疗法(Mannucci,P.M.等,N.Engl.J.Med.344:1773-9(2001)，其以引用的方式整体并入本文)。存在可用于按需治疗出血事件或通过预防性治疗来防止出血事件发生的血浆来源的和重组的FVIII产品。基于这些产品的短半衰期(例如8-12小时)(White G.C.等,Thromb.Haemost.77:660-7(1997)；Morfini,M.,Haemophilia9(增刊1):94-99；discussion100(2003))，治疗方案需要频繁静脉内施用，通常对于预防来说为每周两次至三次且对于按需治疗来说为每日一次至三次(Manco-Johnson,M.J.等,N.Engl.J.Med.357:535-544(2007))，各自以引用的方式整体并入本文。所述频繁施用是令人疼痛且不方便的。
本发明提供向有需要的人类受试者(例如人类患者)施用因子VIII的方法，其包括向所述受试者施用治疗剂量的嵌合因子VIII多肽(例如嵌合因子VIII-Fc多肽)或所述多肽的杂合体，给药间隔为相等剂量的无非因子VIII部分(例如无Fc部分)的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)所需要的给药间隔的至少约一倍半长。本发明还针对延长因子VIII施用在有需要的人类受试者中的给药间隔的方法，其包括施用嵌合因子VIII多肽。
给药间隔可为相等剂量的无非因子VIII部分(例如无Fc部分)的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)所需要的给药间隔的至少约一倍半至六倍长、一倍半至五倍长、一倍半至四倍长、一倍半至三倍长或一倍半至两倍长。给药间隔可为相等剂量的无非因子VIII部分(例如无Fc部分)的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)所需要的给药间隔的至少约一倍半、两倍、两倍半、三倍、三倍半、四倍、四倍半、五倍、五倍半或六倍长。给药间隔可为约每三天、每四天、每五天、每六天、每七天、每八天、每九天、每十天、每十一天、每十二天、每十三天或每十四天或更长时间。
给药间隔可为至少约一天半至5天、一天半、2天、3天、4天或5天或更长时间。
本发明还提供向有需要的人类受试者施用因子VIII的方法，其包括向所述受试者施用治疗剂量的嵌合因子VIII多肽(例如嵌合因子VIII-Fc多肽)或所述多肽的杂合体，以获得由相等剂量的无非因子VIII部分(例如无Fc部分)的所述因子VIII(由所述因子VIII部分组成的多肽)所获得的血浆浓度对时间曲线下面积(AUC)的至少约一又四分之一倍大的AUC。本发明因此包括增加或延长因子VIII活性在有需要的人类受试者中的AUC的方法，其包括施用嵌合因子VIII多肽。
本发明还提供向有需要的受试者施用因子VIII的方法，其包括向所述受试者施用治疗剂量的包含因子VIII及Fc的多肽或所述多肽的杂合体，给药间隔为约每三天、每四天、每五天、每六天、每七天、每八天、每九天、每十天、每十一天、每十二天、每十三天或每十四天或更长时间。
本发明的方法可对需要预防性治疗或按需治疗的受试者实施。
如本文所用的“施用”意指经由药学上可接受的途径向受试者给予本发明的药学上可接受的因子VIII多肽。施用途径可为静脉内，例如静脉内注射及静脉内输注。其它施用途径包括例如皮下、肌肉内、经口、经鼻及肺部施用。嵌合多肽和杂合蛋白可作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的一部分施用。
如本文所用的“血浆浓度对时间曲线下面积(AUC)”与药理学领域中的术语相同，并且是基于施用后因子VIII吸收的速率及程度。AUC是针对指定时期(如12小时、18小时、24小时、36小时、48小时或72小时)测定，或使用外推法基于曲线的斜率针对无穷大测定的。除非本文另外说明，否则AUC是针对无穷大测定的。AUC的测定可在单一受试者中进行，或在受试者群体中进行，其中针对所述受试者群体计算平均值。
如本文所用，因子VIII的“B结构域”与本领域中已知通过内部氨基酸序列同一性及凝血酶蛋白水解裂解位点界定的B结构域相同，例如全长人类因子VIII的残基Ser741-Arg1648。其它人类因子VIII结构域由以下氨基酸残基界定：A1，残基Ala1-Arg372；A2，残基Ser373-Arg740；A3，残基Ser1690-Ile2032；C1，残基Arg2033-Asn2172；C2，残基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括残基Ser1690-Tyr2332。其余序列(残基Glu1649-Arg1689)通常称为因子VIII轻链活化肽。猪、小鼠及犬因子VIII的所有结构域(包括B结构域)的边界的位置在本领域中也已知。在一个实施方案中，因子VIII的B结构域缺失(“B结构域缺失因子VIII”或“BDD FVIII”)。BDD FVIII的一个实例为
Figure BDA0000473150590000201
(重组BDD FVIII)，其具有与表2A(i)中序列的因子VIII部分相同的序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1457或20至1457)。在另一实施方案中，B结构域缺失因子VIII含有完整的细胞内加工位点，其对应于B结构域缺失因子VIII的残基754处的精氨酸(其对应于SEQ ID NO:2的精氨酸残基773)或全长因子VIII的残基1648处的精氨酸(其对应于SEQ ID NO:6的精氨酸残基1667)。除非另外指示，否则未提及任何SEQ ID编号时本文所用的序列残基编号对应于无信号肽序列(19个氨基酸)的因子VIII序列。举例来说，由于19个氨基酸的信号肽序列，全长因子VIII的S743/Q1638对应于SEQ ID NO:6的S762/Q1657。在其它实施方案中，B结构域缺失的FVIII包含对应于精氨酸1645的氨基酸位置处的取代或突变、对应于精氨酸1648的氨基酸位置处的取代或突变、或对应于全长因子VIII中精氨酸1645和精氨酸1648的氨基酸位置处的取代或突变。在一些实施方案中，在对应于精氨酸1645的氨基酸位置处取代的氨基酸为与在对应于精氨酸1648的氨基酸位置处取代的氨基酸不同的氨基酸。在某些实施方案中，取代或突变为除精氨酸以外的氨基酸，例如丙氨酸。
“B结构域缺失的因子VIII”可具有以下文献中公开的完全或部分缺失：美国专利号6,316,226、6,346,513、7,041,635、5,789,203、6,060,447、5,595,886、6,228,620、5,972,885、6,048,720、5,543,502、5,610,278、5,171,844、5,112,950、4,868,112及6,458,563，所述文献各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，本发明的B结构域缺失的因子VIII序列包含美国专利号6,316,226(还在US6,346,513中)的第4列第4行至第5列第28行及实施例1-5所公开的任一缺失。在一些实施方案中，本发明的B结构域缺失的因子VIII具有美国专利号5,789,203(还为US6,060,447、US5,595,886及US6,228,620)的第2列第26-51行及实施例5-8所公开的缺失。在一些实施方案中，B结构域缺失的因子VIII具有以下中所述的缺失：美国专利号5,972,885的第1列第25行至第2列第40行；美国专利号6,048,720的第6列第1-22行及实施例1；美国专利号5,543,502的第2列第17-46行；美国专利号5,171,844的第4列第22行至第5列第36行；美国专利号5,112,950的第2列第55-68行、图2及实施例1；美国专利号4,868,112的第2列第2行至第19列第21行及表2；美国专利号7,041,635的第2列第1行至第3列第19行、第3列第40行至第4列第67行、第7列第43行至第8列第26行及第11列第5行至第13列第39行；或美国专利号6,458,563的第4列第25-53行。在一些实施方案中，B结构域缺失的因子VIII已缺失大部分B结构域，但仍含有B结构域中为初级翻译产物体内蛋白水解加工成两条多肽链所必需的氨基端序列(即细胞内加工位点)，如WO91/09122中所公开，所述文献以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，B结构域缺失的因子VIII构建成缺失氨基酸747-1638，即B结构域几乎完全缺失。Hoeben R.C.等,J.Biol.Chem.265(13):7318-7323(1990)，以引用的方式整体并入本文。B结构域缺失的因子VIII还可含有因子VIII的氨基酸771-1666或氨基酸868-1562的缺失。MeulienP.等,Protein Eng.2(4):301-6(1988)，以引用的方式整体并入本文。作为本发明的一部分的其它B结构域缺失包括例如缺失氨基酸982至1562或760至1639(Toole等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:5939-5942(1986))、797至1562(Eaton等,Biochemistry25:8343-8347(1986))、741至1646(Kaufman(PCT公开申请号WO87/04187))、747-1560(Sarver等,DNA6:553-564(1987))、741至1648(Pasek(PCT申请号88/00831))、816至1598或741至1689(Lagner(Behring Inst.Mitt.(1988)No82:16-25,EP295597))，所述文献各自以引用的方式整体并入本文。前述各缺失可在任何因子VIII序列中进行。
在一个实施方案中，嵌合多肽中的B结构域缺失的因子VIII部分被加工成由金属键连接(或缔合)的两条链，第一链包含重链(A1-A2-部分B)且第二链包含轻链(A3-C1-C2)。在另一实施方案中，B结构域缺失的因子VIII部分为单链因子VIII。单链因子VIII可包含细胞内加工位点，其对应于B结构域缺失的因子VIII的残基754(SEQ IDNO:2的残基773)或全长因子VIII的残基1648(SEQ ID NO:6的残基1657)处的精氨酸。
重链与轻链之间的金属键可为本领域中已知的任何金属。举例来说，适用于本发明的金属可为二价金属离子。可用于缔合重链与轻链的金属包括(但不限于)Ca2+、Mn2+或Cu2+。Fatouros等,Intern.J.Pharm.155(1):121-131(1997)；Wakabayashi等,JBC.279(13):12677-12684(2004)。
如本文所用的“嵌合多肽”意指其中包括来自不同来源的至少两种多肽(或子序列或肽)的多肽。嵌合多肽可包括例如来自不同来源(如不同基因、不同cDNA或不同动物或其它物种)的两种、三种、四种、五种、六种、七种或更多种多肽。嵌合多肽可包括例如连接不同子序列的一个或多个接头。因此，在单一嵌合多肽内，子序列可直接连接或其可经由接头间接连接或两者。嵌合多肽可包括例如其它肽，如信号序列及有助于蛋白质纯化或检测的序列(如6His及FLAG)。此外，嵌合多肽可在N端和/或C端具有氨基酸或肽添加。
在一些实施方案中，嵌合多肽包含因子VIII部分及非因子VIII部分。示例性非因子VIII部分包括例如Fc、XTEN、白蛋白、PAS序列、转铁蛋白、CTP(具有4个O-聚糖的人类绒毛膜促性腺激素(hCG)的28个氨基酸的C端肽(CTP))、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合多肽及白蛋白结合小分子。本发明的示例性嵌合多肽包括例如嵌合因子VIII-Fc多肽、嵌合因子VIII-XTEN多肽、嵌合因子VIII-白蛋白多肽、嵌合因子VIII-PAS多肽、嵌合因子VIII-转铁蛋白多肽、嵌合因子VIII-CTP多肽、嵌合因子VIII-PEG多肽、嵌合因子VIII-HES多肽、嵌合因子VIII-白蛋白结合多肽多肽及嵌合因子VIII-白蛋白结合小分子多肽。
示例性嵌合因子VIII-Fc多肽包括例如有或无信号序列的SEQ IDNO:2或6(表2)及SEQ ID NO:4的嵌合Fc多肽(表2)。
嵌合多肽可包含与表2A(i)中所示无信号序列的因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸20至1684)至少90%或95%同一或与表2A(i)中所示有信号序列的因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸1至1684)至少90%或95%同一的序列，其中所述序列具有因子VIII活性。因子VIII活性可通过活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPPT)测定、显色测定或其它已知方法测量。嵌合多肽可包含与表2A(i)中所示无信号序列的因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸20至1684)同一或与表2A(i)中所示有信号序列的因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1684)同一的序列。
如上文所论述，示例性嵌合多肽包括融合于一个或多个XTEN多肽的因子VIII。Schellenburger等,Nat.Biotech.27:1186-90(2009)，所述文献以引用的方式整体并入本文。XTEN多肽可融合于FVIII的N端或FVIII的C端。可在XTEN部分与因子VIII部分之间包括蛋白酶位点以允许所述加工。XTEN多肽包括例如以下文献中公开的那些：WO2009/023270、WO2010/091122、WO2007/103515、US2010/0189682及US2009/0092582，所述文献各自以引用的方式整体并入本文。
如上文所论述，示例性嵌合多肽还包括融合于一个或多个白蛋白多肽、白蛋白结合多肽或白蛋白结合小分子的因子VIII。在一个实施方案中，白蛋白为人类白蛋白。白蛋白或白蛋白结合蛋白可融合于FVIII的N端或FVIII的C端，或插入FVIII中的两个氨基酸之间。可用于本发明中的白蛋白(例如其片段)的实例为已知的。例如美国专利号7,592,010；美国专利号6,686,179；及Schulte,Thrombosis Res.124增刊2:S6-S8(2009)，所述文献各自以引用的方式整体并入本文。
白蛋白结合多肽可包含(但不限于)细菌白蛋白结合域、白蛋白结合肽或可结合白蛋白的白蛋白结合抗体片段。如由Kraulis等,FEBSLett.378:190-194(1996)及Linhult等,Protein Sci.11:206-213(2002)所公开来自链球菌蛋白G的结构域3为细菌白蛋白结合域的一个实例。白蛋白结合肽的实例包括具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ IDNO:7)的一系列肽。参见例如Dennis等,J.Biol.Chem.2002,277:35035-35043(2002)。白蛋白结合抗体片段的实例公开于以下文献中：Muller和Kontermann,Curr.Opin.Mol.Ther.9:319-326(2007)；Rooverset等,Cancer Immunol.Immunother.56:303-317(2007)；及Holt等,Prot.Eng.Design Sci.,21:283-288(2008)，所述文献以引用的方式整体并入本文。
在某些方面，本发明的重组FVIII多肽包含至少一个用于非多肽小分子、变体或其可结合白蛋白的衍生物的连接位点。所述白蛋白结合部分的一个实例为2-(3-马来酰亚胺基丙酰胺基)-6-(4-(4-碘苯基)丁酰胺基)己酸酯(“Albu”标签)，如由Trusselet等,Bioconjugate Chem.20:2286-2292(2009)所公开。
如上文所论述，示例性嵌合多肽还包括融合于人类绒毛膜促性腺激素的C端肽(CTP)的至少一个β亚单位或其片段、变体或衍生物的因子VIII。CTP可在FVIII的N端或FVIII的C端融合于因子VIII，或插入FVIII中的两个氨基酸之间。融合于重组蛋白或插入重组蛋白中的一个或多个CTP肽已知增加所述蛋白质的体内半衰期。参见例如美国专利号5,712,122，以引用的方式整体并入本文。示例性CTP肽包括DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO:8)或SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:9)。参见例如美国专利申请公布号US2009/0087411A1，以引用的方式并入本文。
如上文所论述，示例性嵌合多肽还包括融合于至少一个PAS序列或其片段、变体或衍生物的因子VIII。PAS序列可融合于FVIII的N端或FVIII的C端，或插入FVIII中的两个氨基酸之间。如本文所用的PAS肽或PAS序列意指主要包含丙氨酸及丝氨酸残基或主要包含丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基的氨基酸序列，所述氨基酸序列在生理条件下形成无规卷曲构象。因此，PAS序列为包含丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸、基本上由丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸组成或由丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸组成的构建块、氨基酸聚合物或序列盒，其可用作嵌合蛋白中异源部分的一部分。氨基酸聚合物还可在添加除丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸以外的残基作为PAS序列中的次要成分时形成无规卷曲构象。“次要成分”意指除丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸以外的氨基酸可以以下某一程度添加于PAS序列中：例如至多约12%，即PAS序列的100个氨基酸中约12个，至多约10%、至多约9%、至多约8%、约6%、约5%、约4%、约3%，即约2%或约1%的氨基酸。不同于丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸的氨基酸可选自由以下组成的组：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr及Val。在生理条件下，PAS肽形成无规卷曲构象且由此可介导本发明重组蛋白的增加的体内和/或体外稳定性，且具有促凝血活性。
PAS肽的非限制性实例包括ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQID NO:10)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO:11)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO:12)、APSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO:13)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO:14)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO:15)、ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO:16)或其任何变体、衍生物、片段或组合。PAS序列的其它实例从例如美国专利公布号2010/0292130A1及PCT申请公布号WO2008/155134A1、欧洲授权专利EP2173890知晓。
如上文所论述，示例性嵌合多肽还包括融合于至少一个转铁蛋白肽或其片段、变体或衍生物的因子VIII。至少一个转铁蛋白肽可融合于FVIII的N端或FVIII的C端，或插入FVIII中的两个氨基酸之间。任何转铁蛋白都可融合于本发明的重组FVIII蛋白或插入本发明的重组FVIII蛋白中。作为一个实例，野生型人类Tf(Tf)为约75KDa(未计算糖基化)的679个氨基酸的蛋白质，具有两个主要结构域N(约330个氨基酸)和C(约340个氨基酸)，所述结构域似乎来源于基因复制。参见基因库登录号NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM039847及S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov)，全部以引用的方式整体并入本文。
转铁蛋白经由转铁蛋白受体(TfR)介导的内吞作用来转运铁。在铁释放至内体区室中且Tf-TfR复合物再循环至细胞表面后，Tf释放回到细胞外间隙以进行下一个铁转运循环。Tf具有超过14-17天的长半衰期(Li等,Trends Pharmacol.Sci.23:206-209(2002))。已针对半衰期延长、用于癌症疗法的靶向递送、经口递送及胰岛素原的持续活化对转铁蛋白融合蛋白进行了研究(Brandsma等,Biotechnol.Adv.,29:230-238(2011)；Bai等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:7292-7296(2005)；Kim等,J.Pharmacol.Exp.Ther.,334:682-692(2010)；Wang等,J.Controlled Release155:386-392(2011))。
如上文所论述，示例性嵌合多肽还包括融合于至少一个聚乙二醇(PEG)部分的因子VIII。
聚乙二醇化的FVIII可指的是FVIII与至少一个聚乙二醇(PEG)分子之间形成的缀合物。PEG可以多种分子量及平均分子量范围购得。PEG平均分子量范围的典型实例包括但不限于约200道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约600道尔顿、约1000道尔顿、约1300-1600道尔顿、约1450道尔顿、约2000道尔顿、约3000道尔顿、约3000-3750道尔顿、约3350道尔顿、约3000-7000道尔顿、约3500-4500道尔顿、约5000-7000道尔顿、约7000-9000道尔顿、约8000道尔顿、约10000道尔顿、约8500-11500道尔顿、约16000-24000道尔顿、约35000道尔顿、约40000道尔顿、约60000道尔顿以及约80000道尔顿(dalton)。这些平均分子量仅作为实例提供且不意图以任何方式具有限制性。
本发明的重组FVIII蛋白可被聚乙二醇化以包括单个或多个(例如2-4个)PEG部分。聚乙二醇化可通过本领域中已知的任何聚乙二醇化反应进行。制备聚乙二醇化蛋白质产物的方法通常包括(i)使多肽与聚乙二醇(如PEG的反应性酯或醛衍生物)在使得本发明的肽连接至一个或多个PEG基团的条件下反应；及(ii)获得反应产物。一般来说，用于所述反应的最佳反应条件将基于已知参数及所要结果逐项确定。
存在许多本领域技术人员可用的PEG连接方法，例如Malik F等,Exp.Hematol.20:1028-35(1992)；Francis,Focus on Growth Factors3(2):4-10(1992)；欧洲专利公布号EP0401384、EP0154316及EP0401384；及国际专利申请公布号WO92/16221及WO95/34326。作为一个非限制性实例，FVIII变体可在FVIII中的一个或多个插入位点中含有半胱氨酸取代，且所述半胱氨酸可进一步缀合于PEG聚合物。参见Mei等,Blood116:270-279(2010)及美国专利号7,632,921，所述文献以引用的方式整体并入本文。
如上文所论述，示例性嵌合多肽还包括融合于至少一个羟乙基淀粉(HES)聚合物的因子VIII。HES为天然存在的支链淀粉的衍生物且在体内由α-淀粉酶降解。HES展现有利的生物性质且用作血容量替代剂且在临床上用于血液稀释疗法中。参见例如Sommermeyer等,Krankenhauspharmazie8:271-278(1987)；及Weidler等,Arzneim.-Forschung/Drug Res.41:494-498(1991)。
HES的主要特征在于分子量分布及取代度。HES具有1至300kD、2至200kD、3至100kD或4至70kD的平均分子量(分子量平均值)。羟乙基淀粉可进一步展现0.1至3、0.1至2、0.1至0.9或0.1至0.8的摩尔取代度，及关于羟乙基在2至20范围内的C2:C6取代比率。平均分子量为约130kD的HES为来自Fresenius的
Figure BDA0000473150590000281
Figure BDA0000473150590000282
为人工胶体，用于例如治疗及预防低血容量症的治疗适应症中所用的容量替代。存在许多本领域技术人员可用的HES连接方法，例如与上文所述的PEG连接方法相同。
在一些实施方案中，包含因子VIII部分的嵌合多肽具有相比于由相同因子VIII部分组成而无非因子VIII部分的多肽增加的半衰期(t1/2)。t1/2增加的嵌合因子VIII多肽在本文中可称为长效因子VIII。长效嵌合因子VIII多肽包括例如融合于Fc的因子VIII(包括例如呈杂合体形式的嵌合因子VIII多肽，如FVIIIFc单体二聚体杂合体；参见实施例1、图1及表2A；及美国专利号7,404,956及7,348,004)、融合于XTEN的因子VIII及融合于白蛋白的因子VIII。
如本文所用，“培养(Culture/to culture/culturing)”意指在允许细胞生长或分裂或维持细胞呈活的状态的体外条件下孵育细胞。如本文所用，“培养细胞”意指体外繁殖的细胞。
除非另外说明，否则如本文所用的“因子VIII”意指在凝血中发挥正常作用的功能性因子VIII多肽。因此，术语因子VIII包括具有功能性的变体多肽。因子VIII蛋白可为人类、猪、犬及鼠类因子VIII蛋白。如背景技术部分中所描述，全长多肽及多核苷酸序列为已知的，许多功能性片段、突变体及修饰型式也是已知的。人类因子VIII序列的实例展示为SEQ ID NO:2或6中的子序列(表2)。因子VIII多肽包括例如全长因子VIII、在N端减去Met的全长因子VIII、成熟因子VIII(减去信号序列)、在N端具有附加Met的成熟因子VIII和/或B结构域完全或部分缺失的因子VIII。因子VIII变体包括B结构域缺失，无论为部分或完全缺失。
大量功能性因子VIII变体为已知的，如上文及下文所论述。另外，已在血友病患者中鉴别出因子VIII中的数百种非功能性突变，且已确定这些突变对因子VIII功能的影响更多地由于其在因子VIII的3维结构中所处的位置而非取代的性质(Cutler等,Hum.Mutat.19:274-8(2002))，以引用的方式整体并入本文。另外，来自人类及其它物种的因子VIII之间的比较已鉴别出可能为功能所需的保守残基(Cameron等,Thromb.Haemost.79:317-22(1998)；US6,251,632)，以引用的方式整体并入本文。
在哺乳动物细胞中分离并表达了人类因子VIII基因(Toole,J.J.等,Nature312:342-347(1984)；Gitschier,J.等,Nature312:326-330(1984)；Wood,W.I.等,Nature312:330-337(1984)；Vehar,G.A.等,Nature312:337-342(1984)；WO87/04187；WO88/08035；WO88/03558；美国专利号4,757,006)，所述文献各自以引用的方式整体并入本文，且由cDNA推导出了氨基酸序列。以引用的方式整体并入本文的Capon等的美国专利号4,965,199公开用于在哺乳动物宿主细胞中制造因子VIII及纯化人类因子VIII的重组DNA方法。已报道在CHO(中国仓鼠卵巢)细胞及BHKC(幼仓鼠肾细胞)中的人类因子VIII表达。已对人类因子VIII进行修饰以缺失部分或全部B结构域(美国专利号4,994,371及4,868,112，所述文献各自以引用的方式整体并入本文)，并且已将人类因子VIII B结构域用人类因子V B结构域置换(美国专利号5,004,803，以引用的方式整体并入本文)。编码人类因子VIII的cDNA序列及预测的氨基酸序列分别展示于美国申请公布号2005/0100990(以引用的方式整体并入本文)的SEQ ID NO:1及2中。
以引用的方式整体并入本文的美国专利号5,859,204,Lollar,J.S.报道免疫原性降低且免疫反应性降低的因子VIII的功能性突变体。以引用的方式整体并入本文的美国专利号6,376,463,Lollar,J.S.也报道了免疫反应性降低的因子VIII的突变体。以引用的方式整体并入本文的美国申请公布号2005/0100990,Saenko等报道因子VIII的A2结构域中的功能性突变。
许多功能性因子VIII分子(包括B结构域缺失)公开于以下专利中：US6,316,226及US6,346,513(均转让给Baxter)；US7,041,635(转让给In2Gen)；US5,789,203、US6,060,447、US5,595,886及US6,228,620(转让给Chiron)；US5,972,885及US6,048,720(转让给Biovitrum)、US5,543,502及US5,610,278(转让给Novo Nordisk)；US5,171,844(转让给Immuno Ag)；US5,112,950(转让给Transgene S.A.)；US4,868,112(转让给Genetics Institute)，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
猪因子VIII序列已公布(Toole,J.J.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5939-5942(1986))，以引用的方式整体并入本文，且已报道由PCR扩增来自猪脾cDNA文库的因子VIII序列获得的完整的猪cDNA序列(Healey,J.F.等,Blood88:4209-4214(1996)，以引用的方式整体并入本文)。所有结构域、所有亚单位及具体氨基酸序列被取代的杂合人类/猪因子VIII公开于Lollar和Runge的美国专利号5,364,771及WO93/20093中，所述文献以引用的方式整体并入本文。最近，猪因子VIII的A1及A2结构域以及用猪A1和/或A2结构域取代相应人类结构域的嵌合因子VIII的核苷酸及相应氨基酸序列报道于WO94/11503中，所述文献以引用的方式整体并入本文。美国专利号5,859,204,Lollar,J.S.也公开猪cDNA及推导的氨基酸序列。以引用的方式整体并入本文的美国专利号6,458,563(转让给Emory)公开B结构域缺失的猪因子VIII。
因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可与表2中所示无信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸20至1457；及SEQID NO:6的氨基酸20至2351)至少90%或95%同一，其中所述因子VIII部分具有因子VIII活性。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可与表2中所示无信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸20至1457；及SEQ ID NO:6的氨基酸20至2351)同一。
因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可与表2中所示有信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1457；及SEQID NO:6的氨基酸1至2351)至少90%或95%同一，其中所述因子VIII部分具有因子VIII活性。因子VIII(或嵌合多肽的因子VIII部分)可与表2中所示有信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1457及SEQ ID NO:6的氨基酸1至2351)同一。
