CN103796659A

CN103796659A - 包含胶原、透明质酸衍生物和哺乳动物脐带来源干细胞的软骨细胞治疗物

Info

Publication number: CN103796659A
Application number: CN201280044621.9A
Authority: CN
Inventors: 金仙美; 李荣濬; 崔容秀
Original assignee: Chabio and Diostech Co Ltd
Current assignee: Chabio and Diostech Co Ltd
Priority date: 2011-07-13
Filing date: 2012-07-11
Publication date: 2014-05-14
Also published as: WO2013009102A2; JP2014520844A; KR20130009651A; KR101422689B1; WO2013009102A3; US20140227235A1

Abstract

本发明涉及一种医学复合性生物材料。更具体地，本发明涉及一种包含胶原和透明质酸衍生物的医学复合性生物材料。还有，本发明涉及一种软骨细胞治疗剂，其使用所述生物材料和源自哺乳动物脐带的干细胞。所述生物材料不导致免疫反应，具有优越的持久性，而且包含所述生物材料和干细胞的所述软骨细胞治疗剂使得能进行关节镜手术，由此减少患者的疼痛并有效治疗退行性关节炎和软骨损伤。

Description

包含胶原、透明质酸衍生物和哺乳动物脐带来源干细胞的软骨细胞治疗物

相关申请

本申请要求在韩国知识产权局于2011年7月13日提交的韩国专利申请No.10-2011-0069551的权益，其公开内容通过提述完整并入本文。

发明领域

本发明的一个或多个实施方案涉及一种包含胶原和透明质酸衍生物的生物材料，以及包含所述生物材料和脐带来源的干细胞的软骨细胞治疗物。

发明背景

胶原是在人中发现的最普遍的蛋白质，而且是哺乳动物中最大量的蛋白质，其构成身体所有蛋白质的约25%至约35%。更具体地，胶原是骨、腱和韧带的重要组分，而且主要维持器官的结构。胶原可从牛或猪的皮肤容易地提取。然而，由于胶原源自非人动物，因此胶原在对人体施用时具有免疫应答方面的问题。

相反，与胶原不同，透明质酸的结构在从细菌到哺乳动物的物种之间没有差异，如此透明质酸不充当抗原。因此，透明质酸目前被用作替代物填充剂(filler)材料。透明质酸的结构在所有物种中均相同，且如此具有极小的免疫应答，这解决了胶原填充剂的问题。

透明质酸在体内经由两种途径分解：第一个途径是经由透明质酸酶，而第二个途径是经由透明质酸粘附于要吞入细胞的细胞受体，然后通过溶酶体中的酶分解。透明质酸的生物降解发生得非常快，而且已知透明质酸在约0.5天至约数天内完全分解。因此，透明质酸随着时间在体内分解，如此对维持透明质酸的效果存在限制。

同时，软骨组织与其他组织不同，其不具有神经和血管，因此软骨组织一旦受损就不自我再生。因此，手术如人工关节手术、骨微裂(microfracture)、或镶嵌成形术(mosaicplasty)是不可避免的一种常规治疗方法。然而，这类方法并不提供完全的解决办法，因为存在问题如植入的人造关节的持久性(其仅持续10年左右)和由于手术引起的继发性感染。

由于最近在组织工程学和再生药物中的进展，开发出一种软骨细胞治疗以通过使用人细胞使软骨组织完全再生(KR10-2010-0084142A)。常规的软骨细胞治疗是自体软骨细胞治疗，其中取患者软骨组织的一部分来体外大量培养该组织达约4周。首先，清洁患病区域，然后从患者胫骨提取骨膜组织，并将骨膜组织置于软骨区域上并密封，然后以悬浮状态移植在受损软骨区域中培养的细胞。这是一种自体软骨细胞治疗，其中将血纤蛋白胶(fibrin glue)应用于所述区域，该区域被密封以防止细胞漏出。

