DE3785102T2

DE3785102T2 - Verfahren zur herstellung von faktor-viii:c-typ-proteinen.

Info

Publication number: DE3785102T2
Application number: DE8787900933T
Authority: DE
Inventors: Robert Adamson; J Kaufman
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1986-01-03
Filing date: 1987-01-02
Publication date: 1993-07-22
Anticipated expiration: 2007-01-03
Also published as: NO873679L; DK457587A; JP2525022B2; JPS63502318A; EP0253870A4; DE3785102D1; EP0253870B1; DK457587D0; WO1987004187A1; FI873796L; FI873796A7; ATE87663T1; FI873796A0; EP0253870A1; NO873679D0

Description

Grundlagen der Erfindung

Der Faktor VIII-Komplex hat zwei unterschiedliche biologische Funktionen: die koagulierende Wirkung und eine Rolle bei der primären Hämostase. Die Analyse von Faktor VIII-Mangelerkranungen, der klassischen Hämophilie und der von Willebrand-Krankheit, trugen zu der Erkenntnis bei, daß der Faktor VIII ein Komplex aus zwei Komponenten ist. Das Faktor VIII:c-Prokoagulationsprotein (antihämophiler Faktor) und das mit Faktor VIII in Beziehung stehende Antigen (von Willebrand-Faktor, VWF) stehen unter getrennter genetischer Kontrolle, haben unterschiedliche biochemische und imnunologische Eigenschaften und haben einzigartige und essentielle physiologische Funktionen.
Das Molekül von Faktor VIII:c ist ein wichtiges regulatofisches Protein im Verlauf der Blutkoagulation. Nach der Aktivierung durch Thrombin beschleunigt es die Aktivierungsrate von Faktor X durch Faktor IXa und führt in der Folge zur Bildung der Fibrinausfällung. Ein Mangel an Faktor VIII:c (klassische Hämophilie) ist eine X-gebundene chromosomale Störung, die eine Hauptquelle der hämorrhagischen Morbidität und Mortalität bei betroffenen Männern darstellt. Die Behardlung besteht im allgemeinen aus häufigen Transfusionen mit Blutprodukten. Diese letzteren führen zu einem gehäuften Auftreten infektiöser Komplikationen (wie verschiedene Formen von Hepatitis und erworbene Immunmangelerkrakung (AIDS)) bei der hämophilen Bevölkerung.
Das VWF-Molekül ist ein klebriges Glykeprotein, das eine zentrale Rolle bei der Plättchen-Agglutinierung spielt. Es dient als Träger für den Faktor VIII:c im Plasma und erleichtert die Wechselwirkungen zwischen Plättchen und Gefäßwand. Es wurden diskrete Bereiche von VWF, die sich an die Plättchen-Rezeptorstellen auf dem Glykoprotein 1b und auf dem Glykoprotein IIb-IIIa-Komplex binden, ebenso wie Bindungsstellen auf dem Kollagen festgestellt. VWF besteht aus vielfältigen, wahrscheinlich identen Untereinheiten von jeweils 230.000 Dalton. VWF wird in den endothelialen Zellen und in Megakaryozyten synthetisiert. Im Plasma liegt es als Multimer mit hohem Molekulargewicht im Bereich von 5 x 10&sup5; bis 10&sup7; Dalton vor. Der von Willebrand-Faktor enthält 5-6 % komplexes Kohlehydrat, das für die Fähigkeit der Moleküle zur Bindung von Plättchen wichtig zu sein scheint. Eine Vielzahl von Anomalien in der VWF-Aktivität kann zu der von Willebrand-Krankheit führen. Die Störung wird normalerweise in autosomaler dominanter Weise vererbt und kann bis zu eine Person pro 2000 betreffen. Schwache Formen der Krankheit werden häufig nicht diagnostiziert, wogegen stark befallene Patienten eine häufige Zufuhr von Blutprodukten benötigen können, bei welcher die damit verbundenen Risken auftreten.
In letzter Zeit wurde es durch die Isolierung der Gene sowohl für Faktor VIII:c als auch für den von Willebrand-Faktor möglich, durch rekombinante Verfahren Zubereitungen von Faktor VIII:c und VWF zu produzieren, die im wesentlichen keine verunreinigenden Viren enthalten (Toole et al. 1984, Wood et al. 1984, Lynch et al. Cell. 41: 49-56 1985, Ginsberg et al. Science 228:1401-1406 1985). Die Produktion von Faktor VIII:c und von Analoga desselben durch rekombinante DNA-Technologie wurde erreicht durch Verwendung von Säugetierzellen als Rezipient der für den Faktor VIII:c (oder Analoga desselben) codierenden DNA, die in geeigneten Expressionsvektoren enthalten ist. Die Hauptgesichtspunkte bei der Synthese eines rekombinanten Faktors VIII:c sind (i) die Ausbeute des aus dem Kulturmedium erhältichen, rekombinanten FVIII:c, (ii) die Stabilität des so hergestellten rekombinanten FVIII:c, (iii) die Wirksamkeit und die Kosten der Reinigung von FVIII:c sowie (iv) die Gesamtkosten bei der Produktion von gereinigtem, rekombinantem FVIII:c.
Zur Erzielung bester Ergebnisse haben wir in der Regel FVIII: c-produzierende Zellen in Medien gezüchtet, die Säugetierserum, z.B. übliche Zubereitungen von fötalem Rinderserum, in Mengen von etwa 10 Vol. % Serum, bezogen auf das Gesamtvolumen des Mediums, enthielten (Zum Zweck der Vereinfachung werden im Folgenden alle Serumkonzentrationen als Volumsprozent des Gesamtmediums angegeben.) Wir konnten feststellen, daß beim Fehlen solcher Serumergänzungen sowohl die Ausbeute als auch die Stabilität des rekombinanten FVIII:c in deutlicher Weise beeinträchtigt wurden. Jedoch sind die Kosten des Serumzusatzes und die dadurch auftretenden Nachteile und Kosten bei der Reinigung, die auf die Verwendung des Serums zurückzuführen waren, der Grund dafür, daß die Verwendung des Serums eine unerwünschte Notwendigkeit darstellt und daß die Verwendung des rekombinanten FVIII:c in großem Maßstab eine wirtschaftlich wenig attraktive Alternative für die Verwendung von natürlichem, aus Plasma gereinigtem FVIII:c bildet.
Nach zahlreichen experimentellen Veränderungen der Medien für die FVIII:c-produzierenden Zellen haben wir überraschenderweise ein Verfahren gefunden, mit dessen Hilfe größere Ausbeuten von stabilen Proteinen des Typs FVIII:c (wie im Folgenden beschrieben) durch Verwendung von Medien mit geringeren Serummengen (z. B. halbdefinierte Medien) oder von im wesentlichen serumfreien Medien (definierte Medien) produziert werden können. Wir haben gefunden, daß Wirtszellen, die Proteine des Typs FVIII:c produzieren, gewinnbare, stabile Proteine des Typs FVIII:c in halbdefinierten und definierten Medien in Ausbeuten hervorbringen, die zumindest vergleichbar mit jenen sind, die in Anwesenheit von 10 % Serum gewonnen werden, wenn das halbdefinierte oder definierte Medium eine geeignete Menge einer hydrophoben Substanz, wie etwa VWF oder bestimmte Phospholipide, enthält Außerdem haben wir gefunden, daß die in halbdefinierten oder definierten Medien ohne derartige Ergänzungen produzierten Proteine des Typs FVIII:c in der Regel eine dramatische Instabilität aufweisen und, wenn überhaupt, so nur in extrem niedriger Ausbeute gewinnbar sind.
Die bisher erbrachten Beweise deuten darauf hin, daß der VWF entweder in vivo eine stabilisierende Wirkung auf den Faktor VIII:c im Plasma hat oder daß er die in vivo-Freigabe aus Speicherdepots bewirken oder die in vivo-Synthese und/oder Auscheidung von Faktor VIII:c stimulieren kann (Weiss, H. J. et al., 1977, J. Clin. Invest. 60: 390-404). Es wurde auch angenommen, daß der durch Thrombin aktivierte Faktor VIII (aus natürlichem, humanem FVIII stammend) durch Phospholipide, voraussichtlich im Hinblick auf den Thrombin-mediierten Abbau, stabilisiert wird (vgl. Andersson und Brown, 1981, Biochem. J. 200: 161-167). Unseres Wissens wurde jedoch im Stand der Technik nie davon gesprochen, daß VWF oder Phospholipid auf die in vitro-Produktion von Proteinen des Typs Faktor VIII:c (wo beispielsweise Thrombin praktisch vollständig fehlt) irgendeine mögliche Wirkung oder Wirkungen haben könnte, noch werden Medienzusätze erwähnt, in denen VWF und/oder Phospholipide enthalten sind und die in Übereinstimmung mit der Erfindung im wesentlichen frei von den in Säugetierserum vorliegenden komplexen Bestandteilsmischungen sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Proteinen vom Typ Faktor VIII:c.