如本文所用，“相等剂量”意指以国际单位表述的相同剂量的因子VIII活性，其与所讨论的多肽的分子量无关。一个国际单位(IU)的因子VIII活性大致对应于一毫升正常人类血浆中因子VIII的量。若干种测定可用于测量因子VIII活性，包括欧洲药典(EuropeanPharmacopoeia)显色底物测定及单级凝结测定。
除非另外说明，否则如本文所用的“Fc”意指功能性新生儿Fc受体(FcRn)结合配偶体。FcRn结合配偶体为可由FcRn受体特异性结合的任何分子且随后由FcRn受体活性转运所述FcRn结合配偶体。因此，术语Fc包括IgG Fc的任何功能性变体。IgG的Fc部分中结合FcRn受体的区已基于X射线结晶学进行了描述(Burmeister等,Nature372:379(1994)，以引用的方式整体并入本文)。Fc与FcRn的主要接触区在CH2与CH3结构域的接点附近。Fc-FcRn接触全部在单一Ig重链内。FcRn结合配偶体包括例如整个IgG、IgG的Fc片段及包括完整FcRn结合区的其它IgG片段。主要接触位点包括CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428及433-436。提及免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区的氨基酸编号均基于Kabat等1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department ofPublic Health,Bethesda;MD，以引用的方式整体并入本文。(FcRn受体已从若干哺乳动物物种(包括人类)中分离。人类FcRn、大鼠FcRn及小鼠FcRn的序列为已知的(Story等,J.Exp.Med.180:2377(1994)，以引用的方式整体并入本文)。Fc可包含免疫球蛋白的CH2及CH3结构域，有或无免疫球蛋白的铰链区。示例性Fc变体提供于WO2004/101740及WO2006/074199中，所述文献以引用的方式整体并入本文。
Fc(或嵌合多肽的Fc部分)可含有一个或多个突变及突变的组合。
Fc(或嵌合多肽的Fc部分)可含有使半衰期增加的突变，如M252Y、S254T、T256E及其组合，如Oganesyan等,Mol.Immunol.46:1750(2009)中所公开，所述文献以引用的方式整体并入本文；H433K、N434F及其组合，如Vaccaro等,Nat.Biotechnol.23:1283(2005)中所公开，所述文献以引用的方式整体并入本文；US2009/0264627A1的第1-2页的段落[0012]及实施例9和10所公开的突变体，所述文献以引用的方式整体并入本文；及US20090163699A1的第2页的段落[0014]至[0021]所公开的突变体，所述文献以引用的方式整体并入本文。
Fc(或嵌合多肽的Fc部分)还可包括例如以下突变：IgG的Fc区可根据如定点诱变及其类似工序的公认工序进行修饰以产生将由FcRn结合的修饰的IgG或其Fc片段或部分。所述修饰包括例如远离FcRn接触位点的修饰以及接触位点内保留或甚至增强与FcRn的结合的修饰。举例来说，人类IgG1Fc(Fcy1)中的以下单个氨基酸残基可被取代而不显著损失Fc对FcRn的结合亲和力：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、A330S、P331A、P331S、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A以及K447A，其中例如P238A表示在位置编号238处野生型脯氨酸取代为丙氨酸。除丙氨酸外，其它氨基酸也可取代上文指定位置处的野生型氨基酸。突变可单独引入Fc中，从而产生一百种以上不同于天然Fc的FcRn结合配偶体。另外，可一起引入两个、三个或更多个这些单个突变的组合，从而产生数百种多的FcRn结合配偶体。某些所述突变可对FcRn结合配偶体赋予新功能性。举例来说，一个实施方案并入N297A，从而除去高度保守的N糖基化位点。这个突变的作用是在于降低免疫原性，由此增强FcRn结合配偶体的循环半衰期，并且使FcRn结合配偶体不能结合FcyRI、FcyRIIA、FcyRIIB及FcyRIIIA而不有损对FcRn的亲和力(Routledge等1995,Transplantation60:847，其以引用的方式整体并入本文；Friend等1999,Transplantation68:1632，其以引用的方式整体并入本文；Shields等1995,J.Biol.Chem.276:6591，其以引用的方式整体并入本文)。此外，至少三种人类Fcγ受体似乎识别IgG上的下铰链区内的结合位点，通常为氨基酸234-237。因此，新功能性及可能降低的免疫原性的另一实例可由这个区的突变，如例如通过将人类IgG1的氨基酸233-236“ELLG”置换为来自IgG2的相应序列“PVA”(具有一个氨基酸缺失)来产生。已显示介导各种效应功能的FcyRI、FcyRII及FcyRIII在已引入所述突变时将不结合IgG1(Ward和Ghetie,Therapeutic Immunology2:77(1995)，其以引用的方式整体并入本文；及Armour等,Eur.J.Immunol.29:2613(1999)，其以引用的方式整体并入本文)。作为由上述突变产生的新功能性的另一实例，在一些情况下，对FcRn的亲和力可增加超过野生型的亲和力。此增加的亲和力可反映增加的“缔合”速率、降低的“解离”速率或增加的“缔合”速率与降低的“解离”速率两者。据信使对FcRn的亲和力增加的突变包括例如T256A、T307A、E380A及N434A(Shields等,J.Biol.Chem.276:6591(2001)，其以引用的方式整体并入本文)。
Fc(或嵌合多肽的Fc部分)可与表2中所示的Fc氨基酸序列(SEQID NO:2的氨基酸1458至1684或SEQ ID NO:6的氨基酸2352至2578)至少90%或95%同一。Fc(或嵌合多肽的Fc部分)可与表2中所示的Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1458至1684及SEQ ID NO:6的氨基酸2352至2578)同一。
如本文所用，“杂合”多肽及蛋白意指嵌合多肽与第二多肽的组合。杂合体中的嵌合多肽及第二多肽可经由蛋白质-蛋白质相互作用(如电荷-电荷相互作用或疏水性相互作用)彼此缔合。杂合体中的嵌合多肽及第二多肽可经由二硫键或其它共价键彼此缔合。杂合体描述于WO2004/101740及WO2006/074199中，所述文献各自以引用的方式整体并入本文。还参见美国专利号7,404,956及7,348,004，所述文献各自以引用的方式整体并入本文。第二多肽可为相同嵌合多肽的第二拷贝或其可为不相同的嵌合多肽。参见例如图1、实施例1及表2。在一个实施方案中，第二多肽为包含Fc的多肽。在另一实施方案中，嵌合多肽为嵌合因子VIII-Fc多肽且第二多肽基本上由Fc组成，例如实施例1的杂合多肽，其为由融合于人类IgG1的二聚Fc结构域且无插入接头序列的单一分子的重组B结构域缺失的人类FVIII(BDD-rFVIII)组成的rFVIIIFc重组融合蛋白。此杂合多肽在本文中称为FVIIIFc单体Fc融合蛋白、FVIIIFc单体杂合体、单体FVIIIFc杂合体及FVIIIFc单体-二聚体。参见实施例1、图1及表2A。所述实施例提供此杂合多肽的临床前及临床数据。
杂合体中的第二多肽可包含以下或基本上由以下组成：与表2A(ii)中所示无信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸21至247)至少90%或95%同一或与表2A(ii)中所示有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO-:4的氨基酸1至247)至少90%或95%同一的序列。第二多肽可包含以下或基本上由以下组成：与表2A(ii)中所示无信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸21至247)同一或与表2A(ii)中所示有信号序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至247)同一的序列。
图1为展示B结构域缺失的因子VIII-Fc嵌合多肽及其与为Fc多肽的第二多肽的缔合的结构的示意图。为获得此杂合体，使用FVIII特异性引物通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人类肝脏poly ARNA(Clontech)获得人类重组B结构域缺失的FVIII的编码序列。FVIII序列包括FVIII的天然信号序列。B结构域缺失为从丝氨酸743(S743；2287bp)至谷氨酰胺1638(Q1638；4969bp)，总共缺失2682bp。接着，使用Fc特异性引物通过RT-PCR从人类白细胞cDNA文库(Clontech)获得人类重组Fc的编码序列。引物设计成使得B结构域缺失的FVIII序列直接融合于Fc序列的N端而无插入接头。在CMV启动子的控制下将FVIIIFc DNA序列克隆至哺乳动物双重表达载体pBUDCE4.1(Invitrogen)中。通过RT-PCR获得包括小鼠Igk信号序列的第二相同Fc序列且克隆于表达载体pBUDCE4.1中第二启动子EF1α的下游。
使用脂转染胺2000(Lipofectamine2000)转染试剂(Invitrogen)将rFVIIIFc表达载体转染至人类胚肾293细胞(HEK293H；Invitrogen)中。通过用博莱霉素(Zeocin)(Invitrogen)进行选择来产生稳定克隆的细胞系。一个克隆的细胞系3C4-22用于产生FVIIIFc以供在体内表征。在Biogen Idec(Cambridge,MA)产生重组FVIIIFc并进行纯化(McCue等2009)。预期上述转染策略产生三种产物，即单体rFVIIIFc杂合体、二聚rFVIIIFc杂合体及二聚Fc。然而，在来自这些细胞的条件培养基中基本上未检测到二聚rFVIIIFc。相反，条件培养基含有Fc及单体rFVIIIFc。有可能二聚rFVIIIFc的尺寸过大且妨碍细胞有效分泌。这个结果为有益的，因为相比于所有三种蛋白质均存在，其使得单体纯化的复杂程度较低。这些研究中所用的材料具有约9000IU/mg的比活性。
在一个实施方案中，向表达高水平冯·维勒布兰德因子(VWF)的患者施用本发明的多肽。如本文所用的“受试者”或“患者”意指人类受试者。受试者可为当前正患有出血病症或预期需要所述治疗的患者。“受试者”可包括成人或小儿科受试者。小儿科受试者可为年龄小于12岁的小儿科患者。如本文所用的术语“小儿科”为医学上的分支，其处理婴儿及儿童的护理及其疾病的治疗。在一个实施方案中，受试者为已诊断出重度血友病A的小儿科患者。在某些实施方案中，小儿科受试者用本发明的长效因子VIII多肽治疗。
VWF为具有多聚体结构的血浆蛋白，其中各种形式的分子量在各单体亚单位的约230kDa与呈具有更大分子量的多聚体形式的高达超过2千万Da之间变化，由此形成最大的已知可溶性蛋白。其血浆浓度为约5-10μg/ml左右(Siedlecki等,Blood,第88卷:2939-2950(1996))且具有更小尺寸的血浆形式为对应于二聚体者，大致尺寸为500kDa。
VWF在初期止血中发挥必需的作用，负责使血小板粘附至受损的血管表面且因此形成血小板栓塞，在所述血小板栓塞上发展形成纤维蛋白凝结物的机制。已提出更高分子量的多聚体支持血小板以更高效率粘附于内皮下层的机制，且已发现VWF浓缩物的临床功效与这些更高分子量的多聚体的浓度有关(Metzner等,Haemophilia4:25-32(1998)。
因此，表达高水平VWF的受试者将需要与表达较低或正常水平的VWF的受试者相比频率更低的FVIII给药。VWF在血浆中的平均范围在约50IU/dL与约200IU/dL之间。在一个实施方案中，VWF在血浆中的平均水平为约50IU/dL。在另一实施方案中，血浆中至少约100IU/dL的VWF水平被视为高VWF水平。在另一实施方案中，VWF在血浆中的高水平在约100IU/dL与约200IU/dL之间。在另一实施方案中，VWF在血浆中的高水平为至少约110IU/dL、约120IU/dL、约130IU/dL、约140IU/dL、约150IU/dL、约160IU/dL、约170IU/dL、约180IU/dL、约190IU/dL或约200IU/dL。
因此，在一个实施方案中，对表达至少约100IU/dL的血浆VWF的受试者以长间隔给药方案施用本发明的长效FVIII多肽。在一个实施方案中，长效FVIII多肽以至少约3天的给药间隔施用。在另一实施方案中，长效FVIII多肽以至少约每周一次、约每两周一次、约每15天一次、约每20天一次、约每三周一次、约每25天一次、约每四周一次或约每个月一次的给药间隔施用。
在一个实施方案中，受试者先前鉴别为具有高VWF水平。在某些实施方案中，具有除O以外的血液血清型(即A、B或AB)的受试者因为长效FVIII在这些受试者中具有更长半衰期而需要较低频率的长效FVIII给药。在这些受试者中，增加的半衰期是由于其升高VWF水平。
此外，药物代谢动力学数据(定义为药物吸收、分布、代谢及排出的时程的研究)可用作适于使用本发明长效FVIII多肽时的更长或更短给药间隔的受试者的指标。临床药物代谢动力学为药物代谢动力学原理应用于药物在单个患者中的安全和有效的治疗管理。临床药物代谢动力学的主要目标包括增强功效及降低患者药物疗法的毒性。药物浓度与其药理学反应之间的强相关性的发展使得临床医师能够根据实际患者情形来应用药物代谢动力学原理。
因此，在一个实施方案中，使用本发明FVIII-Fc多肽的半衰期来鉴别表达高水平VWF的患者。FVIII-Fc半衰期的范围在约10小时与约40小时之间，至少部分取决于还存在的VWF的水平。然而，FVIII-Fc的半衰期平均为约18小时。一般来说，与FVIII-Fc在施用于具有平均水平的VWF的个体时的半衰期相比，FVIII-Fc在具有高水平VWF的患者体内展现至少约1.2倍的增加的半衰期。在一个实施方案中，与FVIII-Fc施用于具有平均水平VWF的个体时的半衰期相比，FVIII-Fc展现至少约1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍或2.5倍的增加的半衰期。在一个实施方案中，在表达高水平VWF的受试者中，FVIII-Fc的半衰期在至少约20小时与约40小时之间。在另一实施方案中，FVIII-Fc的半衰期为至少约21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时或40小时。在一个实施方案中，在具有高水平VWF的受试者中，FVIII-Fc的半衰期在约20小时与约27小时之间。因此，在一个实施方案中，FVIII-Fc的半衰期与平均值相比的增加指示受试者适于在使用本发明的长效FVIII多肽时的更长给药间隔。
在另一实施方案中，使用短效FVIII多肽的半衰期来鉴别表达高水平VWF的患者。如本文所用，术语“短效FVIII”是指未添加半衰期延长剂的FVIII多肽。在一个实施方案中，短效FVIII多肽由全长或B结构域缺失的FVIII组成。短效FVIII多肽的实例为
Figure BDA0000473150590000381
和
Figure BDA0000473150590000382
因为短效FVIII的半衰期还至少部分视VWF水平而变化，所以短效FVIII多肽还可用于鉴别适于本发明长效FVIII多肽的更长给药间隔的患者。在一个实施方案中，与短效FVIII在施用于具有平均水平的VWF的个体时的半衰期相比，短效FVIII在表达高水平VWF的个体体内展现至少约1.2倍的增加的半衰期。在另一实施方案中，与短效FVIII在施用于具有平均水平的VWF的个体时的半衰期相比，短效FVIII在表达高水平VWF的个体体内展现至少约1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍或2.5倍的增加的半衰期。因此，在施用短效FVIII时显示至少约1.2倍的增加的半衰期的个体适于在使用本发明长效FVIII多肽时的更长给药间隔。
如本文所用，“给药间隔”意指施用于受试者的多次剂量之间逝去的时间量。给药间隔的比较可在单一受试者中或在受试者群体中进行，且接着可计算在所述群体中获得的平均值。
施用嵌合因子VIII多肽，例如本发明的嵌合因子VIII-Fc多肽(包含因子VIII的多肽或杂合体)时的给药间隔可为相等剂量的无非因子VIII部分(例如无Fc部分)的所述因子VIII(由所述因子VIII组成的多肽)所需要的给药间隔的至少约一倍半长。给药间隔可为相等剂量的无非因子VIII部分(例如无Fc部分)的所述因子VIII(由所述因子VIII组成的多肽)所需要的给药间隔的至少约一倍半至六倍长、一倍半至五倍长、一倍半至四倍长、一倍半至三倍长或一倍半至两倍长。给药间隔可为相等剂量的无非因子VIII部分(例如无Fc部分)的所述因子VIII(由所述因子VIII组成的多肽)所需要的给药间隔的至少约一倍半、两倍、两倍半、三倍、三倍半、四倍、四倍半、五倍、五倍半或六倍长。给药间隔可为约每三天、每四天、每五天、每六天、每七天、每八天、每九天、每十天、每十一天、每十二天、每十三天或每十四天或更长时间。给药间隔可为至少约一天半至5天、一天半、2天、3天、4天或5天或更长时间。对于按需治疗，所述嵌合多肽或杂合体的给药间隔为约每24-36小时、每24-48小时、每24-72小时、每24-96小时、每24-120小时、每24-144小时、每24-168小时、每24小时、每25小时、每26小时、每27小时、每28小时、每29小时、每30小时、每31小时、每32小时、每33小时、每34小时、每35小时、每36小时、每37小时、每38小时、每39小时、每40小时、每41小时、每42小时、每43小时、每44小时、每45小时、每46小时、每47小时、每48小时、每49小时、每50小时、每51小时、每52小时、每53小时、每54小时、每55小时、每56小时、每57小时、每58小时、每59小时、每60小时、每61小时、每62小时、每63小时、每64小时、每65小时、每66小时、每67小时、每68小时、每69小时、每70小时、每71小时或每72小时或更长时间一次。
在一个实施方案中，有效剂量为25-80IU/kg(25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80IU/kg)且给药间隔为每3-5天、每3-6天、每3-7天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天或每8天或更多天一次，或每周三次，或每周不超过三次。在一个实施方案中，有效剂量为80IU/kg且给药间隔为每3天一次。在另一实施方案中，向小儿科受试者施用以每3天的给药间隔给予的80IU/kg的有效剂量。在另一实施方案中，有效剂量为65IU/kg且给药间隔为每周一次或每6-7天一次。只要需要，即可重复施用剂量(例如至少10、20、28、30、40、50、52或57周、至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年)。
在某些实施方案中，用于按需治疗的有效剂量为20-50IU/Kg(20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50IU/kg)。按需治疗可为一次性给药或重复给药。对于重复给药，给药间隔可为每12-24小时、每24-36小时、每24-48小时、每36-48小时或每48-72小时。
“长效因子VIII”为相比于参考因子VIII具有增加的半衰期(在本文中又称为t1/2、t1/2β、消除半衰期及HL)的因子VIII。长效因子VIII的半衰期增加可由于融合于一个或多个非因子VIII多肽，例如像Fc、XTEN、白蛋白、PAS序列、转铁蛋白、CTP(具有4个O-聚糖的hCG的28个氨基酸的C端肽(CTP))、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合多肽、白蛋白结合小分子或其两个或更多个组合。半衰期的增加可由于一个或多个修饰，如聚乙二醇化。示例性长效因子VIII多肽包括例如包含Fc的嵌合因子VIII多肽、包含XTEN的嵌合因子VIII多肽及包含白蛋白的嵌合因子VIII多肽。其它示例性长效因子VIII多肽包括例如聚乙二醇化因子VIII。
在长效嵌合因子VIII多肽的情况下，“参考”多肽为基本上由嵌合多肽的因子VIII部分组成的多肽，例如无Fc部分、无XTEN部分或无白蛋白部分的相同因子VIII部分。同样，在修饰的因子VIII的情况下，参考多肽为无修饰的相同因子VIII，例如无聚乙二醇化的因子VIII。
在一些实施方案中，长效因子VIII当施用于受试者时具有一种或多种以下性质：
在所述受试者中的平均滞留时间(MRT)(活性)为约14-41.3小时；
在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.22-5.19mL/h/kg或1.22-5.19mL/h/kg以下；
在所述受试者中的t1/2β(活性)为约11-26.4小时；
在所述受试者中的增量回收率(K值)(活性；观测值)为每IU/kg约1.38-2.88IU/dL；
在所述受试者中的Vss(活性)为约37.7-79.4mL/kg；及
在所述受试者中的AUC/剂量为每IU/kg约19.2-81.7IU*h/dL。
在一些实施方案中，长效因子VIII当施用于患者群体时具有一种或多种以下性质：
平均增量回收率(K值)(活性；观测值)大于每IU/kg1.38IU/dL；
平均增量回收率(K值)(活性；观测值)为每IU/kg至少约1.5、至少约1.85或至少约2.46IU/dL；
在所述患者群体中的平均清除率(CL)(活性)为约2.33±1.08mL/h/kg或2.33±1.08mL/h/kg以下；
在所述患者群体中的平均清除率(CL)(活性)为约1.8-2.69mL/h/kg；
在所述患者群体中的平均清除率(CL)(活性)为包含无修饰的所述因子VIII的多肽的清除率的约65%；
在所述患者群体中的平均平均滞留时间(MRT)(活性)为至少约26.3±8.33小时；
在所述患者群体中的平均MRT(活性)为约25.9-26.5小时；
在所述患者群体中的平均MRT(活性)为包含无修饰的所述因子VIII的多肽的平均MRT的约1.5倍长；
在所述患者群体中的平均t1/2β(活性)为约18.3±5.79小时；
在所述患者群体中的平均t1/2β(活性)为约18-18.4小时；
在所述患者群体中的平均t1/2β(活性)为包含无修饰的所述因子VIII的多肽的平均t1/2β的约1.5倍长；
在所述患者群体中的平均增量回收率(K值)(活性；观测值)为每IU/kg约2.01±0.44IU/dL；
在所述患者群体中的平均增量回收率(K值)(活性；观测值)为每IU/kg约1.85-2.46IU/dL；
在所述患者群体中的平均增量回收率(K值)(活性；观测值)为包含无修饰的所述因子VIII的多肽的平均增量回收率的约90%；
在所述患者群体中的平均Vss(活性)为约55.1±12.3mL/kg；
在所述患者群体中的平均Vss(活性)为约45.3-56.1mL/kg；
在所述患者群体中的平均AUC/剂量(活性)为每IU/kg约49.9±18.2IU*h/dL；
在所述患者群体中的平均AUC/剂量(活性)为每IU/kg约44.8-57.6IU*h/dL。
在其它实施方案中，长效因子VIII当施用于患者群体时具有一种或多种以下性质：
当通过单级(aPTT)测定或两级(显色)测定测量时，施用嵌合多肽的所述受试者中的Cmax_OBS与施用相同量的由全长、成熟因子VIII组成的多肽的受试者中的Cmax_OBS相当；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约60.5IU/dL、约60.5±1IU/dL、约60.5±2IU/dL、约60.5±3IU/dL、约60.5±4IU/dL、约60.5±5IU/dL、约60.5±6IU/dL、约60.5±7IU/dL、约60.5±8IU/dL、约60.5±9IU/dL或约60.5±10IU/dL；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约53.1-69IU/dL；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约119IU/dL、约119±1IU/dL、约119±2IU/dL、约119±3IU/dL、约119±4IU/dL、约119±5IU/dL、约119±6IU/dL、约119±7IU/dL、约119±8IU/dL、约119±9IU/dL、约119±10IU/dL、约119±11IU/dL、约119±12IU/dL、约119±13IU/dL、约119±14IU/dL、约119±15IU/dL、约119±16IU/dL、约119±17IU/dL或约119±18IU/dL；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约103-136IU/dL；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约76.5IU/dL、约76.5±1IU/dL、约76.5±2IU/dL、约76.5±3IU/dL、约76.5±4IU/dL、约76.5±5IU/dL、约76.5±6IU/dL、约76.5±7IU/dL、约76.5±8IU/dL、约76.5±9IU/dL、约76.5±10IU/dL、约76.5±11IU/dL、约76.5±12IU/dL、约76.5±13IU/dL、约76.5±14IU/dL或约76.5±15IU/dL；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约64.9-90.1IU/dL；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约182IU/dL、约182±2IU/dL、约182±4IU/dL、约182±6IU/dL、约182±8IU/dL、约182±10IU/dL、约182±12IU/dL、约182±14IU/dL、约182±16IU/dL、约182±18IU/dL或约182±20IU/dL；或
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约146-227IU/dL、约146±5IU/dL、约146±10IU/dL、约227±5IU/dL或约146±10IU/dL。
在某些实施方案中，长效因子VIII当施用于患者群体时具有一种或多种以下性质：
当通过单级(aPTT)测定或两级(显色)测定所测量时，在所述受试者中的t1/2β(活性)为施用相同量的由全长、成熟因子VIII组成的多肽的受试者中的t1/2β(活性)的至少1.48、1.49、1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89或1.90倍高；
如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的t1/2β(活性)为约18.8小时、18.8±1小时、18.8±1小时、18.8±2小时、18.8±3小时、18.8±4小时、18.8±5小时、18.8±6小时、18.8±7小时、18.8±8小时、18.8±9小时、18.8±10小时或18.8±11小时；
如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的t1/2β(活性)为约14.3-24.5小时；
如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的t1/2β(活性)为约16.7小时、16.7±1小时、16.7±2小时、16.7±3小时、16.7±4小时、16.7±5小时、16.7±6小时、16.7±7小时、16.7±8小时、16.7±9小时、16.7±10小时或16.7±11小时；
如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的t1/2β(活性)为约13.8-20.1小时；
如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的t1/2β(活性)为约19.8小时、19.8±1小时、19.8±2小时、19.8±3小时、19.8±4小时、19.8±5小时、19.8±6小时、19.8±7小时、19.8±8小时、19.8±9小时、19.8±10小时或19.8±11小时；或
如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的t1/2β(活性)为约14.3-27.5小时。
在某些实施方案中，长效因子VIII当施用于患者群体时具有一种或多种以下性质：
当通过单级(aPTT)测定或两级(显色)测定所测量时，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为施用相同量的由全长、成熟因子VIII组成的多肽的受试者中的清除率的0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69或0.70倍低；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.68mL/h/kg、1.68±0.1mL/h/kg、1.68±0.2mL/h/kg、1.68±0.3mL/h/kg、1.68±0.4mL/h/kg、1.68±0.5mL/h/kg、1.68±0.6mL/h/kg或1.68±0.7mL/h/kg；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.31-2.15mL/h/kg；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约2.32mL/h/kg、2.32±0.1mL/h/kg、2.32±0.2mL/h/kg、2.32±0.3mL/h/kg、2.32±0.4mL/h/kg、2.32±0.5mL/h/kg、2.32±0.6mL/h/kg或2.32±0.7mL/h/kg；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.64-3.29mL/h/kg；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.49mL/h/kg、1.49±0.1mL/h/kg、1.49±0.2mL/h/kg、1.49±0.3mL/h/kg、1.49±0.4mL/h/kg、1.49±0.5mL/h/kg、1.49±0.6mL/h/kg或1.49±0.7mL/h/kg；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.16-1.92mL/h/kg；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.52mL/h/kg、1.52±0.1mL/h/kg、1.52±0.2mL/h/kg、1.52±0.3mL/h/kg、1.52±0.4mL/h/kg、1.52±0.5mL/h/kg、1.52±0.6mL/h/kg或1.52±0.7mL/h/kg；或
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.05-2.20mL/h/kg。
在一些实施方案中，长效因子VIII当施用于患者群体时具有一种或多种以下性质：
当通过单级(aPTT)测定或两级(显色)测定所测量时，在所述受试者中的MRT为施用相同量的由全长、成熟因子VIII组成的多肽的受试者中的MRT的至少1.46、1.47、1.48、1.49、1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.90、1.91、1.92或1.93倍高；
如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的MRT(活性)为约27小时、27±1小时、27±2小时、27±3小时、27±4小时、27±5小时、27±6小时、27±7小时、27±8小时、27±9小时或27±10小时；
如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的MRT(活性)为约20.6-35.3小时；