然而，该方法具有局限性，因为当受损区域较大时，仅用培养的细胞可能不能充分治疗患病区域，且可能受重量挤压使得细胞漏出而阻止组织再生。

在克服这类问题并开发有效的生物材料和软骨治疗时，开发出一种新的生物材料，其具有极小的免疫反应并且能在长时间内维持有效性。此外，发现可将干细胞加入这种要用作软骨治疗物的新生物材料来完善本发明。此外，当将交联的透明质酸衍生物与胶原混合，然后向其混合干细胞以在体外培养它们来制备胶原复合物时，发现了使胶原复合物不膨胀或收缩的透明质酸与胶原最佳混合比率。

发明概述

本发明的一个或多个实施方案包括一种包含胶原和透明质酸或其衍生物的组合物，和包含所述组合物的生物材料组合物。

本发明的一个或多个实施方案包括一种软骨细胞治疗物，其包含胶原、透明质酸或其衍生物、和干细胞。

其他方面将部分在以下说明中列出，部分根据说明书将是明显的，或者可通过实践所呈现的实施方案学到。

附图简述

这些和/或其他方面根据以下实施方案说明，连同所附附图将变得明显和更容易领会的：

图1显示依照本发明一个实施方案的实施例1的脐带来源干细胞的增殖效力。所述干细胞能进行25轮传代培养并在20轮的传代培养中进行60轮细胞分裂；

图2显示实施例2的脐带来源的干细胞在RNA水平上表达胚胎干细胞标志物；

图3和4是根据实施例3的脐带来源干细胞传代培养的间充质干细胞标志物的分析结果；

在这一方面，x轴指示强度而y轴指示细胞数(计数)。在图上写出的CD标志物可基于x轴和y轴的变化区分；

如图4中显示的，可以得出结论CD29、CD73、CD105和CD166(间充质干细胞的特性)维持长达20轮的传代培养，但从25轮以后的传代培养中丧失；

图5是显示实施例4的脐带来源干细胞的分化效力(分化成软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞)的图；

图6和7显示根据实施例5和7所制基质中胶原对透明质酸衍生物的比率，对形态学的维持的分析结果；

图8和9显示当脐带来源的干细胞与基质混合时，实施例7中制备的基质中细胞的增殖和存活率；

可以得出结论，将透明质酸衍生物与脐带来源的胶原混合的那些实验组显示比仅由胶原形成的对照组有更高的增殖效力和存活率；

图10显示依照实施例8的脐带来源干细胞的体内分化(小鼠皮下)；

图11显示实施例8的脐带来源干细胞经各种方法染色的体内分化(小鼠皮下)；

图12和13显示，损伤家兔膝盖的关节软骨，直至软骨下骨(subchondralbone)，然后制备非治疗组、仅包含支持物的组(对照组)、以及将脐带来源干细胞与支持物混合的组(实验组)，再进行移植的结果，其中实验组在移植8周后和16周后显示软骨的完全再生；

图14显示实施例9的脐带来源干细胞混合物的软骨(家兔关节)再生效果，经H&E染色证明；和

图15显示实施例9的脐带来源干细胞的混合物的软骨(家兔关节)再生效果，经II型胶原染色证明。

发明详述

现将对实施方案进行详细提述，其例子已例示在所附附图中，其中贯穿本文类似的参考数字指类似的要素。在此方面，本发明的实施方案可具有不同的形式且不应理解为受限于本文列出的说明。因此，通过参照附图仅在下文描述实施方案以解释本发明的方面。

本发明提供一种生物材料组合物。

本发明提供一种依照一个实施方案包含胶原和透明质酸或其衍生物的组合物。

所述胶原可以是哺乳动物胶原，且优选地是人脐带来源的胶原。此外，所述人脐带来源的胶原可以是I型胶原。哺乳动物胶原可通过使用常规技术从哺乳动物的各种组织获得。

更具体地，可通过以下方法制备人脐带来源的胶原，包括：研磨用过氧化氢处理过的人脐带组织；将磨碎的人脐带组织用乙酸和胃蛋白酶处理，然后将其离心；设置从离心获得的上清液pH为7并向其加入NaCl以浸没胶原；并分离浸没的胶原。

所述透明质酸衍生物可通过一种制备具有很好的生物相容性和生物降解性的透明质酸或其盐衍生物的方法制备，其可用作包含干细胞的细胞治疗产品的细胞载体。在此情况中，所述透明质酸衍生物可以是微粒。