Proteine "vom Typ Faktor VIII:c", wie der Ausdruck hier verwendet wird, bedeuten Proteine, die eine prokoagulierende Wirkung vom Typ Faktor VIII:c aufweisen. Proteine vom Typ Faktor VIII:c werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung von DNA-Sequenzen codiert, die zur Hybridisierung an eine für Faktor VIII:c codierende DNA befähigt sind. Zusätzlich zu dem natürlichen Faktor VIII:c von Säugetieren, z.B. Menschen, umfassen die Proteine des Typs Faktor VIII:c beispielsweise Proteine, die Deletionen von einer oder mehreren Aminosäuren zwischen den 90 Kd und 69 Kd Spaltungsstellen in bezug auf den nativen Faktor VIII:c enthalten, wie detaillierter in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US86/00774, die am 23. Oktober 1986 veröffentlicht wurde, beschrieben ist. Die Proteine vom Tpy Faktor VIII:c umfassen auch Analoga des Faktor VIII:c, die Aminosäuredeletionen zwischen der Spaltungsstelle 50/40 und der 69 Kd Spaltungsstelle enthalten und die durch Verfahren produziert werden können, die analog den in der PCT/US86/00774 beschriebenen sind. Poteine vom Typ Faktor VIII:c umfassen außerdem Analoga (mit oder ohne oben genannten Deletionen), bei welchen eine oder mehrere der Spaltungsstellen, die die Argininreste an den Positionen 226, 336, 562, 740, 776, 1313, 1648 oder 1721 überspannen, gegen proteolytische Spaltung resistent gemacht wurden, z.B. durch Ersatz einer oder mehrerer Aminosäuren durch andere Aminosäuren in üblicher, stellengelenkter Mutagenese der zu exprimierenden cDNA. Daher umfassen die Proteine vom Typ Faktor VIII:c den natürlichen Faktor VIII:c, den "rekombinanten" Faktor VIII:c und Analoga derselben mit prokoagulierender Wirkung sowie den nicht rekombinanten Faktor VIII:c oder Analoga desselben, die von Zell-Linien produziert werden, die ihrerseits von Zellen stammen, die das Protein produzieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet somit Säugetierzellen, die eine DNA enthalten, die für ein Protein vom Typ Faktor VIII:c codiert, und die zur Expression des Proteins befähigt sind. In Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Zellen in einem Medium gezüchtet, das eine wirksame Menge einer stabilisierenden Substanz für ein Protein vom Typ Faktor VIII:c enthält. Derartige Substanzen umfassen: (i) von Willebrand-Faktor (VWF) aus Säugetieren, (ii) ein stabilisierendes Phospholipid oder eine Phospholipidmischung und (iii) Mischungen von VWF mit einem oder mehreren Phospholipiden. Die bevorzugten wirksamen Mengen von VWF reichen von etwa 0, 1 bis 10 ug VWF/ml Medium, wobei 1-3 ug/ml besonders bevorzugt sind. Eine leicht erhältliche Quelle geeigneter Phospholipide sind die im Handel erhäitlichen Trockenmilchzubereitungen, wie getrocknete Magermilch und Magermilch mit niedrigem Fettgehalt. Derartige Trockenmilchpräparate können dem Medium in Mengen zugesetzt werden, die von etwa 0,01 % bis 10 % (Gewicht der Trockenmilch/Volumen des Mediums) reichen. Für eine optimale Wirkung auf die Produktion von Faktor VIII mit minimaler toxischer Wirkung auf die Zellen werden derzeit 1 % bis 3 % Trockenmilch bevorzugt. Die Trockenmilchpräparate können günstigerweise sterilisiert werden, indem zuerst eine 10 %-ige wässerige Suspension der Milch hergestellt und autoklaviert wird. Eine andere leicht zugängliche Quelle für geeignete Phospholipide ist im Handel erhältliches Sojabohnenlecithin, das dem Medium gemäß dieser Erfindung vorzugsweise in Liposom-Form zugesetzt werden kann.
Der Ausdruck "Phospholipid", wie er hier verwendet wird, bedeutet einen Phosphorsäureester, der ein oder zwei Moleküle Fettsäure, einen Alkohol und eine Stickstoffbase enthält. Beispiele solcher Phospholipide sind Cephalin, Phosphatidylserin-Phosphatidylcholin-Mischungen, Phosphatidylinositol, Phosphatidylethanolamin, Sojabohnenlecithin und Mischungen derselben, wobei das Sojabohnenlecithin besonders bevorzugt ist. Andere für dieses Verfahren geeignete Phospholipide können ebenso wie die wirksamen und/oder optimalen Konzentrationen und/oder Mischungen derselben leicht vom Fachmann unter Verwendung von Verfahren bestimmt werden, die detaillierter im Folgenden beschrieben werden. Derzeit enthalten die bevorzugten wirksamen Mengen von Phospholipid oder Phospholipidmischungen etwa 1-1000 ug Phospholipid oder Phospholipidmischung pro ml Kulturdedium, wobei Konzentrationen von mehr als etwa 100 ug/ml bevorzugter sind und Konzentrationen zwischen etwa 200 und 300 ug/ml besonders bevorzugt sind. Außerdem wird derzeit die Phospholipidmischung dem Kulturmedium speziell in Form von Liposomen zugesetzt, die bevorzugterweise einen Durchmesser von bis zu etwa 500 nm aufweisen. Vorzugsweise sind die Liposome unilamellar, obwohl auch multilamellare Liposome verwendet werden können. Ein besonders bevorzugter Durchmesser der Liposome liegt bei weniger als etwa 100 nm. Außerdem können Liposome, die durch übliche Methoden aus diesen Phospholipiden hergestellt wurden, entweder in Mischung mit dem oder enthaltend das Protein vom Typ Faktor VIII:c als Träger oder Vehikel zur Verabreichung des Proteine an Patienten verwendet werden. Wenn Trockenmilch als Quelle für die Phospholipide eingesetzt wird, so kann diese dem Medium direkt (besser als in Form von Liposomen) zugesetzt werden.
VWF kann aus Säugetierserum, z.B. von Mensch, Rind, Schwein etc., durch übliche Methoden erhalten werden oder er kann aus Zell-Linien gewonnen werden, die von VWF-produzierenden Zellen, wie etwa Endothelialzellen, stammen. Außerdem kann "rekombinanter" VWF verwendet werden (d.h. VWF, der von genetisch veränderten Zellen stammt). Bei einer Ausführungsform werden VWF-produzierende Zellen, wie etwa Zellen, die zur Produktion von VWF geeigneterweise genetisch verändert wurden, in dem Medium gezüchtet, um dasselbe entweder vor oder gleichzeitig mit der Züchtung der das Protein vom Typ Faktor VIII:c produzierenden Zellen mit VWF zu konditionieren. Andererseits kann der rekombinante VWF unabhängig davon produziert und als exogene Ergänzung dem Medium zugesetzt werden, welches zur Züchtung der das Protein vom Typ Faktor VIII:c produzierenden Zellen verwendet werden soll. Bei einer anderen Ausführungsform werden die Zellen, die das Protein vom Typ Faktor VIII:c produzieren, in geeigneter Weise gentechnisch verändert, d.h. in wirksamer Weise mit einer VWF-Transkriptionseinheit transformiert, sodaß der VWF und das Protein vom Typ Faktor VIII:c von der gleichen Zelle co-exprimiert werden. Bei einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung enthält das Medium, das zur Züchtung der das Protein vom Typ Faktor VIII:c produzierenden Zellen verwendet wird, sowohl VWF auf Grund eines der oben erwähnten Verfahren als auch ein oder mehrere stabilisierende Phospholipide. In diesem Fall kann es wnnschenswert sein, geringere Mengen jeder Komponente im Verhältnis zu den Mengen bei alleinigem Einsatz zu verwenden. Durch Einsatz geeigneterweise erganzter definierter Medien gemäß der vorliegenden Erfindung werden große Mengen an gewinnbarer, stabiler Aktivität vom Tip Faktor VIII:c produziert, die dann isoliert und gereinigt werden können, ohne daß die Notwendigkeit einer Abtrennung von Serumbestandteilen von derselben gegeben wäre. Das erfindungsgemäß verwendete Kulturedium kann außerdem ein von Säugetieren stammendes Serum, z.B. fötales Rinderserum, vorzugsweise in Mengen von weniger als etwa 10 %, insbesondere in Mengen von weniger als etwa 5 % und sogar besonders bevorzugt in Mengen zwischen 0 und 1 % enthalten, obwohl im wesentlichen serumfreies Medium besonders bevorzugt ist. Es können auch andere für Säugetier-Zellkulturen übliche Medienzusätze eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert, die zur Darstellung typischer Verfahren angegeben sind, und die unter anderem die Fähigkeit zur Vermeidung der Serumabhängigkeit bei der Produktion von gewinnbaren aktiven Proteinen vom Typ Faktor VIII:c demonstrieren, indem Phospholipide und VWF als Medienzusätze eingesetzt werden. Die Beispiele sind zur Hilfe beim Verständnis der Erfindung angegeben, beabsichtigen jedoch keinerlei Einschräkung der Erfindung, die durch die folgenden Patentansprüche definiert ist.