如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的MRT(活性)为约23.9-28.5小时；
如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的MRT(活性)为约19.8-28.9小时；或
如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的MRT(活性)为约20.5-39.6小时。
在其它实施方案中，长效因子VIII当施用于患者群体时具有一种或多种以下性质：
当通过单级(aPTT)测定或两级(显色)测定测量时，在所述受试者中的增量回收率与施用相同量的由全长、成熟因子VIII组成的多肽的受试者中的增量回收率相当；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约2.44IU/dL、每IU/kg2.44±0.1IU/dL、每IU/kg2.44±0.2IU/dL、每IU/kg2.44±0.3IU/dL、每IU/kg2.44±0.4IU/dL、每IU/kg2.44±0.5IU/dL、每IU/kg2.44±0.6IU/dL、每IU/kg2.44±0.7IU/dL、每IU/kg2.44±0.8IU/dL、每IU/kg2.44±0.9IU/dL、每IU/kg2.44±1.0IU/dL、每IU/kg2.44±1.1IU/dL或每IU/kg2.44±1.2IU/dL；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约2.12-2.81IU/dL；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约1.83IU/dL、每IU/kg1.83±0.1IU/dL、每IU/kg1.83±0.2IU/dL、每IU/kg1.83±0.3IU/dL、每IU/kg1.83±0.4IU/dL、每IU/kg1.83±0.5IU/dL、每IU/kg1.83±0.6IU/dL、每IU/kg1.83±0.7IU/dL、每IU/kg1.83±0.8IU/dL、每IU/kg1.83±0.9IU/dL、每IU/kg1.83±1.0IU/dL或每IU/kg1.83±1.1IU/dL；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约1.59-2.10IU/dL；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约3.09IU/dL、每IU/kg3.09±0.1IU/dL、每IU/kg3.09±0.2IU/dL、每IU/kg3.09±0.3IU/dL、每IU/kg3.09±0.4IU/dL、每IU/kg3.09±0.5IU/dL、每IU/kg3.09±0.6IU/dL、每IU/kg3.09±0.7IU/dL、每IU/kg3.09±0.8IU/dL、每IU/kg3.09±0.9IU/dL、每IU/kg3.09±1.0IU/dL、每IU/kg3.09±1.1IU/dL、每IU/kg3.09±1.2IU/dL或每IU/kg3.09±1.3IU/dL；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约2.80IU/dL、每IU/kg2.80±0.1IU/dL、每IU/kg2.80±0.2IU/dL、每IU/kg2.80±0.3IU/dL、每IU/kg2.80±0.4IU/dL、每IU/kg2.80±0.5IU/dL、每IU/kg2.80±0.6IU/dL、每IU/kg2.80±0.7IU/dL、每IU/kg2.80±0.8IU/dL、每IU/kg2.80±0.9IU/dL、每IU/kg2.80±1.0IU/dL、每IU/kg2.80±1.1IU/dL或每IU/kg2.80±1.2IU/dL；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约2.61-3.66IU/dL；或
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约2.24-3.50IU/dL。
在其它实施方案中，长效因子VIII当施用于患者群体时具有一种或多种以下性质：
当通过单级(aPTT)测定或两级(显色)测定测量时，在所述受试者中的Vss(活性)与施用相同量的由全长、成熟因子VIII组成的多肽的受试者中的Vss(活性)相当；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约45.5mL/kg、45.5±1mL/kg、45.5±2mL/kg、45.5±3mL/kg、45.5±4mL/kg、45.5±5mL/kg、45.5±6mL/kg、45.5±7mL/kg、45.5±8mL/kg、45.5±9mL/kg、45.5±10mL/kg或45.5±11mL/kg；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约39.3-52.5mL/kg；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约62.8mL/kg、62.8±1mL/kg、62.8±2mL/kg、62.8±3mL/kg、62.8±4mL/kg、62.8±5mL/kg、62.8±6mL/kg、62.8±7mL/kg、62.8±8mL/kg、62.8±9mL/kg、62.8±10mL/kg、62.8±11mL/kg、62.8±12mL/kg、62.8±13mL/kg、62.8±14mL/kg、62.8±15mL/kg或62.8±16mL/kg；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约55.2-71.5mL/kg；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约35.9mL/kg、35.9±1mL/kg、35.9±2mL/kg、35.9±3mL/kg、35.9±4mL/kg、35.9±5mL/kg、35.9±6mL/kg、35.9±7mL/kg、35.9±8mL/kg、35.9±9mL/kg、35.9±10mL/kg、35.9±11mL/kg、35.9±12mL/kg或35.9±13mL/kg；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约30.4-42.3mL/kg；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约43.4mL/kg、43.4±1mL/kg、43.4±2mL/kg、43.4±3mL/kg、43.4±4mL/kg、43.4±5mL/kg、43.4±6mL/kg、43.4±7mL/kg、43.4±8mL/kg、43.4±9mL/kg、43.4±10mL/kg、43.4±11mL/kg、43.4±12mL/kg、43.4±13mL/kg、43.4±14mL/kg、43.4±15mL/kg或43.4±16mL/kg；或
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约38.2-49.2mL/kg。
在其它实施方案中，长效因子VIII当施用于患者群体时具有一种或多种以下性质：
当通过单级(aPTT)测定或两级(显色)测定所测量时，在所述受试者中的AUCINF为施用相同量的由全长、成熟因子VIII组成的多肽的受试者中的AUCINF的至少1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.90倍高；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约1440±316hr*IU/dL；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约1160-1880hr*IU/dL；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约1480hr*IU/dL、每IU/kg1480±100hr*IU/dL、每IU/kg1480±200hr*IU/dL、每IU/kg1480±300hr*IU/dL、每IU/kg1480±400hr*IU/dL、每IU/kg1480±500hr*IU/dL、每IU/kg1480±600hr*IU/dL、每IU/kg1480±700hr*IU/dL、每IU/kg1480±800hr*IU/dL、每IU/kg1480±900hr*IU/dL或每IU/kg1480±1000hr*IU/dL；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约2910±1320hr*IU/dL；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约1980-3970hr*IU/dL；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约2800hr*IU/dL、每IU/kg2800±100hr*IU/dL、每IU/kg2800±200hr*IU/dL、每IU/kg2800±300hr*IU/dL、每IU/kg2800±400hr*IU/dL、每IU/kg2800±500hr*IU/dL、每IU/kg2800±600hr*IU/dL、每IU/kg2800±700hr*IU/dL、每IU/kg2800±800hr*IU/dL、每IU/kg2800±900hr*IU/dL或每IU/kg2800±1000hr*IU/dL；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约1660hr*IU/dL、每IU/kg1660±100hr*IU/dL、每IU/kg1660±200hr*IU/dL、每IU/kg1660±300hr*IU/dL、每IU/kg1660±400hr*IU/dL、每IU/kg1660±500hr*IU/dL、每IU/kg1660±600hr*IU/dL、每IU/kg1660±700hr*IU/dL、每IU/kg1660±800hr*IU/dL、每IU/kg1660±900hr*IU/dL或每IU/kg1660±1000hr*IU/dL；
当施用约25IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约1300-2120hr*IU/dL；
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约4280hr*IU/dL、每IU/kg4280±100hr*IU/dL、每IU/kg4280±200hr*IU/dL、每IU/kg4280±300hr*IU/dL、每IU/kg4280±400hr*IU/dL、每IU/kg4280±500hr*IU/dL、每IU/kg4280±600hr*IU/dL、每IU/kg4280±700hr*IU/dL、每IU/kg4280±800hr*IU/dL、每IU/kg4280±900hr*IU/dL、每IU/kg4280±1000hr*IU/dL、每IU/kg4280±1100hr*IU/dL、每IU/kg4280±1200hr*IU/dL、每IU/kg4280±1300hr*IU/dL、每IU/kg4280±1400hr*IU/dL、每IU/kg4280±1500hr*IU/dL或每IU/kg4280±1600hr*IU/dL；或
当施用约65IU/kg嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约2960-6190hr*IU/dL。
如本文所用，“按需治疗”意指意图在短时程内进行且响应于现有病状(如出血事件)或认为需要(如计划手术)的治疗。可能需要按需治疗的病状包括例如出血事件、关节积血、肌肉出血、口腔出血、流血、肌肉内流血、口腔流血、创伤、头部创伤、胃肠出血、颅内流血、腹内流血、胸内流血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血或髂腰肌鞘出血。受试者可能需要手术预防、围手术期管理或用于手术的治疗。所述手术包括例如小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝气切开术、滑膜切除术、全膝置换、开颅术、骨缝合术、创伤外科手术、颅内手术、腹内手术、胸内手术或关节置换手术。
在一个实施方案中，按需治疗在单一剂量中消退多于80%(多于80%、多于81%、多于82%、多于83%、多于84%、多于85%、多于86%、多于87%、多于88%、多于89%、多于90%、多于91%、多于92%、多于93%、多于94%、多于95%、多于96%、多于97%、多于98%、多于99%或100%)或80-100%、80-90%、85-90%、90-100%、90-95%或95-100%的出血(例如自发性出血)。在另一实施方案中，在按需治疗后多于80%(多于81%、多于82%、多于83%、多于84%、多于85%、多于86%、多于87%、多于88%、多于89%、多于90%、多于91%、多于92%、多于93%、多于94%、多于95%、多于96%、多于97%、多于98%或100%)或80-100%、80-90%、85-90%、90-100%、90-95%或95-100%的出血事件由医师评级为优良或良好。在其它实施方案中，在按需治疗后多于5%(多于6%、多于7%、多于8%、多于9%、多于10%、多于11%、多于12%、多于13%、多于14%、多于15%、多于16%、多于17%、多于18%、多于19%、多于20%)或5-20%、5-15%、5-10%、10-20%或10-15%的出血事件由医师评级为合格。
“多肽”、“肽”及“蛋白质”可互换使用且指的是由共价连接的氨基酸残基构成的聚合化合物。
“多核苷酸”与“核酸”可互换使用且指的是由共价连接的核苷酸残基构成的聚合化合物。多核苷酸可为DNA、cDNA、RNA、单链或双链、载体、质粒、噬菌体或病毒。多核苷酸包括例如表1中的那些多核苷酸，其编码表2的多肽(参见表1)。多核苷酸还包括例如表1的多核苷酸的片段，例如编码表2的多肽的片段的那些，所述多肽片段为如因子VIII、Fc、信号序列、6His及表2的多肽的其它片段。
如本文所用，“预防性治疗”意指经历一定时程向受试者以多个剂量施用因子VIII多肽以增加受试者血浆中因子VIII活性的水平。增加的水平可足以降低自发性出血的发生率或预防出血，例如在不可预见的损伤事件中。在预防性治疗期间，受试者体内的血浆蛋白水平可能并不下降低于所述受试者的基线水平，或低于表征重度血友病的因子VIII水平(<1IU/dl[1%])。
在一个实施方案中，预防方案是根据单个患者例如通过测定各患者的PK数据且以维持1-3%FVIII活性的谷水平的给药间隔施用本发明因子VIII来“定制”。可在受试者经历不可接受的出血事件(定义为在连续两个月的时间内≥2次自发性出血事件)时进行调整。在此情况下，调整的目标为3-5%的谷水平。在另一实施方案中，预防性治疗使得出血得到预防和控制、出血得到持续控制、持续防止出血和/或持续益处。预防(例如持续保护)可由相比于短效FVIII而言至最后测量的时间点的AUC(AUC-LAST)增加及清除率降低，从而使得终末t1/2增加得以证明。预防可由相比于短效FVIII而言Cmax更佳、Tmax更佳和/或平均滞留时间更长得以证明。在一些实施方案中，预防使得在注射(例如最后一次注射)后约24小时、36小时、48小时、72小时或96小时(例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、96、87、88、89、90、91、92、93、94、95或96小时)内无自发性出血事件。在某些实施方案中，预防使得在每周一次给药(例如65IU/kg)的情况下每年的出血事件平均减少多于30%(例如多于31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、96、87、88、89或90%，例如多于50%)。如本文所用，“治疗剂量”意指达成如本文所述的治疗目标的剂量。因子VIII的所需剂量的计算是基于根据经验发现每公斤体重1IU的因子VIII平均使血浆因子VIII活性升高约2IU/dL。所需剂量使用下式来确定：
所需单位=体重(kg)×所要因子VIII升高(IU/dL或正常值的%)×0.5(每IU/dL的IU/kg数)
可用于本发明方法中的治疗剂量为约10-100IU/kg，更特定来说为10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100IU/kg，且更特定来说为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100IU/kg。
可用于本发明方法中的其它治疗剂量为约10至约150IU/kg，更特定来说为约100-110、110-120、120-130、130-140、140-150IU/kg，且更特定来说为约110、115、120、125、130、135、140、145或150IU/kg。
如本文所用，“变体”是指不同于原始多核苷酸或多肽，但保留其基本性质(例如因子VIII凝血活性或Fc(FcRn结合)活性)的多核苷酸或多肽。一般来说，变体总体上接近类似，且在许多区中与原始多核苷酸或多肽同一。变体包括例如多肽及多核苷酸片段、缺失、插入及原始多肽的修饰型式。
变异多核苷酸可包含以下或者由以下组成：与例如SEQ IDNO:1、3或5中的核苷酸编码序列(个别地或一起的因子VIII部分、Fc部分)或其互补链至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的核苷酸序列、已知突变体及重组因子VIII或Fc(如本文引用的公布及专利中所公开的那些)的核苷酸编码序列或其互补链、编码SEQ ID NO:2、4或6的多肽(个别地或一起的因子VIII部分、Fc部分)的核苷酸序列，和/或这些核酸分子中任一个的多核苷酸片段(例如本文所述的那些片段)。还包括在严格杂合条件或较低严格度条件下与这些核酸分子杂合的多核苷酸作为变体，由这些多核苷酸编码的多肽也是如此，只要其具功能性即可。
变异多肽可包含以下或者由以下组成：与例如SEQ ID NO:2、4或6中所示的多肽序列(个别地或一起的因子VIII部分、Fc部分)至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一的氨基酸序列，和/或这些多肽中任一个的多肽片段(例如本文所述的那些片段)。
至于具有与参考核苷酸序列至少例如95%“同一”的核苷酸序列的核酸，旨在除所述核酸的核苷酸序列可在每100个参考核苷酸序列的核苷酸中包括至多五个点突变外，所述核苷酸序列与参考序列同一。换句话说，为获得具有与参考核苷酸序列至少95%同一的核苷酸序列的核酸，参考序列中的至多5%核苷酸可缺失或取代为另一核苷酸，或数目为参考序列中总核苷酸的至多5%的核苷酸可插入参考序列中。查询序列可为例如SEQ ID NO:1或3中所示的完整序列、ORF(开放阅读框)或如本文所述指定的任何片段。
实际上，任何具体核酸分子或多肽是否与本发明的核苷酸序列或多肽至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一可使用已知的计算机程序常规地确定。在一个实施方案中，用于确定查询序列(参考或原始序列)与主题序列之间的最佳总体匹配的方法(又称为全面序列比对)可使用基于Brutlag等,Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序确定，所述文献以引用的方式整体并入本文。在序列比对中，查询及主题序列均为DNA序列。RNA序列可通过将U转化为T来进行比较。所述全面序列比对的结果为同一性百分比。在另一实施方案中，DNA序列的FASTDB比对中用于计算同一性百分比的参数为：矩阵=单一，k-元组=4，错配罚分=1，连接罚分=30，随机化组长度=0，截止计分=1，缺口罚分=5，缺口大小罚分0.05，窗口大小=500或主题核苷酸序列长度中的较短者。
如果主题序列由于5’或3’缺失而非由于内部缺失而比查询序列短，那么须对结果进行人工校正。这是因为FASTDB程序在计算同一性百分比时不计入主题序列的5’及3’截短。对于相对于查询序列在5’或3’端截短的主题序列，通过将位于主题序列的5’及3’的不匹配/对准的查询序列的碱基数目计算为查询序列总碱基的百分比来校正同一性百分比。核苷酸是否匹配/对准由FASTDB序列比对的结果确定。接着将此百分比从通过上述FASTDB程序使用指定参数计算的同一性百分比中扣除以获得最终同一性百分比计分。此校正的计分为用于本发明目的的计分。仅计算未与查询序列匹配/对准的如由FASTDB比对所展示位于主题序列5’及3’碱基外部的碱基用于人工调整同一性百分比计分的目的。
举例来说，将90个碱基的主题序列与100个碱基的查询序列比对以确定同一性百分比。缺失发生于主题序列的5’端且因此FASTDB比对不显示5’端前10个碱基的匹配/对准。所述10个未配对碱基占序列的10%(位于5’及3’端的不匹配碱基的数目/查询序列中碱基的总数)，因此将10%从由FASTDB程序计算的同一性百分比计分中扣除。如果剩余90个碱基完全匹配，那么最终同一性百分比将为90%。在另一实施例中，将90个碱基的主题序列与100个碱基的查询序列比较。此时缺失为内部缺失，因此在主题序列的5’或3’处不存在不与查询序列匹配/对准的碱基。在此情况下，不对由FASTDB计算的同一性百分比进行人工校正。再次，仅人工校正不与查询序列匹配/对准的主题序列的5’及3’的碱基。出于本发明的目的，不进行其它人工校正。
至于具有与本发明的查询氨基酸序列至少例如95%“同一”的氨基酸序列的多肽，旨在除主题多肽序列可在每100个查询氨基酸序列的氨基酸中包括至多五个氨基酸改变外，主题多肽的氨基酸序列与查询序列同一。换句话来说，为获得具有与查询氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列的多肽，主题序列中的至多5%的氨基酸残基可插入、缺失(插入/缺失)或取代为另一氨基酸。参考序列的这些改变可发生于参考氨基酸序列的氨基或羧基端位置或那些末端位置之间个别地散布于参考序列中的残基之间或以一个或多个连续群组散布于参考序列内的任何位置。
实际上，任何具体多肽是否与例如SEQ ID NO:2(个别地或一起的因子VIII部分、Fc部分)或4或已知因子VIII或Fc多肽序列的氨基酸序列至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一可使用已知计算机程序常规地确定。在一个实施方案中，用于确定查询序列(参考或原始序列)与主题序列之间的最佳总体匹配的方法(又称为全面序列比对)可使用基于Brutlag等,Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序确定，所述文献以引用的方式整体并入本文。在序列比对中，查询序列与主题序列均为核苷酸序列或均为氨基酸序列。所述全面序列比对的结果为同一性百分比。在另一实施方案中，FASTDB氨基酸比对中所用的参数为：矩阵=PAM0，k-元组=2，错配罚分=1，连接罚分=20，随机化组长度=0，截止计分=1，窗口大小=序列长度，缺口罚分=5，缺口大小罚分=0.05，窗口大小=500或主题氨基酸序列长度中的较短者。
如果主题序列由于N或C端缺失而非由于内部缺失而比查询序列短，那么须对结果进行人工校正。这是因为FASTDB程序在计算全面同一性百分比时不计入主题序列的N及C端截短。对于相对于查询序列在N或C端截短的主题序列，通过将位于主题序列的N及C端的与相应主题残基不匹配/对准的查询序列的残基数目计算为查询序列总碱基的百分比来校正同一性百分比。残基是否匹配/对准由FASTDB序列比对的结果确定。接着将此百分比从通过上述FASTDB程序使用指定参数计算的同一性百分比中扣除以获得最终同一性百分比计分。此最终同一性百分比计分为用于本发明目的的计分。仅考虑位于主题序列N及C端的与查询序列不匹配/对准的残基用于人工调整同一性百分比计分的目的。即，仅查询残基位于主题序列的最远N及C端残基以外。
举例来说，将90个氨基酸残基的主题序列与100个残基的查询序列比对以确定同一性百分比。缺失发生于主题序列的N端且因此FASTDB比对不显示N端前10个残基的匹配/对准。所述10个未配对残基占序列的10%(位于N及C端的不匹配残基的数目/查询序列中残基的总数)，因此将10%从由FASTDB程序计算的同一性百分比计分中扣除。如果剩余90个残基完全匹配，那么最终同一性百分比将为90%。在另一实施例中，将90个残基的主题序列与100个残基的查询序列比较。此时缺失为内部缺失，因此在主题序列的N或C端不存在不与查询序列匹配/对准的残基。在此情况下，不对由FASTDB计算的同一性百分比进行人工校正。再次，仅人工校正不与查询序列匹配/对准的如FASTDB比对中所展示的主题序列N及C端以外的残基位置。出于本发明的目的，不进行其它人工校正。
多核苷酸变体可在编码区、非编码区或两者中含有改变。在一个实施方案中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失，但不改变所编码多肽的性质或活性的改变。在另一实施方案中，核苷酸变体由于遗传密码的简并性而由沉默取代产生。在其它实施方案中，在变体中，5-10、1-5或1-2个氨基酸以任何组合取代、缺失或添加。多核苷酸变体可出于多种原因而产生，例如以针对具体宿主来优化密码子表达(将人类mRNA中密码子改变为其它，例如细菌宿主，如大肠杆菌(E.coli))。
天然存在的变体被称为“等位基因变体”，且指的是占据生物体染色体上给定基因座的基因的若干种替代形式的一种(Genes II,Lewin,B.编,John Wiley&Sons,New York(1985))。这些等位基因变体可在多核苷酸和/或多肽水平上不同且包括于本发明中。或者，可通过诱变技术或直接合成产生非天然存在的变体。
使用蛋白质改造和重组DNA技术的已知方法，可生成变体以改进或改变多肽的特征。举例来说，可在不实质性损失生物功能的情况下从分泌的蛋白的N端或C端缺失一个或多个氨基酸。Ron等,J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)(以引用的方式整体并入本文)报道甚至在缺失3、8或27个氨基端氨基酸残基后仍具有发夹结合活性的变异的KGF蛋白。类似地，干扰素γ在从这个蛋白的羧基端缺失8-10个氨基酸残基后显示高达十倍高的活性。(Dobeli等,J.Biotechnology7:199-216(1988)，以引用的方式整体并入本文)。
此外，大量证据证明变体经常保留与天然存在的蛋白质的生物活性类似的生物活性。举例来说，Gayle与合作者(J.Biol.Chem268:22105-22111(1993)，以引用的方式整体并入本文)对人类细胞激素IL-1a进行了广泛的突变分析。他们使用随机诱变以生成超过3,500种单个IL-1a突变体，所述突变体在分子的整个长度上平均每个变体具有2.5个氨基酸变化。在每个可能的氨基酸位置处检查了多种突变。研究者发现“可在对[结合或生物活性]的影响极小的情况下改变[大部分]分子”。(参见摘要)。实际上，在所检查的超过3,500种核苷酸序列中，仅23种独特氨基酸序列产生了活性与野生型显著不同的蛋白质。
如上文所述，多肽变体包括例如修饰的多肽。修饰包括例如乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(Mei等,Blood116:270-79(2010)，其以引用的方式整体并入本文)、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、蛋白质的转移RNA介导的氨基酸添加，如精氨酰化，及泛素化。在一些实施方案中，因子VIII在任何适宜位置处被修饰(例如聚乙二醇化)。在一些实施方案中，因子VIII在因子VIII的表面暴露氨基酸(例如表面暴露半胱氨酸，其可为改造的半胱氨酸)上被聚乙二醇化。同上。在一些实施方案中，修饰的因子VIII(例如聚乙二醇化的因子VIII)为长效因子VIII。
如本文所用，“稳态下的分布体积(Vss)”具有与药理学中所用的术语相同的含义，其为药物分布进入的表观空间(体积)。Vss=体内药物的量除以稳态下的血浆浓度。
如本文关于范围所用，“约”修饰范围的两端。因此，“约10-20”意指“约10至约20”。
本文所用的嵌合多肽可包含加工过的因子VIII或单链因子VIII或其组合。如本文所用，“加工过的因子VIII”意指已在精氨酸1648(对于全长因子VIII)或精氨酸754(对于B结构域缺失的因子VIII)(即细胞内加工位点)处裂解的因子VIII。由于在细胞内加工位点处的裂解，因此加工过的因子VIII包含两条多肽链，第一链为重链且第二链为轻链。举例来说，加工过的因子VIII-Fc融合蛋白(即重链及轻链融合于Fc)在非还原性SDS-PAGE上分别跑胶至约90kDa及130kDa且在还原性SDS-PAGE上分别跑胶至90kDa及105kDa。因此，在一个实施方案中，嵌合多肽中因子VIII部分的至少约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%为加工过的因子VIII。在另一实施方案中，嵌合多肽中因子VIII部分的约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%为加工过的因子VIII。在一个具体实施方案中，从包含单链因子VIII的嵌合多肽纯化(或分离)包含加工过的因子VIII的嵌合多肽，且嵌合多肽中因子VIII部分的至少约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%为加工过的因子VIII。
如本文所用，“单链因子VIII”、“SC因子VIII”或“SCFVIII”意指尚未在精氨酸位点(对于全长因子VIII来说为残基1648(即SEQ IDNO:6的残基1667)或对于B结构域缺失的因子VIII来说为残基754(即SEQ ID NO:2的残基773))处裂解的因子VIII。因此，本文所用的嵌合多肽中的单链因子VIII包含单链。在一个实施方案中，单链因子VIII含有完整的细胞内加工位点。在另一实施方案中，本发明的单链因子VIII包含对应于精氨酸1645的氨基酸位置处的取代或突变、对应于精氨酸1648的氨基酸位置处的取代或突变、或对应于全长因子VIII中精氨酸1645与精氨酸1648的氨基酸位置处的取代或突变。在其它实施方案中，在对应于精氨酸1645的氨基酸位置处取代的氨基酸为与在对应于精氨酸1648的氨基酸位置处取代的氨基酸不同的氨基酸。在某些实施方案中，取代或突变为除精氨酸以外的氨基酸，例如异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、硒半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、组氨酸、鸟氨酸、吡咯赖氨酸或牛磺酸。单链因子VIII-Fc融合蛋白可在非还原性SDS-PAGE上跑胶至约220kDa且在还原性SDS-PAGE上跑胶至约195kDa。
