CN113384753A - 一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶及其制备方法和应用，属于生物医用材料及组织工程领域。本发明包括：将甲壳素改性制备成羟丙基甲壳素，然后复合胶原蛋白和透明质酸钠，构建了可注射温敏复合型水凝胶，加载新西兰兔的脂肪间充质干细胞和京尼平，最后在生理温度下原位形成含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶。本发明制备的水凝胶具有三维多孔结构，有利于营养物质和代谢废物的传递，为细胞的生长提供优良的微环境，既有利于维持脂肪间充质干细胞的存活和生物活性，又能够促进脂肪间充质干细胞分化成软骨组织，同时具有较高的力学强度，因此可广泛用于软骨组织工程领域。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料及组织工程领域，具体涉及一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
关节软骨损伤是较为常见的骨科疾病，其预后差，复发率高，给全世界数千万病人带来生活上的不便和精神上的痛苦。骨折及骨折后治疗不当、严重创伤、感染、骨肿瘤等是造成关节软骨损伤的重要原因。对于早期或者较轻程度的软骨损伤，采用药物处理即可使缺损的组织自行修复。但是当损伤的软骨出现较大程度的缺损时，则需要寻找更为有效的方式才能治疗。尽管自体或异体软骨移植是修复软骨缺损的有效手段，但也存在明显的不足，如造成二次损伤，组织来源有限、供体与受体组织尺寸和形状错配，造成供区损伤或功能障碍等。因此，亟待寻找一种简单、有效的方式治疗软骨缺损。
以支架材料和脂肪间充质干细胞为基础的组织工程技术为软骨缺损的治疗提供了新途径。近年来，支架材料中可注射温敏水凝胶的应用倍受关注，其优点是通过微创介入的方式将加载脂肪间充质干细胞的水凝胶注射到患处，根据缺损的尺寸和形状进行自我调节，形成特定形状的填料与缺损腔体匹配。另外，可注射温敏水凝胶能在生理温度下原位形成凝胶，避免细胞流失。甲壳素作为一种性能优良的天然高分子材料，其所制备的温敏水凝胶具有作为组织工程支架材料的潜力，但较低的力学强度限制了其应用。为此，中国专利(CN108310460A)利用京尼平交联温敏甲壳素水凝胶，虽然交联后水凝胶的强度明显提高，但交联剂的引入减弱了水凝胶的细胞相容性，从而限制了其在软骨组织工程领域的应用。解决这一问题最简单有效的方式即引入能够促进细胞增殖的生物活性物质，如胶原蛋白和透明质酸。众多研究已证实胶原蛋白和透明质酸可促进细胞增殖和组织再生，且加载脂肪间充质干细胞可进一步提升组织再生效率(Zhang et al.,2019,19:155.；Zhou et al.,2018,71:496-509.；Yang et al.,2017,57:1-25.)。因此，构建含脂肪间充质干细胞的可注射温敏水凝胶，协调水凝胶的力学强度，提高其与细胞的生物相容性并确保软骨组织的再生功能是需要解决的关键问题。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶及其制备方法和应用，以解决现有技术中干细胞存活率较低且活性较弱的问题。
为了实现上述第一方面的目的，本发明采用以下技术方案：一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，其特征在于，所述复合型水凝胶材料包含脂肪间充质干细胞、羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠。
所述胶原蛋白和透明质酸钠的比例范围优选为(0.1％-3％):(0.1％-0.6％)。
羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠的比例范围优选为(1.2％-4％):(0.1％-3％):(0.1％-0.6％)；脂肪间充质干细胞的含量为1×106-1×108个/mL。
本发明的可注射温敏复合型水凝胶中，除了上述主要成分为脂肪间充质干细胞、羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠，还可含有多肽、寡肽、氨基酸或具有促细胞生长作用的生物活性物质。
为了实现上述第一方面的目的，本发明采用以下技术方案：一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
S1.将甲壳素溶于氢氧化钠和尿素的混合碱溶液中，加入环氧丙烷反应制备羟丙基甲壳素，经透析、干燥、溶解获得羟丙基甲壳素溶液。
S2.将羟丙基甲壳素溶液与胶原蛋白溶液和透明质酸钠溶液混合制备复合溶液。
S3.利用S2中制备的复合溶液重悬脂肪间充质干细胞，在搅拌条件下获得含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合溶液。
S4.将京尼平加至S3的可注射温敏复合溶液中，然后置于相应的凝胶温度下，获得含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶。
