CN101148657A - 转化生长因子beta2基因修饰的组织工程化软骨的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转化生长因子beta2基因修饰的组织工程化软骨的构建方法，包括人脂肪来源的成体干细胞分离培养与扩增，携带转化生长因子beta2基因的5型复制缺陷腺病毒转染人脂肪来源的成体干细胞，转染细胞与载体材料聚乳酸一聚羟基乙酸/藻酸钙复合物复合，以及体内组织工程化软骨生成。实验结果显示转基因人脂肪来源的成体干细胞接种于聚乳酸－聚羟基乙酸/藻酸钙复合物可于体内生成组织工程软骨，显示了基因增强组织工程在软骨缺损修复中的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医学和生物医学工程领域，具体的涉及基因增强的组织工程领域。
背景技术
骨性关节炎或外伤等造成软骨丢失而引起的关节疼痛是中老年人残疾的重要原因。关节软骨自身修复能力十分有限，损伤后若得不到有效治疗，往往会引起关节软骨的退变，最终导致骨性关节炎，出现疼痛、关节强直和功能障碍等症状。常用的治疗方法包括关节镜下打磨、钻孔、微骨折，同种自体或异体软骨移植，自体骨膜或软骨膜移植和假体置换手术等，然而这些传统治疗方案往往并不能生成透明软骨，无法达到关节软骨承载负荷的力学要求，假体置换手术能较好地解决疼痛和功能障碍问题，但其寿命有限，不适用于青壮年病人。
组织工程学科的兴起为关节软骨修复提供了新的选择，其基本原理为体外培养扩增的细胞结合基质材料构建出新的软骨组组织以供移植。种子细胞的获取是组织工程软骨构建的基础，目前最常用的种子细胞有软骨细胞、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、脂肪来源的成体干细胞(adiposederived adult stem cells，ADSCs)、胚胎干细胞(embronic stem cells，ESCs)。软骨细胞分离和培养较为简单，但软骨细胞来源有限，体外培养代谢缓慢，体外扩增易出现反分化，表型(特别是II型胶原)难以维持；BMSCs的获取常需要进行局麻或硬膜外麻醉，且来源有限，干细胞数目相对较少。胚胎干细胞具有全分化潜能，可以无限增殖并分化成全身所具有的200余种细胞类型，从而有望形成机体的任何组织或器官，但控制ESCs细胞向特定细胞分化极为复杂，而且ESCs的使用涉及生物安全性和伦理问题。ADSCs因其易于获取、增殖能力强以及具有多项分化潜能而显示出了广泛的应用前景，成为近年来的研究热点。
许多细胞因子在对软骨细胞的增殖代谢及干细胞向软骨细胞分化方面发挥重要作用，如转化生长因子-β(TGF-β)、骨形态发生蛋白(BMPs)、胰岛素样生长因子(IGFs)、成纤维细胞生长因子(FGFs)，但外用细胞因子价格昂贵，而且在使用过程中极易损失，基因增强的组织工程方法在这方面显示出优势，即将目的基因通过合适的载体转移至靶细胞，并在其中表达，从而达到促进细胞增殖或分化的效果。转染细胞合成分泌的内源性蛋白经过适当的翻译后修饰过程，具有更多可识别的配体，能更有效地同细胞表面受体结合，因此，其表达产物活性更高，所需产物量更小，大大减少了外源性重组蛋白大剂量反复使用的副作用。
目前应用于软骨组织工程构建中的三维支架材料总体上可分为以胶原为代表的天然材料和以聚羟基乙酸(polyglycolic acid，PGA)、聚乳酸(poly-L-lactic acid，PLLA)和聚乳酸-聚羟基乙酸复合物(PLGA)为代表的人工合成材料，其中每种材料均有其优劣性，不同材料的复合可以将各种材料的优点整合，PLGA/藻酸钙复合物中PLGA可以使复合物保持一定的机械强度和特定形状，而藻酸钙凝胶则可以避免组织工程软骨构建过程中细胞的大量流失并促进干细胞向软骨细胞分化，因此PLGA/藻酸钙复合物在软骨组织工程中的构建中显示出了其优越性。
发明内容
本发明为了解决上述缺点，提供了一种基于脂肪来源成体干细胞的转化生长因子beta2基因修饰的组织工程化软骨的体内构建方法，以期能够应用于关节软骨损伤修复。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