在一个实施方案中，从包含加工过的因子VIII的嵌合多肽中纯化(或分离)包含单链因子VIII的嵌合多肽，且本文所用嵌合多肽的因子VIII部分的至少约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约99%或约100%为单链因子VIII。在另一实施方案中，嵌合多肽的因子VIII部分的至少约1%、约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%或约35%为单链因子VIII。在其它实施方案中，本文所用嵌合多肽的因子VIII部分的约1%-约10%、约5%-约15%、约10%-约20%、约15%-约25%、约20%-约30%、约25%-约35%、约30%-约40%为单链因子VIII。在一个具体实施方案中，本文所用嵌合多肽的因子VIII部分的约1%、约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%为单链因子VIII。在其它实施方案中，本文所用嵌合多肽的因子VIII部分的约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%为单链因子VIII。在一些实施方案中，嵌合多肽的单链因子VIII与加工过的因子VIII的比率为(a)约25%单链因子VIII与约75%加工过的因子VIII；(b)约20%单链因子VIII与约80%加工过的因子VIII；(c)约15%单链因子VIII与约85%加工过的因子VIII；(d)约10%单链因子VIII与约90%加工过的因子VIII；(e)约5%单链因子VIII与约95%加工过的因子VIII；(f)约1%单链因子VIII与约99%加工过的因子VIII；(g)约100%加工过的因子VIII；(h)约30%单链因子VIII与约70%加工过的因子VIII；(i)约35%单链因子VIII与约65%加工过的因子VIII；或(j)约40%单链因子VIII与约60%加工过的因子VIII。在其它实施方案中，嵌合多肽的单链因子VIII与加工过的因子VIII的比率为(a)约30%单链因子VIII与约70%加工过的因子VIII；(b)约40%单链因子VIII与约60%加工过的因子VIII；(c)约50%单链因子VIII与约50%加工过的因子VIII；(d)约60%单链因子VIII与约40%加工过的因子VIII；(e)约70%单链因子VIII与约30%加工过的因子VIII；(f)约80%单链因子VIII与约20%加工过的因子VIII；(g)约90%单链因子VIII与约10%加工过的因子VIII；(h)约95%单链因子VIII与约5%加工过的因子VIII；(i)约99%单链因子VIII与约1%加工过的因子VIII；或(j)约100%单链因子VIII。
本文所用嵌合多肽中的因子VIII部分具有因子VIII活性。因子VIII活性可通过本领域中的任何已知方法测量。举例来说，那些方法中的一种可为显色测定。显色测定机制是基于凝血级联的原理，其中活化的因子VIII加速在活化因子IX、磷脂及钙离子存在下因子X向因子Xa的转化。因子Xa活性是通过对因子Xa具有特异性的对硝基酰苯胺(pNA)底物的水解来评估。在405nM下测得的对硝基苯胺的初始释放速率与因子Xa活性正相关且因此与样品中的因子VIII活性正相关。显色测定由国际血栓症及止血协会(International Society onThrombosis and Hemostatsis；ISTH)的科学标准化委员会(Scientific andStandardization Committee；SSC)的因子VIII与因子IX下属委员会(Factor VIII and Factor IX Subcommittee)推荐。自1994年以来，显色测定还已成为欧洲药典关于FVIII浓缩物效能指定的参考方法。因此，在一个实施方案中，当通过显色测定体外测量因子VIII活性时，包含单链因子VIII的嵌合多肽具有与包含加工过的因子VIII的嵌合多肽(例如基本上由或由两个Fc部分与加工过的因子VIII组成的嵌合多肽，其中所述加工过的因子VIII融合于所述两个Fc部分中的一个)相当的因子VIII活性。
在另一实施方案中，本发明的包含单链因子VIII的嵌合多肽具有与包含加工过的因子VIII的嵌合多肽(例如基本上由或由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽，其中加工过的因子VIII融合于所述两个Fc部分中的一个Fc)相当的因子Xa产生速率。
为将因子X活化为因子Xa，活化的因子IX(因子IXa)在Ca2+、膜磷脂及因子VIII辅因子存在下将因子X中的一个精氨酸-异亮氨酸键水解以形成因子Xa。因此，因子VIII与因子IX的相互作用为凝血途径中的关键。在某些实施方案中，包含单链因子VIII的嵌合多肽可以与包含加工过的因子VIII的嵌合多肽(例如基本上由或由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽，其中加工过的因子VIII融合于所述两个Fc部分中的一个Fc)相当的速率与因子IXa相互作用。
另外，因子VIII当在循环中呈非活性时结合于冯·维勒布兰德因子。因子VIII在未结合于vWF时快速降解且通过凝血酶的作用而从vWF释放。在一些实施方案中，包含单链因子VIII的嵌合多肽可以与包含加工过的因子VIII的嵌合多肽(例如基本上由或由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽，其中加工过的因子VIII融合于所述两个Fc部分中的一个Fc)相当的程度结合于冯·维勒布兰德因子。
因子VIII可由活化的蛋白C在钙及磷脂存在下灭活。活化的蛋白C在A1结构域中精氨酸336后方裂解因子VIII重链，这破坏了因子X底物相互作用位点，且在A2结构域中精氨酸562后方裂解，这增强了A2结构域的解离并且破坏与因子IXa的相互作用位点。此裂解还将A2结构域(43kDa)平分且产生A2-N(18kDa)和A2-C(25kDa)结构域。因此，活化的蛋白C可催化重链中的多个裂解位点。在一个实施方案中，包含单链因子VIII的嵌合多肽可以与包含加工过的因子VIII的嵌合多肽(例如基本上由或由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽，其中加工过的因子VIII融合于所述两个Fc部分中的一个Fc)相当的程度由活化的蛋白C灭活。
在其它实施方案中，包含单链因子VIII的嵌合多肽在体内具有与包含加工过的因子VIII的嵌合多肽(例如基本上由或由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽，其中加工过的因子VIII融合于所述两个Fc部分中的一个Fc)相当的因子VIII活性。在一个具体实施方案中，在HemA小鼠尾静脉横断模型中，包含单链因子VIII的嵌合多肽能够以与包含加工过的因子VIII的嵌合多肽(例如基本上由或由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽，其中所述加工过的因子VIII融合于所述两个Fc部分中的一个Fc)相当的程度保护HemA小鼠。
如本文所用的术语“相当”意指通过使用嵌合多肽产生的比较速率或水平等于、大致上等于或类似于参考速率或水平。如本文所用的术语“类似”意指比较速率或水平与参考速率或水平(例如基本上由或由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽的FXa产生速率，其中所述加工过的因子VIII融合于所述两个Fc部分中的一个Fc)的差异不超过10%或不超过15%。术语“大致上相等”意指比较速率或水平与参考速率或水平的差异不超过0.01%、0.5%或1%。
本发明进一步包括包含具有因子VIII活性的嵌合多肽的组合物，其中至少约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约85%、约90%、约95%或约99%的嵌合多肽包含为单链因子VIII的因子VIII部分及第二部分。在另一实施方案中，组合物中嵌合多肽的约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%为单链因子VIII。在其它实施方案中，第二部分为Fc、XTEN、白蛋白、PAS序列、转铁蛋白、CTP(具有4个O-聚糖的hCG的28个氨基酸的C端肽(CTP))、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合多肽、白蛋白结合小分子或其两个或两个以上组合。在其它实施方案中，本发明的组合物包含含加工过的因子VIII的嵌合多肽与含单链因子VIII的嵌合多肽的组合，(a)其中嵌合多肽的约30%因子VIII部分为单链因子VIII，且嵌合多肽的约70%因子VIII部分为加工过的因子VIII；(b)其中嵌合多肽的约40%因子VIII部分为单链因子VIII且嵌合多肽的约60%因子VIII部分为加工过的因子VIII；(c)其中嵌合多肽的约50%因子VIII部分为单链因子VIII且嵌合多肽的约50%因子VIII部分为加工过的因子VIII；(d)其中嵌合多肽的约60%因子VIII部分为单链因子VIII且嵌合多肽的约40%因子VIII部分为加工过的因子VIII；(e)其中嵌合多肽的约70%因子VIII部分为单链因子VIII且嵌合多肽的约30%因子VIII部分为加工过的因子VIII；(f)其中嵌合多肽的约80%因子VIII部分为单链因子VIII且嵌合多肽的约20%因子VIII部分为加工过的因子VIII；(g)其中嵌合多肽的约90%因子VIII部分为单链因子VIII且嵌合多肽的约10%因子VIII部分为加工过的因子VIII；(h)其中嵌合多肽的约95%因子VIII部分为单链因子VIII且嵌合多肽的约5%因子VIII部分为加工过的因子VIII；(i)其中嵌合多肽的约99%因子VIII部分为单链因子VIII且嵌合多肽的约1%因子VIII部分为加工过的因子VIII；或(j)其中嵌合多肽的约100%因子VIII部分为单链因子VIII。
在某些实施方案中，当通过显色测定体外测量因子VIII活性时，本发明的组合物具有与包含加工过的因子VIII的组合物(例如包含基本上由或由两个Fc部分与加工过的因子VIII组成的嵌合多肽的组合物，其中所述加工过的因子VIII融合于所述两个Fc部分中的一个)相当的因子VIII活性。
在其它实施方案中，本发明的组合物具有与包含加工过的因子VIII的组合物(例如包含基本上由或由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽的组合物，其中加工过的因子VIII融合于所述两个Fc部分中的一个Fc)相当的因子Xa产生速率。在其它实施方案中，包含单链因子VIII的组合物可以与包含加工过的因子VIII的组合物(例如包含基本上由或由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽的组合物，其中加工过的因子VIII融合于一个Fc)相当的速率与因子IXa相互作用。在其它实施方案中，本发明组合物的嵌合多肽中的单链因子VIII以与组合物的嵌合多肽中的加工过的因子VIII(例如包含基本上由或由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽的组合物，其中加工过的因子VIII融合于所述两个Fc部分中的一个Fc)相当的程度由活化的蛋白C灭活。在一个具体实施方案中，包含单链因子VIII的组合物在体内具有与包含加工过的因子VIII的组合物(例如包含基本上由或由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽的组合物，其中加工过的因子VIII融合于所述两个Fc部分中的一个Fc)相当的因子VIII活性。在一些实施方案中，在HemA小鼠尾静脉横断模型中，本发明的包含单链因子VIII的组合物能够以与包含加工过的因子VIII的组合物(例如包含基本上由或由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽的组合物，其中所述加工过的因子VIII融合于所述两个Fc部分中的一个Fc)相当的程度保护HemA小鼠。
本发明进一步提供使用本发明的组合物治疗人类受试者的出血病状的方法。示例性方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含具有因子VIII活性的嵌合多肽的药物组合物/制剂，其中至少约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约85%、约90%、约95%或约99%的嵌合多肽包含为单链因子VIII的因子VIII部分及第二部分。
出血病状可由凝血病症引起。凝血病症又可称为凝血病。在一个实施例中，可用本公开的药物组合物治疗的凝血病症为血友病或冯·维勒布兰德氏病(von Willebrand disease；vWD)。在另一实施例中，可用本公开的药物组合物治疗的凝血病症为血友病A。
在一些实施方案中，与出血病状相关的出血类型选自关节积血、肌肉出血、口腔出血、流血、肌肉内流血、口腔流血、创伤、头部创伤、胃肠出血、颅内流血、腹内流血、胸内流血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血及髂腰肌鞘出血。
在其它实施方案中，患有出血病状的受试者需要用于手术的治疗，包括例如手术预防或围手术期管理。在一个实施例中，手术选自小手术及大手术。示例性手术工序包括拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝气切开术、滑膜切除术、开颅术、骨缝合术、创伤外科手术、颅内手术、腹内手术、胸内手术或关节置换手术(例如全膝置换、髋关节置换及其类似手术)、心脏手术及剖腹产。
在另一实施例中，受试者伴随用FIX来治疗。因为本发明的化合物能够活化FIXa，所以其可用于在向受试者施用FIXa前预活化FIXa多肽。
本发明的方法可对需要预防性治疗或按需治疗的受试者实施。
包含至少30%单链因子VIII的药物组合物可配制用于任何适当投药方式，包括例如局部(例如经皮或眼部)、经口、经颊、经鼻、阴道、直肠或胃肠外投药。
如本文所用的术语胃肠外包括皮下、皮内、血管内(例如静脉内)、肌肉内、脊柱、颅内、鞘内、眼内、眼周、眼眶内、滑膜内及腹膜内注射以及任何类似注射或输注技术。组合物还可为例如混悬液、乳液、持续释放制剂、霜剂、凝胶或粉末。组合物可用传统的粘合剂和载体(如甘油三酯)配制为栓剂。
在一个实施例中，药物制剂为液体制剂，例如缓冲的等张水溶液。在另一实施例中，药物组合物具有生理或接近生理的pH。在其它实施例中，水性制剂具有生理或接近生理的渗透压和盐度。其可含有氯化钠和/或乙酸钠。在一些实施例中，本发明的组合物被冻干。
现已详细描述了本发明，其将通过参考以下实施例得到更清楚的理解，所述实施例包括于本文仅用于说明目的且不意图限制本发明。本文提及的所有专利及公开明确以引用的方式并入本文。
实施例
实施例1
rFVIIIFc的克隆、表达和纯化
所有分子生物学工序均根据标准技术执行。人类FVIII的编码序列(基因库登录号NM_000132)(包括其天然信号序列)是通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人类肝脏polyA RNA获得。由于FVIII的大尺寸，编码序列以若干部分从分开的RT-PCR反应获得，并且通过一系列PCR反应进行组装，限制性消化并且连接至含有B结构域缺失的(BDD)FVIII编码区的中间克隆载体中，其中在所述编码区中，丝氨酸743(S743)融合于谷氨酰胺1638(Q1638)，从而从全长FVIII的B结构域消除2682bp。人类IgG1Fc序列(例如基因库登录号Y14735)通过PCR从白细胞cDNA文库获得，并且制备最终表达盒的方式应使得BDD FVIII序列直接融合于Fc序列(铰链、CH2和CH3结构域，始于IgG1序列的D221，EU编号)的N端而无插入接头。为仅表达Fc链，以合成寡核苷酸产生小鼠Igκ(kappa)轻链信号序列并且使用PCR添加至Fc编码序列以使得所述蛋白质产物能够分泌。将FVIIIFc和Fc链编码序列克隆至双重表达载体pBudCE4.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。
使用脂转染胺转染试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)用pSYN-FVIII-013质粒转染HEK293H细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)，并且利用博莱霉素选择稳定细胞系。细胞在无血清悬浮培养物中生长，并且使用包括FVIII特异性亲和纯化步骤的四管柱纯化方法(McCue J.等,J.Chromatogr.A.,1216(45):7824-30(2009))，接着通过阴离子交换管柱与疏水性相互作用管柱的组合从澄清的收集培养基纯化rFVIIIFc蛋白。
实施例2
生物化学表征
加工过的重组FVIII-Fc(rFVIIIFc)合成为两条多肽链，一条链由BDD-FVIII(S743-Q1638融合体，1438个氨基酸)融合于IgG1的Fc结构域(铰链、CH2和CH3结构域)(226个氨基酸，从D221延伸至G456，EU编号)组成，总链长度为1664个氨基酸，另一条链由单独的相同Fc区组成(226个氨基酸)。尽管预期用FVIIIFc/Fc双重表达质粒转染的细胞分泌三种产物(FVIIIFc二聚体、FVIIIFc单体和Fc二聚体)，但在条件培养基中仅检测到FVIIIFc单体和Fc二聚体。通过非还原性和还原性SDS-PAGE分析对纯化的FVIIIFc进行分析(图2A和图2B)。对于非还原性SDS-PAGE，发现条带迁移至约90kDa和130kDa，与FVIIIFc重链(HC)和轻链-二聚Fc融合体(LCFc2)的预测分子量一致(图2A，泳道3)。还在约220kDa检测到第三条带，与单链FVIIIFc(SC FVIIIFc；HC+LCFc2)的预测分子量一致，其中位置754(对于全长序列来说为1648)上的精氨酸残基在分泌期间未裂解。对于还原性SDS-PAGE分析，见到主要条带迁移至约25kDa、90kDa、105kDa和195kDa，与单链Fc、HC、LCFc和SC FVIIIFc的预测分子量一致(图2B，泳道3)。用人类PC5(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶(subtlisin)/kexin(PCSK)型蛋白酶的成员)共转染引起rFVIIIFc产物的完全加工(图2A、图2B，泳道2)。
SDS-PAGE后，若干批rFVIIIFc的密度测定分析指示预期条带的纯度大于98%。还使用尺寸排阻色谱(SEC)来评定所存在聚集的程度，并且发现所有批次均具有0.5%或0.5%以下的聚集物水平。
通过凝血酶裂解、还原和LC/UV与LC/MS分析进一步分析rFVIIIFc结构。通过UV吸收(图2C)可检测到由凝血酶产生的四个因子VIII片段(通过在位于位置372、740和795(795对应于相对于全长FVIII序列的1689)处的三个精氨酸残基处裂解)，对应于以下蛋白质区段：Fc(峰1)、轻链-Fc(峰2)、来自重链的A1结构域(峰3)和来自重链的A2结构域(峰4)。14个氨基酸的B结构域接头和约6kDa的a3相关肽因其尺寸小而未由UV吸收检测到。
通过HPLC/MS分析rFVIIIFc的凝血酶消化提供四个主要结构域以及约6kDa a3相关肽的其它详细信息，并且使用相同方法与
Figure BDA0000473150590000701
(CHO来源的重组BDD-FVIII蛋白(rBDD FVIII))进行比较。使FVIII样品经过Detergent-OUTDTG-100X管柱(GBioscience,Maryland Heights,MO)以便移除Tween，用凝血酶充分消化，还原并且通过RP-HPLC-UV(POROS R1/10,Applied Biosystems)或RP-HPLC-MS(与Agilent6210TOF质谱仪连接的Agilent1200)使用乙腈的水+0.1%甲酸的梯度进行分析。还通过LysC肽定位证实肽序列，通过RP-HPLC/MS(Thermo Finnigan LTQ-XL-ETD)进行分析。
如所预期，rFVIIIFc的总离子流(TIC)色谱图(图2D)似乎与UV色谱图(图2C)类似。通过LC/MS可检测到预期六种产物中的五种，包括由加工过的和单链异构体产生的a3酸性区的两种形式，以及用于消化的凝血酶。还观察到a3酸性区的另一截短形式，并且在下文更详细描述。rBDD FVIII产生类似TIC色谱图，但与rFVIIIFc LC-Fc相比无游离Fc链并且具有不同LC质量，此与缺乏Fc区一致(数据未示出)。
由于大多数蛋白质上糖基化的异质性，A1、LC-Fc和Fc区的去卷积质谱为复杂的并且因此未确立所有分子离子的密度。然而，发现来自Fc区的三个主要峰的观测质量匹配IgG分子上发现的G0、G1和G2，对应于终止于0、1或2个半乳糖残基的双触角寡糖。a3相关肽和A2结构域的去卷积质谱提供最具确定性的数据，因为在这些区中的翻译后修饰中不存在异质性，从而允许明确鉴别预期质量。
如果从加工过的异构体衍生，那么预期R1689裂解后从LC释放的6kDa N端肽包含a3酸性区(氨基酸E1649至R1689)，并且如果从单链异构体衍生，那么包含融合于a3酸性区的14个氨基酸的截短B结构域。发现rFVIIIFc与rBDD FVIII均含有a3区的两种形式，与基于SDS-PAGE分析的预期水平成比例。此外，两种蛋白质均含有对应于氨基酸D1658-R1689的a3区的截短形式，如对于其它FVIII产物所报道，不过发现其在rBDD FVIII中的丰度比在rFVIIIFc中高。
A2结构域含有三个潜在酪氨酸硫酸化位点，但没有可能导致复杂异质性的糖基化位点，并且因此可计算此区的确切质量。除rFVIIIFc的去卷积质谱中对应于S373至R740序列的质量的主要预期峰外(图2E)，还鉴别出对应于与在E720和Y729处截短的A2结构域相关的FVIII HC的已知截短的两种其它形式。在rBDD FVIII A2的去卷积质谱中也直接观察到所述报道的截短形式(图2E)。rFVIIIFc与rBDD FVIII A2均含有类似相对量的在Y729处截短的形式，而与rFVIIIFc中的相同形式相比，rBDD FVIII A2结构域含有显著较大量的在E720处截短的形式(图2E)。
通过利用赖氨酰基内肽酶(Lys-C)消化进行肽定位并随后进行UV和质谱检测确认rFVIIIFc的一级序列。在由rFVIIIFc产生的99种理论肽中，检测到81种，对应于总序列的98%。还通过此方法表征rFVIIIFc的翻译后修饰。FVIII含有6个潜在酪氨酸硫酸化位点，对应于位置346、718、719、723、1664和1680。当通过将总离子色谱图整合于质谱中进行评定时，发现对应于所述六个位点的完全硫酸化肽，同时存在痕量对应于位置1680的非硫酸化肽，并且没有可检测的对应于其它位置的非硫酸化肽。BDD FVIII还含有6个潜在N糖基化位点，其中四个已报道在重组FVIII产物中糖基化。与此一致，发现rFVIIIFc在相同的4个位点糖基化；发现N239和N2118含有高甘露糖结构，同时发现N41和N1810含有更复杂的碳水化合物，与在rBDD FVIII上发现的那些类似。通过LC/MS发现Fc区N连接型糖基化匹配利用凝血酶定位发现的G0、G1和G2异构体。已报道FVIII具有部分占据的Ser741和743上的O糖基化位点，并且在rFVIIIFc的情况下也发现此情况。
在未共转染加工酶的情况下产生的rFVIIIFc多肽显示15-25%单链FVIIIFc(SC FVIIIFc)，此与加工过的rFVIIIFc的不同之处在于R754与E755(相对于全长FVIII来说为R1648/E1649)之间的单一肽键。纯化此异构体并且在所有上述生物化学分析中表征，并且如下所示发现与rFVIIIFc相当。在显色测定中以及根据下文所述的各种功能测定，发现纯化的单链FVIIIFc的活性与rFVIIIFc类似。
通过显色和单级aPTT测定测量FVIII活性
通过FVIII显色测定测量FVIII活性。通过显色测定发现来自四个单独批次rFVIIIFc的平均比活性为9762±449IU/mg，对应于2148±99IU/nmol。通过aPTT测定发现来自十四个单独批次rFVIIIFc的平均比活性为8460±699IU/mg，并且通过显色测定发现为9348±1353IU/mg，分别对应于1861±154IU/nmol和2057±298IU/nmol。还通过显色测定测量单链FVIII:Fc的FVIII活性并且与完全加工的rFVIII:Fc或rFVIII:Fc DS(含有约25%单链rFVIII:Fc)进行比较。如表3A所示，根据显色测定，在存在和不存在冯·维勒布兰德因子(VWF)的情况下，单链rFVIIIFc显示FVIII活性与完全加工的FVIIIFc或rFVIIIFc DS的FVIII活性无显著差异。表3B示出如通过单级活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测定所测量，在不存在VWF的情况下观测到SCrFVIIIFc的完全活性。
表_3A_通过显色测定获得的FVIII活性
Figure BDA0000473150590000731
*CV=变异系数
表_3B_通过aPTT测定获得的FVIII活性
Figure BDA0000473150590000732
在单级凝结测定(APTT)中，当血浆具有正常VWF水平时，SCrFVIIIFc显示活性降低60%，表明VWF在活化SC rFVIIIFc中的潜在作用。此观测结果通过再向去除FVIII/VWF的血浆中添加人类VWF得到进一步证实(表3)，其中SC rFVIIIFc的凝血活性降至与先天FVIII缺乏血浆相同的程度。
Xase复合物中的活性
还通过在钙存在下在磷脂表面上培育活化的FIX和凝血酶活化的
Figure BDA0000473150590000742
或rFVIIIFc蛋白并且如通过显色或荧光底物的裂解(由其测定FXa产生速率)所测量监测FX向FXa的转化，在Xase复合物的情形下测量FVIII活性。接着通过改变所述测定的一种组分，同时使其它组分保持恒定，来对所述测定加以修改以便检查与各单个组分的相互作用。
对于rFVIIIFc DS、rBDD FVIII和单链rFVIIIFc(图3A)来说，FXa产生速率使用合成磷脂囊泡(25%磷脂酰丝氨酸/75%磷脂酰胆碱)测定为不同磷脂浓度的函数。发现两种蛋白质具有类似活性概况，其中峰值活性位于约156μM磷脂。
接着将FXa产生速率测定为不同FX浓度的函数，并且计算Km和Vmax值(图3B)。发现rFVIIIFc DS、rBDD FVIII和单链rFVIIIFc的活性概况类似，具有类似的Km和Vmax(表4)。最后，FXa产生速率测定为不同FIX浓度的函数(图3C)。活性概况看起来类似，具有类似的Kd和Vmax(表4)。使用血小板作为磷脂源获得类似结果(未公开数据，2009年6月)。
表4.磷脂上FVIII蛋白的FXa产生参数
Figure BDA0000473150590000751
表5.FIXa与FVIII蛋白的相互作用
通过APC的灭活
呈活性时，FVIII通过由活化的蛋白C(APC)裂解以及A2结构域解离而灭活。rFVIIIFc和rBDD FVIII均由凝血酶活化，接着与APC一起培育不同时间并且在FXa产生测定中测定活性(图4)。在不存在凝血酶活化的情况下，检测到极少FXa产生，并且其在凝血酶消化下显著增加。用APC处理90分钟导致FXa产生速率显著降低，与未活化样品类似，并且所述结果对于rFVIIIFc DS、rBDD FVIII和单链rFVIIIFc来说为类似的。
对vWF的亲和力
通过实时生物分子相互作用分析(BIAcore)基于表面等离子体共振(SPR)技术测量FVIII与冯·维勒布兰德因子(vWF)的相互作用，以测定rFVIIIFc和rBDD FVIII对vWF的结合的动力学(表6)。在相同条件下测定各FVIII相互作用的动力学速率参数Ka(结合速率)和Kd(解离速率)以及亲和力KD(Kd/Ka)。发现rFVIIIFc和rBDD FVIII均对vWF具有低nM结合亲和力(KD)，分别为1.64±0.37nM和0.846±0.181nM。所述蛋白质具有类似解离速率，其中结合速率的两倍差异导致亲和力的两倍差异。
表6.FVIII蛋白对vWF的Biocore结合分析
Figure BDA0000473150590000761
如表6中所示，发现rFVIII:Fc DS或单链rFVIIIFc与vWF的亲和力处于低nM范围，约为仅BDD FVIII的亲和力的两倍大。在生理浓度下，这将导致与vWF复合的rFVIIIFc(加工过的或单链)的百分比与游离FVIII相比稍微降低，然而体内研究表明，尽管存在此稍微较低的亲和力，但rFVIIIFc的半衰期比全长或BDD FVIII显著延长，并且因此其似乎并不有损分子的半衰期。游离rFVIIIFc有可能更有效地通过FcRn途径再循环，并且因此其可有助于半衰期更加延长。
对vWF的亲和力和凝血酶介导的从vWF的释放
在HEK293细胞中表达重组B结构域缺失的因子VIIIFc(rFVIIIFc)。在HEK293细胞中的生物合成期间，通过限制蛋白水解加工大部分rFVIIIFc来生成FVIII重链(HC)和Fc部分所连接的FVIII轻链(LC)。认为HC和LC在血浆中以及在FVIII药品储存期间的自发性解离造成FVIII活性降低。未加工的生物合成rFVIIIFc的剩余部分形成rFVIIIFc的单链异构体(SC rFVIIIFc)，其可提供与加工过的rFVIIIFc相比增强的可制造性和稳定性。
此实施例描述比较SC rFVIIIFc与冯·维勒布兰德因子(vWF)的相互作用相对于rFVIIIFc与vWF的相互作用的测定。通过实时生物分子相互作用分析(BIAcore)基于表面等离子体共振(SPR)技术测量与vWF的相互作用，以测定rFVIIIFc和SC rFVIIIFc对vWF的结合的动力学(表11和图16A)。通过氨偶合将不含FVIII的人类血浆来源vWF以足够低以防止质量转运限制的水平固定于生物传感器表面上。rFVIIIFc和SC rFVIIIFc依序以0.13nM至5.0nM范围内的浓度以单循环动力学模式注射。将传感器图数据拟合至1:1相互作用模型。
在相同条件下测定各FVIII相互作用的动力学速率参数Ka(结合速率)和Kd(解离速率)以及亲和力KD(Kd/Ka)。发现rFVIIIFc和SCrFVIIIFc均对vWF具有低nM结合亲和力(KD)，分别为0.34±0.1nM和0.31±0.1nM。两种异构体还具有类似的结合速率和解离速率。
表11.FVIII蛋白对vWF的Biocore结合分析
Figure BDA0000473150590000771
接着，在25℃和37℃下测量rFVIIIFc、SC rFVIIIFc和缺乏Fc部分的B结构域缺失的FVIII(rBDD FVIII)的凝血酶介导的释放。通过氨偶合将人类vWF以类似含量固定于生物传感器表面上的三个流量槽上。剩余流量槽用作空白用于参考目的。rFVIIIFc和SC rFVIIIFc蛋白由vWF捕捉并且允许缓慢解离，并且调整rFVIIIFc和SCrFVIIIFc的浓度以在解离相结束时获得等摩尔捕捉水平。通过2倍连续稀释制备人类α-凝血酶溶液并且以0.005U/mL至20U/mL范围内的浓度应用，从而使FVIIIa物质从vWF蛋白水解释放。使用基于SPR的光学生物传感器实时监测凝血酶介导的活化rFVIIIFc、SC rFVIIIFc和rBDD FVIII从vWF的释放(图16B)。扣除空白参考(图16C)后，确定作为α-凝血酶浓度的函数的释放速率(图16D)。在25℃下，SCrFVIIIFc的凝血酶半最大有效浓度(EC50)为12±1U/mL，相比之下rFVIIIFc为3.9±0.3U/mL，并且在37℃下，SC rFVIIIFc的凝血酶半最大有效浓度(EC50)为15±1U/mL，相比之下rFVIIIFc为4.8±0.2U/mL(图16E)。rFVIIIFc具有与rBDD FVIII类似的凝血酶EC50值，在25℃下，所具有的值分别为3.9±0.3U/mL和3.3±0.3U/mL，并且在37℃下，所具有的值分别为4.8±0.2U/mL和4.0±0.2U/mL。SCrFVIIIFc具有约为rFVIIIFc的3倍高的凝血酶EC50值。凝血酶介导的从vWF的释放的此降低可为存在vWF的aPTT测定中所观察到的SC rFVIIIFc的比活性特异性降低的基础(表3B)。
实施例3
设计I/IIa期开放标记交叉剂量递增多中心首次人类(first-in-human)研究来评估单次剂量rFVIIIFc在患有重度(定义为<1IU/dL[1%]内源性因子VIII[FVIII])血友病A的受试者中的安全性、耐受性和药物代谢动力学。总共约12名先前接受治疗的患者入选并且给予25IU/kg或65IU/kg的rFVIIIFc。筛选(安排在第一剂量参考比较药剂
Figure BDA0000473150590000781
[rFVIII]之前28天内)以及第一次注射前无FVIII治疗情况下经过最少4天(96小时)后，约6名受试者接受单次25IU/kg剂量的
Figure BDA0000473150590000782
接着为3天(72小时)药物代谢动力学(PK)概况，随后交叉并且接受25IU/kg单次开放标记剂量的rFVIIIFc用于7天(168小时)PK概况研究。对前3名受试者依序给药。对给予25IU/kgrFVIIIFc的前三名(3)受试者，各受试者在注射rFVIIIFc后14天(336小时)进行抑制剂评定。一旦完成抑制剂测试，即进行下一个受试者的给药(仅对于前三名受试者)。第3名受试者完成14天抑制剂评定后，25IU/kg的剩余三名受试者和65IU/kg的六名受试者在各剂量组内依序间隔至少1天开始参与。
最后一名受试者接受25IU/kg剂量的rFVIIIFc一周后，招募约6名独特受试者作为65IU/kg组。65IU/kg组中的各受试者接受单次65IU/kg剂量的