本发明上述方法通过将羟丙基甲壳素复合胶原蛋白和透明质酸钠制备可注射温敏水凝胶，有利于提高水凝胶中干细胞的活性和存活率。通过加载脂肪间充质干细胞构建含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，生理温度下原位成型实现水凝胶的固化为细胞提供稳定的生长环境，从而提高水凝胶的组织再生能力。通过上述特定制备方法不仅能够提高干细胞的存活率和活性，有利于软骨组织的再生，还能提高水凝胶的力学强度，使水凝胶对细胞的快速增殖和外力作用具有更强的支撑作用。
优选地，所述步骤S1中甲壳素的分子量范围为0.5-100万，S2中胶原蛋白和透明质酸钠的分子量范围分别为5-30万和8-230万。该优选方案带来的直接技术效果是使复合溶液不至于过粘影响水凝胶的制备过程，也不至于过稀难以形成凝胶，从而更有利于制备工艺的控制和连续化生产的稳定进行。
优选地，所述步骤S2制备的复合溶液中羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠的质量比为(15-20):(1-3):(1-3)。
优选地，所述步骤S3中，可注射温敏复合溶液含有脂肪间充质干细胞的浓度为1×106-1×108个/mL。
在所述制备方法中，多肽、寡肽、氨基酸或具有促细胞生长作用的生物活性物质可以在所述步骤S2中随羟丙基甲壳素溶液一起与胶原蛋白溶液和透明质酸钠溶液混合制备复合溶液。
在所述制备方法中，加入环氧丙烷反应制备羟丙基甲壳素的反应条件为：首先在冰浴状态下，机械搅拌反应0.5-2h，然后升温至4-10℃反应12-36h，再升温至15-34℃反应1-12h，最后冷却至0-10℃静置1-12h，这样既可以防止环氧丙烷在搅拌过程中不断挥发影响反应，还能防止生成的羟丙基甲壳素固化影响反应地顺利进行，从而使整个反应更充分且凝胶的温度敏感特性更好。在本发明中，所述凝胶温度为37℃。
在所述制备方法中，羟丙基甲壳素的干燥方式可以是自然干燥、鼓风干燥、冷冻干燥、真空干燥和临界点干燥。
在本发明的另一个实施例中，所述步骤S4中获得的含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶中京尼平的浓度为0.01-0.05wt％。通过对京尼平的进一步限定，有利于制备得到不同力学强度的水凝胶。
所述方法得到的含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶的力学强度为2343.6-2490.8Pa，37℃的成凝胶时间为2.7-4.2min，能够作为细胞支架和软骨修复支架材料的应用。
本发明的制备方法和可注射温敏复合型水凝胶具有如下优点：
(1)本发明通过将羟丙基甲壳素复合胶原蛋白和透明质酸钠制备可注射温敏水凝胶，有利于提高水凝胶中干细胞的活性和存活率。通过加载脂肪间充质干细胞构建含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，生理温度下原位成型实现水凝胶的固化为细胞提供稳定的生长环境，从而提高水凝胶的组织再生能力。
(2)本发明通过上述特定的制备方法不仅能够提高干细胞的存活率和活性，有利于软骨组织的再生，还能提高水凝胶的力学强度，使水凝胶对细胞的快速增殖和外力作用具有更强的支撑作用。
附图说明
图1-1为实施例3-8制成的可注射温敏复合型水凝胶样品图以及注射图。
图1-2为实施例3-8中所得不同配比的可注射温敏复合型水凝胶样品平均推挤力的统计结果柱形图。
图2-1为实施例3-8在不同温度下凝胶制得的可注射温敏复合型水凝胶样品的状态照片，其中，a、b、c分别为4℃、25℃、37℃下的样品状态。
图2-2为实施例3-8质量比条件下在不同温度下成凝胶时间的统计结果柱形图，B和C分别为25℃和37℃下各样品成凝胶时间。
图3为实施例3-8中所得不同配比的复合型水凝胶的扫面电镜图，a、b、c、d、e和f分别代表羟丙基甲壳素、胶原蛋白、透明质酸钠的质量比为20:1:2、20:2:1、20:1:1、15:2:2、15:3:1和15:1:3的复合水凝胶。
图4为实施例3-8中不同配比条件下，京尼平交联前(A)和交联后(B)的压缩强度统计结果图。
图5-1和5-2分别为实施例2-8中所得不同配比的复合型水凝胶中脂肪间充质干细胞的增殖情况和荧光染色图。图5-1中，为培养1、2和3天后，培养体系的吸光度值；图5-2中，为培养3天后，细胞的荧光染色图，a为单纯羟丙基甲壳素水凝胶，b、c、d、e、f和G分别代表羟丙基甲壳素、胶原蛋白、透明质酸钠的质量比为20:1:2、20:2:1、20:1:1、15:2:2、15:3:1和15:1:3的复合水凝胶。
图6为实施例1-8中所得不同配比的复合型水凝胶在37℃和5％二氧化碳培养箱中连续培养21天后的免疫荧光染色图。A和B分别为II型胶原蛋白和I型胶原蛋白的免疫荧光染色图，a为不含脂肪间充质干细胞的羟丙基甲壳素水凝胶，b为含有脂肪间充质干细胞的羟丙基甲壳素水凝胶，c、d、e、f、g和h分别代表羟丙基甲壳素、胶原蛋白、透明质酸钠的质量比为20:1:2、20:2:1、20:1:1、15:2:2、15:3:1和15:1:3的复合水凝胶。