在本发明的第一方面提供了一种转化生长因子beta2基因修饰的组织工程化软骨的构建方法，包括种子细胞的分离培养与扩增、基因转染、细胞与载体复合，以及体内组织工程化软骨生成，步骤如下：(1)脂肪来源的成体干细胞的分离培养与扩增：取手术病人皮下脂肪，PBS充分洗涤，剪刀将组织块剪碎；0.1％胶原酶I中振荡消化45min，加入含10％FBS的DMEM中止消化，1200g离心10min，得到的细胞团用培养液悬浮后滤网过滤以除去杂质，细胞接种于培养瓶，置于370C、5％CO2培养箱进行培养，二天后换液去除未贴壁的红细胞。以后每周换液两次。至细胞达90％融合后，吸净培养基，以PBS冲洗2次，加入0.05％胰蛋白酶，置于370C、5％C02培养箱中孵育5分钟，加入完全DMEM培养基以中和胰蛋白酶活性，用吸管轻轻吹打使成单细胞悬液，按1∶2进行传代培养；(2)携带转化生长因子beta2基因的复制缺陷5型腺病毒转染脂肪来源的成体干细胞；(3)转染细胞和载体材料的复合：以聚乳酸-聚羟基乙酸/藻酸钙复合物做为细胞载体材料。转染后二十四小时，单层细胞用胰酶消化后制成单细胞悬液，离心后弃去培养液，细胞以2×107/ml浓度重悬于1.2％藻酸钠溶液中，100μl细胞悬液轻轻滴于聚乳酸-聚羟基乙酸复合物上，待细胞悬液完全浸入后，将聚乳酸-聚羟基乙酸复合物轻轻浸于102mM氯化钙溶液中，置于370C、5％CO2培养箱中孵育10分钟后取出细胞材料复合物，生理盐水轻轻冲洗三次后加入含血清DMEM培养基。
较佳的，上述组织工程化软骨的构建方法中的种子细胞是脂肪来源的成体干细胞。
较佳的，上述组织工程化软骨的构建方法中的脂肪来源的成体干细胞为3-5代的传代细胞。
较佳的，上述组织工程化软骨的构建方法利用携带转化生长因子beta2基因的复制缺陷5型腺病毒转染脂肪来源的成体干细胞。
较佳的，上述组织工程化软骨的构建方法中的载体材料是聚乳酸-聚羟基乙酸/藻酸钙复合物，其中聚乳酸和聚羟基乙酸的比例是90∶10，孔径大小是100-300μm，孔隙率为90％。
较佳的，上述组织工程化软骨的构建方法中的聚乳酸-聚羟基乙酸复合物采用如下方法进行预处理：25KGY60Co射线照射12小时，使用前用75％的酒精浸泡30分钟，消除表面张力，然后用无血清的培养液反复冲洗掉残余的酒精，最后用无菌纱布吸干，置于24孔板中。
较佳的，上述组织工程化软骨的构建方法中的细胞与材料的复合是通过如下方法实现的：携带转化生长因子beta2基因的5型复制缺陷腺病毒转染脂肪来源的成体干细胞24小时后，单层细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，离心后弃去培养液，细胞以2×107/ml浓度重悬于1.2％藻酸钠溶液中，细胞悬液轻轻滴于聚乳酸-聚羟基乙酸复合物上，待细胞悬液完全浸入后，将聚乳酸-聚羟基乙酸复合物轻轻浸于102mM氯化钙溶液中，置于370C、5％CO2培养箱中孵育10分钟，使藻酸钠和氯化钙充分聚合成凝胶状的藻酸钙。10分钟取出细胞材料复合物，生理盐水轻轻冲洗三次后加入含血清DMEM培养基。
在本发明的第二方面提供了一种体内软骨生成的方法，将根据上述组织工程化软骨构建方法得到的细胞材料复合物植入体内透明软骨缺损的部位。
由于采取了上述技术方案，本发明具有下述优点：人脂肪来源成体干细胞来源方便、增殖能力强、具有多项分化潜能、对供体创伤小。载体材料PLGA/藻酸钙复合物中PLGA可以使复合物保持一定的机械强度和特定形状，而藻酸钙凝胶则可以避免组织工程软骨构建过程中细胞的大量流失并促进干细胞向软骨细胞分化。转基因人脂肪来源成体干细胞接种于载体材料后可即时植入体内、缩短了细胞获取和手术植入之间的时间。
附图说明
图1 Ad5-hTGF-β2转染的hADSCs材料复合物于裸鼠皮下形成色泽光亮类软骨组织块，左图显示其体积较移植前无明显变化，右图显示对照组移植物较术前有不同程度的缩小，外观颜色晦暗。
图2实验组HE染色显示细胞包埋于陷窝当中，左图显示周围包绕有嗜碱性细胞基质，右图显示对照组HE染色显示大量成纤维组织及血管侵入，无明显软骨生成结构。
图3实验组AB-PAS法染色显示细胞周围基质呈明显蓝色异染，左图提示细胞可分泌大量酸性粘多糖，右图提示II型胶原免疫组化染色呈阳性。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。这些实施例和附图仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(2002年第三版[美]萨姆布鲁克等箸，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例、基于脂肪来源成体干细胞的转化生长因子beta2基因修饰的组织工程化软骨的体内构建