Figure BDA0000473150590000791
接着为4天(96小时)PK概况研究，随后交叉并且接受65IU/kg单次开放标记剂量的rFVIIIFc用于10天(240小时)概况研究。如果在任何组中在第一次注射rFVIIIFc前发生出血事件，那么使用受试者的先前研究FVIII产物进行治疗并且在接受第一次rFVIIIFc注射用于PK概况前必须经过至少4天的间隔。
所有受试者接着在施用用于安全性的rFVIIIFc25IU/kg或65IU/kg后经历14天(336小时)和28天安全性评估期。所有受试者在给药前后在指定时间点随同用于分析FVIII活性的血液样品进行药物代谢动力学取样。
I/IIa期临床试验的药物代谢动力学数据对于FVIIIFc显示以下结果。相比于
Figure BDA0000473150590000792
(全长rFVIII)，FVIIIFc的全身性暴露(AUCINF)增加约50%，清除率(Cl)降低约50%，并且终末半衰期和MRT增加约50-70%。此外，FVIIIFc显示与
Figure BDA0000473150590000793
相比，C168、TBLP1、TBLP3和TBLP5值增加。
Figure BDA0000473150590000794
Figure BDA0000473150590000801
实施例4
产生重组B结构域缺失的因子VIII-Fc(rFVIIIFc)融合蛋白作为延长FVIII的半衰期的方法。在血友病A小鼠中比较rFVIIIFc与rFVIII的药物代谢动力学(PK)。我们发现rFVIIIFc的终末半衰期为rFVIII的两倍长。为证实半衰期延长的潜在机制是由于rFVIIIFc受到FcRn保护，在FcRn基因敲除和人类FcRn转基因小鼠中评估PK。施用单次静脉内剂量(125IU/kg)并且使用显色活性测定测量血浆浓度。在两种小鼠品系中Cmax在rFVIIIFc与
Figure BDA0000473150590000802
之间类似。然而，虽然在FcRn基因敲除的小鼠中rFVIIIFc的半衰期与rFVIII相当，但在hFcRn转基因小鼠中rFVIIIFc的半衰期延长至rFVIII半衰期的约两倍长。所述结果证实FcRn介导或负责使rFVIIIFc的半衰期相比于rFVIII延长。因为在血友病小鼠的出血模型中以及在临床应用中已显示通过旋转血栓弹性描计法测量的全血中的凝血与凝血因子的功效有关，因此我们寻求在血友病A小鼠中使用
Figure BDA0000473150590000804
评估rFVIIIFc的离体功效。向血友病A小鼠施用单次静脉内剂量的50IU/kg rFVIIIFc、
Figure BDA0000473150590000805
或
Figure BDA0000473150590000806
给药后5分钟时，凝块形成的凝结时间(CT)、凝块形成时间(CFT)和α角类似。然而，与
Figure BDA0000473150590000807
和
Figure BDA0000473150590000808
相比，rFVIIIFc显示在给药后72和96小时时CT显著改善，并且CFT和α角在96小时时也改善，这与rFVIIIFc的PK延长一致。因此，构建FVIII的Fc融合体产生具有确定作用机制的分子，其具有增加的半衰期以及提供延长的出血保护的潜能。
实施例5
本实施例呈示来自用25IU/kg和65IU/kg FVIII产品治疗的16名患者的最终FVIII活性分析结果。参见实施例3。
在本实施例中，rFVIIIFc为由单个分子的重组B结构域缺失的人类FVIII(BDD-rFVIII)融合于人类IgG1的二聚Fc结构域构成而无插入接头序列的重组融合蛋白。此蛋白质构建体在本文中又称为rFVIIIFc异二聚杂合蛋白、FVIIIFc单体Fc融合蛋白、FVIIIFc单体杂合体、单体FVIIIFc杂合体以及FVIIIFc单体-二聚体。参见实施例1、图1和表2A。
利用rFVIIIFc进行的临床前研究显示rFVIII活性的半衰期与可商购获得的rFVIII产品相比延长约2倍。此研究的基本原理为评估冷冻液体制剂中单次剂量的rFVIIIFc的安全性和耐受性，并且提供重度血友病A受试者中PK的数据。对于此研究，可获得16名可评估受试者用于PK评估。每公斤体重25IU(n=6)和65IU(n=10)标称剂量的rFVIIIFc与
Figure BDA0000473150590000811
的两次剂量的单次施用是历经约10分钟静脉内输注的。在输注前以及直至给药后10天获得用于血浆PK评定的血液样品。在此研究中使用依赖于模型的方法表征
Figure BDA0000473150590000812
与rFVIIIFc的FVIII活性的PK。
目标
此研究的主要目标为评定在先前治疗的12岁患者(PTP)和患有重度血友病A的上述患者中单次施用两次剂量的rFVIIIFc(25IU/kg和65IU/kg)的安全性和耐受性。
第二目标为确定在单级凝结和显色测定中，由与相比在单次施用25IU/kg或65IU/kg rFVIIIFc后，FVIII随时间的药效学(PD)活性确定的药物代谢动力学(PK)参数。
研究设计(参见实施例3)
在筛选访问(在给予
Figure BDA0000473150590000821
前28天以内)；第0天(注射
Figure BDA0000473150590000822
)，注射前以及注射后10和30分钟以及1、3、6和9小时；第1天，注射
Figure BDA0000473150590000823
后24小时；第2天，注射
Figure BDA0000473150590000824
后48小时；第3天，注射后72小时；以及第4天，注射高剂量
Figure BDA0000473150590000826
(仅组B)后96小时，收集用于FVIII活性PK评估的血液样品。
在rFVIIIFc注射日，恰在施用rFVIIIFc之前、注射rFVIIIFc后10和30分钟以及1、3、6和9小时；第1天，注射rFVIIIFc后24小时；第2至5天，注射rFVIIIFc后48、72、96和120小时；第7天，注射rFVIIIFc后168小时；第8、9和10天，注射高剂量rFVIIIFc(仅组B)后192、216和240小时，收集用于FVIII活性PK评估的血液样品。还在最终研究访问(注射rFVIIIFc后28天)，注射rFVIIIFc后672小时时测量FVIII活性。
药物代谢动力学模型化和计算
缩写
TBLP1=给药后当FVIII活性降至高于基线约1IU/dL时的模型预测时间。
TBLP3=给药后当FVIII活性降至高于基线约3IU/dL时的模型预测时间
KV_M=Cmax_M/实际剂量(IU/kg)
KV_OB=Cmax_OB/实际剂量(IU/kg)
IVR_M=100×Cmax_M×血浆体积(dL)/总剂量(IU)；其中血浆体积(mL)=(23.7×Ht(cm))+(9.0×Wt(kg))–1709。
IVR_OB=100×Cmax_OB×血浆体积(dL)/总剂量(IU)；其中血浆体积(mL)=(23.7×Ht(cm))+(9.0×Wt(kg))–1709。
结果
单剂量药物代谢动力学(单级测定)
观测到的FVIII活性在短期静脉内输注
Figure BDA0000473150590000831
或rFVIIIFc后急剧增加，其中分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测Cmax值对于
Figure BDA0000473150590000832
来说为56.6±4.74IU/dL和121±28.2IU/dL，并且对于rFVIIIFc来说为55.6±8.18IU/dL和108±16.9IU/dL。所有用
Figure BDA0000473150590000833
和rFVIIIFc治疗的患者的FVIII活性均具有剂量相关性增加。观测到的Cmax与AUCINF的增加在比例上均与所评估剂量范围内的剂量相比稍低。
在输注结束时，观测到的FVIII活性的下降显示单指数衰减特征，直到达到基线水平。rFVIIIFc的FVIII活性降低的速率低于
Figure BDA0000473150590000834
其中分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测消除半衰期值对于
Figure BDA0000473150590000835
来说为11.9±2.98小时和10.4±3.03小时，并且对于rFVIIIFc来说为18.0±3.88小时和18.4±6.99小时。消除半衰期值在对于两种FVIII产品所评估的剂量范围内似乎与剂量无关。
在25IU/kg和65IU/kg剂量水平下，rFVIIIFc施用后的总全身性FVIII暴露量(通过AUCINF所评定)分别比
Figure BDA0000473150590000836
高约48%和61%。分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测AUCINF值对于
Figure BDA0000473150590000837
来说为974±259hr*IU/dL和1810±606hr*IU/dL，并且对于rFVIIIFc来说为1440±316hr*IU/dL和2910±1320hr*IU/dL。
类似于消除半衰期，rFVIIIFc的MRT相对于延长。分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测MRT值对于
Figure BDA0000473150590000841
来说为17.1±4.29小时和14.9±4.38小时，并且对于rFVIIIFc来说为25.9±5.60小时和26.5±10.1小时。MRT值在对于两种FVIII产品所评估的剂量范围内似乎与剂量无关。
此外，测定CL和V的主要PK参数值。在相等剂量下，rFVIIIFc的CL值仅占对于
Figure BDA0000473150590000842
所观测到的CL值的约66%。分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测CL值对于
Figure BDA0000473150590000843
来说为2.70±0.729mL/hr/kg和4.08±1.69mL/hr/kg，并且对于rFVIIIFc来说为1.80±0.409mL/hr/kg和2.69±1.25mL/hr/kg。V值在
Figure BDA0000473150590000844
与rFVIIIFc之间相当，其中分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测V值对于来说为43.9±4.27mL/kg和56.1±13.4mL/kg，并且对于rFVIIIFc来说为45.3±7.23mL/kg和61.6±10.6mL/kg。随
Figure BDA0000473150590000846
和rFVIIIFc的剂量增加注意到平均CL和V值的稍微增加；然而，在65IU/kg剂量下与有限剂量水平偶联的标准偏差增加干扰对所述参数的剂量依赖性的评定。举例来说，rFVIIIFc治疗组的CV%几何平均CL值从23.0%(25IU/kg)增加至48.6%(65IU/kg)。
除主要PK参数外，还测定次级PK参数(例如K值、IVR等)以评估FVIII作用持续时间。在rFVIIIFc的情况下还观测到PK差异的证据，表明在相等剂量下与相比，TBLP1和TBLP3值增加。
Figure BDA0000473150590000848
与rFVIIIFc的IVR和K值似乎相当。随
Figure BDA0000473150590000849
和rFVIIIFc的剂量增加观测到TBLP1和TBLP3值稍微增加。相反，随
Figure BDA00004731505900008410
和rFVIIIFc的剂量增加注意到平均IVR和K值稍微降低。如先前所指示，所述参数的剂量依赖性的评定受到有限剂量水平干扰。
分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)所观测TBLP1对于
Figure BDA00004731505900008411
来说为每IU/kg2.88±0.733IU/dL和2.93±0.848IU/dL，并且对于rFVIIIFc来说为每IU/kg4.28±0.873IU/dL和5.16±2.02IU/dL。分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)所观测TBLP3对于
Figure BDA0000473150590000851
来说为每IU/kg2.06±0.527IU/dL和2.26±0.666IU/dL，并且对于rFVIIIFc来说为每IU/kg3.09±0.623IU/dL和3.93±1.59IU/dL。
使用观测到的Cmax值(扣除基线和模型内的残余药物)计算的平均IVR和K值通常大于使用模型预测Cmax值测定的值；与使用一室模型会稍微低估观测到的峰值活性一致。分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)所观测K值对于
Figure BDA0000473150590000852
来说为每IU/kg2.57±0.198IU/dL和2.13±0.598IU/dL，并且对于rFVIIIFc来说为每IU/kg2.46±0.330IU/dL和1.85±0.332IU/dL。分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)所观测IVR值对于
Figure BDA0000473150590000853
来说为94.1±15.6%和85.8±16.5%，并且对于rFVIIIFc来说为89.5±11.9%和74.8±6.72%。
单剂量药物代谢动力学(显色测定)
观测到的FVIII活性在短期静脉内输注
Figure BDA0000473150590000854
或rFVIIIFc后急剧增加，其中分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测Cmax值对于
Figure BDA0000473150590000855
来说为70.2±9.60IU/dL和157±38.6IU/dL，并且对于rFVIIIFc来说为70.3±10.0IU/dL和158±34.7IU/dL。
所有用和rFVIIIFc治疗的患者的FVIII活性均具有剂量相关性增加。观测到的Cmax与AUCINF的增加在比例上均与所评估剂量范围内的剂量相比稍低。
在输注结束时，观测到的FVIII活性的下降显示单指数衰减特征，直到达到基线水平。rFVIIIFc的FVIII活性下降的速率低于
Figure BDA0000473150590000857
其中分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测消除半衰期值对于
Figure BDA0000473150590000858
来说为10.7±1.98小时和10.3±3.27小时，并且对于rFVIIIFc来说为16.2±2.92小时和19.0±7.94小时。消除半衰期值在对于两种FVIII产品所评估的剂量范围内似乎与剂量无关。
在25IU/kg和65IU/kg剂量水平下，rFVIIIFc施用后的总全身性FVIII暴露量(通过AUCINF所评定)分别比
Figure BDA0000473150590000861
高约53%和84%。分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测AUCINF值对于
Figure BDA0000473150590000862
来说为1080±236hr*IU/dL和2320±784hr*IU/dL，并且对于rFVIIIFc来说为1650±408hr*IU/dL和4280±1860hr*IU/dL。
类似于消除半衰期，rFVIIIFc的MRT相对于
Figure BDA0000473150590000863
延长。分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测MRT值对于
Figure BDA0000473150590000864
来说为15.3±2.86小时和14.8±4.72小时，并且对于rFVIIIFc来说为23.4±4.22小时和27.3±11.4小时。MRT值在对于两种FVIII产品所评估的剂量范围内似乎与剂量无关。
此外，测定CL和V的主要PK参数值。在相等剂量下，rFVIIIFc的CL值仅占对于
Figure BDA0000473150590000865
所观测到的CL值的约58-66%。分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测CL值对于
Figure BDA0000473150590000866
来说为2.39±0.527mL/hr/kg和3.21±1.40mL/hr/kg，并且对于rFVIIIFc来说为1.57±0.349mL/hr/kg和1.86±0.970mL/hr/kg。V值在
Figure BDA0000473150590000867
与rFVIIIFc之间相当，其中分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)模型预测V值对于
Figure BDA0000473150590000868
来说为35.8±5.52mL/kg和43.6±11.2mL/kg，并且对于rFVIIIFc来说为35.9±6.65mL/kg和42.7±8.91mL/kg。随
Figure BDA0000473150590000869
和rFVIIIFc的剂量增加，注意到平均CL和V值的增加；然而，在65IU/kg下与有限剂量水平偶联的标准偏差增加干扰对所述参数的剂量依赖性的评定。
除主要PK参数外，还测定次级PK参数(例如K值、IVR等)以评估FVIII作用持续时间。在rFVIIIFc的情况下还观测到PK差异的证据，表明在相等剂量下与
Figure BDA00004731505900008610
相比，TBLP1和TBLP3值增加。
Figure BDA00004731505900008611
与rFVIIIFc的IVR和K值似乎相当。
随和rFVIIIFc的剂量增加，观测到TBLP1和TBLP3值稍微增加。相反，随和rFVIIIFc的剂量增加，注意到平均IVR和K值稍微降低。如先前所指示，所述参数的剂量依赖性的评定受到有限剂量水平干扰。
分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)所观测TBLP1对于
Figure BDA0000473150590000873
来说为每IU/kg2.70±0.511IU/dL和3.09±0.978IU/dL，并且对于rFVIIIFc来说为每IU/kg4.06±0.798IU/dL和5.66±2.38IU/dL。分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)所观测TBLP3对于
Figure BDA0000473150590000874
来说为每IU/kg1.98±0.377IU/dL和2.39±0.718IU/dL，并且对于rFVIIIFc来说为每IU/kg3.04±0.598IU/dL和4.44±1.84IU/dL。
使用观测到的Cmax值(扣除基线和模型内的残余药物)计算的平均IVR和K值通常大于使用模型预测Cmax值测定的值；与使用一室模型会稍微低估观测到的峰值活性一致。分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)所观测K值对于
Figure BDA0000473150590000875
来说为每IU/kg3.08±0.429IU/dL和2.85±0.721IU/dL，并且对于rFVIIIFc来说为每IU/kg3.12±0.451IU/dL和2.92±0.985IU/dL。分别对于25IU/kg和65IU/kg剂量组，平均(±SD)所观测IVR值对于
Figure BDA0000473150590000876
来说为112±14.5%和116±26.9%，并且对于rFVIIIFc来说为113±16.3%和117±33.6%。
结论
所有
Figure BDA0000473150590000877
和rFVIIIFc治疗的患者在所评估的剂量范围内均具有相当的剂量相关性Cmax和AUCINF增加。在输注结束后第一小时内观测到和rFVIIIFc活性的峰值血浆水平，并且在给药后若干天保持可检测。在输注结束后，基线校正的FVIII活性的下降显示单指数衰减直到达到两种产品的基线。消除半衰期和MRT的参数值在对于两种FVIII产品所评估的剂量范围内似乎与剂量无关。随
Figure BDA0000473150590000881
和rFVIIIFc的剂量增加，注意到平均CL和V值的稍微增加；然而，在65IU/kg下与有限剂量水平偶联的受试者间可变性增加干扰对所述参数的剂量依赖性的评定。
rFVIIIFc与
Figure BDA0000473150590000882
活性PK的比较揭示在相当的剂量下，rFVIIIFc与
Figure BDA0000473150590000883
相比，全身性暴露量增加约48-61%(单级测定)或53-84%(显色测定)，清除率降低约30-40%，并且消除半衰期和MRT均增加约50-80%。在rFVIIIFc的情况下也观测到PK差异的证据，表明在相等剂量下与
Figure BDA0000473150590000884
相比，TBLP1和TBLP3值增加。
Figure BDA0000473150590000885
与rFVIIIFc的IVR和K值似乎相当。
由显色测定结果获得的PK参数通常与由单级测定获得的那些一致，显色测定得到的暴露量参数(例如Cmax、AUCINF等)的较高估算除外。
鉴于观测到PK的改善，因此rFVIIIFc可提供延长的出血保护，从而允许对于患有血友病A的个体给予较低频率的注射。
实施例6
基于由rFVIII:Fc的首次人类研究(实施例3)获得的临时PK分析，设计A-LONG研究。A-LONG为重组因子VIII Fc融合体(FVIII:Fc)在先前治疗的患有重度血友病A(定义为<1IU/dL[<1%]内源性FVIII)的受试者中预防和治疗出血的安全性、药物代谢动力学和功效的开放标记多中心评估。
约106名受试者将入选三种方案之一：定制预防方案(小组1)、每周给药方案(小组2)和按需方案(小组3)。
小组1：定制预防方案
小组1将包括整个群组和PK子群。约66名受试者将入选。最初的方案为每周两次，在第一天25IU/kg，接着在所述周的第四天50IU/kg。受试者将在此每周预防方案中施用rFVIIIFc直到获得rFVIIIFc的PK结果。基于所述结果，将对各受试者建立定制预防方案，其中将确定剂量和间隔以维持1-3%FVIII活性的谷水平。各受试者接着将在整个研究中施用其单个定制的预防方案。
将在整个研究中监测受试者并且进行不间断的剂量和间隔调整。仅在受试者经历不可接受的出血事件(定义为在连续两个月的时间内≥2次自发性出血事件)时进行调整。在此情况下，调整的目标为3-5%的谷水平。
小组2：每周给药方案
约20名受试者将入选/随机化并且如下进行简短rFVIIIFc PK概况分析：洗脱(Washout)至少96小时；单次剂量的rFVIIIFc65IU/kg；在rFVIIIFc第0天开始简短取样，包括注射前以及注射开始后10(±2)分钟、3小时(±15分钟)、72(±2)小时[第3天]和96(±2)小时[第4天]。简短PK概况分析后，受试者接着将每隔7天施用固定剂量的65IU/kgrFVIIIFc至少持续28周并且达52周。
小组3：按需方案
在研究中将评估至少5名受试者中的最少10次大手术。大手术定义为涉及全身麻醉和/或呼吸辅助的任何手术工序(选择性或紧急性)，其中穿透并且暴露主要体腔，或身体或生理功能受到实质性损害(例如剖腹术、开胸术、开颅术、关节置换和截肢)。
对于手术期间的预防，受试者将每12小时至24小时用20IU/kg至50IU/kg rFVIIIFc治疗。手术前，医师将审查受试者的rFVIIIFc PK概况并且评定所述类型的计划手术通常需要的因子VIII替代的剂量方案和受试者的临床状态。手术治疗期(包括任何康复时间)中rFVIIIFc适当给药的推荐将考虑这些因素。
所述研究的主要目标为(a)评估作为预防、按需和手术治疗方案施用的rFVIIIFc的安全性和耐受性；以及(b)评估作为预防、按需和手术治疗方案施用的rFVIIIFc的功效。所述研究的次级目标为(a)表征rFVIIIFc的PK概况并且将rFVIIIFc的PK与当前市售产品
Figure BDA0000473150590000901
进行比较；(b)评估与FVIIIFc的单个反应；以及(c)评估FVIIIFc消耗。
主要目标
●评估作为预防、每周、按需和手术治疗方案施用的rFVIIIFc的安全性和耐受性
●评估作为定制预防、按需和手术治疗方案施用的rFVIIIFc的功效
次级目标
●表征rFVIIIFc的PK概况并且将rFVIIIFc的PK概况与当前市售产品
Figure BDA0000473150590000902
进行比较
●评估与rFVIIIFc的单个反应
●表征在预防方案中充分预防出血；在手术环境中维持止血；或在按需、每周治疗或预防环境中治疗出血事件所需要的剂量范围和时程
●评估rFVIIIFc消耗(例如每名受试者每年总rFVIIIFc消耗)
实施例7
临床
Figure BDA0000473150590000903
评定
在实施例7中的研究中，除通过单级活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测定测量血浆FVIII活性外，还利用全血旋转血栓弹性描计法
Figure BDA0000473150590000904
来在2名受试者中(特定来说，1名在低剂量组中并且1名在高剂量组中)通过rFVIIIFc和
Figure BDA0000473150590000905
评定全面止血的改善。
rFVIIIFc和
Figure BDA0000473150590000911
当在rFVIIIFc治疗前添加至受试者的血液中时在凝块形成方面似乎具有类似活性。凝结时间(CT)关于rFVIIIFc和
Figure BDA0000473150590000912
的剂量在正常值的100%的约1%范围内呈线性，并且剂量反应在同一受试者中在rFVIIIFc与
Figure BDA0000473150590000913
之间相当。
给予
Figure BDA0000473150590000914
并且随后给予rFVIIIFc后，在不同时间点对柠檬酸化全血进行取样，并且通过
Figure BDA0000473150590000915
监测再钙化后的凝块形成。尽管在给予
Figure BDA0000473150590000916
或rFVIIIFc前由于残余FVIII水平而具有可变基线CT，但两种产品均在注射后30分钟在相当的水平上有效校正CT。此外，在注射25IU/kg rFVIIIFc后3小时时以及之后，相对于
Figure BDA0000473150590000917
在以此低剂量给药的受试者中CT的改善得到更佳的维持。然而，rFVIIIFc与
Figure BDA0000473150590000918
的改善差异在65IU/kg剂量下明显程度低得多。
实施例8
使用HemA小鼠进行尾夹研究。首先麻醉小鼠并且接着注射4.6μg/kg、1.38μg/kg或0.46μg/kg的加工过的rFVIIIFc(药物物质，其含有约75%-85%加工过的rFVIIIFc)和纯化的单链rFVIIIFc。注射后，将尾从尖端切断并且即刻放置在管中以收集血液。测量加工过的FVIIIFc(药物物质)和单链FVIIIFc的存活保护百分比，如表7和图7中所示。
表7.rFVIII:Fc DS和单链rFVIIIFc的体内功效
Figure BDA0000473150590000919
如表7和图7中所示，单链rFVIIIFc的存活保护与加工过的rFVIIIFc(DS)相当。
通过体外ROTEM测定凝结活性
进一步以全血旋转血栓弹性描计法(ROTEM)在一定浓度范围研究rFVIIIFc的凝结效能，并且与rBDD FVIII(Xyntha)和重组全长FVIII(rflFVIII；Advate)进行比较。对于体外ROTEM，将rFVIII蛋白以三份重复添加至从5-6只雄性HemA小鼠的腔静脉收集的柠檬酸化汇集血液中至最终浓度为正常血浆FVIII水平的0、0.1%、1%、10%和100%。通过添加CaCl2(NATEM)起始凝块并且在ROTEM系统(Pentapharm GmbH,Munich,Germany)上记录凝结时间(CT)、凝块形成时间(CFT)、α角和最大凝块坚实度(MCF)。以正常FVIII水平的0.1-100%的递增剂量添加至HemA小鼠血液中的三种蛋白质的凝结时间(CT)、凝块形成时间(CFT)和α角在图14中示出。在正常值的0.1%至100%的宽范围中，CT和CFT在rFVIIIFc、rBDD FVIII和rflFVIII之间相当。α角仅在10%的rFVIIIFc与rBDD FVIII之间显著不同(p<0.05)。
通过离体ROTEM测定凝结活性
在单次静脉内注射至血友病A小鼠中后，将通过ROTEM测量的rFVIIIFc的药效学与rBDD FVIII和rflFVIII进行比较。对于离体ROTEM，向雄性HemA小鼠静脉内注射单次剂量的50IU/kgrFVIIIFc、
Figure BDA0000473150590000921
或
Figure BDA0000473150590000922
并且在各时间点(给药后5分钟、24、48、72和96小时)处死5只小鼠。即刻在ROTEM系统上通过NATEM分析从腔静脉收集的单个柠檬酸化全血并且如上所述测量参数。测定给药后5分钟至96小时获取的样品的CT、CFT和α角，并且在图15中示出。5分钟时，全部的有效性相当，得到类似的CT、CFT和α角(图15A至图15C)。然而，相对于rBDD FVIII和rflFVIII，rFVIIIFc显示显著改善(p<0.05)72和96小时时的CT以及96小时时的CFT和α角(图15A至图15C)。
实施例9
重组因子VIIIFc(rFVIIIFc)由遗传融合于人类免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc结构域的B结构域缺失的(BDD)rFVIII蛋白构成。在从HEK293细胞分泌前，大部分rFVIIIFc加工成FVIII重链(HC)和轻链(LC+Fc)。在循环中，rFVIIIFc与冯·维勒布兰德因子(VWF)复合并且在活化后以不可与天然FVIII区分的方式释放。认为HC和LC的自发性解离造成FVIII活性在血浆中和在FVIII药品储存期间降低。此处我们描述rFVIIIFc的单链未加工异构体(SC rFVIIIFc)，其可提供与天然FVIII相比优良的可制造性和增强的稳定性。
从含有一部分未加工异构体的rFVIIIFc中纯化SC rFVIIIFc。与rFVIIIFc相比，SC rFVIIIFc显示相等显色活性，但在单级(aPTT)测定中活性降低约60%(表3A至表3B)。使用校准的自动化凝血酶曲线(calibrated automated thrombogram)(来自
Figure BDA0000473150590000931
)进行凝血酶产生测定(TGA)。在凝血酶产生测定(TGA)中，SC rFVIIIFc还显示与rFVIIIFc相比降低的凝血酶潜能(图13A)和峰值凝血酶(图13B)。然而，如表3B中所示，在不存在vWF的情况下通过aPTT观测到SC rFVIIIFc的完全活性，表明从vWF的释放可由于在SC rFVIIIFc中的Arg1680裂解后a3酸性区共价连接至HC而延迟，相比之下a3从完全加工的FVIII的释放和解离。从vWF的解离延迟可解释在aPTT测定和TGA中观测到的活性降低，而在两级显色测定中观测到完全活性。在vWF存在下活化速率降低在利用限制凝血酶作为FVIII活化剂的经过修改的显色底物测定中证实。
在HemA小鼠尾静脉横断(TVT)模型中评定SC rFVIIIFc的体内功能。在TVT前48小时将HemA雄性小鼠用指定剂量的rFVIIIFc药品或SC rFVIIIFc处理。TVT后每小时监测尾再出血和存活直到12小时，其中最后一次观测在TVT后24小时进行。当在输注后48小时进行TVT时，SC rFVIIIFc与rFVIIIFc在此模型中显示相等的体内功效，其中ED50分别为1.17μg/kg和1.23μg/kg(图7(A))。对于各测试剂量水平下的SC rFVIIIFc和rFVIIIFc，在HemA小鼠中观测到相当的TVT后24小时存活曲线(p≥0.65)(图7(B))和再出血速率(图7(C))，表明SC rFVIIIFc尽管具有较低表观aPTT活性，但其与rFVIIIFc同样有效。因此在vWF存在下SC rFVIIIFc的体外活化延迟似乎对其体内功效并无显著影响。因此，SC rFVIIIFc代表一种具有潜在临床应用的rFVIIIFc的新型并且有效的异构体。将需要其它研究来证明在此Fc融合蛋白的情形下产品的稳定性增强。