图7为实施例1-8中所得不同配比的复合型水凝胶在37℃和5％二氧化碳培养箱中培养21天后的免疫组织化学染色结果。a为不含脂肪间充质干细胞的羟丙基甲壳素水凝胶，b为含有脂肪间充质干细胞的羟丙基甲壳素水凝胶，c、d、e、f、g和h分别代表羟丙基甲壳素、胶原蛋白、透明质酸钠的质量比为20:1:2、20:2:1、20:1:1、15:2:2、15:3:1和15:1:3的复合水凝胶。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书提示的内容轻易地了解本发明的其他优点和功效，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下各实施例采用的原料如下：
甲壳素粉末：分子量范围为0.5-100万，来自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
胶原蛋白：分子量范围为5-30万，来自杭州协合医疗用品有限公司。
透明质酸钠：分子量范围为8-230万，来自山东华熙生物科技股份有限公司。
环氧丙烷、氢氧化钠和尿素：来自国药集团化学试剂有限公司。
脂肪间充质干细胞，源于新西兰兔腹股沟，来自江苏赛业生物科技有限公司。
实施例1
本实施例为一种可注射温敏羟丙基甲壳素水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
S1.将甲壳素粉末溶于11wt％的氢氧化钠和4wt％尿素的复合碱溶液中，加入环氧丙烷首先在冰浴状态下，机械搅拌反应2h，然后升温至5℃反应24h，再升温至15℃反应6h，最后冷却至4℃静置2h，制备羟丙基甲壳素，经透析、冷冻干燥、溶解获得2.5wt％的羟丙基甲壳素溶液。
S2.将京尼平加至S1的羟丙基甲壳素溶液中，然后置于37℃下，获得可注射温敏羟丙基甲壳素水凝胶，所得水凝胶中京尼平的浓度为0.02wt％。
实施例2
本实施例为一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏羟丙基甲壳素水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
S1.将甲壳素粉末溶于11wt％的氢氧化钠和4wt％尿素的复合碱溶液中，加入环氧丙烷首先在冰浴状态下，机械搅拌反应2h，然后升温至5℃反应24h，再升温至15℃反应6h，最后冷却至4℃静置2h，制备羟丙基甲壳素，经透析、冷冻干燥、溶解获得2.5wt％的羟丙基甲壳素溶液。
S2.利用S1中制备的羟丙基甲壳素溶液重悬脂肪间充质干细胞，在搅拌条件下获得含脂肪间充质干细胞的可注射温敏羟丙基甲壳素溶液，其中，脂肪间充质干细胞的细胞浓度为1×106个/mL。
S3.将京尼平加至S2的可注射温敏羟丙基甲壳素溶液中，然后置于37℃下，获得含脂肪间充质干细胞的可注射温敏羟丙基甲壳素水凝胶，所得水凝胶中京尼平的浓度为0.02wt％。
实施例3
本实施例为一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
S1.将甲壳素粉末溶于11wt％的氢氧化钠和4wt％尿素的复合碱溶液中，加入环氧丙烷首先在冰浴状态下，机械搅拌反应2h，然后升温至5℃反应24h，再升温至15℃反应6h，最后冷却至4℃静置2h，制备羟丙基甲壳素，经透析、冷冻干燥、溶解获得2.5wt％的羟丙基甲壳素溶液。
S2.将羟丙基甲壳素溶液与胶原蛋白溶液和透明质酸钠溶液混合制备复合溶液，其中胶原蛋白溶液的浓度为1wt％，透明质酸钠溶液的浓度为1wt％，复合溶液中羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠的质量比为20:1:2。
S3.利用S2中制备的复合溶液重悬脂肪间充质干细胞，在搅拌条件下获得含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合溶液，其中，脂肪间充质干细胞的细胞浓度为1×106个/mL。
S4.将京尼平加至S3的可注射温敏复合溶液中，然后置于37℃下，获得含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，所得复合型水凝胶中京尼平的浓度为0.02wt％。
实施例4
除“S2中，复合溶液中羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠的质量比为20:2:1”之外，其余步骤均同实施例3。
实施例5
除“S2中，复合溶液中羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠的质量比为20:1:1”之外，其余步骤均同实施例3。
实施例6
除“S2中，复合溶液中羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠的质量比为15:2:2”之外，其余步骤均同实施例3。
实施例7