此外，所述透明质酸衍生物可通过使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)交联透明质酸来制备。还有，可将制备用于医学目的的透明质酸衍生物研磨成微米级大小。

很久以来就知晓透明质酸，其为一种广泛用于自然界的生物相容性材料。透明质酸是糖胺聚糖，它是胞外基质(ECM)的基本组分而且是其中N-乙酰葡糖胺单体和D-葡糖醛酸连续连接的线性多糖。透明质酸是生物组织的骨架材料，其是细胞的形态发生、分化和分裂所必要的，并且促进伤口愈合。透明质酸在水性溶液中是一种水不溶性凝胶(由于醚键)，但显示很好的弹性和高水分吸收能力，如此透明质酸在一定时间段内在体内维持其形状，然后分解以被身体吸收。

天然的透明质酸在注射到体内时被透明质酸酶快速分解，因此，天然的透明质酸需要通过各种方法交联或通过化学材料(如苯甲醇)结构性变形以控制分解速度。

在依照本发明一个实施方案的医学生物材料组合物中，透明质酸或其盐没有具体限制。所述透明质酸或其盐可以约1%至约50%的浓度添加到约0.1N至约10N的碱性水溶液中，并以基于透明质酸或其盐的重复单元量计约0.01%至约200%等同比率的量向其添加交联剂。优选地，以对应于约0.1%至约50%的等同比率的量添加交联剂以均一混合透明质酸或其盐来制备混合物溶液。用于制备混合物溶液的时间量没有具体限制，且优选可为约1小时至约48小时。

包含两个或更多个环氧官能团的交联剂没有具体限制，但优选的例子包括化合物如1BDDE、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)、1,6-己二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚四亚甲基二醇二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚、双甘油缩水甘油醚、甘油聚缩水甘油醚、三甲基丙烷聚缩水甘油醚、1,2-(二(2,3-环氧丙氧基)乙烯、季戊四醇聚缩水甘油醚和山梨糖醇聚缩水甘油醚。

混合物溶液发生反应，然后用盐溶液清洗以除去不反应的产物。将从其获得的产物通过使用粉磨器磨成微型大小，然后用盐溶液清洗。将从其获得的清洗产物研磨以调整其颗粒大小，并将其浓度调整为优选约0.5%至约10%，更优选约1%至约3%。之后，将从其获得的研磨后产物在约100℃或更高的温度(优选约121℃或更高)高压灭菌以制备透明质酸衍生物，其最终可作为生物材料组合物医学应用于人体。

交联的透明质酸衍生物是一种水凝胶类型的材料，其具有网状结构，因此当交联的透明质酸衍生物接触周围水分子时，该交联的透明质酸衍生物膨胀且其体积增加。然而，凝胶类型的胶原与透明质酸不同，其在相同条件下收缩，如此其体积减小。然而，依照在本发明中开发的方法，当透明质酸或透明质酸衍生物以特定比率与胶原混合来制备组合物时，所述组合物和干细胞可混合为使得在体外培养干细胞时不能发生膨胀或收缩。

透明质酸衍生物与哺乳动物脐带来源的胶原的混合比率可以是约1:10至约10:1、约1:5至约5:1，优选地可以是约1:1至约1:3。还有，哺乳动物脐带来源的干细胞可以以约1.0×10⁴至约1.0×10¹¹细胞/ml、约1.0×10⁵至约1.0×10⁹细胞/ml，优选约1.0×10⁶至约1×10⁷细胞/ml的浓度与透明质酸衍生物和哺乳动物脐带来源的胶原凝胶混合。

当将本发明的医学复合性生物材料移植到体内时，周围的人组织细胞移动到医学复合性生物材料中。所述人组织细胞分泌胞外材料，如此甚至在所述医学复合性生物材料降解时，胞外材料也维持期望的效果。在这一方面，所述医学生物材料组合物显示不能从常规技术预期的结果。