实施例10
现有因子VIII(FVIII)产品显示约8-12小时的半衰期(t1/2)，从而需要频繁静脉内注射以便预防和治疗血友病A患者。rFVIIIFc为由单个FVIII分子共价连接至用于延长循环rFVIII半衰期的人类IgG1的Fc结构域构成的重组融合蛋白。在患有重度血友病A的先前经过治疗的雄性受试者中进行的此首次人类研究对rFVIIIFc的安全性和药物代谢动力学进行研究。十六名受试者接受单次剂量的25IU/kg或65IU/kg的
Figure BDA0000473150590000941
接着接受相等剂量的rFVIIIFc。大部分不良事件与研究药物无关。没有研究受试者发展出抗FVIIIFc抗体或抑制剂。在整个剂量水平内，与
Figure BDA0000473150590000942
相比，rFVIIIFc显示出1.54至1.71倍长的消除t1/2和平均滞留时间、1.49至1.56倍低的清除率和1.48至1.56倍高的总全身性暴露量。
Figure BDA0000473150590000943
与rFVIIIFc具有相当的剂量依赖性峰值血浆浓度和回收率。在整个剂量水平内达到FVIII活性比基线高1%的时间为
Figure BDA0000473150590000944
的约1.53至1.68倍长。因此，rFVIIIFc可提供切实可行的在患有血友病A的患者中获得延长的止血保护作用并且给药频率较低的治疗方法。
血友病A为导致关节和软组织中频繁自发性和创伤性出血的遗传性出血病症。Mannucci PM,Tuddenham EGD,N Engl J Med,344:1773-1779(2001)。当治疗不充分时，此出血导致慢性关节病变、残疾以及增加的死亡风险。Soucie JM等,Blood.96(2):437-442(2000)。
利用血浆来源的FVIII(pdFVIII)和重组人类FVIII(rFVIII)产品来治疗(按需疗法)和预防(预防疗法)出血事件。开发rFVIII以降低血浆产品受HIV和肝炎病毒广泛污染后血源性病原体传播的风险，以及确保FVIII产品的充分供应。然而，利用当前FVIII产品获得的止血保护因约8-12小时的短半衰期(t1/2)而在时间上受到限制，对于大部分患者来说需要每周三次或每隔一天一次预防性注射，以维持FVIII水平高于1%，已确定所述水平对大部分自发性出血事件具有保护性。Manco-Johnson等,New Engl J Med.357(6):535-44(2007)。
许多研究显示，即使在高剂量下，按需疗法在预防关节病变方面也无效。Aledort L.等,J Intern Med.236:391-399(1994)；Petrini P.等,Am J Pediatr Hematol Oncol.13:280-287(1991)。在众多临床研究中4, 6-15和Manco-Johnson等,同上已证明预防性疗法的效益，确定在首次关节出血后开始初级预防的儿童具有比按需治疗的儿童显著较少的出血和较少关节损伤。
与按需治疗相比，预防性疗法也减少残疾、住院率和从学校或工作损失的时间6,16；并且改善患者及其家人的生活质量17。然而，预防性疗法在儿童中通常需要使用中枢性神经接入装置，并且其伴随感染、败血症和血栓症的风险。此外，尽管具有效益，但部分由于不便利性和侵入性，预防的接受度和依从性随年龄而降低18,19。因此，具有延长的血浆t1/2的rFVIII产品将可能为有益的。Lillicrap D.,CurrentOpinion in Hematology17:393-397(2010)。
rFVIIIFc为由单个B结构域缺失的rFVIII分子共价连接至人类IgG1Fc结构域构成的重组融合蛋白。Fc融合蛋白的潜在益处包括较佳耐受性和延长的止血保护，并且Fc结构域代表没有已知固有毒性的天然分子21,22。连接至IgG1Fc结构域允许结合至在多种细胞类型(包括内皮细胞)中表达的新生儿Fc受体(FcRn)。FcRn表达在一生中保持稳定并且负责保护IgG1和Fc融合蛋白免于溶酶体降解，因此延长蛋白质的t1/2 21,23。循环内的众多蛋白质经由非特异性胞饮作用内化至衬于血管上的细胞中并且运至内体和溶酶体降解途径。
Fc蛋白与驻留于内体中的FcRn相互作用。含有FcRn的内体引导Fc融合蛋白返回至质膜，以pH依赖性方式将其释放至循环中24，从而避免溶酶体降解。这个再循环方法已成功用于延长治疗性生物剂的t1/2；多种基于Fc融合体的药物已批准用于临床用途(例如伊纳西普(etanercept)、罗米斯汀(romiplostim))并且其它正在开发25,26。
rFVIIIFc的临床前数据表明可以通过由FcRn介导的天然保护性途径使FVIII免于降解，因此延长t1/2。在血友病A小鼠和狗中，rFVIIIFc的终末血浆t1/2为rFVIII的约2倍长27,28。基于这些数据，我们进行首次人类临床研究以在患有血友病A的受试者中研究持久rFVIIIFc融合蛋白的安全性和PK。
研究设计：在先前经过治疗的患有重度血友病A的患者中的此开放标记剂量递增多中心1/2a期研究在与
Figure BDA0000473150590000961
(抗冯·维勒布兰德因子[重组]，血浆/无白蛋白方法，octocog alfa, Baxter Healthcare)比较的情况下研究rFVIIIFc的安全性及其药物代谢动力学(PK)。根据US CFR和ICH良好临床实践指南(Guidelines on Good ClinicalPractices)执行此研究。在任何测试前，从参与机构审查委员会(participating Institutional Review Boards)获得批准并且从所有受试者获得书面知情同意书。研究设计为依序的；以25IU/kg或65IU/kg施用单次剂量的
Figure BDA0000473150590000962
接着为相等剂量的rFVIIIFc(图8)。两种药物均经约10分钟静脉内注射。预期所述两种剂量水平囊括典型治疗剂量范围。受试者在接受rFVIIIFc后跟踪28天以进行安全性分析，包括在注射后14和28天测试抗FVIII抗体和抑制剂。在注射前、rFVIIIFc注射后10和30分钟、1、3、6、9、24、48、72、96、120和168小时(7天)测量受试者中的血浆FVIII活性，其中对于给予65IU/kg rFVIIIFc的受试者另外在192、216和240小时(10天)取样。在
Figure BDA0000473150590000963
治疗后的相同时间点测量血浆FVIII活性，对于25IU/kg组至72小时并且对于65IU/kg组至96小时。
受试者：男性受试者为至少12岁，患有重度血友病A(定义为FVIII活性水平<1%)并且具有至少100次有记录的先前FVIII浓缩物(pdFVIII或rFVIII)暴露日。排除对于小鼠或仓鼠蛋白质具有已知过敏性、筛选时具有抑制剂或可检测抑制剂效价病史或服用任何可能影响止血的药物或全身性免疫抑制性药物或者在筛选30天以内经历活性细菌或病毒感染(除肝炎或HIV以外)的受试者。当已知时，在研究登记时记录受试者的基因型。
治疗产品：人类rFVIIIFc和Fc转基因稳定转染至HEK293细胞中并且广泛测试细胞系的稳定性、无菌性和病毒污染以确保安全性。纯化的药品由单体B结构域缺失的FVIII通过其羧基端共价连接至Fc单体的N端构成，所述Fc单体的N端在合成和从细胞分泌期间与第二Fc单体形成二硫键。通过色谱和纳米过滤纯化rFVIIIFc，并且在单级和显色凝结测定中相对于可商购获得的rFVIII制剂完全具有活性。它作为每2mL溶液含有1000IU并且用L-组氨酸(pH7)、氯化钠、氯化钙、蔗糖、甘露糖醇和聚山梨醇酯20调配的冷冻液体供应。对于注射，将产品用盐水溶液(0.9%NaCl)稀释。
结果测量：研究的主要目标为安全性，通过身体检查、治疗紧急性不良事件(AE)的报道、抗体的发展和随时间的实验室监测进行评估。次级目标包括从PK分析获得的参数。实验室评定包括凝血酶原时间、活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)、国际正规化比率、D二聚体水平、冯·维勒布兰德因子(vWF)抗原、标准血液学和血液化学测试以及尿分析。
在Siemens BCS-XP分析仪上使用商业试剂(Dade Actin FSL)在针对可追踪至关于人类血浆的世界卫生组织(WHO)第5版国际标准(IS)的正常参考血浆(Precision Biologics CRYOcheckTM)校准下通过单级凝结(aPTT)测定来测量FVIII活性。除aPTT测定外，还使用符合欧洲药典推荐的可商购获得的试剂盒(Aniara BIOPHEN FVIII:C)通过显色底物测定29来测量FVIII活性。针对也具有针对WHO第5版IS人类血浆标准指定的效能的正常人类参考血浆(InstrumentationLaboratories ORKE45)校准显色测定。
单级和显色测定的定量下限(LLOQ)分别为0.5IU/dL和0.4IU/dL。通过经过-*Nijmegen修改的贝塞斯达(Bethesda)测定测量FVIII抑制剂并且少于0.6BU/mL视为阴性。使用特异性桥接电化学发光免疫测定评定抗rFVIIIFc抗体，所述电化学发光免疫测定使用生物素和磺基标签的rFVIIIFc。使用抗人类FVIII单株抗体作为替代对照测得测定敏感性为89ng/mL。在各种时间点在两名受试者(各剂量水平一名)中进行探索性全血旋转血栓弹性描计法
Figure BDA0000473150590000981
以评定注射
Figure BDA0000473150590000982
和rFVIIIFc后全面止血作用的改善。
药物代谢动力学分析：在WinNonLin中利用用户定义的一室配置模型(其自动估算内源性FVIII水平和后续残余衰减)以便分析单次施用
Figure BDA0000473150590000983
或rFVIIIFc后的单个受试者血浆FVIII活性对时间数据。实际取样时间、剂量和注射持续时间用于计算参数，包括最大活性(Cmax)、t1/2、清除率(CL)、稳态分布体积(Vss)、曲线下面积(时间零外推至无穷大[AUCINF])、平均滞留时间(MRT)以及增量回收率。
rFVIIIFc活性对时间曲线的蒙特卡洛仿真(Monte CarloSimulation)-为在25IU/kg或65IU/kg的给药方案后构建FVIII活性-时间曲线，使用
Figure BDA0000473150590000984
和rFVIIIFc的群体PK模型进行蒙特卡洛仿真。在此1/2a期研究中基于来自16名受试者的
Figure BDA0000473150590000985
和rFVIIIFc的单级(aPTT)凝结测定活性数据估算所测试群体中模型参数(CL、分布体积)的平均估算值、个体间方差和残余可变性。对于每个给药方案，以每名受试者的15个取样点模拟五百名受试者。估算在
Figure BDA0000473150590000986
或rFVIIIFc的不同给药方案后的不同时间点FVIII活性高于或等于1%和3%的群体的百分比。
统计分析-使用方差分析模型比较rFVIIIFc和
Figure BDA0000473150590000987
的所选PK参数。对于这些分析将PK参数进行对数转化，并且转化对数尺度上的估算平均值、平均差异和信赖区间以分别获得原始尺度上的几何平均值、几何平均比率(GMR)和信赖区间的估算。GMR为rFVIIIFcPK参数值与
Figure BDA0000473150590000988
参数值的受试者内比率的几何平均值。
结果
受试者配置-十九名受试者入选所述研究；16名进行和rFVIIIFc的PK评估。一名受试者在给予
Figure BDA0000473150590000992
后的洗脱期前自己施用其先前产品并且因此从PK分析中排除，但包括于安全性分析中。三名受试者在接受研究药物前中断研究：一名自愿退出；第二名因无依从性而由研究者使其退出；并且一名因完成研究入选而在资助者要求下退出。在给药的受试者中，六名受试者接受25IU/kg并且10名受试者接受65IU/kg的
Figure BDA0000473150590000993
和rFVIIIFc。平均年龄为40.3岁(23至61岁)。收集七名受试者的基因型鉴定；在六名受试者中报道内含子22倒位；并且在一名受试者中报道移码缺陷。九名受试者的基因型未知。十三名受试者具有C型肝炎抗体，其中四名还为HIV阳性。
安全性-在治疗和追踪期期间由11(69%)名受试者报道四十四次治疗紧急性AE。这包括Advate或rFVIIIFc给药日至给药后观察期28天。大部分事件视为轻度并且没有人导致从研究中退出。一次事件(味觉障碍)在一名受试者中在接受65IU/kg剂量的rFVIIIFc时短暂发生并且认为与rFVIIIFc有关。
一名受试者在接受65IU/kg rFVIIIFc后经历焦虑发作，65IU/kgrFVIIIFc导致21次AE，其中19次分级为轻度，并且其中两次(头痛和畏光)分级为中度。在研究者看来没有一个与rFVIIIFc有关。
未报道严重出血事件。未检测到对注射的过敏性反应的证据。所有所测试的血浆样品对于FVIII抑制剂和抗rFVIIIFc抗体呈阴性。未观察到注射部位反应迹象。未报道异常实验室值的临床上有意义的变化。
药物代谢动力学：血浆中rFVIIIFc的aPTT与显色活性之间的相关性-在相同测定中使用可商购获得的试剂和针对正常人类血浆标准的校准测定
Figure BDA0000473150590000994
和rFVIIIFc活性。在具有高于LLOQ的活性的样品中通过单级凝结测定和显色测定获得的结果之间存在强相关性。在给予后的151个样品与给予rFVIIIFc后的185个样品分别的两个测定结果之间观察到0.94和0.95的相关性系数(Pearson R2)。与aPTT结果相比，显色FVIII活性平均高21%(对于
Figure BDA0000473150590001002
)和高32%(对于rFVIIIFc)，无统计显著性(图9)。此观测结果导致由两种药物的显色评定获得的暴露量参数的评估稍高。由显色测定获得的明显较高FVIII回收率对于在临床分析中所测试的重组FVIII产品为典型的，并且与大部分其它市售FVIII产品一致30-32。
rFVIIIFc的改善的药物代谢动力学-从单级(aPTT)凝结测定活性数据推导出初级PK估算值。在相等剂量的rFVIIIFc后接受25IU/kg或65IU/kg
Figure BDA0000473150590001003
的受试者中，血浆FVIII活性急剧上升并且在给药后一小时内达到Cmax。观测到的FVIII活性的后续下降展现出单指数衰减特征，直到达到基线FVIII活性(图10)。Cmax与剂量成比例增加，但在相等剂量的
Figure BDA0000473150590001004
与rFVIIIFc之间相当(表8)。总暴露量(AUCINF)也与剂量成比例增加。然而，rFVIIIFc的AUCINF分别为25IU/kg(p=0.002)和65IU/kg(p<0.001)的
Figure BDA0000473150590001005
的AUCINF的1.48和1.56倍高(表8)。
表8.每个剂量组中通过单级(aPTT)测定获得的rFVIIIFc和的PK参数
Figure BDA0000473150590001011
CI=信赖区间；Geom.Mean=几何平均值；OBS=观测值。转化估算平均值、平均值的95%CI和平均差异以分别获得估算几何平均值、几何平均值的95%CI和几何平均值比率。
t1/2、MRT、CL和Vss似乎与剂量无关(表8)。rFVIIIFc的t1/2几何平均值对于25IU/kg和65IU/kg剂量组均为18.8小时。这表示在相等剂量下，相比于(12.2小时和11.0小时)分别得到1.54和1.70倍改善(p<0.001)(表8)。比较rFVIIIFc的MRT(对于两个剂量组均为27.0小时)与
Figure BDA0000473150590001013
的MRT(对于25IU/kg为17.5小时并且对于65IU/kg为15.8小时)，观察到相同的受试者内改善(p<0.001)。与t1/2和MRT的改善一致，在25IU/kg(p=0.002)和65IU/kg(p<0.001)剂量下受试者内CL分别具有相应1.49和1.56倍降低。在
Figure BDA0000473150590001014
与rFVIIIFc之间，Vss和增量回收率无显著差异。因此，在各受试者中，rFVIIIFc显示与
Figure BDA0000473150590001015
相比，PK概况得到改善。还观察到，在时具有较短半衰期的患者在rFVIIIFc时具有较短半衰期，并且在
Figure BDA0000473150590001017
时具有较长半衰期的患者在rFVIIIFc时具有较长半衰期。
rFVIIIFc的PK概况改善使得给药后到达1%FVIII活性的时间增加，所述时间在25IU/kg(p<0.001)和65IU/kg(p<0.001)下分别为
Figure BDA0000473150590001018
时的1.53和1.68倍长(数据未示出)，表明rFVIIIFc的潜在较长治疗持续时间。
rFVIIIFc相对于
Figure BDA0000473150590001019
有利的PK概况也通过在显色测定中测量的FVIII活性证明(表9)，其与由aPTT测定得到的数据相当。然而，
Figure BDA0000473150590001021
和rFVIIIFc基于显色测定的暴露量(即Cmax和AUCINF)的估算稍高于基于单级(aPTT)凝结测定。
表9.每个剂量组中通过两级(显色)测定获得的rFVIIIFc和
Figure BDA0000473150590001022
的PK参数
Figure BDA0000473150590001023
CI=信赖区间；Geom.Mean=几何平均值；OBS=观测值。转化估算平均值、平均值的95%CI和平均差异以分别获得估算几何平均值、几何平均值的95%CI和几何平均值比率。
冯·维勒布兰德因子与rFVIIIFc配置之间的相关性-因为循环中的大部分FVIII与VWF复合33并且因为基因组联合研究已鉴定出FVIII水平的遗传决定子主要取决于VWF水平34，我们检查了VWF与rFVIIIFc之间的联合。在VWF水平与rFVIIIFc和两者的CL和t1/2之间观察到强相关性。如图10中所示，随着VWF的水平增加，rFVIIIFc(p=0.0016)和的CL降低。
在VWF的水平与t1/2之间观察到相反关系。随着VWF的水平增加，rFVIIIFc(p=0.0003)和
Figure BDA0000473150590001026
的t1/2增加。此相关性表明rFVIIIFc的Fc部分不改变VWF在保护FVIII免于清除方面的作用。
全血
Figure BDA0000473150590001031
上rFVIIIFc的延长的PK的作用-在施用研究药物之前，向来自各剂量组中一名受试者的血液中添加相等剂量的rFVIIIFc或
Figure BDA0000473150590001032
并且通过全血
Figure BDA0000473150590001033
进行分析。凝结时间(CT)在正常值的约1%至100%的范围内关于剂量呈线性，并且剂量反应在同一受试者中在rFVIIIFc与
Figure BDA0000473150590001034
之间相当(数据未示出)，表明在凝块形成中rFVIIIFc与
Figure BDA0000473150590001035
具有相当的效能。
尽管在施用或rFVIIIFc之前，由于残余FVIII水平而具有可变基线CT，但两种产品均在给药后30分钟在相当的水平上有效校正CT(图12)。在25IU/kg的剂量3小时后(图12A)并且在65IU/kg的剂量24小时后(图12B)，CT的改善由rFVIIIFc获得的维持优于
Figure BDA0000473150590001037
rFVIIIFc在两种剂量下受试者均良好耐受。在临床上未观测到血液学、血液化学和尿分析参数的显著变化。大部分AE为轻度的，与rFVIIIFc无关，并且可消退而无后遗症。在研究期间未发生严重AE或死亡，并且任一剂量的受试者均未发展针对rFVIIIFc的中和或结合抗体。
rFVIIIFc显示相对于
Figure BDA0000473150590001038
显著改善FVIII活性PK概况，其中如通过单级(aPTT)凝结测定所测量，t1/2和MRT在整个剂量水平内为1.54至1.71倍长，并且通过两级显色测定测量时为1.59至1.84倍长。rFVIIIFc的活性延长预示可能的功效延长，从而允许在预防性治疗患有血友病A的患者时以较低频率给药的方案。
采用由此研究获得的PK参数，蒙特卡洛仿真预测与接受相等剂量的
Figure BDA0000473150590001039
的患者相比，较高百分比的接受rFVIIIFc的患者将维持FVIII水平高于1%或3%(表10)。举例来说，在25IU/kg的剂量下，预测12.2%的
Figure BDA00004731505900010310
患者与71.2%的rFVIIIFc患者在第4天时具有高于1%的FVIII谷水平；在65IU/kg的剂量下，预测11.0%的
Figure BDA0000473150590001041
患者与66.4%的rFVIIIFc患者在第4天时具有高于3%的FVIII含量。计划在大量患者中进行临床试验以证实由此1/2a期研究和蒙特卡洛仿真预测获得的结果。
表10.
Figure BDA0000473150590001042
或rFVIIIFc的指定剂量方案下达到高于正常值的1%和3%的FVIII谷水平的受试者的预测百分比
Figure BDA0000473150590001043
尽管对于多种蛋白质治疗剂，Fc融合体技术在延长循环t1/2中获得成功，但认为rFVIII太大从而不能成功产生二聚Fc融合体。因此我们制成单体Fc融合蛋白，由此将单个效应分子共价连接至二聚Fc，使得能够结合细胞内FcRn并且后续再循环21,22。体外凝血测定通过凝结或显色测定使用可商购获得的试剂和常用FVIII参考标准证明，与B结构域缺失的或天然FVIII相比，对于rFVIIIFc的比活性未降低(JAD,TL,SCL等，2011年8月提交的原稿)。此外，这些结果指示rFVIIIFc可以在临床环境中通过单级测定或显色方法可靠地分析。
总之，此1/2a期临床试验为第一次证明rFVIIIFc在患有重度血友病A的患者中的安全性和延长的t1/2的试验。关键的第3期研究正利用rFVIIIFc在进行，以建立用于患有血友病A的受试者的有效预防给药方案。
实施例11
由在生物合成期间在残基R1648处的不完全蛋白水解产生的因子VIII(FVIII)的新型单链(SC)异构体可提供相对于天然FVIII优良的可制造性和稳定性。融合于免疫球蛋白Fc结构域的单一重组B结构域缺失的因子VIII分子(rFVIIIFc)及其纯化的SC对应物(SC-rFVIIIFc)在使用去除冯·维勒布兰德因子(VWF)的血浆的单级凝结测定中显示类似比活性，但SC-rFVIIIFc在VWF存在下显示较低的比活性。进行此研究以确定VWF结合的rFVIIIFc、SC-rFVIIIFc和rBDD-FVIII
Figure BDA0000473150590001051
在凝血酶介导的从VWF蛋白水解释放方面是否不同。
将等摩尔量的rFVIIIFc、SC-rFVIIIFc和rBDD-FVIII捕捉于通过氨偶合固定有人类VWF的光学生物传感器芯片上。将一定浓度范围的人类α-凝血酶输注在芯片表面上，并且实时监测FVIII从固定的VWF释放的速率。测定各FVIII物质的α-凝血酶的半最大有效浓度(EC50)。
rFVIIIFc和rBDD-FVIII的α-凝血酶EC50值相当(分别为3.7±0.2U/mL和3.2±0.3U/mL)，而SC-rFVIIIFc的EC50值大于3倍高(11.7±0.9U/mL)。SC-rFVIIIFc从VWF的释放比rFVIIIFc或rBDD-FVIII缓慢的此发现与先前观测到的在单级凝结测定(aPTT)中关于rFVIIIFc和SC-rFVIIIFc的活性的发现一致，在所述测定中，仅当在测定血浆样品中存在VWF时，SC-FVIIIFc具有较低表观活性。然而，所有样品在小鼠出血模型中具有相等活性，指示在FVIII从VWF的释放中FVIII制剂对凝血酶的反应性与体内功效不相关。
表1：多核苷酸序列
A.B结构域缺失的FVIIIFc
(i)B结构域缺失的FVIIIFc链DNA序列(FVIII信号肽加有下划 线，Fc区呈粗体)(SEQ ID NO:1，其编码SEQ ID NO:2)
Figure BDA0000473150590001061
Figure BDA0000473150590001071
(ii)Fc DNA序列(小鼠Igκ信号肽加有下划线)(SEQ ID NO:3，其 编码SEQ ID NO:4)
Figure BDA0000473150590001072
B.全长FVIIIFc
(i)全长FVIIIFc DNA序列(FVIII信号肽加有下划线，Fc区呈粗 体)(SEQ ID NO:5，其编码SEQ ID NO:6)
Figure BDA0000473150590001081
Figure BDA0000473150590001091
Figure BDA0000473150590001101
(ii)Fc(序列与A(ii)相同(SEQ ID NO:3))]
表2：多肽序列
A.B结构域缺失的FVIII-Fc单体杂合体(BDD FVIIIFc单体二聚体)：通过BDD FVIIIFc和Fc链共表达产生。
构建体=HC-LC-Fc融合体。Fc表达盒与BDDFVIII-Fc共转染以生成BDD FVIIIFc单体-。对于BDD FVIIIFc链，Fc序列以粗体显示；HC序列以双重下划线显示；剩余B结构域序列以斜体显示。信号肽加有下划线。
i)B结构域缺失的FVIII-Fc链(19个氨基酸的信号序列加有下划 线)(SEQ ID NO:2)
MQIELSTCFFLCLLRFCFS
Figure BDA0000473150590001102
Figure BDA0000473150590001103
EITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRFJQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSCLICPLLVCHTNTLIJPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDL
Figure BDA0000473150590001105
Figure BDA0000473150590001106
ii)Fc链(来自小鼠Igκ链的20个氨基酸的异源信号肽加有下划 线)(SEQ ID NO:4)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
B.全长FVIIIFc单体杂合体(全长FVIIIFc单体二聚体)：通过FVIIIFc和Fc链共表达产生。
构建体=HC-B-LC-Fc融合体。Fc表达盒与全长FVIII-Fc共转染以生成全长FVIIIFc单体。对于FVIIIFc链，Fc序列以粗体显示；HC序列以双重下划线显示；B结构域序列以斜体显示。信号肽加有下划线。
i)全长FVIIIFc链(FVIII信号肽加有下划线)(SEQ ID NO:6)
MQIELSTCFFLCLLRFCFS
Figure BDA0000473150590001111
Figure BDA0000473150590001112
OREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSCLICPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPCLVMAQDQRIRWYLLSMCSNENIHSIHFSCHVFTVRKKEEYKMALYNLYPCVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFIJPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDL
Figure BDA0000473150590001114
ii)Fc链(来自小鼠Igκ链的20个氨基酸的异源信号肽加有下划 线)(SEQ ID NO:4)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
引用的参考文献
4.Aledort L.等,J Intern Med.:236:391-399(1994)
5.Petrini P.等,Am J Pediatr Hematol Oncol.13:280-287(1991).
6.Aznar J.等,Haemophilia6(3):170-176(2000).
7.Feldman B.等,J Thromb Haemost.4:1228-1236(2006).
8.Kreuz W.等,Haemophilia4:413-417(1998).
9.Liesner R.等,B J Haem.92:973-978(1996).
10.Ljung R.,Haemophilia.4(4):409-412(1998).
11.
Figure BDA0000473150590001121
 T等,J Intern Med241:395-400(1997).
12.Nilsson I等,B.J Int Med232:25-32(1992).
13.Risebrough N.等,Haemophilia.14:743-752(2008).
14.Van Den Berg H.等,Haemophilia9(增刊1):27-31(2003).
15.Van Den Berg H.等,Haematologica89(6):645-650(2004).
16.Molho P.等,Haemophilia6(1):23-32(2000).
17.Coppola A.等,Blood Transfus.6(2):4-11(2008).
18.Geraghty S.等,Haemophilia12:75-81(2006).
19.Hacker M.等,Haemophilia7(4):392-396(2001).
20.Lillicrap D.,Current Opinion in Hematology17:393-397(2010).
21.Dumont J.A.等,BioDrugs20(3):151-60(2006).
22.Dumont J.A.等,“Monomeric Fc fusion technology:an approachto create long lasting clotting factors,”Kontermann R.编,TherapeuticProteins-Strategies to Modulate Half-Life,第11章,Wiley VCH出版商;未定稿.
23.Roopenian D.C.等,Nat Rev Immunol.7(9):715-25(Epub2007年8月17日).
24.Lencer W.I.和Blumberg R.S.,Trends Cell Biol.15(1):5-9(2005).
25.Huang C.,Curr Opin Biotechnol.20(6):692-9.(Epub2009年11月4日).
26.Schmidt S.R.,Curr Opin Drug Discov Devel.12(2):284-295(2009).
27.Dumont J.等,Blood.116(21)Abstract545(2009).
28.Liu T.等,J Thromb Haemost.9(S2):561(2011).
29.Rosen S.,Scand J Haematol Suppl.33(增刊40):139-45(1984).
30.Lee C.A.等,Thromb Haemost.82(6):1644-7(1999年12月).
31.Mikaelsson M.和Oswaldsson U.,Semin Thromb Hemost.28(3):257-64(2002年6月).
32.Stroobants A.K.等,J Thromb Haemost.9(增刊2)(2011).
33.Lenting P.J.等,J Thromb Haemost.5:1353-60(2007).
34.Smith N.L.等,Circulation121:1382-1392(2010).