除“S2中，复合溶液中羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠的质量比为15:3:1”之外，其余步骤均同实施例3。
实施例8
除“S2中，复合溶液中羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠的质量比为15:1:3”之外，其余步骤均同实施例3。
实验例1
分别按照上述实施例3-8制备含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，将分别制备的水凝胶样品装入含27G注射针的1mL注射器中，一方面轻推注射器推杆，在空白纸上书写，另一方面将注射器夹在拉力试验机上(HG1697A、昆山恒广仪器有限公司、江苏、中国)，调节推挤速度为10mm/min，记录推挤过程的平均推挤力。
图1-1为实施例3-8中所得不同配比的复合型水凝胶的注射图，图1-2为各复合型水凝胶平均推挤力的统计结果。由图可知，所制备的水凝胶可通过注射器自由书写，且注射过程的平均推挤力均较小，表明水凝胶的可注射性能良好。
实验例2
分别按照上述实施例3-8制备含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，取2mL实施例3-8中制备的样品装入10mL玻璃瓶中，拧紧瓶盖，4℃静置10min，25℃静置10min，37℃静置10min，记录样品在各温度下的状态。将各样品依次放置在4℃、25℃、37℃环境中，每隔30s取出观察状态，倒置30s不脱落判定为凝胶形成，记录样品形成凝胶的时间。
图2-1为实施例3-8中所得不同配比的复合型水凝胶在不同温度下的状态，图2-2为各复合型水凝胶成凝胶时间的统计结果。由图2-1可知，所制备的水凝胶在4℃和25℃时为液态，37℃时为固态。图2-2的统计结果显示，25℃时羟丙基甲壳素、胶原蛋白、透明质酸钠的质量比为20:1:2、20:2:1和20:1:1的水凝胶可在20min内形成凝胶，而质量比为15:2:2、15:3:1和15:1:3的水凝胶在900min以后才能形成凝胶，37℃时所有比例的水凝胶均可在5min内形成凝胶，表明所制备的水凝胶可在生理温度下快速形成凝胶，且改变羟丙基甲壳素的添加比例可调节水凝胶的成凝胶时间。
实验例3
分别按照上述实施例3-8制备含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，取100μL实施例3-8中制备的样品装入24孔培养板中，-20℃冷冻2h后，冷冻干燥机上冷冻干燥24h，喷金，扫描电子显微镜观察样品的表面形态。
图3为实施例3-8中所得不同配比的复合型水凝胶的扫面电镜图。由图可知，所制备的水凝胶均为三维多孔结构，该结构有利于营养物质和代谢废物的交换。
实验例4
分别按照上述实施例3-8制备含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，采用动态力学分析仪(DMA,TA instrument Q800 series,USA)，调节压缩应力速率为0.05N/min，对实施例2-6中制备的样品进行分析，测试并记录各样品在37℃下的压缩强度。
图4为实施例3-8中所得不同配比的复合型水凝胶的压缩强度的统计结果。由图可知，未经京尼平交联的水凝胶，其压缩强度为970-1078Pa，而经过京尼平交联的水凝胶，其压缩强度超过了2300Pa，表明京尼平交联可明显提高水凝胶的压缩强度。
实验例5
分别按照上述实施例2-8制备含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，取200μL实施例2-8中制备的样品，加入到24孔培养板中，37℃孵育30min后，补加800μL的细胞培养基，继续在37℃和5％二氧化碳条件下培养，分别在第一、二和三天加入10μL的PrestoBlueTM细胞活性试剂(HH-A13262,Life Technologies,USA)，37℃继续孵育30min后，吸取培养上清100μL，酶标仪记录各上清液在570nm处的吸光度值，并对第三天的样品进行染色，倒置荧光显微镜观察细胞状态。
图5-1和5-2分别为实施例2-8中所得不同配比的复合型水凝胶中脂肪间充质干细胞的增殖状态和荧光染色图。由图可知，细胞在单纯羟丙基甲壳素水凝胶中连续培养三天没有表现出明显的增殖且存在较多的死细胞，而在复合型水凝胶中的细胞表现出明显的增殖，且仅有很少的死细胞，表明胶原蛋白和透明质酸钠的加入可以提高脂肪间充质干细胞的存活并增强其细胞活性。
实验例6
分别按照上述实施例1-8制备含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，取200μL实施例1-8中制备的样品，加入到6孔培养板中，37℃孵育30min后，补加1.8mL的分化培养基(江苏赛业生物科技有限公司，江苏，中国)，继续在37℃和5％二氧化碳条件下连续培养21天，每3天更换一次培养基。取出样品，用2.4％戊二醛固定1h后，行免疫荧光染色。