依照本发明的另一个方面，提供一种软骨细胞治疗物，其包含干细胞、胶原、和透明质酸或其衍生物。

在本发明的软骨细胞治疗物中，所述干细胞可以是哺乳动物干细胞。哺乳动物脐带来源的干细胞包含哺乳动物脐带提取物和用于分离或培养哺乳动物脐带来源的干细胞的干细胞培养基组合物，其可通过在用细胞粘附蛋白包被的容器中连续传代培养来制备。在此方面，所述干细胞培养基不能包含血清。

而且，所述哺乳动物脐带来源的干细胞可通过一种从哺乳动物脐带分离干细胞的方法制备，所述方法包括(i)添加用于分离或培养哺乳动物脐带来源的干细胞的细胞培养基组合物(包含哺乳动物脐带提取物且无血清)以从用细胞粘附蛋白包被的容器除去血，并向其加入分块的哺乳动物脐带组织以对其培养；和(ii)将从其获得的培养产物用含有干细胞分离酶的培养基处理以分离哺乳动物脐带来源的干细胞。还有，所述哺乳动物可以是人、猪、马、牛、小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、山羊和绵羊。

还有，所述哺乳动物脐带提取物可通过一种制备哺乳动物脐带提取物的方法制备，所述方法包括(i)将分块的脐带放置到缓冲液中以搅拌获得溶液，并(ii)回收从过程(i)所获溶液的上清。

在从哺乳动物脐带分离干细胞的方法中，其中过程(ii)的干细胞分离酶可以是胶原酶，优选地，是I型胶原酶而(ii)中I型胶原酶的量可以是约180U/ml至约220U/ml，其可处理约2小时至约6小时。还有，在开始过程(i)后过程(ii)可进行约1天至约10天。

还有，所述细胞粘附蛋白可以是但不限于哺乳动物脐带来源的胶原、明胶、纤连蛋白、核纤层蛋白、或聚-D-溶素。此外，哺乳动物脐带来源的干细胞可以是人脐带来源的干细胞。

在依照本发明一个实施方案的软骨细胞治疗物中，胶原可从哺乳动物脐带获得。所述胶原可通过各种方法获得。然而，优选地，哺乳动物脐带来源的胶原可通过以下方法制备，包括研磨用过氧化氢处理过的哺乳动物脐带；将研磨后的哺乳动物脐带组织用乙酸和胃蛋白酶处理，然后将其离心；设置从离心获得的上清液pH为7并向其加入NaCl以浸没胶原；并分离浸没的胶原。

在依照本发明一个实施方案的软骨细胞治疗物中，所述透明质酸衍生物可通过一种制备具有很好的生物相容性和生物降解性的透明质酸或其盐衍生物的方法制备，其可用作包含干细胞的细胞治疗产品的细胞载体。在此情况中，所述透明质酸衍生物可以是微粒。

此外，所述透明质酸衍生物可通过使用BDDE交联透明质酸衍生物获得。还有，可将制备用于医学目的的透明质酸衍生物研磨成微米级大小。

在依照本发明一个实施方案的软骨细胞治疗物中，透明质酸或其盐没有具体限制。所述透明质酸或其盐可以约1%至约50%的浓度添加到约0.1N至约10N的碱性水溶液中，并以基于透明质酸或其盐的重复单元量计约0.01%至约200%等同比率的量向其添加交联剂。优选地，交联剂以对应于约0.1%至约50%的等同比率的量添加以均一混合透明质酸或其盐来制备混合物溶液。用于制备混合物溶液的时间量没有具体限制，且优选为约1小时至约48小时。

在所述混合物溶液反应后，将混合物溶液用盐溶液清洗。将从其获得的清洗产物磨成微型大小以调整期颗粒大小，并将其浓度调整为约1%至约3%。之后，将从其获得的研磨后产物在约100℃或更高的温度(优选约121℃或更高)高压灭菌以制备透明质酸衍生物，其最终可应用于人体，其可用于依照本发明一个实施方案的软骨细胞治疗。