(1)脂肪来源的成体干细胞(human adipose derived adult stem cell，hADSCs)的分离培养与扩增：征得同意后取少量手术病人少量皮下脂肪(病人男性，年龄56岁，陈旧性股骨颈骨折患者，行全髋关节置换术)，PBS洗涤三次，去除肉眼可见血管，PBS吹洗三次，剪刀将脂肪块尽量剪碎后置于50ml离心管中，加入5倍体积0.1％I型胶原酶振荡消化45min，后加入含10％FBS的DMEM中止消化，1200g离心10min，去除上清及脂滴，得到的细胞团用培养液悬浮后滤网(100μm)过滤以除去杂质，细胞接种于75cm2培养瓶，置于37℃、5％CO2培养箱进行培养，二天后换液去除未贴壁的红细胞。以后每周换液两次(高糖DMEM，含10％FBS)。至细胞达90％融合后，吸净培养基，以PBS冲洗2次，加入0.05％胰蛋白酶，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育5分钟，加入完全DMEM培养基以中和胰蛋白酶活性，用吸管轻轻吹打使成单细胞悬液，按1∶2进行传代培养。
(2)携带转化生长因子beta2基因的5型复制缺陷腺病毒(Ad5-hTGF-β2)转染hADSCs：前期实验应找到适于hADSCs转染的适当的转染复数，具体方法为二十四孔板中接种适量细胞，至转染时细胞密度以90％左右，二十四孔板中加入无血清培养液200μl，选择适当的转染复数(MOI＝100∶1，200∶1，500∶1，1000∶1)，加入携带增强的绿色荧光基因基因的5型复制缺陷腺病毒(Ad5-EGFP)后感染90分钟，每15分钟轻轻晃动培养液一次，混匀，90分钟后吸去原培养液，加入新鲜完全培养液，24小时后荧光显微镜下观察转染效率，当MOI＝500∶1时腺病毒对hADSCs的转染效率可达到82.5％，并且未对细胞造成明显损伤，因此，我们选择500∶1为适合于hADSCs的MOI值。转染前24小时，培养皿中接种适量hADSCs，至转染时细胞密度以90％左右，转染前换液，加入适量无血清DMEM，以MOI＝500∶1加入Ad5-hTGF-β2，感染时间为90分钟，每15分钟轻轻晃动培养液一次，混匀，90分钟后吸去原培养液，加入新鲜完全培养液。
(3)载体材料的制备及转染细胞和材料的复合：聚乳酸-聚羟基乙酸复合物(PLGA，其中聚乳酸∶聚羟基乙酸为90∶10，孔隙率是90％，孔径为100-300μm)委托山东省医用高分子材料重点实验室制备。PLGA用刀片修成6×4×0.4cm大小，25KGY60Co射线照射12小时消毒备用。使用前PLGA于离心管中用75％乙醇浸泡30分钟，吸去75％乙醇，用不含血清的DMEM吹洗三遍，然后置于DMEM中浸泡2小时。转染后二十四小时，单层细胞用胰酶消化后制成单细胞悬液，离心后弃去培养液，细胞以2×107/ml浓度重悬于1.2％藻酸钠溶液中，100μl细胞悬液轻轻滴于PLGA上，待细胞悬液完全浸入多孔PLGA后，将PLGA轻轻浸于102mM氯化钙溶液中，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育10分钟，使藻酸钠和氯化钙充分聚合成凝胶状的藻酸钙。10分钟取出细胞材料复合物，生理盐水轻轻冲洗三次后加入含血清DMEM培养基。Ad5-EGFP转染的细胞和未转染的细胞进行同样操作以作对照。
(4)体内植入：选4-6周的BALB/C裸鼠为作皮下植入模型，操作过程如下：无菌条件下腹腔注射击氯胺酮麻醉动物，将于体外培养24小时的细胞材料复合物植入裸鼠皮下，缝合切口。其中6只裸鼠背部皮下植入Ad5-hTGF-β2转染的hADSCs材料复合物，另外6只植入Ad5-EGFP转染的hADSCs材料复合物。3个月后取材，行组织学和免疫组织化学检测。