BEISPIEL I

Errichtung von Zell-Linien von Chinesischen Hamsterovarienzellen, die humanen Faktor VIII:c exprimieren.

Das in diesem Beispiel verwendete Expressionsplasmid für Faktor VIII:c war RxPy VIII-I, das im Uhrzeigersinn enthält: den Polyomvirus-Verstärker, die erste Führungssequenz der deeiteiligen Adenovirus-Führungssequenz, eine Faktor VIII:c-Transkriptionseinheit, an die ein DHFR-Gen und ein SV40-Polyadenylierungssignal anschließt, sowie ein für Tetracyclin- Resistenz codierendes Gen. Dieses Plasmid wurde in Dihydrofolatreductase(DHFR)-defiziente Chinesische Hamsterovarienzellen durch Cotransformation mit einem DHFR-Expressionsplasmid und anschließende Selektion auf Zellen, die in Abwesenheit zugesetzter Nucleotide wachsen, eingesetzt. Ein besonderer Pool von Transformanten mit der Bezeichnung lig 1 wurde anschließend in steigenden Konzentrationen von Methotrexat (MTX) gezüchtet, um die DHFR- und die Faktor VIII-Gene zu vervielfältigen. Die entstehende Zell-Linie exprimierte hohe Mengen von Faktor VIII-Aktivität, die entweder durch die Fähigkeit zur Gerinnung von Faktor VIII-defizientem Plasma [Clotech (APPT)- Assay] oder durch die Fähigkeit zur Schaffung von Faktor Xa in Gegenwart von Faktor IXa, Phospholipid, Kalzium und Faktor X (Kabi-Cotest-Assay) bestimmt wurden. Die Fähigkeit dieser CHO-Zellen zur Produktion von Faktor VIII:c ist in Tabelle I gezeigt. Die Faktor VIII-Aktivität stieg um das 10.000-Fache mit ansteigenden Gehalten von MTX-Resistenz, was mit der Faktor VIII-Genkopienzahl zusammenhing. Es können auch andere Expressionsvektoren anstelle von RxPy VIII-I verwendet werden, solange diese imstande sind, die Expression von Faktor VIII:c oder von Analoga desselben zu lenken. Derartige Vektoren sind beispielsweise pCVSVL2-VIII (ATCC Nr. 39813, vgl. Europäische Patentanmeldung Nr. 85202121.1) sowie pDGR-2 (ATTC Nr. 53100, vgl. PCT/US86/00774-Deletionsanalog). Andere FaktorVIII: c-Expressionsvektoren können unter Verwendung üblicher Expressionsvektoren und Verfahren hergestellt werden, die beispielsweise das SalI-Fragment von pCVSVL2-VIII oder pSP64-VIII (ATTC Nr. 39812) enthalten Das SalI-Fragment beider Vektoren enthält eine DNA-Sequenz, die für die volle Länge des Faktors VIII:c codiert. Tabelle I: Faktor VIII-Expression in transfizierten und amplifizierten CHO-Zellen Pool * Bedeutet Proben von zwei unhängigen Assays.
Die Plasmide pAdD26SVpA(3) (Kaufman und Sharp, 1982, Mol. Cell. Biol.) sowie das Plasmid pRXPy-VIII-I wurden mit Cla I abgebaut und die entstehende linearisierte DNA wurde in vitro ligiert und mit CaPO4 gemeinsam gefällt, worauf sie zur Transfektion von DHFR-defizienten CHO-DUKX-BII- Zellen verwendet wurde. Man würde annehmen, daß Zellen mit wirksamer DHFR- Expression das Verstärkerelement aus pRXPyVIII-I in Kombination mit dem DHFR-Gen aus pAdD26SVpA(3) enthalten. Die Ergebnisse waren in Übereinstimmung mit dieser Hypothese. Die anschließende Selektion hinsichtlich verstärkter DHFR-Expression durch Vermehrung der Zellen in steigenden Konzentrationen von MTX führt zu Zellen, die das Faktor VIII-Gen und das DHFR-Gen amplifizieren. Bei jedem Niveau der MTX-Selektion wurden Proben des konditionierten Mediums (etwa 10&sup6; Zellen/ml in Alpha-Medium, das mit 10 % fötalem Rinderserum ergänzt wurde) entnommen und wurden mit einem Faktor VIII:c-Aktivitätsassay im Kabi-Cotest-Verfahren untersucht, das zur Verbesserung der Empfindlichkeit auf über 0,05 mE/ml modifiziert worden war. Vergleichbare Resultate wurden auch in dem einstufigen Koagulationstest der aktivierten, partiellen Thromboplastinzeit (APTT) unter Verwendung von Faktor VIII:c-defizientem Plasma erhalten. Alle Proben zeigten eine 30 - 50-fache Thrombinaktivierung. Zur Thrombinaktivierung wurden die Proben 1-10 Minuten mit 0,2 Einheiten/ml Thrombin bei Raumtemperatur vorbehandelt.

BEISPIEL II:

Serumabhängigkeit der Faktor VIII:c-Synthese.