在依照本发明一个实施方案的软骨细胞治疗物中，透明质酸衍生物与哺乳动物脐带来源的胶原的混合比率可以为约1:10至约10:1、约1:5至约5:1，优选可以为约1:1至约1:3。还有，哺乳动物脐带来源的干细胞可以以约1.0×10⁴至约1.0×10¹¹细胞/ml、约1.0×10⁵至约1.0×10⁹细胞/ml，和优选约1.0×10⁶至约1×10⁸细胞/ml的浓度与透明质酸衍生物和哺乳动物脐带来源的胶原凝胶混合。

依照本发明一个实施方案的软骨细胞治疗物优选可具有水凝胶形式。因此，所述软骨细胞治疗物可容易地注射到受损的软骨区域。还有，可将软骨细胞治疗物作为组合物用于一种包含该软骨细胞治疗物的软骨细胞治疗注射剂。

词“用于注射的组合物或用于注射的细胞治疗”指一种可经由胃肠外注射(如针头注射)注射到缺陷区域或其临近区域中的药物组合物，其包含干细胞以矫正组织缺陷。

根据其形式，可按需要的适宜地向其加入悬浮剂、增溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、防吸附剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节剂、安抚剂(soothing agent)、缓冲剂、含硫还原剂、抗氧化剂等。

悬浮剂的例子包括甲基纤维素、聚山梨醇酯80、羟乙基纤维素、阿拉伯胶、黄芪胶(tragacanth gum)、羧甲基纤维素钠和聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯。

增溶剂的例子包括聚氧乙烯硬化的蓖麻油、聚山梨醇酯80、烟碱、聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯、macro bone、蓖麻油脂肪酸乙酯等。

稳定剂的例子包括葡聚糖40、甲基纤维素、明胶、亚硫酸钠和偏硫酸钠(sodium meta sulfate)。

等渗剂的例子包括D-甘露醇和山梨糖醇。

防腐剂的例子包括p-苯甲酸甲酯、乙基p-苯甲酸、山梨酸、酚、甲酚和氯化甲酚。

防吸附剂的例子包括人血清清蛋白、卵磷脂、葡聚糖、乙烯氧化物丙烯氧化物共聚物、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚氧乙烯氢化的蓖麻油和聚乙二醇。

含硫还原剂的例子包括N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高半胱氨酸、硫辛酸、硫双乙醇、三乙醇胺、含硫甘油、含硫山梨糖醇、巯基乙酸(thioglycolic acid)及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、和包含巯基基团的化合物如C1-C7含硫烷酸(thio alkane acid)。

抗氧化剂的例子包括螯合剂如异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、α-生育酚、生育酚乙酸酯、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸盐、L-抗坏血酸硬脂酸盐、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、大蒜酸(garlic acid)三戊基、大蒜酸丙基或乙二胺四乙酸钠(EDTA)、焦磷酸钠、和偏磷酸钠。

依照本发明实施方案的注射产品根据患者的状况和缺陷类型，可以配制为填充有本领域常规已知量的注射剂。

依照本发明实施方案的注射产品可以注射到缺陷区域或其临近区域。

依照本发明的另一个方面，提供一种治疗受损软骨的方法，包括对患者注射所述软骨细胞治疗注射剂。

可将用于注射的组合物直接注射到患者的受损软骨或临近于受损软骨的区域。更具体地，可不经手术(通过使用关节镜)来治疗受损的软骨。

实施例

<实施例1>分析脐带干细胞的分离和增殖效力

本研究中使用的脐带是在分娩后弃去的经正常母亲同意后得到的脐带。在收集脐带后24小时内使用该脐带。

除去脐带外部血的组织通过使用无Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS除去外部羊膜和两个动脉，切成1mm³大小，然后置于包含100U/mL青霉素、0.1μg/mL链霉素和0.2μg/mL脐带提取物的α-最小必需培养基(α-MEM)中。在将其培养7天后，当细胞表现为贴于底部时，将细胞用包含500U/mlΙ型胶原酶的α-MEM处理4小时以分离细胞。之后，将细胞按2×10³个/cm²接种于培养皿(包含α-MEM，皿中包含100U/ml的青霉素、0.1μg/ml链霉素和0.2mg/ml的脐带提取物)，将细胞培养在37℃、5%CO₂的培养箱中。每周将细胞培养基替换3次，且当细胞在细胞培养容器中生长至约70%至约80%时，将细胞用0.125%的胰蛋白酶和1mM的EDTA处理3分钟以使细胞脱壁，将2×10³个细胞置于每1cm²的细胞培养皿，然后在其中供应5%CO₂的培养箱中培养。