(5)3个月后取材可发现经Ad5-hTGF-β2转染的hADSCs材料复合物于裸鼠皮下形成色泽光亮类软骨组织块，其体积较移植前无明显变化，HE染色显示细胞包埋于陷窝当中，周围包绕有嗜碱性细胞基质，AB-PAS法染色显示细胞周围基质呈明显蓝色异染，提示细胞可分泌大量酸性粘多糖，II型胶原免疫组化染色呈阳性。而对照组移植物较术前有不同程度的缩小，外观颜色晦暗，HE染色显示大量成纤维组织及血管侵入。实验结果提示Ad5-hTGF-β2转染的hADSCs结合PLGA/藻酸钙复合物可于体内生成组织工程软骨，显示了基因增强组织工程在软骨缺损修复中的应用前景。
Claims (8)
1.一种转化生长因子beta2基因修饰的组织工程化软骨的构建方法，包括种子细胞的分离培养与扩增、基因转染、细胞与载体复合，以及体内组织工程化软骨生成，其特征在于：(1)脂肪来源的成体干细胞的分离培养与扩增：取手术病人皮下脂肪，PBS充分洗涤，剪刀将组织块剪碎；0.1％胶原酶I中振荡消化45min，加入含10％FBS的DMEM中止消化，1200g离心10min，得到的细胞团用培养液悬浮后滤网过滤以除去杂质，细胞接种于培养瓶，置于37℃、5％CO2培养箱进行培养，二天后换液去除未贴壁的红细胞。以后每周换液两次。至细胞达90％融合后，吸净培养基，以PBS冲洗2次，加入0.05％胰蛋白酶，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育5分钟，加入完全DMEM培养基以中和胰蛋白酶活性，用吸管轻轻吹打使成单细胞悬液，按1∶2进行传代培养；(2)携带转化生长因子beta2基因的复制缺陷5型腺病毒转染脂肪来源的成体干细胞；(3)转染细胞和载体材料的复合：以聚乳酸-聚羟基乙酸/藻酸钙复合物做为细胞载体材料。转染后二十四小时，单层细胞用胰酶消化后制成单细胞悬液，离心后弃去培养液，细胞以2×107/ml浓度重悬于1.2％藻酸钠溶液中，100μl细胞悬液轻轻滴于聚乳酸-聚羟基乙酸复合物上，待细胞悬液完全浸入后，将聚乳酸-聚羟基乙酸复合物轻轻浸于102mM氯化钙溶液中，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育10分钟后取出细胞材料复合物，生理盐水轻轻冲洗三次后加入含血清DMEM培养基。
2.权利要求1中所述的转化生长因子beta2基因修饰的组织工程化软骨的构建方法，其特征在于种子细胞是脂肪来源的成体干细胞。
3.权利要求1中所述的转化生长因子beta2基因修饰的组织工程化软骨的构建方法，其特征在于脂肪来源的成体干细胞为3-5代的传代细胞。
4.权利要求1中所述的转化生长因子beta2基因修饰的组织工程化软骨的构建方法，其特征在于利用携带转化生长因子beta2基因的复制缺陷5型腺病毒转染脂肪来源的成体干细胞。
5.权利要求1中所述的转化生长因子beta2基因修饰的组织工程化软骨的构建方法，其特征在于载体材料是聚乳酸-聚羟基乙酸/藻酸钙复合物，其中聚乳酸和聚羟基乙酸的比例是90∶10，孔径大小是100-300μm，孔隙率为90％。
6.权利要求1中所述的转化生长因子beta2基因修饰的组织工程化软骨的构建方法，其特征在于聚乳酸-聚羟基乙酸复合物采用如下方法进行预处理：25KGY60Co射线照射12小时，使用前用75％的酒精浸泡30分钟，消除表面张力，然后用无血清的培养液反复冲洗掉残余的酒精，最后用无菌纱布吸干，置于24孔板中。
7.权利要求1中所述的转化生长因子beta2基因修饰的组织工程化软骨的构建方法，其特征在于细胞与材料的复合是通过如下方法实现的：携带转化生长因子beta2基因的5型复制缺陷腺病毒转染脂肪来源的成体干细胞24小时后，单层细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，离心后弃去培养液，细胞以2×107/ml浓度重悬于1.2％藻酸钠溶液中，细胞悬液轻轻滴于聚乳酸-聚羟基乙酸复合物上，待细胞悬液完全浸入后，将聚乳酸-聚羟基乙酸复合物轻轻浸于102mM氯化钙溶液中，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育10分钟，使藻酸钠和氯化钙充分聚合成凝胶状的藻酸钙。10分钟取出细胞材料复合物，生理盐水轻轻冲洗三次后加入含血清DMEM培养基。
8.一种体内软骨生成的方法，其特征在于将根据权利要求1所述的组织工程化软骨构建方法得到的细胞材料复合物植入体内透明软骨缺损的部位。
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