CHO-Zellen (Lig 1 2 A Subklon B10 in 0,1 uM MTX bei 80 % Confluenz), die gespült und mit einem Medium gefüttert wurden, das 10 % FCS oder definiertes Medium (serumfrei, mit einem Gehalt von 5 mg/ml BSA, Insulin, Transferrin, Selen, Hydrocortison und Putrescin enthielt) reicherten die Faktor VIII-Aktivität an. Die Geschwindigkeit des Auftretens in definiertem Medium ist ungefähr um das 4-fache geringer als in serumhaltigem Medium. Der 4-fache Unterschied wird noch größer, wenn die Zellen in Abwesenheit von Serum vermehrt werden. Das ist auf das wirkungslose Spülen der Zellen zurückzuführen. Die Geschwindigkeit des Auftretens von Faktor VIII:c nimmt deutlich linear während 24 Stunden zu, was darauf hindeutet, daß der VIII in dem Medium stabil ist. Dieses Ergebnis stimmt überein mit Ergebnissen, die mit COS-Zellen bei niedrigeren Ausmaßen von VIII-Expression (etwa 10 mE/ml/Tag) erhalten wurden.
Cephalin, eine Mischung von Phospholipiden, kann zumindest einen Teil des Serummangels wieder wettmachen. CHO-Zellen (Lig. 2 A Pool in 20 uM MTX) wurden unahängig voneinander mit und ohne Serum gezüchtet und nach 4 Stunden gespült. Die beiden CHO-Kulturen wurden dann neuerlich aufgespalten und es wurde ein Teil der Serum+- und ein Teil der Serum&supmin;-CHO-Zellen mit 5 uM Caphalin während weiterer 2 Stunden ergänzt. Der andere Teil der Serum&spplus;- und Serum&supmin;-CHO-Zellen wurde nicht mit Cephalin ergänzt. Das Medium wurde nach 6 Stunden und 25 Stunden untersucht und die Ergebnisse sind im Folgenden dargestellt: Bedingungen FVIII:c-Aktivität* Serum Cephalin *mE/ml
Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß Cephalin allein die VIII-Aktivität in Abwesenheit von Serum verstärken kann, daß seine Wirkung jedoch kurzlebig ist (d. hl. nach 2 Stunden beobachtet, nach 25 Stunden jedoch verschwunden ist). Bei einem Versuch wurde die Konzentration von Cephalin erhöht und es ergab sich keine weitere Steigerung in der VIII-Attivität. Dag deutet darauf hin, daß irgendeine Komponente in dem Cephalin nicht geschwindigkeitsbegrenzend war.
Ein Teil der Cephalinwirkung kann durch eine einfachere Mischung von Phospholipiden oder durch einzelne Poospholipide hervorgerufen werden. Die Zellen (Lig 1 2 A.02 Pool in 20 uM MTX) wurden mit 10 % fötalem Kalbsserum oder serumfreiem Medium 24 Stunden gefüttert und dann wurde entweder Cephalin (5 uM) oder eine Mischung (1:4) von Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin (PCPS) zu den serumfreien Kulturen zugesetzt. Die Ergebnisse der Medien, die nach 2 Stunden untersucht wurden, waren: Bedingungen FVIII:c-Aktivität Serumfrei Serumfrei + Cephalin Serumfrei + PCPS
Dieses Ergebnis deutet darauf hin, daß in konditioniertem Medium die Phospholipide allein die VIII-Aktivität erhöhen können.
Die Untersuchung der Thrombin-Aktivierbarkeit von VIII, der in CHO-Zellen exprimiert wird, die unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet werden, deutet darauf hin, daß die Anwesenheit von Serum das Ausmaß der Thrombin-Attivierung herabsetzt. CHO-Zellen (Lig 1 2 A Pool in 20 uM MTX) wurden gespült und mit einem Medium, das 10 % fötales Kalbsserum enthielt, oder mit definiertem Medium (5 mg/ml BSA, Transferrin, Selen, Insulin, Hydrocortison, Putrescin) gefüttert. 24 Stunden später wurde entweder Cephalin oder 10 % FCS zugesetzt und nach weiteren 2 Stunden wurden für jeden Versuch Proben entnommen und die Thrombin-Aktivierberkeit gemessen: Assay nach 26 h. Probenmedium zugesetzt nach 24 h Cobas Koagulationsversuch (-fache Aktivierung) Definiertes Medium Cephalin 10 % abgekochtes FCS
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Anwesenheit von Serum die gebildete Aktivität im Vergleich zu serumfreiem Medium steigert, jedoch die Thrombin-Aktivierbarkeit herabsetzt. Im Gegensatz dazu kann Cephalin die Wirkung des Serums auf die Steigerung der gebildeten VIII-Aktivität kompensieren, setzt jedoch die Thrombin-Aktivierbarkeit nicht herab. Somit produzieren CHO-Zellen in serumfreiem Medium mit Zusatz von Cephalin 2 Stunden vor der Ernte VIII in einem Ausmaß von 1 Einheit/ml und dieses Material zeigt eine 34-fache Thrombin-Aktivierung. Dieser Versuch demonstriert auch, daß der Zusatz von 10 % FCS zu serumfreiem Medium 2 Stunden vor dem Versuch auch das Ausznaß der VIII-Aktivität steigern kann: Diese Fähigkeit ging durch Abkochen des Serums 10 Minuten vor seiner Zugabe nicht verloren Somit ist der für die VIII-Aktivität erforderliche Serumfaktor hitzestabil. Wir schließen daraus, daß der zur Steigerung von VIII erforderliche Serumfaktor 2 Komponenten enthalten kann: ein Phospholipid und einen anderen, hitzestabilen Faktor, der zur Stabilisierung des Phospholipids erforderlich sein kann.
Zur Bestimmung, ob das 10 %-ige Serum für die Expression von Faktor VIII:c in hoch applifizierten CHO-Zell-Linien begrenzend war, haben wir die Wirkung von zunehmenden Serummengen auf die Fähigkeit zur Anregung der Faktor VIII:c-Aktivität in der Zell-Linie 10A1 überwacht. 10A1 ist ein Klon, der aus der Selektion des Lig 1 Pools für das Wachstum in 1 mM MTX stammt. Dieser Versuch zeigte die Wirkung der Zugabe steigender Mengen von fötalem Rinderserum zu den 10A1-Zellen auf die Faktor VIII-Aktivität während 24 Stunden 50 % Serum lieferte dreimal mehr Aktivität in dem während 24 Stunden konditionierten Medium im Vergleich zu 10 % Serum. Andere Ergebnisse deuteten darauf hin, daß die Menge von aktivem Faktor VIII-Antigen entsprechend gesteigert wird, wenn die Zellen in 50 % Serum vermehrt werden. Andere Zell-Linien, die nur geringfügig niedrigere Mengen von Faktor VIII:c exprimieren, zeigen weniger dramatische Steigerungen der Faktor VIII:c-Aktivität beim Wachstum in höheren Serumkonzentrationen. Es scheint hier somit ein beschränkendes Erfordernis für die Expression von Faktor VIII in stärker produzierenden Zellen vorzuliegen, wie jenen, die für eine Produktion von Faktor VIII in industriellem Maßstab wünschenswert wären.