<实施例2>通过RT-PCR分析胚胎干细胞标志物

将细胞团粒用无Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS清洗，向其加入1ml裂解缓冲液(iNtRON Biotechnology产品)，然后依照可自iNtRON Biotechnology获得的手册中描述的方法从其分离总RNA。将1μg RNA通过使用cDNA合成试剂盒(iNtRON Biotechnology产品)在20μL的反应溶液中逆转录，反应溶液包含反应缓冲液、1mM dNTP混合物、0.5μg/μL寡聚(dT)15、20U RNase抑制剂和20U的AMV逆转录酶。反应在42℃温度进行60分钟。将从其获得的RT产物(cDNA)进行PCR，使用2X PCR Master混合溶液试剂盒(iNtRONBiotechnology产品)，其中包含10μL的反应溶液，反应溶液包含1X Taq缓冲液、0.25U Taq聚合酶、10pM有义和反义基因特异性引物。扩增一共进行32个循环且每个循环包括94℃变性30秒，退火30秒，和72℃延伸30秒。在完成反应后，将从其获得的PCR产物加载到2%琼脂糖凝胶中用于电泳。电泳后将凝胶用溴化乙锭染色，用紫外线获得DNA图像。

[表1]

引物的DNA序列信息

基因

引物序列(5'-3')

温度(℃)

OCT4	有义	agaaggagtggtccgagtg	SEQ ID NO:1	60
					反义	agagtggtgacggagacagg	SEQ ID NO:2
Nanog	有义	atacctcagcctccagcaga	SEQ ID NO:3	59
					反义	cctgattgrrccaggattgg	SEQ ID NO:4
KLF4	有义	accctgggtcttgaggaagt	SEQ ID NO:5	59
					反义	tgccttgagatgggaactct	SEQ ID NO:6
Sox2	有义	gatgcacaactcggagatcag	SEQ ID NO:7	60
					反义	gccgttcatgtaggtctgcga	SEQ ID NO:8
GAPDH	有义	gaaggtgaaggtcggagtca	SEQ ID NO:9	60
					反义	ggaggcattgctgatgatct	SEQ ID NO:10	60

<实施例3>通过FACS分析间充质干细胞标志物的表达

使用流式细胞术来分析分离的细胞的特性。分离的细胞用PBS清洗，用胰蛋白酶-EDTA处理以制备单细胞组，然后用包含2%FBS和1mM EDTA的PBS清洗。之后，处理与异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)结合的干细胞标志物，并使之反应20分钟，然后用FACSCalibur(Becton-Dickinson产品)分析。

<实施例4>分析脐带干细胞的分化效力

<4-1>诱导脂肪细胞中的分化

将脐带来源的干细胞按2×10³个/cm²置于24孔板中，培养3天，然后将细胞培养基用细胞分化培养基替换，所述细胞分化培养基于DMEM中含有10%的FBS、1μM的地塞米松(dexamethasone)、0.5μM的3-3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.05mg/L的人胰岛素和200μM的吲哚美辛(indomethacin)。然后，将细胞培养基每周替换3次。在培养3周后，实施Oil Red O染色来分析其中积累脂质的脂肪细胞的存在。

<4-2>诱导骨细胞中的分化

将脐带来源的干细胞按2×10³个/cm²置于24孔板中，培养3天，然后将细胞培养基用细胞分化培养基替换，所述细胞分化培养基包含10%的FBS、1μM地塞米松、100mM的β-甘油磷酸和50μM抗坏血酸-2-磷酸。然后，将细胞培养基每周替换3次。在培养3周后，实施ALP染色来分析分化。