图6为实施例1-8中所得不同配比的复合型水凝胶在37℃和5％二氧化碳培养箱中连续培养21天后的免疫荧光染色图。由图可知，不含脂肪间充质干细胞的水凝胶不表达I型和II型胶原蛋白，含有脂肪间充质干细胞的羟丙基甲壳素水凝胶轻微表达I型胶原蛋白，不表达II型胶原蛋白，而含有脂肪间充质干细胞的复合水凝胶可大量表达II型胶原蛋白，很少表达I型胶原蛋白，表明复合型水凝胶可促进脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化。
实验例7
分别按照上述实施例1-8制备含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，取200μL实施例1-8中制备的样品，加入到24孔培养板中，37℃孵育30min后，补加1.8mL的分化培养基，继续在37℃和5％二氧化碳条件下连续培养21天，每3天更换一次培养基。21天后，将形成的组织样品用2.4％戊二醛固定48h后，行免疫组织化学染色。
图7为实施例1-8中所得不同配比的复合型水凝胶在37℃和5％二氧化碳培养箱中培养21天后的免疫组织化学染色结果。由图可知，不含脂肪间充质干细胞的水凝胶，阿利新蓝、I型胶原蛋白和II型胶原蛋白的染色均呈阴性。含有脂肪间充质干细胞的羟丙基甲壳素水凝胶，阿利新蓝染色和I型胶原蛋白染色呈阳性，而II型胶原蛋白染色呈阴性。含有脂肪间充质干细胞的复合水凝胶，阿利新蓝染色和II型胶原蛋白染色呈阳性，而I型胶原蛋白染色呈阴性，这些结果表明含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶可促进细胞形成软骨组织。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对此作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，其特征在于，所述复合型水凝胶材料包含脂肪间充质干细胞、羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠。
2.根据权利要求1所述的一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，其特征在于，所述胶原蛋白和透明质酸钠的比例范围优选为(0.1％-3％):(0.1％-0.6％)。
3.根据权利要求1所述的一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，其特征在于，羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠的比例范围优选为(1.2％-4％):(0.1％-3％):(0.1％-0.6％)；脂肪间充质干细胞的含量为1×106-1×108个/mL。
4.根据权利要求1所述的一种含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1.将甲壳素溶于氢氧化钠和尿素的混合碱溶液中，加入环氧丙烷反应制备羟丙基甲壳素，经透析、干燥、溶解获得羟丙基甲壳素溶液；
S2.将羟丙基甲壳素溶液与胶原蛋白溶液和透明质酸钠溶液混合制备复合溶液；
S3.利用S2中制备的复合溶液重悬脂肪间充质干细胞，在搅拌条件下获得含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合溶液；
S4.将京尼平加至S3的可注射温敏复合溶液中，然后置于相应的凝胶温度下，获得含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所使用的甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠的分子量范围分别为0.5-100万、5-30万和8-230万。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S2制备的复合溶液中羟丙基甲壳素、胶原蛋白和透明质酸钠的质量比为(15-20):(1-3):(1-3)。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，可注射温敏复合溶液含有脂肪间充质干细胞的浓度为1×106-1×108个/mL。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S4获得的含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶中京尼平的浓度为0.01-0.05wt％。
9.权利要求4所述的方法得到的含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的力学强度为2343.6-2490.8Pa，37℃成凝胶时间为2.7-4.2min。
10.权利要求1或9所述的含脂肪间充质干细胞的可注射温敏复合型水凝胶作为细胞支架和软骨修复支架材料的应用。
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