BEISPIEL III

Serumabhängigkeit der Synthese von rFaktor VIII:c in Suspensionskulturen von CHO

Die folgende Tabelle erläutert die Abhängigkeit der Aktivität des rekombinanten Faktors VIII:c (rFVIII) von den Serumgehalten in der Kultur. Ein Produzent von relativ wenig rFVIII, der Klon 1E6, wurde 3 bis 4 Tage in Suspensionskultur in einem Medium gezüchtet, das verschiedene Konzentrationen von fötalem Rinderserum (FBS) enthielt. Serumkonzentration im Medium * rVIII-Aktivität (mE/ml) nach 3-4 Tagen Durchschnittliche Produktivität (E/10&sup6; Zellen/Tag) Definiert * * RPMI 1640 wurde als Grundmedium für alle obigen Versuche verwendet. Das definierte Medium besteht aus Insulin, 5 ug/l; Transferrin, 5 ug/ml, Serenium, 5 ng/ml; Hydrocortison, 10&supmin;&sup8;M, Putrescin, 100 ng/ml; BSA, 5 mg/ml.
Die gleiche Serumabhängigkeit wurde mit anderen rFVIII-abscheidenden CHO-Zell-Linien beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen keine genetische Instabilität, da die ursprünglichen Expressionsausmaße durch Zusatz von Serum wiedergewonnen werden können.
Wir haben gefunden, daß die Zugabe von Phospholipid zum Kulturmedium das Serumerfordernis ersetzen kann, jedoch sind relativ hohe Konzentrationen von Phospholipid notwendig (in der Größenordnung des 10 bis 20-Fachen dessen, das vorher mit serumhaltigem Medium verwendet wurde). Im Hinblick auf die Abhängigkeit der Gewinnung der FVIII-Aktivität von der Phospholipid-Konzentration haben wir gefunden, daß bei der Ergänzung von definiertem Medium (DM) mit 240 ug Sojabohnenlecithin (SL)/ml das Medium (nach 24 Stunden) etwa die doppelte FVIII-Aktivität als ein DM mit einem Gehalt von 160 ug SL/ml und die 5-fache FVIII-Aktivität als ein DM mit einem Gehalt von 80 ug SL/ml lieferte. Nichtsdestoweniger ergab ein DM mit einem Gehalt von 80 ug SL/ml meßbar mehr FVIII-Aktivität als ein DM mit einem Gehalt von 1 % fötalem Rinderserum (FBS) (halbdefiniertes Medium), während das halbdefinierte Medium deutlich mehr FVIII-Aktivität als das DM allein lieferte. Das Ausmaß des während eines Zeitraums von 24 Stunden im definierten Medium in Gegenwart von 240 ug SL/ml Medium erzeugten rFVIIIs ist in signifikanter Weise mindestens ebenso hoch wie das Ausmaß des in DM mit einer Ergänzung von 10 % FBS erzeugten Faktors. Eine Steigerung der Konzentration von SL über 240 ug/ml lieferte keine weitere Steigerung der rVIII- Aktivität bei diesem Versuch. Illustrative Ergebnisse eines Experimentes sind im Folgenden dargestellt: Medium rFVIII-Aktivität nach 24 h Definiertes Medium (DM) DM + Sojabohnenlecithin (SL) (240 ug SL/ml Medium) Medium mit einem Gehalt an fötalem Rinderserum (FBS) (10% FBS)
Diese Werte erläutern den Anstieg der rFVIII:c-Aktivität, die mit relativ hohen Konzentrationen (z.B. 240 ug/ml) von Sojabohnenlecithin- Phospholipid in Abwesenheit von fötalem Rinderserum erzielt wird. Die CHO-Zellen (1E6 in 0,1 umolarem MTX) wurden mit einer Konzentration von 3 x 10&sup5; Zellen/ml in definiertem Medium mit einem Gehalt von 5 g/l Rinderserumalbumin entweder in Abwesenheit oder in Anwesenheit von Phospholipid oder in einem Medium mit einem Gehalt von 10 % FBS während 24 Stunden bei 37ºC suspendiert. Nach beendeter Inkubation wurden Proben des zellfrei konditionierten Mediums durch einen Chromogenassay auf rFVIII:c-Aktivität untersucht.
Wir haben gefunden, daß die Zugabe von Phospholipid in Mengen bis zu etwa 320 ug/ml Medium keine deutliche Änderung des Zellwachstums sowohl in definiertem als auch in halbdefiniertem Medium verursacht. Bei einer Reihe von Versuchen haben wir gefunden, daß die maximale rFVIII-Aktivität in jener Kultur erhalten wurde, bei der 320 ug Phospholipid/ml Medium zugesetzt worden waren. In halbdefiniertem Medium wurden die maximalen Gehalte nach 72 Stunden dann erreicht, wenn 240 ug/ml Sojabonenlecithin zugegeben worden waren. Diese und andere Werte illustrieren die Tatsache, daß Sojabohnenlecithin in stufenweiser Zugabe zu den Kulturen an den Tagen 0, 1, 2 und 3 die Bildung von rFVIII ermöglichte. Die optimalen Konzentrationen lagen bei etwa 240 ug/ml bei diesen und anderen Versuchen, unabhängig von der Herstellungsmethode des Phospholipids.
Die Zellproduktivitäten bei zwei verschiedenen CHO-Zell-Linien wurden in Experimenten bestimmt, die den obigen ähnlich sind und die im Folgenden gezeigt werden: Medium Mittlere Produktivität (E/10&sup6; Zellen/Tag) Zell-Linie - 1E6) Definiert Medium Mittlere Produktivität Zell-Linie - H9.05) Definiert Einheiten wie oben.
Somit sind die Produktivitäten von rFVIII aus rCHO-Zellen in mit Phospholipid ergänztem definiertem Medium zumindest equivalent den Ergebenissen in serumhaltigem Medium. Wie jedoch durch die obigen Werte erläutert wird, ist die Hauptmenge des in dem definiertem Medium produzierten Faktors rFVIII geringer als in serumhaltigem Medium. Das ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß die Zellen in serumhaltigem Medium rascher wachsen und zu höheren Zelldichten gelangen, als daß sie produktiver sind. Bei der Ergänzung des definierten Mediums mit geringen Serummengen (z.B. 1 %) wird das Zellwachstum verbessert. Tatsächlich wachsen die Zellen nach einer kurzen Adaptionszeit fast so gut in semidefiniertem Medium wie in einem mit 10 % FBS ergänzten Medium. Wir haben gefunden, daß die rCHO-Zell-Linien z.B. unsere Linie H9.05) zu ähnlichen Zelldichten heranwachsen und zumindest gleichwertig produktiv (hinsichtlich Faktor VIII) in mit Phospholipid ergänztem halbdefiniertem Medium wie in mit 10 % FBS ergänztem Medium sind.
Außerdem haben wir auch die physikalische Natur der Sojabohnenlecithin-Präparate untersucht. Es wurde ein Größenprofil einer typischen Phospholipid-Zubereitung erstellt, bei welcher das Sojabohnenlecithin in Salzlösung suspendiert, dreimal durch einen Manton-Gaulin Homogenisator laufen gelassen und dann durch ein 0,2 um Filter filtriert worden war. Die durchschnittliche mittlere Größe der Liposcme lag bei etwa 100 nm Durchmesser, was darauf hindeutet, daß die Hauptmenge der aus diesem Prozeß stammenden Liposome kleine unilamellare Vesikel (small unilamellar vesicles, SUVs) darstellen. Der folgende Versuch deutet darauf hin, daß die Größe der Sojabohnenlecithin-Liposome eine wichtige Rolle in der Wirksamkeit des Phospholipids, d.h. der Fähigkeit des SL, eine Steigerung der FVIII: c-Expression zu bewirken spielen kanrL
Eine Sojabohnenlecithin-Zubereitung wurde in Salzlösung erstellt, jedoch nicht hornogenisert. Die Zubereitung enthielt deutlich weniger SUV als eine normale Zubereitung (d.h. eine mit Hoogenisierung) (nur 44 % der Liposome lagen unter 100 nm im Vergleich zu 74 % in einem normalen Präparat). Die Zubereitung enthielt auch eine deutliche Population multilamellarer Vesikel (MVs), deren Durchmesser bei etwa 500 nm lag (30-40 % der gesamten Liposome waren MVs), die in normalen Zubereitungen nur in geringen Mengen vorliegen (in der Regel weniger als 5 %). Die Wirksamkeit dieser Probe lag bei etwa 60 % einer normalen Probe, was darauf hindeutet, daß die Größe der Liposome eine wichtige Rolle in der Wirksamkeit des Phospholipids spielen kann.