<4-3>诱导软骨细胞中的分化

将脐带来源的干细胞按2×10³个/cm²与胶原凝胶混合，取其100μl接种到培养皿，在37℃温度的培养箱中维持10分钟以使胶原形成胶体，并向其添加细胞分化培养基，是DMEM中包含0.1μM地塞米松、50μg/mL抗坏血酸-2-磷酸、100μg/mL丙酮酸钠、10ng/mL转化生长因子-β3和50mg/mL的ITS相加预混合物(包含6.25μg/mL胰岛素、运铁蛋白和亚硒酸)，来培养所述脐带来源的干细胞。然后，将细胞培养基每周替换3次，但仅是将总体积的一半用新培养基替换。在培养3周后，实施II型胶原染色来分析分化。

<实施例5>制备透明质酸衍生物

将透明质酸钠在0.25N NaOH溶液中以100mg/ml的浓度溶解以获得溶液。将BDDE加入溶液。在以30℃温度反应36小时后，将从其获得的产品用盐水溶液清洗来除去不反应的产物。将从其获得的清洗后产物研磨以调整其颗粒大小，并将其浓度调整为20mg/ml来制备透明质酸衍生物。

<实施例6>制备人脐带来源的胶原

将冷冻的脐带在室温解冻。将该脐带切成约1cm至约2cm的长度，并用蒸馏水清洗。将脐带用70%乙醇溶液处理，在4℃反应24小时。然后用蒸馏水清洗，用3%H₂O₂溶液处理，然后用磁棒在4℃搅动约12小时至约24小时。然后，将从其获得的产物用蒸馏水清洗2次或更多次，并在加入0.5M乙酸溶液后用搅动器和匀浆器研磨组织。然后，将从其获得的研磨后产物用胃蛋白酶处理并在4℃温度反应24小时，接着以10,000rpm在4℃离心30分钟。

离心后，使用NaOH将从其获得的上清液的pH设为7以消除胃蛋白酶的活性。将从其获得的经pH调节的溶液用NaCl处理，搅动直至NaCl完全溶解，并在4℃维持约12小时至约24小时直至胶原被盐析而出且被浸没。将从其获得的浸没产物在10,000rpm和4℃离心30分钟，分离从其获得的盐析出的胶原团粒以通过使用超滤系脱盐和浓缩。最后，将从其获得的脱盐和浓缩后的产物通过过滤除去微生物，冻干，然后储存以制备胶原溶液。经由羟脯氨酸分析对该胶原溶液定量并经由SDS-PAGE分析其纯度。

<实施例7>制备复合性水凝胶和三维体外培养

为了确定2%(w/v)透明质酸衍生物与3%(w/v)胶原的最佳混合比率，将这两种材料和干细胞以各种条件下的体积比混合，然后在细胞培养基中分析体积中的变化(图6和7)。选择复合性水凝胶体积不随培养时间变化的比率来制备最终复合性水凝胶。

以最佳比率制备包含这两种材料的水凝胶，然后将包含NaHCO₃和溶解于0.05N NaOH溶液的HEPES的缓冲溶液与细胞混合，接着将细胞在培养容器中分成约20μl至约40μl的量。将细胞置于37℃温度的培养箱中，其中供应5%的CO₂达20分钟。然后，当包含细胞的基质变得不透明时，向其添加细胞培养基来培养细胞，且每3天替换该细胞培养基。

<实施例8>体内分化效力(用小鼠模型)

用于本实验的鼠(BALB/c-nu Slc)是约5周龄的雌性鼠。对于每个实验组，将100μl包含10ng TGF-β3的注射剂皮下注射到鼠中，并在4周后从鼠获得样品。将样品用4%中性缓冲的福尔马林固定，并通过苏木精&曙红(H&E)、Alcian blue、Safranin-O染色和II型胶原免疫染色来分析软骨化(cartilaginification)的程度。

<实施例9>体内效果分析(家兔关节模型)

将称重为约3kg至约3.5kg的雌性New Zealand白色家兔用于本实验。将该兔麻醉，切割兔膝以损害膝关节区域，该区域具有2.5mm的半径直至软骨下骨。作为对照组，使用一个完全未治疗的组和一个仅用支持物治疗的组。作为实验组，将脐带干细胞和支持物一起移植以实施该实验。在8周和16周后提取样品，通过使用4%中性缓冲的福尔马林固定样品，然后进行H&E染色和II型胶原免疫染色来分析软骨再生的效果。