Figure IDA0000473150640000031
Figure IDA0000473150640000041
Figure IDA0000473150640000051
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Figure IDA0000473150640000171
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Figure IDA0000473150640000191
Figure IDA0000473150640000201
Figure IDA0000473150640000211
Figure IDA0000473150640000231
Figure IDA0000473150640000241
Figure IDA0000473150640000251
Figure IDA0000473150640000261
Figure IDA0000473150640000271

Claims (264)

1.一种向有需要的人类受试者施用因子VIII的方法，其包括向所述受试者施用治疗剂量的包含因子VIII部分及第二部分的嵌合多肽，给药间隔为相等剂量的由所述因子VIII部分组成的多肽所需要的给药间隔的至少约一倍半长，其中所述因子VIII部分包含加工过的因子VIII，所述加工过的因子VIII具有两条链，第一链包含重链且第二链包含轻链，其中所述第一链与所述第二链通过金属键缔合。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的至少约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约99%为加工过的因子VIII。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约100%为加工过的因子VIII。
4.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述因子VIII部分包含单链因子VIII，其为单链。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述单链因子VIII含有完整的细胞内加工位点。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述细胞内加工位点对应于全长因子VIII的残基1648处的精氨酸(SEQ ID NO:6的氨基酸20-2351的精氨酸残基1667)。
7.如权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的至少约1%、约5%、约10%、约15%、约20%或约25%为单链因子VIII。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约25%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约75%为加工过的因子VIII。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约20%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约80%为加工过的因子VIII。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约15%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约85%为加工过的因子VIII。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约10%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约90%为加工过的因子VIII。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约5%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约95%为加工过的因子VIII。
13.如权利要求7所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约1%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约99%为加工过的因子VIII。
14.如权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的至少约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%或约99%为单链因子VIII。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约30%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约70%为加工过的因子VIII。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约40%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约60%为加工过的因子VIII。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约50%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约50%为加工过的因子VIII。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约60%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约40%为加工过的因子VIII。
19.如权利要求14所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约70%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约30%为加工过的因子VIII。
20.如权利要求14所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约80%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约20%为加工过的因子VIII。
21.如权利要求14所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约85%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约15%为加工过的因子VIII。
22.如权利要求14所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约90%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约10%为加工过的因子VIII。
23.如权利要求14所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约95%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约5%为加工过的因子VIII。
24.如权利要求14所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约99%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约1%为加工过的因子VIII。
25.如权利要求14所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约100%为单链因子VIII。
26.如权利要求4至25中任一项所述的方法，其中当在体外通过显色测定测量因子VIII活性时，包含单链因子VIII的所述嵌合多肽具有程度与由两个Fc部分及融合于所述两个Fc部分中的一个的加工过的因子VIII组成的嵌合多肽相当的因子VIII活性。
27.如权利要求4至26中任一项所述的方法，其中包含单链因子VIII的所述嵌合多肽在体内具有与由两个Fc部分及融合于所述两个Fc部分中的一个的加工过的因子VIII组成的嵌合多肽相当的因子VIII活性。
28.如权利要求4至27中任一项所述的方法，其中包含单链因子VIII的所述嵌合多肽具有与由两个Fc部分及融合于所述两个Fc部分中的一个的加工过的因子VIII组成的嵌合多肽相当的因子Xa产生速率。
29.如权利要求4至28中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽中的所述单链因子VIII由活化的蛋白C灭活的程度与由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽中的加工过的因子VIII相当。
30.如权利要求4至29中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽中的所述单链因子VIII具有与由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽中的加工过的因子VIII相当的因子IXa相互作用速率。
31.如权利要求4至30中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽中的所述单链因子VIII以与由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽中的加工过的因子VIII相当的程度结合冯·维勒布兰德因子(von Willebrand Factor)。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽具有选自由以下组成的组的一个或多个特征：
与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相当的与磷脂囊泡相互作用的能力；
与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相当的形成激活因子X的Xase复合物的能力；
与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相当的在五分钟内由α-凝血酶激活的能力；以及
与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相当的与因子IXa相互作用的能力。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述嵌合多肽具有选自由以下组成的组的一个或多个特征：
形成激活因子X的Km在由所述因子VIII部分组成的多肽的Km的约一个、约一个半或约两个标准偏差以内的Xase复合物，其中Km测量为因子X浓度的函数；
形成激活因子X的Vmax在由所述因子VIII部分组成的多肽的Vmax的约一个、约一个半或约两个标准偏差以内的Xase复合物，其中Vmax测量为因子X浓度的函数；
形成激活因子X的Kd在由所述因子VIII部分组成的多肽的Kd的约一个、约一个半或约两个标准偏差以内的Xase复合物，其中Kd测量为因子IXa浓度的函数；以及
形成激活因子X的Vmax在由所述因子VIII部分组成的多肽的Vmax的约一个、约一个半或约两个标准偏差以内的Xase复合物，其中Vmax测量为因子IXa浓度的函数。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述剂量具有大于每IU/kg1.38IU/dL的平均增量回收率(K值)(活性；观测值)。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述剂量具有每IU/kg至少约1.5、至少约1.85或至少约2.46IU/dL的平均增量回收率(K值)(活性；观测值)。
36.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽在所述患者群体中或在所述受试者中展现选自由以下组成的组的一种或多种药物代谢动力学参数：
当通过单级(aPTT)测定或两级(显色)测定测量时，在施用25IU/kg的所述嵌合多肽的所述受试者中的Cmax_OBS与施用25IU/kg的由所述全长、成熟因子VIII组成的多肽的受试者中的Cmax_OBS相当；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约60.5IU/dL；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约53.1-69IU/dL；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约119IU/dL；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约103-136IU/dL；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约76.5IU/dL；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约64.9-90.1IU/dL；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约182IU/dL；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Cmax_OBS为约146-227IU/dL；
在所述患者群体中的平均清除率(CL)(活性)为约2.33±1.08mL/h/kg或2.33±1.08mL/h/kg以下；
在所述患者群体中的平均清除率(CL)(活性)为约1.8-2.69mL/h/kg；
在所述患者群体中的平均清除率(CL)(活性)为由所述因子VIII部分组成的多肽的清除率的约65%；
在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.22-5.19mL/h/kg；
当通过单级(aPTT)测定或两级(显色)测定所测量时，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为施用相同量的由所述全长、成熟因子VIII组成的多肽的受试者中的清除率的0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69或0.70倍低；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.68mL/h/kg；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.31-2.15mL/h/kg；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约2.32mL/h/kg；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.64-3.29mL/h/kg；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.49mL/h/kg；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.16-1.92mL/h/kg；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.52mL/h/kg；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的清除率(CL)(活性)为约1.05-2.20mL/h/kg；
在所述患者群体中的平均平均滞留时间(MRT)(活性)为至少约26.3±8.33小时；
在所述患者群体中的平均MRT(活性)为约25.9-26.5小时；
在所述患者群体中的平均MRT(活性)为由所述因子VIII部分组成的多肽的平均MRT的约1.5倍长；
在所述受试者中的平均滞留时间(MRT)(活性)为约14-41.3小时；
当通过单级(aPTT)测定或两级(显色)测定所测量时，在所述受试者中的MRT为施用相同量的由所述全长、成熟因子VIII组成的多肽的受试者中的MRT的至少1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89或1.90倍高；
如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的MRT(活性)为约27小时；
如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的MRT(活性)为约20.6-35.3小时；
如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的MRT(活性)为约23.9-28.5小时；
如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的MRT(活性)为约19.8-28.9小时；
如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的MRT(活性)为约20.5-39.6小时；
在所述患者群体中的平均t1/2β(活性)为约18.3±5.79小时；
在所述患者群体中的平均t1/2β(活性)为约18-18.4小时；
在所述患者群体中的平均t1/2β(活性)为由所述因子VIII部分组成的多肽的平均t1/2β的约1.5倍长；
在所述受试者中的t1/2β(活性)为约11-26.4小时；
当通过单级(aPTT)测定或两级(显色)测定所测量时，在所述受试者中的t1/2β(活性)为施用相同量的由所述全长、成熟因子VIII组成的多肽的受试者中的t1/2β(活性)的至少1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86或1.87倍高；
如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的t1/2β(活性)为约18.8小时；
如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的t1/2β(活性)为约14.3-24.5小时；
如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的t1/2β(活性)为约16.7小时；
如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的t1/2β(活性)为约13.8-20.1小时；
如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的t1/2β(活性)为约19.8小时；
如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的t1/2β(活性)为约14.3-27.5小时；
在所述患者群体中的平均增量回收率(K值)(活性；观测值)为每IU/kg约2.01±0.44IU/dL；
在所述患者群体中的平均增量回收率(K值)(活性；观测值)为每IU/kg约1.85-2.46IU/dL；
在所述患者群体中的平均增量回收率(K值)(活性；观测值)为由所述因子VIII部分组成的多肽的平均增量回收率的约90%；
在所述受试者中的增量回收率(K值)(活性；观测值)为每IU/kg约1.38-2.88IU/dL；
当通过单级(aPTT)测定或两级(显色)测定测量时，在所述受试者中的增量回收率与施用由所述全长、成熟因子VIII组成的多肽的受试者中的增量回收率相当；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约2.44IU/dL；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约2.12-2.81IU/dL；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约1.83IU/dL；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约1.59-2.10IU/dL；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约3.09IU/dL；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约2.80IU/dL；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约2.61-3.66IU/dL；及
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的增量回收率为每IU/kg约2.24-3.50IU/dL；
在所述患者群体中的平均Vss(活性)为约55.1±12.3mL/kg；
在所述患者群体中的平均Vss(活性)为约45.3-56.1mL/kg；
在所述受试者中的Vss(活性)为约37.7-79.4mL/kg；
当通过单级(aPTT)测定或两级(显色)测定测量时，在所述受试者中的Vss(活性)与施用相同量的由所述全长、成熟因子VIII组成的多肽的受试者中的Vss(活性)相当；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约45.5mL/kg；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约39.3-52.5mL/kg；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约62.8mL/kg；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约55.2-71.5mL/kg；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约35.9mL/kg；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约30.4-42.3mL/kg；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约43.4mL/kg；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的Vss(活性)为约38.2-49.2mL/kg；
在所述患者群体中的平均AUC/剂量(活性)为每IU/kg约49.9±18.2IU*h/dL；
在所述患者群体中的平均AUC/剂量(活性)为每IU/kg约44.8-57.6IU*h/dL，以及
在所述受试者中的AUC/剂量为每IU/kg约19.2-81.7IU*h/dL；
当通过单级(aPTT)测定或两级(显色)测定所测量时，在所述受试者中的AUCINF为施用相同量的由所述全长、成熟因子VIII组成的多肽的受试者中的AUCINF的至少1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.90倍高；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约1440±316hr*IU/dL；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约1160-1880hr*IU/dL；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约1480hr*IU/dL；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约2910±1320hr*IU/dL；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约1980-3970hr*IU/dL；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过单级(aPTT)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约2800hr*IU/dL；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约1660hr*IU/dL；
当施用约25IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约1300-2120hr*IU/dL；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约4280hr*IU/dL；
当施用约65IU/kg所述嵌合多肽时，如通过两级(显色)测定所测量，在所述受试者中的AUCINF为每IU/kg约2960-6190hr*IU/dL。
37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述治疗剂量为约10至约150、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、110、115、120、125、130、135、140、145或150IU/kg。
38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述给药间隔为一天半至5天、一天半、2天、3天、4天或5天或更长。
39.一种组合物，其包含具有因子VIII活性的嵌合多肽，其中所述多肽的至少约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%包含为单链因子VIII的因子VIII部分及第二部分，其中所述单链因子VIII与表2中所示无信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸20至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸20至2351)至少90%或95%同一。
40.如权利要求39所述的组合物，其中所述单链因子VIII与表2中所示无信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸20至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸20至2351)同一。
41.一种组合物，其包含具有因子VIII活性的嵌合多肽，其中所述多肽的至少约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%包含为单链因子VIII的因子VIII部分及第二部分，其中所述单链因子VIII与表2中所示有信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2351)至少90%或95%同一。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述单链因子VIII与表2中所示有信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2351)同一。
43.如权利要求39至42中任一项所述的组合物，其中所述第二部分为Fc区、白蛋白、PAS序列、转铁蛋白或CTP(具有4个O-聚糖的hCG的28个氨基酸的C端肽(CTP))、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合多肽、白蛋白结合小分子或其任何组合。
44.如权利要求43所述的组合物，其中所述第二部分为Fc区。
45.如权利要求44所述的组合物，其中所述Fc与表2中所示的所述Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1458至1684或SEQ IDNO:6的氨基酸2352至2578)至少90%或95%同一。
46.如权利要求45所述的组合物，其中所述Fc与表2中所示的所述Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1458至1684或SEQ IDNO:6的氨基酸2352至2578)同一。
47.如权利要求39所述的组合物，其中所述多肽包含与表2A(i)中所示无信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸20至1684)至少90%或95%同一或与表2A(i)中所示有信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1684)至少90%或95%同一的序列。
48.如权利要求39所述的组合物，其中所述多肽包含与表2A(i)中所示无信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸20至1684)同一或与表2A(i)中所示有信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1684)至少90%或95%同一的序列。
49.如权利要求39至48中任一项所述的组合物，其中所述多肽呈包含第二多肽的杂合体形式，其中所述第二多肽基本上由Fc组成。
50.如权利要求49所述的组合物，其中所述第二多肽基本上由以下组成：与表2A(ii)中所示无信号序列的所述氨基酸序列(SEQ IDNO:4的氨基酸21至247)至少90%或95%同一或与表2A(ii)中所示有信号序列的所述氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至247)至少90%或95%同一的序列。
51.如权利要求50所述的组合物，其中所述第二多肽基本上由以下组成：与表2A(ii)中所示无信号序列的所述氨基酸序列(SEQ IDNO:4的氨基酸21至247)同一或与表2A(ii)中所示有信号序列的所述氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至247)至少90%或95%同一的序列。
52.如权利要求39至51中任一项所述的组合物，其中所述多肽具有由所述因子VIII组成的多肽的至少一倍半至六倍长、一倍半至五倍长、一倍半至四倍长、一倍半至三倍长或一倍半至两倍长的半衰期。
53.如权利要求39至52中任一项所述的组合物，其具有选自由以下组成的组的一个、约一个半或约两个或两个以上特征：
与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相当的与磷脂囊泡相互作用的能力；
与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相当的形成激活因子X的Xase复合物的能力；
与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相当的在五分钟内由α-凝血酶激活的能力；以及
与由所述因子VIII部分组成的多肽的能力相当的与因子IXa相互作用的能力。
54.如权利要求39至53中任一项所述的组合物，其中所述多肽的所述因子VIII部分的约70%、约60%、约50%、约40%、约30%、约20%、约10%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%为加工过的因子VIII。
55.如权利要求39至54中任一项所述的组合物，其中当在体外通过显色测定测量因子VIII时，包含单链因子VIII的所述嵌合多肽具有与由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽相当的因子VIII活性，其中所述加工过的因子VIII融合于所述两个Fc部分中的一个Fc。
56.如权利要求39至55中任一项所述的组合物，其中包含单链因子VIII的所述嵌合多肽具有与加工过的因子VIII相当的因子Xa产生速率。
57.如权利要求39至56中任一项所述的组合物，其中包含单链因子VIII的所述嵌合多肽具有与由两个Fc部分及融合于所述两个Fc部分中的一个的加工过的因子VIII组成的嵌合多肽相当的因子Xa产生速率。
58.如权利要求39至57中任一项所述的组合物，其中所述嵌合多肽中的所述单链因子VIII具有与由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽中的加工过的因子VIII相当的因子IXa相互作用速率。
59.如权利要求39至58中任一项所述的组合物，其中所述嵌合多肽中的所述单链因子VIII由活化的蛋白C灭活的程度与由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽中的加工过的因子VIII相当。
60.如权利要求39至59中任一项所述的组合物，其中所述嵌合多肽中的所述单链因子VIII以与由两个Fc部分及加工过的因子VIII组成的嵌合多肽中的加工过的因子VIII相当的程度结合冯·维勒布兰德因子。
61.如权利要求39至60中任一项所述的组合物，其中包含单链因子VIII的所述嵌合多肽在体内具有与由两个Fc部分及融合于所述两个Fc部分中的一个的加工过的因子VIII组成的嵌合多肽相当的因子VIII活性。
62.如权利要求39至61中任一项所述的组合物，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约30%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约70%为加工过的因子VIII。
63.如权利要求39至61中任一项所述的组合物，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约40%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约60%为加工过的因子VIII。
64.如权利要求39至61中任一项所述的组合物，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约50%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约50%为加工过的因子VIII。
65.如权利要求39至61中任一项所述的组合物，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约60%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约40%为加工过的因子VIII。
66.如权利要求39至61中任一项所述的组合物，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约70%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约30%为加工过的因子VIII。
67.如权利要求39至61中任一项所述的组合物，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约80%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约20%为加工过的因子VIII。
68.如权利要求39至61中任一项所述的组合物，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约90%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约10%为加工过的因子VIII。
69.如权利要求39至61中任一项所述的组合物，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约95%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约5%为加工过的因子VIII。
70.如权利要求39至61中任一项所述的组合物，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约99%为单链因子VIII，且所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约5%为加工过的因子VIII。
71.如权利要求39至61中任一项所述的组合物，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分的约100%为单链因子VIII。
72.如权利要求39至71中任一项所述的组合物，其为进一步包含赋形剂的药物组合物。
73.一种治疗出血病状的方法，其包括施用治疗有效量的如权利要求39至72中任一项所述的组合物。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述治疗为预防性治疗。
75.如权利要求73所述的方法，其中所述治疗为按需治疗。
76.如权利要求73至75中任一项所述的方法，其中所述出血病状选自由以下组成的组：出血凝血病症、关节积血、肌肉出血、口腔出血、流血、肌肉内流血、口腔流血、创伤、头部创伤、胃肠出血、颅内流血、腹内流血、胸内流血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血及髂腰肌鞘出血。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述出血凝血病症为血友病。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述出血凝血病症为血友病A。
79.如权利要求1至38及73至78中任一项所述的方法，其中所述施用使所述患者群体的至少90%中的因子VIII谷水平维持在高于1%的水平。
80.如权利要求1至38及73至78中任一项所述的方法，其中所述施用使所述群体的至少60%中的因子VIII谷水平维持在高于3%的水平。
81.一种使患者群体中的因子VIII维持在高于1%的水平持续至少一天、两天或三天的方法，其包括向所述群体施用治疗有效量的rFVIIIFc，其中所述治疗有效量为至少25IU/kg的rFVIIIFc且其中所述群体的至少90%维持所述因子VIII谷水平为至少1%或1%以上。
82.一种使患者群体中的因子VIII维持在高于3%的水平持续至少一天、两天、三天的方法，其包括向所述群体施用治疗有效量的rFVIIIFc，其中所述治疗有效量为至少65IU/kg的rFVIIIFc且其中所述群体的至少90%维持所述因子VIII谷水平为至少3%或3%以上。
83.如权利要求4至38及73至82中任一项所述的方法，其中所述单链因子VIII在对应于精氨酸1645的氨基酸位置处包含取代或突变。
84.如权利要求4至38及73至83中任一项所述的方法，其中所述单链因子VIII在对应于精氨酸1648的氨基酸位置处包含取代或突变。
85.如权利要求4至38及73至84中任一项所述的方法，其中所述单链因子VIII在对应于全长因子VIII的精氨酸1645及精氨酸1648的氨基酸位置处包含取代或突变。
86.如权利要求85所述的方法，其中在对应于精氨酸1645的所述氨基酸位置处取代的氨基酸为与在对应于精氨酸1648的所述氨基酸位置处取代的氨基酸不同的氨基酸。
87.如权利要求83至86中任一项所述的方法，其中所述取代或突变为除精氨酸以外的氨基酸。
88.如权利要求39至72中任一项所述的组合物，其中所述单链FVIII包含完整的细胞内加工位点。
89.如权利要求39至72中任一项所述的组合物，其中所述单链因子VIII在对应于全长成熟因子VIII中的精氨酸1645的氨基酸位置处包含取代或突变。
90.如权利要求39至72中任一项所述的组合物，其中所述单链因子VIII在对应于全长成熟因子VIII中的精氨酸1648的氨基酸位置处包含取代或突变。
91.如权利要求39至72中任一项所述的组合物，其中所述单链因子VIII在对应于全长因子VIII中的精氨酸1645及精氨酸1648的氨基酸位置处包含取代或突变。
92.如权利要求91所述的组合物，其中在对应于精氨酸1645的所述氨基酸位置处取代的氨基酸为与在对应于精氨酸1648的所述氨基酸位置处取代的氨基酸不同的氨基酸。
93.如权利要求89至92中任一项所述的组合物，其中所述取代或突变为除精氨酸以外的氨基酸。
94.如权利要求73至82中任一项所述的方法，其中所述单链因子VIII包含完整的细胞内加工位点。
95.如权利要求73至82中任一项所述的方法，其中所述单链因子VIII在对应于全长成熟因子VIII中的精氨酸1645的氨基酸位置处包含取代或突变。
96.如权利要求73至82中任一项所述的方法，其中所述单链因子VIII在对应于全长成熟因子VIII中的精氨酸1648的氨基酸位置处包含取代或突变。
97.如权利要求73至82中任一项所述的方法，其中所述单链因子VIII在对应于全长因子VIII中的精氨酸1645及精氨酸1648的氨基酸位置处包含取代或突变。
98.如权利要求97所述的方法，其中在对应于精氨酸1645的所述氨基酸位置处取代的氨基酸为与在对应于全长因子VIII中的精氨酸1648的所述氨基酸位置处取代的氨基酸不同的氨基酸。
99.如权利要求95至98中任一项所述的方法，其中所述取代或突变为除精氨酸以外的氨基酸。
100.如权利要求87或99所述的方法，其中除精氨酸以外的所述氨基酸残基选自由以下组成的组：异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、硒半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、组氨酸、鸟氨酸、吡咯赖氨酸或牛磺酸。
101.如权利要求93所述的组合物，其中除精氨酸以外的所述氨基酸残基选自由以下组成的组：异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、硒半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、组氨酸、鸟氨酸、吡咯赖氨酸或牛磺酸。
102.如权利要求1至38、73至87或94至100中任一项所述的方法，其中所述受试者为小儿科受试者。
103.一种预防、减少或治疗受试者的出血事件的方法，其包括向所述受试者施用有效量的长效因子VIII(FVIII)蛋白，其中所述受试者在血浆中表达高水平的冯·维勒布兰德因子(VWF)。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述受试者已鉴别为在血浆中表达高水平的VWF。
105.一种预防、减少或治疗受试者的出血事件的方法，其包括：
(a)通过测量受试者的血浆中VWF的水平来鉴别具有高VWF水平的所述受试者，其中至少约100IU/dL的VWF水平将所述受试者鉴别为具有高VWF水平；以及
(b)向所述受试者施用有效量的长效FVIII蛋白。
106.如权利要求103至105中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
107.如权利要求103至106中任一项所述的方法，其中所述受试者为小儿科受试者。
108.如权利要求103至107中任一项所述的方法，其中所述受试者患有血友病A。
109.如权利要求103至108中任一项所述的方法，其中VWF的所述高水平为至少约100IU/dL。
110.如权利要求103至109中任一项所述的方法，其中VWF的所述高水平在约100IU/dL与约200IU/dL之间。
111.如权利要求110所述的方法，其中VWF的所述高水平为约110IU/dL、约120IU/dL、约130IU/dL、约140IU/dL、约150IU/dL、约160IU/dL、约170IU/dL、约180IU/dL、约190IU/dL或约200IU/dL。
112.如权利要求103至111中任一项所述的方法，其中所述受试者具有血液血清型A、B或AB。
113.如权利要求103至112中任一项所述的方法，其中所述长效FVIII蛋白在所述受试者体内具有约20与约40小时之间的半衰期。
114.如权利要求113所述的方法，其中所述长效FVIII蛋白具有约21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时或40小时的半衰期。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述长效FVIII蛋白具有约20小时与27小时之间的半衰期。
116.如权利要求103至115中任一项所述的方法，其中所述长效FVIII蛋白具有为所述所述长效FVIII蛋白施用于具有平均水平VWF的个体时的半衰期的至少约1.2倍大的半衰期。
117.如权利要求116所述的方法，其中所述长效FVIII蛋白具有为所述所述长效FVIII蛋白施用于具有平均水平VWF的个体时的半衰期的至少约约1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍或2.5倍大的半衰期。
118.如权利要求103至117中任一项所述的方法，其中所述有效量为至少约20IU/kg、至少约25IU/kg、至少约30IU/kg、至少约35IU/kg、至少约40IU/kg、至少约45IU/kg、至少约50IU/kg、至少约55IU/kg、至少约60IU/kg、至少约65IU/kg、至少约70IU/kg、至少约75IU/kg、至少约80IU/kg、至少约85IU/kg或至少约90IU/kg。
119.如权利要求103至118中任一项所述的方法，其中所述有效量为至少约65IU/kg至至少约90IU/kg。
120.如权利要求119所述的方法，其中所述有效量为80IU/kg。
121.如权利要求103至120中任一项所述的方法，其中所述长效FVIII蛋白每72小时或更长时间施用一次。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述长效FVIII蛋白约一周或更长时间施用一次。
123.如权利要求121所述的方法，其中所述有效量的所述长效FVIII蛋白约每10天施用一次、约每两周施用一次、约每15天施用一次、约每20天施用一次、约每三周施用一次、约每25天施用一次、约每四周施用一次或约每一个月施用一次。
124.如权利要求121所述的方法，其中所述长效FVIII以80IU/kg的剂量每72小时施用一次。
125.如权利要求124所述的方法，其中所述受试者为小儿科受试者。
126.如权利要求103至125中任一项所述的方法，其中所述施用消退多于5-20%、多于5-15%、多于5-10%、多于10-20%或多于10-15%的出血事件。
127.如权利要求103至126中任一项所述的方法，其中所述受试者体内血浆因子VIII:C的谷水平维持高于1-3或3-5IU/dl。
128.如权利要求103至127中任一项所述的方法，其中所述施用预防所述受试者的出血事件。
129.如权利要求128所述的方法，其中所述出血事件为自发性的。
130.如权利要求129所述的方法，其中所述施用消退多于80-100%、多于80-90%、多于85-90%、多于90-100%、多于90-95%或多于95-100%的出血事件。
131.如权利要求103至130中任一项所述的方法，其中所述施用在需要手术的所述受试者的群体中维持稳态。
132.如权利要求103至131中任一项所述的方法，其中所述长效FVIII蛋白在所述手术之前、期间或之后施用。
133.如权利要求132所述的方法，其中所述手术为小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝气切开术、滑膜切除术、全膝置换、开颅术、骨缝合术、创伤外科手术、颅内手术、腹内手术、胸内手术或关节置换手术。
134.如权利要求131至133所述的方法，其中所述手术为急救外科手术。
135.如权利要求103至134中任一项所述的方法，其中所述长效FVIII蛋白具有比由FVIII组成的多肽长的半衰期。
136.如权利要求103至135中任一项所述的方法，其中所述长效FVIII蛋白被聚乙二醇化、羟乙基淀粉化或聚唾液酸化。
137.如权利要求103至136中任一项所述的方法，其中所述长效FVIII蛋白为包含FVIII部分及第二部分的嵌合蛋白。
138.如权利要求137所述的方法，其中所述第二部分为Fc区、白蛋白、PAS序列、转铁蛋白或CTP(具有4个O-聚糖的hCG的28个氨基酸的C端肽(CTP))、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合多肽、白蛋白结合小分子或其任何组合。
139.如权利要求137或138所述的方法，其中所述第二部分融合于所述FVIII部分的氨基端或羧基端。
140.如权利要求137或138所述的方法，其中所述第二部分插入所述FVIII部分中的两个氨基酸之间。
141.如权利要求137至140中任一项所述的方法，其中所述嵌合蛋白为FVIIIFc单体二聚体杂合体。
142.如权利要求141所述的方法，其中所述FVIII部分为单链。
143.如权利要求142所述的方法，其中所述FVIII部分包含重链和轻链。
144.如权利要求137至143中任一项所述的方法，其中所述FVIII部分包含全长因子VIII、成熟因子VIII或B结构域完全或部分缺失的因子VIII。
145.如权利要求141所述的方法，其中所述FVIII部分包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至1438或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2332至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列。
146.如权利要求145所述的方法，其中所述FVIII部分包含SEQID NO:2的氨基酸1至1438或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2332。
147.如权利要求137至146中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述第二部分包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1439至1665或SEQ ID NO:6的氨基酸2333至2559至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的Fc区。
148.如权利要求147所述的方法，其中所述第二部分包含SEQID NO:2的氨基酸1439至1665或SEQ ID NO:6的氨基酸2333至2559。
149.如权利要求103至148中任一项所述的方法，其中所述长效FVIII多肽作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的一部分施用。
150.一种治疗诊断患有出血病症的受试者的方法，其包括测量所述受试者体内FVIII-Fc的半衰期，其中为正常受试者体内FVIII-Fc半衰期的至少约1.2倍大的半衰期指示所述受试者为长间隔给药的候选者，及以有效量及至少3天的给药间隔施用FVIII-Fc多肽。
151.一种治疗诊断患有出血病症的受试者的方法，其包括以有效量及至少3天的给药间隔向受试者施用FVIII-Fc多肽，其中所述受试者体内FVIII-Fc的半衰期为FVIII-Fc施用于具有平均水平的VWF的受试者时的半衰期的至少约1.2倍大。
152.如权利要求150或151所述的方法，其中所述受试者体内FVIII-Fc的血浆半衰期为FVIII-Fc施用于具有平均水平的VWF的受试者时的血浆半衰期的至少约1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍大。
153.如权利要求150至152中任一项所述的方法，其中所述FVIII-Fc血浆半衰期在20-40小时之间。
154.如权利要求153所述的方法，其中所述长效FVIII蛋白具有约21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时或40小时的半衰期。
155.如权利要求154所述的方法，其中所述长效FVIII蛋白具有在约20小时与27小时之间的半衰期。
156.一种治疗诊断患有出血病症的受试者的方法，其包括测量施用于所述受试者的短效FVIII的半衰期，其中为所述短效FVIII在具有平均VWF水平的受试者体内的半衰期的至少约1.2倍大的半衰期指示所述受试者为长间隔给药的候选者，及以有效量及至少3天的给药间隔施用长效FVIII-Fc多肽。
157.如权利要求156所述的方法，其中所述受试者体内所述短效FVIII的所述半衰期为短效FVIII施用于具有平均水平VWF的受试者时的半衰期的至少约1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍大。
158.如权利要求150至157中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
159.如权利要求150至158中任一项所述的方法，其中所述受试者为小儿科受试者。
160.如权利要求150至159中任一项所述的方法，其中所述受试者患有血友病A。
161.如权利要求150至160中任一项所述的方法，其中所述受试者具有血液血清型A、B或AB。
162.如权利要求150至161中任一项所述的方法，其中所述长效FVIII-Fc以以下有效量施用：至少约20IU/kg、至少约25IU/kg、至少约30IU/kg、至少约35IU/kg、至少约40IU/kg、至少约45IU/kg、至少约50IU/kg、至少约55IU/kg、至少约60IU/kg、至少约65IU/kg、至少约70IU/kg、至少约75IU/kg、至少约80IU/kg、至少约85IU/kg或至少约90IU/kg。
163.如权利要求150至161中任一项所述的方法，其中所述有效量为至少约65IU/kg至至少约90IU/kg。
164.如权利要求150至163中任一项所述的方法，其中所述有效量的所述FVIII-Fc蛋白约每周施用一次、约每10天施用一次、约每两周施用一次、约每15天施用一次、约每20天施用一次、约每三周施用一次、约每25天施用一次、约每四周施用一次或约每一个月施用一次。
165.如权利要求150至164中任一项所述的方法，其中所述施用消退多于5-20%、多于5-15%、多于5-10%、多于10-20%或多于10-15%的出血事件。