BEISPIEL IV

Schweine-VWF kann zur Anregung der Faktor VIII:c-Aktivität von CHO-Zellen, die in Abwesenheit von Serum vermehrt wurden, wirken.
Lig 1 (20 uM MTX) Zellen wurden gespült und mit definiertem Medium (Alpha-Medium, das Insuiin, Transferrin, Selen, Hydrocortison und Putrescin, Glutamin und Penicillin sowie Streptomycin enthielt), das mit steigenden Konzentrationen von Rinderserumalbumin oder mit ähnlichen Konzentrationen von Ovalbumin riickversetzt worden war, gefüttert (Tabelle II ). Beide Proteine können zur Anregung der Expression von Faktor VIII:c wirken. Wenn jedoch teilweise gereinigter VWF dem Medium, das 5 g/l Rinderserumalbmmin enthält, zugesetzt wird, steigt die Faktor VIII:c-Aktivität um das 4-fache oder sogar höher als die bei Vermehrung der Zellen in 10%igem fötalem Rinderserum gewonnenen Mengen. Dies demonstriert auf dramatische Weise die Fähigkeit des VWF zur Anregung der Faktor VIII:c-Aktivität in Abwesenheit von Serum. Dieses Ergebnis wurde mit verschiedenen Zubereitungen von Schweine-VWF und auch mit gereinigtem, humam VWF in doppelter Ausführung erhalten.
Um zu zeigen, daß die Fähigkeit zur Anregung von Faktor VIII:c auf VWF zurückzuführen war, wurde der folgende Versuch unternommen. Zellen, die Faktor VIII:c exprimieren, wurden in Gegenwart eines serumhaltigen Mediums, das aus humanem VWF-defizientem Plasma stammt, inkubiert. Die Faktor VIII:c-Aktivität in den in VWF-defizientem Serum inkubierten CHO Lig 1 Zellen betrug 25 % des Gehalts im Vergleich mit normalem humanem Serum. Wenn das Schweine-VWF-Präparat dem VWF-defizienten Serum rückgegeben wurde, stieg die Faktor VIII-Aktivität auf den Wert des 10%igen fötalen Rinderserums. Diese Wirkung konnte mit einer geringen Menge wie etwa 2,50 ug/ml VWF angeregt werden Vgl. Tabelle IIA. In einem anderen Versuch, bei dem die VWF-Konzentration auf 0,25 ug/ml abgesenkt wurde, betrug die Aktivität nur 50 % jener bei 10 % fötalem Rinderserum.
Die CHO-Zell-Linie 1E6, die während eines 2-3 monatigen Zeitraums an das Wachstum in Abwesenheit von Serum in definiertem Medium angepaßt worden war, wurde bei dem folgenden Versuch verwendet, um zu zeigen, daß exogener VWF das Ausmaß der rVIII-Expression in definiertem Medium in Abwesenheit selbst restlicher Mengen von Einder-VWF steigern konnte. Die im Folgenden angegebenen Werte zeigen, daß eine Ergänzung des definierten Mediums mit etwa 1 Mikrogramm/ml Schweine-VWF eine Expression von rFVIII erlaubt, die dem Ausmaß äquivalent ist, das in mit 10 % fötalem Rinderserum ergänztem Medium gewonnen wird. Da diese Zellen mehr als 3 Monate lang in Abwesenheit von FBS gezüchtet worden waren, waren keine Spuren von Rinder-VWF vorhandem Daher war die becbachtete Steigerung der rFVIII:c-Gehalte nur auf den exogenen VWF zurückzuführen. Wirkung von VWF auf die rFVIII-Expression in Abwesenheit von Serum MEDIUM Definiertes Medium (DM) Medium mit einem Gehalt an FBS (10 %)
Diese Werte zeigen die Steigerung der rFVIII-Aktivität durch exogenen, teilweise gereinigten VWF (Schwein) in Abwesenheit von fötalem Rinderserum. CHO-Zellen (1E6 in 0,1 mikromolarem MTX) wurden mit einer Konzentration von 3 x 10&sup5; Zellen/ml in definiertem Medium mit einem Gehalt von 5 g/l Rinderserumalbumin entweder in Abwesenheit oder in Anwesenheit von teilweise gereinigtem Schweine-VWF (mit etwa 1 Mikrogramm/ml) oder in einem Medium mit einem Gehalt von 10 % FBS während 24 Stunden bei 37ºC suspendiert. Nach beendeter Inkubation wurden die Proben des zellfreien konditionierten Mediums durch einen Chromogenassay auf rFrVIII:c-Aktivität untersucht. TABELLE II: Faktor VIII:c-Expression in definiertem Medium mit an Lig 1 Zellen rückgegebenem VWF Definiertes Medium + Ovalbumin (g/l) Einheiten/ml/Tag mit Schweine-VWF bei 2,5 ug/ml Definiertes Medium + Rinderserumalbumin (g/l) 10 % fötales Rinderserum TABELLE IIA: Wirkung des VWF auf die Produktion von Faktor VIII MEDIUM 10 % fötales Rinderserum definertes Medium mit 5 g/l Rinderserumalbumin 10 % normales Humanserum 10 % VWF-defizientes Humanserum 10 % VWF-defizientes Humananserum mit rückgegebenem Schweine-VWF:
Zur Prüfung der Wirkung des zugesetzten VWF auf die Menge von Faktor VIII:c in dem konditioniertem Medium wurden die Zellen mit einem einstüddigen Puls von 35-S-Methionin gekennzeichnet und in beiden Medien, von denen eines 10 % fötales Rinderserum und 10 % VWF-defizientes Humanserum und das andere 10 % VWF-defizientes Humanserum mit rückgegebenem Schweine-VWF enthielt, verfolgt. Die Ergebnisse zeigten, daß bei Zugabe von VWF zu VWF-defizientem Serum mehr Faktor VIII:c (sowohl die schwere Kette mit 200 kD als auch die leichte Kette mit 76 kD) in dem Medium vorlag. Es wurde keine Veränderung bei der intrazellularen Synthese von Faktor VIII:c beobachtet. VWF-Zugabe zu 10 % fötalem Rinderserum führte zu keiner Änderung im Gehalt des Faktor VIII:c in dem konditionertem Medium. Diese Versuche deuten darauf hin, daß VWF für die Ausscheidung und/oder Stabilität von Faktor VIII:c notwendig ist.

BEISPIEL V

Expression von humanem VWF in COS-Zellen.

Die Klonierung eines Teilsegments der humanen VWF cDNA wurde bereits früher berichtet (Ginsberg, et al. 1985, Science). Im Anschluß an diesen Bericht wurde die volle Länge von VWF cDNA zusammengesetzt und ihre Sequenz bestimmt. Klonierung, Sequenz und Expression von VWF wurden im Detail in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US86/00760, die am 23. Oktober 1986 veröffentlicht wurde, beschrieben. Wir haben einen cDNA-Klon voller Länge in den Expressionsvektor pMT2 eingesetzt, um pMT2-VWF herzustellen (ATCC Nr. 67122). pMT2-VWF enthält die Adenovirus-assoziierten (VA) Gene, den SV40 Replikationsursprung inklusive des transkriptionellen Verstärkers, den größeren späten Adenovirus-Promotor, inklusive der dreiteiligen Adenovirus-Fürung und eine 5' -Spleißstelle, eine 3' -Spleißstelle, die von einem Immunglobulin-Gen stammt, die VWF-Codierungsregion, ein nicht codierendes DHFR-Insert, die SV-40 frühe Polyadenylierungsstelle und die für die Verrehrung in E. coli notwendigen pBR322-Sequenzen. Details dieses Vektors, der ein Abkömmling von pQ2 ist, werden von Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:689-693 (1985) angegeben. Dann wurde pMT2-VWF-DNA zur COS-Zelltransfektion auf übliche Weise hergestellt. 60 Stunden nach der durch DEAE-Dexran mediierten Transfektion der COS-Zellen wurden diese mit 35-S-Methionin gekennzeichnet und das Medium und die Zellextrakte wurden einer Immunopräzipitation mit einem polyklonalen Kaninchen-anti-human-Antikörper (Calbiochem) unterworfen und die Niederschläge durch SDS-Reduktionsgel-Elektrophorese analysiert. Die Ergebnisse zeigen, daß eine signifikante Menge VWF in den transfizierten COS-Zellen synthetisiert wurde, von der der Großteil ausgeschieden wird. In dem konditionierten Medium liegt ein etwa 260 kD Protein und ein 220 kD Protein vor, das der komplett prozessierten Form des VWF ähnlich ist. Etwa 50 % des synthetisierten VWF werden zu der 200 kD Form prozessiert. Bei der Analyse auf Multimerbildung durch nicht reduzierende Gelelektrophorese wurde gefunden, daß der VWF zu Multimeren assoziiert war, die jedoch kein derart extrem hohes Molekulargewicht hatten, wie jene, die im Plasma vorkommen. Die Multimere liegen bei grober Schätzung in einem Bereich von bis zu 1 Million Dalton. Die Analyse des VWF-Antigens in den konditionierten Medien der COS-Zellen deutete auf die Anwesenheit von humanem VWF in einem Ausmaß von 0, 35 ug/ml. Andere Analysen deuteten darauf hin, daß der in COS-Zellen exprimierte VWF spezifisch sowohl Plättchen als auch Kollagen bindet.