依照本发明一个实施方案的包含胶原和透明质酸衍生物的组合物可用作针对各种目的的医学复合性生物材料。还有，当向其添加干细胞时，所述组合物可用作有效的软骨治疗物。常规的软骨治疗大多数是手术治疗；然而，当使用依照本发明一个实施方案的组合物时，可以不经手术进行软骨治疗。如此，所述组合物具有较高的工业适用性。

如上文所述，依照本发明的上文一个或多个实施方案，所述医学复合性生物材料包含类似于人皮肤组织的组合物，换言之，其包含人胶原和透明质酸衍生物。如此，所述医学复合性生物材料对人细胞具有很好的亲和力。还有，取代手术，可将关节内窥镜(arthroscope)用于简单治疗，而所述组合物可通过注射容易地移植到受损的软骨组织，其中所述组合物在凝胶化后变为固定的。

依照本发明一个实施方案的软骨细胞治疗物具有水凝胶形式，其具有比仅使用透明质酸的常规支持物更慢的分解速率。如此，所述软骨细胞治疗物可不管外部物理和机械影响来维持其形状，从而在长时间内维持很好的治疗效果，并且可提供很好的软骨细胞治疗。

应理解本文中描述的例示性实施方案应仅视为描述性意义且不意图限制。对每个实施方案中特征或方面的描述通常应视为可用于其它实施方案中的其他类似特征或方面。

尽管已参照附图描述了本发明的一个或多个实施方案，但本领域普通技术人员会理解可在其形式和细节中进行各种变化而不背离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.一种组合物，其包含胶原和透明质酸或透明质酸衍生物。

2.权利要求1的组合物，其中所述胶原是哺乳动物胶原。

3.权利要求2的组合物，其中所述哺乳动物胶原是人脐带来源的胶原。

4.权利要求3的组合物，其中所述人脐带来源的胶原是I型胶原。

5.权利要求1的组合物，其中所述透明质酸衍生物通过使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)交联透明质酸来制备。

6.一种医学复合性生物材料，其包含权利要求1的组合物。

7.一种软骨细胞治疗物，其包含干细胞、胶原、和透明质酸或透明质酸衍生物。

8.权利要求7的软骨细胞治疗物，其中所述干细胞是哺乳动物干细胞。

9.权利要求8的软骨细胞治疗物，其中所述哺乳动物干细胞是脐带来源的干细胞。

10.权利要求7的软骨细胞治疗物，其中所述胶原自哺乳动物脐带获得。

11.权利要求7的软骨细胞治疗物，其中通过使用包含哺乳动物脐带提取物的干细胞培养基在用细胞粘附蛋白包被的容器中培养所述干细胞。

12.权利要求11的软骨细胞治疗物，其中所述干细胞培养基不包含血清。

13.权利要求11的软骨细胞治疗物，其中所述细胞粘附蛋白选自下组：哺乳动物脐带来源的胶原、明胶、纤连蛋白、核纤层蛋白和聚-D溶素。

14.权利要求7的软骨细胞治疗物，其中所述透明质酸衍生物通过使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)交联透明质酸来制备。

15.权利要求7的软骨细胞治疗物，其中透明质酸或透明质酸衍生物与所述胶原的混合比率为约3:1至约1:3。

16.权利要求15的软骨细胞治疗物，其中以约1%至约3%的量包含所述透明质酸或所述透明质酸衍生物。

17.权利要求15的软骨细胞治疗物，其中以约1%至约3%的量包含所述胶原。

18.权利要求7的软骨细胞治疗物，其中所述哺乳动物脐带来源的干细胞以约1.0×10⁶至约1×10⁸细胞/ml的浓度与透明质酸和哺乳动物脐带来源的胶原混合。

19.权利要求7的软骨细胞治疗物，其中所述软骨细胞治疗物是水凝胶。

20.一种软骨细胞治疗注射剂，其包含权利要求7的软骨细胞治疗物。

21.一种治疗受损软骨的方法，包括对患者注射权利要求20的软骨细胞治疗注射剂。