166.如权利要求150至165中任一项所述的方法，其中所述受试者体内血浆因子VIII:C的谷水平维持高于1-3IU/dl或3-5IU/dl。
167.如权利要求150至166中任一项所述的方法，其中所述施用预防所述受试者的出血事件。
168.如权利要求167所述的方法，其中所述出血事件为自发性的。
169.如权利要求167所述的方法，其中所述施用消退多于80-100%、多于80-90%、多于85-90%、多于90-100%、多于90-95%或多于95-100%的出血事件。
170.如权利要求150至169中任一项所述的方法，其中所述施用在需要手术的所述受试者的群体中维持稳态。
171.如权利要求150至170中任一项所述的方法，其中所述FVIII-Fc蛋白在所述手术之前、期间或之后施用。
172.如权利要求170或171所述的方法，其中所述手术为小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝气切开术、滑膜切除术、全膝置换、开颅术、骨缝合术、创伤外科手术、颅内手术、腹内手术、胸内手术或关节置换手术。
173.如权利要求170至172中任一项所述的方法，其中所述手术为急救外科手术。
174.如权利要求150至173中任一项所述的方法，其中所述FVIII-Fc蛋白具有比由FVIII组成的多肽更长的半衰期。
175.如权利要求150至174中任一项所述的方法，其中所述FVIII-Fc蛋白被聚乙二醇化、羟乙基淀粉化或聚唾液酸化。
176.如权利要求174或175所述的方法，其中所述FVIII-Fc蛋白为FVIIIFc单体二聚体杂合体。
177.如权利要求172至176中任一项所述的方法，其中所述FVIII部分为单链。
178.如权利要求177所述的方法，其中所述FVIII部分包含重链及轻链。
179.如权利要求174至178中任一项所述的方法，其中所述FVIII部分包含全长因子VIII、成熟因子VIII或B结构域完全或部分缺失的因子VIII。
180.如权利要求179所述的方法，其中所述FVIII部分包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至1438或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2332至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列。
181.如权利要求180所述的方法，其中所述FVIII部分包含SEQID NO:2的氨基酸1至1438或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2332。
182.如权利要求174至181中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述第二部分包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1439至1665或SEQ ID NO:6的氨基酸2333至2559至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的Fc区。
183.如权利要求182所述的方法，其中所述第二部分包含SEQID NO:2的氨基酸1439至1665或SEQ ID NO:6的氨基酸2333至2559。
184.如权利要求150至183中任一项所述的方法，其中所述FVIII-Fc多肽作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的一部分施用。
185.一种用于确定诊断患有出血病症的受试者是否为用于长间隔给予长效FVIII多肽的候选者的方法，其包括测量血浆VWF的表达水平，其中至少100IU/dL的VWF表达水平指示所述受试者为使用长效FVIII多肽进行长间隔给药的候选者。
186.如权利要求185所述的方法，其中所述VWF表达水平为至少约110IU/dL、约120IU/dL、约130IU/dL、约140IU/dL、约150IU/dL、约160IU/dL、约170IU/dL、约180IU/dL、约190IU/dL或约200IU/dL。
187.一种用于确定诊断患有出血病症的受试者是否为用于长间隔给予长效FVIII多肽的候选者的方法，其包括测量所述受试者体内FVIII-Fc的半衰期，其中为FVIII-Fc施用于具有平均VWF水平的受试者时的半衰期的至少约1.2倍大的半衰期指示所述受试者为用于长间隔给药的候选者。
188.如权利要求187所述的方法，其中FVIII-Fc的所述半衰期为FVIII-Fc施用于具有平均水平的VWF的受试者时的半衰期的至少约1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍大。
189.一种用于确定诊断患有出血病症的受试者是否为用于长间隔给予长效FVIII多肽的候选者的方法，其包括测量所述受试者体内短效FVIII的半衰期，其中为短效FVIII施用于具有平均VWF水平的受试者时的半衰期的至少约1.2倍大的半衰期指示所述受试者为用于长间隔给药的候选者。
190.如权利要求189所述的方法，其中所述半衰期为FVIII-Fc施用于具有平均水平的VWF的受试者时的半衰期的至少约1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍大。
191.如权利要求1至38、73至87、94至100及102至190中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽包含Fc部分。
192.如权利要求191所述的方法，其中所述给药间隔为相等剂量的由所述因子VIII部分组成的多肽所需要的给药间隔的至少约一倍半至六倍长、一倍半至五倍长、一倍半至四倍长、一倍半至三倍长或一倍半至两倍长。
193.如权利要求192所述的方法，其中所述给药间隔为相等剂量的由所述因子VIII部分组成的多肽所需要的给药间隔的至少约一倍半、两倍、两倍半、三倍、三倍半、四倍、四倍半、五倍、五倍半或六倍长。
194.如权利要求1至38、73至87、94至100及102至193中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述给药间隔为约每三天、每四天、每五天、每六天、每七天、每八天、每九天、每十天、每十一天、每十二天、每十三天或每十四天或更长时间。
195.如权利要求1至38、73至87、94至100及102至194中任一项所述的方法，其中所述受试者需要预防性治疗。
196.如权利要求1至38、73至87、94至100及102至193中任一项所述的方法，其中所述受试者需要按需治疗。
197.如权利要求196所述的方法，其中所述受试者需要治疗出血事件。
198.如权利要求197所述的方法，其中所述受试者需要治疗关节积血、肌肉出血、口腔出血、流血、肌肉内流血、口腔流血、创伤、头部创伤、胃肠出血、颅内流血、腹内流血、胸内流血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血或髂腰肌鞘出血。
199.如权利要求196所述的方法，其中所述受试者需要手术预防、围手术期管理或用于手术的治疗。
200.如权利要求199所述的方法，其中所述手术为小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝气切开术、滑膜切除术、全膝置换、开颅术、骨缝合术、创伤外科手术、颅内手术、腹内手术、胸内手术或关节置换手术。
201.如权利要求196至200中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述给药间隔为约每24-36小时、每24-48小时、每24-72小时、每24-96小时、每24-120小时、每24-144小时、每24-168小时、每24小时、每25小时、每26小时、每27小时、每28小时、每29小时、每30小时、每31小时、每32小时、每33小时、每34小时、每35小时、每36小时、每37小时、每38小时、每39小时、每40小时、每41小时、每42小时、每43小时、每44小时、每45小时、每46小时、每47小时、每48小时、每49小时、每50小时、每51小时、每52小时、每53小时、每54小时、每55小时、每56小时、每57小时、每58小时、每59小时、每60小时、每61小时、每62小时、每63小时、每64小时、每65小时、每66小时、每67小时、每68小时、每69小时、每70小时、每71小时或每72小时或更长时间一次。
202.如权利要求1至38、73至87、94至100及102至201中任一项所述的方法，其中所述治疗剂量为10-100IU/kg。
203.如权利要求201所述的方法，其中所述治疗剂量为10-20IU/kg、20-30IU/kg、30-40IU/kg、40-50IU/kg、50-60IU/kg、60-70IU/kg、70-80IU/kg、80-90IU/kg或90-100IU/kg。
204.如权利要求202所述的方法，其中所述治疗剂量为10IU/kg、15IU/kg、20IU/kg、25IU/kg、30IU/kg、35IU/kg、40IU/kg、45IU/kg、50IU/kg、55IU/kg、60IU/kg、65IU/kg、70IU/kg、75IU/kg、80IU/kg、85IU/kg、90IU/kg、95IU/kg或100IU/kg。
205.如权利要求1至38、73至87、94至100及102至204中任一项所述的方法，其中所述因子VIII为人类因子VIII。
206.如权利要求1至38、73至87、94至100及102至205中任一项所述的方法，其中所述因子VIII的B结构域完全或部分缺失。
207.如权利要求205所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分与表2中所示无信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸20至1457；SEQ ID NO:6的氨基酸20至2351)至少90%或95%同一。
208.如权利要求207所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分与表2中所示无信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸20至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸20至2351)同一。
209.如权利要求205所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分与表2中所示有信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸1至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2351)至少90%或95%同一。
210.如权利要求209所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分与表2中所示有信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸1至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2351)同一。
211.如权利要求205或206所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述第二部分与表2中所示的所述Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1458至1684或SEQ ID NO:6的氨基酸2352至2578)至少90%或95%同一。
212.如权利要求211所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述第二部分与表2中所示的所述Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1458至1684或SEQ ID NO:6的氨基酸2352至2578)同一。
213.如权利要求1至38、73至87、94至100及102至212中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽呈包含第二多肽与所述嵌合多肽缔合的杂合体形式，其中所述第二多肽基本上由Fc组成。
214.如权利要求213所述的方法，其中所述嵌合多肽包含与表2A(i)中所示无信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸20至1684)至少90%或95%同一或与表2A(i)中所示有信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1684)至少90%或95%同一的序列。
215.如权利要求214所述的方法，其中所述嵌合多肽包含与表2A(i)中所示无信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸20至1684)同一或与表2A(i)中所示有信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1684)同一的序列。
216.如权利要求213至215中任一项所述的方法，其中所述第二多肽基本上由以下组成：与表2A(ii)中所示无信号序列的所述氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸21至247)至少90%或95%同一或与表2A(ii)中所示有信号序列的所述氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至247)至少90%或95%同一的序列。
217.如权利要求216所述的方法，其中所述第二多肽基本上由以下组成：与表2A(ii)中所示无信号序列的所述氨基酸序列(SEQ IDNO:4的氨基酸21至247)同一或与表2A(ii)中所示有信号序列的所述氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至247)同一的序列。
218.如权利要求1至38、73至87、94至100及102至217中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的一部分施用。
219.一种向有需要的人类受试者施用因子VIII的方法，其包括向所述受试者施用治疗剂量的包含因子VIII部分及第二部分的嵌合多肽，以获得为通过相等剂量的由所述因子VIII部分组成的多肽获得的血浆浓度对时间曲线下面积(AUC)的至少约一又四分之一倍大的AUC。
220.如权利要求219所述的方法，其中所述嵌合多肽以约每三天、每四天、每五天、每六天、每七天、每八天、每九天、每十天、每十一天、每十二天、每十三天或每十四天或更长时间的给药间隔施用。
221.如权利要求219或220所述的方法，其中所述受试者需要预防性治疗。
222.如权利要求219或220所述的方法，其中所述受试者需要按需治疗。
223.如权利要求219至222中任一项所述的方法，其中所述受试者需要治疗出血事件。
224.如权利要求219至222中任一项所述的方法，其中所述受试者需要治疗关节积血、肌肉出血、口腔出血、流血、肌肉内流血、口腔流血、创伤、头部创伤、胃肠出血、颅内流血、腹内流血、胸内流血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血或髂腰肌鞘出血。
225.如权利要求222所述的方法，其中所述受试者需要手术预防、围手术期管理或用于手术的治疗。
226.如权利要求225所述的方法，其中所述手术为小手术、大手术、拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝气切开术、滑膜切除术、全膝置换、开颅术、骨缝合术、创伤外科手术、颅内手术、腹内手术、胸内手术或关节置换手术。
227.如权利要求219至226中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述给药间隔为约每24-36小时、每24-48小时、每24-72小时、每24-96小时、每24-120小时、每24-144小时、每24-168小时、每24小时、每25小时、每26小时、每27小时、每28小时、每29小时、每30小时、每31小时、每32小时、每33小时、每34小时、每35小时、每36小时、每37小时、每38小时、每39小时、每40小时、每41小时、每42小时、每43小时、每44小时、每45小时、每46小时、每47小时、每48小时、每49小时、每50小时、每51小时、每52小时、每53小时、每54小时、每55小时、每56小时、每57小时、每58小时、每59小时、每60小时、每61小时、每62小时、每63小时、每64小时、每65小时、每66小时、每67小时、每68小时、每69小时、每70小时、每71小时或每72小时或更长时间一次。
228.如权利要求219至227中任一项所述的方法，其中所述治疗剂量为10-100IU/kg。
229.如权利要求228所述的方法，其中所述治疗剂量为10-20IU/kg、20-30IU/kg、30-40IU/kg、40-50IU/kg、50-60IU/kg、60-70IU/kg、70-80IU/kg、80-90IU/kg或90-100IU/kg。
230.如权利要求229所述的方法，其中所述治疗剂量为10IU/kg、15IU/kg、20IU/kg、25IU/kg、30IU/kg、35IU/kg、40IU/kg、45IU/kg、50IU/kg、55IU/kg、60IU/kg、65IU/kg、70IU/kg、75IU/kg、80IU/kg、85IU/kg、90IU/kg、95IU/kg或100IU/kg。
231.如权利要求219至230中任一项所述的方法，其中所述因子VIII为人类因子VIII。
232.如权利要求219至231中任一项所述的方法，其中所述因子VIII的B结构域完全或部分缺失。
233.如权利要求231所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分与表2中所示无信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸20至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸20至2351)至少90%或95%同一。
234.如权利要求233所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分与表2中所示无信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸20至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸20至2351)同一。
235.如权利要求231所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分与表2中所示有信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸1至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2351)至少90%或95%同一。
236.如权利要求235所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述因子VIII部分与表2中所示有信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸1至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2351)同一。
237.如权利要求231或232所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述第二部分与表2中所示的所述Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1458至1684或SEQ ID NO:6的氨基酸2352至2578)至少90%或95%同一。
238.如权利要求237所述的方法，其中所述嵌合多肽的所述第二部分与表2中所示的所述Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:的氨基酸1458至1684或；SEQ ID NO:6的氨基酸2352至2578)同一。
239.如权利要求219至238中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽呈包含第二多肽与所述嵌合多肽缔合的杂合体形式，其中所述第二多肽基本上由Fc组成。
240.如权利要求239所述的方法，其中所述嵌合多肽包含与表2A(i)中所示无信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸20至1684)至少90%或95%同一或与表2A(i)中所示有信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1684)至少90%或95%同一的序列。
241.如权利要求240所述的方法，其中所述嵌合多肽包含与表2A(i)中所示无信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸20至1684)同一或与表2A(i)中所示有信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1684)至少90%或95%同一的序列。
242.如权利要求239至241中任一项所述的方法，其中所述第二多肽基本上由以下组成：与表2A(ii)中所示无信号序列的所述氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸21至247)至少90%或95%同一或与表2A(ii)中所示有信号序列的所述氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至247)至少90%或95%同一的序列。
243.如权利要求242所述的方法，其中所述第二多肽基本上由以下组成：与表2A(ii)中所示无信号序列的所述氨基酸序列(SEQ IDNO:4的氨基酸21至247)同一或与表2A(ii)中所示有信号序列的所述氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至247)至少90%或95%同一的序列。
244.如权利要求219至243中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的一部分施用。
245.一种向有需要的人类受试者施用因子VIII的方法，其包括
以约每三天、每四天、每五天、每六天、每七天、每八天、每九天、每十天、每十一天、每十二天、每十三天或每十四天或更长时间的给药间隔向所述受试者施用治疗剂量的包含因子VIII及Fc的多肽。
246.如权利要求245中任一项所述的方法，其中所述受试者需要预防性治疗。
247.如权利要求245或246所述的方法，其中所述治疗剂量为10-100IU/kg。
248.如权利要求247所述的方法，其中所述治疗剂量为10-20IU/kg、20-30IU/kg、30-40IU/kg、40-50IU/kg、50-60IU/kg、60-70IU/kg、70-80IU/kg、80-90IU/kg或90-100IU/kg。
249.如权利要求248所述的方法，其中所述治疗剂量为10IU/kg、15IU/kg、20IU/kg、25IU/kg、30IU/kg、35IU/kg、40IU/kg、45IU/kg、50IU/kg、55IU/kg、60IU/kg、65IU/kg、70IU/kg、75IU/kg、80IU/kg、85IU/kg、90IU/kg、95IU/kg或100IU/kg。
250.如权利要求245至249中任一项所述的方法，其中所述因子VIII为人类因子VIII。
251.如权利要求245至250中任一项所述的方法，其中所述因子VIII的B结构域完全或部分缺失。
252.如权利要求250所述的方法，其中所述因子VIII与表2中所示无信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸20至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸20至2351)至少90%或95%同一。
253.如权利要求252所述的方法，其中所述因子VIII与表2中所示无信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸20至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸20至2351)同一。
254.如权利要求250所述的方法，其中所述因子VIII与表2中所示有信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2351)至少90%或95%同一。
255.如权利要求254所述的方法，其中所述因子VIII与表2中所示有信号序列的因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1457或SEQ ID NO:6的氨基酸1至2351)同一。
256.如权利要求250或251所述的方法，其中所述第二部分与表2中所示的所述Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1458至1684或SEQ ID NO:6的氨基酸2352至2578)至少90%或95%同一。
257.如权利要求256所述的方法，其中所述第二部分与表2中所示的所述Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1458至1684或SEQ ID NO:6的氨基酸2352至2578)同一。
258.如权利要求245至257中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽为呈包含第二多肽与所述嵌合多肽缔合的杂合体形式的因子VIII-Fc嵌合多肽，其中所述第二多肽基本上由Fc组成。
259.如权利要求258所述的方法，其中所述嵌合多肽包含与表2A(i)中所示无信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸20至1684)至少90%或95%同一或与表2A(i)中所示有信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1684)至少90%或95%同一的序列。
260.如权利要求259所述的方法，其中所述嵌合多肽包含与表2A(i)中所示无信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ IDNO:2的氨基酸20至1684)同一或与表2A(i)中所示有信号序列的所述因子VIII及Fc氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸1至1684)至少90%或95%同一的序列。
261.如权利要求258至260中任一项所述的方法，其中所述第二多肽基本上由以下组成：与表2A(ii)中所示无信号序列的所述氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸21至247)至少90%或95%同一或与表2A(ii)中所示有信号序列的所述氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至247)至少90%或95%同一的序列。
262.如权利要求261所述的方法，其中所述第二多肽基本上由以下组成：与表2A(ii)中所示无信号序列的所述氨基酸序列(SEQ IDNO:4的氨基酸21至247)同一或与表2A(ii)中所示有信号序列的所述氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1至247)至少90%或95%同一的序列。
263.如权利要求1至38、73至87、94至100及102至262中任一项所述的方法，其中所述多肽作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的一部分施用。
264.如权利要求1至38、73至87、94至100及102至263中任一项所述的方法，其中所述嵌合多肽具有因子VIII活性。
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TW (3) TWI687226B (zh)
WO (1) WO2013009627A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112512555A (zh) * 2018-05-18 2021-03-16 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 治疗血友病a的方法
US12161696B2 (en) 2016-12-02 2024-12-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilic arthropathy using chimeric clotting factors

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1624891E (pt) * 2003-05-06 2010-01-05 Syntonix Pharmaceuticals Inc Proteínas quiméricas de factor de coagulação-fc destinadas ao tratamento da hemofilia
JP5876208B2 (ja) 2006-12-15 2016-03-02 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 延長されたｉｎｖｉｖｏ半減期を有する第ＶＩＩａ因子−（ポリ）シアル酸結合体
US12203113B2 (en) 2009-07-09 2025-01-21 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
EP3093029A1 (en) 2009-07-27 2016-11-16 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
JP5909755B2 (ja) 2009-07-27 2016-04-27 リポクセン テクノロジーズ リミテッド 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
SG178141A1 (en) 2009-07-27 2012-03-29 Baxter Int Blood coagulation protein conjugates
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
AU2010325787B2 (en) * 2009-12-06 2016-05-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-Fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
DK2654794T3 (da) 2010-12-22 2020-06-08 Baxalta GmbH Materialer og fremgangsmåder til konjugering af et vandopløseligt fedtsyrederivat til et protein
KR102110736B1 (ko) 2011-07-08 2020-05-14 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. Viii 인자 키메라 및 하이브리드 폴리펩타이드, 그리고 이들의 사용 방법
HUE041595T2 (hu) * 2012-01-12 2019-05-28 Bioverativ Therapeutics Inc A VIII-as faktorral szembeni immunogenitás csökkentése a VIII-as faktorterápiát kapó egyéneknél
WO2013155324A1 (en) 2012-04-11 2013-10-17 Biogen Idec Ma Inc. Methods of detecting glycosaminoglycans
EP3693000B1 (en) 2012-06-08 2022-03-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Procoagulant compounds
EP2863940A4 (en) 2012-06-08 2016-08-10 Biogen Ma Inc Chimeric clotting factors
EP3404105A1 (en) 2012-07-06 2018-11-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
EP2914293A4 (en) * 2012-10-30 2016-04-20 Biogen Ma Inc METHOD OF USE OF FVIII POLYPEPTIDE
PL2956477T5 (pl) 2013-02-15 2024-05-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Zoptymalizowany gen czynnika viii
EA201890671A1 (ru) 2013-03-15 2019-01-31 Биовератив Терапьютикс Инк. Препараты полипептида фактора viii
US8989053B1 (en) 2013-11-29 2015-03-24 Fedex Corporate Services, Inc. Association management in a wireless node network
US10453023B2 (en) 2014-05-28 2019-10-22 Fedex Corporate Services, Inc. Methods and node apparatus for adaptive node communication within a wireless node network
WO2016004113A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Biogen Ma Inc. Optimized factor ix gene
TWI746427B (zh) * 2014-12-10 2021-11-21 以色列商歐科生物製品有限公司 製造長效ｃｔｐ修飾的多肽之方法
US11238397B2 (en) 2015-02-09 2022-02-01 Fedex Corporate Services, Inc. Methods, apparatus, and systems for generating a corrective pickup notification for a shipped item using a mobile master node
US10305744B2 (en) * 2015-07-08 2019-05-28 Fedex Corporate Services, Inc. System, apparatus, and methods of event monitoring for an event candidate related to an ID node within a wireless node network
PE20231949A1 (es) 2015-10-30 2023-12-05 Spark Therapeutics Inc VARIANTES DEL FACTOR VIII REDUCIDO CON CpG, COMPOSICIONES Y METODOS Y USOS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA
PT3411478T (pt) 2016-02-01 2022-09-13 Bioverativ Therapeutics Inc Genes do fator viii otimizados
CA3014870A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Fedex Corporate Services, Inc. Systems, apparatus, and methods for self-adjusting a broadcast setting of a node in a wireless node network
CN106279437B (zh) * 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
US11123438B2 (en) 2016-08-19 2021-09-21 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Linker peptide for constructing fusion protein
CN107759697B (zh) 2016-08-19 2023-03-24 安源医药科技（上海）有限公司 制备融合蛋白的方法
BR112019011198A2 (pt) * 2016-12-02 2019-12-17 Bioverativ Therapeutics Inc métodos de indução de tolerância imune a fatores de coagulação
AU2018366110B2 (en) 2017-11-07 2024-08-08 Rani Therapeutics, Llc Clotting factor preparations for delivery into tissue of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
US20210023209A1 (en) 2018-03-16 2021-01-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from pcsk2 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
EP3765053A2 (en) 2018-03-16 2021-01-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from urocortin 3 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
WO2019175380A2 (en) 2018-03-16 2019-09-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from secretogranin v and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
CN112512551A (zh) * 2018-03-28 2021-03-16 奥里尼斯生物科学公司股份有限公司 双功能蛋白及其构建
CA3137539A1 (en) * 2019-05-03 2020-10-20 Rani Therapeutics, Llc Clotting factor preparations for delivery into tissue of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device
EP3736286A1 (en) * 2019-05-09 2020-11-11 Biotest AG Single chain factor viii molecule
TW202115127A (zh) 2019-06-19 2021-04-16 美商百歐維拉提夫治療公司 治療血友病及低骨質密度之方法及組成物
WO2021067389A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 Bioverativ Therapeutics Inc. Lentiviral vector formulations
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
US12173307B2 (en) 2020-06-24 2024-12-24 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods for the purification of viral vectors

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100120664A1 (en) * 2006-12-22 2010-05-13 Stefan Schulte Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
JPH0788399B2 (ja) 1985-04-12 1995-09-27 ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド 新規プロコアギュラント蛋白質
KR910006424B1 (ko) 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
DE3785102T2 (de) 1986-01-03 1993-07-22 Genetics Inst Verfahren zur herstellung von faktor-viii:c-typ-proteinen.
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5543502A (en) 1986-06-24 1996-08-06 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
CA1331157C (en) 1987-04-06 1994-08-02 Randal J. Kaufman Method for producing factor viii:c-type proteins
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5171844A (en) 1987-06-12 1992-12-15 Gist-Brocades N.W. Proteins with factor viii activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
DE3720246A1 (de) 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
US4994371A (en) 1987-08-28 1991-02-19 Davie Earl W DNA preparation of Christmas factor and use of DNA sequences
US5171544A (en) 1988-02-02 1992-12-15 Lang John S Method of mixing fluids in packing media for reactors
US5004803A (en) 1988-11-14 1991-04-02 Genetics Institute, Inc. Production of procoagulant proteins
JP2989002B2 (ja) 1988-12-22 1999-12-13 キリン―アムジエン・インコーポレーテツド 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子
DE69029799T2 (de) 1989-02-21 1997-05-28 Washington University, St. Louis, Mo. Modifizierte formen von fortpflanzungshormonen
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
ATE240740T1 (de) 1991-03-15 2003-06-15 Amgen Inc Pegylation von polypeptiden
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US6376463B1 (en) 1992-04-07 2002-04-23 Emory University Modified factor VIII
US5859204A (en) 1992-04-07 1999-01-12 Emory University Modified factor VIII
US5364771A (en) 1992-04-07 1994-11-15 Emory University Hybrid human/porcine factor VIII
US5563045A (en) 1992-11-13 1996-10-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric procoagulant proteins
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
CA2225189C (en) 1997-03-06 2010-05-25 Queen's University At Kingston Canine factor viii gene, protein and methods of use
US6200560B1 (en) 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
AU4314801A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Lexigen Pharm Corp Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
EP1572889B1 (en) * 2001-10-05 2008-12-17 Expression Therapeutics, LLC Nucleic acid and amino acid sequences encoding high-level expressor factor viii polypeptides and methods of use
EP2990417A1 (en) 2001-12-21 2016-03-02 Human Genome Sciences, Inc. Albumin insulin fusion protein
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
PT1624891E (pt) 2003-05-06 2010-01-05 Syntonix Pharmaceuticals Inc Proteínas quiméricas de factor de coagulação-fc destinadas ao tratamento da hemofilia
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7348004B2 (en) * 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7211559B2 (en) 2003-10-31 2007-05-01 University Of Maryland, Baltimore Factor VIII compositions and methods
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
LT1824988T (lt) 2004-11-12 2017-10-25 Bayer Healthcare Llc Nukreipta į užduotą saitą fviii modifikacija
SG123635A1 (en) 2004-12-28 2006-07-26 Nanoscience Innovation Pte Ltd Nanostructured zinc oxide and a method of producing the same
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
WO2007103515A2 (en) 2006-03-06 2007-09-13 Amunix, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
US8048848B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Prolor Biotech Ltd. Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof
ATE502114T1 (de) 2007-06-21 2011-04-15 Univ Muenchen Tech Biologisch aktive proteine mit erhöhter in-vivo- und/oder in-vitro-stabilität
BRPI0815416A2 (pt) 2007-08-15 2014-10-21 Amunix Inc Composições e métodos para modificar propriedades de polipeptídeos biologicamente ativos
US8239182B2 (en) 2007-12-04 2012-08-07 Spansion Llc Data transmission system-on-chip memory model based validation
PL2393828T3 (pl) 2009-02-03 2017-06-30 Amunix Operating Inc. Wydłużone rekombinowane polipeptydy i zawierające je kompozycje
AU2010325787B2 (en) * 2009-12-06 2016-05-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-Fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
CL2012001463A1 (es) 2009-12-06 2014-02-07 Bioverativ Therapeutics Inc Uso de un polipeptido factor viii de larga duracion para disminuir la incidencia de episodio de sangrado en sujetos humanos y mantener la homeostasis en un sujeto humano que requiere cirugia.
AU2011274423B2 (en) * 2010-07-09 2016-02-11 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
US9611310B2 (en) * 2010-07-09 2017-04-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor VIII processing and methods thereof
KR102110736B1 (ko) 2011-07-08 2020-05-14 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. Viii 인자 키메라 및 하이브리드 폴리펩타이드, 그리고 이들의 사용 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100120664A1 (en) * 2006-12-22 2010-05-13 Stefan Schulte Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12161696B2 (en) 2016-12-02 2024-12-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilic arthropathy using chimeric clotting factors
CN112512555A (zh) * 2018-05-18 2021-03-16 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 治疗血友病a的方法
US12030925B2 (en) 2018-05-18 2024-07-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilia A

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Publication number Publication date
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