BEISPIEL VI

Der rekombinante VWF kann die Expression von humanem Faktor VIII:c anregen.
Das VWF-Expressionsplasmid pMT2-VWF wurde auf COS-Zellen durch DEAE- Dextran-mediierte Transfektion übertragen und 36 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium durch ein serumfreies Medium (DMEM ohne Serum) ersetzt. 72 Stunden später wurde das konditionierte COS-Zellen-Medium geerntet und für CHO Lig 1-Zellen (20 uM MTX-resistent) verwendet, die vorher mit serumfreiem Medium (bei 10&sup6; Zellen/ml) gespült worden waren. 24 Stunden später wurde das Medium von den CHO-Zellen entfernt und auf Faktor VIII-Aktivität untersucht. Die Resultate sind unten gezeigt und werden mit den Faktor:c-Aktivitäten aus CHO-Zellen verglichen, die in 10 % fötalem Rinderserum und in serumfreiem Medium 24 Stunden vermehrt worden waren. Medium auf CHO Lig 1 (20 uM MTX) mE/ml Faktor VIII:c Konditioniertes Medium von Mock-transfizierten COS-Zellen Konditioniertes Medium von VWF-transfizierten COS-Zellen * 10 % fötales Rinderserum Serumfreies Medium * In diesem Versuch enthielt das konditionierte Medium 0,3 ug/ml humanen VWF.

BEISPIEL VII: Einsetzung, Expression und Amplifikation der VWF-Gene in CHO-Zellen, die Faktor VIII:c exprimieren.

Zur Expression von VWF in Ovarienzellen von Chinesischen Hamstern (CHO) wurde zur Amplifizierung der Plasmidsequenzen ein zweiter Expressionsvektor, pMT2ADA-VWF (ATCC #67172), mit einem Selektionsprotokoll für Zellen, die das Enzym Adenosin-Deaminase überexprimieren, verwendet (Kaufman et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:3136; U.S. Serial Nr. 619,801). Eine Faktor VIII:c exprimierende Zell-Linie, die von Lig 1 2-a (aus Beispiel I) in 1 mM MTX geklont und als 10A1 bezeichnet worden war, wurde als Rezipient für die Übertragung von pMT2ADA-VWF verwendet. pMT2ADA-VWF wurde durch Protoplastfusion in die 10A1-Zellen eingesetzt (Sandri-Goldin et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1: 743). E. coli DH5-Zellen, in denen pMT2ADA-VWF untergebracht war (DH5 wurde zur Minimierung der homologen Rekombination und Deletion der VWF-Sequenzen verwendet), wurden in 50 ml L-Brühe mit einem Gehalt von 50 ug/ml Ampicillin bis zu einem A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,6 gezüchtet. Chloramphenicol in einer Menge bis zu 250 ug/ml wurde zugesetzt und die Kultur bei 37ºC weitere 16 Stunden inkubiert, um die Plasmidkopienzahl zu vervielfältigen. Eine Protoplastensuspension wurde nach der Beschreibung (Sandri-Goldin et al., 1981) hergestellt, zu den 10A1-Zellen in einem Verhältnis von etwa 1-2 x 10&sup4; Protoplasten/Zelle zugesetzt und bei 2000 Upm 8 Minuten in einer IEC-Zentrifuge Modell K auf die Zellen zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand abgesaugt und 2 ml Polyethylenglykollösung (50 g PEG 1450, Baker Chem. Co., in 50 ml Dulbeccos modifiziertem Medium) wurden auf jede Platte aufgebracht. Die Zellen wurden neuerlich 90 Sekunden bei 2000 Upm zentrifugiert, die Polyethylenglykollösung abgetrennt und die Platten dreimal mit Alpha-Medium, das 10 % (v/v) fötales Kalbsserum enthielt, gespült. Dann wurden die Zellen in Gewebekulturschalen in ein Medium eingesetzt, das 100 ug/ml Kanamycin, 10 ug/ml jeweils Penicillin und Streptomycin sowie 20 uM MTX enthielt. 2 Tage später wurden die Zellen trypsinisiert und in selektives ADA Medium mit 10 % dialysiertem fötalem Kalbsserum, 0, 1 um Deoxycoformycin, 10 ug/ml Penicillin und Streptomycin in Gegenwart und in Abwesenheit von 20 uM MTX in Subkulturen 1:15 gezüchtet. Das ADA Selektivdmedium (AAU) enthielt 1,1 mM Adenosin, 10 ug/ml Alanosin und 1 uM Uridin. In der Folge wurde gezeigt, daß die Abtrennung der MTX-Selektion zu diesem Zeitpunkt zu einer Abnahme der Faktor VIII:c-Expression führte. In der Folge wurde das MTX in dem ADA Selektivmedium belassen.
Es war möglich, das VWF-Gen durch Selektion hinsichtlich Wachstum in steigenden Konzentrationen von 2'-Deoxycoformycin (dCF) in Gegenwart cytotoxischer Konzentrationen von Adenosin zu amplifizieren. Aus den 10A1-Zellen wurde ein Taansformanten-Pool (6 Kolonien) hergestellt, die 6 Kolonien im Pool in Anwesenheit von 20 uM MTX auf ADA selektioniert. Das ADA-Selektionsmittel wurde verändert, indem successive die Konzentration von 2' -Deoxycoformycin in Gegenwart von 20 uM MTX angehoben wurde (Stufen von 0,1 uM, 0,5 uM, 1,0 uM und 2,0 uM). In jeder Stufe wurde die Bildung von VWF und Faktor VIII:c nach 24 Stunden in Gegenwart von 10 % fötalem Kalbeserum (FCS) oder in definiertem Medium gemessen. Die Ergebnisse sind im Folgenden zusammengefaßt: Coexpression von VWF und FVIII:c in CHO-Zell-Linien Zell-Linie Selektion VWF Antigen Faktor VIII:c u Einheiten/Zelle * - in definiertem Medium; ** = in Medium mit einem Gehalt von 10 % fötalem Kalbsserum; VWF-Antigen wurde durch einen ELISA-Assay unter Verwendung von affinitätsgereinigtem Kaninchen-Anti-VWF-Antiserum (Calbiochem-Behring, 782301), gereinigtem VWF-Antigen aus normalen humanen Plasma-Pools als Standard und Vergleich, und IgG, isoliert von Calbiochem-Behring, 782301, bestimmt und mit Alkaliphosphatase konjugiert. Die Faktor VIII:c-Aktivität wurde durch den in Beispiel I beschriebenen Chromogenassay bestimmt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die VWF-Expression mit ansteigender ADASelektion zunahm. Außerdem war die Expression von Faktor VIII:c nicht von der Anwesenheit von Serum abhängig, wie dies bei der Linie 10A13-a in 2 uM dCF ur4 1000 uM MTX beobachtet wurde, die 1,4 u Einheiten/Zelle/Tag Faktor VIII:c in definiertem Medium exprimiert.

BEISPIEL VIII: Fusion von Faktor VIII:c exprimierenden CHO-Zellen und VWF exprimierenden CHO-Zellen.

Das VWF-Gen wurde in DHFR-defizienten CHO-Zellen eingesetzt (DUKX-B11, Chasin und Urlaub, 1980, Proc. Natl. Aca& Sci. 77: 44216). Es wurden zwei Wege beschritten, um Zellen zu erhalten, die entweder MTX-Resistenz oder dCF-Resistenz in Kombination mit VWF-Expression exprimierten. Dann kann jede Zell-Linie anschließend verwendet werden, um an andere Zellen zu fusionieren, die Faktor VIII:c exprimieren und die Fähigkeit zur Selektion entweder hinsichtlich MTX- oder hinsichtlich dCF-Resistenz besitzen.

MTX-Amplifikation in DHFR-defizienten CHO-Zellen

Die Plasmide pMT2VWF und pAdD26SVpa(3) wurden 10:1 gemischt und durch CaPO&sub4;-Copräzipitation in CHO DUKX-B11-Zellen nach der Beschreibung von Kaufman und Sharp (1982, J. Mol. Biol. 150:601) transfiziert. Die Zellen wurden durch Wachstum in Abwesenheit von Nucleosiden auf den DHFR-positiven Phänotyp selektioniert und die Kolonien wurden vereinigt und auf zunemende MTX-Resistenz gesichtet. Die Ergebnisse zeigten, daß die VWF-Expression mit zunemender MTX-Resistenz anstieg, welche Ergebnisse in der folgenden Tabelle angegeben sind: Selektion

dCF-SelekLion von VWF in DHFR-defizienten CHO-Zellen

Das Plasmid pMT2ADA-VWF wurde in DUKX-B11-CHO-Zellen nach der Beschreibung von Beispiel VIII eingesetzt und die Zellen wurden auf Wachstum in selektivem ADA Alpha-Medium mit 4 uM Xyl-A, 0,03 uM dCF, 10 ug/ml Hypoxanthin, 10 ug/ml Thymidin und 10 ug/ml Penicillin und Streptomvcin selektioniert. Ein Klon PM5F, der 3-5 pg VWF/Zelle/Tag exprimierte, wurde abgeleitet. Dieser Klon wurde anschließend zur Fusion an Faktor VIII: c-Zell-Linien und als Rezipient für die Einsetzung von Faktor VIII:c-Genen verwendet.

Fusion von Zell-Linien, die Faktor VIII:c und VWF exprimieren

Das Faktor VIII:c-Expressionsplasmid pLA2 ist beschrieben (Toole et al., 1986, Proc. Natl. Acad; Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US86/00774). Dieses Plasmid wurde in DUKX-B11 CHO-Zellen durch Protoplastfusion mit Selektion auf DHFR aus der 3'-Region des Faktor VIII- DHFR-Transcripts eingesetzt (vgl. PCT/US86/00774). Es wurde durch Selektion auf MTX-Resistenz gegen 1,0 uM MTX eine Zell-Linie abgeleitet, die die Bezeichnung LA3-5 erhielt. Diese Zell-Linie exprimiert eine deletierte Form des Faktors VIII:c mit 3-5 u Einheiten/Zelle/Tag (in 10 % fötalem Kalbsserum). Dieser modifizierte Faktor VIII:c bindet auch an VWF und erfordert diesen für eine effiziente Synthese. LA3-5 wurde an PM5F fusioniert und es wurden Hybride ausgesucht, die Phänotypen sowohl mit MTX-Resistenz als auch mit dCF-Resistenz exprimierten.
Zum Zweck der Fusion wurde PMSF mit Diethylepyrocarbonat (0,03 %, 30 Minuten auf Eis) behandelt, um den PM5F abzutöten. Diese Zellen wurden dann durch Polyethylenglykol-induzierte Zellfusion an LA3-5 fusioniert; DEPC-bebandelte pMSF-Zellen wurden auf LA 3-5 (1,5 X 10&sup6; Zellen) bei 2000 Upm 8 Minuten in einer IEC-Zentrifuge Modell K zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand abgetrennt und es wurden 2 ml 50 %-ige PEG- Lösung zugesetzt. Das PEG wurde 45 Sekunden belassen und die Zellen wurden sorgfältig mit serumfreiem Medium gewaschen. Die Zellen wurden mit serumhaltigem Medium 48 Stunden platiert gelassen und wurden dann in Selektivmedium mit einem Gehalt von 4 uM Xyl-A, 0,03 uM dCF in Anwesenheit von 10 ug/ml jeder der folgenden Substanzen: Thymidin, Hypoxanthinin, Streptomycin und Penicillin, in Subkulturen gezüchtet. Es war jedoch nicht notwendig, Thymidin und Hypoxanthin mitzuverwenden. Es wurde ein Pool von Hybriden gewonnen, die 0,73 pg/Zelle/Tag VWF und 0,2 - 2,0 Einheiten/ml/Tag Faktor VIII:c exprimierten. Der Pool wurde anschließend in Abwesenheit von Thymidin und Hypoxanthin und in Gegenwart von 0,5 uM MTX gezüchtet. Diese Zellen wurden in Alpha-Medium mit 4 uM Xyl-A, 0,03 uM dCF und 0,5 uM MTX geklont, um die folgenden Klone zu gewinnen: Faktor VIII:c und VWF Coexpression in CHO-Zellen Klon VWF Expression (pg/Zelle) Faktor VIII:c Expression (u Einheiten/Zelle-Medium) definiert
Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit von VWF- und Faktor VIII:c- coexprimierenden Zell-Linien zur Produktion hoher Gehalte von Faktor VIII:c in definiertem Medium.

Einsetzung von Faktor VIII:c-Genen in Zellen, die VWF exprimieren.

Eine Faktor VIII:c-Deletionsmutante von 907 Aminosäuren wurde durch Heteroduplex-Mutagenese konstruiert (PCT/US86/00774), wobei direkt die 90 kD Spaltungsstelle (am Rest 740) an die 76 kD Spaltungsstelle (bei 1647) fusioniert wird. Das entstehende Plasmid p90-76R hat die Faktor VIII:c Codierungsregion 5' an der polycistronischen Transkriptionseinheit in pMT2. Die Protoplasten von E. coli HB101, in denen dieses Plasmid untergebracht ist, wurden hergestellt und nach der Beschreibung von Beispiel VIII an die VWF-exprimierende Zell-Linie PM5F fusioniert. 48 Stunden nach der Gewinnung aus der Protoplastfusion wurden die Zellen in DHFR Selektionsmedium in Subkulturen gezüchtet (Alpha-Medium ohne Nucleoside mit 10 % dialysiertem fötalem Kalbsserum, 4 uM Xyl-A und 0,03 uM dCF). Nach zwei Wochen wurden die Transformanten isoliert und auf Faktor VIII: c-Expression untersucht. Etwa 20 % der entstandenen Transformanten exprimierten sowohl VWF als auch Faktor III:c. Die Ergebnisse für einen Transformanten sind im Folgenden angegeben: Zell-Linie Faktor VIII: c-Aktivität Einheiten/Zelle Einheiten/ml defin. Medium
Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit zur Selektion hinsichtlich des DHFR-Phänotys in der Zell-Linie PM5F und zur Coexpression von Faktor VIII:c und VWF, um die Serumabhängigkeit der Faktor VIII:c-Expression zu vermeiden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins vom Typ Faktor VIII:c, welches Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a) Transfektion von Säugetierzellen mit einem Gen, das für ein Protein vom Typ Faktor VIII:c codiert;

b) Züchtung der Zellen in einem serumfreien Kulturmedium, das mit einer Zusammensetzung konditioniert ist, die von Willebrand-Faktor (VWF), ein Phospholipid oder eine Mischung der beiden enthält;

c) Gewinnung des Proteins vom Typ Faktor VIII:c aus dem Kulturmedium.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Phospholipid eine Phospholipidmischung ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem der VWF einen auf natürliche Weise produzierten Säugetier-VWF umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem der VWF einen rekombinanten Säugetier-VWF umfaßt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4, bei welchem die Säugetierzellen mit rekombinanten, ein rekombinantes VWF-Gen exprimierenden Säugetierzellen co-gezüchtet werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4, das weiters die Schritte der Transfektion der Säugetierzellen mit einem für VWF codierenden Gen und die Züchtung der Zellen zur Co-Expression des VWF und des Proteins vom Typ Faktor VIII:c umfaßt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem das Phospholipid ausgewählt ist aus Cephalin, Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylinositol, Phosphatidyiethanolamin, Sojabohnen-Lecithin oder einer Mischung derselben.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem das Phospholipid in Form getrockneter Milch eingesetzt wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das weiters den Schritt der Amplifizierung des für das Protein vom Tip Faktor VIII:c codierenden Gens umfaßt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, das weiters den Schritt der Amplifizierung des für VWF codierenden Gens umfaßt.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem das Protein vom Tip Faktor VIII:c, das aus dem Kulturredium gewonnen wird, mit VWF assoziiert ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, das weiters den Schritt der Abtrennung des Proteins vom Tip Faktor VIII:c von dem VWF umfaßt.